ES2326848T3 - Inhibidores de la actividad de secuencias inmunoestimulatorias de adn. - Google Patents

Inhibidores de la actividad de secuencias inmunoestimulatorias de adn. Download PDF

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Abstract

Procedimiento para la identificación de un oligonucleótido (IIS-ON) que inhibe la actividad inmunoestimulatoria de ISS-ODN, que comprende: (a) contactar una población de células inmunes estimuladas con antígenos con un polinucleótido inmunoestimulatorio (ISS-ODN) que incluye por lo menos un motivo 5''-CG-3'' o metilado para inducir la proliferación de linfocitos en secreción de citocinas IFNBeta, IFN-alfa, IFN-ípsilon, IL-12 y IL-18 de, la producción de anticuerpos IgG1 mediante, o la supresión de IgE en, la población de células inmunes estimuladas con antígenos; (b) medir cualquier cambio en el número de linfocitos o los niveles de citocinas secretadas y/o los niveles de anticuerpos IgE o IgG1 en la población de células estimuladas con antígenos después de contactar con el ISS-ODN; (c) contactar la población de células estimuladas con antígenos con un oligonucleótido inhibitorio IIS-ON candidato, comprendiendo dicho IIS-ON una secuencia de nucleótidos hexamérica de fórmula 5''-Purina-Purina-[Y]-[Z]- Pirimidina-Pirimidina-3'' o 5'' Purina-Purina-[Y]-[Z]-poli(Pirimidina)-3''; en la que Y es cualquier nucleótido que se produce naturalmente o sintético excepto citosina y Z es cualquier nucleótido que se produce naturalmente o sintético y en la que cuando Y no es guanosina o inosina, Z es guanosina o inosina; y (d) medir cualquier cambio en el número de linfocitos o los niveles de citocinas IFNbeta, IFN-alfa, IFN-ípsilon, IL-12 y IL-18 secretadas y/o los niveles de anticuerpos IgE o IgG1 en la población de células estimuladas con antígenos después de contactar con el oligonucleótido, en el que una disminución en cualquiera de los valores medidos para la proliferación de linfocitos, secreción de citocinas, o producción de anticuerpo IgG1, así como un aumento en la producción de anticuerpo IgE, comparado con las mediciones tomadas en la etapa (b) indica que el oligonucleótido inhibe la actividad inmunoestimulatoria del ISS-ODN de la etapa (a).

Description

Inhibidores de la actividad de secuencias inmunoestimulatorias de ADN.
Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención
La invención se refiere a secuencias inmunoestimulatorias en ADN. La invención también se refiere a vectores de expresión recombinantes para su uso en terapia génica.
2. Historia de la técnica relacionada
Los vectores de expresión recombinantes son las herramientas que los investigadores y los clínicos utilizan para conseguir los objetivos de la terapia génica y la inmunización génica. En la terapia génica, se utilizan vectores virales y no virales para proporcionar un gen que se puede expresar en un huésped para reemplazar el gen faltante o defectuoso, o para proporcionar de otra manera al huésped un polipéptido terapéuticamente beneficioso. En la inmunización génica, se utilizan principalmente vectores no virales para inducir una respuesta inmune por parte del huésped a un antígeno expresado.
Uno de los obstáculos para la práctica clínica exitosa de la terapia génica y la inmunización génica ha sido la naturaleza a menudo transitoria de la expresión génica conseguida en vivo. La expresión génica transitoria es menos problemática en la inmunización génica, donde las respuestas inmunes suficientes para ciertos esquemas de inmunización se pueden estimular incluso mediante una exposición a corto plazo al antígeno expresado. Además, están disponibles varias opciones para impulsar la respuesta inmune del huésped al antígeno, incluyendo el uso del propio vector como adyuvante para la respuesta inmune deseada mediante la exposición del huésped a secuencias de nucleótidos inmunoestimulatorios no codificadores (ISS-ODN) presentes en el vector (Sato, et al., Science, 273:352-354 (1996)).
Sin embargo, en un protocolo de terapia génica, la pérdida prematura de expresión génica priva al huésped de los beneficios potenciales de la terapia (Friedmann, Scientific American, "Making Gene Therapy Work" (Junio 1997)). La dosificación repetitiva para extender la exposición del huésped a un polipéptido terapéutico puede requerir el uso de diferentes vectores para suministrar cada dosis, de manera que se minimiza la respuesta inmune de huésped a antígenos de vector (Tripathy, et al., Nature Med., 2:545-550 (1996)).
Una fuente potencial de inmunogenicidad del vector son ISS-ODN en el genoma de las especies microbianas usadas para construir vectores de expresión recombinantes. Para explicarlo, los motivos CpG que caracterizan el ISS-ODN están presentes en bacterias y virus (incluyendo retrovirus) en una frecuencia mucho mayor de la que se aprecia en genomas de vertebrados. Una consecuencia de la actividad del ISS-ODN es la producción inducida de ISS-ODN de citocinas tales como interferon-\alpha (INF-\alpha), INF-\gamma y interleuquina-12 (IL-12). Esta inflamación del ISS-ODN se cree que es defensiva contra infección microbiana en vertebrados y también se cree que se produce en respuesta al ISS-ODN introducido en un huésped como oligonucleótidos o como parte de un vector de expresión recombinante.
El documento WO96/02555 describe oligonucleótidos inmunomoduladores que contienen dinucleótidos de CpG no metilados. Oligonucleótidos similares también se describen en Kreig et al, Nature 374:546-549 (1995) y Ballas et al, J. Immunol., 157:1840-1845 (1996). El documento WO95/26204 describe ciertos oligonucleótidos antisentido que están marcados en ARNms virales seleccionados.
Descripción de la invención
La invención se refiere a compuestos que consisten en oligodeoxinucleótidos, ribonucleótidos y análogos de los mismos que inhiben específicamente la actividad inmunoestimulatoria del ISS-ODN y su utilización.
La secreción inducida de ISS-ODN de INF-\alpha en particular puede suprimir expresiones génicas recombinantes e impide que ARNm y síntesis de proteínas en células transfectadas. Así, la inhibición de la actividad de ISS-ODN evita substancialmente pérdidas inducidas de ISS-ODN de expresión génica, prolongando así la disponibilidad del polipéptido expresado en un huésped que sufre terapia génica o inmunización génica con un vector de expresión recombinante que contiene ISS-ODN. Además, se evita la necesidad de dosificación repetitiva para prolongar la disponibilidad de proteínas expresadas y reingeniería extensiva de vectores de expresión recombinante para eliminar las secuencias de ISS-ODN a través del uso de los compuestos aquí descritos.
Los compuestos aquí descritos también son útiles en la modulación de la actividad inmunoestimulatoria del ISS-ODN administrado como adyuvantes para impulsar las respuestas inmunes del huésped al antígeno en, por ejemplo, inmunoterapia. Respecto a esto, los compuestos aquí descritos permiten un control exquisito sobre el efecto de los adyuvantes basados en ISS-ODN en un huésped.
Además, los compuestos aquí descritos reducen la inflamación del huésped generada en respuesta a una infección por un ISS-ODN que contiene bacterias o virus. Ventajosamente, los compuestos aquí descritos se pueden administrar para inhibir la actividad del ISS-ODN ejercida por un microbio incluso si la identidad del ISS-ODN particular presente en el microbio es desconocida. Así, los compuestos aquí descritos se pueden considerar que son agentes antiinflamatorios de amplio espectro.
En un aspecto, la invención proporciona un procedimiento para identificar un oligonucleótido (IIS-ON) que inhibe la actividad inmunoestimulatoria del ISS-ODN que comprende: (a) contactar una población de células inmunes estimuladas con antígeno con un polinucleótido inmunoestimulatorio (ISS-ODN) que incluye por lo menos motivo 5'-CG-3' no metilado para inducir la proliferación de linfocitos en forma de secreción de citocina IFN\beta, IFN-\alpha, IFN-\gamma, IL-12 y IL-18, producción de anticuerpos IgG1, o la supresión de IgE en la población de células inmunes estimuladas con antígeno; (b) medir cualquier cambio en el número de linfocitos o niveles de citocinas secretadas y/o niveles de anticuerpos IgE o IgG1 en la población de células estimuladas de antígenos después de contactar con el ISS-ODN; (c) contactar la población de células estimuladas con antígeno con un oligonucleótido inhibitorio IIS-ON candidato, comprendiendo dicho IIS-ON una secuencia nucleótida hexamérica de fórmula 5'-Purina-Purina-[Y]-[Z]-Pirimidina-Pyrimidina-3' o 5' Purina-Purina-[Y]-[Z]-poli(Pirimidina)-3'; en la que Y es cualquier nucleótido que se produce de manera natural o sintética excepto citosina y Z es cualquier nucleótido que se produce de manera natural o sintética y en el que cuando Y no es guanosina o inosina, Z es guanosina o inosina; y (d) medir cualquier cambio en el número de linfocitos o niveles de citocinas IFN\beta, IFN-\alpha, IFN-\gamma, IL-12 y IL-18 secretadas y/o niveles de anticuerpos IgE o IgG1 en la población de células estimuladas con antígeno después de contactar con el oligonucleótido, en el que una disminución en cualquiera de los valores medidos de la proliferación de linfocitos, secreción de citocina o producción de anticuerpo IgG1, así como un aumento en la producción de anticuerpo IgE, comparado con las mediciones tomadas en la etapa (b) indica que el oligonucleótido inhibe la actividad inmunoestimulatoria del ISS-ODN de la etapa (a).
En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende: a) un oligonucleótido que comprende una secuencia de nucleótido hexamérica de fórmula 5'-Purina-Purina-[Y]-[Z]-Pirimidina-Pirimidina-3' o 5' Purina-Purina-[Y]-[Z]-poly(Pirimidina)-3'; en la que Y es cualquier nucleótido que se produce de manera natural o sintética excepto citosina y Z es cualquier nucleótido que se produce de manera natural o sintética y en el que cuando Y no es guanosina o inosina, Z es guanosina o inosina, en la que dicho oligonucleótido exhibe un efecto inmunoinhibitorio contra un polinucleótido inmunoestimulatorio que incluye por lo menos un motivo 5'-CG-3' no metilado; y b) un portador farmacéuticamente aceptable, para su uso en un procedimiento de inhibición de la estimulación de una secuencia inmunoestimulatoria que comprende por lo menos un motivo CG no metilado.
