DE69132725T2

DE69132725T2 - Neue sequenzen vorzugsweise exprimiert während der frühen keimentwicklung und darauf bezogene methoden

Info

Publication number: DE69132725T2
Application number: DE69132725T
Authority: DE
Inventors: C. Knauf; C. Kridl; E. Scherer
Original assignee: Calgene LLC
Current assignee: Monsanto Co
Priority date: 1990-03-16
Filing date: 1991-03-14
Publication date: 2002-07-11
Anticipated expiration: 2011-03-15
Also published as: DK0472712T3; CA2058756A1; US5530194A; ES2163392T3; EP0472712A4; JPH04506155A; WO1991013980A1; ATE205530T1; DE69132725D1; EP0472712A1; EP0472712B1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige in vitro konstruierte DNA-Expressionskassetten, die Samengewebe-Transkription steuern können. Die Erfindung wird anhand eines Promotors veranschaulicht, der sich zur Samengewebe-Transkription einer Pflanze der Gattung Brassica eignet.

Hintergrund der Erfindung

Die Fähigkeit, Genexpression in einem bestimmten Stadium des Pflanzenwachsums oder in einem spezifischen Pflanzengewebe zu steuern, wird von Gentechnikern als wünschenswert angesehen. Zur Erreichung dieses Ziels sind Nukleinsäuresequenzen erforderlich, die die Transkription im gewünschten Gewebe im gewünschten Stadium im Pflanzenwachstumszyklus initiieren. Eine Anwendung von Interesse ist die Fähigkeit; den Phenotyp von Samengewebe zu modifizieren, z. B. die Proteinzusammensetzung, die Ölzusammensetzung, den Nährwert und dergleichen zu verändern.
Um geeignete Nukleinsäuresequenzen zu isolieren, muss ein Produkt identifiziert werden, das im gewünschten Gewebe, nicht jedoch im anderen Gewebe vorhanden ist. Dieses Produkt kann dann dazu dienen, eine Nukleinsäuresequenz im Pflanzengenom zu identifizieren, welche die flankierenden Regulationsregionen enthält. Sobald die Regulationsregionen identifiziert und isoliert wurden, muss ein Konstrukt erzeugt werden, sodass DNA-Sequenzen von Interesse an der richtigen Position angeordnet werden können, um durch diese Sequenzen reguliert zu werden. Schließlich muss das Konstrukt in ein Pflanzengenom integriert und die Wirkung seiner Gegenwart bestimmt werden, d. h. die Fähigkeit, Transkription zu initiieren und den Phenotyp zu beeinflussen.

Einschlägige Literatur

Die EP-A-0.255.378 (und die verwandte EP-A-0.255.377) beschreiben samenspezifische Transkriptionsregulation in allgemeiner Weise und führen Beispiele für zahlreiche Promotoren an, die präferentielle Transkription in verschiedenen Samengeweben initiieren können.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung bietet somit ein extrachromosomales Nukleinsäurefragment, das eine Transkriptionsinitiations-Regulationsregion umfasst;
wobei die Region vom B. campestris Bce4-Gen erhältlich ist, das aus dem Plasmid pCGN1857 (ATCC Nr. 68251) erhältlich ist, oder eine Sequenz mit zumindest 60%iger Sequenzidentität damit ohne jegliche Deletionen oder Mutationen aufweist; und
wobei die Region zumindest bereits 11 Tage nach der Blüte bis etwa 30 bis 35 Tage nach der Blüte Transkription in Samengewebe lenken kann.
In einem weiteren Aspekt bietet die Erfindung ein DNA-Konstrukt, das als operabel verbundene Komponenten in 5'→3-Transkriptionsrichtung eine oben definierte Regulationsregion sowie eine DNA-Sequenz von Interesse, die sich von der mit der Transkriptionsinitiations-Region assoziierten intakten Struktur-Gen-Sequenz der Wildform unterscheidet, umfasst.
Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Modifizieren des Phenotyps einer Pflanze, welches Folgendes umfasst: das Integrieren eines DNA-Konstrukts in eine Pflanzenzelle, das als operabel verbundene Komponenten in 5'→3'-Transkriptionsrichtung eine Regulationsregion, wie zuvor definiert, sowie eine DNA-Sequenz von Interesse umfasst, die (a) den Phenotyp der Pflanze modifizieren kann und (b) sich von der mit der Transkriptionsinitiationsregion assoziierten intakten Strukturgen-Sequenz der Wildform unterscheidet,
wodurch die Transkription der DNA-Sequenz von Interesse durch die Pflanze deren Phenotyp modifiziert.
Auf diese Weise können die Produktion exogener Produkte sowie die Modulierung endogener Produkte realisiert werden.
Außerdem bietet die Erfindung Samen, Pflanzenzellen und Pflanzen, die mit solchen Konstrukten transformiert wurden.
Die Transkriptionsinitiationsregion auf Plasmid pCGN1857 umfassendes E. coli wurde bei der American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA) hinterlegt.

BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN

Fig. 1 ist eine DNA-Sequenz eines cDNA-Klons für Bce4 (SEQ.-ID Nr. 1).
Fig. 2 zeigt partielle Restriktionskarten verschiedener genomischer Subklone eines genomischen Klons von Bce4. Die Kästchen zeigen die Position der Bce4-Kodierregion. B: BamHl, Bg: Bglll, C. Clal, H: Hindlll, P: PStl, S. Sall, X: Xbal.
Fig. 3 zeigt die DNA-Sequenz des genomischen Bce4-Klons (SEQ.-ID Nr. 2).
Fig. 4 zeigt die DNA-Sequenz des genomischen Bce4-Klons nach der in vitro-Mutagenese (SEQ.-ID Nr. 3). Mutagenisierte Sequenzen sind fett gedruckt.
Fig. 5 ist ein schematisches Diagramm der Konstruktion der Bce4-Expressionskassette pCGN1870.
Fig. 6 ist eine DNA-Sequenz der BE5-cDNA.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Neuartige DNA-Sequenzen, die Pflanzenzellen von Pflanzenteilen und ganze Pflanzen umfassen, Konstrukte unter Einsatz solcher Sequenzen und solche Konstrukte enthaltende Pflanzenzellen werden bereitgestellt, in denen die Sequenzen mit Bce4 assoziiert sind.
Bce4 ist ein Pflanzengen, das ursprünglich aus embryonalem Gewebe von Brassica campestris isoliert wurde und ein Expressionsprofil aufweist, das für die Pflanzenbiologie von Interesse ist. Relativ große Mehgen an Bce4-mRNA werden in einem Frühstadium der Embryoentwicklung beobachtet. Tests zeigen, dass die Bce4-RNA-Transkripte zumindest 11 Tage nach der Blüte vorhanden sind, etwa 17-19 Tage nach der Blüte ein Maximum erreichen und 35 Tage nach der Anthese nicht nachweisbar sind. Bce4- mRNA wurde in Wurzel-, Setzling- oder Blattgewebe nicht nachgewiesen, obwohl bestimmte Mengen in Samenmantelgewebe nachgewiesen wurden.
Obwohl die Funktion des aus den Bce4-RNA-Transkripten translatierten Proteins unbekannt ist, sind -da die Expression von Bce4 mit der Akkumulation von Lipiden im Pflanzensamen zusammenfällt und Bce4 vorzugsweise in Samengewebe exprimiert wird - die mit der genomischen Sequzenz von Bce4 assoziierten Regulationsregionen, d. h. die nichtkodierenden Regionen, die das Strukturgen flankieren, für gentechnische Anwendungen von Interesse. Etwa 2 kb der Bce4 entsprechenden genomischen Sequenz sind in Fig. 1 veranschaulicht.
Die für Bce4 kodierende cDNA-Sequenz ist hierin auch dargestellt (Fig. 2). Die cDNA- Sequenz, d. h. die Kodierregion für das Strukturgen, ist relativ kurz und besitzt einen offenen Leserahmen von nur etwa 300 bp. Außerdem ist zu beachten, dass sie keine Intronsequenzen enthält. Die geringe Länge der Bce4-Kodierregion erlaubt die problemlose Manipulation des Bce4-Gens für biotechnologische Anwendungen.
Die mit dem Bce4-Gen assoziierten Regulationsregionen sind insofern erwünscht, als sie die Transkription oder die Transkription und Translation von DNA-Sequenzen von Interesse in Pflanzenwirtszellen bewirken. Bei Verwendung in einem Konstrukt kann die Bce4-Sequenz für den Zielwirt endogen oder exogen sein. Darüber hinaus sind die mit Termination und Transkription assoziierten Bce4-Regulationssequenzen auch von Interesse, insbesondere wenn sie in Verbindung mit stromauf gelegenen Bce4-Transkriptionsinitiationssequenzen verwendet werden.
Die unmittelbar 5' stromauf von der Bce4-Kodierregion befindliche Region sorgt für Initiation der Transkription und Translation des Bce4-Strukturgens. Für einige Anwendungszwecke kann die Transkriptionsinitiationsregion ohne Translationsinitiationssequenzen verwendet werden, z. B. bei Verwendung der Bce4-Transkriptionsinitiationsregion zum Regulieren der Transkription einer DNA-Sequenz von Interesse in Antisense- Orientierung. Die Transkriptionsinitiationsregion umfasst Transkriptionskontrollregionen, wie z. B. "TATAA"- und "CAAT"-Box-Sequenzen sowie Sequenzen, die den zeitlichen Ablauf und die Gewebespezifität des transkribierten Produkts regulieren. Die Bce4-Translationsinitiationsregion, Ribosomen-Bindungsstelle und andere mit der Proteinexpression der mRNA-Sequenz des "ATG"-Startcodons assoziierten verwandten Sequenzen werden vorzugsweise in Verbindung mit der Bce4-Transkriptionsinitiationsregion verwendet. Das "ATG"-Startcodon wird oft von der DNA-Sequenz von Interesse bereitgestellt. Die Verwendung der Bce4-Transkriptions/Translationsinitiationsregionen in Kombination wird als "Bce4-Promotor" bezeichnet. Alternativ dazu können in einigen Ausführungsformen die Transkriptions- oder Translationsinitiationsregionen von Bce4 mit anderen nichtkodierenden 5'-Regionen kombiniert werden, um heterologe Promotoren zu erzeugen.
Die Bce4-Transkriptionsinitiationsregion erstreckt sich über mindestens 500 bp 5' stromauf von der Transkriptionsstartstelle des Strukturgens. Noch bevorzugter umfasst die Transkriptionsinitiationsregion zumindest 1 kb stromauf von der Transkriptionsstartstelle des Strukturgens, und am bevorzugtesten wird ein Bce4-Promotor, d.h. umfassend sowohl die Transkriptions- als auch die Translationssequenzen unmittelbar 5' vom "ATG"- Translationsstart, mit zumindest etwa 5 oder 7 kb verwendet.
Die Regulationsregion unmittelbar 3' stromab vom Strukturgen (steuert die Transkriptionstermination) erstreckt sich über zumindest 100 bp, noch bevorzugter 500 bp4 noch bevorzugter etwa 700 bp und am bevorzugtesten zumindest etwa 1,5 kb, über das Transkriptionsstopcodon "TAA" der Kodierregion hinaus. Sequenzen unter Verwendung von 1,9 kb der Bce4-3'-Sequenz stromab vom Stopcodon sind ebenfalls vorzuziehen.
Es gibt Hinweise darauf, dass Bce4 einer Einzelgen-Familie von Brassica campestris, jedoch einer Mehrfachgen-Familie von Brassica napus angehört. Unter Mehrfachgen-Familien ist es wünschenswert, jene Transkriptionsinitiations-Regulationsregion zu finden, die ein hohes Ausmaß an Transkription bietet. Somit sollte die Transkriptionsinitiations- Regulationsregion zumindest etwa 10%, vorzugsweise zumindest etwa 20%, noch bevorzugter zumindest etwa 30%, der gesamten Bce4-mRNA bereitstellen. Dies kann durch Verwendung zweier Sonden ermittelt werden, wobei eine Sonde eine konservierte Sequenz enthält und sich an die gesamte Bce4-mRNA bindet und die andere Sonde in einer polymorphen Region des Bce4-Locus liegt, der sich nur an das gerade untersuchte Bce4-Gen bindet.
Die hierin bereitgestellten Nukleinsäuresequenzen können dazu dienen, Sonden herzustellen, die Bce4-Gene ausanderen Pflanzenquellen als Brassica campestris identifizieren. Somit kann die Bce4-Sequenz unter Anwendung unterschiedlicher Techniken aus jeder geeigneten Pflanze isoliert werden, z. B. aus anderen Samen tragenden Pflanzen, insbesondere anderen Pflanzen der Gattung Brassica, und anderen Ölsamenpflanzen, wie z. B. Sonnenblumen, Sojabohnen, Saflor, Mais und dergleichen. Insbesondere durch Identifizieren von Sequenzen der vorliegenden mit dem Bce4-Gen assoziierten Pflanze können beliebige konservierte Sequenzen als Sonden zur Hybridisierung an DNA oder RNA verwendet werden, die aus einigen anderen Pflanzenquellen stammen. Üblicherweise weist die Sequenz zumindest etwa 60%, vorzugsweise zumindest etwa 70%, Identität der Basen paare auf, ausschließlich allenfalls vorhandener Deletionen oder Mutationen. Somit können cDNA-Bibliotheken aus der Pflanzenquelle von Interesse hergestellt und die Sonden dazu vewendet werden, cDNA-Sequenzen für Bce4 zu identifizieren. Günstigerweise kann die Ziel-cDNA in einem Plaque-bildenden Virusvektor kloniert werden, sodass hybridisierende Phagen aus dem Plaque gereinigt werden können. Die identifizierten cDNAs können weiter subkloniert und die subklonierte Sequenz analysiert und zur Produktion anderer Sonden verwendet werden. Von cDNA-Sequenzen abgeleitete Sönden können dazu dienen, genomische Sequenzen in einer genomischen Pflanzenbibliothek der geeigneten Pflanzenspezies zu identifizieren, und die positiven Klone durch Restriktionsenzymspaltung analysiert werden. Das Transkriptionsausmaß kann dann in einer Vielfalt an Pflanzengeweben bestimmt werden, um das Transkriptionsmuster in der Pflanze aufzuzeigen. Auf diese Weise können eine oder mehrere Sequenzen identifiziert werden, die sowohl die Kodierregion als auch die Transkriptionsregulationselemente des Gens aufweisen.
Die Sonden können deutlich kürzer als die gesamte Sequenz sein, sollten aber eine Länge von zumindest etwa 10, vorzugsweise zumindest etwa 15, noch bevorzugter zumindest etwa 20, Nukleotiden aufweisen. Längere Oligonukleotide sind auch nützlich, und zwar bis zur vollen Länge des Bce4-Gens. Sowohl DNA- als auch RNA-Sonden kommen in Frage.
Bei der Verwendung werden die Sonden typischerweise nachweisbar markiert (z. B. mit ³²P-markierten oder biotinylierten Nukleotiden) und mit Einzelstrang-DNA oder RNA inkubiert, die typischerweise auf einem Nitrocellulose- oder Nylonfilter immobilisiert ist und aus dem Organismus stammt, in dem das Gen gesucht wird. Auf diese Weise können Nukleinsäuren identifiziert werden, die an die Sonde hybridisieren.
Obwohl Sonden normalerweise zusammen mit einem nachweisbaren Marker verwendet werden, der leichte Identifizierung ermöglicht, eignen sich auch unmarkierte Oligonukleotide - sowohl als Vorläufer markierter Sonden als auch zur Vervendung in Verfahren, die direkte Detektion von DNA oder DNA/RNA ermöglichen. Demzufolge bezieht sich der Ausdruck "Oligonukleotid" auf markierte und unmarkierte Formen.
Sonden und andere diskrete Nukleinsäuresequenzen werden oft als "Fragmente" bezeichnet und können RNA oder DNA umfassen. Ein extrachr omosomales Nukleinsäurefragment kann außerhalb des Genoms als einzelstrangiges oder doppelstrangiges, RNA oder DNA umfassendes Fragment oder in Kombination mit anderen Sequenzen vorliegen. Fragment können in einen viralen Vektor als Teil eines DNA-Konstrukts oder eines Plasmids integriert sein, d. h. eine zirkularisierte Kombination von Fragmenten, die einen Replikationsursprung umfasst, der in Viren, Bakterien und/oder Pflanzen funktionell ist.
Ein DNA-Konstrukt kann - wie oben erwähnt - in 5'→3'-Transkriptionsrichtung eine Bce4-Transkriptionsinitiationsregion und eine DNA-Sequenz von Interesse enthalten, die sich von der Bce4-Strukturgen-Sequenz der Wildform unterscheidet. Eine Transkriptionsterminationsregion ist in Abhängigkeit vom beabsichtigten Verwendungszweck gegebenenfalls im DNA-Konstrukt vorhanden und kann innerhalb der DNA-Sequenz von Interesse angeordnet sein oder aus einer heterologen DNA-Transkriptionsterminationsregion stammen, die auf die DNA-Sequenz von Interesse in 5'→3'-Transkriptionsrichtung folgt. Vorzugsweise kann die Transkriptionsterminationsregion aus dem Bce4-Gen erhalten werden. Die Bce4-Transkriptionsinitiationsregion liegt vorzugsweise in einem Bce4- Promotor. Wenn die DNA-Sequenz unter der Regulationskontrolle der Transkriptions- und der Translationsinitiations- sowie Transkriptionsterminations-Kontrollregionen steht, wird das DNA-Konstrukt als "Expressionskassette" angesehen.
Die DNA-Sequenz von Interesse kann eines von zahlreichen Strukturgenen umfassen. Beispielsweise können Gene dazu dienen, dem Samen günstige agronomische Eigenschaften zu verleihen, z. B. die Verleihung von Herbizid- oder Pestizidresistenz, die Veränderung des Verhältnisses und/oder der Zusammensetzung von Nährstoffen im Samen oder andere wünschenswerte Eigenschatten.
Regulationsregionen aus dem 'Bce4-Gen eignen sich besonders für Anwendungen zur Modifikation von Pflanzensamen-Fettsäuren und/oder -Ölen, ohne den Rest der Pflanze zu beeinflussen. Verschiedene Änderungen sind wünschenswert, z. B. die Veränderung des Verhältnisses und/oder der Mengen verschiedener Fettsäuren betreffend Länge, Sättigung und dergleichen, und in ähnlicher Weise die anschließende Modifikation der Zusammensetzung der Pflanzenspeicherlipide, wenn die Fettsäurereste in Triacylglycerine eingebaut werden. Diese Ergebnisse können erzielt werden, indem die Expression eines oder mehrerer endogener Produkte, insbesondere von Enzymen oder Cofaktoren, durch Erzeugung eines Transkriptionsprodukts reduziert wird, das zum Transkriptionsprodukt eines nativen Gens komplementär ist, um die Reifung und/oder Expression des Transkriptionsprodukts zu hemmen oder für die Expression eines Strukturgens zu sorgen (entweder endogen oder exogen), das mit der Fettsäuresynthese assoziiert ist. Mit Fettsäuresynthese assoziierte Expressionsprodukte sind z. B. Acylträgerprotein (beschrieben in der US-A-5.110.728 (USSN 437.764)) und Stearoyl-ACP-Desaturase.
Ein DNA-Konstrukt kann aus getrennten Nukleinsäurefragmenten zusammengesetzt werden. Diese Fragmente können mittels einer Vielzahl von Techniken aus einer Vielzahl von Quellen gewonnen werden. Die Fragmente können durch Einsatz von Restriktionsenzymen von unerwünschter DNA abgetrennt werden. Wenn keine nützlichen Restriktionserkennungsstellen an günstiger Position in der gerade manipulierten DNA-Sequenz liegen, können Stellen mittels stellengerichteter Mutagenese, Polymerase-Kettenreaktion, Linkern oder dergleichen hinzugefügt werden.
Nachdem die gewünschten Fragmente erhalten und so konstruiert wurden, dass sie kompatible, "klebrige" oder abgestumpfte Enden aufweisen, können die Fragmente miteinander ligiert werden, wodurch ein Plasmid entsteht, und zum Klonieren in einen geeigneten Wirt transformiert werden, z. B. E. coli. Plasmid-DNA kann aus Bakterien isoliert und z. B. unter Einsatz von Restriktionsspaltlösungen, Größenscreening, DNA-Sequenzierung oder dergleichen analysiert werden.
Das DNA-Konstrukt kann ferner eines oder mehrere zusätzliche Elemente, wie z. B. selektierbare Marker, Sequenzen für die Translokation des Produkts, einen oder mehrere Replikationsursprünge usw., umfassen. Außerdem kann das DNA-Konstrukt eine zweite DNA-Sequenz von Interesse unter der Regulationskontrolle einer anderen Transkriptions- oder Transkriptions/Translationsinitiationsregion als von Bce4 stehen. Beispiele für zusätzliche Elemente sind weiter unten ausführlich beschrieben.
Je nach der Sequenz von Interesse, dem Zweck der Transformation und dem jeweiligen Wirt sind andere Sequenzen, die im erfindungsgemäßen DNA-Konstrukt vorhanden sein können, Sequenzen, die bestimmte Funktionen erfüllen. In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, die Translokation des Expressionsprodukts aus dem Zytoplasma zu einer Organelle oder Sekretion zu ermöglichen. In diesem Fall können verschiedene Transitpeptide für das Translozieren der Sequenz von Interesse zu einer Organelle (z. B. dem Chloroplast oder dem Mitochondrion) oder zum Sekretieren des Proteins in den extrazellulären Raum oder an die Zelloberfläche verwendet werden. Es wurden bislang verschiedene Transitpeptide verwendet, z. B. das Transitpeptid der kleinen Untereinheit des Rubisco-Gens, Pflanzen-EPSP-Synthase, Acyl-Trägerprotein und dergleichen.
Bce4-Regulationskonstrukte sind ein wertvolles zusätzliches Instrument für Pflanzengentechnik und eignen sich für jene Anwendungen, die zwei Transkriptionsinitiationsregiorien erfordern. Beispielsweise können Bce4-Konstrukte dazu verwendet werden, andere samenspezifische, 5' stromauf befindliche Regulationsregionen zu verstärken (z. B. aus Napin und Samen-ACP; siehe US-A-5.420.034, Anmeldung 07/147.781 vom 25. Januar 1988). Transkripte aus einem Napingen, "Napin 1-2", isoliert aus Brassica napus, können 18 Tage nach der Blüte detektiert werden und erreichen 27 Tage nach der Blüte ihr Maximum. Transkripte aus einem ACP-Gen, "Bcg 4-4", isoliert aus unreifem embryonalem B. campestris, treten in embryonalem Samengewebe auf, jedoch nicht in Samenmantelgewebe. Somit kann die Verwendung von 5' stromauf befindlichen Bce4-Regulationsregionen in Verbindung mit anderen Transkriptinitiationsregionen, die vorzugsweise in Samen exprimiert werden, die Manipulation und. Koordination zahlreicher Kombinationen von Gewebespezifität, Messagewerten und Zeitablauf ermöglichen. Solche Konstrukte können auch einen zweiten selektierbaren Marker enthalten, der sich vom ersten selektierbaren Marker unterscheidet, um die Bestimmung positiver Transformation zu erleichtern. Der zweite Marker kann sich beim Klonieren bewähren und stellt ein alternatives Verfahren zur Selektion, ausgehend vom ersten selektierbaren Marker dar.
Transformierte Pflanzen der Erfindung enthalten Zellen, die in vitro-Hinzufügung von DNA erfuhren und eine Nachkommenschaft aufweisen, welche die hinzugefügte DNA trägt. Unter Pflanzenzellen sind hierin diskrete Zellen, organisiertes oder unorganisiertes Pflanzengewebe, Pflanzenteile oder ganze Pflanzen zu verstehen. Pflanzenwirte von Interesse sind Brassica, insbesondere napus und campestris, Sonnenblumen, Sojabohnen, Saflor, Mais und andere Samenpflanzen, insbesondere andere Ölsamenpflanzen. Pflanzenzellen können in vitro durch Cokultivierung mit Agrobacterium, Elektroporation, Protoplastenfusion, Mikroinjektion, Beschuss mit Mikroprojektilen und dergleichen transformiert werden.
In der Pflanzentransformation verwendete Plasmide, die in Agrobacterium tumefaciens transformiert werden können, werden oft als binäre Vektoren bezeichnet. Zusätzlich zu den Transkriptionsregulationsregionen kann ein binärer Vektor die linke und noch bevorzugter zumindest eine rechte Grenze des Ti-Plasmids aus Agrobacterium tumefaciens enthalten. Der Vektor kann Replikationsursprünge enthalten, die in E. coli und Agrobacterium aktiv sind, sodass das Plasmid in beiden Wirten replizierbar ist. Um die Selektion von Wirtszellen zu ermöglichen, die den binären Vektor tragen, kann ein selektierbarer Marker an die anderen Komponenten des Vektors gebunden werden, d. h. das DNA- Konstrukt. Dieser Marker ist besonders ein Antibiotikaresistenz-Marker, wie z. B. Gentamicin, Chloramphenicol, Kanamycin, Ampicillin und dergleichen.
Die Gattung Agrobacterium umfasst die Spezies A. tumefaciens, die Gallerkrankung bei Pflanzen hervorruft, und die Spezies A. rhizogenes, die Wurzelhaarerkrankung bei Pflanzen bewirkt. Die Virulenz von A. tumefaciens kann auf das Ti-Plasmid (Tumor induzierendes Plasmid) und die Virulenz von A. rhizogenes auf das Ri-Plasmid (Wurzel induzierendes Plasmid) zurückgeführt werden. Das Ti- und das Ri-Plasmid tragen Regionen, die man als T-DNA (transferierte DNA) bezeichnet); sie werden in das Wirtspflanzengenom integriert und induzieren daraus Tumorbildung oder das Entstehen haariger Wurzeln. Günstigerweise werden solche Plasmide "entwaffnet", wodurch die Region zwischen den T-DNA-Regionen, die Tumore oder haarige Wurzeln hervorruft, entfernt wird. Anschließend können DNA-Sequenzen von Interesse zwischen die T-DNA-Regionen insertiert werden, wobei solche Konstrukte üblicherweise als "Expressionskonstrukte" bezeichnet werden. Diese neue DNA-Sequenz wird dann gemeinsam mit der T- DNA in das Pflanzengenom integriert, wodurch eine Pflanze entsteht, die in ihren Genom diese DNA-Sequenz von Interesse enthält.
Sobald die Zellen transformiert wurden, können transgene Zellen mittels eines mit dem Expressionskonstrukt assoziierten Markers selektiert werden. Das Expressionskonstrukt wird üblicherweise mit einem Marker verbunden, der die Selektion transformierter Pflanzenzellen ermöglicht (im Gegensatz zu nichttransformierten Zellen). Der Marker liefert üblicherweise Resistenz gegenüber einem Antibiotikum, d. h. Kanamycin, Gentamycin, Hygromycin und dergleichen, das für Pflanzenzellen in moderaten Konzentrationen toxisch ist.
Nach der Transformation können die Pflanzenzellen in einem geeigneten Medium gezüchtet werden. Im Falle von Protoplasten ermöglicht die Zellwand die Neubildung unter geeigneten Osmose-Bedingungen. Im Falle von Samen oder Embryonen wird ein zweckmäßiges Keimbildungs- oder Kallus-Initiationsmedium verwendet. Für Explantate wird man auf ein geeignetes Regenerationsmedium zurückgreifen.
Der aus Zellen entstehende Kallus kann in ein Nährstoffmedium eingeführt werden, das für die Bildung von Schösslingen und Wurzeln sorgt; die resultiertenen Pflänzchen können eingesetzt und zu Samen herangezüchtet werden. Während des Wachstums kann Gewebe geerntet und auf das Vorliegen von Expression des Expressionskonstrukts gescreent werden. Nach dem Wachstum kann der Samen gesammelt und neu gepflanzt werden. Eine oder mehrere Generationen können dann gezüchtet werden, um zu ermitteln, ob das Gen nach Mendelschen Regeln vererbt wurde.
Nach dieser allgemeinen Beschreibung der Erfindung folgen zum leichteren Verständnis Beispiele, die lediglich zu Zwecken der Veranschaulichung angeführt werden und keinesfalls als Einschränkung zu verstehen sind.

