JP5048524B2 - 植物における、化学物質による外来遺伝子の誘導発現方法 - Google Patents
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Description
前者の例としては、具体的には例えば、熱誘導性システム(例えば、特許文献1参照)、低温誘導性システム(例えば、特許文献2参照)、植物病原体の攻撃により誘導されるシステム(例えば、特許文献3参照)等が挙げられる。これらは、誘導性プロモーターを目的とする外来遺伝子の上流に連結してなる遺伝子構造体を構築し当該遺伝子構造体を利用するだけでよく、当該遺伝子構造体の構造は極めて単純である。しかしながら、温度や光、植物病原体等の非化学物質により誘導発現させるものは、予期せぬ環境の変化や植物病原体の襲来等で突発的に目的とする外来遺伝子が発現してしまう危険性がある。
一方、後者の例としては、具体的には例えば、銅イオン誘導性システム(例えば、非特許文献2参照)、ステロイドホルモン誘導性システム(例えば、非特許文献3参照)、エタノール誘導性システム(例えば、非特許文献4参照)、テトラサイクリン誘導性システム(例えば、非特許文献5参照)等が挙げられる。これらは、Moore I et al (例えば、非特許文献6参照)、Padidam M (例えば、非特許文献7参照)等により詳細に解説されており、特定の化学物質の濃度に依存して目的とする外来遺伝子の発現を制御することができる。即ち、所望の時期に必要な分だけ目的とする外来遺伝子の発現を誘導することができる。
上述のような誘導性システムにおける化学物質による目的とする外来遺伝子の誘導発現のうち、銅イオン誘導性システムについては、当該システムが有する誘導発現の低い誘導倍率が問題となっており(例えば、非特許文献7参照)、本発明では、より理想に近づけることによって、当該銅イオン誘導性システムにおいて、目的とする外来遺伝子の誘導発現での誘導倍率の向上を達成できる方法を提供することを課題としている。
即ち、本発明は、
1.植物における、化学物質による目的とする外来遺伝子の誘導発現方法であって、前記の目的とする外来遺伝子が含むプロモーター機能を有する領域の下流に任意の外来遺伝子の5'−非翻訳領域を有するように構築されてなる遺伝子構築物に含まれる転写因子であり、前記の目的とする外来遺伝子とは異なる他の外来遺伝子によりコードされる転写因子を、銅イオンにより活性化することにより、前記の目的とする外来遺伝子が含むプロモーター機能を有する領域による前記の目的とする外来遺伝子の転写活性化を誘導する工程を有することを特徴とする方法(以下、本発明誘導発現方法と記すこともある。);
2.前記の5'−非翻訳領域の塩基配列が、下記の5'−非翻訳領域に係る塩基配列群から選ばれてなる塩基配列であることを特徴とする前項1記載の方法;
<5'−非翻訳領域に係る塩基配列群>
(1)ウイルスの遺伝子又は植物の誘導性遺伝子由来の塩基配列
(2)トバモウイルス属に属するウイルスの遺伝子由来の塩基配列
(3)トマトモザイクウイルスの遺伝子由来の塩基配列
(4)トマトモザイクウイルスの130k/180k遺伝子由来の塩基配列
3.前記の転写因子の塩基配列が、下記の転写因子に係る塩基配列群から選ばれてなる塩基配列であることを特徴とする前項1又は2記載の方法;
<転写因子に係る塩基配列群>
(1)真核生物由来の塩基配列
(2)酵母由来の塩基配列
(3)酵母ACE1由来の塩基配列
4.前記の遺伝子構築物が、前記の転写因子とは異なる他の転写因子の転写活性化領域であり、前記の転写因子の下流に位置する転写活性化領域を、さらに追加的に有するように構築されてなる遺伝子構築物であることを特徴とする前項1、2又は3記載の方法;
5.前記の転写活性化領域が、下記の転写活性化領域に係る塩基配列群から選ばれてなる塩基配列であることを特徴とする前項4記載の方法;
<転写活性化領域に係る塩基配列群>
(1)ウイルスの転写因子由来の塩基配列
(2)シンプレックスウイルス属に属するウイルスの転写因子由来の塩基配列
(3)単純ヘルペスウイルスの転写因子由来の塩基配列
(4)単純ヘルペスウイルスのVP16転写因子由来の塩基配列
6.前記の遺伝子構築物が、任意のプロモーターを前記の転写因子の上流に追加的に有するように構築されてなる遺伝子構築物であることを特徴とする前項1、2、3、4又は5記載の方法;
7.植物において、化学物質により目的とする外来遺伝子を誘導発現させるための遺伝子構築物であって、
(a)プロモーター機能を有する領域と目的とする外来蛋白質に係る構造遺伝子領域とを含む、目的とする外来遺伝子と、
(b)前記の目的とする外来遺伝子とは異なる他の外来遺伝子によりコードされ且つ銅イオンにより活性化される転写因子と、
(c)前記の目的とする外来遺伝子が含むプロモーター機能を有する領域(以下、本プロモーター領域と記すこともある。)の下流に位置する任意の外来遺伝子の5'−非翻訳領域と
を有するように構築可能に調製されてなることを特徴とする遺伝子構築物(以下、本発明遺伝子構築物と記すこともある。);
8.前記の5'−非翻訳領域の塩基配列が、下記の5'−非翻訳領域に係る塩基配列群から選ばれてなる塩基配列であることを特徴とする前項7記載の遺伝子構築物;
<5'−非翻訳領域に係る塩基配列群>
(1)ウイルスの遺伝子又は植物の誘導性遺伝子由来の塩基配列
(2)トバモウイルス属に属するウイルスの遺伝子由来の塩基配列
(3)トマトモザイクウイルスの遺伝子由来の塩基配列
(4)トマトモザイクウイルスの130k/180k遺伝子由来の塩基配列
9.前記の転写因子の塩基配列が、下記の転写因子に係る塩基配列群から選ばれてなる塩基配列であることを特徴とする前項7又は8記載の遺伝子構築物;
<転写因子に係る塩基配列群>
(1)真核生物由来の塩基配列
(2)酵母由来の塩基配列
(3)酵母ACE1由来の塩基配列
10.前記の転写因子とは異なる他の転写因子の転写活性化領域であり、前記の転写因子の下流に位置する転写活性化領域を、さらに追加的に有するように構築されてなることを特徴とする前項7、8又は9記載の遺伝子構築物;
11.前記の転写活性化領域が、下記の転写活性化領域に係る塩基配列群から選ばれてなる塩基配列であることを特徴とする前項10記載の遺伝子構築物;
<転写活性化領域に係る塩基配列群>
(1)ウイルスの転写因子由来の塩基配列
(2)シンプレックスウイルス属に属するウイルスの転写因子由来の塩基配列
(3)単純ヘルペスウイルスの転写因子由来の塩基配列
(4)単純ヘルペスウイルスのVP16転写因子由来の塩基配列
12.任意のプロモーターを前記の転写因子の上流に追加的に有するように構築されてなる遺伝子構築物であることを特徴とする前項7、8、9、10又は11記載の遺伝子構築物;
13.前項7〜12のいずれかの前項記載の遺伝子構築物が導入されてなることを特徴とする形質転換体植物(以下、本発明形質転換体植物と記すこともある。);
14.前項13記載の形質転換体植物から目的とする外来蛋白質を回収することを特徴とする外来蛋白質の取得方法(以下、本発明外来蛋白質取得方法と記すこともある。);
等を提供するものである。
本発明遺伝子構築物は、植物において、化学物質により目的とする外来遺伝子を誘導発現させるために利用することができる。当該遺伝子構築物は、
(a)プロモーター機能を有する領域と目的とする外来蛋白質に係る構造遺伝子領域とを含む、目的とする外来遺伝子と、
(b)前記の目的とする外来遺伝子とは異なる他の外来遺伝子によりコードされ且つ銅イオンにより活性化される転写因子(以下、本転写因子と記すことがある。)と、
(c)前記の目的とする外来遺伝子が含むプロモーター機能を有する領域(以下、本プロモーター領域と記すこともある。)の下流に位置する任意の外来遺伝子の5'−非翻訳領域(以下、本5'−非翻訳領域と記すことがある。)と