La invención también prevé la utilización de la composición farmacéutica definida para la fabricación de un medicamento para inhibir la estimulación mediante una secuencia inmunoestimulatoria que comprende por lo menos un motivo CG no metilado.
Más preferiblemente, las purinas 5' son el mismo nucleótido, ya que son las pirimidinas 3'. Por ejemplo, si ** es YZ, las purinas 5' y las pirimidinas 3' pueden ser AA**TT,AG**TT, GA**TT, GG**TT, AA**TC, AG**TC, etc. Cualquier secuencia presente que flanquea la secuencia del núcleo del hexámero se construye para que coincida substancialmente con las secuencias flanqueadoras presentes en cualquier ISS-ODN conocido.
El IIS-ON inhibitorio de la invención se prepara en una composición farmacéuticamente aceptable para su uso en un huésped. El IIS-ON se puede mezclar en la composición de manera simple, en múltiples copias o en una mezcla de IIS-ON diferente. Alternativamente, el IIS-ON inhibitorio de la invención se puede incorporar en un vector de expresión recombinante. El IIS-ON inhibitorio también se puede prever en forma de un conjunto, que comprende IIS-ON inhibitorio y construcciones de vector de expresión que contienen, o son susceptibles de inserción, un gen de interés.
Una ventaja particular del IIS-ON de la invención es que se puede usar para dirigir ISS-ON en cualquier IIS-ODN que contiene el vector de expresión recombinante o el microbio, si se conoce o no la composición del nucleótido del vector o microbio. Incluso, no es necesario conocer la existencia, identidad o posición del ISS-ODN en el vector o microbio. Si el ISS-ODN no está presente en el vector o microbio, el ISS-ON de la invención simplemente no tendrá ningún efecto. Sin embargo, si el ISS-ODN está presente en el vector o microbio, se puede esperar que su actividad inmunoestimulatoria será inhibida en una manera que depende de la dosis mediante el IIS-ON, incluso si no se conoce la estructura o posición específica del ISS-ODN en el vector o microbio.
Así, en otro aspecto, la invención proporciona una alternativa simple y efectiva para la ardua tarea de eliminar la actividad del ISS-ODN de los vectores de expresión recombinante mediante la identificación de todos los ISS-ODN presentes en el vector y su eliminación.
También en este aspecto, la invención proporciona procedimiento para el cribado de vectores de expresión recombinantes para la presencia de ISS-ON y para identificar IIS-ON inhibitorio adicional. En el aspecto anterior, la presencia de ISS-ODN en un vector de expresión recombinante se confirma mediante la incubación del vector en una población de linfocitos con un IIS-ON de actividad inhibitoria conocida y comparando la diferencia, si la hay, en el nivel de producción de citocina inducida con ISS mediante los linfocitos antes y después de la incubación del IIS-ON.
En este último aspecto, el IIS-ON inhibitorio adicional que tiene las características aquí descritas se identifica por su capacidad de inhibir la actividad inmunoestimulatoria de un polinucleótido o vector de expresión recombinante que contiene ISS conocido.
En todavía otro aspecto, la invención también proporciona un agente antiinflamatorio útil para su uso en la inhibición de la actividad inmunoestimulatoria de cualquier ISS-ODN presente en una bacteria infecciosa o virus.
Además, la invención proporciona medios útiles para modular la actividad inmunoestimulatoria del ISS-ODN suministrado a un huésped para inmunoestimulación (por ejemplo, como adyuvante).
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es un gráfico que representa la inhibición en vivo de la actividad inmunoestimulatoria del ISS-ODN mediante el IIS-ON inhibitorio de la invención (I-ON DY1019 y DY1041 (que tienen regiones de hexámero que consisten en, respectivamente, AAGGTT and AAGCTT)). La proliferación de linfocitos estimulados en un modelo de murina mediante el ISS-ODN (DY1038, que tiene una región de hexámero que consiste en AACGTT) se comparó en presencia o ausencia del IIS-ON. Una disminución en las cuentas por minutos medidas (CPM; eje vertical) representa la inhibición de la actividad inmunoestimulatoria del ISS-ODN en la figura. Se muestran dosis para cada IIS-ON probado a lo largo del eje horizontal. DY1039 (un ISS-ODN con la citosina), DY1040, DY1042 y DY1043 (todos con dinucleótidos CC en lugar del dinucleótido CG de DY1038) sirvieron como controles. Para confirmar la posición de competición potencial con DY1038, todos los oligonucleótidos era idénticos a DY1038 excepto para las regiones de hexámero identificada y DY1043 (un control de secuencia irrelevante).
La figura 2 es un gráfico que confirma la inhibición dependiente de la dosis en vivo de la actividad inmunoestimulatoria del ISS-ODN mediante el IIS-ON DY1019 y DY1041 de la invención. La proliferación de linfocitos estimulada en un modelo de murina mediante un ISS-ODN diferente al probado en el experimento de la figura 1 (DY1018) se comparó en presencia o ausencia del IIS-ON. Una disminución en las cuentas por minuto medidas (CPM; eje vertical) representa la inhibición de la actividad inmunoestimulatoria del ISS-ODN en la figura. Dosificaciones para cada IIS-ON probado se muestran a lo largo del eje horizontal. La actividad inhibitoria del IIS-ON DY1019 y DY-1041 aumentó con la dosificación, siendo el aumento en la actividad del DY1019 proporcional al aumento en la dosificación. Para confirmar para posición de la competición potencial con DY1018, DY1019 y DY1041 son idénticos a DY1018 excepto para las regiones de hexámero identificadas.
La figura 3 es un gráfico que representa la inhibición dependiente de la dosis en vivo de la actividad inmunoestimulatoria del ISS-ODN mediante varios IIS-ON inhibitorios de la invención. La proliferación de linfocitos estimulada en un modelo de murina mediante DY1038 se comparó en presencia o ausencia del IIS-ON. Una disminución en las cuentas por minuto medidas (CPM; eje vertical) representa la inhibición de la actividad inmunoestimulatoria del ISS-ODN en la figura. Dosificaciones para cada IIS-ON probado se muestran a lo largo del eje horizontal. En orden descendente, la actividad más inhibitoria se mostró por parte del IIS-ON DY1019, DY-1041, DY1048, DY1050 y DY1060 (este último tiene regiones de hexámero que consisten en, respectivamente, AGGGTT, GAGGTC y TTGCAA). DY1039 (un ISS-ODN con la citosina metilada), DY1040 y DY1043 (este ultimo con dinucleótidos CC en lugar del dinucleótido CG de DY1038) sirvieron como controles. Para confirmar para posición de la competición potencial con DY1038, todos los oligonucleótidos eran idénticos a DY1038 excepto para las regiones de hexámero identificadas y DY1043 (un control de secuencia irrelevante).
La figura 4 es un gráfico que representa la inhibición dependiente de la dosis en vivo de la actividad inmunoestimulatoria del ISS-ODN mediante el IIS-ON inhibitorio de la invención. La producción de INF-\gamma estimulado mediante DY1018 ISS-ODN en un modelo de murina se comparó en presencia o ausencia del IIS-ON. Una disminución en el INF-\gamma medido (eje vertical) representa la inhibición de la actividad inmunoestimulatoria del ISS-ODN en la figura. Las dosificaciones para cada I-ON probado se muestran a lo largo del eje horizontal. Se observó alguna actividad inhibitoria para todos excepto un IIS-ON, mostrándose la mayor actividad por parte de I-ON DY1019 y DY-1041, así como DY1042 (que tiene una región de hexámero que consiste en TTCCTT). La inserción separa los datos de la inhibición de la producción de INF-\gamma mediante DY1019. Para confirmar la posición de la competición potencial con DY1018, todos los oligonucleótidos eran idénticos a DY1018 excepto para las regiones de hexámero identificadas y DY1043 (un control de secuencia irrelevante).
La figura 5 es un gráfico que representa las propiedades adyuvantes del IIS-ODN, mediante el cual se induce una respuesta inmune celular de tipo Th2 en ratones inmunizados con antígeno (\beta-galactosidasa) mediante coadministración del antígeno y IIS-ODN DY1019 (identificado en la figura como \beta-gal/M-ODN). Las respuestas del TH2 se representan mediante niveles IgE medidos después del impulso. Los valores obtenidos se comparan con los niveles IgE medidos el ratones inmunizados con antígeno y la composición de ISS-ODN b-gal/ISS-ODN (5'-AATTCAACGTTCGC-3'), pKISS-3 (un plásmido que tiene tres copias del hexámero AACGTT ISS-ODN en la espina dorsal) y pKISS-0 (un plásmido que no tiene copias del hexámero AACGTT ISS-ODN en la espina dorsal), así como ratones que recibieron salino solamente. Se obtuvieron respuestas de IgE potentes (respuestas de tipo Th2) por encima de 1000 CPM solamente en los ratones que recibieron salino (aproximadamente 1200 CPM 1 semana después de la activación) y \beta-gal/M-ODN (aproximadamente 1750 CPM 1 semana después de la activación).
Descripción detallada de la invención A. Actividad y Estructura del IIS-ON 1. Actividad del IIS-ON y Ensayo de Cribado
El IIS-ON de la invención reduce el efecto inmunoestimulatorio del ISS-ODN. Estructuralmente, los ISS-ON son oligonucleótidos no codificadores con una longitud de 6 mer o mayor que pueden incluir por lo menos un motivo CG no metilado. La posición relativa de cada secuencia CG en ISS-ODN con actividad inmunoestimulatoria en ciertas especies de mamíferos (por ejemplo roedores) es 5'-CG-3' (es decir, la C está en la posición 5' respecto a la G en la posición 3'). Muchos ISS-ODN conocidos flanquean el motivo CG con por lo menos dos nucleótidos de purina (por ejemplo, GA or AA) y por lo menos dos nucleótidos de pirimidina (por ejemplo, TC o TT) para mejorar la actividad estimulatoria de los linfocitos B del polinucleótido inmunoestimulatorio (ver, por ejemplo, Krieg, et al., Nature, 374:546-549, 1995).