BEISPIELE

Beispiel 1: Isolierung von Bce4-cDNA

A. Konstruktion einer cDNA-Bibliothek

Voll-RNA wird aus 5 g B. campestris cv. R500-Embryonen isoliert, die aus 17-19 Tage nach der Blüte geernteten Samen stammten. RNA wird in 25 ml 4 M Guanidinthiocyanat-Puffer extrahiert (siehe Colbert et al., PNAS 80, 2248-2252 (1983)). Polysaccharide werden aus der RNA-Probe durch Resuspendieren des Pellets in 6 ml 1 · TE (10 mM Tris/1 mM EDTA, pH = 8), Zugabe von Kaliumacetat bis zu einer Konzentration von 0,05 M und Zugabe des halben Volumens an Ethanol entfernt. Die Probe wird 60 Minuten lang auf Eis gelegt und 10 Minuten lang bei 3000 · g zentrifugiert. RNA wird aus dem Überstand gefällt, indem Natriumacetat bis zu einer Konzentration von 0,3 M zugegeben wird, gefolgt von der Zugabe des doppelten Volumens an Ethanol. RNA wird durch 10-minütige Zentrifugation bei 12.000 · g aus der Probe gewonnen und die Ausbeute mittels UV-Spektralphotometrie berechnet. 2 mg der Voll-RNA werden durch Entfernen von Polysacchariden auf einer 0,25 g Sigma Cell 50 Cellulose-Säule weiter gereinigt. Die RNA wird in 1 ml Ladepuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,5 M NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% SDS) auf die Säule geladen, mit Ladepuffer eluiert und in 10 500 pl-Fraktionen gesammelt. Ethanol wird den 10 Proben zugegeben, um die RNA zu fällen. Die Proben werden zentrifugiert und die Pellets (in den Fraktionen 2-7) in sterilem destilliertem Wasser resuspendiert, vereinigt und erneut in Ethanol gefällt. Die Probe wird zentrifugiert, das resultierende RNA-Pellet an poly(A) + RNA durch Oligo(dt)-CellulosQ-Chromatographie angereichert (Maniatis et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1982), Cold Spring Harbor, New York) und mittels UV-Spektrophotometrie quantifiziert.
Eine embryonale Brassica campestris-cDNA-Bibliothek (17-19 Tage nach der Blüte) wird in Plasmidvektor pCGN1703 unter Verwendung von 5 ug poly(A) + RNA mittels eines ursprünglich von Jackon und Larkins beschriebenen Verfahrens konstruiert (Plant Physiol. 57, 5-10 (1986); modidifziert von Goldberg et al., Developmental Biol. 53, 201- 217 (1981)). Der Plasmid-Klonierungsvektor pcGN1703, der aus dem im Handel erhältlichen Klonierungsvektor Bluescribe M13- (Stratagene Cloning Systems; La Jolla, CA, USA) stammt, wird wie folgt erzeugt: Der Polylinker von Bluescribe M13- wird durch Spaltung mit BamHl, Behandlung mit Mungobohnen-Endonuklease und Ligation stumpfer Enden verändert, um ein BamHl-deletiertes Plasmid (pCGN1700) zu erzeugen. pCGN1700 wird mit EcoRl und Sstl (benachbarte Restriktionsstellen) gespalten und mit synthetischen komplementären Oligonukleotiden mit den Sequenzen
5' CGGATCCACTGCAGTCTAGAGGGCCCGGGA 3' und
5' AATTTCCCGGGCCCTCTAGACTGCAGTGGATCCGAGCT 3'
anneliert. Diese Sequenzen werden insertiert, um die EcoRl-Stelle zu eliminieren, die BamHl-Selle auf die der Sstl-Stelle in Bluescribe M13- gegenüberliegende Seite zu bewegen und neue Restriktionsstellen Pstl, Xbal, Apal, Smal einzuschließen: Das resultierende Plasmid pCGN1702 wird mit Hindlll gespalten und mit Klenow-Enzym mit stumpfen Enden versehen. Die lineare DNA wird teilweise mit Pvull gespalten und mit T4 DNA-Ligase in verdünnter Lösung ligiert. Ein Transformant mit deletierter lac-Promotorregion wird selektiert (pCGN1703) und als Plasmid-Klonierungsvektor verwendet.
Die Bibliothek, die aus etwa 1,5 · 10&sup5; Transformanten besteht, wird in pCGN1703 nach dem Verfahren von Alexander konstruiert (Methods in Enzymology 154, 41-64 (1987)). Kurz zusammengefasst wird poly(A) + RNA im Überschuss an Vektor-DNA anneliert, die an der Sacl-Stelle unter Einsatz des Enzyms terminale Desoxynukleotidyl-Transferase und freier dTTP-Nukleotide mit T-Schwanz versehen wird. Die Vektor-DNA wird dann als Primer für die Synthese des ersten cDNA-Strangs durch das Enzym reverse Transkriptase verwendet (BRL; Gaithersburg, MD, USA), das komplementäre DNA aus dem RNA- Templat transkribiert. Terminale Desoxynukleotidyl-Transferase und freie dGTP-Nukleotide dienen dann dazu, eine Reihe von dGTP-Resten an beide 3'-Enden des Vektor/- cDNA-Komplexes anzufügen. An diesem Punkt sind zwei cDNA-Moleküle pro Vektor vorhanden. Die Vektor/cDNA wid dann mit der Restriktionsendonuklease BamHl gespalten. Diese Spaltung führt zu zwei Arten von DNA-Fragmenten. DNA, die in E. coli kloniert wird, besteht aus dem an ein RNA/cDNA-Molekül gebundenen Vektor. Das andere Fragment besteht lediglich aus RNA/cDNA und kann nicht in E. coli kloniert werden, da es die für die Replikation notwendige genetische Information nicht enthält. Nach der BamHl-Spaltung wird eine Linker-DNA der folgenden Sequenz
der Reaktion zugegeben. Die poly(C)-Reste dieses Linkers annelieren an den poly(G)- Schwanz der RNA/cDNA-Komplexe. Die Reaktionsbedingungen werden dann geändert, um die Zyklisierung der DNA zu erlauben, die nun an beiden Enden BamHl-Restriktionsstellen enthält. E. coli-DNA-Ligase wird der Reaktion zugegeben, um diese Enden enzymatisch zu verknüpfen. Schließlich werden die Enzyme T4-DNA-Ligase, RNaseH und DNA-Polymerase I (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN, USA) der Reaktion zugegeben, sodass das ursprüngliche RNA-Templat entfernt und durch DNA ersetzt wird. Die cDNA (die Plasmid enthält), die nun aus doppelstrangiger cDNA plus Vektor besteht, wird dann in kompetente E. coli-DH5α-Zellen (BRL, Gaithersburg, MD, USA) transformiert, durch Ausplattieren und Abschaben von Kolonien amplifizieä und als rief- gefrorene E, coli-Zellen in 10% DMSO bei -80ºC gelagert.
DNA wird aus einem Teil der amplifizierten Bibliothek isoliert, indem die Alkali-Lyse- Technik von Birnboim und Doly (Nucleic Acids Res. 7, 1513 (1979)) auf einen größeren Maßstab umgelegt wird, und durch CsCl-Zentrifugation gereinigt. Bibliotheks-DNA viird mit EcoRl gespalten und 0,17 ug in 1 ug EcoRl-gespaltene Bakteriophagen-Lambda-gt10- DNA (Stratagene; La Jolla, CA, USA) kloniert. Die DNA wird mittels Packagene-in vitro- Packungsextrakten (Promega; Madison, Wi, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers gepackt. Der Titer des Phagenmaterials, bestimmt durch Verdünnungsplattieren des Phagen in C. coli C600-Zellen (Huynh et al., "DNA Cloning", 8d. 1, D. M. Gover (Hrsg.) (1985), IRL Press Limited; Oxford, England, S. 56-110), beträgt 1 · 10&sup6; pfu pro ml. Phagen mit cDNA-Bibliotheksinserts werden in einer Konzentration von 10³ Plaque-bildenden Einheiten (pfu) pro Platte auf zwei runde NZY-Platten (NZYM-Medium, definiert von Maniatis et al., s.o.) mit einem Durchmesser von 1 SO mm in E. coli C600-Zellen ausplattiert. Die Plaques werden wie folgt von den Platten auf je zwei Nitrocellulose-Filter abgehoben. Die Filter werden 2 Minuten fang auf die Platten aufgelegt und mit der Plaqueseite nach oben auf ein Tablett mit denaturierender Lösung (1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH) übertragen, wo sie 1 Minute lang schwimmen. Die Filter werden dann 2 Minuten lang in neutralisierende Lösung (1,5 M NACl, 0,5 M Tris-HCl, pH 8,0) übertragen, gefolgt von einer 3-minütigen Waschung in 2 · SSC (1 · = 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat, pH 7). Die Filter werden bei Raumtemperatur getrocknet und in einem 80 ºC heißen Vakuumofen 2 Stunden lang gebacken.
Um auf samenspezifische Promotorkandidaten zu screenen, werden obige Filter nacheinander mit radiomarkierter DNA sondiert, die durch reverse Transkription von Brassica campestris-Blatt-mRNA (zwecks Eliminierung von in Blättern exprimierten Klonen) und reverse Transkription von mRNA aus Brassica campestris-Embrvonen (17-19 Tage nach der Blüte zwecks Identifikation von im Embryo exprimierten Klonen gewonnen) hergestellt wird. Da man jedoch davon ausgeht, dass viele der als embryospezifisch identifizierten Klone möglicherweise Klone für das Samenspeicherprotein Napin sind, die nicht erwünscht sind, werden die Filter auch mit radiomarkierter Napin-cDNA hybridisiert, um Napin-Klone zu identifizieren. Alle Vorhybridisierungen und Hybridisierungen erfolgen bei 42ºC in 50 % Formamid, 6 · SSC, 5 · Denhardt-Lösung (1 · = 0,02 % Polyvinylpyrrolidon/0,02 % Ficoll/0,02 % Rinderserumalbumin) und 0,1% denaturierter Lachssperma-DNA. Alle Filter werden nach der Hybridisierung in einer Lösung von 0,1 · SSC mit 0,1% SDS bei 65ºC gewaschen. Autoradiogramme werden durch Belichten eines Röntgenfilms bei -80ºC durch die Filter mit einem Verstärkerschirm erhalten.
Die Napin-Sonde wird durch Nick-Translation gemäß den Anweisungen der Hersteller (Nick Translation System, BRL; Gaithersburg, MD, USA) unter Einsatz von 0,1 ug eines Xhol-Sall DNA-Fragments aus BES, eines Napin cDNA-Klons, der aus einer B. campestris-Samen-cDNA-Bibliothek isoliert wurde (Fig. 6), hergestellt. Die Isolierung von BE5 ist in der US-A-5.420.034 (Anmeldung 07/147.781, eingereicht am 25. Januar 1988) beschrieben. Die radiomarkierten cDNAs aus B. campestris-Blatt- und embryonaler mRNA werden wie folgt erzeugt. 2 ug mRNA wird irl 15 ul sterilem destilliertem Wasser resuspendiert und ein Strang der cDNA aus der mRNA durch Zugabe von 10 ul BRL 5X M- MLV (Moloney-Mäuse-Leukämievirus) Reverse Transkriptase-Puffer (BRL), 40 Einheiten RNasin, Ribonuklease-Hemmer (Promega; Madison, WI, USA), 5 ug Rinderserumalbumin. 1,5 ul einer 20 mM Lösung der Nukleotide dATP, dGTP und dTTP, 1 ul einer 0,4 mM Lösung von dCTP, 1,25 ug Oligo(dt)18, 1,9 ug Actinomycin D, 80 uCi α-³²P-dCTP und von 500 Einheiten M-MLV Reverser Transkriptase (BRL) in einem Reaktionsendvolumen von 50 ul synthetisiert. Die Reaktion wird 60 Minuten lang bei 37ºC laufen gelassen und dann durch Zugabe von 5 ul 0,25 M EDTA abgebrochen. Die Probe wird mit Phenol : Chloroform (50 : 50) extrahiert und dann mit Chloroform alleine extrahiert. Die cDNA wird durch Zugabe des halben Volumens an 7,5 M Ammoniumacetat und dem doppelten Volumen an Ethanöl gefällt. Die Probe wird bei -20ºC 30 Minuten lang gelagert und in einer Mikrozentrifuge geschleudert, um die cDNA zu pelletieren. Das Pellet wird in 100 ul sterilem destilliertem Wasser resuspendiert und die Menge des enthaltenen radioaktiven dCTP durch Flüssigkeits-Szintillationsspektrometrie bestimmt.
16 cDNA-Klone wurden durch Differentialscreening als Klone identifiziert, die in den Samen, jedoch nicht in den Blättern stark exprimiert wurden. Einer dieser Klone, Bce4, wurde Plaque gereinigt und Phagen-DNA unter Verwendung von LambdaSorb Phagen- Adsorbens (Prometa; Madison, WI, USA) gemäß den Anweisungen der Hersteller isoliert. Der Klon wurde durch Spaltung mit EcoRl, Ligation und Transformation in E. coli 71-18-Zellen (Yanisch-Perron et al., Gene 33, 103-119 (1985)) wieder in die Plasmidform zurückgeführt. Der Klon wurde außerdem durch DNA-Sequenzierung (siehe unten) sowie Northern- und Southern-Analysen analysiert.
Der cDNA-Klon Bce4 wurde in 5'→3'-Richtung unter Verwendung synthetisierter Oligomere (Applied Biosystems 380A Synthetisierer, Applied Biosystems; Foster City, CA, USA) sequenziert. Die Oligomere dienten als Primer für die Sequenzierung nach dem Didesoxy-Verfahren (Sanger et al., PNAS 74, 5463-5467 (1977)). Die Sequenz ist in Fig. 1 dargestellt.