を有するように構築可能に調製すればよい。このようにして、本発明遺伝子構築物を得ることができる。
このような発現カセットは、通常の遺伝子工学的手法を用いて行えばよい。尚、2つの発現カセットとして構築する場合には、例えば、前記(a)及び(c)を第一発現カセットとして構築し、また前記(b)を第二発現カセットとして構築してもよい。
また更に、本発明遺伝子構築物としては、好ましくは、任意のターミネーターを前記の転写因子の下流に追加的に有するように構築されてなる遺伝子構築物等を挙げることができる。当該ターミネーターとしては、例えば、NOSターミネーター、CR16ターミネーター(特開2000-166577)、ダイズ種子グリシニンターミネーター(特開06-189777)等を挙げることができる。
具体的には例えば、第一発現カセットと第二発現カセットとをベクター上で連結してなる遺伝子構築物に含まれる目的とする外来遺伝子を導入してもよいし、またこれらの発現カセットを連結せずに混合して導入してもよい。また、第一発現カセット又は第二発現カセットのいずれかを導入した宿主植物に、再度、他方の発現カセットを導入してもよい。さらに、第一発現カセットを導入した個体と第二発現カセットを導入した個体とを交配してもよい。第一発現カセットを複数種類導入することで、複数種類の外来遺伝子を同時に誘導発現することも可能である。
本発明遺伝子構築物の導入方法としては、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、ウイルスベクター法等の各種の公知方法を用いることができる。
宿主植物には、農業上及び園芸上、重要な種又はゲノム解析等遺伝学上有用な種が挙げられるが、さらに、任意の植物種が含まれる。例えば、ダイズ、エンドウ、インゲン、アルファルファ、ミヤコグサ、クローバ、ピーナッツ、スイートピー、クルミ、チャ、ワタ、コショウ、キュウリ、スイカ、カボチャ、メロン、ダイコン、ナタネ、キャノーラ、テンサイ、レタス、キャベツ、ブロッコリー、カリフラワー、シロイヌナズナ、タバコ、ナス、ジャガイモ、サツマイモ、サトイモ、キクイモ、トマト、ホウレンソウ、アスパラガス、ニンジン、ゴマ、エンダイブ、キク、フウロウソウ、キンギョソウ、カーネーション、ナデシコ、ニチニチソウ、ブバルディア、カスミソウ、ガーベラ、トルコキキョウ、チューリップ、ストック、スターチス、シクラメン、ユキノシタ、ノースポール、スミレ、バラ、サクラ、リンゴ、イチゴ、ウメ、ミカン、ボケ、サツキ、ツツジ、ナンヨウアブラギリ、リンドウ、コスモス、アサガオ、ヒマワリ、イチョウ、スギ、ヒノキ、ポプラ、マツ、セコイア、オーク、スイレン、トチュウ、ブナ、イネ、コムギ、オオムギ、ライムギ、エンバク、トウモロコシ、ネギ、タマネギ、ニンニク、ユリ、オニユリ、ラン、グラジオラス、パイナップルである。
<転写因子に係る塩基配列群>
(1)真核生物由来の塩基配列
(2)酵母由来の塩基配列
(3)酵母ACE1由来の塩基配列
また例えば、candida glabrataのAMT1(Thorvaldsen JL et al、1993、J Biol Chem 268、12512-12518)由来の塩基配列、Yarrowia lipolyticaのCRF1(Garcia S、2002、J Biol Chem 277、37359-37368)由来の塩基配列、トウモロコシのSOD遺伝子群を銅イオン依存的に誘導発現させる転写因子(Ruzsa SM et al、2003、Biochemistry 42、1508-1516)由来の塩基配列等を挙げることができる。尚、由来の塩基配列には、当該塩基配列の一部使用や他の塩基配列とのキメラ、欠失及び挿入、置換等の変異を導入した塩基配列も含まれる。
尚、前記の通常使用されるプロモーター機能を有する領域は、構成的プロモーターでもよいし、組織特異的プロモーターや、ある刺激により転写活性が誘導される誘導性プロモーターでもよい。使用場面に応じて適宜選択することが望ましい。
構成的プロモーターとしては、例えば、CaMV 35Sプロモーター、PG10-90(特開09-131187)、ユビキチンプロモーター(国際公開01/094394)、アクチンプロモーター(国際公開00/070067)等を挙げることができる。また、組織特異的プロモーターとしては、例えば、ダイズ種子グリシニンプロモーター(特開06-189777)、プロラミンプロモーター(国際公開2004/056993)、インゲンマメ種子ファゼオリンプロモーター(国際公開91/013993)、ナタネ種子ナピンプロモーター(国際公開91/013972)、シロイヌナズナSultr2;2プロモーター(Takahashi H et al、2000、Plant J 23、171-82)、アグロバクテリウムrolCプロモーター(Almon E et al、1997、Physiol 115、1599-1607)等を挙げることができる。
<5'−非翻訳領域に係る塩基配列群>
(1)ウイルスの遺伝子又は植物の誘導性遺伝子由来の塩基配列
(2)トバモウイルス属に属するウイルスの遺伝子由来の塩基配列(例えば、Gallie D et al、1987、Nucleic Acid Res 15、3257-3273; 米国特許5489527参照)
(3)トマトモザイクウイルスの遺伝子由来の塩基配列
(4)トマトモザイクウイルスの130k/180k遺伝子由来の塩基配列
尚、由来の塩基配列には、当該塩基配列の一部使用や他の塩基配列とのキメラ、欠失及び挿入、置換等の変異を導入した塩基配列も含まれる。また、5'−非翻訳領域の塩基配列数が48 bp以上の塩基配列、又は、二次構造予測プログラム「mfold (version 2.3)」(http://frontend.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/cgi-bin/rna-form1-2.3.cgi、The Bioinformatics Center at Rensselaer and Wadsworth提供; 例えば、Zuker M、2003、Nucleic Acids Res 31(13)、3406-3415参照)を用いて25℃の条件下で二次構造を予測した場合に、分子内で相互作用が予測されない連続した最長の塩基数が11 bp以上である塩基配列を挙げることもできる。
<転写活性化領域に係る塩基配列群>
(1)ウイルスの転写因子由来の塩基配列
(2)シンプレックスウイルス属に属するウイルスの転写因子由来の塩基配列
(3)単純ヘルペスウイルスの転写因子由来の塩基配列
(4)単純ヘルペスウイルスのVP16転写因子由来の塩基配列(例えば、Triezenberg SJ et al、1988、Genes Dev 2(6)、718-29参照)
また例えば、GAL4転写因子(Gill G、Ptashne M、1987、Cell 51(1)、121-126)由来の塩基配列、転写活性化能力を有する人工的に合成されたペプチドAH(Ansari AZ et al、2001、Chem Biol 8(6)、583-592)由来の塩基配列等を挙げることもできる。尚、由来の塩基配列には、当該塩基配列の一部使用や他の塩基配列とのキメラ、欠失及び挿入、置換等の変異を導入した塩基配列も含まれる。
因みに、FT遺伝子とは、Flowering Locus T 遺伝子の略称であり、花成制御に関して正に働く因子をコードする遺伝子を意味する。FT遺伝子は、日長に応答して維管束師部での発現が増大し、茎頂に移動して、茎頂で発現しているFDと呼ばれるbZIP型転写因子と相互作用することにより花成を誘導する作用を有する(例えば、Kobayashi Y and Weigel D、2007、Genes Dev 21、2371-2384参照)。
