DE69934023T2

DE69934023T2 - Pflanzliche promotoren und terminatoren

Info

Publication number: DE69934023T2
Application number: DE69934023T
Authority: DE
Inventors: Satomi Ashiya-shi Nishikawa; 251-1-202 Kenji Kyoto-shi OEDA
Original assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority date: 1998-10-02
Filing date: 1999-09-28
Publication date: 2007-06-21
Anticipated expiration: 2019-09-29
Also published as: AU5761199A; BR9914130B1; EP1117812B1; CN1263862C; CN1321198A; US7202083B1; ATE345393T1; CA2343652A1; WO2000020613A1; EP1117812A1; AR021842A1; CA2343652C; BR9914130A; DE69934023D1

Description

Hintergrund der Erfindung
1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft pflanzliche Promotoren, pflanzliche Terminatoren und dergleichen.
2. Beschreibung des verwandten Fachgebiets
Es hat viele Versuche gegeben, verschiedene transgene Pflanzen, ausgestattet mit nützlichen Merkmalen, durch Einführen eines Gens in Pflanzen und Expression davon zu erzeugen, und einige dieser transgenen Pflanzen sind bereits kommerziell praktikabel geworden. Um solche transgenen Pflanzen zu erzeugen, ist es wichtig, ein Gen, das in Pflanzenzellen eingebracht wird, wirksam zu exprimieren. Ein Promotor ist ein wesentlicher Faktor, der die Transkriptionsrate eines Gens bestimmt, und es ist generell möglich, die Expression eines Gens von Interesse zu erhöhen, indem das Gen unter die Kontrolle eines Promotors mit einer hohen transkriptionellen Aktivität gebracht wird. Da ein Terminator neben seiner Funktion, Anweisungen für die Termination der Transkription zu geben, wichtige Auswirkungen auf die Prozessierung und den Abbau der durch die Transkription erzeugten RNA-Stränge hat, ist es im Hinblick auf die Erhöhung der Expression eines Gens von Interesse zudem oft wirkungsvoll, einen Terminator unmittelbar nach dem 3'-Ende der translatierten Region dieses Gens einzubringen.
EP-A2 0 824 150 beschreibt einen in Pflanzenzellen funktionsfähigen Promotor, welcher von einem Karotten-Gen abgeleitet wurde.
Jedoch sind die bisher erzeugten pflanzlichen Promotoren und pflanzlichen Terminatoren, die in der Pflanzenzucht bei der Einführung eines Gens von Interesse verwendet werden können, alles andere als zufriedenstellend, und daher besteht der dringende Wunsch, neue Promotoren und Terminatoren zu entwickeln, die befähigt sind, ein Gen von Interesse in Pflanzen wirksam zu exprimieren.
Zusammenfassung der Erfindung
Unter diesen Umständen konzentrierten die hierin genannten Erfinder ihre Anstrengungen auf die Untersuchung von Promotoren und Terminatoren, die in Pflanzenzellen funktionsfähig sind, und haben auf diese Weise festgestellt, dass ein Gen von Interesse in pflanzlichen Geweben wie Blatt, Wurzel, Stamm oder dergleichen unter Verwendung einer DNA, die eine bestimmte Nucleotidsequenz hat, wirksam exprimiert werden kann. Die vorliegende Erfindung ist auf der Grundlage dieser Entdeckung vollendet worden.
Folglich stellt die vorliegende Erfindung das Folgende bereit:

1. Einen Promotor, umfassend die folgende DNA (a) oder (b), dadurch gekennzeichnet, dass er in Pflanzenzellen funktionsfähig ist: (a) DNA, umfassend die Nucleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 7 gezeigt ist, oder (b) DNA, umfassend eine Nucleotidsequenz, in welcher eine oder mehrere Basen in der in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 7 gezeigten Nucleotidsequenz entfernt, ersetzt oder hinzugefügt sind, und welche mehr als 90% Identität zu der Nucleotidsequenz einer beliebigen Region bestehend aus 250 bp oder mehr innerhalb der in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 7 gezeigten Nucleotidsequenz aufweist, wobei die DNA Promotorfunktionen hat, welche zu denen der oben unter (a) genannten DNA äquivalent sind.
2. Einen Terminator, umfassend die folgende DNA (a) oder (b), dadurch gekennzeichnet, dass er in Pflanzenzellen funktionsfähig ist: (a) DNA, umfassend die Nucleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 2 gezeigt ist, oder (b) DNA, umfassend eine Nucleotidsequenz, in welcher eine oder mehrere Basen in der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Nucleotidsequenz entfernt, ersetzt oder hinzugefügt sind, und welche mehr als 90% Identität zu der Nucleotidsequenz einer beliebigen Region bestehend aus 250 bp oder mehr innerhalb der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Nucleotidsequenz aufweist, wobei die DNA Terminatorfunktionen hat, welche zu denen der oben unter (a) genannten DNA äquivalent sind.
3. Ein chimäres Gen, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Promotor nach Punkt 1 und ein gewünschtes Gen umfasst, welche in einer funktionsfähigen Form miteinander verbunden sind.
4. Ein chimäres Gen, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Promotor nach Punkt 1, ein gewünschtes Gen und einen Terminator nach Punkt 2 umfasst, welche in einer funktionsfähigen Form miteinander verbunden sind.
5. Einen Vektor, dadurch gekennzeichnet, dass er einen Promotor nach Punkt 1 enthält.
6. Einen Vektor, dadurch gekennzeichnet, dass er einen Promotor nach Punkt 1 und ein gewünschtes Gen enthält.
7. Einen Vektor, dadurch gekennzeichnet, dass er einen Promotor nach Punkt 1, ein gewünschtes Gen und einen Terminator nach Punkt 2 enthält.
8. Ein Verfahren zur Herstellung einer Transformante, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Schritt umfasst, in welchem ein Promotor nach Punkt 1, ein chimäres Gen nach Punkt 3 oder 4 oder ein Vektor nach Punkt 5, 6 oder 7 in eine Wirtszelle eingebracht wird.
9. Eine Transformante, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Promotor nach Punkt 1, ein chimäres Gen nach Punkt 3 oder 4 oder einen Vektor nach Punkt 5, 6 oder 7 trägt, welche in die Wirtszelle eingebracht sind.
10. Eine Transformante nach Punkt 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirtszelle eine Mikrobenzelle oder eine Pflanzenzelle ist.
11. Ein Verfahren zur Expression eines Gens, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Schritt umfasst, in welchem ein Promotor nach Punkt 1 und ein gewünschtes Gen, welches stromabwärts des Promotors angeordnet ist, in eine Wirtszelle eingebracht werden, und einen Schritt, in welchem das gewünschte Gen in der Wirtszelle unter der Kontrolle des Promotors exprimiert wird.
12. Ein Verfahren zur Expression eines Gens, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Schritt umfasst, in welchem ein Terminator nach Punkt 2 und ein gewünschtes Gen, welches stromaufwärts des Terminators angeordnet ist, in eine Wirtszelle eingebracht werden, und einen Schritt, in welchem das gewünschte Gen in der Wirtszelle unter der Kontrolle des Terminators exprimiert wird.

Der weitere Anwendungsbereich der vorliegenden Erfindung wird aus der nachstehend angegebenen, ausführlichen Beschreibung offensichtlich. Jedoch sollte es selbstverständlich sein, dass die ausführliche Beschreibung und die spezifischen Beispiele, obwohl sie bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung zeigen, nur zur Erläuterung angegeben werden, da verschiedene Veränderungen und Modifikationen innerhalb des Geistes und des Schutzumfangs der Erfindung für Fachleute aus dieser ausführlichen Beschreibung ersichtlich werden.
In der Beschreibung und den Ansprüchen, welche folgen, ist selbstverständlich, dass das Wort "umfassen" und Variationen davon wie "umfasst" und "umfassend", sofern es der Zusammenhang nicht anderweitig erforderlich macht, die Einbeziehung einer(s) angegebenen ganzen Zahl oder Schritts oder Gruppe von ganzen Zahlen oder Schritten beinhalten, aber nicht irgendeine(n) andere(n) ganze Zahl oder Schritt oder Gruppe von ganzen Zahlen oder Schritten ausschließen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Restriktionsenzymkarte von Plasmid pCR16G6P, das einen Promotor der vorliegenden Erfindung enthält. "Promotor" kennzeichnet den Promotor der vorliegenden Erfindung. Desgleichen bedeutet "Amp" ein Ampicillin-Resistenzgen; bedeutet "lac I" das Repressorprotein-Gen des Lactose-Operons; bedeutet "lac Z" ein β-Glactosidase-Gen; und bedeutet "ORI" einen Replikationsursprung.
2 zeigt die Restriktionsenzymkarte von Plasmid pCR16G6T, das einen Terminator der vorliegenden Erfindung enthält. "Terminator" kennzeichnet den Terminator der vorliegenden Erfindung. Desgleichen bedeutet "Amp" ein Ampicillin-Resistenzgen; bedeutet "lac I" das Repressorprotein-Gen des Lactose-Operons; bedeutet "lac Z" ein β-Glactosidase-Gen; und bedeutet "ORI" einen Replikationsursprung.
3 zeigt die Restriktionsenzymkarte und die Konstruktionsverfahren für den Expressionsvektor pBICR16G6P, in den ein Promotor der vorliegenden Erfindung eingebracht worden ist. "G6-p" kennzeichnet den Promotor der vorliegenden Erfindung. "nos-p" kennzeichnet den Promotor des Nopalin-Synthase-Gens; "nos-t" kennzeichnet den Terminator des Nopalin-Synthase-Gens; und "35S-p" kennzeichnet den 35S-Promotor des Blumenkohlmosaikvirus. Desgleichen bedeutet "NPTII" ein Kanamycin-Resistenzgen; bedeutet "GUS" ein β-Glucuronidase-Gen; und bedeutet "HPT" ein Hygromycin-Resistenzgen.
4 zeigt die Restriktionsenzymkarte und das Konstruktionsverfahren für den Expressionsvektor pBICR16G6PTΔ-G, in den ein Promotor und ein Terminator der vorliegenden Erfindung eingebracht worden sind. "G6-p" kennzeichnet den Promotor der vorliegenden Erfindung, und "G6-t" kennzeichnet den Terminator der vorliegenden Erfindung. "G6-t" kennzeichnet den von "G6-t" abgeleiteten Terminator, dessen HindIII-Spaltstelle deletiert worden ist. "RB" bedeutet die rechte Grenzsequenz und "LB" bedeutet die linke Grenzsequenz, welche auf dem binären Vektor lokalisiert sind. "GUS" bedeutet ein β-Glucuronidase-Gen.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wird nun ausführlicher beschrieben.
Die Gentechnik-Verfahren, die in der vorliegenden Erfindung angewendet werden, können in Übereinstimmung mit den üblichen Verfahren, welche zum Beispiel bei Sambrook J., Fritsch E.F. und Maniatis T., "Molecular Cloning", 2. Auflage (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989); und Glover D.M., "DNA Cloning" (IRL Press, 1985) beschrieben sind, durchgeführt werden.
In der vorliegenden Erfindung kennzeichnet der Begriff "Promotor" eine DNA, welche die Funktion hat, die Transkription eines Gens von Interesse, welches stromabwärts der DNA angeordnet ist, zu initiieren.
Ein Promotor der vorliegenden Erfindung umfasst die folgende DNA (a) oder (b) (nachstehend bezeichnet als die vorliegende Promotor-DNA):

(a) DNA, umfassend die Nucleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 7 gezeigt ist, oder
(b) DNA, umfassend eine Nucleotidsequenz, in welcher eine oder mehrere Basen in der in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 7 gezeigten Nucleotidsequenz entfernt, ersetzt oder hinzugefügt sind, und welche mehr als 90% Identität zu der Nucleotidsequenz einer beliebigen Region bestehend aus 250 bp oder mehr innerhalb der in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 7 gezeigten Nucleotidsequenz aufweist, wobei die DNA biologische Funktionen hat, welche zu denen der oben unter (a) genannten DNA äquivalent sind.

In diesem Zusammenhang können Beispiele für die "Nucleotidsequenz, in welcher eine oder mehrere Basen entfernt, ersetzt oder hinzugefügt sind", solche Nucleotidsequenzen einschließen, welche natürlich vorkommende Variationen, die aus dem Art- oder Individuum-bedingten Unterschied zwischen Organismen oder dem Unterschied zwischen Geweben, aus denen die DNAs erhalten werden, resultieren, oder künstlich in die DNA eingeführte Variationen enthalten. Die DNA, welche "biologische Funktionen hat, welche zu denen der oben unter (a) genannten DNA äquivalent sind", kann zum Beispiel solche DNAs einschließen, welche eine Nucleotidsequenz umfassen, in welcher eine oder mehrere Basen in der in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 7 gezeigten Nucleotidsequenz entfernt, ersetzt oder hinzugefügt sind, vorausgesetzt, dass sie die Promotorfunktionen in Pflanzenzellen beibehalten, und welche mehr als 90% Identität zu der Nucleotidsequenz einer beliebigen Region bestehend aus 250 bp oder mehr innerhalb der in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 7 gezeigten Nucleotidsequenz aufweisen. Solche DNAs können DNAs sein, welche aus natürlichen Quellen cloniert sind oder welche eine künstlich eingeführte Deletion, Substitution oder Addition einer oder mehrerer Basen in DNAs enthalten, die aus natürlichen Quellen cloniert sind, oder welche durch chemische Synthese künstlich hergestellt werden.
Es ist auch möglich, die Expressionseffizienz eines gewünschten Gens zu erhöhen, wobei ein Schritt ausgeführt wird, in welchem ein Promotor der vorliegenden Erfindung und das gewünschte Gen, welches stromabwärts des Promotors angeordnet ist, in Wirtszellen eingebracht werden, und ein Schritt, in welchem das gewünschte Gen in den Wirtszellen unter der Kontrolle des Promotors exprimiert wird.
Die vorliegenden Promotor-DNAs können mit Hilfe eines PCR-Verfahrens zum Beispiel aus der genomischen DNA von Karotten wie Daucus carota isoliert werden.