B. Northern-Analyse

Die Northern-Analyse zeigt, dass Bce4 vorzugsweise in Samengeweben von B. campestris exprimiert wird.
RNA wird aus einer Reihe von Geweben isoliert: B. campestris-Blättern, ganzen Samen, die 15, 19 und 23 Tage nach der Blütte gewonnen werden, und aus 17-19 Tage nach der Blüte gewonnenen Embryonen. Voll-RNA wird durch Adaptierung des Verfahrens von Lagrimini et al. (PNAS 84, 7542-7546 (1987)) isoliert. Nach der Homogenisierung in 2,5 ml/g Mahlpuffer, Phenol/Chloroform-Extraktion und Zentrifugation (wie oben beschrieben) wird RNA aus der wässrigen Phase durch Zugabe von 1/10 des Volumens an 3 M Natriumacetat und dem doppelten Volumen an Ethanol gefällt, gefolgt von 30-minütigem Gefrieren bei -80ºC und 20-minütiger Zentrifugation bei 13.000 · g. Die Pellets werden mit 80% Ethanol gewaschen und die Zentrifugation wie öben wiederholt. Die Pellets werden in Wasser resuspendiert, das doppelte Volumen an 4 M LiCl wird zugegeben, und die Proben werden über Nacht bei -20ºC gelagert. Die Proben werden wie oben zentrifugiert und die Pellets mit 80% Ethanol gewaschen. Ethanolfällung wird wie oben durchgeführt. Kontaminierende Polysaccharide werden durch Laden der Proben auf Sigma Cell 50-Säulen und Eluieren der RNA wie oben entfernt. Der Dürchfluss wird mit Ethanol gefällt und die RNA an poly(A) + RNA durch oligo(dt)-Cellulose-Säulenchromatographie (Maniatis et al., s.o.) angereichert:
Voll-RNA wird aus 3 Tage alten keimenden B. campestris-Setzlingen und Wurzeln der Setzlinge mittels Extraktion in 4 M Guanidinthiocyanat-Puffer (Colbert et al., s.o.) isoliert. Polysaccharide werden durch Fällung in 50 mM Kaliumacetat und dem halben Volumen an Ethanol entfernt. Die RNA wird aus den Überständen gefällt, und die Proben werden wie oben an poly(A) + RNA angereichert.
Voll-RNA wird aus 17 Tage nach der Blüte gewonnenen Samenmänteln durch eine RNA-Minipräparationstechnik isoliert (Scherer und Knauf, Plant Mol. Biol. 9, 127-134 (1987)) und wie obenan poly(A) + RNA angereichert.
Poly(A) + RNA wird durch UV-Spektralphotometrie quantifiziert. 2 ug poly(A) + RNA aus 17-19 Tage nach der Blüte gewonnenen B. campestris-Embryonen, 15, 19 und 23 nach der Blüte gewonnenen Vollsamen, 17 Tage nach der Blüte gewonnenen Samenmänteln, Blättern, Wurzeln und Setzlingen werden auf Formaldehyd/Agarose-Gelen Elektrophorese unterzogen (Fourney et al., Focus 10(1), 5-7 (1988)) und auf ein GeneScreen Plus-Nylonfilter (NEN Research Products; Boston, MA, USA) übertragen. Das Filter wird - wie oben für das Differentialscreening beschrieben - bei 42ºC über Nacht vorhybridisiert und hybridisiert. Blots werden jeweils 15 min lang zweimal mit 1 · SSC, 0,1 % SDS bei 65 ºC und einmal 30 min lang in 0,2 · SSC, 0,1% SDS bei 65 ºC gewaschen und Röntgenfilm damit belichtet.
Die Ergebnisse zeigen die Gegenwart einer etwa 700 bp-mRNA in Vollsamen-RNA 15, 19 und 23 Tage nach der Blüte und in Embryonen 17-19 Tage nach der Blüte. Ein schwächeres Signal wird in der Samenmantel-RNA detektiert. Kein Hybridisierungssignal wird bei der Wurzel-, Setzlings- oder Blatt-RNA detektiert.

C. Southern-Analyse

Die Anzahl an Genen, die für Bce4 im B. campestris-Genom kodieren, wird durch Southern Blot-Analyse bestimmt. Genomische DNA wird aus jungen B. campestris-Blättern nach dem Verfahren von Dellaporta et al. (Plant Mol. Biol. Rep. 1, 19-21 (1983)) isoliert und einmal durch Banding in CsCl gereinigt. 50 um der DNA werden mit den Restriktionsenzymen Hindill, BamHl, Sall, Xhol oder Balll vollständig gespalten. Die DNA-Spaltlösungen werden auf einem 0,7% Agarosegel Elektrophorese unterzogen. Das Gel wird denaturiert und neutralisiert und die DNA auf eine Nitrocellulosemembran übertragen wie von Maniatis et al. (s.o.) beschrieben. Hybridisierung erfolgt mit einem gereinigten Pstl-Fragment aus dem Bce4 cDNA-Klon, der gemäß den Anweisungen des Herstellers radiomarkiert wurde (Nick Translation Sytem, BRL; Gaithersburg, MD, USA). Die Hybridisierungs- und Waschbedingungen sind die gleichen wie oben bei der Northern-Analyse.
Die Ergebnisse der Hybridisierung zeigen eine einzelne Bande aus jeder der obigen Spaltlösungen, was nahe legt, dass es ein einzelnes Gen gibt, das für Bce4 in B. campestris kodiert. Die BamHl-Spaltlösung lieferte das größte Fragment (> 15 kb) aller Spaltlösungen. Eine ähnliche Southern-Analyse mit B. napus-DNA zeigte Hybridisierung von 3 Banden in DNA-Spaltlösungen mit HindlIl, EcoRl oder Balll - ein Indiz dafür, dass es 3 Gene gibt, die Bce4 im B. napus-Genom entsprechen.

D. Analyse von Bce4-Lokalisierung und Zeitablauf

Das Timing der Bc4-Expression während der Samenentwicklung wird durch Northern- Analyse bestimmt. Unreife Samen von Brassica campestris cv R500 werden 11, 13, 15, 17, 19, 21, 25, 30, 35, 40, 55 und 60 Tage nach der Blüte gesammelt. Voll-RNA wird nach dem Verfahren von Scherer und Knauf (s.o.) hergestellt. 25 ug RNA von jedem Zeitpunkt werden auf einem Formaldehyd-enthaltenden 1,5% Agarosegel Elektrophorese unterzogen (siehe Fourney, Focus 10(1), 5-7 (1988)) und auf Nitrocellulose geblottet (Thomas, PNAS 77, 5201-5205 (1980)). Der Blot wird mit dem Pstl-Insert von Bce4- cDNA, markiert mit ³²P-dCTP, durch Nicktranslation sondiert (Nick Translation Kit, Boehringer Mannheim; Indianapolis, IN, USA). Der Blot wird in 50% Formamid, 10 · Denhardt-Lösung, 5 · SSC, 0,1%& SDS, 5 mM EDTA, 100 pg/ml Lachssperma-DNA und 10% Dextransulfat (nur Hybridisierung) bei 42ºC vorhybridisiert und hybridisiert (Reagenzien beschrieben in Maniatis, s.o.). Die Waschungen erfolgen in 1 · SSC und 0,1% SDS 30 min lang und zweimal in 0,1 · SSC, 0,1% SDS jeweils 15 min lang bei 55ºC. Mit den Blots wird mittels eines Verstärkerschirms über Nacht Röngtenfilm belichtet.
Das Autoradiogramm zeigt, dass eine Bce4-Message zum frühesten untersuchten Zeitpunkt (Tag 11) vorhanden ist, das maximum 17-19 Tage nach der Anthese auftritt und die Message 35 Tage nach der Blüte nicht nachweisbar ist.

Beispiel 2: Isolierung von genomischem Bce4-Klon

Die oben beschriebene Southern-Analyse zeigt, dass das Bce4-Gen auf einem > 15 kb großem BamHl-Fragment enthalten ist. Daher wird eine gerichtete Bibliothek für große BamHl-Fragmente genomischer DNA erzeugt (siehe unten).
Genomische Voll-DNA wird aus primären Blättern 2-3 Wochen alter Brassica campestris cv. R500-Setzlinge, die in Flachschalen keimen gelassen wurden, isoliert. Die Blätter werden gepflückt und vor der Verwendung in flüssigem Stickstoff tiefgefroren. Genomische Voll-DNA wird nach dem Verfahren von Scofield und Crouch (J. Biol. Chem. 262, 12202-12208 (1987)) isoliert. 200 ug genomische DNA werden mit BamHl vollständig gespalten und auf Saccharosegradienten fraktioniert (Maniatis et al., s.o.). Fraktionen, die das genomische Bc4-Fragment enthalten (> 15 kb, bestimmt durch Southern-Analyse von Aliquöten anhand von Fraktionen unter Einsatz eines nicktranslatierten Bce4- cDNA-Fragments), werden vereinigt und durch Ethanolfällung aufkonzentriert.
Eine genomische Brassica campestris-Bibliothek, konstruiert mit BamHl-Restriktioosfragmenten genomischer DNA, wird unter Verwendung des Lambda-Phagen-Vektors LambdaGEM-11 (BamHl-Arme) von Promega (Madison, WI, USA) sowie unter Anwendung der Klonierverfahren nach Maniatis (s.o.) erzeugt. Die resultierenden rekombinanten Phagen werden unter Einsatz von GigaPack Gold gemäß den Anweisungen des Herstellers (Stratagene; La)olla, CA, USA) gepackt und die Bibliothek auf E. coli-Stamm NW2 ausplattiert (Woodcock et al., Nucleic Acids Res. 17, 3469-3478 (1989)). Der Titer der Bibliothek beträgt etwa 2,6 · 10&sup6; pfu/ml.
Die Bibliothek wird durch Adsorbieren der Phagen an NW2 E. coli-Zellen 20 min lang bei 37ºC und durch Ausplattieren auf einer NZY-Platte in NZY + 10 mM MgSO&sub4; und 0,9% Agarose ausplattiert. Insgesamt werden 150.000 rekombinante Bakteriophagen in einer Dichte von 75.000 Plaques/9 cm · 9 cm Platte gescreent. Die Platten werden über Nacht bei 37ºC inkubiert und 2,5 h lang auf 4ºC gekühlt. Die Phagen-DNA wird in doppelter Ausführung auf GeneScreen Plus-Filter (New England Nuclear) übertragen, indem vorgeschnitterie Filter etwa 1 min lang auf die Platten aufgelegt werden. Die Phagen-DNA wird auf den Filtern durch Denaturieren in 1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH für 1 min. Neutralisieren in 1,5 M NaCl, 0,5 M Tris-HCl, pH 8,0, für 2 min und Waschen in 2 · SSC (Maniatis, s.o.) für 3 min immobilisiert. Die Filter werden luftgetrocknet, bis sie gerade noch feucht sind und bei 42ºC gemäß dem Verfahren von Maniatis (s.o.) vorhybridisiert und hybridisiert. Die Filter werden unter Einsatz eines ³²P-markierten Pstl-Fragments (Boehringer Mannheim Nick Translation Kit), das von Bce4-cDNA isoliert wurde, sondiert. Vaschgänge erfolgen mit 1 · SSC, 0,1% SDS 30 min lang und zweimal in 0,1 · SSC, 0,1% SDS jeweils 15 min lang bei 55ºC. Mit den Filtern wird mit einem Verstärkerschirm Röntgenfilm belichtet. Insgesamt 6 Plaques zeigen starke Hybridisierungssignale auf je zwei Filtern. Mehrere werden in den E. coli-Stämmen NW2 und LE392 Plaque gereinigt (Maniatis et il., (1982), s.o.). Ein als P1C1 identifizierter Klon wird durch partielle Restriktionskartierung und DNÄ-Sequenzierung näher charakterisiert. Phagen-DNA aus Fig. 2 wird durch eine modifizierte Version des Verfahrens von Grossberger (Nucleic Acids Research 15(16), 6737 (1987)) isoliert. Zusammenfassend gesagt wird ein Plaque aufgenommen und in ein Röhrchen mit 0,3 ml Adsorptionspuffer (10 mM MgCl&sub2; und 10 mM CaCl&sub2;) und 0,2 ml LE392-Kultur in NZY-Medium eingebracht. Das Röhrchen wird 10 min lang bei 37ºC inkubiert, und es werden 10 ml ECLB (Maniatis, s.o.) mit 10 mM MgCl&sub2; und 0,1% Glucose zugegeben. Das Röhrchen wird über Nacht bei 37ºC geschüttelt. Wenn Lyse sichtbar ist, wird das Röhrchen zweimal bei 5.000 bis 8.000 U/min 10 min lang zentrifugiert. Der Überstand wird dann in einem SW41-Rotor (Beckman) bei 30.000 U/min 30 min lang zentrifugiert. Das Pellet wird in 200 ul SM (Maniatis et al., s.o.) suspendiert und in ein 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen übertragen. 2 ul 10 % SDS werden dem Röhrchen zugegeben und gut vermischt und das Röhrchen bei Raumtemperatur 10 min lang inkubiert. Das Gemisch wird einmal mit Phenol und einmal mit Chloroform extrahiert. Die DNA wird durch Zugabe von 100 ul 7,5 M Ammoniumacetat und 1 ml Ethanol gefällt.
Die DNA-Sequenz des genomischen Klons P1C1 wird durch doppelstrangige Didesoxysequenzierung von pCGN1855 erhalten. pCGN1855 wird durch Insertieren des 5,5 kb- Xbal-Fragments von P1C1, umfassend das Bce4-Gen, in die Xbal-Stelle von pUC18 konstruiert (Norrander et al., Gene 26, 101-106 (1983)). Die DNA-Sequenz wird durch Didesoxysequenzierung (siehe Sanger et al., PNAS 74, 5463-5467 (1977)) einer Reihe genesteter Deletionen erhalten. Deletionen erfolgen in 5'→3'-Richtung unter Verwendung von Exolll- und SI-Nuklease gemäß dem Verfahren von Henikoff (Gene 215, 351-359 (1984)) auf Kpnl/BamHl-gespaltener pcGN1855 DNA. Die erhaltene Sequenz beginnt 662 bp stromauf vom Start der cDNA-Sequenz und setzt sich bis 856 bp stromab vom Ende der cDNA-Sequenz fort. P1C1 aus Fig. 3 kodiert für die Bce4-cDNA, was anhand seiner vollständigen Homologie zur Nukleotidsequenz von Bce4 gezeigt wird.