(1)CRE DNAリコンビナーゼ遺伝子を誘導発現させることにより、2つのloxPサイトに挟まれた薬剤耐性遺伝子発現カセット等を切り出す。
(2)RNAiを誘発するRNAを誘導発現させることにより、所望の遺伝子の発現を抑制する。
(3)イントロンのドナーサイトとアクセプターサイトを含むmRNAを誘導発現させることにより、所望のcDNAを単離したり、無作為にcDNAを単離する。
(4)第一発現カセットの5’−非翻訳領域下流に遺伝子やターミネーターを配置せず、偶発的に5’−非翻訳領域下流に組み込まれた染色体上の遺伝子を誘導発現させることにより、機能的な遺伝子を単離する。
以上、同様なコンストラクトを作製することにより、これらの技術の全てに対して、本発明誘導発現方法を適用させることも可能である。
(1)転写因子遺伝子発現カセットの構築
YPD培地(1% 酵母エキス、2% ポリペプトン、2% グルコース)中、30℃で2日間振とう培養した出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae strain AH22)から、ゲノムDNA抽出キット「Genとるくん」(タカラバイオ)を用いてゲノムDNAを抽出した。抽出されたゲノムDNAを鋳型に、2種の特異的プライマー(ACE1-1F、ACE1-1RC)を用いてPCRを行うことにより、ACE1転写因子遺伝子を増幅した。増幅されたACE1転写因子遺伝子を、pBI221(Clontech)のGUS遺伝子と置換し、p35S-ACE1-NOSを作製した。次に、p35S-ACE1-NOSに含まれるNOSターミネーターを、CR16ターミネーター(特開2000-166577)に置換し、p35S-ACE1-CRを作製した。
ACE1-1RC:5'-tggagctcttattgtgaatgtgagttatg-3'(配列番号2)
ACE1-2RC:5'-aactcgagttgtgaatgtgagttatgcg-3’(配列番号3)
VP16-1F:5'-acggctccaccgaccgacgtc-3'(配列番号4)
VP16-1RC:5'-ctacccaccgtactcgtcaattc-3'(配列番号5)
VP16-2F:5'-ggacgaactccacttagacgg-3'(配列番号6)
VP16-2RC:5'-ccgtctaagtggagttcgtcc-3'(配列番号7)
VP16-3F:5'-tactcgagtcaacggctccaccgaccgacgt-3'(配列番号8)
VP16-3RC:5'-aagagctcttacccaccgtactcgtcaattccaag-3'(配列番号9)
プラスミドCaMV35S-sGFP(S65T)-NOS3'(「植物の細胞を観る実験プロトコール」 福田裕穂他監修、1997年、秀潤社、ISBN 4-87962-170-6)からsGFP遺伝子を切り出し、アダプター(NS-1F、NS-1RC)を使用して、pBI221のGUS遺伝子と置換、p35S-sGFPを作製した。p35S-sGFPに含まれるCaMV35Sプロモーターの-830bpから-91bpまでの領域を、合成オリゴヌクレオチド(MRE-1F、MRE-1RC)に置換し、pMRE/35S(-90)-sGFPを作製した。
pMRE/35S(-90)-sGFPを制限酵素EcoRVで処理した後、「Calf intestine Alkaline Phosphatase」(タカラバイオ)で脱リン酸化した。そこへ、「Blunting Kination Ligation kit」(タカラバイオ)を用いて平滑末端化及びリン酸化した合成オリゴヌクレオチド(MRE-1F、MRE-1RC)を挿入することで、MRE配列を順向きに2回繰返して配置させた。得られたMRE配列の2回繰返し部分を切り出し、上記と同様の方法で平滑末端化し、再度EcoRVサイトに挿入した。これにより、MRE配列を順向きに4回繰返して配置させたpMRE4/35S(-90)-sGFPを作製した。
さらに、pBI221を鋳型に、2種の特異的プライマー(46bp-1F、46bp-1RC)を用いてPCRを行うことにより、CaMV35Sプロモーターの-46bpから-1bpまでの領域を含むDNA断片を増幅した。増幅されたDNA断片を、pMRE4/35S(-90)-sGFPの4回繰返し配置させたMRE配列の下流に位置するCaMV35Sプロモーターの-90bpから-1bpまでの領域と置換し、pMRE4/35S(-46)-sGFPを作製した。
他方では、CaMV35Sプロモーターの-90bpから-1bpまでの領域に存在するas-1サイト(非特許文献1)に変異が導入された配列とも置換した。
まず、NASCより購入した組換えシロイヌナズナ(No.N70016)からゲノムDNAを抽出した。抽出されたゲノムDNAを鋳型に、2種の特異的プライマー(90m-1F、90m-1RC)を用いてPCRを行うことにより、as-1サイトに変異を持つ35S(-90m)配列をpCR2.1(Invitrogen)にTAクローニングし、pCR2.1-35S(-90m)を作製した。pCR2.1-35S(-90m)を鋳型に、2種の特異的プライマー(90m-2F、90m-2RC)を用いてPCRを行うことにより、5’末端にEcoRVサイトを付加し3’末端にXbaIサイトを付加した。得られたDNA断片を、pMRE4/35S(-90)-sGFPの4回繰返し配置させたMRE配列の下流に位置するCaMV35Sプロモーターの-90bpから-1bpまでの領域と置換し、pMRE4/35S(-90m)-sGFPを作製した。
加えて、プラスミドpiL.erG3(Tamai A et al、2001、Mol Plant Microbe Interact 14(2)、126-134)を鋳型に、2種の特異的プライマー(71bp-1F、71bp-1RC)を用いてPCRを行うことにより、トマトモザイクウイルスの130k/180k遺伝子の5’−非翻訳領域配列(To71配列)を増幅した。増幅された5’−非翻訳領域配列をpMRE4/35S(-46)-sGFP及びpMRE4/35S(-90m)-sGFPのsGFP遺伝子の上流に挿入し、pMRE4/35S(-46)-To71sGFP及びpMRE4/35S(-90m)-To71sGFPを作製した。
NS-1RC:5'-gactgagctcgc-3'(配列番号11)
MRE-1F:5'-agcttagcgatgcgtcttttccgctgaaccgttccagcaaaaaagactagat-3'(配列番号12)
MRE-1RC:5'-atctagtcttttttgctggaacggttcagcggaaaagacgcatcgcta-3'(配列番号13)
46bp-1F:5'-tagatatcgcaagacccttcctctatataagg-3'(配列番号14)
46bp-1RC:5'-atcctctagagtcccccgtgttc-3'(配列番号15)
90m-1F:5'-gctatgaccatgattacgccaagcttg-3'(配列番号16)
90m-1RC:5'-cattgttatatctccttggatccgtcg-3'(配列番号17)
90m-2F:5'-tagatatctccacgtccataagggac-3'(配列番号18)
90m-2RC:5'-aatctagactgcaggtcgtcctctcca-3'(配列番号19)
71bp-1F:5'-tgtctagagtatttttacaacaattaccaacaac-3'(配列番号20)
71bp-1RC:5'-aaggatcctgtagttgtagaatgtaaaatgtaatg-3'(配列番号21)
転写因子遺伝子発現カセットを含むp35S-ACE1-CR及びp35S-ACE1/VP16AD-CRを制限酵素HindIII及びEcoRIで処理し、夫々転写因子遺伝子発現カセットを切り出した。