Insbesondere werden Gewebe zum Beispiel aus Blättern von Karotten wie Daucus carota gewonnen, und die erhaltenen Gewebe werden in flüssigem Stickstoff eingefroren und anschließend durch physikalisches Zerreiben mit einem Mörser oder dergleichen zu fein pulverisierten Gewebestücken zerkleinert. Die genomische DNA wird durch das übliche Verfahren aus den Gewebestücken extrahiert. Das Extraktionsverfahren kann zum Beispiel nach der CTAB-Methode, beschrieben z.B. bei Shure M. et al., Cell 35 (1983), 225, oder nach der Harnstoff-Phenol-Methode, beschrieben z.B. bei Rogers S.O. und Bendich A.J., Plant Mol. Biol. 5 (1985), 69, durchgeführt werden. Zum Beispiel kann die erhaltene genomische DNA als Matrize verwendet werden, um eine bis mehrere PCR-Runden (Reaktionsbedingungen: zum Beispiel eine bis mehrere PCR-Runden, jeweils durchgeführt für 30-40 Inkubationszyklen bei 94°C für 1 min; bei 55°C für 2 min; und dann bei 74°C für 3 min pro Zyklus) durchzuführen, wobei als Primer ein Oligonucleotid mit einer Nucleotidsequenz, gekennzeichnet durch die Basen Nr. 1 bis 20 in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 7, und ein Oligonucleotid mit einer Nucleotidsequenz, die komplementär ist zu der Nucleotidsequenz, welche durch die Basen Nr. 2029 bis 2052 in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 7 gekennzeichnet ist, verwendet werden, um eine DNA, welche die in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 7 gezeigte Nucleotidsequenz umfasst, oder eine DNA, die eine Nucleotidsequenz umfasst, in welcher eine oder mehrere Basen in der in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 7 gezeigten Nucleotidsequenz entfernt, ersetzt oder hinzugefügt sind, zu amplifizieren. Oligonucleotide, die als solche Primer verwendet werden, können geeigneterweise basierend auf der Nucleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 7 gezeigt ist, konstruiert werden, und können wahlweise eine zusätzliche Nucleotidsequenz wie zum Beispiel eine Restriktionsenzym-Erkennungsnucleotidsequenz, gebunden an die 5'-Enden davon, aufweisen.
Eine DNA, welche amplifiziert wurde, wie vorstehend beschrieben, kann gemäß den üblichen Verfahren, beschrieben zum Beispiel in "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2. Auflage (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press) oder "Current Protocols in Molecular Biology" (1987) (John Wiley & Sons, Inc., ISBN 0-471-50338-X), in einen Vektor cloniert werden. Insbesondere kann die Clonierung unter Verwendung eines Plasmidvektors wie zum Beispiel einem, welcher in dem TA-Clonierungskit (Invirogen Co.) enthalten ist, oder pBluescript II (Stratagene) durchgeführt werden. Die Nucleotidsequenz der clonierten DNA kann zum Beispiel durch das Farbstoff-Desoxy-Terminationsverfahren, beschrieben z.B. in "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2. Auflage (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press), 13.42-13.74, analysiert werden. Um Proben für die Nucleotidsequenzanalyse herzustellen, können wahlweise im Handel erhältliche Reagenzien wie der ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready-Reaction Kit (PE Biosystems) verwendet werden.
Die DNA, welche erhalten wurde, wie vorstehend beschrieben, wird stromabwärts mit einem Reportergen, zum Beispiel einem β-Glucuronidase-Gen, verknüpft, gegebenenfalls in einen Vektor cloniert und dann mit Hilfe von Verfahren wie zum Beispiel der Partikelkanonen-Methode oder der Agrobacterium-Infektionsmethode, wie nachstehend beschrieben, in gezüchtete Pflanzenzellen wie zum Beispiel gezüchtete BY-2-Tabakzellen eingebracht. Zum Erhalt der vorliegenden Promotor-DNA kann das Vorhandensein oder das Fehlen der Promotorfunktionen der vorstehenden DNA anschließend durch Herstellung eines Zellextrakts aus den gezüchteten Zellen und Messen des Extrakts auf eine β-Glucuronidase-Aktivität mit Hilfe einer enzymologischen Technik, wobei der Wert für die Aktivität als ein Indikator verwendet wird, oder durch Eintauchen der gezüchteten Zellen in eine Färbelösung, enthaltend 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-glucuronid, und Beobachten der Abscheidung des blauen Farbstoffes, wobei das Ausmaß der Farbstoffabscheidung als ein Indikator verwendet wird, bestätigt werden. Alternativ kann die vorstehende DNA, welche mit einem Reportergen verbunden ist, auch in gleicher Weise in eine Pflanzenzelle wie zum Beispiel eine Zelle aus einem Wildtyp-Tabakstamm eingebracht werden, und kann aus der Zelle eine Pflanze regeneriert werden. Zum Erhalt der vorliegenden Promotor-DNA kann das Vorhandensein oder das Fehlen der Promotorfunktionen der vorstehenden DNA anschließend durch Messen der β-Glucuronidase-Aktivität in Geweben aus der Pflanze oder eines Nachkommens davon oder durch Eintauchen von Geweben oder Schnitten davon aus der Pflanze oder einem Nachkommen davon in eine Färbelösung, enthaltend 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-glucuronid, und Beobachten der Abscheidung des blauen Farbstoffes, wobei das Ausmaß der Farbstoffabscheidung als ein Indikator verwendet wird, bestätigt werden. Neben dem β-Glucuronidase-Gen können auch andere Gene wie das Luciferase-Gen, das Chloramphenicol-Acetyltransferase-Gen und das Gen des grün fluoreszierenden Proteins als ein Reportergen verwendet werden.
Außerdem kann die vorliegende Promotor-DNA auch zum Beispiel durch Markieren einer DNA, umfassend mindestens einen Teil der in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 7 gezeigten Nucleotidsequenz, und Hybridisieren der DNA als Sonde mit DNAs, welche von einer Pflanze oder dergleichen abgeleitet sind, um DNAs nachzuweisen und zu clonieren, welche spezifisch an die Sonde binden, erhalten werden.
In diesem Verfahren kann zum Beispiel eine genomische DNA-Bank, die von einer Pflanze wie einer Karotte abgeleitet ist, als die DNAs, welche man mit der vorstehenden Sonde hybridisieren lässt, verwendet werden. Als solche DNA-Banken können im Handel erhältliche genomische DNA-Banken verwendet werden oder können genomische DNA-Banken zur Verwendung gemäß den üblichen Verfahren zur Bankherstellung, beschrieben z.B. in "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2. Auflage (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press), oder "Current Protocols in Molecular Biology" (1987) (John Wiley & Sons, Inc., ISBN 0-471-50338-X), zum Beispiel unter Verwendung eines λ-Vektors wie λ-FIX II, λ-EMBL3, λ-EMBL4 oder λ-DASH II (Stratagene) zusammen mit Gigapack-Verpackungsextrakten (Stratagene) für die in-vitro-Verpackung auch hergestellt werden.
Die Verfahren, mit deren Hilfe ermöglicht wird, dass eine Sonde mit solchen DNAs hybridisiert, können eine Koloniehybridisierung oder eine Plaquehybridisierung einschließen, wobei das geeignete Verfahren abhängig von der Art des bei der Bankherstellung verwendeten Vektors ausgewählt werden kann. Falls die verwendete Bank mit einem Plasmidvektor konstruiert worden ist, wird eine Koloniehybridisierung durchgeführt. Genauer werden die DNAs in der Bank zuerst in Wirtsmikroorganismen eingebracht, um Transformanten zu erhalten, und die erhaltenen Transformanten werden verdünnt, auf ein Agarmedium plattiert und bei 37°C gezüchtet, bis Kolonien erscheinen. Wenn die verwendete Bank jedoch mit einem Phagenvektor konstruiert worden ist, wird eine Plaquehybridisierung durchgeführt. Genauer werden die Wirtsmikroorganismen und die Phagen in der Bank unter Bedingungen, welche eine Infektion ermöglichen, zuerst gemischt, dann weiterhin mit Weichagarmedium vermischt und auf ein Agarmedium plattiert. Dieses wird dann bei 37°C kultiviert, bis Plaques erscheinen. Insbesondere werden zum Beispiel gemäß den Verfahren, welche z.B. in "Molecular Cloning", 2. Auflage (Sambrook J., Fritsch E.F. und Maniatis T., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), 2.60-2.65, beschrieben sind, etwa 9,0 × 10⁵ PbE der Phagenbank in NZY-Agarmedium in einer Dichte von 0,1 bis 1,0 PbE pro mm²-Agarmedium ausgestrichen und bei 37°C für 6-10 Stunden kultiviert.
Bei beiden der vorstehenden Hybridisierungsverfahren wird dann eine Membran auf die Oberfläche des Agarmediums gelegt, auf dem die vorstehende Kultur gezüchtet worden ist, und die Transformanten, welche Plasmide tragen, oder die Phagen werden auf die Membran übertragen. Nach der Behandlung mit einem alkalischen Mittel wird die Membran neutralisiert und weiter behandelt, um die DNAs auf der Membran zu fixieren. Insbesondere wird zum Beispiel im Falle einer Plaquehybridisierung nach den üblichen Verfahren, welche z.B. in "Kuroningu to Shikuensu; Shokubutsu Baiotekunoroji Jikken Manyuaru (Übersetzung: Cloning and Sequencing: Plant Biotechnology Experimental Manual)" (Watanabe und Sugiura, Hrsg., Nosonbunka-sha, 1989) beschrieben sind, eine Membran wie eine Nitrocellulose- oder Nylonmembran (z.B. Hybond-N+ (Amersham Pharmacia Biotech, Inc.)) auf das vorstehend beschriebene Agarmedium gelegt und für etwa eine Minute darauf belassen, um zu ermöglichen, dass die Phagenpartikel an die Membran adsorbieren. Anschließend wird die Membran für etwa 3 Minuten in eine alkalische Lösung (1,5 M Natriumchlorid, 0,5 N NaoH) getaucht, um die Phagenpartikel zu lysieren und auf diese Weise die Phagen-DNAs auf der Membran freizusetzen, und dann wird die Membran durch Eintauchen der Membran in eine Neutralisierungslösung (1,5 M Natriumchlorid, 0,5 M Tris-HCl-Puffer, pH 7,5) für etwa 5 Minuten behandelt. Nach Waschen mit einer Waschlösung (300 mM Natriumchlorid, 30 mM Natriumcitrat, 200 mM Tris-HCl-Puffer) für etwa 5 Minuten wird die Membran bei etwa 80°C für etwa 90 Minuten gebacken, um die Phagen-DNAs auf der Membran zu fixieren.
Die hergestellte Membran wird dazu verwendet, eine Hybridisierung mit der vorstehenden DNA als eine Sonde durchzuführen. Die Hybridisierung kann durchgeführt werden, wie zum Beispiel bei Glover D.M., Hrsg., "DNA Cloning, A Practical Approach" (IRL Press, 1985, ISBN 0-947946-18-7); in "Kuroningu to Shikuensu; Shokubutsu Baiotekunoroji Jikken Manyuaru (Übersetzung: Cloning and Sequencing: Plant Biotechnology Experimental Manual)" (Watanabe und Sugiura, Hrsg., Nosonbunka-sha, 1989); oder in "Molecular Cloning", 2. Auflage (Sambrook J., Frisch E.F. und Maniatis T., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) beschrieben wird.
Um die DNA, die als eine Sonde verwendet wird, zum Beispiel mit einem Radioisotop zu markieren, kann ein Random Labeling Kit (Boehringer Mannheim oder Takara Shuzo Co., Ltd.) verwendet werden. Es ist auch möglich, die DNA durch das Durchführen einer PCR zu markieren, wobei die DNA für die Sonde als eine Matrize verwendet wird und dCTP durch [α-³²P]-dCTP ersetzt wird. Alternativ kann das ECL Direct Nucleic Acid Labeling and Detection System (Amersham Pharmacia Biotech, Inc.) verwendet werden, um die als Sonde verwendete DNA zum Beispiel mit einem Fluoreszenzfarbstoff zu markieren.
Viele Reagenstypen und Temperaturbedingungen können für die Durchführung der Hybridisierung verwendet werden. Zum Beispiel werden eine Vorhybridisierungslösung, welche 450-900 mM Natriumchlorid, 45-90 mM Natriumcitrat, 0,1-1,0% Natriumdodecylsulfat (SDS) und 0-200 μg/ml denaturierte unspezifische DNA enthält und welche in einigen Fällen wahlweise jeweils 0-0,2% Albumin, Ficoll, Polyvinylpyrrolidon oder dergleichen enthalten kann, und vorzugsweise eine Vorhybridisierungslösung, enthaltend 900 mM Natriumchlorid, 90 mM Natriumcitrat, 1 % SDS und 100 μg/ml denaturierte Kalbsthymus-DNA, in einem Volumen von 50-200 μl pro cm² der, wie vorstehend beschrieben, hergestellten Membran zubereitet, und die vorstehende Membran wird bei 42-68°C für 1-4 Stunden, vorzugsweise bei 45°C für 2 Stunden, in die Lösung getaucht und darin inkubiert. Anschließend werden eine Hybridisierungslösung, welche zum Beispiel 450-900 mM Natriumchlorid, 45-90 mM Natriumcitrat, 0,1-1,0% SDS und 0-200 μg/ml denaturierte unspezifische DNA enthält und welche in einigen Fällen wahlweise jeweils 0-0,2% Albumin, Ficoll, Polyvinylpyrrolidon oder dergleichen enthalten kann, und vorzugsweise eine Hybridisierungslösung, enthaltend 900 mM Natriumchlorid, 90 mM Natriumcitrat, 1 % SDS und 100 μg/ml denaturierte Kalbsthymus-DNA, mit der Sonde, welche durch die vorstehend beschriebenen Verfahren erhalten wurde, vermischt (in einer Menge äquivalent zu 1,0 × 10⁴ bis 2,0 × 10⁶ ZpM (Zählimpulse pro Minute) pro cm² Membran), um ein Lösungsgemisch in einem Volumen von 50-200 μl pro cm² Membran herzustellen, und die Membran wird bei 42-68°C für 4-20 Stunden, vorzugsweise bei 45°C für 16 Stunden, in das Lösungsgemisch getaucht und darin inkubiert, um eine Hybridisierung zu bewirken. Nach der Hybridisierungsreaktion wird die Membran entnommen und 1-4-mal für jeweils 10-60 Minuten, vorzugsweise zweimal für jeweils 15 Minuten, mit einer Waschlösung, enthaltend zum Beispiel 15-300 mM Natriumchlorid, 1,5-30 mM Natriumcitrat, 0,1-1,0% SDS und dergleichen, bei 42-68°C und vorzugsweise mit einer Waschlösung, enthaltend 300 mM Natriumchlorid, 30 mM Natriumcitrat und 1,% SDS, bei 55°C gewaschen. Zusätzlich wird die Membran mit 2 × SSC-Lösung (300 mM Natriumchlorid, 30 mM Natriumcitrat) kurz gespült und dann getrocknet. Die Positionen der DNAs auf der Membran, welche mit der verwendeten Sonde hybridisieren, werden bestimmt, wobei die Membran zum Beispiel einer Autoradiographie unterzogen wird, um die Positionen der Sonde auf der Membran zu ermitteln. Die Clone, welche den Positionen der nachgewiesenen DNAs auf der Membran entsprechen, werden auf dem ursprünglichen Agarmedium identifiziert und können dann entnommen werden, um Clone zu isolieren, welche diese DNAs tragen. Genauer wird die Membran für 4 Stunden einer Abbildungsplatte (Fuji Photo Film Co., Ltd.) ausgesetzt, und diese Abbildungsplatte wird mittels BAS 2000 (Fuji Photo Film Co., Ltd.) analysiert, um Signale nachzuweisen. Anschließend werden aus dem Agarmedium, welches zur Herstellung der Membran verwendet wurde, die Teile, welche den Positionen entsprechen, an denen Signale nachgewiesen werden, als Teilstücke von etwa 5 mm² ausgeschnitten, und diese Teilstücke werden für 2-16 Stunden, vorzugsweise für 3 Stunden, in etwa 500 μl SM-Puffer (50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5, 0,1 M Natriumchlorid, 7 mM Magnesiumsulfat, 0,01% Gelatine) getaucht, um die Phagenpartikel zu eluieren. Das erhaltene Phagenpartikel-Eluat wird gemäß dem Verfahren, welches in "Molecular Cloning", 2. Auflage (Sambrook J., Fritsch E.F. und Maniatis T., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), 2.60-2.65, beschrieben ist, auf einem Agarmedium ausgestrichen und bei 37°C für 6-10 Stunden kultiviert. Unter Verwendung dieses Agarmediums werden die Phagen-DNAs in der gleichen Weise, wie vorstehend beschrieben, auf einer Membran fixiert, und diese Membran und die vorstehend beschriebene Sonde werden verwendet, um eine Hybridisierung durchzuführen. Anschließend werden aus den Teilstücken des zur Herstellung der Membran verwendeten Agarmediums, welche den Positionen entsprechen, an denen Signale nachgewiesen werden, die Phagenpartikel eluiert, auf einem Agarmedium ausgestrichen und in der gleichen Weise, wie vorstehend beschrieben, bei der Herstellung einer Membran verwendet, um eine Hybridisierung durchzuführen. Diese Identifizierungs- und Reinigungsschritte werden wiederholt, um einen Phagen-Clon zu erhalten, welcher eine DNA trägt, die eine Nucleotidsequenz aufweist, welche mit der verwendeten Sonde hybridisiert.