Funcionalmente, los ISS-ODN mejoran las respuestas inmunes celulares y humorales en un huésped, particularmente la proliferación de linfocitos y la liberación de citocinas (incluyendo IFN) mediante monocitos huésped y células asesinas naturales (NK). El ADN bacteriano contiene dinucleótidos CpG no metilados con una frecuencia de aproximadamente uno por cada 16 bases. Estos dinucleótidos están también presentes en ciertas especies virales, pero están claramente poco representados en especies vertebradas.
Se cree que la capacidad de las micobacterias, así como otras especies bacterianas y virales, para estimular la proliferación de linfocitos, producción de IL-12, producción del factor de necrosis tumoral (TNF), actividad de células asesinas naturales (NK) y secreción IFN-\gamma es debida a la presencia de ISS-ODN en ADN bacteriano y viral (ver, por ejemplo, Krieg, Trends in Microbiology, 4:73-76 (1996)). Por el contrario, la supresión y metilación de CpG en vertebrados puede ser una respuesta evolutiva a la amenaza de las infecciones bacterianas y virales. De manera interesante, recientemente se ha implicado también un oligonucleótido que contiene CpG comparable con el ISS-ODN bacteriano en el inicio y la exacerbación de enfermedades autoinmunes a través de una trayectoria dependiente del IL-12 (Segal, et al., J. Immunol., 158:5087 (1997)).
La inmunoestimulación mediante ISS-ODN sintético en vivo se produce mediante el contacto de linfocitos huésped con, por ejemplo, oligonucleótidos de ISS-ODN, los vectores de expresión recombinantes de conjugados oligonucleótidos de ISS-ODN y que contienen ISS (datos respecto a la actividad de los conjugados ISS-ODN y vectores ISS-ODN se indican en la solicitudes de patente solicitadas al mismo tiempo y del mismo titular Nº. 60/028,118 y 08/593,554; cuyos datos se incorporan aquí como referencia solamente para demostrar la actividad inmunoestimulatoria del ISS-ODN en vivo). Así, mientras el ISS-ODN microbiano nativo estimula a que el sistema inmune huésped responda a la infección, análogos sintéticos de estos ISS-ODN pueden ser terapéuticamente útiles para modular la respuesta inmune del huésped no solamente para antígenos microbianos, sino también para antígenos tumorales, alérgenos y otras substancias (id.).
Aunque la invención no está limitada mediante ninguna teoría respecto al mecanismo de acción del IIS-ON, se cree que compiten con el ISS-ODN para unirse a la membrana celular de los linfocitos huésped. La región del ISS-ODN que confiere su actividad inmunoestimulatoria se cree que es la longitud de 6 mer o más de nucleótidos que incluye un dinucleótido no metilado (por ejemplo, CpG). Por lo tanto, se cree que la presencia de una región de longitud de aproximadamente 6 mer o más que tiene por lo menos un dinucleótido de competencia (definido como [Y]-[Z] y [Y]-poli[Z] en las fórmulas indicadas a continuación) confiere actividad inhibitoria ISS en el IIS-ON de la invención.
Así, los compuestos inhibitorios de la invención son oligonucleótidos sintetizados (IIS-ON) que inhibe la actividad inmunoestimulatoria de los ISS-ON en vertebrados y en células inmunes de vertebrados.
Para identificar los IIS-ON entre un grupo de IIS-ONs sintetizados candidatos, las siguientes etapas proporcionan unos medios simples y eficientes para cribar rápidamente el grupo de candidatos:
a. Una población de linfocitos y/o monocitos cultivados estimulados con antígeno se contacta con un ISS-ODN para inducir la proliferación de linfocitos, la secreción de citocina IFN\beta, IFN-\alpha, IFN-\gamma, IL-12 y IL-18 y/o la producción de anticuerpo IgG2.
b. Se mide cualquier cambio en el número de linfocitos, niveles de citocinas IFN\beta, IFN-\alpha, IFN-\gamma, IL-12 y IL-18 secretadas, niveles de anticuerpos IgG1 o IgG2 o niveles de anticuerpo IgE en el cultivo celular después del contacto con el ISS-ODN.
c. Las células se contactan con el candidato IIS-ON.
d. Se mide cualquier cambio en el número de linfocitos, niveles de citocinas secretadas, niveles del anticuerpo IgG2 o niveles del anticuerpo IgE en la población de células después de contactar con el oligonucleótido.
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Una disminución de cualquiera de estos valores (excepto anticuerpos IgG1 y IgE) comparados con las mediciones tomadas en la etapa (2) indica que el oligonucleótido candidato es un IIS-ON de la invención; es decir, inhibe la actividad inmunoestimulatoria del ISS-ODN.
Alternativamente, un aumento en los niveles medidos de anticuerpos IgG1 o IgE es un indicador indirecto de un aumento en una respuesta de linfocitos de tipo Th2, que indica que la actividad estimulatoria Th1 del ISS-ODN ha disminuido en presencia del IIS-ODN. Las técnicas de ensayo adecuadas para su uso en la realización de las etapas anteriores se muestran en los ejemplos adjuntos. En vista de las enseñanzas de esta descripción, otras técnicas de ensayo para medir los cambios en la proliferación de linfocitos inducidos con ISS-ODN o la secreción de citocina serán evidentes para los expertos en la materia.
El procedimiento de cribado también se puede usar para detectar ISS-ODN en una muestra de células inmunes tomadas del huésped. Este aspecto de la invención es útil en la confirmación de la presencia de antígenos que contienen ISS-ODN (por ejemplo, antígenos microbianos) y autoantígenos en el huésped. Para este propósito, las etapas del procedimiento de cribado descrito anteriormente se modifican para incluir las etapas de:
a. Obtener una muestra de células inmunes del huésped, cuyas células se creen que están expuestas a un antígeno o autoantígeno.
b. Medir los niveles de proliferación de linfocitos en; secreción de citocina IFN\beta, IFN-\alpha, IFN-\gamma, IL-12 y IL-18 de; producción de anticuerpos IgG1 y IgG2 mediante; o producción de anticuerpo IgE mediante, la muestra de las células inmunes del huésped.
c. Contactar la muestra de las células inmunes del huésped con un IIS-ON.
d. Medir cualquier cambio en el número de linfocitos o niveles de citocinas secretadas IFN\beta, IFN-\alpha, IFN-\gamma, IL-12 y IL-18 y/o en los niveles de anticuerpos IgE o IgG1 en la muestra de células inmunes del huésped después de contactar con el IIS-ON, en el que una disminución en cualquiera de los valores medidos para la proliferación de linfocitos, secreción de citocina o producción del anticuerpo IgG2, así como un aumento en la producción de anticuerpos IgG1 y IgE, comparado con las mediciones tomadas en la etapa (b) indica que un ISS-ODN objeto de inhibición mediante el IIS-ON está presente en la muestra de células inmunes del huésped.
2. Estructura IIS-ON de ejemplo
Un IIS-ON particular que inhibe la actividad del IIS-ODN que contiene un motivo CpG incluye los oligonucleótidos que están comprendidos en la siguiente estructura primaria general:
5'-Purina-Purina-[Y]-[Z]-Pirmidina-Pirimidina-3' o
5'-Purina-Purina-[Y]-[Z]-Pirimidina-poliPirimidina-3'
en donde Y es cualquier nucleótido que se produce de manera natural o sintética excepto citosina y es preferiblemente guanosina, adenosina o inosina (para ARN IIS-ON), más preferiblemente guanosina. En general, Z es cualquier nucleótido que se produce de manera natural o sintética o la repetición del mismo nucleótido. Preferiblemente, si Y es inosina, Z es inosina o una o más guanosina(s). Si Y es guanosina, Z es preferiblemente guanosina o una o más citosina(s) no metiladas. Si Y es adenosina, Z es preferiblemente guanosina. Sin embargo, cuando Y no es guanosina, adenosina o inosina, Z es guanosina, adenosina o inosina. Más preferiblemente, las purinas 5' son el mismo nucleótido, porque son las pirimidinas 3'. Por ejemplo, si ** es YZ, las purinas 5' y las pirimidinas 3' pueden ser AA**TT, AG**TT, GA**TT, GG**TT, AA**TC, AG**TC, etc.
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La estructura del hexámero del núcleo del IIS-ON anterior se puede flanquear antes y/o después mediante cualquier número o composición de nucleótidos o nucleósidos. Sin embargo, el IIS-ON tendrá preferiblemente una longitud de 6 mer, o entre 6 y 45 mer de longitud, para mejorar la absorción del IIS-ON y minimizar las interacciones no específicas entre el IIS-ON y el vector de expresión recombinante o células huésped objetivo. Preferiblemente, cualquier secuencia que flanquea el IIS-ON presentes se construyen para coincidir con las secuencias flanqueadoras presentes en cualquier ISS-ODN conocido (tal como la secuencia flanqueadora DY1038 (TTGACTGTG******AGAGATGA), donde ****** es la secuencia de hexámero inmunoestimulatoria. Los expertos en la materia serán familiares, o pueden identificar fácilmente, las secuencias de nucleótidos reportadas de IIS-ODN conocido. Para facilidad de referencia en este respecto, las siguientes fuentes son especialmente útiles:
Yamamoto, et al., Microbiol. Immunol., 36:983 (1992)
Ballas, et al., J. Immunol., 157:1840 (1996)
Klinman, et al., J. Immunol., 158:3635 (1997)
Sato, et al., Science, 273:352 (1996)
Cada uno de estos artículos se incorpora aquí como referencia para el propósito de ilustrar el nivel de conocimiento en la técnica con referencia a la composición de nucleótido del ISS-ODN.
Los IIS-ON inhibitorios particulares de la invención incluyen los que tienen las siguientes secuencias de hexámero:
1. IIS-ODN que tiene dinucleótidos "GG": AAGGTT, AGGGTT, GGGGTT, GGGGTC, AAGGTC, AAGGCC, AGGGTC, GAGGTT, GAGGTC, GAGGCC, GGGGCT, etc.
2. IIS-ODN que tiene dinucleótidos "GC": AAGCTT, AGGCTC, AGGCCC, GAGCTT, GAGCTC, GAGCCC, GGGCTT, GGGCTC, GGGCCC, AAGCCC, AAGCCT, AGGCCT, GAGCCT, etc.