sGFP遺伝子発現カセットを含むpMRE/35S(-90)-sGFP及びpMRE4/35S(-46)-sGFP、pMRE4/35S(-46)-To71sGFP、pMRE4/35S(-90m)-To71sGFPを制限酵素HindIIIで処理した後、「Blunting Kination Ligation kit」を用いて平滑末端化及びリン酸化し、そこへ合成オリゴヌクレオチド(KXS-1F、KXS-1RC)を挿入、pKXS-MRE/35S(-90)-sGFP及びpKXS-MRE4/35S(-46)-sGFP、pKXS-MRE4/35S(-46)-To71sGFP、pKXS-MRE4/35S(-90m)-To71sGFPを作製した。作製したこれらのプラスミドを制限酵素KpnI及びEcoRIで処理し、夫々sGFP遺伝子発現カセットを切り出した。
一方、pBI121(Clontech)に含まれるGUS遺伝子発現カセットを、合成オリゴヌクレオチド(HEK-1F、HEK-1RC)に置換し、pBI121-HEKを作製した。pBI121-HEKを制限酵素HindIII及びKpnIで処理した。
制限酵素HindIII及びKpnIで処理したpBI121-HEKに、切り出した転写因子遺伝子発現カセットとsGFP遺伝子発現カセットをライゲーションすることにより、転写因子遺伝子発現カセットとsGFP遺伝子発現カセットとが、夫々のターミネーター側で連結したベクターを得た(図1参照)。p35S-ACE1-CRとpKXS-MRE/35S(-90)-sGFPを由来とするものをベクターA、p35S-ACE1-CRとpKXS-MRE4/35S(-46)-sGFPを由来とするものをベクターB、p35S-ACE1/VP16AD-CRとpKXS-MRE4/35S(-46)-sGFPを由来とするものをベクターC、p35S-ACE1/VP16AD-CRとpKXS-MRE4/35S(-46)-To71sGFPを由来とするものをベクターD、p35S-ACE1/VP16AD-CRとpKXS-MRE4/35S(-90m)-To71sGFPを由来とするものをベクターEとした。
KXS-1RC:5'-gtcgactcgaggtacc-3'(配列番号23)
HEK-1F:5'-agcttgaattcgtcgacggtacctaggacgagctc-3'(配列番号24)
HEK-1RC:5'-aattgagctcgtcctaggtaccgtcgacgaattca-3'(配列番号25)
(1)組換えシロイヌナズナの作製及び選抜
実施例1で作製されたベクターAからEをそれぞれアグロバクテリウム(Agrobacterium tumefaciens strain C58C1)に導入した。アグロバクテリウムを50 mg/L カナマイシン、100 mg/L アンピシリン、100 mg/L リファンピシンを含むLB寒天培地(0.5% 酵母エキス、1.0% バクトトリプトン、0.5% 食塩、1% 寒天)で培養して薬剤耐性コロニーを選抜することにより、組換えアグロバクテリウムを得た。得られた組換えアグロバクテリウムを、モデル植物ラボマニュアル(岩渕雅樹他編集、2000年、シュプリンガー・フェアラーク東京株式会社、ISBN 4-431-70881-2 C3045)に記載される方法に準じて、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana ecotype Columbia)に感染させることにより、遺伝子導入を行った。遺伝子導入されたシロイヌナズナから採取されたT1種子を、20 mg/L ベンレート、200 mg/L クラフォラン、25 mg/L カナマイシンを含む改変MS寒天培地(MS無機塩類、B5ビタミン、1% ショ糖、0.8 % 寒天)に播種し生育した後、カナマイシンに耐性を示す植物個体を選抜した。選抜された植物個体を予め培土が入れられたポットに移植し、人工気象器内で生育させることにより、T2種子を得た。得られたT2種子を25 mg/L カナマイシンを含む改変MS寒天培地(MS無機塩類、B5ビタミン、2% ショ糖、0.8% 寒天)に播種し生育した後、χ2検定に基づいた5%の有意水準において、カナマイシンに耐性を示す植物個体が3:1の割合で出現するラインを選抜した。尚、植物個体の生育のための培養条件は、明期23時間、暗期1時間、23〜25℃とした。
選抜されたラインについて、播種後10日目の植物個体を、誘導発現処理区として100μM CuSO4を含む改変MS寒天培地(MS無機塩類、B5ビタミン、2% ショ糖、0.8 % 寒天)に6個体ずつ移植することにより、銅イオンによる目的とする外来遺伝子の誘導発現のための処理(以下、誘導発現処理と記すこともある。)を行った(尚、非誘導発現処理区として CuSO4を含まない改変MS寒天培地を用いた。)。
その後、当該誘導発現処理6時間後の植物個体から、植物RNA抽出キット「RNeasy Plant Mini Kit」(QIAGEN)を用いて全RNAを抽出した。抽出された全RNAから、cDNA合成キット「ReverTra Ace」(TOYOBO)を用いてcDNAを合成した。合成されたcDNAを鋳型に、7500 Fast Real-time PCR装置(Applied Biosystems)を用いてリアルタイムPCRを行うことにより、mRNA量の定量を行った。sGFP遺伝子のmRNA量の定量には、2種の特異的プライマー(S01F、S01R)及びTaqManプローブ(S01)を用いた。内部標準としては、シロイヌナズナアクチン遺伝子(AtACT2、GenBank Accession Number NM180280)を用いた。AtACT遺伝子のmRNA量の定量には、2種の特異的プライマー(S03F、S03R)及びTaqManプローブ(S03)を用いた。
S01R:5'-gaactccagcaggaccatgtg-3'(配列番号27)
S01:5'-FAM-ccaacgagaagcgcga-MGB-3'(配列番号28)
S03F:5'-cggtggttccattcttgctt-3'(配列番号29)
S03R:5'-cggccttggagatccacat-3'(配列番号30)
S03:5'-VIC-cctcagcacattcc-MGB-3'(配列番号31)
一方、ACE1転写因子にVP16ADが付加されたベクターCが導入されてなる組換えシロイヌナズナでは、誘導発現処理区でのsGFP遺伝子のmRNA量が非誘導発現処理区でのsGFP遺伝子のmRNA量と比較して273.0倍(以下、ベクターCが導入されてなる組換えシロイヌナズナにおける誘導倍率と記すこともある。)であり、またベクターBが導入されてなる組換えシロイヌナズナにおける誘導倍率と比較して31.7倍の改善が認められた。
さらに、トマトモザイクウイルスの130k/180k遺伝子の5’−非翻訳領域配列が挿入されたベクターDが導入されてなる組換えシロイヌナズナでは、誘導発現処理区でのsGFP遺伝子のmRNA量が非誘導発現処理区でのsGFP遺伝子のmRNA量と比較して628.6倍(以下、ベクターDが導入されてなる組換えシロイヌナズナにおける誘導倍率と記すこともある。)であり、またベクターCが導入されてなる組換えシロイヌナズナにおける誘導倍率と比較して2.3倍の改善が認められた。
また、as-1サイトに変異を持つ35S(-90m)配列が用いられたベクターEが導入されてなる組換えシロイヌナズナでは、誘導発現処理区でのsGFP遺伝子のmRNA量が非誘導発現処理区でのsGFP遺伝子のmRNA量と比較して325.6倍(以下、ベクターEが導入されてなる組換えシロイヌナズナにおける誘導倍率と記すこともある。)であった(図2参照)。
(1)組換えタバコの作製及び選抜