Die DNA, enthalten in einem Clon, welcher durch Durchführen einer Durchmusterung mit Hilfe einer Hybridisierung, wie vorstehend beschrieben, erhalten wurde, kann in einen Plasmidvektor, der eine einfache Präparation oder Analyse der DNA ermöglicht, wie zum Beispiel die im Handel erhältlichen Vektoren pUC18, pUC19, pBluescript KS+ oder pBluescript KS-, subcloniert werden, um die Plasmid-DNA zu präparieren, und die Nucleotidsequenz davon kann gemäß dem Farbstoff- Desoxy-Terminationsverfahren, zum Beispiel beschrieben in "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2. Auflage (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press), 13.42-13.74, bestimmt werden. Die Proben, welche für die Nucleotidsequenzanalyse verwendet werden, können zum Beispiel mittels der Primerextension-Methode, beschrieben z.B. in "Molecular Cloning", 2. Auflage (Sambrook J., Fritsch E.F. und Maniatis T., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), 13.15, hergestellt werden. Alternativ kann der Phagen-Clon für eine Analyse der Nucleotidsequenz gemäß dem Verfahren, welches zum Beispiel in "Molecular Cloning", 2. Auflage (Sambrook J., Fritsch E.F. und Maniatis T., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), 2.60-2.65, beschrieben ist, in NZYM-Flüssigmedium vermehrt werden, um eine Phagenlösung herzustellen. Aus dieser Phagenlösung kann die DNA des Phagen-Clons dann zum Beispiel unter Verwendung des Lambda-TRAP PLUS-DNA-Isolation Kit (Clontech Laboratories, Inc.) extrahiert werden, und die erhaltene DNA kann als eine Matrize in dem vorstehend beschriebenen Primerextension-Verfahren verwendet werden, um Proben für eine Nucleotidsequenzanalyse herzustellen.
Die vorliegende Promotor-DNA kann durch Untersuchen der Promotorfunktionen, wie vorstehend beschrieben, der so erhaltenen DNA gewonnen werden.
Die vorliegende Promotor-DNA kann auch durch Einführung einer oder mehrerer Variationen in die Nucleotidsequenz der DNA, umfassend die Nucleotidsequenz, welche in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 7 gezeigt ist, erhalten werden. Genauer können Variationen zufällig in die DNA, umfassend die Nucleotidsequenz, welche in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 7 gezeigt ist, eingeführt werden, zum Beispiel gemäß dem Verfahren, das z.B. bei Greener A. und Callahan M., Strategies, Bd. 7 (1994), S. 32-34, beschrieben ist, oder können ortsspezifisch in die DNA, umfassend die Nucleotidsequenz, welche in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 7 gezeigt ist, eingeführt werden, zum Beispiel gemäß dem Lücken-Duplex-Verfahren, das z.B. bei Kramer W. et al., Nucleic Acids Research, Bd. 12 (1984), S. 9441, oder bei Kramer W. und Frits H.J., Methods in Enzymology, Bd. 154 (1987), S. 350, beschrieben ist, oder gemäß der Methode nach Kunkel, welche z.B. bei Kunkel T.A., Proc. of Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 82 (1985), S. 488, oder bei Kunkel T.A. et al., Methods in Enzymology, Bd. 154 (1987), S. 367, beschrieben ist. Alternativ kann ein Oligonucleotidprimer, umfassend eine Nucleotidsequenz, in der eine oder mehrere Basen in einem Teil der Nucleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 7 gezeigt ist, entfernt, ersetzt oder hinzugefügt sind, als Primer für die Durchführung einer PCR verwendet werden, um eine DNA, umfassend eine Nucleotidsequenz, in welcher eine oder mehrere Basen in der in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 7 gezeigten Nucleotidsequenz entfernt, ersetzt oder hinzugefügt sind, zu amplifizieren. Ferner kann eine chimäre DNA, in welcher ein Teil der Nucleotidsequenz(en) eines oder mehrerer Segmente innerhalb der Nucleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 7 gezeigt ist, durch einen Teil einer Nucleotidsequenz von einem oder mehreren anderen Promotoren ersetzt sind, hergestellt werden, und es kann auch eine DNA mit einer Nucleotidsequenz, in welcher ein Teil der Nucleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 1 gezeigt ist, entfernt ist, hergestellt werden, zum Beispiel gemäß dem Verfahren, welches z.B. bei Henikoff S. et al., Gene, Bd. 28 (1984), S. 351, oder bei Yanisch-Perron C. et al., Gene, Bd. 33 (1985), S. 103, beschrieben ist. Die vorliegende Promotor-DNA kann durch Untersuchen der Promotorfunktionen, wie vorstehend beschrieben, der so erhaltenen DNA gewonnen werden.
Bei den vorliegenden Promotor-DNAs, welche erhalten werden, wie vorstehend beschrieben, kann ein Promotor der vorliegenden Erfindung entweder die oben definierte DNA (a) oder (b) oder sowohl (a) als auch (b) enthalten, wobei er diese DNAs auch wiederholt enthalten kann.
Zusätzlich kann ein Promotor der vorliegenden Erfindung ferner eine Nucleotidsequenz enthalten, welche den Effekt hat, die Transkriptionseffizienz eines Gens in Pflanzen zu erhöhen. Eine solche Nucleotidsequenz kann zum Beispiel eine Nucleotidsequenz sein, welche ihre erhöhende Wirkung auf die Transkriptionseffizienz in einer konstitutiven Weise ausübt, oder eine Nucleotidsequenz, welche ihre erhöhende Wirkung auf die Transkriptionseffizienz in einer spezies-, gewebs- oder stadiumspezifischen Weise ausübt, oder eine Nucleotidsequenz, deren erhöhende Wirkung auf die Transkriptionseffizienz induziert wird, zum Beispiel durch die Infektion mit einem pathogenen Mikroorganismus oder durch Stress wie Licht, Hitze, Trockenheit, Salze oder eine Wunde. Spezifische Beispiele für eine Nucleotidsequenz, welche den Effekt hat, die Effizienz der Transkription eines Gens in Pflanzen zu erhöhen, umfassen zum Beispiel die Transkription-Translation-aktivierende Nucleotidsequenz, in welcher eine Region des Mannopin-Synthase-Gens, beginnend bei der Base in Position 318 bis zu der Base in Position 138 stromaufwärts vom Transkriptionsstartpunkt, stromabwärts mit einer Region des Agrobacterium-Octopin- Synthase-Gens, beginnend bei der Base in Position 333 bis zu der Base in Position 116 stromaufwärts vom Transkriptionsstartpunkt, verbunden ist, sowie die Transkription-aktivierende Nucleotidsequenz, in welcher eine Region des Octopin-Synthase-Gens, beginnend bei der Base in Position 333 bis zu der Base in Position 116 stromaufwärts vom Transkriptionsstartpunkt, stromabwärts mit einer Region des Mannopin-Synthase-Gens, beginnend bei der Base in Position 318 bis zu der Base in Position 213 stromaufwärts vom Transkriptionsstartpunkt, verbunden ist (The Plant Journal 7 (4) (1995), 661-676; die Nucleotidsequenz, umfassend die Basen von Position 343 bis Position 91 stromaufwärts vom Transkriptionsstartpunkt des Blumenkohlmosaikvirus-35S-Promotors (Nature 313 (1985), 810-812); die Nucleotidsequenz, umfassend die Basen von Position 1099 bis Position 205 stromaufwärts vom Transkriptionsstartpunkt der kleinen Untereinheit (rbc-3A) des Tomaten-Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylase/ Oxygenase-Gens (Plant Cell 1 (1990), 217-227; die Nucleotidsequenz, umfassend die Basen von Position 902 bis Position 287 stromaufwärts vom Transkriptionsstartpunkt des Tabak-PR1a-Gens (Plant Cell 2 (1990), 357-366); und die Nucleotidsequenz, umfassend die Basen von Position 1300 bis Position 195 stromaufwärts vom Transkriptionsstartpunkt des Kartoffel-Protease-Inhibitor-Gens (PI-II) (Plant Cell 2 (1990), 61-70).
Außerdem kann ein Promotor der vorliegenden Erfindung eine Nucleotidsequenz mit einer erhöhenden Wirkung auf die Transkriptionseffizienz enthalten, welche in der Nucleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 7 gezeigt ist, eingeschlossen ist. Es ist auch möglich, eine solche Nucleotidsequenz zu identifizieren und einen Promotor der vorliegenden Erfindung herzustellen, in welchem diese Nucleotidsequenz wiederholt enthalten ist, oder einen neuen Pflanzen-Promotor herzustellen, wobei eine solche Nucleotidsequenz mit einer anderen DNA-Sequenz, die Promotortunktionen in Pflanzenzellen hat, verbunden wird. Um eine solche Nucleotidsequenz zu identifizieren, kann zum Beispiel ein Reportergen in Pflanzenzellen unter der Kontrolle einer Vielzahl der vorliegenden Promotor-DNAs exprimiert werden, und die Expressionsmengen werden verglichen, um die Nucleotidsequenzen zu untersuchen, welche zu der erhöhenden Wirkung auf die Transkriptionseffizienz beitragen. Insbesondere werden zum Beispiel verschiedene DNAs, umfassend eine Nucleotidsequenz, in welcher eine oder mehrere Basen der in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 7 gezeigten Nucleotidsequenz entfernt, ersetzt oder hinzugefügt sind, hergestellt, und wird ein Reportergen, zum Beispiel das β-Glucuronidase-Gen, stromabwärts mit jeder der DNAs verbunden. Diese Konstrukte werden dann mit Hilfe von Verfahren wie der Partikelkanonen-Methode oder der Agrobacterium-Infektionsmethode, wie nachstehend beschrieben, in gezüchtete Pflanzenzellen wie gezüchtete BY-2-Tabakzellen eingebracht. Um die Nucleotidsequenzen zu definieren, welche zu der erhöhenden Wirkung auf die Transkriptionseffizienz beitragen, kann anschließend die Expressionsmenge des Reportergens in jeder Zelle miteinander verglichen werden, indem aus den gezüchteten Zellen ein Zellextrakt hergestellt wird und der Extrakt mit Hilfe einer enzymatischen Technik auf seine β-Glucuronidase-Aktivität gemessen wird, wobei der Wert für die Aktivität als ein Indikator verwendet wird, oder indem die gezüchteten Zellen in eine Färbelösung, enthaltend 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-glucuronid, getaucht werden und die Abscheidung des blauen Farbstoffes beobachtet wird, wobei das Ausmaß der Farbstoffabscheidung als ein Indikator verwendet wird, und die Ergebnisse können mit den Nucleotidsequenzen der vorstehenden DNA, welche mit dem Reportergen verbunden ist, verglichen werden. Alternativ kann die vorstehende DNA, welche mit einem Reportergen verbunden ist, auch in gleicher Weise in eine Pflanzenzelle wie eine Zelle eines Wildtyp-Tabakstamms eingebracht werden und kann aus der Zelle die Pflanze regeneriert werden. Um die Nucleotidsequenzen zu definieren, welche zu der erhöhenden Wirkung auf die Transkriptionseffizienz beitragen, kann die Expressionsmenge des Reportergens, welches durch jede der vorstehenden DNAs kontrolliert wird, dann durch Messen der β-Glucuronidase-Aktivität in Geweben aus der Pflanze oder aus einem Nachkommen davon oder durch das Eintauchen von Geweben oder Schnitten davon aus der Pflanze oder einem Nachkommen davon in eine Färbelösung, enthaltend 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-glucuronid, und Beobachten der Abscheidung des blauen Farbstoffes, wobei das Ausmaß der Farbstoffabscheidung als ein Indikator verwendet wird, verglichen werden.
In der vorliegenden Erfindung verweist der Begriff "Terminator" auf eine DNA, welche die Funktion hat, Anweisungen für die Termination der Transkription eines Gens von Interesse, das stromabwärts der DNA angeordnet ist, zu geben. Ein Terminator der vorliegenden Erfindung umfasst die folgende DNA (a) oder (b) (nachstehend bezeichnet als die vorliegende Terminator-DNA):

(a) DNA, umfassend die Nucleotidsequenz, welche in SEQ ID NO: 2 gezeigt ist, oder
(b) DNA, umfassend eine Nucleotidsequenz, in welcher eine oder mehrere Basen in der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Nucleotidsequenz entfernt, ersetzt oder hinzugefügt sind, und welche mehr als 90% Identität zu der Nucleotidsequenz einer beliebigen Region bestehend aus 250 bp oder mehr innerhalb der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Nucleotidsequenz aufweist, wobei die DNA biologische Funktionen hat, welche zu denen der oben unter (a) genannten DNA äquivalent sind.