Beispiel 3: Konstruktion der Expressionskassette

Das etwa 20 kb große Insert von Klon P1C1 wird durch BamHl-Spaltung freigesetzt und in die BamHl-Stelle des binären Vektors PCGN1547 (siehe unten) insertiert, wodurch pCGN1853 gebildet wird. Das Pstl-Fragment von pCGN1853, umfassend das Bce4-Gen, wird in die Pstl-Stelle von pUC18 (Norrander et al. (1983), s.o.) insertiert, wc.durch pCGN1857 gebildet wird. Das Plasmid pCGN1857 wurde bei der ATCC, Rockville, MD, USA, am 9. März 1990 unter der Zugriffsnummer 68251 hinterlegt. Das Clal-Fragment von pCGN1857, umfassend das Bce4-Gen, wird in Clal-gespaltenen Bluescript KS+ (Stratagene; La Jolla, CA, USA) ligiert, wodurch pCGN1864 gebildet wird. Einstrangige DNA wird aus pCGN1864 erzeugt und durch in vitro-Mutagenese unter Verwendung nachstehender Oligonukleotide verändert:
Dies erfolgt nach dem Verfahren von Adelman et al., DNA 2, 183-193 (1983)). Das Oligonukleotid BSCP2 (5' GTAAGACACGACTTATCGCCACTG 3'), das komplementär zu einem Teil von Bluescript ist, ist in der Reaktion enthalten, um die Ausbeute an doppelstrangigen DNA-Molekülen zu verbessern. Das resultierende Plasmid pCGN1866-enthält Xhol- und BamHl-Stellen (aus ßCE45P) unmittelbar 5' vom Bce4-Startcodon sowie BamHl- und Smäl-Stellen (aus BCE43P) unmittelbar 3' vom Bce4-Stopcodon. Siehe Fig. 4. Das Clal-Fragment von pCGN1866, das die mutagenisierten Sequenzen umfasst, wird in die Clal-Stelle von pCGN2016 (weiter unten beschrieben) insertiert, wodurch pCGN- 1866C gebildet wird. Das Clal-Fragment von pCGN1866C dient dazu, das entsprechende Clal-Fragment von pCGN1867 der Wildform (weiter unten beschrieben) zu ersetzen, wodurch pCGN1868 gebildet wird. Bce4-Kodierungssequenzen werden durch Spaltung von pCGN1868 mit BamHl und Rezirkularisierung des Plasmids entfernt, um pCGN- 1870 zu bilden. Siehe Fig. 5. Die Bce4-Expressionskassette pCGN1870 enthält 7,4 kb der 5'-Regulationssequenz und 1,9 kb der 3'-Regulationssequenz aus dem genomischen Bce4-Klon, getrennt durch die Klonierungsstellen Xhol, BamHi und Smal.

pCGN1867

Die BamHl- und Smal-Stellen von pUCl8 (Norrander et al. (1983), s.o.) werden durch BamHl-Smal-Spaltung und Rezirkularisierung des Plasmids entfernt, ohne dass die Enden repariert werden, wodurch pCGN1862 gebildet wird. Das Pstl-Fragment von pCGN1857, umfassend das Bce4-Gen, wird in die Pst-Stelle von pCGN1862 insertiert, um pcGN1867 zu bilden.

pCGN2016

Die Mehrfach-Klonierungsstellen von pUC12-Cm (K. Buckley, Doktorarbeit, UCSD, CA, USA (1985)) werden durch jene von pUC18 ersetzt, um pCGN565 zu bilden. Das Hhal- · Fragment von pCGN565, welches das Chloramphenicolresistenz-Gen enthält, wird ausgeschnitten, unter Verwendung von Mungobohnen-Nuklease abgestumpft und in die EcoRV-Stelle von Bluescript KS- (Stratagene; La Jolla, CA, USA) insertiert, um pCGN- 2008 zu bilden. Das Chloramphenicolresistenz-Gen von pCGN2008 wird durch EcoRl- Hindlil-Spaltung entfernt. Nach der Behandlung mit Klenow-Enzym zwecks Abstumpfen der Enden wird das das Chloramphenicolresistenz-Gen tragende Fragment in die Dral- Stelle von Bluescript KS- insertiert, wbdurch das Ampicillinresistenz-Gen von Bluescript KS- ersetzt wird, um pCGN2016 zu bilden.

pCGN1547

pCGN1547 (McBride und Summerfelt, Plant Mol. Biology 14(27), 269-276 (1990)) ist ein binärer Pflanzen-Transformationsvektor, der die linke und die rechte T-DNA-Grenze von Agrobacterium tumefaciens Octopin Ti-Plasmid pTiA6 (Currier und Nester,). Bact. 126, 157-165 (1976)), das Gentamicinresistenz-Gen von pPh1JI (Hirsch und Beringer, Plasmid 9, 2871-2890 (1984)), einen Agrobacterium rhizogenes Ri Plasmid-Replikationsursprung aus pLJbBl1 (Jouanin et al., Mol. Gen. Genet. 201, 370-374 (1985)), die mas Promotor-Region und mas 3'-Region von pTiA6 mit dem Kanamycinresistenz-Gen von Tn5 Uorgensen et al., s.o.), einen ColE1-Replikationsursprung aus pBR322 (Bolivar et al., Gene 2, 95-133 (1971)) und ein screenbares IacZ'-Markergen aus pUC1 8 (Norrander et al. (1983), s.o.) enthält.
Es gibt drei wesentliche Zwischenkonstrukte, die zur Erzeugung von pCGN1547 dienen:
pCGN1432 (siehe unten) besteht aus der pCGN1547-Hauptkette, dem pRl Plasmid-Replikationsursprung und dem ColEl-Replikationsursprung.
pCGN1536 (siehe unten) enthält die selektierbare mas5'-kan-mas3'-Pflanzen-Markerregion.
pCGN1541b enthält die rechte und die linke T-DNA-Grenze von A. tumefaciens Octopin Ti-Plasmid sowie die IacZ'-Region mit mehreren Klonierungsstellen (zur Ver Vendung als screenbarer Marker in Bakterien) aus pUC19 (Yanisch-Perron et al., Gene 33, 103-119 (1985)). Die Konstruktion dieses Plasmid wird unten beschrieben.
Um pCGN1547 aus den obigen Plasmiden zu konstruieren, wird pCGN1536 mit Xhol gespalten und das die mas5'-kan-mas3'-Region enthaltende Fragment in die Xhol-Stelle von pCGN154ib kloniert, um das Plasmid pCGNi543 zu ergeben, das die T-DNA-linke Grenze-mas5'-kan-mas3'-IacZ'-T-DNA-rechte Grenze enthält. pCGN1543 wird mit Bglll gespalten und das die T-DNA-linke Grenze-mass'-kan-mas3'-IacZ'-rechte Grenze-Region enthaltende Fragment in BamHl gespaltenes pCGN1532 ligiert, um den vollständigen binären Vektor zu ergeben.

pCGN1532

Das 3,5 kb große EcoRl-Pstl-Fragment, welches das Gentamycinresistenz-Gen enthält, wird aus pPhlJI (Hirsch und Beringer, Plasmid 12, 139-141 (1984)) durch EcoRl-Pstl- Spaltung entfernt und in EcoRl-Pstl-gepaltenen pUC9 kloniert (Vieira und Messing, Gene 19, 259-268 (1982)), um pCGN549 zu erzeugen. Hindll-Pstl-Spaltung von pCGN549 liefert ein 3,1 kb-Fragment mit dem Gentamycinresistenz-Gen, das mit dem Klenow- Fragment von DNA Polymerase I an den Enden abgestumpft und in Pvull-gespaltenes pBG322 kloniert wird (Bolivar et al., Gene 2, 95-113 (1977)), um pCG322 Gm zu bilden. pBR322 Gm wird mit Dral und Sphl gespalten, mit Klenow-Enzym behandelt, um stumpfe Enden zu bilden, und das 2,8 kb-Fragment in das Ri Ursprung-enthaltende Plasmid pLJbB11 (Jouanin et al., Mol. Gen. Genet. 201, 370-374 (1985)) kloniert, das mit Apal gespalten und mit Klenow-Enzym an den Enden abgestumpft wurde, wodurch pLHbB11Gm gebildet wird. Der zusätzliche ColEl-Ursprung und das Kanamycinresistenz-Gen werden aus pLHbB11Gm durch Spaltung mit BamHl deletiert; anschließend erfolgt Selbstschluss, um pGmB11 zu bilden. Die Hindill-Stelle vno pGmB11 wird durch Hindlil-Spaltung deletiert, gefolgt von Behandlung mit Klenow-Enzym und Selbstschluss, wodurch pGmB11-H erhalten wird. Die Pstl-Stelle von pGmB11-H wird durch Pstl-Spaltung deletiert, gefolgt von Behandlung mit Klenow-Enzym und Selbstschluss, um pCGN 1532 zu bilden.

pCGN1536

Das 5,4 kb-EcoRl-Fragment wird aus pVK232 (Knauf und Nester, Plasmid 8, 45 (1982)) durch EcoRl-Spaltung entfernt und in EcoRl-gespaltenes pACYC184 kloniert (Chang und Cohen, J. Bacteriol. 134, 1141-1156 (1978)), um pCGN14 zu bilden. Das 1434 bp-Clal- Sphl-Fragment von pCGN14, das die mas 5'-Region (bp 20128-21562 gemäß der Nummerierung von Barker et al., Plant Mol. Biol. 2, 355-350 (1983)) enthält, wird in Accl- Sphl-gespaltenen pUC19 kloniert (Yanisch-Perron et al. (1985), s.o.), um pCGN40 zu erzeugen. Ein 746 bp-EcoRV-Nael-Fragment der mas 5-Region wird durch eine Xhol-Stelle durch Spalten von pCGN40 mit EcoRV und Nael ersetzt, gefolgt von der Ligation in Gegenwart einer synthetischen Xhol-Linker-DNA, wodurch pCGN1036 gebildet wird. Das 765 bp-Sstl-Hindlll-Fragment (bp 18474-19239) von pCGN14, umfassend die mas 3'-Region, wird in Sstl-Hindlll-gespaltenen pUC18 kloniert (Norrander et al. (1983), s.o.), um pCGN43 zu ergeben. Die Hindill-Stelle von pCGN43 wird durch Spaltung mit Hindlll, Abstumpfen der Enden mit Klenow-Enzym und Ligation synthetischer EcoRl-Linker-DNA durch eine EcoRl-Stelle ersetzt, wodurch pCGN1034 gebildet wird. Das 767 bp-EcoRl-Fragment von pCGN1034 wird in EcoRl-gespaltenes pCGN1036 in Jener Orientierung kloniert, die bp 19239 der mas 3'-Region proximal zur mas 5'-Region positioniert, um pcGN1040 zu erzeugen. pCGN1040 wird partieller Spaltung mit Sstl unterzogen, mit T4 DNA-Polymerase behandelt, um stumpfe Enden zu bilden, und in Gegenwart synthetischer Xhol-Linker-DNA ligiert. Ein Klon wird selektiert, in dem nur die Sstl- Stelle an der Verbindungsstelle von bp 18484 und Vektor-DNA (konstruiert in pCGN43 und in pCGN 1040 getragen) durch eine Xhol-Stelle ersetzt ist, um pCGN 1047 zu erzeugen.
pCGN565 (siehe oben) wird mit EcoRl und HindlIl gespalten, mit Klenow-Enzymzwecks Abstumpfen der Enden behandelt und in Gegenwart synthetischer Xhol-Linker- DNA ligiert, um pCGN1003 zu bilden. Dies erzeugt wiederum die EcoRl-Stelle, die an den Xhol-Linker angrenzt. pCGN1003 wird mit EcoRl gespalten, mit Klenow-Enzym zwecks Abstumpfen der Enden behandelt und in Gegenwart synthetischer Pstl-Linker- DNA ligiert, um pcGN1007 zu erzeugen. Das 1,5 kb Xhol-Fragment von pcGN1047, das die mas 5'-Region und die mas 3'-Region mit mehreren Klonierungsstellen dazwischen enthält, wird in Xhol-gespaltenes pCGN1007 kloniert, um pCGN1052 zu bilden. Ein Teil der Mehrfach-Klonierungsstellen von pCGN1052 wird durch Spaltung mit Xbal und Sstl deletiert, zwecks Abstumpfen der Enden mit Klenow-Enzym behandelt und ligiert, um pCGN1052ΔXS zu erzeugen.
Das 1 kb-EcoRl-Smal-Fragment von pCGN783 ist ein binäres Plasmid, das die linke und die rechte T-DNA-Grenze von A. tumefaciens enthält (Barker et al., Plant. Mol. Biol. 2, 335-350 (1983)). Das Gentamicinresistenz-Gen von pPHIJI (Hirsch et al., Plasmid 9, 2871-2890 (1984)), das Kanamycinresistenz-Gen von Tn5 (Jorgenson et al., Mol. Gen. Genet. 177, 65 (1979); und Wolffet al., Nucleic Acids Research 13, 355-367 (1985)) und die 3'-Region aus Transkript 7 von pTiA6 (Barker et al., s.o. (1983)). Das Plasmid pCGN783, das bei der ATCC (Rockville, MD, USA) am 23. Dezember 1988 unter der Zugriffsnummer 67868 hinterlegt wurde und das 1 ATG-Kanamycinresistenz-Gen enthält, wid in EcoRl-Smal-gespaltenen Bluescript M13-KS (Stratagene, Inc., CA, USA) kloniert, um pBSKm zu bilden; dieses Plasmid enthält eine M13-Region, die die Bildung einstrangiger DNA ermöglicht. Einstrangige DNA wird gemäß den Anweisungen des Herstellers erzeugt, und die in vitro-Mutagenese erfolgt gemäß Adelman et al., DNA 2, 183-193 (1983), unter Einsatz eines synthetischen Oligonukleotids mit der Sequenz 5' GAACTCCAGGACGAGGC 3', urim eine Pstl-Stelle mit dem Kanamycinresistenz-Gen zu verändern und sie unspaltbar zu machen, wodurch pCGN1534 gebildet wird. pCGN- 1534 wird mit Smal gespalten und in Gegenwart synthetischer EcoRl Linker-DNA ligiert, um pCGN1535 zu erzeugen.
Das 1 kb-EcoRl-Fragment von pCGN1535 wird in EcoRl-gespaltenes pCGN1052ΔXS kloniert, um eine selektierbare mas5'-kan mas 3'-Pflanzenmarker-Kassette pCGN1536 zu bilden.