実施例1で作製されたベクターB及びEをそれぞれアグロバクテリウム(Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404)に導入した。アグロバクテリウムを50 mg/L カナマイシン、300 mg/L ストレプトマイシン、100 mg/L リファンピシンを含むLB寒天培地(0.5% 酵母エキス、1.0% バクトトリプトン、0.5% 食塩、1% 寒天)で培養して薬剤耐性コロニーを選抜することにより、組換えアグロバクテリウムを得た。得られた組換えアグロバクテリウムを、植物遺伝子操作マニュアル(内宮博文著、1992年、講談社サイエンティフィック)に記載される方法に準じて、タバコ(Nicotiana tabacum strain SR1)に感染させることにより、遺伝子導入を行った。遺伝子導入されたタバコの葉片から100 mg/L カナマイシンに耐性を示す不定芽を選抜し、選抜された不定芽から植物個体を再生させた。得られた植物個体から採取されたT1種子を50 mg/L カナマイシンを含むMS寒天培地(MS無機塩類、MSビタミン、3% ショ糖、0.8% 寒天)に播種し生育した後、χ2検定に基づいた5%の有意水準において、カナマイシンに耐性を示す植物個体が3:1の割合で出現するラインを選抜した。尚、植物個体の生育のための培養条件は、明期23時間、暗期1時間、23〜25℃とした。
選抜されたラインについて、播種後12日目の植物個体を、誘導発現処理区として100μM CuSO4を含むMS寒天培地(MS無機塩類、MSビタミン、3% ショ糖、0.8% 寒天)に3個体ずつ移植することにより、銅イオンによる目的とする外来遺伝子の誘導発現のための処理(以下、誘導発現処理と記すこともある。)を行った(尚、非誘導発現処理区として CuSO4を含まないMS寒天培地を用いた。)。
その後、当該誘導発現処理6時間後の植物個体から、植物RNA抽出キット「RNeasy Plant Mini Kit」(QIAGEN)を用いて全RNAを抽出した。抽出された全RNAから、cDNA合成キット「ReverTra Ace」(TOYOBO)を用いてcDNAを合成した。合成されたcDNAを鋳型に、7500 Fast Real-time PCR装置(Applied Biosystems)を用いてリアルタイムPCRを行うことにより、mRNA量の定量を行った。sGFP遺伝子のmRNA量の定量には、2種の特異的プライマー(S01F、S01R)及びTaqManプローブ(S01)を用いた。内部標準としては、タバコユビキチン遺伝子(NtUBI、GenBank Accession Number U66264)を用いた。NtUBI遺伝子のmRNA量の定量には、2種の特異的プライマー(S06F、S06R)及びTaqManプローブ(S06)を用いた。
S06R:5'-gacgggttgactctttctggat-3'(配列番号33)
S06:5'-VIC-accttggctgactacaa-MGB-3'(配列番号34)
一方、ACE1転写因子にVP16ADが付加され且つsGFP遺伝子の上流にトマトモザイクウイルスの130k/180k遺伝子の5’−非翻訳領域配列が挿入されたベクターEが導入されてなる組換えタバコでは、誘導発現処理区でのsGFP遺伝子のmRNA量が非誘導発現処理区でのsGFP遺伝子のmRNA量と比較して40.8倍(以下、ベクターEが導入されてなる組換えタバコにおける誘導倍率と記すこともある。)であり、またベクターBが導入されてなる組換えタバコにおける誘導倍率と比較して4.2倍の改善が認められた(図3参照)。
(1)組換えタバコ培養細胞の作製及び選抜
実施例1で作製されたベクターA及びB、Eがコーティングされた直径1.0μmの金粒子を用いたパーティクルガン法(森川弘道ら著、1992年、植物細胞工学 Vol.4 No.1 p.47-52、秀潤社)により、前記ベクターをそれぞれタバコ培養細胞(BY-2)に導入した。金粒子1mg当たりのDNA量は0.1μgとした。遺伝子導入されたタバコ培養細胞の細胞懸濁液を、遺伝子導入操作後3〜5日目に、30 mg/L カナマイシンを含む改変MS寒天培地(MS無機塩類、3% ショ糖、1μM 2,4-D、1 mg/L thiamin・HCl、100 mg/L myo-inositol、200 mg/L KH2PO4、0.8 % 寒天)に広げた。培養1ヵ月間後に、30 mg/L カナマイシンに耐性を示す細胞塊を選抜し、選抜された細胞塊をその後1〜2週間毎に新しい寒天培地に植え継ぎながら4〜8週間培養した。培養条件は、暗下、23〜25℃とした。
得られた細胞塊を、誘導発現処理区として100μM CuSO4を含む改変MS寒天培地(MS無機塩類、3% ショ糖、1μM 2,4-D、1 mg/L thiamin・HCl、100 mg/L myo-inositol、200 mg/L KH2PO4、0.8 % 寒天)に移植することにより、銅イオンによる目的とする外来遺伝子の誘導発現のための処理(以下、誘導発現処理と記すこともある。)を行った(尚、非誘導発現処理区として CuSO4を含まない改変MS寒天培地を用いた。)。
その後、当該誘導発現処理3日間後の細胞塊について、蛍光顕微鏡(Nikon)にて、GFPの蛍光発光状態を調べた。
一方、ACE1転写因子にVP16ADが付加され且つsGFP遺伝子の上流にトマトモザイクウイルスの130k/180k遺伝子の5’−非翻訳領域配列が挿入されたベクターEが導入されてなる組換えタバコ培養細胞では、誘導発現処理区でのGFPの蓄積量が非誘導発現処理区でのGFPの蓄積量と比較して21.9倍(以下、ベクターEが導入されてなる組換えタバコ培養細胞における誘導倍率と記すこともある。)であり、またベクターBが導入されてなる組換えタバコ培養細胞における誘導倍率と比較して11.5倍の改善が認められた(図4参照)。
(1)試料の準備及びパーティクルガンによる遺伝子導入
シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、タバコ(Nicotiana tabacum)、ダイズ(Glycine max 'Jack')、カーネーション(Dianthus caryophyllus 'True Love'、キリン グリーン アンド フラワー)、イネ(Oryza sativa ssp. japonica cv. Nipponbare)、オニユリ(Liliunm lancifolium)の夫々の葉を切り取り、切り取られた葉(葉片)を誘導発現処理区として100μM CuSO4を含む0.6% 寒天培地上に静置することにより、銅イオンによる目的とする外来遺伝子の誘導発現のための処理(以下、誘導発現処理と記すこともある。)を行った(尚、非誘導発現処理区として CuSO4を含まない寒天培地を用いた。)。
その後、当該誘導発現処理1日間後の葉片に、実施例1で作製されたベクターEとpBI221(Clontech)とを等量混合してなる組成物がコーティングされた直径1.0μmの金粒子を用いたパーティクルガン法により、前記組成物を導入した。金粒子1mg当たりのDNA量は0.1μgとした。pBI221は、遺伝子導入効率を補正する目的で混合導入した。対照として、前記組成物に代えて実施例1で作製されたp35S-sGFPとpBI221とを等量混合してなる組成物が用いられた。
遺伝子導入された葉片について、遺伝子導入後1日目に、蛍光顕微鏡(Nikon)にてGFPの蛍光発光が観察されるスポット数をカウントした。その後、遺伝子導入された葉片をGUS染色液(0.5 mg/ml X-Gluc、0.5 mM K3Fe(CN)6、0.5 mM K4Fe(CN)6、0.01% Triton X-100、100 mM リン酸ナトリウム)に浸し、これを400 mmHgで10分間、減圧処理した後、37℃で1日間、染色した。染色された葉片について、70% エタノールで脱色処理した後、光学顕微鏡(Nikon)にてGUS染色が観察されるスポット数をカウントした。
(1)導入ベクターの作製
シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana ecotype Columbia)を改変MS寒天培地(MS無機塩類、B5ビタミン、2% ショ糖、0.8% 寒天)に播種し、23℃で3週間生育させた。得られた植物を、予め培土が入れられたポットに移植し、人工気象器内で生育させた。移植後2週間目の植物の花芽及び本葉から、植物RNA抽出キット「RNeasy Plant Mini Kit」(QIAGEN)を用いて全RNAを抽出した。抽出された全RNAから、cDNA合成キット「ReverTra Ace」(TOYOBO)を用いてcDNAを合成した。合成されたcDNAを鋳型に、2種の特異的プライマー(FT-1F、FT-1RC)を用いてPCRを行うことにより、FT遺伝子(GenBank Accession Number AB027504)を増幅した。増幅されたFT遺伝子を、pBI221(Clontech)のGUS遺伝子と置換した。このようにして得られたプラスミドを鋳型に、6種の特異的プライマー(FT-2F、FT-2RC、FT-3F、FT-3RC、FT-4F、FT-1RC)を用いてfusion PCRを行うことにより、FT遺伝子内部に存在するBamHIサイト及びEcoRIサイトにアミノ酸置換を伴わない変異を導入し且つ5’末端のXbaIサイトをBamHIサイトに変更した。このようにして得られた改変FT遺伝子を、実施例1で作製されたpKXS-MRE4/35S(-90m)-To71sGFPのsGFP遺伝子と置換することにより、pKXS-MRE4/35S(-90m)-To71FTを作製した。pKXS-MRE4/35S(-90m)-To71FTに含まれるFT遺伝子発現カセットを実施例1に記載された方法と同様の方法に準じて、p35S-ACE1/VP16AD-CRに含まれる転写因子遺伝子発現カセットとターミネーター側で連結したベクターFを得た(図5参照)。
FT-1RC:5'-atagagctcctaaagtcttcttcctccg-3'(配列番号36)
FT-2F:5'-taaggatccatgtctataaatataagagaccctc-3'(配列番号37)
FT-2RC:5'-gaacatctggatcgaccataaccaaagta-3'(配列番号38)
FT-3F:5'-tactttggttatggtcgatccagatgttc-3'(配列番号39)
FT-3RC:5'-gacacgatgaatacctgcagtggga-3'(配列番号40)
FT-4F:5'-tcccactgcaggtattcatcgtgtc-3'(配列番号41)
作製されたベクターFを、アグロバクテリウム(Agrobacterium tumefaciens strain C58C1)に導入した。アグロバクテリウムを50 mg/L カナマイシン、100 mg/L アンピシリン、100 mg/L リファンピシンを含むLB寒天培地(0.5% 酵母エキス、1.0% バクトトリプトン、0.5% 食塩、1% 寒天)で培養して薬剤耐性コロニーを選抜することにより、組換えアグロバクテリウムを得た。得られた組換えアグロバクテリウムを、モデル植物ラボマニュアル(岩渕雅樹他編集、2000年、シュプリンガー・フェアラーク東京株式会社、ISBN 4-431-70881-2 C3045)に記載される方法に準じて、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana ecotype Columbia)に感染させることにより、遺伝子導入を行った。遺伝子導入されたシロイヌナズナから採取されたT1種子を、20 mg/L ベンレート、200 mg/L クラフォラン、25 mg/L カナマイシンを含む改変MS寒天培地(MS無機塩類、B5ビタミン、1% ショ糖、0.8 % 寒天)に播種し生育した後、カナマイシンに耐性を示す植物個体を選抜した。選抜された植物個体を予め培土が入れられたポットに移植し、人工気象器内で生育させることにより、T2種子を得た。得られたT2種子を25 mg/L カナマイシンを含む改変MS寒天培地(MS無機塩類、B5ビタミン、2% ショ糖、0.8% 寒天)に播種し生育した後、χ2検定に基づいた5%の有意水準において、カナマイシンに耐性を示す植物個体が3:1の割合で出現するラインを選抜した。選抜されたラインの植物数個体を予め培土が入れられたポットに移植し、人工気象器内で生育させることにより、T3種子を得た。得られたT3種子を、25 mg/L カナマイシンを含む改変MS寒天培地(MS無機塩類、B5ビタミン、2% ショ糖、0.8% 寒天)に播種し生育した後、全てがカナマイシンに耐性を示すホモ接合体を選抜した。尚、植物個体の生育のための培養条件は、明期23時間、暗期1時間、23〜25℃とした。
選抜されたホモ接合体について、T3種子を、改変MS寒天培地(MS無機塩類、B5ビタミン、2% ショ糖、0.8% 寒天)に播種した。明期23時間、暗期1時間、23〜25℃の条件下で3日間生育させた後、明期12時間、暗期12時間、23〜25℃の条件下で生育させた。播種後10日経過した植物個体を誘導発現処理区として100μM CuSO4を含む改変MS寒天培地(MS無機塩類、B5ビタミン、2% ショ糖、0.8 % 寒天)に移植することにより、銅イオンによる目的とする外来遺伝子の誘導発現のための処理(以下、誘導発現処理と記すこともある。)を行った(尚、非誘導発現処理区として CuSO4を含まない改変MS寒天培地を用いた。)。
(1)導入ベクターの作製
pSUM-35S-rSt-1609soy(特開2006-001921)から、制限酵素BamHI及びSacIを用いて、rSt-1609soy遺伝子を切り出した。切り出しされたrSt-1609soy遺伝子を、実施例1で作製されたpKXS-MRE4/35S(-90m)-To71sGFPのsGFP遺伝子と置換することにより、pKXS-MRE4/35S(-90m)-To71rSt-1609soyを作製した。pKXS-MRE4/35S(-90m)-To71rSt-1609soyに含まれるrSt-1609soy遺伝子発現カセットを実施例1に記載された方法と同様の方法に準じて、p35S-ACE1/VP16AD-CRに含まれる転写因子遺伝子発現カセットとターミネーター側で連結したベクターGを得た(図5参照)。
作製されたベクターGをアグロバクテリウム(Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404)に導入した。アグロバクテリウムを50 mg/L カナマイシン、300 mg/L ストレプトマイシン、100 mg/L リファンピシンを含むLB寒天培地(0.5% 酵母エキス、1.0% バクトトリプトン、0.5% 食塩、1% 寒天)で培養して薬剤耐性コロニーを選抜することにより、組換えアグロバクテリウムを得た。得られた組換えアグロバクテリウムを、植物遺伝子操作マニュアル(内宮博文著、1992年、講談社サイエンティフィック)に記載される方法に準じて、タバコ(Nicotiana tabacum strain SR1)に感染させることにより、遺伝子導入を行った。遺伝子導入されたタバコの葉片から100 mg/L カナマイシンに耐性を示す不定芽を選抜し、選抜された不定芽から植物個体を再生させた。得られた植物個体から採取されたT1種子を50 mg/L カナマイシンを含むMS寒天培地(MS無機塩類、MSビタミン、3% ショ糖、0.8% 寒天)に播種し生育した後、χ2検定に基づいた5%の有意水準において、カナマイシンに耐性を示す植物個体が3:1の割合で出現するラインを選抜した。尚、植物個体の生育のための培養条件は、明期23時間、暗期1時間、23〜25℃とした。