In diesem Zusammenhang können Beispiele für eine "Nucleotidsequenz, in welcher eine oder mehrere Basen entfernt, ersetzt oder hinzugefügt sind", solche Nucleotidsequenzen einschließen, welche natürlich vorkommende Variationen, die aus dem Spezies- oder Individuum-bedingten Unterschied zwischen Organismen oder dem Unterschied zwischen Geweben, aus denen die DNAs erhalten werden, resultieren, oder künstlich in die DNA eingeführte Variationen enthalten. Die DNA, welche "biologische Funktionen hat, die zu denen der oben unter (a) genannten DNA äquivalent sind", kann zum Beispiel solche DNAs einschließen, welche eine Nucleotidsequenz umfassen, in welcher eine oder mehrere Basen in der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Nucleotidsequenz entfernt, ersetzt oder hinzugefügt sind, vorausgesetzt, dass sie die Terminatorfunktionen in Pflanzenzellen beibehalten. Solche DNAs können DNAs einschließen, welche aus natürlichen Quellen cloniert sind oder welche eine künstlich eingeführte Deletion, Substitution oder Addition einer oder mehrerer Basen in DNAs enthalten, die aus natürlichen Quellen cloniert sind, oder welche durch chemische Synthese künstlich hergestellt werden.
Es ist auch möglich, die Expressionseffizienz eines gewünschten Gens zu erhöhen, wobei ein Schritt ausgeführt wird, in welchem ein Terminator der vorliegenden Erfindung und das gewünschte Gen, welches stromabwärts des Terminators angeordnet ist, in Wirtszellen eingebracht werden, und ein Schritt, in welchem das gewünschte Gen in den Wirtszellen unter der Kontrolle des Terminators exprimiert wird.
Die vorliegenden Terminator-DNAs können basierend auf der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Nucleotidsequenz gemäß den Verfahren, welche vorstehend für den Erhalt der vorliegenden Promotor-DNAs beschrieben wurden, isoliert werden. Ein spezifisches Beispiel hierfür kann das Verfahren sein, in dem eine genomische DNA, welche von einer Pflanze wie einer Karotte abgeleitet ist, als Matrize verwendet wird, um eine oder mehrere PCR-Runden (Reaktionsbedingungen: zum Beispiel eine bis mehrere PCR-Runden, jeweils durchgeführt für 30-40 Inkubationszyklen bei 94°C für 1 min; bei 55°C für 2 min; und dann bei 74°C für 3 min pro Zyklus) durchzuführen, wobei als Primer ein Oligonucleotid mit der Nucleotidsequenz, angezeigt durch die Basen Nr. 1 bis 20 in SEQ ID NO: 2, und ein Oligonucleotid mit einer Nucleotidsequenz, die komplementär ist zu der Nucleotidsequenz, welche durch die Basen Nr. 827 bis 851 in SEQ ID NO: 2 angezeigt ist, verwendet werden.
Um die Terminatorfunktionen der vorliegenden Terminator-DNA in Pflanzenzellen zu bestätigen, werden zum Beispiel ein Promotor, welcher in Pflanzenzellen funktionsfähig ist, ein Reportergen wie ein β-Glucuronidase-Gen und die vorliegende Terminator-DNA in der Form miteinander verbunden, welche eine Expression ermöglicht, während als eine Kontrolle der Promotor und das β-Glucuronidase-Gen in der gleichen Weise miteinander verbunden werden. Jedes dieser Konstrukte wird mit Hilfe von Verfahren wie der Partikelkanonen-Methode oder der Agrobacterium-Infektionsmethode, wie nachstehend beschrieben, in gezüchtete Pflanzenzellen, zum Beispiel gezüchtete BY-2-Tabakzellen eingebracht. Anschließend wird durch Herstellung eines Zellextrakts aus jeder Zelle und Messen der β-Glucuronidase-Aktivität in dem Extrakt, wobei der Wert für die Aktivität als ein Indikator verwendet wird, oder durch Eintauchen der Zellen in eine Färbelösung, enthaltend 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-glucuronid, und Beobachten der Abscheidung des blauen Farbstoffes, wobei der Umfang der Farbstoffabscheidung als ein Indikator verwendet wird, bestätigt, dass das Ausmaß der β-Glucuronidase-Expression im Vergleich zu der Kontrolle in Pflanzenzellen, in welche der Promotor, das β-Glucuronidase-Gen und die vorliegende Terminator-DNA in Verbindung miteinander eingebracht wurden, höher ist. In gleicher Weise werden auch ein Promotor, welcher in Pflanzenzellen funktionsfähig ist, ein β-Glucuronidase-Gen und die vorliegende Terminator-DNA miteinander verbunden, während als eine Kontrolle der Promotor und das β-Glucuronidase-Gen in der gleichen Weise miteinander verbunden werden, und jedes dieser Konstrukte wird dann in eine Pflanzenzelle wie eine Zelle eines Wildtyp-Tabakstamms eingebracht, und eine Pflanze kann aus der Zelle regeneriert werden. Das Vorhandensein oder das Fehlen von Terminatorfunktionen der vorliegenden Terminator-DNA kann durch Messen der β-Glucuronidase-Aktivität in Geweben aus der regenerierten Pflanze oder eines Nachkommens davon oder durch das Eintauchen von Geweben oder Schnitten davon aus der Pflanze oder einem Nachkommen davon in eine Färbelösung, enthaltend 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-glucuronid, und Beobachten der Abscheidung des blauen Farbstoffes, wobei das Ausmaß der Farbstoffabscheidung als ein Indikator verwendet wird, bestätigt werden.
Außerdem kann die vorliegende Terminator-DNA auch zum Beispiel durch Markieren einer DNA, umfassend mindestens einen Teil der Nucleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 2 gezeigt ist, und Hybridisieren der DNA als eine Sonde mit DNAs, welche von einer Pflanze oder dergleichen abgeleitet sind, um DNAs nachzuweisen und zu clonieren, welche spezifisch an die Sonde binden, erhalten werden.
In diesem Verfahren kann zum Beispiel eine genomische DNA-Bank, die von einer Pflanze wie einer Karotte abgeleitet ist, für die DNAs, mit welchen man die vorstehende Sonde hybridisieren lässt, verwendet werden. Als solche DNA-Banken können im Handel erhältliche genomische DNA-Banken verwendet werden oder können genomische DNA-Banken zur Verwendung gemäß den üblichen Verfahren zur Bankherstellung, welche z.B. in "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2. Auflage (1989) (Gold Spring Harbor Laboratory Press) oder in "Current Protocols in Molecular Biology" (1987) (John Wiley & Sons, Inc., ISBN 0-471-50338-X) beschrieben sind, zum Beispiel unter Verwendung eines λ-Vektors wie λ-FIX II, λ-EMBL3, λ-EMBL4 oder λ-DASH II (Stratagene) zusammen mit Gigapack-Verpackungsextrakten (Stratagene) für die in-vitro-Verpackung auch hergestellt werden.
Das Verfahren, mit dessen Hilfe ermöglicht wird, dass eine Sonde mit solchen DNAs hybridisiert, kann eine Koloniehybridisierung oder eine Plaquehybridisierung einschließen, wobei das geeignete Verfahren abhängig von der Art des bei der Bankherstellung verwendeten Vektors ausgewählt werden kann. Falls die verwendete Bank mit einem Plasmidvektor konstruiert worden ist, wird eine Koloniehybridisierung durchgeführt. Genauer werden die DNAs in der Bank zuerst in Wirtsmikroorganismen eingebracht, um Transformanten zu erhalten, und die erhaltenen Transformanten werden verdünnt, auf ein Agarmedium plattiert und bei 37°C gezüchtet, bis Kolonien erscheinen. Wenn die verwendete Bank jedoch mit einem Phagenvektor konstruiert worden ist, wird eine Plaquehybridisierung durchgeführt. Genauer werden die Wirtsmikroorganismen und die Phagen in der Bank unter Bedingungen, welche eine Infektion ermöglichen, zuerst gemischt, dann weiterhin mit Weichagarmedium vermischt und auf ein Agarmedium plattiert. Dieses wird dann bei 37°C kultiviert, bis Plaques erscheinen. Insbesondere werden zum Beispiel gemäß den Verfahren, welche z.B. in "Molecular Cloning", 2. Auflage (Sambrook J., Fritsch E.F. und Maniatis T., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), 2.60-2.65, beschrieben sind, etwa 9,0 × 10⁵ PFU der Phagenbank in NZY-Agarmedium in einer Dichte von 0,1 bis 1,0 PFU pro mm² Agarmedium ausgestrichen und bei 37°C für 6-10 Stunden kultiviert.
Bei beiden der vorstehenden Hybridisierugsverfahren wird dann eine Membran auf die Oberfläche des Agarmediums gelegt, auf dem die vorstehende Kultur gezüchtet worden ist, und die Transformanten, welche Plasmide tragen, oder die Phagen werden auf die Membran übertragen. Nach der Behandlung mit einem alkalischen Mittel wird die Membran neutralisiert und weiter behandelt, um die DNAs auf der Membran zu fixieren. Insbesondere wird zum Beispiel im Falle einer Plaquehybridisierung nach den üblichen Verfahren, welche z.B. in "Kuroningu to Shikuensu; Shokubutsu Baiotekunoroji Jikken Manyuaru (Übersetzung: Cloning and Sequencing: Plant Biotechnology Experimental Manual)" (Watanabe und Sugiura, Hrsg., Nosonbunka-sha, 1989) beschrieben sind, ein Filter wie eine Nitrocellulose- oder Nylonmembran (z.B. Hybond-N+ (Amersham Pharmacia Biotech, Inc.)) auf das vorstehend beschriebene Agarmedium gelegt und für etwa eine Minute darauf belassen, um zu ermöglichen, dass die Phagenpartikel an die Membran adsorbieren. Anschließend wird die Membran für etwa 3 Minuten in eine alkalische Lösung (1,5 M Natriumchlorid, 0,5 N NaoH) getaucht, um die Phagenpartikel zu lysieren und auf diese Weise die Phagen-DNAs auf der Membran freizusetzen, welche dann durch Eintauchen der Membran in eine Neutralisierungslösung (1,5 M Natriumchlorid, 0,5 M Tris-HCl-Puffer, pH 7,5) für etwa 5 Minuten behandelt werden. Nach Waschen mit einer Waschlösung (300 mM Natriumchlorid, 30 mM Natriumcitrat, 200 mM Tris-HCl-Puffer) für etwa 5 Minuten wird die Membran bei etwa 80°C für etwa 90 Minuten gebacken, um die Phagen-DNAs auf der Membran zu fixieren.
Die auf diese Weise hergestellte Membran wird dazu verwendet, eine Hybridisierung mit der vorstehenden DNA als eine Sonde durchzuführen. Was die Hybridisierungsverfahren anbetrifft, kann zum Beispiel auf Glover D.M., Hrsg., "DNA Cloning, A Practical Approach" (IRL Press, 1985, ISBN 0-947946-18-7); "Kuroningu to Shikuensu; Shokubutsu Baiotekunoroji Jikken Manyuaru (Übersetzung: Cloning and Sequencing: Plant Biotechnology Experimental Manual)" (Watanabe und Sugiura, Hrsg., Noson-bunka-sha, 1989); oder "Molecular Cloning", 2. Auflage (Sambrook J., Fritsch E.F. und Maniatis T., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) verwiesen werden.
Um die DNA, welche als eine Sonde verwendet wird, zum Beispiel mit einem Radioisotop zu markieren, kann ein Random Labeling Kit (Boehringer Mannheim oder Takara Shuzo Co., Ltd.) verwendet werden. Es ist auch möglich, die DNA mit Hilfe einer PCR-Reaktion zu markieren, wobei die DNA für die Sonde als eine Matrize verwendet wird und dCTP durch [α-³²P]-dCTP in der üblichen PCR-Zusammensetzung ersetzt wird. Alternativ kann das ECL Direct Nucleic Acid Labeling and Detection System (Amersham Pharmacia Biotech, Inc.) verwendet werden, um die als Sonde verwendete DNA zum Beispiel mit einem Fluoreszenzfarbstoff zu markieren.