pCGN1541b

pCGN565RBα2X (siehe unten) wird mit Bglll und Xhol gespalten und das 728 bp-Fragment, das das rechte T-DNA-Grenzstück und das IacZ'-Gen enthält, mit Bglll-Xhol-gespaltenes pCGN65ΔKX - S + K (siehe unten) ligiert, wodurch das rechte Bglll-Xhol-Grenzfragment von pCGN65ΔKX - S + K ersetzt wird. Das resultierende Plasmid pCGN65α2X enthält beide T-DNA-Grenzen und das IacZ'-Gen. Das Clal-Fragment von pCGN65α2X wird durch Spalten mit Clal, Abstumpfen der Enden mittels Klenow-Fragment und Ligieren mit Xhol-Linker-DNA durch eine Xhol-Stelle ersetzt, vodurch Plasmid pCGN65u- 2XX erhalten wird. pcGN65α2XX wird mit Bglll und EcoRV gespalten, mit dem Klenow- Fragment von DNA Polymerase I behandelt, um stumpfe Enden zu bilden, und in Gegenwart von Bglll-Linker-DNA ligiert, wodurch pCGN65αL2XX' erhalten wird. pCGN65- α2XX' wird mit Bglll gespalten und mit Bglll-gespaltenem pcGN1538 (sich unten) ligiert, wodurch pCGN1541a gebildet wurde, das beide Plasmidhauptketten enthält. pCGN1541a wird mit Xhol gespalten und religiert. Ampicillin-resistente, Chloramphenicol-sensitive Klone werden selektiert, die keine von pACYC184 stammende Hauptkette aufweisen, wodurch pcGN1541b erhalten wird.
pCGN1538 wird durch Spalten von pBR322 mit EcoRl und Pvull, Behandeln mit Klenow zwecks Abstumpfen der Enden und Ligieren mit Bglll-Linkern erzeugt. pCGN1538 ist Ampicillin-resistent und Tetracyclin-sensitiv.
pCG N 65ΔKX-S + K
pCGN501 wird durch Klonieren eines 1,85 kb großen EcoRl-Xhol-Fragments von pTiA6 (Currier und Nester, J. Bact. 126, 157-165 (1976)), umfassend die Basen 13362-15208 (Barker et al., Plant. Mol. Biol. 2, 335-350 (1983)) der T-DNA (rechte Grenze), in EcoRl- Sall-gespaltenes M13mp9 (Vieira und Messing, Gene 19, 259-268 (1982)) konstruiert. pCGN502 wird durch Klonieren eines 1,6 kb-HindlIl-Smal-Fragments von pTiA6, umfassend die Basen 602-2212 der T-DNA (linke Grenze), in Hindll-Smal-gespaltenes M13- mp9 konstruiert. pCGN501 und pCGN502 werden beide mit EcoRl und Hindlll gespalten und beide T-DNA-enthaltende Fragmente gemeinsam in Hindlll-gespaltenes pUC9 kloniert (Vieira und Messing, Gene 19, 259-268 (1982)), um pCGN503 zu ergeben, das beide T-DNA-Grenzfragmente enthält. pCGN503 wird mit Hindlil und EcoRl gespalten, und die zwei resultierenden Hindlll-EcoRl-Fragmente (umfassend die T-DNA-Grenzen) werden in EcoRl-gespaltenes pHC79 (Hohn und Collins, Gene 11, 291-298 (1980)) kloniert, um pCGN518 zu erzeugen. Das 1,6 kb-Kpnl-Ecorl-Fragment von pCGN518, das die linke T-DNA-Grenze enthält, wird in Kpnl-EcoRl-gespaltenes pCGN565 kloniert, um pCGN580 zu erzeugen: Das BamHll-Bglll-Fragment von pCGN580 wid in die BamHl- Stelle von pACYC184 (Chang und Cohen, J. Bacteriol. 134, 1141-1156 (1978)) kloniert, um pCGN51 zu erzeugen. Das 1,4 kb-BamHl-Sphl-Fragment von pcGN60 (siehe Beschreibung zu pCGN565a2X weiter unten), umfassend das rechte T-DNA-Grenzfragment, wird in BamHl-Sphl-gespaltenes pCGN51 kloniert, um pCGN65 zu bilden, das die rechte und die linke T-DNA-Grenze enthält.
pCGN65 wird mit Kpnl und Xbal gespalten, mit Klenow-Enzym zwecks Abstumpfen der Enden behandelt und in Gegenwart synthetischer Bglll-Linker-DNA ligiert, wodurch pCGN65ΔKX erhalten wird. pCGN65AKX wird mit Sall gespalten, mit Klenow-Enzym zwecks Abstumpfen der Enden behandelt und in Gegenwart synthetischer Xho-Linker- DNA ligiert, um pCGN65AKX - S + X zu bilden.

pCGN565RBα2X

pCGN451 (siehe unten) wird mit Hpal gespalten und in Gegenwart synthetischer Sphl- Linker-DNA Ligiert, um pcGN55 zu bilden. Das Xhol-Sphl-Fragment von pCGN55 (bp 13800-15208, einschließlich der rechten Grenze von Agrobacterium tumfaciens T- DNA; (Barker et al., Gene 2, 95-113 (1977))) wird in Sall-Sphl-gespaltenes pUC19 kloniert (Yanisch-Perron et al. (1985), s.o.), wodurch pCGN60 erhalten wird. Das 1,4 kb- Hindlll-BamHl-Fragment von pCGN60 wird in HindIll-BamHl gespaltenes pSP64 kloniert (Promega, Inc.), um pCGN1039 zu erzeugen. pCGN1039 wird mit Smal und Nrul gespalten (unter Deletion der bp 14273-15208; siehe Barker et al., Gene 2, 95-113 (1977)) und in Gegenwart synthetischer Bglll-Linker-DNA ligiert, wodurch pCGN1039- ΔNS erhalten wird. Das 0,47 kb große EcoRl-Hindlll-Fragment von pCGN 1039ANS wird in EcoRl-Hindll-gespaltenes pCGN565 kloniert, um pCGN565RB zu bilden. Die Hind- III-Stelle von pCGN565RB wird durch Spalten mit HindlIl, Behandeln mit Klenow- Enzym und Ligieren in Gegenwart synthetischer Xhol-Linker-DNA durch eine Xhol-Stelle ersetzt, um pCGN565RB - H + X zu erzeugen.
pUC18 (Norrander et al., Gene (1983) s.o.) wird mit Haell gespalten, um das IacZ'-Fragment freizusetzen, zwecks Abstumpfen der Enden mit Klenow-Enzym behandelt und das lacZ' enthaltende Fragment in pCGN565RB - H + X, das mit Accl und Sphl gespalten und mit Klenow-Enzym behandelt wurde, in einer solchen Orientierung : ligiert, dass sich der IacZ'-Promotor proximal zum rechten Grenzfragment befindet. Dieses Konstrukt - pCGN565RBα2x - ist bezüglich IacZ'-Expression positiv, wenn es auf einen geeigneten Wirt ausplattiert wird, und enthält die bp 13990-14273 des rechten Grenzfragments (Barker et al., Plant Mol. Biol. 2, 335-350 (1983)) mit dem deletierten Accl-Sphl-Fragment (bp 13800-13990).

pCGN451

pCGN451 enthält eine ocs5'-ocs3'-Kassette einschließlich der rechten T-DNA-Grenze, kloniert in ein Derivat von pUC8 (Vieira und Messing, s.o.). Der modifizierte Vektor wird durch Spalten von pUCB mit Hincll und Ligieren in Gegenwart synthetischer Linker-DNA zur Bildung von pCGN416 sowie anschließendes Deletieren der EcoRl-Stelle von pCGN416 durch EcoRl-Spaltung und darauf folgende Behandlung mit Klenow-Enzym und Selbstligation zur Bildung von pCGN426 abgeleitet.
Die ocs5'-ocs3'-Kassette wird durch eine Reihe von Schritten aus DNA erzeugt, die vom Octopin Ti-Plasmid pTiA6 abgeleitet wurde (Currier und Nester, s.o.). Um das 5'-Ende zu erzeugen, das die rechte T-DNA-Grenze enthält, wird ein EcoRl-Fragment von pTiA6 (bp 13362-16202; Nummerierung gemäß Barker et al., Plant Mol. Biol. 2, 335-350 (1983), für das eng verwandte Ti-Plasmid pTi15955) durch EcoRl-Spaltung aus pVK232 entfernt (Knauf und Nester, Plasmid 8, 45 (1982)) und in EcoRl-gespaltenes pACYC184 kloniert (Chang und Cohen, s.o.), um pCGN15 zu erzeugen.
Das 2,4 kb-BamHl-EcoRl-Fragment (bp 13774-16202) von pCGN15 wird in EcoRl-Bam- HI-gespaltenes pBR322 kloniert (Bolivar et al., s.o.), um pCGN429 zu ergeben. Das 412 bp große EcoRl-BamHl-Fragment (bp 13362-13772) von pCGN15 wird in EcoRl-BamHlgespaltenes pBR322 kloniert, um pCGN407 zu ergeben. Das abgeschnittene Promotorfragment wird durch Spalten von pCGN407 mit Xmnl (bp 13512) erhalten, gefolgt von Resektion mit Ba131-Exonuklease, Ligation synthetischer EcoRl-Linker und Spaltung mit BamHl. Die resultierenden Fragmente von etwa 130 bp werden gelgäeinigt, in M13- mp9 kloniert (Vieirä und Messing, s.o.) und sequenziert. Ein Klon, nämlich 1-4, in dem der EcoRl-Linker an bp 1362 zwischen dem Transkriptionsinitiationspunkt und dem Translationsinitiationscodon insertiert wurde, wird durch Vergleich mit der Sequenz von de Greve et al., J. Mol. Appl. Genet. 1, 499-512 (1982), identifiziert. Die EcoRl-Spaltungsstelle befindet sich an Position 13639 stromab von der mRNA-Startstelle. Das 141 bp-EcoRl-BamHl-Fragment von 1-4, das den abgeschnittenen Promotor enthält, wird in EcoRl-BamHl gespaltenes pBR322 kloniert, um pCGN428 zu erzeugen. Das 141 bp große EcoRl-BamHl-Promotorstück von pCGN428 und das 2,5 kb große EcoRl-BamHlocs5'-Stück von pCGN429 werden gemeinsam in EcoRl-gespaltenes pUC19 kloniert (Yanisch-Perron (1985), s.o.), um pCGN442 zu erzeugen, wodurch die stromauf gelegene ocs-Region mit einem abgeschnittenen Promotorabschnitt rekonstruiert wird.
Um das ocs3'-Ende zu bilden, wird das Hindlll-Fragment von pLB41 (D. Figurski, UC San Diego, CA, USA) mit dem Gentamicinresistenz-Gen in HindlIl-gespaltenes pACYC- 184 kloniert (Chang und Cohen, s.o.), um pCGN413b zu bilden. Das 4,7 kb BamHl- Fragment von pTiA6 (s.o.) mit der ocs3'-Region wird in BamHl gespaltenes pBR325 kloniert (F. Bolivar, Gene 4, 121-136 (1978)), um 33c-19 zu erzeugen. Die Smal-Stelle an Position 11207 (Barker, s.o.) von 33c-19 wird unter Verwendung eines synthetischen Xhol-linkers in eine Xhol-Stelle umgewandelt, wodurch pCCG401.2 erhalten wird. Das 3,8 kb-BamHl-EcoRl-Fragment von pCGN401.2 wird in BamHl-EcoRl-gespaltenes pCG- N413b kloniert, um pCGN419 zu erzeugen.
Die ocs5'-ocs3'-Kassette wird durch Klonieren des 2,64 kb-EcoRl-Fragments von pCGN- 442, umfassend die 5'-Region, in EcoRl-gespaltenes pCGN419 erzeugt, um pCNG446 zu bilden. Das 3,1 kb-Xhol-Fragment von pCGN446 mit der ocs5-Region (bp 13639- 15208) und der ocs3'-Region (bp 11207-12823) wird in die Xhol-Stelle von pCGN426 kloniert, um pCGN451 zu erzeugen.

Konstruktion von pCGN1557

pcGN 1557 (McBride und Summerfelt, Plant Molecular Biology 14(2), 269-276 (1990)) ist ein binärer Pflanzen-Transformationsvektor, der die linke und die rechte T-DNA- Grenze von Agrobacterium tumefaciens Octopin Ti-Plasmid pTiA6 (Currier und Nester, J. Bact. 126, 157-165 (1976)), das Gentamicinresistenz-Gen von pPhlJl (Hirsch und Beringer, Plasmid 9, 2871-2890 (1984)), einen Agrobacterium rhizogenes Ri Plasmid-Replikationsursprung aus pLJbB11 (Jouanin et al., Mol. Gen. Genet. 201, 370-374 (1985)), eine 35S Promotor-kanR-tml3'-Region, die transformierten Pflanzen Kanamycinresistenz verleihen kann, einen ColE1-Replikationsursprung aus pBR322 (Bolivar et al., Gene 2, 95-133 (1977)) und ein screenbares lacZ'-Markergen aus pUC18 (Norrander et al. (1983), s.o.) enthält.
Es gibt drei wesentliche Zwischenkonstrukte zur Produktion von pCGN1557:
pCGN1532 (siehe Beschreibung betreffend pCGN1547) enthält die pCGN1557-Hauptkette, den pRi Plasmid-Replikationsursprung und den ColE1-Replikationsursprung.
pCGN1546 (siehe unten) enthält die selektierbare CaMV35S5'kanR-tml3'-Pflanzenmarkerregi on.
pCGN 1541b (siehe Beschreibung betreffend pCGN 1547) enthält die rechte und die linke T-DNA-Grenze des A. tumefaciens Octopin Ti-Plasmids und die lacZ'-Region aus pUC19.
Um pCGN 1557 aus den obigen Plasmiden zu konstruieren, wird pCGN 1546 mit Xhol gespalten und das die CaMV 35S5'-kanR-tml3'-Region enthaltende Fragment in die Xhol Stelle von pCGN1541b kloniert, um das Plasmid pCGN1553 zu ergeben, das T-DNA/linke Grenze/CaMV35S5'-kanR-tml3'/IacZ'/T-DNA/linke Grenze enthält. pcGN1553 wird mit Bglll gespalten und das die Region T-DNA/linke Grenze/CaMV35S5% -kanRtml3'/IacZ'/T-DNA-linke Grenze enthaltende Fragment in BamHl gespaltenes pCGN- 1532 ligiert, um den vollständigen binären Vektor pCGN1557 zu ergeben.