選抜されたラインについて、播種後数日経過した植物個体を、予め培土が入れられたポットに移植した後、当該植物個体に、誘導発現処理区としてCuSO4を含む水溶液を散布する(尚、非誘導発現処理区として CuSO4を含まない水溶液を用いた。)。さらに、前記植物個体に、PPO阻害型除草剤を散布する。
誘導発現処理区では、非誘導発現処理区と比較して、より高濃度の除草剤に耐性を示す結果となる。
(1)導入ベクターの作製
実施例1で作製されたpKXS-MRE4/35S(-46)-To71sGFPを鋳型に2種の特異的プライマー(EV46-1F、o46-1RC)を用いてPCRを行うことにより、46o断片を増幅した。また、プラスミドCaMV35S-sGFP(S65T)-NOS3'(「植物の細胞を観る実験プロトコール」 福田裕穂他監修、1997年、秀潤社、ISBN 4-87962-170-6)を鋳型に2種の特異的プライマー(omg-1F、omg-1RC)を用いてPCRを行うことにより、Ω配列断片を増幅した。さらに、実施例1で作製されたpKXS-MRE4/35S(-46)-To71sGFPを鋳型に2種の特異的プライマー(oGFP-1F、SIGFP-1RC)を用いてPCRを行うことにより、oGFP断片を増幅した。得られた3種のDNA断片(46o、Ω配列、oGFP)の混合物を鋳型に、2種の特異的プライマー(EV46-1F、SIGFP-1RC)を用いてPCRを行うことにより、ΩsGFP断片を増幅した。得られたΩsGFP断片を、実施例1で作製されたpKXS-MRE4/35S(-46)-To71sGFPのEcoRV及びSacIサイトで切り出される断片と置換することにより、pKXS-MRE4/35S(-46)-ΩsGFPを作製した。作製されたpKXS-MRE4/35S(-46)-ΩsGFPを鋳型に2種の特異的プライマー(Xo-1F、SIGFP-1RC)を用いてPCRを行うことにより、xΩsGFP断片を増幅した。得られたxΩsGFP断片を、実施例1で作製されたpKXS-MRE4/35S(-46)-To71sGFPのXbaI及びSacIサイトで切り出される断片と置換することにより、pKXS-MRE4/35S(-46)-xΩsGFPを作製した。
作製された4種のsGFP遺伝子発現カセットを、実施例1に記載された方法と同様の方法に準じて、p35S-ACE1/VP16AD-CRに含まれる転写因子遺伝子発現カセットとターミネーター側で連結し、ベクターを得た(図7参照)。pKXS-MRE4/35S(-46)-ΩsGFPを由来とするものをベクターH、pKXS-MRE4/35S(-46)-xΩsGFPを由来とするものをベクターI、pKXS-MRE4/35S(-46)-A94sGFPを由来とするものをベクターJ、pKXS-MRE4/35S(-46)-xA94sGFPを由来とするものをベクターKとした。
o46-1RC:5'-gtaaaaataccctctccaaatgaaatgaacttc-3'(配列番号43)
omg-1F:5'-ggtatttttacaacaattaccaacaacaac-3'(配列番号44)
omg-1RC:5'-cattgtaattgtaaatagtaattgtaatgt-3'(配列番号45)
oGFP-1F:5'-acaattacaatggtgagcaagggcga-3'(配列番号46)
SIGFP-1RC:5'-ttagagctcttacttgtacagctcgtcc-3'(配列番号47)
Xo-1F:5'-gactctagagtatttttacaacaattaccaac-3'(配列番号48)
a46-1RC:5'-gttaaatagaccctctccaaatgaaatgaacttc-3'(配列番号49)
aGFP-1F:5'-gaaaaataaatggtgagcaagggcgag-3'(配列番号50)
A94-1F:5'-gtctatttaactcagtattcagaaacaacaaaagttcttctctacataaaattttcctattttagtgatcagtgaaggaaatcaagaaaaataaatg-3'(配列番号51)
A94-1RC:5'-catttatttttcttgatttccttcactgatcactaaaataggaaaattttatgtagagaagaacttttgttgtttctgaatactgagttaaatagac-3'(配列番号52)
Xa-1F:5'-actctagagtctatttaactcagtattcag-3'(配列番号53)
作製されたベクターHからKをそれぞれアグロバクテリウム(Agrobacterium tumefaciens strain C58C1)に導入した。アグロバクテリウムを50 mg/L カナマイシン、100 mg/L アンピシリン、100 mg/L リファンピシンを含むLB寒天培地(0.5% 酵母エキス、1.0% バクトトリプトン、0.5% 食塩、1% 寒天)で培養して薬剤耐性コロニーを選抜することにより、組換えアグロバクテリウムを得た。得られた組換えアグロバクテリウムを、モデル植物ラボマニュアル(岩渕雅樹他編集、2000年、シュプリンガー・フェアラーク東京株式会社、ISBN 4-431-70881-2 C3045)に記載される方法に準じて、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana ecotype Columbia)に感染させることにより、遺伝子導入を行った。遺伝子導入されたシロイヌナズナから採取されたT1種子を、20 mg/L ベンレート、200 mg/L クラフォラン、25 mg/L カナマイシンを含む改変MS寒天培地(MS無機塩類、B5ビタミン、1% ショ糖、0.8 % 寒天)に播種し11日間生育させた後、カナマイシンに耐性を示す植物個体を選抜した。選抜された植物個体を20 mg/L ベンレート、200 mg/L クラフォラン、25 mg/L カナマイシンを含む改変MS寒天培地(MS無機塩類、B5ビタミン、1% ショ糖、0.8 % 寒天)に移植し、さらに6日間生育させた。播種後17日経過した植物個体を100μM CuSO4を含む改変MS寒天培地(MS無機塩類、B5ビタミン、2% ショ糖、0.8 % 寒天)に移植することにより、銅イオンによる目的とする外来遺伝子の誘導発現のための処理(以下、誘導発現処理と記すこともある。)を行った。当該誘導発現処理1時間以内(0日目)に、植物個体におけるGFPの蛍光発光状態をマクロ蛍光顕微鏡VB-G05(キーエンス)にて観察し、高感度冷却CCDカメラVB-7010(キーエンス)を用いて蛍光画像を取得した。その後、当該誘導発現処理3日目に、同様の観察をし、蛍光画像を取得した。その結果、ベクターHからKが導入されてなる組換えシロイヌナズナは、誘導発現処理0日目ではGFP蛍光が観察されないのに対して、誘導発現処理3日目では強いGFP蛍光が観察された(図8参照)。尚、植物個体の生育のための培養条件は、播種後11日目までは明期23時間、暗期1時間、23〜25℃とし、播種後11日目以降は明期12時間、暗期12時間、23〜25℃とした。
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号2
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号3
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号4
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号5
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号6
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号7
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号8