Viele Reagenstypen und Temperaturbedingungen können für die Durchführung der Hybridisierung verwendet werden. Zum Beispiel wird eine Vorhybridisierungslösung, welche 450-900 mM Natriumchlorid, 45-90 mM Natriumcitrat, 0,1-1,0% Natriumdodecylsulfat (SDS) und 0-200 μg/ml denaturierte unspezifische DNA enthält und welche in einigen Fällen wahlweise jeweils 0-0,2% Albumin, Ficoll, Polyvinylpyrrolidon oder dergleichen enthalten kann, und vorzugsweise eine Vorhybridisierungslösung, enthaltend 900 mM Natriumchlorid, 90 mM Natriumcitrat, 1 % SDS und 100 μg/ml denaturierte Kalbsthymus-DNA, in einem Volumen von 50-200 μl pro cm² der, wie vorstehend beschrieben, hergestellten Membran zubereitet, und die vorstehende Membran wird bei 42-68°C für 1-4 Stunden, vorzugsweise bei 45°C für 2 Stunden, in die Lösung getaucht und darin inkubiert. Anschließend wird zum Beispiel eine Hybridisierungslösung, welche 450-900 mM Natriumchlorid, 45-90 mM Natriumcitrat, 0,1-1,0% SDS und 0-200 mg/ml denaturierte unspezifische DNA enthält und welche in einigen Fällen wahlweise jeweils 0-0,2% Albumin, Ficoll, Polyvinylpyrrolidon oder dergleichen enthalten kann, und vorzugsweise eine Hybridisierungslösung, enthaltend 900 mM Natriumchlorid, 90 mM Natriumcitrat, 1 % SDS und 100 μg/ml denaturierte Kalbsthymus-DNA, mit der Sonde, welche durch die vorstehend beschriebenen Verfahren erhalten wurde, vermischt (in einer Menge äquivalent zu 1,0 × 10⁴ bis 2,0 × 10⁶ ZpM pro cm² Membran), um ein Lösungsgemisch in einem Volumen von 50-200 μl pro cm² Membran herzustellen, und die Membran wird bei 42-68°C für 4-20 Stunden, vorzugsweise bei 45°C für 16 Stunden, in das Lösungsgemisch getaucht und darin inkubiert, um eine Hybridisierung zu bewirken. Nach der Hybridisierungsreaktion wird die Membran entnommen und 1-4-mal für jeweils 10-60 Minuten, vorzugsweise zweimal für jeweils 15 Minuten, zum Beispiel mit einer Waschlösung, enthaltend 15-300 mM Natriumchlorid, 1,5-30 mM Natriumcitrat, 0,1-1,0% SDS und dergleichen, bei 42-68°C, und vorzugsweise mit einer Waschlösung, enthaltend 300 mM Natriumchlorid, 30 mM Natriumcitrat und 1,% SDS, bei 55°C gewaschen. Zusätzlich wird die Membran mit 2 × SSC-Lösung (300 mM Natriumchlorid, 30 mM Natriumcitrat) kurz gespült und dann getrocknet. Die Positionen der DNAs auf der Membran, welche mit der verwendeten Sonde hybridisieren, werden bestimmt, wobei die Membran zum Beispiel einer Autoradiographie unterzogen wird, um die Positionen der Sonde auf der Membran zu ermitteln. Die Clone, welche den Positionen der nachgewiesenen DNAs auf der Membran entsprechen, werden auf dem ursprünglichen Agarmedium identifiziert, und können entnommen werden, um Clone zu isolieren, welche diese DNAs tragen. Genauer wird die Membran für 4 Stunden einer Abbildungsplatte (Fuji Photo Film Co., Ltd.) ausgesetzt, und diese Abbildungsplatte wird mittels BAS 2000 (Fuji Photo Film Co., Ltd.) analysiert, um Signale nachzuweisen. Anschließend werden aus dem Agarmedium, welches zur Herstellung der Membran verwendet wurde, die Teile, welche den Positionen entsprechen, an denen Signale nachgewiesen werden, als Teilstücke von etwa 5 mm² ausgeschnitten, und diese Teilstücke werden für 2-16 Stunden, vorzugsweise für 3 Stunden, in etwa 500 μl SM-Puffer (50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5, 0,1 M Natriumchlorid, 7 mM Magnesiumsulfat, 0,01 % Gelatine) getaucht, um die Phagenpartikel zu eluieren. Das erhaltene Phagenpartikel-Eluat wird gemäß dem Verfahren, welches in "Molecular Cloning", 2. Auflage (Sambrook J., Fritsch E.F. und Maniatis T., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), 2.60-2.65, beschrieben ist, auf einem Agarmedium ausgestrichen und bei 37°C für 6-10 Stunden kultiviert. Unter Verwendung dieses Agarmediums werden die Phagen-DNAs in der gleichen Weise, wie vorstehend beschrieben, auf einer Membran fixiert, und diese Membran und die vorstehend beschriebene Sonde werden verwendet, um eine Hybridisierung durchzuführen. Anschließend werden aus den Teilstücken des zur Herstellung der Membran verwendeten Agarmediums, welche den Positionen entsprechen, an denen Signale nachgewiesen wurden, die Phagenpartikel eluiert, auf einem Agarmedium ausgestrichen und in der gleichen Weise, wie vorstehend beschrieben, bei der Herstellung einer Membran verwendet, um eine Hybridisierung durchzuführen. Diese Identifizierungs- und Reinigungsschritte werden wiederholt, um einen Phagen-Clon zu erhalten, welcher eine DNA trägt, die eine Nucleotidsequenz aufweist, die mit der verwendeten Sonde hybridisiert.
Die DNA, enthalten in einem Clon, welcher durch Durchführen einer Durchmusterung mit Hilfe einer Hybridisierung, wie vorstehend beschrieben, erhalten wurde, kann in einen Plasmidvektor, der eine einfache Präparation oder Analyse der DNA ermöglicht, wie zum Beispiel die im Handel erhältlichen Vektoren pUC18, pUC19, pBluescript KS+ oder pBluescript KS-, subcloniert werden, um die Plasmid-DNA zu präparieren, und die Nucleotidsequenz davon kann gemäß dem Farbstoff-Desoxy-Terminationsverfahren, zum Beispiel beschrieben in "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2. Auflage (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press), 13.42-13.74, bestimmt werden. Die Proben, welche für die Nucleotidsequenzanalyse verwendet werden, können zum Beispiel gemäß der Primerextension-Methode, beschrieben z.B. in "Molecular Cloning", 2. Auflage (Sambrook J., Fritsch E.F. und Maniatis T., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), 13.15, hergestellt werden. Alternativ kann der Phagen-Clon für eine Analyse der Nucleotidsequenz gemäß dem Verfahren, welches zum Beispiel in "Molecular Cloning", 2. Auflage (Sambrook J., Fritsch E.F. und Maniatis T., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), 2.60-2.65, beschrieben ist, in NZYM-Flüssigmedium vermehrt werden, um eine Phagenlösung herzustellen. Aus dieser Phagenlösung kann die DNA des Phagen-Clons dann zum Beispiel unter Verwendung des Lambda-TRAP PLUS DNA Isolation Kit (Clontech Laboratories, Inc.) extrahiert werden, und die erhaltene DNA kann als eine Matrize in dem vorstehend beschriebenen Primerextensions-Verfahren verwendet werden, um Proben für eine Nucleotidsequenzanalyse herzustellen.
Die vorliegende Terminator-DNA kann durch Untersuchen der Terminatorfunktionen der so erhaltenen DNA gewonnen werden, wie vorstehend beschrieben. Um ein gewünschtes Gen unter Verwendung eines Promotors der vorliegenden Erfindung in Wirtszellen wie solchen von Pflanzen zu exprimieren, kann ein Gen, in welchem der Promotor der vorliegenden Erfindung und das gewünschte Gen sowie gegebenenfalls ferner ein Terminator in einer funktionsfähigen Form miteinander verbunden sind (nachstehend bezeichnet als chimäres Gen der vorliegenden Erfindung), verwendet werden. In diesem Zusammenhang sind gewünschte Gene solche Gene, die in Wirtszellen wie solchen von Pflanzen exprimiert werden sollen, einschließlich zum Beispiel Gene, die Proteine wie Enzyme, Speicherproteine, Rezeptoren, Transkriptionsfaktoren oder Signaltransduktionsfaktoren codieren, und diese Gene können geeigneterweise stromabwärts mit dem Promotor der vorliegenden Erfindung in der Sense- oder Antisense-Richtung, abhängig von ihrem Zweck, verbunden sein. Die verwendeten Terminatoren sind nicht besonders begrenzt, so fange sie die Funktion haben, Anweisungen für die Termination der Transkription in Wirtszellen, in welche sie eingebracht werden, zu gegeben, und können zum Beispiel den Terminator des Nopalin-Synthase-Gens, abgeleitet aus dem Ti-Plasmid von Agrobacterium (nos-t), und Terminatoren, abgeleitet aus Pflanzenviren wie den Knoblauchviren GV1 und GV2, sowie Terminatoren der vorliegenden Erfindung einschließen. Außerdem können chimäre Gene der vorliegenden Erfindung die Nucleotidsequenz eines Promotors der vorliegenden Erfindung oder eines Teils davon wiederholt enthalten. In diesem Zusammenhang bedeutet der Ausdruck "in einer funktionsfähigen Form", dass ein gewünschtes Gen, das in dem chimären Gen der vorliegenden Erfindung enthalten ist, mit einem Promotor der vorliegenden Erfindung und/oder einem Terminator in einer solchen Weise verbunden worden ist, dass, wenn eine Wirtszelle durch Einführung des chimären Gens transformiert wird, das Gen in der Wirtszelle unter der Kontrolle des Promotors und/oder des Terminators exprimiert wird.
In Bezug auf Vektoren, die einen Promotor der vorliegenden Erfindung enthalten, verweist der Begriff "Vektor" auf eine DNA, die in Wirtszellen vermehrt werden kann, einschließlich zum Beispiel Plasmide, Phagen und Phagemide, welche sich in Zellen wie Escherichia coli, Hefen, Pflanzenzellen oder tierischen Zellen vermehren können, und solche Vektoren werden abhängig von der Wirtszelle und ihrem Zweck geeigneterweise ausgewählt. Spezifische Beispiele können auf pUC basierende Plasmide (wie pUC118 oder pUC119 (Takara Shuzo Co., Ltd.)], auf pSC101 basierende Plasmide, Ti-Plasmide [wie pBI101 oder pBI121 (Clontech Laboratories, Inc.)], Bluescript-Phagemide [wie pBluescript SK (+/–) (Stratagene)], auf M13 basierende Phagen [wie mp10 oder mp11 (Amersham Pharmacia Biotech, Inc.)], auf λ basierende Phagen [wie λ-gt10 oder λ-gt11 (Amersham Pharmacia Biotech, Inc.)] oder Cosmide [wie SuperCos I (Stratagene)] sein, wobei durch den Einbau eines Promotors der vorliegenden Erfindung in einen solchen Vektor durch herkömmliche Gentechnik-Verfahren ein Vektor, enthaltend den Promotor der vorliegenden Erfindung, konstruiert werden kann.
Falls in solchen Vektoren, welche einen Promotor der vorliegenden Erfindung enthalten, weiterhin eine Geninsertionsstelle oder ein Terminator stromabwärts von dem Promotor vorhanden sind, können die Vektoren vorzugsweise bei der Konstruktion von Vektoren zur Expression eines gewünschten Gens in Wirtszellen verwendet werden. In diesem Zusammenhang verweist der Begriff "Geninsertionsstelle" zum Beispiel auf eine Nucleotidsequenz, welche durch ein Restriktionsenzym, das gewöhnlich in Gentechnik-Verfahren verwendet wird, spezifisch erkannt und gespalten werden kann, und vorzugsweise auf eine Restriktionsenzym-Erkennungsnucleotidsequenz der Art, welche auf dem Vektor, der einen Promotor der vorliegenden Erfindung und einen Terminator enthält, nur einmal vorkommt. Eine solche Geninsertionsstelle, ein Promotor der vorliegenden Erfindung und ein Terminator sind vorzugsweise derart angeordnet, dass, wenn ein gewünschtes Gen in die Geninsertionsstelle inseriert wird, der Promotor der vorliegenden Erfindung, das gewünschte Gen und der Terminator auf dem Vektor in einer funktionsfähigen Form miteinander verbunden sind. Ein solcher Vektor kann zum Beispiel durch Insertion der DNA eines Promotors der vorliegenden Erfindung in ein Plasmid, welches eine Geninsertionsstelle und einen Terminator enthält, und genauer in die multiple Clonierungsstelle (Geninsertionsstelle) von pBI101.3 (Clontech Laboratories, Inc.) oder dergleichen, konstruiert werden. Alternativ kann er auch durch Insertion eines Promotors der vorliegenden Erfindung und eines Terminators in einen Vektor, welcher eine Geninsertionsstelle enthält, und genauer in die multiple Clonierungsstelle (Geninsertionsstelle) von pBIN19 (Nucl. Acid. Res. 12 (1984), 8711-8721) oder dergleichen, konstruiert werden.
Ein Vektor, welcher ein chimäres Gen der vorliegenden Erfindung enthält, kann vorzugsweise verwendet werden, um das chimäre Gen in Wirtszellen einzubringen, und kann durch Clonieren des chimären Gens in einen Vektor, wie vorstehend beschrieben, oder durch Clonieren eines gewünschten Gens in eine Geninsertionsstelle auf einem Vektor, wie vorstehend beschrieben, welcher einen Pro motor der vorliegenden Erfindung, eine Geninsertionsstelle und einen Terminator enthält, hergestellt werden. Zum Beispiel kann ein Vektor, wie vorstehend beschrieben, welcher unter Verwendung von pBI101.3 (Clontech Laboratories, Inc.) hergestellt wird, mit Restriktionsenzymen gespalten werden, um das auf dem Vektor vorliegende Rezeptorgen (β-Glucuronidase-Gen) zu entfernen, und kann ein gewünschtes Gen anstelle des Rezeptorgens inseriert werden, um einen Vektor herzustellen, welcher ein chimäres Gen der vorliegenden Erfindung enthält.
Ein Vektor der vorliegenden Erfindung, wie vorstehend beschrieben, kann zusätzlich zu einen Promotor der vorliegenden Erfindung ein gewünschtes Gen und/oder einen Terminator enthalten und kann weiterhin ein Markergen zur Selektion von Wirtszellen, in welche der Vektor eingebracht worden ist (zum Beispiel ein Kanamycin-Resistenzgen, Hygromycin-Resistenzgen, Neomycin-Resistenzgen, ein Gen, welches eine Herbizidresistenz auf Pflanzen übertragen kann, oder dergleichen), enthalten. Der Vektor kann außerdem auch die Nucleotidsequenz eines Promotors der vorliegenden Erfindung in wiederholter Form enthalten.
Ein Vektor der vorliegenden Erfindung kann in Wirtszellen wie E. coli oder Agrobacterium eingebracht werden, wobei zum Beispiel ein Verfahren wie das Calciumchloridverfahren oder das Elektroporationsverfahren, beschrieben z.B. bei Sambrook J., Fritsch E.F. und Maniatis T., "Molecular Cloning", 2. Auflage (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press), angewendet wird. Die vorstehenden mikrobiellen Zellen, in welche ein Vektor der vorliegenden Erfindung eingebracht worden ist (Transformanten), sind für die Präparation der DNA eines chimären Gens der vorliegenden Erfindung oder zum Einführen des chimären Gens in Pflanzenzellen nützlich.
Alternativ kann eine DNA, die einen Promotor der vorliegenden Erfindung codiert, oder die DNA eines chimären Gens der vorliegenden Erfindung in Pflanzenzellen als Wirtszellen eingebracht werden, wobei zum Beispiel die Partikelkanonen-Methode (ein Verfahren für die direkte Einführung in Pflanzengewebe oder gezüchtete Zellen unter Verwendung einer Partikelkanone) angewendet wird. Ein Vektor der vorliegenden Erfindung kann auch in gleicher Weise in Pflanzenzellen als Wirtszellen durch ein beliebiges der öffentlich bekannten Verfahren wie eine Agrobacterium-Infektion (ein Verfahren, in dem Pflanzengewebe mit Agrobacterium infiziert werden), Elektrotransfektionen (Elektroporationsverfahren oder Elektrotrans fektionsverfahren in Protoplasten) oder das Partikelkanonen-Verfahren eingebracht werden.
Von den Transformanten, bei denen ein beliebiger Promotor der vorliegenden Erfindung, ein chimäres Gen der vorliegenden Erfindung oder ein Vektor der vorliegenden Erfindung in Wirtszellen eingeführt worden ist, können die Transformanten, welche Pflanzen sind, zum Beispiel Monocotyledonen wie Reis, Mais, Gerste und Weizen, sowie Dicotyledonen einschließlich Hülsenfrüchte wie Sojabohne, Erbse, Bohne und Alfalfa; Nachtschattengewächse wie Tabak, Tomate und Kartoffel; Kreuzblütler wie Kohl, Raps und Blattsenf; Kürbisgewächse wie Melone, Kürbis und Gurke; Doldenblütler wie Karotte und Sellerie; und Lattichgewächse wie Salat einschließen.