Konstruktion von pCGN1546

Die 35S Promotor-tml3'-Expressionskassette pCGN986 enthält einen Blumenkohl-Mosaikvirus 35S- (CaMV35-) Promotor und eine T-DNA tml 3'-Region mit mehreren Restriktionsstellen dazwischen. pCGN986 wird aus einer anderen Kassette abgeleitet, pCGN206, die einen CaMV35S-Promotor und eine andere 3-Region enthält, das CaMV Region VI-3'-Ende. Der CaMV 35S-Promtoor wird als Alul-Fragment (bp 7144-7734) (Gardner et al., Nucl. Acids Res. 9, 2871-2888 (1981)) in die Hinchl-Stelle von M13mp7 kloniert (Messing et al., Nucl. Acids Res. 9, 309-321 (1981)), um C614 zu erzeugen. Eine EcoRl-Spaltlösung von C614 ergab das EcoRl-Fragment aus C614, das den 35S-Promotor enthält, der in die EcoRl-Stelle von pUC8 kloniert wird (Vieira und Messing, Gene 19, 259 (1982)), um pCGN147 zu bilden.
pCGN148a mit einer Promotorregion, einem selektierbaren Marker (KAN mit 2 ATGs) und einer 3'-Region wird durch Spalten von pCGN528 mit Bglll und Insertieren des BamHl-Bglll-Promotorfragments aus pCGN147 hergestellt. Dieses Fragment wird in die Bglll-Stelle von pCGN528 kloniert, sodass die Bglll-Stelle proximal zum Kanamycin- Gen von pCGN528 positioniert wird.
Der für dieses Konstrukt verwendete Shuttlevektor pCGN528 wird wie folgt hergestellt: pCGN525 wird durch Spalten eines Plasmid, das Tn5 enthält, das ein Kanamycin-Gen beinhaltet (Jorgenson et al., Mol: Gen. Genet. 177, 65 (1979)), mit Hindlll-BamHl und Insertieren des Hindlll-BamHl-Fragments mit dem Kanamycin-Gen in die Hindlll-Bam- HI-Stellen im Tetracyclin-Gen von pACYC184 hergestellt (Chang und Cogen, J. Bacteriol. 134, 1141-1156 (1978)). pCGN526 wird durch Insertieren des BamHl-Fragments 19 von pTiA6 (Thomashow et al., Cell 19, 729-739 (1980)), modifiziert mit in die Saml- Stelle insertierten Xhol-Linkern, in die BamHl-Stelle von CGN525 konstruiert. pCGN- 528 wird durch Deletieren des kleinen Xhol-Fragments aus pCGN526 dUrch Spalten mit Xhol und Religieren erhalten.
pCGN149a wird durch Klonieren des BamHl-Kanamycin-Genfragments aus pMB9Kan- XXI in die BamHl-Stelle von pCGN148a hergestellt. pMB9KanXXI ist eine pUC4-Variante (Vieira und Messing, Gene 19, 259-268 (1982)), der die Xhol-Stelle fehlt, die aber ein funktionelles Kanamycin-Gen aus Tn903 enthält, um wirkungsvolle Selektion in Agrobacterium zu ermöglichen.
pCGN149a wird mit Hindlll und BamHl gespalten und an mit Hindlll und BamHl gespaltenes pUC8 ligiert, um pCGN169 zu bilden. Dies entfernt den Tn903-Kanamycinmarker. pCGN169 (siehe Beschreibung betreffend pCGN2016) und pCGN169 werden beide mit Hindill und Pstll gespalten und ligiert, um pCGN203 zu bilden, ein Plasmid, das den CaMV 35S-Promotor und einen Teil des 5'-Endes des Tn5-Kanamycin-Gens enthält (bis zur Pstl-Stelle; )orgenson et al. (1979), s.o.). Eine 3'-Regulationsregion aus pCGN204, einem EcoRl-Fragment von CaMV (bp 408-6105), das die in pUC18 klonierte Region VI 3' enthält (Norrander et al., Gene (1983) s.o.), wird durch Spaltung mit Hindill und Pstl sowie Ligation an pCGN203 angefügt. Die resultierende Kassette pCGN206 bildet die Grundlage für die Konstruktion von pCGN986.
Die pTiA6 T-DNA tml 3'-Sequenzen werden aus dem Bam19 T-DNA-Fragment (Thomashow et al. (1980), s.o.) als BamHl-EcoRl-Fragment (Nukleotide 9062 bis 12.823; Nummerierung gemäß Barker et al., Plant. Mol. Biol. 2, 335-350 (1982)) subkloniert und mit dem pACYC184-Replikationsursprung (Chang und Cohen (1978), s.o.) als EcoRl-Hindlll- Fragment und einem Gentamycin-Resistenzmarker (aus Plasmid pLB41; erhalten von D. Figurski) als BamHl-Hindlll-Fragment kombiniert, um pCGN417 zu erzeugen.
Die einzelne Smal-Stelle von pCGN417 (Nukleotid 11.207 des Bam19-Fragments) wird unter Verwendung von Linkern in eine Sacl-Stelle abgeändert und das BamHl-Sacl-Fragment in pCGN565 subkloniert, um pCGN971 zu ergeben. Die BamHl-Stelle von pCG- N971 wird mittels Linker in eine EcoRl-Stelle umgewandelt. Das resultierende EcoRl- Sacl-Fragment, das die tml 3'-Regulationssequenzen enthält, wird durch Spaltung mit EcoRl und Sacl an pCGN206 gebunden, um pCGN975 zu ergeben. Der kleine Teil des Tn5-Kanamycinresistenz-Gens wird aus dem 3-Ende des CaMV 35S-Promotors durch Spaltung mit Sall und Balll, Abstumpfen der Enden und Ligation mit Sall-Linkern deletiert. Die endgültige Expressionskassette pCGN986 enthält den CaMV 35S-Promotor, gefolgt von zwei Sall-Stellen, einer Xbal-Stelle, BamHl, Smal, Kpnl und der tml 3-Region (Nukleotide 11207-9023 der T-DNA).
Die 35S Promotor-tml 3'-Expressionskassette pCGN986 wird mit Hindlll gespalten. Die Enden werden mit Klenow-Polymerase gefüllt und Xhol-Linker hinzugefügt. Das resultierende Plasmid wird als pCGN986X bezeichnet. Das BamHl-Sacl-Fragment von pBRX- 25 (siehe unten), welches das Nitrilase-Gen enthält, wird in mit BamHl-Sacl gespaltenes pCGN986X insertiert, wodurch pBRX66 erhalten wird.
Die Konstruktion von pBRX25 ist in der US-A-4.810.648 beschrieben. Kurz zusammengefasst ist das Verfahren wie folgt: Die Nukleotidsequenz eines 1212 bp großen Pstl- Hinchl-DNA-Segments, das für die Bromoxynil-spezifische Nitrilase kodiert, enthält 65 bp untranslatierter 5'-Nukleotide. Um die Entfernung eines Teils dieser überschüssigen Nukleotide zu erleichtern, wird Plasmid pBRX9 mit Pstl gespalten und mit Nuklease Ba131 behandelt. BamHl-Linker werden an die resultierenden Enden gebunden. BamHl- Hinchl-Fragmente mit einem fUnktionellen Bromoxynil-Gen werden in die BamHl-Smal- Stellen von pCGN565 kloniert. Das resultierende Plasmid pBRX25 enthält nur 11 bp untranslatierter bakterieller 5'-Sequenz.
pBRX66 wird mit Pstl und EcoRl gespalten, stumpfe Enden werden durch Behandlung mit Klenow-Polymerase gebildet, und Xhol-Linker werden hinzugefügt. Das resultierende Plasmid pBRX68 besitzt nun eine tml 3'-Region, die etwa 1,1 kb groß ist. pBRX68 wird mit Sall und Sacl gespalten, die Enden werden durch Behandlung mit Klenow-Polymerase abgestumpft, und EcoRl-Linker werden hinzugefügt. Das resultierende Plasmid pCGN986XE ist eine 35S-Promotor tml 3'-Expressionskassette ohne das Nitrilase-Gen.
Das Tn5-Kanamycinresistenz-Gen wird dann in pCGN986XE insertiert. Das 1,0 kb-Eco- Rl-Fragment von pCGN1536 (siehe Beschreibung betreffend pCGN1547) wird in mit EcoRl gespaltenes pCGN986XE ligiert. Ein Klon mit dem Tn5-Kanamycinresistenz-Gen in der korrekten Orientierung für Transkription und Translation wird selektiert und als pCGN1537b bezeichnet. Die 35S Promotor KanR-tml 3'-Region wird dann auf eine Chloramphenicol-resistente Plasmidhauptkette übertragen. pCGN786 (ein pUC-CAMbasierter Vektor mit dem synthetischen Oligonukleotid 5' GGAATTCGTCGACAGATC- TCTGCAGCTCGAGGGATCCAAGCTT 3', umfassend die Klonierungsstellen EcoRl, Sall, Bglll, Pstl, Xhol, BamHl und HindlIl, insertiert in pCGN566, wobei pCGN566 den Eco- Rl-Hindlll-Linker von pUC18 enthält, der in die EcoRl-Hindlll-Stellen von pUC13-cm insertiert ist (K: Buckley (1985), s.o.)) wird mit Xhol gespalten und das Xhol-Fragment von pCGN1537b, das die 35S Promotor - Kann-tml 3'-Region enthält, damit ligiert. Der resultierende Klon wird als pCGN1546 bezeichnet.

Beispiel 4: Verwendung von Bce4-Kassette zum Exprimieren von Gus-Gen in transgenen Pflanzen

Verschiedene Abschnitte der Bce4-Expressionskassette können dazu dienen, die Expression von Genen in transgenen Pflanzen voranzutreiben; außerdem können ihre Expressionsmuster miteinander verglichen werden. Zwei Beispiele, die von pCGN1870 abgeleitet wurden (beschrieben in Beispiel 3), sind pCGN1873 und pCGN1876, die nachstehend beschrieben werden.
Das BamHl-Sstl-Fragment von pBl221 (Jefferson et al., EMBO 6, 3901-3907 (1987)), umfassend das β-Glucoronidase-Gen (gus-Gen), wird mit BamHl-Sstl-gespaltenem pUC119 ligiert (Vieira und Messing, Methods in Enzymology 153, 3-4 (1987)), um pCGN1804 zu erzeugen. pCGN1804 wird mit EcoRl gespalten und durch Behandlung mit E. coli DNA-Polymerase I an den Enden abgestumpft. Im Handel erhältliche phosphorylierte Xhol-Linker (P-L Biochemicals; Piscataway, N), USA) werden in die abgestumpfte EcoRl- Stelle insertiert, um pCGN1805 zu erzeugen. Die Ligation mit den Xhol-Linkern regeneriert eine EcoRl-Stelle auf beiden Seiten der Xhol-Stelle von pCGN1805. Das Sall-Xhol- Fragment von pCGN1805 mit dem gus-Gen wird in die Xhol-Stelle von pCGN1870 insertiert, um pcGN1871 zu bilden. Das Pstl-Fragment von pCGN1871, das das gus-Gen in der Bce4-Kassette enthält, wird in die Pstl-Stelle von pCGN1557 (oben beschrieben) insertiert, um pCGN1873 zu bilden. pCGN1873 enthält das gus-Gen unter der Steuerung der 7,4 kb-Bce4-5'- und 1,9 kb-Bce4-3-Regulationssequenzen.
Das Clal-Fragment von pCGN1871, das das gus-Gen enthält, vird in die Clal-Stelle von pCGN2016 insertiert, um pCGN1874 zu bilden. Das Asp718-Pstl-Fragment von pCGN- 1874, das das gus-Gen in der Bce4-Kassette enthält, wird zwischen der Asp718- und der Pstl-Stelle von pCGN1557 insertiert, um pCGN1786 zu erzeugen. pCGN1876 enthält das gus-Gen unter der Steuerung der 5,1 kb-Bce4-5'- und 0,7 kb-Bce4-3'-Regulationssequenzen.
Die binären Vektoren pCGN1873 und pCGN1876 werden in Agrobacterium tumefaciens-Stamm EHA101 transformiert (Hood et al., J. Bacteriol. 168, 1291-1301 (1986)) und dazu verwendet, Brassica napus-Hypokotyle zu transformieren (siehe Beispiel 4).