3. Sustituciones de inosina y/o adenosina para nucleótidos en las secuencias de hexámero anteriores hechas según las fórmulas indicadas anteriores.
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Los hexámeros de IIS-ON con una actividad inhibitoria esperada especialmente fuerte son aquellos con dinucleótidos de competencia GG y GC, particularmente AAGGTT (DY1019 en las fiuras), AAGCTT (DY1041 en las figuras), AGGGCT, y GAGGTT (que incluye sus análogos de Pirimidina-pPirimidina 3').
El IIS-ON puede ser un ADN de cadena simple o de cadena doble, ARN de cadena simple o doble y/o oligonucleósidos. Las bases de nucleótidos del IIS-ON que flanquean los dinucleótidos de competencia pueden ser las bases conocidas que se producen de manera natural o bases sintéticas no naturales (por ejemplo, TCAG o, en ARN, UACGI). Los oligonucleósidos se pueden incorporar en la región interna y/o terminales de los IIS-ON utilizando técnicas convencionales para el uso de puntos de fijación para otros compuestos (por ejemplo, péptidos). La(s) base(s), fracción de azúcar, grupos de fosfato y terminales de los IIS-ON se pueden modificar de cualquier manera conocida para los expertos en la materia para construir un IIS-ON que tiene las propiedades deseadas además de la actividad inhibitoria del IIS-ON. Por ejemplo, se pueden unir fracciones de azúcar a las bases de los nucleótidos del IIS-ON en cualquier configuración estérica. Además, las modificaciones del grupo fosfato de la espina dorsal (por ejemplo, enlaces internucleótidos de metilfosfonato, fosforotioato, fosforoamidato y fosforoditioato) pueden conferir actividad antimicrobiana en los IIS-ON, haciéndolos particularmente útiles en aplicaciones terapéuticas.
Las técnicas para hacer estas modificaciones de los grupos fosfato en los oligonucleótidos son conocidas en la técnica y no requieren una explicación detallada. Para revisión de una de estas técnicas útiles, se prepara y oxida un triéster de fosfato intermedio para el producto de oligonucleótido objetivo en el triéster de fosfato que se produce naturalmente con iodina acuosa o con otros agentes, tales como aminas anhidras. Los fosforamidatos de oligonucleótidos resultantes se pueden tratar con azufre para producir fosforotioatos. La misma técnica general (excepto la etapa de tratamiento con azufre) se puede aplicar para producir metilfosfoamiditas a partir de metilfosfonatos. Para más detalles con referencia a las técnicas de modificación de grupos de fosfato, los expertos en la materia pueden desear consultar las patentes US 4.425.732; 4.458.066; 5.218.103 y 5.453.496, así como Tetrahedron Lett. en 21:4149 (1995), 7:5575 (1986), 25:1437 (1984) y Journal Am. ChemSoc., 93:6657 (1987), cuyas descripciones se incorporan aquí para el único propósito de ilustrar el nivel estándar de conocimiento en la técnica referente a la preparación de estos compuestos.
Una modificación del grupo de fosfato particularmente útil es la conversión a formas fosforotioato o fosforoditioato de los oligonucleótidos IIS-ON. Además de sus propiedades potencialmente antimicrobianas, los fosforotioatos y fosforoditioatos son más resistentes a la degradación en vivo que sus partes contrarias de oligonucleótidos no modificadas, haciendo los IIS-ON de la invención más disponibles para el huésped.
Los IIS-ON se pueden sintetizar utilizando técnicas y equipos de síntesis de ácido nucleico que son bien conocidos en la técnica. Por referencia en este sentido, ver, por ejemplo, Ausubel, et al., Current Protocols in Molecular Biology, Chs. 2 y 4 (Wiley Interscience, 1989); Maniatis, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Lab., New York, 1982); Patente US 4.458.066 y Patente US 4.650.675. Estas referencias se incorporan aquí como referencia para el único propósito de demostrar el conocimiento en la técnica referente a la producción de oligonucleótidos sintéticos.
Alternativamente, se puede obtener IIS-ON mediante mutación de ISS-ON microbiano aislado para sustituir un dinucleótido de competición para el motivo CpG que se produce de manera natural. Los procedimientos de cribado que se basan en hibridización de ácido nucleico hacen posible aislar cualquier secuencia de polinucleótido de cualquier organismo, previendo que esté disponible la sonda o el anticuerpo adecuado. Las sondas de oligonucleótidos, que corresponden a una parte de la secuencia que codifica la proteína en cuestión, se pueden sintetizar químicamente. Esto requiere que se conozcan cortas cadenas de oligopéptido de la secuencia de aminoácido. La secuencia de ADN que codifica la proteína también se puede deducir del código genético, sin embargo, debe tenerse en cuenta la degeneración del código.
Por ejemplo, una librería de ADNc que se cree que contiene un polinucleótido que contiene ISS de interés se puede cribar mediante la inyección de varios ARNm derivados de ADNcs en oocitos, que permiten un tiempo suficiente para que se produzca la expresión de los productos de los genes de ADNc, y se prueba la presencia del producto de expresión de ADNc deseado, por ejemplo, mediante el uso del anticuerpo específico para un péptido codificado mediante el polinucleótido de interés o mediante el uso de sondas para los motivos repetidos y una características del diseño de expresión del tejido de un péptido codificado mediante el polinucleótido de interés. Alternativamente, una librería de ADNc se puede cribar indirectamente para la expresión de los péptidos de interés que tienen por lo menos un epítope que utiliza anticuerpos específicos para los péptidos. Estos anticuerpos pueden ser de manera policlonal o monoclonal derivados y usados para detectar un producto de expresión indicativo de la presencia del ADNc de interés.
Una vez se ha obtenido el polinucleótido que contiene ISS, se puede acortar a la longitud deseada, por ejemplo, mediante digestión enzimática utilizando técnicas convencionales. El motivo CpG en el producto oligonucleótido del ISS-ODN muta a continuación para sustituir un dinucleótido de competición para el motivo CpG. Las técnicas para hacer las mutaciones de sustitución en sitios particulares en el ADN que tiene una secuencia conocida son bien conocidas, por ejemplo mutagénesis de cebo M13 a través de PCR. Como el IIS-ON es no codificador, no hay ningún asunto respecto a mantener un marco de lectura abierto en la realización de la mutación de sustitución. Sin embargo, para uso en vivo, el material inicial del polinucleótido, el oligonucleótido de ISS-ODN intermedio o producto de mutación del IIS-ON se han de volver substancialmente puros (es decir, tan libres de contaminantes que se producen naturalmente y de LPS como sea posible utilizando técnicas conocidas y elegidos por parte de un experto en la
materia).
Los IIS-ON de la invención se pueden usar en solitario o se pueden incorporar en cis o en trans en un vector de expresión recombinante (plásmido, cósmido, virus o retrovirus) que puede, a su vez, codificar cualquier proteína terapéuticamente beneficiosa que se pueda suministrar por parte de un vector de expresión recombinante. Por motivos de conveniencia, los IIS-ON se administran preferiblemente sin incorporación en un vector de expresión. Sin embargo, si se desea la incorporación en un vector de expresión, esta incorporación se puede realizar utilizando técnicas convencionales que no requieran una explicación detallada a un experto en la materia. Para revisión, sin embargo, los expertos puede desear consultar Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, supra.
Brevemente, la construcción de vectores de expresión recombinantes utiliza técnicas de ligadura estándar. Para el análisis para confirmar las secuencias correctas en los vectores construidos, las mezclas de ligadura se pueden usar para transformar una célula huésped y transformadores exitosos seleccionados mediante resistencia antibiótica si es apropiado. Los vectores de los transformadores se preparan, analizan mediante restricción y/o secuencian, por ejemplo, mediante el procedimiento de Messing, et al., (Nucleic Acids Res., 9:309, 1981), el procedimiento de Maxam, et al., (Methods in Enzymology, 65:499,1980), u otros procedimientos adecuados que serán conocidos por parte de los expertos en la materia. La separación de tamaños de fragmentos desprendidos se realiza utilizando electroforesis de gel convencional tal como se describe, por ejemplo, por parte de Maniatis, et al., (Molecular Cloning, pp. 133-134, 1982).
Las células huésped se pueden transformar con los vectores de expresión de esta invención y cultivar en un medio nutriente convencional modificado como es apropiado para inducir los promotores, seleccionando transformadores o amplificando genes. Las condiciones de cultivo, tal como la temperatura, el pH y similares, son las usadas previamente con la célula huésped seleccionada para la expresión, y serán evidentes para el experto en la materia ordinario.
Si se utiliza un vector de expresión recombinante como portador para los IIS-ON de la invención, se prefieren particularmente plásmidos y cósmidos por su falta de patogenicidad. Sin embargo, los plásmidos y los cósmidos están sometidos a degradación en vivo más rápidamente que los virus y, por lo tanto, no proporcionan una dosificación adecuada de IIS-ON para inhibir substancialmente la actividad inmunoestimulatoria del IIS-ODN ejercida mediante un vector de terapia génica administrado de manera sistémica. De las alternativas de vectores virales, los virus adenoasociados poseerán la ventaja de su baja patogenicidad. La relativamente baja capacidad de los virus adenoasociados para la inserción de genes extraños no supondrá ningún problema en este contexto debido al tamaño relativamente pequeño en el que los IIS-ON de la invención se pueden sintetizar.
Otros vectores virales que se pueden utilizar en la invención incluyen adenovirus, virus adenoasociados, virus de herpes, vaccinia o un virus de ARN tal como un retrovirus. Los vectores retrovirales son preferiblemente derivados de una murina, retrovirus VIH aviario o humano. Ejemplos de vectores retrovirales en los un único gen extraño se puede insertar incluyen, pero no están limitados a: virus de leucemia de murina Moloney (MoMuLV), virus de sarcoma de murina Harvey (HaMuSV), virus de tumor mamario de murina (MuMTV), y virus de sarcoma Rous (RSV). Una pluralidad de vectores retrovirales adicionales pueden incorporar múltiples genes. Todos estos vectores pueden transferir o incorporar un ge para un marcador que se puede seleccionar, de manera que se pueden identificar y generar células transducidas.