Transformanten können durch Einführung eines Promotors der vorliegenden Erfindung, eines chimären Gens der vorliegenden Erfindung oder eines Vektors der vorliegenden Erfindung in Wirtszellen, wie vorstehend beschrieben, hergestellt werden. Zum Beispiel können Wirtszellen, in welche ein Promotor der vorliegenden Erfindung stromaufwärts eines gewünschten Gens in die genomische DNA eingebracht worden ist und welche das gewünschte Gen unter der Kontrolle des Promotors der vorliegenden Erfindung exprimieren, oder Wirtszellen, in welche ein chimäres Gen der vorliegenden Erfindung in die genomische DNA eingebracht worden ist und welche das Gen, das in dem chimären Gen enthalten ist, unter der Kontrolle des Promotors der vorliegenden Erfindung exprimieren, oder Wirtszellen, welche einen Vektor tragen, der ein chimäres Gen der vorliegenden Erfindung enthält, und welche das Gen, das in dem chimären Gen enthalten ist, unter der Kontrolle des Promotors der vorliegenden Erfindung exprimieren, erhalten werden.
Pflanzenzellen, welche Transformanten sind, die auf diese Weise erhalten werden, können gemäß einem beliebigen Verfahren, welches in den herkömmlichen Pflanzengewebekultur-Techniken angewendet wird, beschrieben zum Beispiel bei Gelvin S.B., Schilperoot R.A. und Verma D.P.S., "Plant Molecular Biology Manual" (Kluwer Academic Publishers, 1988); Ko Simamoto und Kiyotaka Okada, Hrsg., "Model-Shokubutu-No-Jikken-Protocol (Ine, Shiroinunazuna-Hen) (Übersetzung: Experimental Protocols for Model Plants (Rice and Arabidopsis thaliana))" (Shujunsha, ISBN 4-87962-157-9, C3345, 1996), S. 78-148; oder Hirofumi Uchimiya, "Shokubutu-Idenshi-Sosa-Manual: Transgenic-Shokubutu-No-Tukurikata (Übersetzung: Plant Gene Engineering Manual: How to Produce Transgenic Plants)" (Kodansha-Scientific, 1990, ISBN 4-06-153513-7, C3045), S. 28-33, regeneriert werden; und auf diese Weise kann eine transformierte Pflanze, welche von den Pflanzenzellen abgeleitet ist, erhalten werden. Außerdem können durch Züchten und Inzucht der so erhaltenen Pflanze Nachkommen der Pflanze erhalten werden. In der vorliegenden Erfindung sind alle diese Individuen in den Transformanten eingeschlossen.
Um die erfolgreiche Einführung des gewünschten Gens zu bestätigen, können die DNAs aus den Transformanten, wie vorstehend beschrieben, gemäß den üblichen Gentechnik-Verfahren extrahiert, mit einem Restriktionsenzym gespalten und für die Durchführung einer Southern-Hybridisierung mit der DNA, welche bei der Transformation der Wirtszellen verwendet wurde, oder einem Teil davon als eine Sonde verwendet werden. In gleicher Weise können zur Untersuchung des Expressionsstatus des gewünschten Gens die RNAs aus solchen Transformanten gemäß den üblichen Gentechnik-Verfahren extrahiert werden und für die Durchführung einer Northern-Hybridisierung unter Verwendung eines Oligonucleotids oder einer DNA, welches) die Sense- oder Antisense-Nucleotidsequenz des Gens von Interesse aufweist, das unter der Kontrolle des Promotors der vorliegenden Erfindung exprimiert werden soll, als eine Sonde verwendet werden.
Durch die Verknüpfung eines bestimmtes Gen in der Sinnrichtung unter der Kontrolle eines Promotors der vorliegenden Erfindung und die Expression davon in Zellen des Wirtsorganismus können nützliche Merkmale auf einen Wirtsorganismus wie eine Pflanze übertragen werden. Zum Beispiel kann die Resistenz gegen Bakterien, Pilze, Viren, Insekten und dergleichen in Geweben von Wirtsorganismen durch die Expression eines Abwehrgens wie des Phenylalanin-Ammoniak-Lyase-Gens (PAL), Chalkon-Synthase-Gens (CHS), Chitinase-Gens (CHT), Lysozym-Gens oder PR-Protein-Gens; eines Krankheitsresistenz-Gens wie des Pto-Gens; eines Virus-Hüllprotein-Gens; eines Insektiziden BT (Bacillus thuringiensis)-Protein-Gens oder dergleichen erhöht werden. In gleicher Weise kann der Gehalt an verschiedenen Proteinen oder der Gehalt an essentiellen Aminosäuren in Futterpflanzen durch die Expression eines Speicherprotein-Gens wie des Glycinin-Gens oder β-Conglycinin-Gens der Sojabohne in den Wirtszellen erhöht werden; kann der Methionin-Gehalt oder der Lysin-Gehalt in Futterpflanzen zum Beispiel durch die Expression des 2S-Albumin-Gens der Paranuss, des 10 kDa- oder 15 kDa-Protein-Gens von Mais oder Reis erhöht werden; oder kann der Biotin-Gehalt in Futterpflanzen durch die Expression eines mit der Biotin-Biosynthese in Beziehung stehenden Enzym-Gens wie des bioA-, bioB-, bioC-, bioD-, bioF- oder bioH-Enzym-Gens, erhöht werden; kann eine Erhöhung der Oxidationsstabilität von Lipiden und eine Verbesserung der Lipide aufgrund einer Verringerung des Phospholipid-Gehalts sowie einer Erhöhung des Gehalts an Ölsäure und Linolensäure zum Beispiel durch die Expression des Stearoyl-ACP-Desaturase-Gens, Acyl-ACP-Thioesterase-Gens oder 3-Phosphat-Acetyltransferase-Gens ermöglicht werden; oder kann die Resistenz gegen niedrige Temperaturen durch Erhöhung des Anteils an ungesättigten Fettsäuren durch die Expression eines Acyltransferase-Gens in den Wirtszellen verbessert werden. Eine Antibiotikum-Resistenz, welche bei der Selektion von Transformanten nützlich ist, kann ebenfalls durch die Expression eines Gens, das an der Antibiotikum-Resistenz beteiligt ist, wie eines Kanamycin-Resistenzgens, Hygromycin-Resistenzgens oder Neomycin-Resistenzgens, in der Wirtszelle bereitgestellt werden. Außerdem ist es auch möglich, eine herbizidresistente Nutzpflanze durch die Expression eines Gens, das an der Herbizidresistenz beteiligt ist, wie eines L-Phosphonothricin-Acetyltransferase- oder Protoporphyrinogen-Oxidase (PPO)-Gens, in den Wirtszellen zu erzeugen.
Andererseits kann ein bestimmtes Gen auch in der Antisense-Richtung unter der Kontrolle eines Promotors der vorliegenden Erfindung verknüpft und in Zellen eines Wirtsorganismus wie einer Pflanze exprimiert werden, um ein nützliches Merkmal auf den Wirtsorganismus zu übertragen. Zum Beispiel kann die Stärkekomponente von Reissamen durch Expression eines Antisense-Gens gegen ein Amylopektin abbauendes Enzym-Gen wie dasjenige für die Isomerase von Reis, in den Wirtszellen verbessert werden; kann die Lagerfähigkeit von Früchten, Blumen oder dergleichen durch Expression eines Antisense-Gens gegen ein Ethylensynthase-Gen wie dasjenige für die 1-Aminocyclopropan-1-carboxylat (ACC)-Synthase des Kürbis oder dergleichen in den Wirtszellen verbessert werden; oder kann die Lagerfähigkeit von Früchten durch Expression eines Antisense-Gens gegen das Polygalacturonase-Gen der Tomate in den Wirtszellen ebenfalls verbessert werden.
Außerdem kann auch die Fertilität von Pflanzen durch Expression eines Sense- oder Antisense-Gens oder eines Gens, welches mit der männlichen Sterilität in Beziehung steht, wie zum Beispiel des S-Locus-spezifischen RNAse-Gens, in den Wirtszellen reguliert werden.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele veranschaulicht, aber die vorliegende Erfindung ist nicht auf solche Beispiele begrenzt.
Beispiel 1: Isolierung eines Promotors und eines Terminators der vorliegenden Erfindung
Ein Promotor der vorliegenden Erfindung und ein Terminator der vorliegenden Erfindung wurden mit Hilfe einer umgekehrten Polymerasekettenreaktion (umgekehrten PCR) unter Verwendung einer aus Karottenblättern isolierten genomischen DNA erhalten. Die Verfahren werden nachstehend beschrieben.
(1) Präparation der genomischen DNA einer Karotte
Zehn Gramm Karottenblätter eines 6 Wochen alten Sämlings wurden in flüssigem Stickstoff zerrieben, in 5 ml 2 × CTAB-Lösung (2% Cetyltrimethylammoniumbromid, 100 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, 20 mM EDTA, pH 8,0, 1,4 M Natriumchlorid, 1 % Polyvinylpyrrolidon) suspendiert und dann bei 55°C für 10 Minuten inkubiert. Dazu wurde ein gleiches Volumen an Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) zugegeben, vorsichtig für 30 Minuten bei Raumtemperatur gemischt und dann zentrifugiert, um die untere und die obere Schicht getrennt zu gewinnen. (1) Ein gleiches Volumen an Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) wurde zu der oberen Schicht zugegeben, während (2) ein gleiches Volumen an 1 × CTAB-Lösung (eine Lösung erhalten durch zweifaches Verdünnen einer 2 × CTAB-Lösung mit sterilem destilliertem Wasser) zu der unteren Schicht zugegeben wurde. Nach vorsichtigem Mischen jedes Gemisches für 10 Minuten bei Raumtemperatur wurden diese abermals zentrifugiert, und die unter (1) und (2) gewonnenen unteren Schichten wurden miteinander vermischt. Dazu wurden 1/10 Volumina einer 10%igen CTAB-Lösung (10% Cetyltrimethylammoniumbromid, 0,7 M Natriumchlorid) und ein gleiches Volumen an Fällungspuffer (2% Cetyltrimethylammoniumbromid, 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, 10 mM EDTA, pH 8,0) zugegeben, und die Mischung wurde vorsichtig vermischt und dann zentrifugiert. Der Niederschlag wurde gewonnen, in 1 M Natriumchlorid-TE (1 M Natriumchlorid, 10 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, 1 mM EDTA, pH 8,0) suspendiert, und anschließend wurde ein gleiches Volumen an Isopropanol zugegeben und vorsichtig eingemischt, gefolgt von einer Zentrifugation. Der erhaltene Niederschlag wurde mit 70%igem Ethanol gespült, kurz getrocknet und dann in TE suspendiert. Zu der Suspension wurde RNase bis zum Erhalt einer Endkonzentration von 10 μg/ml zugegeben und bei 37°C für 30 Minuten inkubiert. Anschließend wurden 1/4 Volumen an 4 M Ammoniumacetat und zwei Volumina an 100% Ethanol zugegeben, eingemischt und stehengelassen. Die gefällten DNAs wurden durch Aufwickeln auf eine Pasteurpipette gewonnen, mit 70%igem Ethanol gespült, kurz getrocknet und in TE (10 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, 1 mM EDTA, pH 8,0) suspendiert. Diese DNA-Lösung wurde geeignet verdünnt und einer Extinktionsmessung und einer Agarosegel-Elektrophorese unterzogen. Als Ergebnis wurde bestätigt, dass etwa 350 μg genomische DNA erhalten worden waren.
(2) Amplifikation einer DNA, enthaltend einen Promotor und einen Terminator der vorliegenden Erfindung, mit Hilfe einer PCR
Zehn μg der unter (1) erhaltenen genomischen DNA wurden mit 100 E PvuII behandelt, um sie vollständig zu spalten. Ein 1/10 Volumen an 3 M Natriumacetat und zwei Volumina an 100% Ethanol wurden dann zugegeben und einmischt, und das Gemisch wurde bei 15.000 UpM für 10 Minuten bei 4°C zentrifugiert, um die gefällte DNA zu gewinnen. Der Niederschlag wurde mit 70%igem Ethanol gespült und in TE suspendiert, um eine Endkonzentration von 20 ng/μl zu erhalten. Unter Verwendung dieser DNA-Lösung und eines Ligierungskits (Takara Shuzo Co., Ltd.) wurde eine Ligierungsreaktion bei einer Endkonzentration von 1 ng/μl in einem Reaktionsvolumen von 400 μl durchgeführt, und das Reaktionsgemisch wurde dann als eine Matrize verwendet, um eine PCR (40 Inkubationszyklen bei 94°C für 1 min, dann bei 55°C für 2 min und ferner bei 74°C für 3 min pro Zyklus) durchzuführen, wobei die Oligonucleotide A und B mit den folgenden Nucleotidsequenzen verwendet wurden:
Oligonucleotid A: 5'-GGGTT TCAAT GGATT CGATG-3' (20-Mer) und
Oligonucleotid B: 5'-GCAGA TGCTC AGAAC ACTGC-3' (20-Mer).
Außerdem wurde eine weitere PCR (40 Inkubationszyklen bei 94°C für 1 min, dann bei 55°C für 2 min und ferner bei 74°C für 3 min pro Zyklus) unter Verwendung eines Teils des vorstehenden PCR-Gemisches und der Oligonucleotide C und D mit den folgenden Nucleotidsequenzen durchgeführt:
Oligonucleotid C: 5'-GGGAG CTGGC ACCCA TGATA TTTAG AATG-3' (29-Mer) und
Oligonucleotid D: 5'-GGGAG CTGTT CATAA TTTAC AGAGT GAGTG ACAGT CAG-3' (38-Mer).
Durch die Analyse eines Teils der Reaktionslösung auf einem 0,8%igen Agarosegel wurde bestätigt, dass ein DNA-Fragment von etwa 3 kb amplifiziert worden war.