Beispiel 4: Erzeugung transformierter Pflanzen

Pflanzenmaterial und Transformation

Samen von Brassica napus cv. Westar werden in 95% Ethanol 2 min. lang eingeweicht und die Oberfläche in einer 1,0% Lösung von Natriumhypochlorid, die einen Tropfen Tween 20 enthält, 45 min lang sterilisiert und dreimal mit sterilem destilliertem Wasser ausgespült. Die Samen werden in Magenta-Schachteln mit 1/10 Konzentration von Murashige Minimal Organics Medium (Gibco), ergänzt mit Pyriodoxin (50 ug/l,), Nikotinsäure (50 ug/l), Glycin (200 ug/l,) und 0,6% Phytagar (Gibco), pH 5,8, ausplattiert. Die Samen werden in einer Percival-Kammer bei 22ºC in einer 16-ständigen Lichtphase mit kühlem Fluoreszenzmittel und rotem Licht, dessen Intensität etwa 65 uEinstein pro m² pro s beträgt (uEm&supmin;²s&supmin;¹), zum Keimen gebracht.
Hypokotyle werden aus 5-7 Tage alten Setzlingen ausgeschnitten, zu Stücken mit einer Länge von etwa 4 mm geschnitten und auf Nährplatten ausplattiert (Horsch et al., 1985). Die Nährplatten werden einen Tag vor der Verwendung durch Ausplattieren von 1,0 ml einer Tabak-Suspensionskultur auf einer Petrischale (100 · 25 mm) vorbereitet, die etwa 30 ml MS Salzbasis (Carolina Biological), 100 mg/l Inosit, 1,3 mg/l Thiamin-HCl, 200 mg KH&sub2;PO&sub4; mit 3% Saccharose, 2,4-D (1,0 mg/l), 0,6% Phytagar enthält, und der pH- Wert vor dem Autoklavieren (MS0/1/0 Medium) auf 5,8 eingestellt. Eine sterile Scheibe aus Filterpapier (Whatman 3 mm) wird vor der Verwendung auf die Nährschicht aufgelegt. Tabak-Suspensionskulturen werden wöchentlich durch Übertragen von 10 ml Kultur in 100 ml frisches MS Medium subkultiviert, wie für Nährplatten mit 2,4-D (0,2 mg/l), Kinetin (0,1 mg/l) beschrieben. In Versuchen ohne Verwendung von Nährzellen werden Hypokotylexplantate ausgeschnitten und auf eine Filterpapierscheibe auf dem MSO/I/O Medium aufgelegt. Alle Hypokotylexplantate werden auf Nährplatten 24 h lang bei 22ºC bei kontinuierlichem Licht mit einer Intensität von 30 uEm&supmin;²s&supmin;¹ bis 65 uEm&supmin;²s&supmin;¹ vorinkbiert.
Einzelne Kolonien von A. tumefaciens-Stamm EHA 101 mit einem binären Plasmid werden in 5 ml MG/L-Brühe eingebracht und über Nacht bei 30ºC gezüchtet. Hypokotylexplantate werden in 7-12 I MG/L-Brühe mit Bakterien, die auf 1 · 10&sup8; Bakterien/ml verdünnt wurden, eingetaucht und nach 10-25 min auf Nährplatten aufgelegt. Nach 48- stündiger Coinkubation mit Agrobacterium werden die Hypokotylexplantate in Konzentrationen von 25 mg/l in B5 0/1/0 Kallus-Induktionsmedium eingebracht, das filtersterilisiertes Carbenicillin (500 mg/l, nach Autoklavieren zugegeben) und Kanamycinsulfat (Boehringer Mannheim) enthält.
Nach 3-7 Tagen in Kultur bei kontinuierlicher Lichtbestrahlung mit einer Intensität von 65 uEm&supmin;²s&supmin;¹ ist Kallusgewebe auf der aufgeschnittenen Oberfläche sichtbar, und die Hypokotvlexplantate werden in Schössling-Induktionsmedium übertragen (B5BZ; B5 Salze und Vitamine, ergänzt mit 3 mg/l, Benzylaminopurin, 1 mg/l, Zeatin, 1% Saccharose, 0,6% Phytagar; pH-Wert eingestellt auf 5,8). Dieses Medium enthält auch Carbenicillin (500 mg/l) und Kanamycinsulfat (25 mg/l). Hypokotylexplantate werden alle 2 Wochen auf frischem Schössling-Induktionsmedium subkultiviert.
Die Schösslinge regenerieren sich nach 1-3 Monaten aus den Hypokotylkalli. Grüne Schösslinge mit einer Größe von zumindest 1 cm werden aus den Kalli geschnitten und auf Medium aufgelegt, das B5 Salze und Vitamine, 1% Saccharose, Carbenicillin (300 mg/l), Kanamycinsulfat (50 mg/l) und 0,6% Phytagar enthält. Nach 2-4 Wochen werden die noch grünen Schösslinge an der Basis abgeschnitten und in Magentaschachteln eingelegt, die Wurzel-Induktionsmedium (B5 Salze und Vitamine, 1% Saccharose, 2 mg/l, Indolbuttersäure, 50 mg/l Kanamycinsulfat und 0,6 0/ Phytagar) enthalten. Grüne Schösslinge mit Wurzeln werden auf NPT II-Aktivität getestet.
Wie aus den obigen Ausführungen ersichtlich zeigt eine DNA-Sequenz unter der Regulationskontrolle der stromauf befindlichen Bce4-5'-Regulationsregion bevorzugte Expression in Samengewebe. Gemäß der Erfindung bieten die Bce4-Regulationsregionen ein Verfahren, das nützliche Eigenschaften verleiht, insbesondere die Veränderung des Nährstoffinhalts des Samens.
Alle hierin angeführten Veröffentlichungen und Patentanmeldungen legen Zeugnis über die Kompetenz der Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung ab.
Obwohl die Erfindung ausführlich veranschaulicht und durch Beispiele näher erklärt wurde, ist zu beachten, dass bestimmte Veränderungen und Modifikationen innerhalb des Schutzumfangs der beiliegenden Ansprüche vorgenommen werden können.

Claims

1. Extrachromosomales Nukleinsäurefragment, das eine Transkriptionsinitiationsregulationsregion umfasst;

wobei die Region vom B. campestris Bce4-Gen erhältlich ist, das aus dem Plasniid pCGN1857 (ATCC Nr. 68251) erhältlich ist, oder eine Sequenz mit zumindest 60%iger Sequenzidentität damit ohne jegliche Deletionen oder Mutationen aufweist;

und

N/obei die Region zumindest bereits 11 Tage nach der Blüte bis etwa 30 bis 35 Tage nach der Blüte Transkription in Samengewebe lenken kann.

2. Fragment nach Anspruch 1, das cDNA umfasst. ·

3. Fragment nach Anspruch 1, das eine Genom-Sequenz umfasst.

4. Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Transkriptionsinitiationsregion zumindest 500 bp unmittelbar stromauf von dem in Fig. 1 dargestellten Bce4- Strukturgen umfasst.

5. Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die Regulationsregion zumindest 5,1 kb unmittelbar stromauf von dem in Fig. 1 dargestellten Bce4-Strukturgen umfasst.

6. Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin die Regulationsregion zumindest 7,4 kb unmittelbar stromauf von dem in Fig. 1 dargestellten Bce4-Strukturgen umfasst.

7. DNA-Konstrukt, das als operabel verbundene Komponenten in 5'→3'-Transkriptionsrichtung eine Regulationsregion, wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 definiert, sowie eine DNA-Sequenz von Interesse, die sich von der mit der Transkriptionsinitiationsregion assoziierten intakten Strukturgen-Sequenz der Wildform unterscheidet, umfasst.

8. DNA-Konstrukt nach Anspruch 7, das weiters eine in einer Pflanzenzelle funktionelle Transkriptionsterminationsregion umfasst.

9. DNA-Konstrukt nach Anspruch 8, worin die Transkriptionsterminationsregion zumindest 0,7 kb unmittelbar stromab von dem in Fig. 1 dargestellten Bce4-Strukturgen umfasst.

10. DNA-Konstrukt nach Anspruch 8 oder 9, worin die Transkriptionsterminationsregion zumindest 1,9 kb unmittelbar stromab von dem in Fig. 1 dargestellten Bce4- Strukturgen umfasst.

11. DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 7 bis 10, das weiters einen selektierbaren Märker umfasst.

12. DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 7 bis 11, worin die DNA-Sequenz von Interesse eine Antisense-DNA-Sequenz ist.

13. DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 7 bis 11, worin die DNA-Sequenz von Interesse eine Strukturgen-Sequenz ist.

14. DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 7 bis 13, das weiters eine zweite Transkriptionsinitiationsregion und in 5'→3'-Transkriptionsrichtung eine zweite DNA- Sequenz von Interesse umfasst, worin die zweite Transkriptionsinitiationsregion nicht die Bce4-Transkriptionsinitiationsregion ist und sich die zweite DNA-Sequenz von Interesse von der DNA-Sequenz von Interesse unter der Regulationskontrolle der Bce4-Transkriptionsinitiationsregion unterscheidet.

15. Verfahren zum Modifizieren des Phenotyps einer Pflanze, velches Folgendes umfasst: das Integrieren eines DNA-Konstrukts in eine Pflanzenzelle, das als operabel verbundene Komponenten in 5'→'-Transkriptionsrichtung eine Regulationsregion, wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 definiert, sowie eine DNA-Sequenz von Interesse umfasst, die (a) den Phenotyp der Pflanze modifizieren kann und b) sich von der mit der Transkriptionsinitiationsregion assoziierten intakten Strukturgen-Sequenz der VVildform unterscheidet,

wodurch die Transkription der DNA-Sequenz von Interesse durch die Pflanze deren Phenotyp modifiziert.

16. Verfahren zur Verwendung des DNA-Konstrukts nach einem der Ansprüche 7 bis 14, um für die Transkription einer DNA-Sequenz von Interesse in Pflanzensamen zu sorgen, Folgendes umfassend:

das Integrieren eines DNA-Konstrukts in eine Pflanzenzelle, das in 5'→3'-Transkriptionsrichtung die Transkriptionsinitiationsregion und eine DNA-Sequenz von Interesse umfasst, wodurch die DNA-Sequenz von Interesse in Embryo- und Samenhüllengewebe transkribiert wird.

17. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, das nach der Integration des Konstrukts in die Zelle das Züchten der Zelle zu einer ganzen Pflanze und das Gewinnen von Samen umfasst.

18. Verfahren nach Anspruch 17, das weiters das Sammeln und Neupflanzen des Samens umfasst, um eine oder mehrere Generationen der Pflanzen oder Samen herzustellen, um Produktion eines exogenen Produkts oder Modulierung eines endogenen Produkts zu erzielen.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 18, worin die DNA-Sequenz von Interesse eine Antisense-DNA-Sequenz ist.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 18, worin die DNA-Sequenz von Interesse eine Strukturgen-Sequenz im Leserahmen mit der Bce4-Transkriptionsinitiationsregion ist.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 20, worin die DNA-Sequenz mit Fettsäuresynthese in Zusammenhang steht.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 21, worin die Pflanze aus Samen gezüchtet wird.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 22, worin die Pflanze zum Genus Brassica gehört.

24. Verfahren nach Anspruch 23, worin die DNA-Sequenz in Brassica-Embryo- und - Samenhüllengewebe transkribiert wird.

25. Brassica-Samen, der ein DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 7 bis 14 umfasst.

26. Samen nach Anspruch 25, worin das DNA-Konstrukt eine mit Fettsäuresynthese in Zusammenhang stehende Sequenz umfasst.

27. Olsamen-Nutzpflanzen-Zelle, die ein DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 7 bis 14 umfasst.

28. Brassica-Pflanzenzelle, die ein DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 7 bis 14 umfasst.

29. Pflanze, die eine Pflanzenzelle nach Anspruch 27 oder 28 umfasst.

1. Verfahren zum Modifizieren des Phenotyps einer Pflanze, welches Folgendes umrasst: das Integrieren eines DNA-Konstrukts in eine Pflanzenzelle, das als operabel verbundene Komponenten in 5'→3'-Transkriptionsrichtung Folgendes umfasst:

eine Regulationsregion, wobei die Region vom B. campestris Bce4-Gen erhältlich ist, das aus dem Plasmid pCGN1857 (ATCC Nr. 68251) erhältlich ist, uder eine Sequenz mit zumindest 60%iger Sequenzidentität damit ohne jegliche Deletionen oder Mutationen aufweist; wobei die Region zumindest bereits 11 Tage nach der Blüte bis etwa 30 bis 35 Tage nach der Blüte Transkription in Samengewebe lenken kann; und

eine DNA-Sequenz von Interesse, die (a) den Phenotyp der Pflanze modifizieren kann und (b) sich von der mit der Transkriptionsinitiationsregion assoziierten intakten Strukturgen-Sequenz der Wildform unterscheidet,

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Region cDNA umfasst.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Region eine Genom-Sequenz umfasst.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Transkriptionsinitiationsregion zumindest 500 bp unmittelbar stromauf von dem in Fig. 1 dargestellten Bce4- Strukturgen umfasst.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die Regulationsregion zumindest 5,1 kb unmittelbar stromauf von dem in Fig. 1 dargestellten Bce4-Strukturgen umfasst.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, vorin die Regulationsregion zumindest 7,4 kb unmittelbar stromauf von dem in Fig. 1 dargestellten Bce4-Strukturgen umfasst.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin cfas DNA-Konstrukt weiters eine in einer Pflanzenzelle funktionelle Transkriptionsterminationsregion umfasst.

8. Verfahren nach Anspruch 7, worin die Transkriptionsterminationsregion zumindest 0,7 kb unmittelbar stromab von dem in Fig. 1 dargestellten Bce4-Strukturgen umfasst.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, worin die Transkriptionsterminationsregion zumindest 1, 9 kb unmittelbar stromab von dem in Fig. 1 dargestellten Bce4-Strukturgen umfasst.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, das weiters einen selektierbaren Marker umfasst.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, worin die DNA-Sequenz von Interesse eine Antisense-DNA-Sequenz ist.

12. erfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, worin die DNA-Sequenz von Interesse eine Strukturgen-Sequenz ist.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 12, worin das Konstrukt weiters eine zweite Transkriptionsinitiationsregion und in 5'→3'-Transkriptionsrichtung eine zweite DNA-Sequenz von Interesse umfasst, worin die zweite Transkriptionsinitiationsregion nicht die Bce4-Transkriptionsinitiationsregion ist und sich die zweite DNA-Sequenz von Interesse von der DNA-Sequenz von Interesse unter der Regulationskontrolle der Bce4- Transkriptionsinitiationsregion unterscheidet.

14. Verfahren zur Verwendung des DNA-Konstrukts wie in einem der Ansprüche 1 bis 13 definiert, um für die Transkription einer DNA-Sequenz von Interesse in Pflanzensamen zu sorgen, Folgendes umfassend:

cias Integrieren eines DNA-Konstrukts in eine Pflanzenzelle, das in 5'→3'-Transkriptionsrichtung die Transkriptionsinitiationsregion und eine DNA-Sequenz von Interesse umfasst, wodurch die DNA-Sequenz von Interesse in Embryo- und Samenhüllengewebe transkribiert wird.

15. Verfahren nach Anspruch 14, das nach der Integration des Konstrukts in die Zelle das Züchten der Zelle zu einer ganzen Pflanze und das Gewinnen von Samen umfasst.

16. Verfahren nach Anspruch 15, das weiters das Sammeln und Neupflanzen des Samens umfasst, um eine oder mehrere Generationen der Pflanzen oder Samen herzustellen, um Produktion eines exogenen Produkts oder Modulierung eines endogenen Produkts zu erzielen.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, worin die DNA-Sequenz von Interesse eine Antisense-DNA-Sequenz ist.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, worin die DNA-Sequenz von Interesse eine Strukturgen-Sequenz im Leserahmen mit der Bce4-Transkriptionsinitiationsregion ist.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, worin die DNA-Sequenz mit Fettsäuresynthese in Zusammenhang steht.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, worin die Pflanze aus Samen gezüchtet wird.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, worin die Pflanze zum Genus Brassica gehört.

22. Verfahren nach Anspruch 21, vorin die DNA-Sequenz in Brassica-Embryo- und - Samenhüllengewebe transkribiert wird.

23. 6rassica-Samen, der ein DNA-Konstrukt wie in einem der Ansprüche 1 bis 13 definiert umfasst.

24. Samen nach Anspruch 23, worin das DNA-Konstrukt eine mit Fettsäuresynthese in Zusammenhang stehende Sequenz umfasst.

25. Ölsamen-Nutzpflanzen-Zelle, die ein DNA-Konstrukt wie in einem der Ansprüche 1 bis 13 definiert umfasst.

26. Brassica-Pflanzenzelle, die ein DNA-Konstrukt wie in einem der Ansprüche 1 bis 13 definiert umfasst.

27. Pflanze, die eine Pflanzenzelle nach Anspruch 25 oder 26 umfasst.