Como los retrovirus recombinantes son defectuosos, requieren ayuda para producir partículas de vector infeccionas. Esta ayuda se puede proporcionar, por ejemplo, usando líneas celulares de ayuda que contienen plásmidos que codifican todos los genes estructurales de los retrovirus bajo el control de las secuencias regulatorias en el LTR. Estos plásmidos no disponen de una secuencia de nucleótido que permita al mecanismo de empaquetado reconocer una transcripción de ARN para encapsidación. Las líneas celulares de ayuda que tienen omisiones de la señal de empaquetado incluyen, pero no están limitadas a, \Psi2, PA317 y PA12, por ejemplo. Estas líneas celulares producen viriones vacíos, ya que no se empaqueta ningún genoma. Si se introduce un vector retroviral en estas células de ayuda en las que la señal de empaquetado está intacta, pero los genes estructurales se reemplazan por otros genes de interés, el vector se puede empaquetar y se puede producir el virión del vector.
Insertando una o más secuencias de interés en el vector viral, junto con otro gen que codifica el ligando para un receptor en una célula objetivo específica, por ejemplo, el vector se puede volver el objetivo específico. Los vectores retrovirales se pueden hacer objetivos específicos insertando, por ejemplo, un polinucleótido que codifica un azúcar, un glicolípido o una proteína. El objetivo preferido se cumple usando un anticuerpo para apuntar al vector retroviral. Los expertos en la materia sabrán, o pueden determinar fácilmente sin experimentación indebida, secuencias específicas de polinucleótidos que se pueden insertar en el genoma retroviral para permitir el suministro objetivo específico del vector retroviral que contiene los polinucleótidos de interés.
Alternativamente, se puede usar un sistema de dispersión coloidal para el suministro objetivo. Los sistemas de dispersión coloidal incluyen complejos macromoleculares, nanocápsulas, microesferas, cuentas y sistemas basados en lípidos que incluyen emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mezcladas, y liposomas. El sistema coloidal preferido de esta invención es un liposoma.
Los liposomas son vesículas de membrana artificial que son útiles como vehículos de suministro in vitro y en vivo. Se ha mostrado que grandes vesículas unilaminares (LUV), que varían en tamaño entre 0,2-4,0 \mum pueden encapsular un porcentaje substancial de un tampón acuoso que contiene grandes macromoléculas. ARN, ADN y viriones intactos se pueden encapsular en el interior acuoso y se pueden suministrar a células en una forma biológicamente activa (Fraley, et al., Trends Biochem. Sci., 6:77, 1981). Además de las células de mamíferos, los liposomsa se han usado para suministrar polinucleótidos en células de plantas, levadura y bacterias. Para que un liposoma sea un vehículo de transferencia génica eficiente, las siguientes características deben estar presentes: (1) encapsulación de los genes que codifican los polinucleótidos antisentido con una alta eficiencia mientras no se comprometa su actividad biológica; (2) unión preferente y substancial a una célula objetivo en comparación con células no objetivo; (3) suministro de contenidos acuosos de la vesícula al citoplasma celular objetivo con una alta eficiencia; y (4) expresión precisa y efectiva de información génica (Mannino, el al., Biotechniques, 6:682, 1988).
La composición del liposoma es usualmente una combinación de fosfolípidos, particularmente fosfolípidos de temperatura de transición de fase alta, usualmente en combinación con esteroides, especialmente colesterol. Otros fosfolípidos u otros lípidos también se pueden usar. Las características físicas de los liposomas dependen del pH, la resistencia iónica, y la presencia de cationes divalentes.
Ejemplos de lípidos útiles en la producción de liposomas incluyen compuestos de fosfatidilo, tales como fosfatidilglicerol, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, esfingolípidos, cerebrósidos, y gangliósidos. Particularmente útiles son los diacilfosfatidilgliceroles, donde la porción de lípido contiene de 14 a 18 átomos de carbono, particularmente entre 16 y 18 átomos de carbono, y está saturada. Los fosfolípidos ilustrativos incluyen fosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina y distearoilfosfatidilcolina.
El objetivo de los liposomas se puede clasificar basado en factores anatómicos y de mecanismos. La clasificación anatómica se base en el nivel de selectividad, por ejemplo, específicos de órganos, específicos de células, y específicos de orgánulos. El objetivo de mecanismos se puede distinguir basado en si es pasivo o activo. El objetivo pasivo utiliza la tendencia natural de los liposomas a distribuir las células del sistema retículo-endotelial (RES) en órganos que contienen capilares sinusoidales. El objetivo activo, por lo otro lado, implica la alteración del liposoma mediante el acoplamiento del liposoma a un ligando específico tal como un anticuerpo monoclonal, azúcar, glicolípido o proteína, o cambiando la composición o el tamaño del liposoma para conseguir apuntar a órganos y tipos celulares diferentes de los sitios de localización que se producen naturalmente.
La superficie del sistema de suministro objetivo se puede modificar en una variedad de maneras. En el caso de un sistema de suministro específico liposomal, los grupos de lípidos se pueden incorporar en la bicapa de lípidos del liposoma para mantener el ligando específico en asociación estable con la bicapa liposomal. Se pueden usar varios grupos de enlace bien conocidos para unir las cadenas de lípidos al ligando específico (ver, e.g., Yanagawa, et al., Nuc. Acids Symp. Ser., 19:189 (1988); Grabarek, et al., Anal.Biochem., 185:131 (1990); Staros, et al., Anal. Biochem., 156:220 (1986) y Boujrad, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5728 (1993), cuyas descripciones se incorporan aquí como referencia solamente para ilustrar el nivel estándar de conocimiento en la técnica respecto a la conjugación de oligonucleótidos en lípidos).
El suministro específico de IIS-ON también se puede conseguir mediante la conjugación de los IIS-ON en la superficie de los vectores de expresión recombinante virales y no virales, en un antígeno u otro ligando, en un anticuerpo monoclonal o en cualquier molécula que tenga la especificidad de unión deseada. Un conjugado de IIS-ODN particular de interés es uno en el que un autoantígeno o autoanticuerpo es el socio del conjugado de IIS-ODN. Los conjugados de autoantígeno de IIS-ODN son útiles en la activación de las respuestas inmunes de tipo Th2 del huésped en el autoantígeno (suprimiendo las respuestas Th1 inducidas mediante el propio autoantígeno; ver, por ejemplo, Conboy, et al., J. Exp. Med., 185:439-451 (1997)), mientras que los conjugados de anticuerpos de IIS-ODN son útiles en la inducción de inmunidad pasiva en un huésped que sufre una condición autoinmune. Procedimientos específicos para el suministro de estos conjugados, así como IIS-ON en general, se describen en mayor detalle infra.
Los expertos en la material ordinarios estarán familiarizados con, o pueden determinar fácilmente, las fuentes para autoantígenos y autoanticuerpos útiles como conjugados de IIS-ON. Ejemplos de estos materiales conjugados incluyen proteína básica de mielina (ver, por ejemplo, la información de secuencias y fuentes proporcionada en Segal, et al., J. Immunol., 158:5087 (1997); Matsuo, et al., Am. J. Pathol., 150:1253 (1997); and Schluesener, FEMS Immunol.Med.Microbiol., 17:179 (1997)); autoantígeno del síndrome de Sjorgen (ver, por ejemplo, Hanjei, et al., Science, 276:604 (1997)); autoantígeno de hemocromatosis (ver, por ejemplo, Ruddy, et al., Genome Res., 7:441 (1997)), proteína La/SSB (ver, por ejemplo, Castro, et al., Cell Calcium, 20:493 (1996)); autoantígeno de lupus HsEg5 (ver, por ejemplo, Whitehead, et al., Arthritis Rheum., 39:1635 (1996)); autoantígeno de lupus nuclear Ki (ver, por ejemplo, Paesen y Nuttal, Biochem. Biophys. Acta, 1309:9 (1996)); y anticuerpos para los mismos (ver, por ejemplo, Menon, et al., J. Autoimmun., 10:43 (1997) y Rahman, et al., Semin. Arthritis Rheum., 26:515 (1996) [anticuerpos monoclonales antifosfolípidos de humanos (anti-ADN)]; y, Kramers, et al., J. Autoimmun., 9:723 (1997) [autoanticuerpos monoclonales de lupus antinucleosoma]). Cada una de las referencias citadas se incorpora aquí solamente para ilustrar el nivel de conocimiento y la práctica en la técnica referente a la identidad, actividad y estructura de autoantígenos y autoanticuerpos.
Ejemplos de otros socios conjugados útiles incluyen cualquier antígeno inmunogénico (incluyendo alérgenos, partículas virales vivas y atenuadas y antígenos tumorales), péptidos específicos (tales como ligandos receptores, anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, hormonas y enzimas), antígenos no peptídicos (acoplados a través de un enlace péptido, tales como lípidos, polisacáridos, glicoproteínas, gangliósidos y similares) y citosinas (incluyendo interleucinas, interferones, eritorpoietina, factor de necrosis tumoral y factores de estimulación de colonias). Estos socios conjugados se pueden preparar según técnicas convencionales (por ejemplo, síntesis de péptidos) y están disponibles comercialmente.
Los expertos en la materia también estarán familiarizados con, o podrán determinar fácilmente, procedimientos útiles en la preparación de conjugados de oligonucleótido-péptido. La conjugación se puede realizar en cualquier terminal del IIS-ON o en una base adecuadamente modificada en una posición interna (por ejemplo, una citosina o uracil). Como referencia, se conocen procedimientos para conjugar oligonucleótidos en proteínas y en fracciones de oligosacáridos de Ig (ver, por ejemplo, O'Shannessy, et al., J.Applied Biochem., 7:347 (1985), cuya descripción se incorpora aquí como referencia solamente para ilustrar el nivel estándar de conocimiento en la técnica referente a la conjugación de oligonucleótidos). Otra referencia útil es Kessler: "Nonradioactive Labeling Methods for Nucleic Acids", en Kricka (ed.), Nonisotopic DNA Probe Techniques (Acad.Press, 1992)).