(3) Clonierung und Sequenzierung eines Promotors und eines Terminators der vorliegenden Erfindung
Das unter (2) erhaltene PCR-Gemisch wurde durch Zugabe von TE auf ein Volumen von 200 μl gebracht. Zu dieser Lösung wurde eine gleiche Menge an neutralisiertem Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) zugegeben und gründlich eingemischt, und das Gemisch wurde anschließend bei 15.000 UpM für 5 min bei 20°C zentrifugiert, um die obere Schicht zu gewinnen. Dazu wurden 1/10 Volumina an 3 M Natriumacetat und zwei Volumina an 100%igem Ethanol zugegeben und gemischt, und das Gemisch wurde anschließend bei 15.000 UpM für 10 min bei 4°C zentrifugiert, um die gefällte DNA zu gewinnen. Nach Spülen mit 70%igem Ethanol wurde die DNA in TE suspendiert und mit 30 E PvuII behandelt, um sie vollständig zu spalten. Nach der Reaktion wurden eine Phenolbehandlung und eine Ethanolfällung durchgeführt, wie vorstehend beschrieben wurde. Die gewonnene DNA wurde in 50 μl TE suspendiert und für eine Reinigung auf eine Spin-Säule S-400 (Amersham Pharmacia Biotech, Inc.) aufgegeben. Die Analyse eines 1 μl-Aliquots des Eluats aus der Säule auf einem 0,8%igen Agarosegel ergab, dass DNA-Fragmente mit einer Größe von etwa 2 kb und etwa 1 kb existierten. Zwei μg des pUC18-Vektors wurden mit 10 E SmaI behandelt, um ihn vollständig zu spalten, und anschließend wurde er mit alkalischer Phosphatase (Takara Shuzo Co., Ltd.) behandelt, um eine Dephosphorylierung durchzuführen. Die Reaktionsflüssigkeit wurde einer Phenolbehandlung und einer Ethanolfällung, wie vorstehend beschrieben, unterzogen, um die Vektor-DNA zu gewinnen, welche dann in TE suspendiert wurde. 50 ng dieser Vektor-DNA und 50 ng der oben beschriebenen Fragmente wurden einer Ligierungsreaktion unter Verwendung eines Ligierungskits (Takara Shuzo Co., Ltd.) unterzogen und dann in kompetente Zellen des E. coli-Stamms JM109 (Takara Shuzo Co., Ltd.) eingeschleust. Der Bakterienstamm, welcher den Schritt der Einschleusung durchgemacht hat, wurde auf LB-Medium, enthaltend 100 μg/ml Ampicillin, gezüchtet, und die Plasmid-DNAs wurden aus wachsenden Clonen isoliert. Durch Spalten der DNAs mit dem Restriktionsenzym und einer anschließenden Agarosegel-Elektrophorese wurden jeweils in Frage kommende Clone selektiert, welche die gewünschten DNA-Fragmente mit einer Größe von etwa 2 kb und etwa 1 kb enthalten. Unter Verwendung der folgenden Oligonucleotide E und F mit den Nucleotidsequenzen:
Oligonucleotid E: 5'-AACAA TTTCA CACAG GAAAC AGCTA TGACC-3' (30-Mer)
und
Oligonucleotid F: 5'-CAGTC ACGAC GTTGT AAAAC GACGG CCAGT-3' (30-Mer),
welche auf dem pUC18-Vektor vorliegen, als Primer wurden die Nucleotidsequenzen der DNAs, die in den in Frage kommenden Clonen enthalten waren, unter Verwendung des Taq Dye Desoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (PE Biosystems) und eines Fluoreszenz-Sequenzanalysengeräts (PE Biosystems) analysiert. Basierend auf den so gefundenen Nucleotidsequenzen wurden Oligonucleotide synthetisiert und als Primer verwendet, um die Nucleotidsequenzen in der gleichen Weise, wie vorstehend beschrieben, zu analysieren. Als Ergebnis wurden die in SEQ ID NO: 1 gezeigte Nucleotidsequenz und die in SEQ ID NO: 2 gezeigte Nucleotidsequenz ermittelt.
Beispiel 2: Erzeugung einer transgenen Pflanze, in welche ein Promotor der vorliegenden Erfindung eingebracht worden ist
(1) Konstruktion eines Ti-Plasmid-Expressionsvektors
Die Oligonucleotide G und H mit den folgenden Nucleotidsequenzen:
Oligonucleotid G: 5'-GGAAG CTTCA TGTGT GCCCT ACAGC ACA-3' (28-Mer) und
Oligonucleotid H: 5'-GGTCT AGAGA TCTTT AGAAT GTGAT TGCTG-3' (30-Mer),
welche Restriktionsenzym-Erkennungsnucleotidsequenzen für die Clonierung enthalten, wurden synthetisiert und als Primer verwendet, um eine PCR (40 Inkubationszyklen bei 94°C für 1 min, dann bei 55°C für 2 min und weiter bei 74°C für 3 min pro Zyklus) durchzuführen, wobei als Matrize das Plasmid mit der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Nucleotidsequenz, welches in Beispiel 1 erhalten wurde, verwendet wurde.
Das amplifizierte DNA-Fragment wurde mit 10 E HindIII und 10 E XbaI behandelt, um es vollständig zu spalten, und ein Teil des Spaltprodukts wurde dann auf einem 0,8%igen Agarosegel fraktioniert. Die DNA-Bande mit einer Größe von etwa 1,7 kb wurde ausgeschnitten, und die in dem Gelstück enthaltene DNA wurde mit Hilfe von Glaskügelchen (Bio-Rad Laboratories) gereinigt. In gleicher Weise wurde die restliche Lösung auf einem 4%igen Nusieve-Agarosegel (FMC BioProducts) fraktioniert. Die Bande mit einer Größe von etwa 250 bp wurde ausgeschnitten, und die in dem Gelstück enthaltene DNA wurde gereinigt. Zwei μg des Vektors plG121HM (vgl. 3), welcher von pBIN19 abgeleitet ist, beschrieben z.B. bei Ohta S. et al., Plant Cell Physiol. 31 (6) (1990), 805-813, und bei Hiei Y. et al., Plant J. 6 (1994), 271-282, wurde mit 10 E HindIII und 10 E XbaI gespalten und anschließend mit alkalischer Phosphatase behandelt, um eine Dephosphorylierung durchzuführen. Anschließend wurden eine Phenolbehandlung und eine Ethanolfällung durchgeführt, wie vorstehend beschrieben wurde, um die Vektor-DNA zu gewinnen. Die Vektor-DNA und die vorstehenden zwei DNA-Fragmente (etwa 1,7 kb und etwa 250 bp) wurden einer Ligierungsreaktion unter Verwendung eines Ligierungskits unterzogen. Das Ligierungsprodukt wurde anschließend in kompetente Zellen des E. coli-Stamms HB101 (Takara Shuzo Co., Ltd.) eingeschleust, und der Bakterienstamm, welcher den Schritt der Einschleusung durchgemacht hat, wurde auf LB-Medium, enthaltend 50 μg/ml Kanamycin, gezüchtet. Aus den wachsenden Clonen wurden die Plasmid-DNAs isoliert, mit den Restriktionsenzymen HindIII und XbaI gespalten und durch eine Agarosegel-Elektrophorese analysiert, um ein Plasmid zu selektieren, das sowohl die 1,7 kb große DNA als auch das etwa 250 bp große DNA-Fragment, wie vorstehend beschrieben, enthält. Ferner wurde unter Verwendung des selektierten Plasmids als eine Matrize eine PCR (40 Inkubationszyklen bei 94°C für 1 min, dann bei 55°C für 2 min und weiter bei 74°C für 3 min pro Zyklus) durchgeführt, wobei die oben erwähnten Oligonucleotide G und H als Primer verwendet wurden:
Oligonucleotid G: 5'-GGAAG CTTCA TGTGT GCCCT ACAGC ACA-3' (28-Mer) und
Oligonucleotid H: 5'-GGTCT AGAGA TCTTT AGAAT GTGAT TGCTG-3' (30-Mer),
Als Ergebnis wurde bestätigt, dass ein etwa 2 kb großes DNA-Fragment amplifiziert worden war, wodurch der Ti-Plasmid-Expressionsvektor pBICR16G6P (3), der den Promotor der vorliegenden Erfindung stromaufwärts von dem β-Glucuronidase-Gens enthält, erhalten wurde.
(2) Erhalt einer transgenen Pflanze
Die transgene Pflanze wurde mit Hilfe des Verfahrens erhalten, welches bei Gelvin S.B., Schilperoort R.A. und Verma D.P.S., "Plant Molecular Biology/Manual" (1988) (Kluwer Academic Publishers), und bei Valvekens et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85 (1988), 5536-5540, beschrieben ist.
Der Agrobacterium-Stamm C58C1, welcher aus einem im Handel erhältlichen Standardstamm gemäß dem Verfahren, welches z.B. bei Deblaere R. et al., Nucleic Acids Res. 13 (1985), 4777-4788, beschrieben ist, hergestellt werden kann, wurde in YEB-Medium über Nacht unter Schütteln bei 30°C gezüchtet, dann in frisches YEB-Medium überimpft und weiter gezüchtet, bis die Trübung der Kultur einen OD₆₀₀-Wert = 0,6 erreichte. Die folgenden Manipulationen wurden in einem kalten Raum durchgeführt. Die Bakterienzellen wurden durch Zentrifugation aus der Kulturflüssigkeit gewonnen, in vorgekühltem sterilem destilliertem Wasser suspendiert und abermals zentrifugiert, um sie zu ernten. Das Waschen der Bakterienzellen wurde zweimal wiederholt, und das gleiche Verfahren wurde noch einmal unter Verwendung einer 10%igen Glycerinlösung anstelle des sterilen destillierten Wassers durchgeführt. Die so erhaltenen Bakterienzellen wurden in 10% Glycerin suspendiert, um eine 400-fach konzentrierte Suspension im Vergleich zur Kulturflüssigkeit zu erhalten. In die so hergestellte Bakterienzellsuspension wurde der Ti-Plasmid-Expressionsvektor pBICR16G6P (vgl. 1), welcher konstruiert wurde, wie vorstehend beschrieben, und welcher den Promotor der vorliegenden Erfindung enthielt, oder der Vektor plG121 HM als eine Kontrolle durch Elektroporation eingeschleust, und der Bakterienstamm, welcher der Behandlung zur Einschleusung unterzogen worden war, wurde auf einer YEB-Platte, enthaltend 50 μg/ml Kanamycin, gezüchtet. Aus einem wachsenden, Kanamycin-resistenten Clon wurde die Plasmid-DNA mit Hilfe der Alkali-SDS-Methode isoliert, und die DNA wurde durch eine Elektrophorese auf einem 0,8%igen Agarosegel analysiert. Durch Färben des Gels mit Ethidiumbromid zum Nachweis von DNA-Banden wurde bestätigt, dass der Ti-Plasmid-Expressionsvektor eingeschleust worden ist. Ferner wurde unter Verwendung dieser Plasmid-DNA als eine Matrize eine PCR (40 Inkubationszyklen bei 94°C für 1 min, dann bei 55°C für 2 min und weiter bei 74°C für 3 min pro Zyklus) durchgeführt, wobei die oben erwähnten Oligonucleotide G und H als Primer verwendet wurden:
Oligonucleotid G: 5'-GGAAG CTTCA TGTGT GCCCT ACAGC ACA-3' (28-Mer) und
Oligonucleotid H: 5'-GGTCT AGAGA TCTTT AGAAT GTGAT TGCTG-3' (30-Mer),
Als Ergebnis wurde die Amplifikation eines etwa 2 kb großen DNA-Fragments bestätigt, was zeigt, dass der gewünschte Expressionsvektor eingeschleust worden ist.
Ein Teil eines steril kultivierten Tabakblattes (0,7 cm²) wurde für 2 Minuten in eine Agrobacterium-Flüssigkultur eingetaucht, über Nacht bei 30°C in YEB-Flüssigmedium, enthaltend 50 μg/ml Kanamycin, inkubiert und nach Entfernen der überschüssigen Flüssigkeit mit einem sterilen Filterpapier auf MS-NB-Medium gelegt. Nach Cokultivierung für 5 Tage bei 25°C unter den Bedingungen von 16 Stunden Licht und 8 Stunden Dunkelheit wurde das Teilstück mit MS-Flüssigmedium gewaschen und auf MS-NBC-Medium gelegt. Nach Kultivieren für weitere 5 Tage wurde das Teilstück auf MS-NBCK-Medium, enthaltend 100 μg/ml Kanamycin, übertragen und für etwa einen Monat stationär kultiviert. Der regenerierte Spross wurde von dem Blattstück abgeschnitten und auf MS-CK-Medium subkultiviert. Nach etwa einem Monat wurden die regenerierten Pflanzen, die bewurzelt waren, in Erde gepflanzt, um selbstbestäubte Samen zu erhalten.
Beispiel 3: Nachweis des Transgens in transgenen Pflanzen
Die transgenen Tabaksamen wurden für 5 Minuten in 2,5% Natriumhypochlorit/0,002% Triton X-100 getaucht, anschließend 4- bis 5-mal mit sterilem Wasser gewaschen und dann durch Kultivieren auf MS-Medium, enthaltend 100 μg/ml Kanamycin, aseptisch zum Keimen gebracht. Aus einer Pflanze, welche eine Kanamycin-Resistenz zeigte, wurde die genomische DNA mit Hilfe der CTAB-Methode isoliert. Unter Verwendung von 50 ng dieser DNA als eine Matrize wurde eine PCR (40 Inkubationszyklen bei 94°C für 1 min, dann bei 55°C für 2 min und weiter bei 72°C für 3 min pro Zyklus) durchgeführt, wobei für die Primer entweder eine Kombination aus Oligonucleotid I, umfassend einen Teil der Nucleotidsequenz des GUS-Gens, das ein Reportergen ist, und Oligonucleotid J, umfassend einen Teil der Nucleotidsequenz des Promotors der vorliegenden Erfindung, enthaltend eine DNA, welche die in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 7 gezeigte Nucleotidsequenz umfasst, verwendet wird:
Oligonucleotid I: 5'-ATCAA CACCT CAACA TTGAT GTTAG CGTAC-3' (30-Mer)
Oligonucleotid J: 5'-TCTGC ATCGG CGAAC TGATC-3' (20-Mer),
oder für die Primer eine Kombination aus Oligonucleotid K, umfassend einen Teil der Nucleotidsequenz des GUS-Gens, das ein Reportergen ist, und Oligonucleotid L, umfassend einen Teil der Nucleotidsequenz des NOS-Terminators, verwendet wird:
Oligonucleotid K: 5'-ACATG TGGAG TGAAG AGTAT C-3' (21-Mer)
Oligonucleotid L: 5'-GATAA TCATC GCAAG ACCGG-3' (20-Mer),
und ein Teil des PCR-Produkts wurde durch eine Elektrophorese auf einem 0,8%igen Agarosegel fraktioniert. Als Ergebnis wurde die Amplifikation der gewünschten DNA-Fragmente mit einer Länge von etwa 310 bp bzw. etwa 400 bp bestätigt.
Beispiel 4A: Nachweis der Expression des Transgens
Die GUS-Aktivitätsmessung und die GUS-Färbung wurden in den Blättern und Wurzeln eines Sämlings der in Beispiel 2 erhaltenen transgenen Pflanze gemäß den Verfahren, welche bei Jefferson, Plant Mol. Biol. Rep. 5 (1987), 387-405, beschrieben sind, durchgeführt. Die GUS-Aktivität wurde mittels Fluorometrie unter Verwendung von 4-Methylumbelliferylglucuronid als Substrat durchgeführt, und die Aktivitätsfärbung wurde unter Verwendung von 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-glucuronid (X-Gluc) als Substrat durchgeführt, und die Menge des abgeschiedenen blauen Farbstoffs (Indigotin) wurde gemessen.