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号9
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号10
アダプターのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号11
アダプターのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号12
置換DNA断片のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号13
置換DNA断片のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号14
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号15
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号16
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号17
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号18
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号19
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号20
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号21
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号22
挿入DNA断片のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号23
挿入DNA断片のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号24
置換DNA断片のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号25
置換DNA断片のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号26
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号27
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号28
TaqManプローブのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号29
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号30
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号31
TaqManプローブのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号32
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号33
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号34
TaqManプローブのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号35
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号36
TaqManプローブのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号37
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号38
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号39
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号40
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号41
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号42
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号43
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号44
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号45
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号46
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号47
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号48
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号49
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号50
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号51
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号52
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号53
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
Claims (4)
- 植物において、化学物質により目的遺伝子を誘導発現させるための遺伝子構築物であって、
(a)プロモーター機能を有する領域と目的とする外来蛋白質に係る構造遺伝子領域とを含む、目的遺伝子と、
(b)前記の目的遺伝子とは異なる他の外来遺伝子によりコードされ且つ銅イオンにより活性化される転写因子と、
(c)前記の目的遺伝子が含むプロモーター機能を有する領域の下流に位置する任意の外来遺伝子の5’−非翻訳領域と、
を有するように構築可能に調製されてなり、前記の転写因子とは異なる他の転写因子の転写活性化領域であり、前記の転写因子の下流に位置する転写活性化領域を、さらに追加的に有するように構築されてなることを特徴とする遺伝子構築物、ここで
前記の転写因子の塩基配列は、酵母ACE1由来の塩基配列である、
前記の5’−非翻訳領域の塩基配列は、トマトモザイクウイルスの130k/180k遺伝子由来の塩基配列である、および
前記の転写活性化領域の塩基配列は、単純ヘルペスウイルスのVP16転写因子由来の塩基配列である。 - 任意のプロモーターを前記の転写因子の上流に追加的に有するように構築されてなる遺伝子構築物であることを特徴とする請求項1記載の遺伝子構築物。
- 請求項1または2記載の遺伝子構築物が導入されてなることを特徴とする形質転換体植物。
- 請求項3記載の形質転換体植物から目的とする外来蛋白質を回収することを特徴とする外来蛋白質の取得方法。
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