Brevemente, ejemplos de procedimientos de conjugación adecuados conocidos incluyen: conjugación a través de fijación 3' a través de química de soporte sólido (ver, por ejemplo, Haralambidis, et al., Nuc. Acids Res., 18:493 (1990) y Haralambidis, et al., Nuc. Acids Res., 18:501 (1990) [síntesis de soporte sólido de socio de péptido]; Zuckermann, et al., Nuc. Acids Res., 15:5305 (1987), Corey, et al., Science, 238:1401 (1987) y Nelson, et al., Nuc. Acids Res., 17:1781 (1989) [síntesis de soporte sólido de socio de olignucleótido]). Los enlaces del grupo amino-amino se pueden realizar tal como se describe en Benoit, et al., Neuromethods, 6:43 (1987), mientras que los enlaces del grupo tiol-carboxil se pueden realizar como se describe en Sinah, et al., Oligonucleotide Analogues: A Practical Approach (IRL Press, 1991). En estos últimos procedimientos, el socio del oligonucleótido se sintetiza sobre un soporte sólido y un grupo de enlace que comprende una amina protegida, tiol o grupo carboxil opuesto a la fosforamidita se fija de manera covalente con el 5'-hidroxil (ver, por ejemplo, las patentes US 4.849.513; 5.015.733; 5.118.800 y 5.118.802).
El enlace del socio del oligonucleótido a un péptido se puede realizar también a través de la incorporación de un brazo de enlace (por ejemplo, gripo amino o carboxil) a una base de citosina o uracil modificada (ver, por ejemplo, Ruth, 4th Annual Congress for Recombinant DNA Research at 123). También se pueden usar enlaces de afinidad (por ejemplo biotina-estreptavidina) (ver, por ejemplo, Roget, et al., Nuc. Acids Res., 17:7643 (1989)).
También se conocen procedimientos para enlazar oligonucleótidos con lípidos e incluyen la síntesis de conjugados de oligo-fosfolípidos (ver, por ejemplo, Yanagawa, et al., Nuc. Acids Symp.Ser., 19:189 (1988)), síntesis de conjugados de ácidos oligo-grasos (ver, por ejemplo, Grabarek, et al., Anal. Biochem., 185:131 (1990)) y conjugados oligo-esterol (ver, por ejemplo, Boujrad, et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90:5728 (1993)).
Cada una de las referencias anteriores se incorpora aquí como referencia con el único propósito de ilustrar el nivel de conocimiento y habilidad en la técnica respecto a los procedimientos de conjugación de oligonucleótidos.
Si se suministra sin el uso de un vector u otro sistema de suministro, los IIS-ON se prepararán en una composición farmacéuticamente aceptable. Los portadores farmacéuticamente aceptables preferidos para su uso con los IIS-ON de la invención pueden incluir soluciones acuosas o no acuosas estériles, suspensiones y emulsiones. Ejemplos de solventes no acuosos son propileno glicol, polietileno glicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como etil oleato. Los portadores acuosos incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, incluyendo medios salinos y tamponados. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, aceites de Ringer lactados o fijos. Los vehículos intravenosos incluyen reponedores de fluidos y nutrientes, reponedores de electrolitos (tales como los basados en dextrosa de Ringer), y similares. También pueden estar presentes preservativos y otros aditivos tales como, por ejemplo, agentes antimicrobianos, antioxidantes, quelantes, y gases inertes y similares. Una composición de IIS-ON también se puede liofilizar usando medios bien conocidos en la técnica, para la posterior reconstitución y uso según la invención.
B. Procedimientos para Administrar y Usar IIS-ON de la Invención
Los IIS-ON de la invención son útiles en la inhibición de la actividad inmunoestimulatoria de los ISS, siempre que estén presentes. Así, los IIS-ON son útiles como, por ejemplo, agentes antiinflamatorios para reducir las respuestas inmunes del huésped a los ISS-ODN en bacterias y virus. Los IIS-ON son también útiles como agentes para suprimir la actividad inmunoestimulatoria de cualquier ISS-ODN, conocido o desconocido, presente en vectores de expresión recombinante, especialmente los usados para terapia génica e inmunización. Además, los IIS-ODN son útiles en la inhibición de respuestas autoinmunes del huésped estimuladas mediante ISS-ODN microbiano y en la activación de respuestas de tipo Th2 al antígeno.
En este contexto, "inhibición" se refiere a una reducción en la respuesta inmune del huésped comparada con el nivel de respuesta inmune del huésped estimulado con ISS-ODN antes de la administración del IIS-ODN. Como el IIS-ODN estimula la secreción de estimulación de ciertas citocinas (por ejemplo, IL-12, IL-18 y IFNs) y tiende a cambiar la respuesta inmune celular del huésped al repertorio Th1, la medición de los niveles de citocina, proliferación de linfocitos estimulados con citocina, niveles de anticuerpos IgG2 (cuya producción es indicativa de una respuesta de linfocitos Th1), niveles IgE (cuya supresión es indicativa de una respuesta de linfocitos Th1) y niveles de anticuerpos IgG1 (cuya producción es indicativa de una respuesta de linfocitos Th2) son todos valores adecuados para su uso en la detección de actividad inhibitoria del IIS-ODN. Ejemplos y detalles específicos de procedimientos para determinar estos valores se describen también a continuación.
Respecto a los cambios en el repertorio Th1/Th2 y los consiguientes cambios en los niveles de citocina, es útil recordar que los linfocitos CD4+ generalmente caen en uno de dos subconjuntos distintos; es decir, las células Th1 y Th2. Las células Th1 segregan principalmente IL-2, IFN\gamma y TNF\beta (cuyos últimos dos median en la activación macrófaga y retrasan el tipo de hipersensibilidad), mienras que las células Th2 principalmente segregan IL-4 (que estima la producción de anticuerpos IgE), IL-5, IL-6 y IL-10. Estos subconjuntos CD4+ ejercen una influencia negativa entre sí; es decir, la secreción de linfocinas Th1 inhibe la secreción de linfocinas Th2 y viceversa. Además, se cree que la exposición de las células Th2 a linfocitos T citotóxicos (CTLs) también suprime la actividad celular TH2.
Los factores que se creen que favorecen la activación Th1 se parecen a los inducidos mediante infección viral e incluyen patógenos intracelulares, exposición a IFN-\beta, IFN-\alpha, IFN\gamma, IL-12 y IL-18, así como la presencia de APCs y la exposición a bajas dosis de antígeno. Las respuestas inmunes de tipo Th1 también predominan en las enfermedades autoinmunes. Los factores que se creen que favorecen la activación Th2 incluyen la exposición a IL-4 y IL-10, la actividad APC sobre la parte de linfocitos B y altas dosis de antígeno. Las células Th1 activas (IFN\gamma) mejoran la inmunidad celular y, por lo tanto, de particular valor en la respuesta a infecciones intracelulares, mientras que las células Th2 activas mejoran la producción de anticuerpos y, por lo tanto, son de valor en la respuesta a las infecciones extracelulares (a pesar del riesgo de eventos anafilácticos asociados con la inducción estimulada de IL-4 de producción de anticuerpo IgE). Así, la capacidad de cambiar respuestas inmunes del huésped del repertorio Th1 al Th2 y viceversa tiene una significancia clínica substancial para mejorar y controlar la inmunidad del huésped contra infecciones y alergias. Además, el control sobre la liberación mediada de citocinas Th1/Th2 permite controlar las respuestas immunes del huésped a los auto-antígenos (que tienen significancia clínica para el tratamiento de enfermedades autoinmunes) y para antígenos de vector de expresión recombinante (que tienen significancia clínica para el control de la expresión génica para terapia génica e inmunización génica).
Para su uso en la modulación, la inmunogenicidad de un vector de expresión recombinante, los IIS-ON de la invención se administrarán según cualesquiera medios y rutas mediante las cuales el vector de expresión recombinante específico se administra a un huésped, incluyendo rutas in vivo y ex vivo. La absorción del IIS-ON por parte de células del huésped se produce por lo menos de manera tan robusta como la absorción de la terapia y los vectores de inmunización, si no más debido al pequeño tamaño de los IIS-ON comparado con las dimensiones totales de los ácidos nucleicos plásmido, viral y retroviral.
Un objetivo particular de la administración de IIS-ON en este contexto es la inhibición de ISS-ODN estimulado, la producción de citocina mediada Th1. Así, una reducción que se puede medir de estos niveles de citocina en un huésped tratado constituye la actividad terapéutica del IIS-ON en esta realización de la invención. La actividad terapéutica del IIS-ON también se demuestra en este contexto mediante la prolongación de la expresión génica, comparada con los niveles de expresión obtenidos en ausencia de IIS-ON. Los expertos en la materia en las técnicas de terapia e inmunización génica estarán muy familiarizados con, o pueden determinar fácilmente, medios clínicamente aceptables y rutas de administración de vectores de terapia e inmunización y, por extensión, IIS-ON.
Para su uso como agentes antiinflamatorios, los IIS-ON y los conjugados IIS-ON se administrarán según cualesquiera medios y rutas mediante las cuales se administran antiinflamatorios y antibióticos conocidos. Un objetivo particular de la administración de IIS-ODN en este contexto es la inhibición de la producción de citocina mediada Tg1 estimulada con ISS-ODN. Así, una reducción que se puede medir de estos niveles de citocina en un huésped tratado constituye la actividad terapéutica del IIS-ODN en esta realización de la invención. Los expertos en la materia en el tratamiento de enfermedades infecciosas estarán muy familiarizados con, o pueden determinar muy fácilmente, los medios y las rutas clínicamente aceptables para la administración de antiinflamatorios y antibióticos y, por extensión, IIS-ON y sus conjugados.
Para su uso como moduladores autoinmunes, los IIS-ON y los conjugados de autoantígeno o autoanticuerpo IIS-ON se administrarán según cualesquiera medios y rutas mediante las cuales se practican terapias conocidas para enfermedades autoinmunes. Un objetivo particular de la administración de IIS-ODN en este contexto es la inhibición de la producción de IL-12 mediada con Th1 estimulada con ISS-ODN. Así, una reducción que se puede medir de los niveles de IL-12 en un huésped autoinmune constituye la actividad terapéutica del IIS-ODN en esta realización de la invención. Los expertos en la materia en el tratamiento de enfermedades infecciosas estarán muy familiarizados con, o pueden determinar muy fácilmente, los medios y las rutas clínicamente aceptables para la administración de IIS-ON y sus conjugados.
Para su uso como moduladores de ISS-ODN administrado con inmunoestimulantes, los IIS-ON y los conjugados IIS-ON de la invención se administrarán según cualesquiera medios y rutas mediante las cuales el ISS-ODN específico se administra a un huésped, incluyendo rutas in vivo y ex vivo. Por ejemplo, si los ISS-ODN se administran como adyuvantes en un protocolo de inmunización (ver, las solicitudes de patente US presentadas al mismo tiempo y del mismo titular Nº. 60/028.118 y 08/593.554), puede ser deseable poder reducir o eliminar posteriormente la actividad inmunoestimulatoria del ISS-ODN para modificar el transcurso de la terapia. En este contexto, por lo tanto, los IIS-ON sirven como conmutadores "off" ISS-ODN, con lo cual se demuestra la actividad de los IIS-ON y los conjugados de IIS-ON mediante una reducción medida en la producción de citocina estimulada con ISS-ODN, la producción de linfocitos estimulada con IIS-ODN, o un cambio del repertorio de linfocitos Th1.
Para su uso como adyuvantes para respuestas inmunes de Th2 a antígeno extracelular, la IIS-ON de la invención se administrará según cualesquiera medios y rutas mediante las cuales vacunas basadas en antígenos se pueden administrar a un huésped. Los cambios del repertorio de linfocitos Th1 son una medida de la eficacia para el uso de IIS-ON y conjugados de IIS-ON como adyuvantes estimulatorios de linfocitos Th2 en presencia de antígeno.
Una ventaja particular del IIS-ON de la invención es su capacidad de ejercer una actividad inhibitoria del ISS-ODN incluso con dosis relativamente bajas. Aunque la dosificación utilizada variará dependiendo de los objetivos clínicos a conseguir, un intervalo de dosis adecuadas es el que proporciona hasta aproximadamente 1-200 \mug de IIS-ON/ml de portador en una sola dosis. En vista de las enseñanzas proporcionadas mediante esta descripción, los expertos en las técnicas clínicas estarán familiarizados con, o podrán determinar fácilmente, los parámetros adecuados para la administración de IIS-ON según la invención.
En este respecto, la actividad inhibitoria del IIS-ON depende esencialmente de la dosis. Por lo tanto, para aumentar la potencia del IIS-ON en una magnitud de dos, cada dosis simple se dobla en concentración. Para su uso en la inhibición de la actividad del ISS-ODN (incluyendo la actividad del ISS-ODN en vectores de expresión recombinante), es útil administrar los IIS-ON y los ISS-ODN específicos o vectores en dosis equivalentes, a continuación aumentar la dosis de IIS-ON como sea necesario para conseguir el nivel deseado de inhibición. Para su uso como agente antiinflamatorio, es útil administrar los IIS-ON en una dosis baja (por ejemplo, de aproximadamente 1 \mug/ml a aproximadamente 50 \mug/ml), a continuación aumentar la dosis como sea necesario para conseguir el objetivo terapéutico deseado. Alternativamente, una dosificación específica de IIS-ON se puede considerar de aproximadamente 1-10 \muM en una muestra de sangre del huésped extraída dentro de las primeras 24-48 horas después de la administración del IIS-ON.
Para maximizar la efectividad del IIS-ON para inhibir la actividad inmunoestimulatoria del ISS-ODN, los IIS-ON se coadministran preferiblemente con los ISS-ODN i vector de expresión recombinante específicos. Además, los IIS-ON se pueden incubar previamente con el vector de expresión recombinante específico antes de la administración al huésped para reducir la capacidad de este último a la actividad inmunoestimulatoria del ISS-ODN presente en el huésped durante el tratamiento en un régimen de terapia o inmunización. Para su uso como antiinflamatorio, los IIS-ON se pueden coadministrar con, o tomarse de otra manera por parte de un huésped tratado, otros productos farmacéuticos antiinflamatorios.
Para estos propósitos, los IIS-ON se suministran convenientemente en viales de dosis simples y/o en conjuntos junto con dosis adecuadas de ISS-ODN, vectores de expresión o agentes antiinflamatorios. En conjuntos que incluyen vectores de expresión recombinantes, los IIS-ON y los vectores se pueden premezclar en viales de dosis simples. Si se requiere, medios para administrar cada dosis a un huésped (por ejemplo, jeringuillas, parches transdermales, dispositivos de iontoforesis e inhaladores). A continuación se indican ejemplos que ilustran la actividad inmunoinhibitoria de los IIS-ON. Los ejemplos son solamente por propósitos de referencia y no deben construirse para limitar la invención, que se define mediante las reivindicaciones adjuntas. Todas las abreviaciones y términos usados en los ejemplos tienen su significado esperado y ordinario, a menos que se especifique lo contrario.
Ejemplo I Ensayo para confirmar la actividad inhibitoria del IIS-ON medida mediante una reducción en la proliferacaión de linfocitos
Se cultivaron esplenocitos de ratón Balb/c hembra inmulógicamente naive (6-8 semanas de edad) de cada animal. Supernatantes de los esplenocitos cultivados se incubaron con 1 \mug/ml del ISS-ODN DY1018 ISS-ODN o 1 \mug/ml del ISS-ODN DY1038 en salino normal (todas las secuencias de oligonucleótidos se indican en la leyenda de las figuras y en la descripción de los dibujos). Las columnas vertebrales de DY1018 y DY1038 se modificaron como fosforotioatos. En este contexto, los ISS-ODN sirvieron como adyuvantes no específicos para estimulación in vitro del sistema inmune.
Dentro de las 4 horas de contacto con ISS-ODN, los supernatantes se incubaron con varias concentraciones de IIS-ON o un control. DY1039 (un ISS con la citosina metilada), DY1040 y DY1043 (este último con dinucleótidos en lugar del dinucleótido CG de DY1018 y DY1038) sirvieron como controles. Para confirmar la posición de la competición potencial con DY1018 y DY1038, todos los oligonucleótidos eran idénticos a DY1038 (figuras 1 y 3) o DY1018 (figura 2) excepto para las regiones de hexámero identificadas en las figuras y DY1043 (un control de secuencia irrelevante).
Se midió la proliferación de linfocitos antes y después de la administración de IIS-ODN (como una función de cuentas por minuto) utilizando técnicas de ensayo convencionales. Cualquier cambio observable en la proliferación de linfocitos entre los supernatantes se anotó. Los valores mostrados en las figuras 1 a 3 son los promedios para cada grupo de ratones probado.
Los resultados de estos ensayos se muestran en las figures 1 a 3. Respecto a DY1038 (figuras 1 y 3) y DY1018 (figura 2), la inhibición de la actividad inmunoestimulatoria del ISS mediante IIS-ON inhibitorio de la invención en estos experimentos se demostró mediante IIS-ON DY1019 (que tiene una región de hexámero que consiste en AAGGTT). Otro IIS-ON inhibitorio fuertemente probado fue DY1048 (región de hexámero=GAGGTC), DY1050 (región de hexámero=AGGGCT), DY1060 (región de hexámero=TTGCAA) y DY1041 (región de hexámero=AAGCTT) (figura 3). La fuerza inhibitoria fue dependiente de la dosis en una relación generalmente proporcional de dosis en la reducción en la proliferación de linfocitos medida.
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Ejemplo II Ensayo para confirmar la actividad inhibitoria del IIS-ON medida mediante una reducción en la secrección de INF-\gamma
Grupos de ratones se inmunizaron tal como se describe en el Ejemplo 1, se sacrificaron y sus esplenocitos se cultivaron. Los supernatantes de los espelnocitos cultivados se incubaron con 1 \mug/ml de DY1018 ISS-ODN en salino tal como se describe en el Ejemplo I. Dentro de las 4 horas, los supernantantes se incubaron con varias concentraciones de IIS-ON o un control. DY1039 (un ISS con la citosina metilada), DY1040 y DY 1043 (este ultimo con dincucleótidos CC en lugar del dinucleótido CG de DY1018) sirvieron como controles (todas las secuencias de oligonucleótidos se indican en la leyenda de las figuras y en la descripción de los dibujos. Para confirmar la posición de la competición potencial con DY1018, todos los oligonucleótidos eran idénticos a DY1018 excepto para las regiones de hexámero identificadas y DY1043 (un control de secuencia irrelevante).
Se midieron los niveles de IFN-\gamma antes y después del contacto con IIS-ODN. Cualquier cambio observable en la secreción de IFN-\gamma (pg/ml de supernatantes) entre los supernatantes se anotó. Los valores mostrados en la figura 4 son los promedios para cada grupo de ratones probado.
Los resultados de estos ensayos se muestran en la figura 4. Otra vez, la inhibición más fuerte de la actividad inmunoestimulatoria del ISS mediante los IIS-ON inhibitorios de la invención en estos experimentos se demostró mediante IIS-ON DY1019 (que tiene una región de hexámero que consiste en AAGGTT). DY1041 (region de hexémero=AAGCTT) también fue muy inhibitorio, incluso en bajas dosis (1 \mug/ml salino). En una dosis mayor (10 \mug/ml), los niveles de INF-\gamma empezaron a disminuir también en los ratones de control.
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Ejemplo III Activación de IIS-ODN de las respuestas inmunes de tipo Th2 al antígeno
Grupos de cuatro ratones Balb/c se coinmunizaron con 10 \mug de antígeno \beta-galactosidasa y 50 \mug (en 50 \mul de salino normal) de IIS-ODN DY1019 (identificado en la figura como \beta-gal/M-ODN), la composición de ISS-ODN \beta-gal/ISS-ODN (5'-AATTCAACGTTCGC-3'), el antígeno \beta-gal y pKISS-3 (un plásmido que tiene tres copias del hexámero AACGTT ISS-ODN en la espina dorsal), el antígeno \beta-gal y pKISS-0 (un plásmido de control que no tiene copias del hexámero AACGTT ISS-ODN en la espina dorsal), o salino solamente. Las respuestas Th2 en cada grupo se midieron mediante ELISA como una función de los niveles IgE obtenidos después de la activación. Tal como se muestra en la figura 5, las respuestas potentes de tipo Th2 (por encima de 1000 CPM) se obtuvieron solamente en los ratones que recibieron salino (aproximadamente 1200 CPM en 1 semana después de la activación) y \beta-gal/M-ODN (aproximadamente 1750 CPM en 1 semana después de la activación).
Además, se indujeron altos niveles de anticuerpos IgG2a y bajos niveles de anticuerpos IgG1 (respuestas de tipo Th1 y Th2, respectivamente) en respuesta al antígeno en los ratones tratados con ISS-ODN, mientras que se obtuvieron respuestas opuestas en los ratones tratados con IIS-ON, mostrando así un cambio hacia el repertorio Th2 en este último grupo.
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Referencias citadas en la descripción
Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este respecto.
Documentos de patente citados en la descripción
\bullet WO 9602555 A [0006]
\bullet WO 9526204 A [0006]
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\bullet US 4425732 A [0039]
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\bullet US 5218103 A [0039]
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\bullet US 5015733 A [0062]
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\bullet US 08593554 B [0075]
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Claims (29)

1. Procedimiento para la identificación de un oligonucleótido (IIS-ON) que inhibe la actividad inmunoestimulatoria de ISS-ODN, que comprende:
(a) contactar una población de células inmunes estimuladas con antígenos con un polinucleótido inmunoestimulatorio (ISS-ODN) que incluye por lo menos un motivo 5'-CG-3' no metilado para inducir la proliferación de linfocitos en secreción de citocinas IFN\beta, IFN-\alpha, IFN-\gamma, IL-12 y IL-18 de, la producción de anticuerpos IgG1 mediante, o la supresión de IgE en, la población de células inmunes estimuladas con antígenos;
(b) medir cualquier cambio en el número de linfocitos o los niveles de citocinas secretadas y/o los niveles de anticuerpos IgE o IgG1 en la población de células estimuladas con antígenos después de contactar con el ISS-ODN;
(c) contactar la población de células estimuladas con antígenos con un oligonucleótido inhibitorio IIS-ON candidato, comprendiendo dicho IIS-ON una secuencia de nucleótidos hexamérica de fórmula 5'-Purina-Purina-[Y]-[Z]-Pirimidina-Pirimidina-3' o 5' Purina-Purina-[Y]-[Z]-poli(Pirimidina)-3'; en la que Y es cualquier nucleótido que se produce naturalmente o sintético excepto citosina y Z es cualquier nucleótido que se produce naturalmente o sintético y en la que cuando Y no es guanosina o inosina, Z es guanosina o inosina; y
(d) medir cualquier cambio en el número de linfocitos o los niveles de citocinas IFN\beta, IFN-\alpha, IFN-\gamma, IL-12 y IL-18 secretadas y/o los niveles de anticuerpos IgE o IgG1 en la población de células estimuladas con antígenos después de contactar con el oligonucleótido, en el que una disminución en cualquiera de los valores medidos para la proliferación de linfocitos, secreción de citocinas, o producción de anticuerpo IgG1, así como un aumento en la producción de anticuerpo IgE, comparado con las mediciones tomadas en la etapa (b) indica que el oligonucleótido inhibe la actividad inmunoestimulatoria del ISS-ODN de la etapa (a).
\vskip1.000000\baselineskip
2. Composición farmacéutica, que comprende:
a) un oligonucleótido que comprende una secuencia de nucleótido hexamérica de fórmula 5'-Purina-Purina-[Y]-[Z]-Pirimidina-Pirimidina-3' o 5' Purina-Purina-[Y]-[Z]-poli(Pirimidina)-3'; en la que Y es cualquier nucleótido que se produce naturalmente o sintético excepto citosina y Z es cualquier nucleótido que se produce naturalmente o sintético y en la que cuando Y no es guanosina o inosina, Z es guanosina o inosina, en la que dicho oligonucleótido presenta un efecto inmunoinhibitorio contra un polinucleótido inmunoestimulatorio que incluye por lo menos un motivo 5'-CG-3' no metilado; y
b) un portador farmacéuticamente aceptable, para su uso en un procedimiento de inhibición de la estimulación mediante una secuencia inmunoestimulatoria que comprende por lo menos un motivo CG no metilado.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Composición para su uso según la reivindicación 2, en la que Y es guanosina o inosina.
4. Composición para su uso según la reivindicación 2 ó 3, en la que Y es inosina y Z es inosina o guanosina.
5. Composición para su uso según la reivindicación 2 ó 3, en la que Y es guanosina y Z es guanosina o una citosina no metilada.
6. Composición para su uso según la reivindicación 2, en la que dicha secuencia de nucleótido hexamérico se selecciona entre AAGGTT, AAGGTC, AAGGCC, AGGGTT, AGGGTC, AGGGCT, GGGGTT, GGGGTC, GGGGCT, GAGGTT, GAGGTC, GAGGCC, AAGCTT, AAGCTC, AAGCCC, AAGCCT, AGGCTC, AGGCCC, AGGCCT, GGGCTT, GGGCTC, GGGCCC, GAGCTT, GAGCTC, GAGCCC y GAGCCT.
7. Composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en la que el oligonucleótido tiene una longitud de 6 nucleótidos a 45 nucleótidos.
8. Composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, en la que dicho oligonucleótido comprende una o más modificaciones de espina dorsal de fosfato.
9. Composición para su uso según la reivindicación 8, en la que la espina dorsal de fosfato comprende un enlace de fosforotioato.
10. Composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9, en la que el oligonucleótido se conjuga a un péptido.
11. Composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10, para reducir la inflamación en un huésped en respuesta a una infección microbiana.
12. Composición para su uso según la reivindicación 11, en la que el microbio está presente en un huésped vertebrado.
13. Composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10, para prolongar la expresión génica de un vector de expresión recombinante que se cree que contiene por lo menos un oligodeoxinucleótido inmunoestimulatorio (ISS-ODN).
14. Composición para su uso según la reivindicación 13, en la que el vector de expresión recombinante está presente en un huésped vertebrado.
15. Composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 14, para activar la respuesta inmune de tipo Th2 a un antígeno.
16. Composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 14, para reducir la producción de citocina mediada con Th1 en un individuo.
17. Composición para su uso según la reivindicación 16, en la que la citocina mediada con Th1 se selecciona entre IL-12, interferon-\gamma, y necrosis tumoral de factor-\beta.
18. Procedimiento para detectar actividad inmunoestimulatoria de ISS-ODN en un huésped, que comprende:
(a) proporcionar una muestra de células inmunes obtenidas de un huésped, cuyas células se creen que han sido expuestas a un antígeno o autoantígeno;
(b) medir los niveles de de proliferación de linfocitos en; la secreción de citocina de IFN\beta, IFN-\alpha, IFN-\gamma, IL-12 y IL-18 en; la producción de anticuerpos IgG1 mediante; o la supresión de IgE en, la muestra de células inmunes del huésped;
(c) contactar la muestra de células inmunes del huésped con un oligonucleótido (IIS-ON) que comprende una secuencia de nucleótido hexamérico de fórmula 5'-Purina-Purina-[Y]-[Z]-Pirimidina-Pirimidina-3' o 5' Purina-Purina-[Y]-[Z]-poli(Pirimidina)-3'; en la que Y es cualquier nucleótido que se produce naturalmente o sintético excepto citosina y Z es cualquier nucleótido que se produce naturalmente o sintético y en la que cuando Y no es guanosina o inosina, Z es guanosina o inosina, en la que dicho oligonucleótido presenta un efecto inmunoinhibitorio contra un polinucleótido inmunoestimulatorio que incluye por lo menos un motivo 5'-CG-3' no metilado; y
(d) medir cualquier cambio en el número de linfocitos o los niveles de citocinas IFN\beta, IFN-\alpha, IFN-\gamma, IL-12 y IL-18 secretadas y/o los niveles de anticuerpos IgE o IgG1 en la población de células estimuladas con antígenos después de contactar con el ISS-ON, en el que una disminución en cualquiera de los valores medidos para la proliferación de linfocitos, secreción de citocinas, o producción de anticuerpo IgG2, así como un aumento en la producción de anticuerpos IgG1 o IgE, comparado con las mediciones tomadas en la etapa (b) indica que un IIS-ON está presente en la muestra de células inmunes del huésped.
\vskip1.000000\baselineskip
19. Utilización de una composición farmacéutica, que comprende:
(a) un oligonucleótido que comprende una secuencia de nucleótido hexamérica de fórmula 5'-Purina-Purina-[Y]-[Z]-Pirimidina-Pirimidina-3' o 5' Purina-Purina-[Y]-[Z]-poli(Pirimidina)-3'; en la que Y es cualquier nucleótido que se produce naturalmente o sintético excepto citosina y Z es cualquier nucleótido que se produce naturalmente o sintético y en la que cuando Y no es guanosina o inosina, Z es guanosina o inosina, en la que dicho oligonucleótido presenta un efecto inmunoinhibitorio contra un polinucleótido inmunoestimulatorio que incluye por lo menos un motivo 5'-CG-3' no metilado; y
b) un portador farmacéuticamente aceptable, para la fabricación de un medicamento para inhibir la estimulación mediante una secuencia inmunoestimulatoria que comprende por lo menos un motivo CG no metilado.
\vskip1.000000\baselineskip
20. Utilización según la reivindicación 19, en la que Y es guanosina o inosina.
21. Utilización según la reivindicación 19 ó 20, en la que Y es inosina y Z es inosina o guanosina.
22. Utilización según la reivindicación 19 ó 20, en la que Y es guanosina y Z es guanosina o una citosina no metilada.
23. Utilización según una cualquiera de las reivindiaciones 19 a 22, en la que el oligonucleótido tiene una longitud de 6 nucleótidos a 45 nucleótidos.
24. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 23, para reducir la inflamación en un huésped en respuesta a una infección microbiana.
25. Utilización según la reivindicación 24, en la que el microbio está presente en un huésped vertebrado.
26. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 25 para prolongar la expresión génica de un vector de expresión recombinante que se cree que contiene por lo menos un oligodeoxinucleótido inmunoestimulatorio (ISS-ODN).
27. Utilización según la reivindicación 26, en la que el vector de expresión recombinante está presente en un huésped vertebrado.
28. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 27, para activar la respuesta inmune de tipo Th2 a un antígeno.
29. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 27, para reducir la producción de citocina mediada con Th1 en un individuo.
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