(1) GUS-Färbung
Die vorstehend beschriebenen transgenen Tabaksamen wurden durch das Kultivieren davon auf MS-Medium, enthaltend 100 μg/ml Kanamycin, aseptisch zum Keimen gebracht. Nach einer Woche, drei Wochen oder einem Monat wurde die Kanamycin-resistente Pflanze herausgezogen und über Nacht in eine GUS-Färbelösung (1 mM X-Gluc, 0,5 mM K₃Fe(CN)₆, 0,5 mM K₄Fe(CN)₆, 0,3% Triton X-100) bei 37°C getaucht, um die Reaktion ablaufen zu lassen. Nach der Umsetzung wurde die Pflanze in 100%igem Ethanol entfärbt, und das Färbemuster wurde untersucht. Als Ergebnis wurde gezeigt, dass in der transgenen Tabakpflanze, in welche der Ti-Plasmid-Expressionsvektor pBICR16G6P (vgl. 1), enthaltend den Promotor der vorliegenden Erfindung, eingeschleust worden war, das β-Glucuronidase-Gen, das stromabwärts mit dem Promotor der vorliegenden Erfindung auf dem Expressionsvektor verbunden ist, in den Blättern, der Wurzel und dem Stamm stark exprimiert wurde.
(2) GUS-Aktivitätsmessung
Die vorstehend beschriebenen transgenen Tabaksamen wurden auf einem Medium, enthaltend 100 μg/ml Kanamycin, aseptisch zum Keimen gebracht und bei 25°C weiter kultiviert. Eine Woche, drei Wochen oder einen Monat nach der Keimung wurden Proben von 0,8 g der Wurzel und 0,5 g der Blätter der Kanamycinresistenten Pflanze in einem Mörser gesammelt, mit 1 ml bzw. 0,5 ml Extraktionspuffer (50 mM Phosphatpuffer, pH 7,0, 10 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 0,1 % Sarcosyl, 10 mM Mercaptoethanol) supplementiert und mit einer geeigneten Menge an hinzugefügtem Meersand zerrieben. Die Mahlflüssigkeit wurde in ein Eppendorf-Röhrchen überführt und zentrifugiert, und der Überstand wurde gewonnen. Zehn bis 70 μl dieser Flüssigkeit wurden zu 500 μl der Reaktionssubstratlösung (50 mM Phosphatpuffer, pH 7,0, 10 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 0,1 % Sarcosyl, 10 mM Mercaptoethanol, 1 mM 4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronid) zugegeben und bei 37°C inkubiert. 100 μl-Aliquot-Proben der Reaktionsflüssigkeit wurden in regelmäßigen Abständen entnommen, und 900 μl Stopplösung (0,2 M Natriumcarbonatlösung) wurden sofort dazu zugegeben und eingemischt. Die Fluoreszenz der so hergestellten Proben wurde in einem Spektrophotofluorometer (Hitachi, Ltd., F-2000) (Anregungswellenlänge: 365 nm, Emissionswellenlänge: 455 nm) gemessen. Aus dem gemessenen Wert und der Proteinkonzentration des Extrakts aus den Blättern oder der Wurzel wurde die GUS-Aktivität berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben. Die Quantifizierung der Proteinkonzentration wurde gemäß einer Methode unter Verwendung des Protein-Testreagens von Bio-Rad Laboratories durchgeführt. Die GUS-Aktivität wurde in den Proben aus den Blättern und der Wurzel der transgenen Tabakpflanze, in welche der Ti-Plasmid-Expressionsvektor pBICR16G6P, enthaltend einen Promotor der vorliegenden Erfindung (der Vektor enthält eine DNA, umfassend einen Promotor der vorliegenden Erfindung, verbunden mit dem β-Glucuronidase-Gen), eingeschleust worden ist, nachgewiesen. Eine der Transformanten mit der höchsten GUS-Aktivität zeigte eine um das 8-fache höhere GUS-Aktivität im Vergleich zur der Kontroll-Transformante, die mit dem plG121 NM-Vektor (der Vektor enthält eine DNA, umfassend den 35S-Promotor, verbunden mit dem β-Glucuronidase-Gen) transformiert wurde.
Tabelle 1: Ergebnis der GUS-Aktivitätsmessung einer transgenen Tabakpflanze
[IP-8 bis -14 entsprechen Tabakindividuen, in welche der Ti-Plasmid-Expressionsvektor pBICR16G6P, enthaltend den Promotor der vorliegenden Erfindung, eingeschleust worden ist, und PIG-1 bis -2 entsprechen Tabakindividuen, in welche der plG121 HM-Vektor eingebracht worden ist. Das relative Verhältnis entspricht dem relativen Wert der GUS-Aktivität in den Blättern oder der Wurzel jedes Entwicklungsstadiums, wobei für die entsprechende Aktivität der mit dem plG121 HM-Vektor transformierten Tabakpflanze (PIG-2) ein Wert von 1 angenommen wird.] Eine Woche nach der Aussaat
Drei Wochen nach der Aussaat
Einen Monat nach der Aussaat
Beispiel 4B: Nachweis der Expression des Transgens
(1) Erhalt einer transgenen Pflanze
Die andere transgene Pflanze, Arabidopsis, wurde durch im Wesentlichen das gleiche Verfahren wie in dem vorstehenden Beispiel, in dem der Agrobacterium-Stamm C58C1, enthaltend den Ti-Plasmid-Expressionsvektor pBICR16G6P, verwendet wurde, um den Vektor in die Zielpflanze einzuschleusen, erhalten.
Nach der aseptischen Keimung wurde ein Teil (ca. 1 cm) der Arabidopsis-Wurzel, welche auf MS-Medium bei 23°C für 2-3 Wochen kultiviert worden war, für 2 Tage auf CIM-Agarmedium kultiviert und dann für 2 Minuten in eine Agrobacterium-Flüssigkultur getaucht, über Nacht bei 30°C in YEB-Flüssigmedium, enthaltend 50 μg/ml Kanamycin, inkubiert und nach Entfernen der überschüssigen Flüssigkeit mit einem sterilen Filterpapier auf CIM-Agarmedium gelegt. Nach Kultivieren für 2 Tage wurde das Teilstück auf SIMC-Agarmedium übertragen. Nach weiterem Kultivieren für 2 Tage wurde das Teilstück auf SIMCH-Agarmedium übertragen. Der regenerierte Spross wurde von dem Wurzelstück abgeschnitten und auf MS-Medium subkultiviert. Nach etwa einem Monat wurden die Individuen, welche bewurzelt waren, in Erde oder Steinwolle gepflanzt und in einer Wachstumskammer kultiviert, um Inzuchtsamen zu erhalten.
(2) Nachweis des Transgens in einer transgenen Pflanze
Die transgenen Arabidopsis-Samen wurden für 5 Minuten in 1,0% Natriumhypochlorit getaucht, anschließend 3- bis 5-mal mit sterilem Wasser gewaschen und dann auf MS-Medium, enthaltend 20 μg/ml Hygromycin, aseptisch zum Keimen gebracht. Aus 4 oder 5 Rosettenblättern, erhalten von einem Individuum, das eine Hygromycin-Resistenz zeigte, wurde die genomische DNA durch das CTAB-Verfahren isoliert. Unter Verwendung von 50 ng dieser DNA als eine Matrize wurde eine PCR (40 Inkubationszyklen bei 94°C für 1 min, dann bei 55°C für 2 min und weiter bei 72°C für 3 min pro Zyklus) durchgeführt, wobei für die Primer entweder eine Kombination aus Oligonucleotid I, umfassend einen Teil der Nucleotidsequenz des GUS-Gens, das ein Reportergen ist, und Oligonucleotid J, umfassend einen Teil der Nucleotidsequenz des Promotors der vorliegenden Erfindung, enthaltend eine DNA, welche die in SEQ ID NO: 7 gezeigte Nucleotidsequenz umfasst, verwendet wird:
Oligonucleotid I: 5'-ATCAA CACCT CAACA TTGAT GTTAG CGTAC-3' (30-Mer) und
Oligonucleotid J: 5'-TCTGC ATCGG CGAAC TGATC-3' (20-Mer),
oder für die Primer eine Kombination aus Oligonucleotid K, umfassend einen Teil der Nucleotidsequenz des GUS-Gens, das ein Reportergen ist, und Oligonucleotid L, umfassend einen Teil der Nucleotidsequenz des NOS-Terminators, verwendet wird:
Oligonucleotid K: 5'-ACATG TGGAG TGAAG AGTAT C-3' (21-Mer)
Oligonucleotid L: 5'-GATAA TCATC GCAAG ACCGG-3' (20-Mer),
und ein Teil des PCR-Produkts wurde durch eine Elektrophorese auf einem 0,8%igen Agarosegel fraktioniert. Als Ergebnis wurde die Amplifikation der gewünschten DNA-Fragmente mit einer Länge von etwa 310 bp bzw. etwa 400 bp bestätigt.
(3) Nachweis der Expression des Transgens
Die GUS-Aktivitätsmessung und die GUS-Färbung wurden in den Blättern und Wurzeln eines Sämlings der in Beispiel 4B (1) und (2) erhaltenen transgenen Pflanze gemäß den Verfahren, welche bei Jefferson, Plant Mol. Biol. Rep. 5 (1987), 387-405, beschrieben sind, durchgeführt. Die GUS-Aktivität wurde mittels Fluorometrie unter Verwendung von 4-Methylumbelliferylglucuronid als Substrat durchgeführt, und die Aktivitätsfärbung wurde unter Verwendung von 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-glucuronid (X-Gluc) als Substrat durchgeführt, und die Menge des abgeschiedenen blauen Farbstoffs (Indigotin) wurde gemessen.
(3-1) GUS-Färbung
Die vorstehend beschriebenen transgenen Arabidopsis-Samen wurden durch das Kultivieren davon auf MS-Medium, enthaltend 20 μg/ml Hygromycin, aseptisch zum Keimen gebracht. Nach drei Wochen wurde die Hygromycin-resistente Pflanze herausgezogen und über Nacht in eine GUS-Färbelösung (1 mM X-Gluc, 0,5 mM K₃Fe(CN)₆, 0,5 mM K₄Fe(CN)₆, 0,3% Triton X-100) bei 37°C getaucht, um die Reaktion ablaufen zu lassen. Nach der Umsetzung wurde die Pflanze in 100%igem Ethanol entfärbt, und das Färbemuster wurde untersucht. Als Ergebnis wurde gezeigt, dass in der transgenen Arabidopsis-Pflanze, in welche der Ti-Plasmid-Expressionsvektor pBICR16G6P (vgl. 1), enthaltend den Promotor der vorliegenden Erfindung, eingeschleust worden ist, das β-Glucuronidase-Gen, das strom abwärts mit dem Promotor der vorliegenden Erfindung auf dem Expressionsvektor verbunden ist, in den Blättern, der Wurzel und dem Stamm stark exprimiert wurde.
(3-2) GUS-Aktivitätsmessung
Die vorstehend beschriebenen transgenen Arabidopsis-Samen wurden durch das Kultivieren davon auf einem Medium, enthaltend 20 μg/ml Hygromycin, aseptisch zum Keimen gebracht und bei 23°C weiter kultiviert. Drei Wochen nach der Aussaat wurden die Wurzeln und die Blätter, die von drei Individuen erhalten wurden, welche eine Hygromycin-Resistenz zeigten, in einem Mörser gesammelt, mit 1 ml bzw. 1 ml Extraktionspuffer (50 mM Phosphatpuffer, pH 7,0, 10 mM EDTA, 0,1 % Triton X-100, 0,1% Sarcosyl, 10 mM Mercaptoethanol) supplementiert und mit einer geeigneten Menge an hinzugefügtem Meersand zerrieben. Die Mahlflüssigkeit wurde in ein Eppendorf-Röhrchen überführt und zentrifugiert, und der Überstand wurde gewonnen. Zehn bis 70 μl dieser Flüssigkeit wurden zu 500 μl der Reaktionssubstratlösung (50 mM Phosphatpuffer, pH 7,0, 10 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 0,1% Sarcosyl, 10 mM Mercaptoethanol, 1 mM 4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronid) zugegeben und bei 37°C inkubiert. 100 μl-Aliquot-Proben der Reaktionsflüssigkeit wurden in regelmäßigen Abständen entnommen, und 900 μl Stopplösung (0,2 M Natriumcarbonatlösung) wurden sofort dazu zugegeben und eingemischt. Die Fluoreszenz der so hergestellten Proben wurde in einem Spektrophotofluorometer (Hitachi, Ltd., F-2000) (Anregungswellenlänge: 365 nm, Emissionswellenlänge: 455 nm) gemessen. Aus dem gemessenen Wert und der Proteinkonzentration des Extrakts aus den Blättern oder der Wurzel wurde die GUS-Aktivität berechnet. Die Quantifizierung der Proteinkonzentration wurde gemäß einer Methode unter Verwendung des Protein-Testreagens von Bio-Rad Laboratories durchgeführt. Als Ergebnis wurde die GUS-Aktivität in den Proben aus den Blättern und der Wurzel der transgenen Arabidopsis-pflanze, in welche der Ti-Plasmid-Expressionsvektor pBICR16G6P, enthaltend den Promotor der vorliegenden Erfindung (der Vektor enthält eine DNA, umfassend den Promotor der vorliegenden Erfindung verbunden mit dem β-Glucuronidase-Gen), eingeschleust worden ist, nachgewiesen. Einige der Transformanten zeigten eine um das Mehrfache höhere GUS-Aktivität im Vergleich zu der Kontroll-Transformante, welche mit dem plG121 HM-Vektor (der Vektor enthält eine DNA, umfassend den 35S-Promotor verbunden mit dem β-Glucuronidase-Gen) transformiert war.
Beispiel 5: Erzeugung einer transgenen Pflanze, in welche ein Promotor der vorliegenden Erfindung eingeschleust worden ist, und Nachweis der Expression des Transgens
Wie in Beispiel 2 (1) dargelegt, wurde der Bakterienclon, der den Vektor pBICR16G6P trägt, über Nacht bei 37°C in 2 ml LB-Medium, enthaltend 50 μg/ml Kanamycin, gezüchtet. Anschließend wurde die Vorkultur auf 500 ml LB-Medium, enthaltend 50 μg/ml Kanamycin, überimpft und über Nacht bei 37°C gezüchtet. Die Bakterienzellen wurden durch Zentrifugation bei 8000 UpM für 10 Minuten gewonnen, und die Vektor-DNA wurde unter Verwendung des Plasmidreinigungskits von Qiagen (Qiagen, Inc.) gereinigt.
Der gewonnene Vektor wurde in ein expandiertes Sojabohnenblatt eingeschleust, das von der im Gewächshaus gewachsenen Pflanze entfernt worden war, und der somatische Sojabohnen-Embryo wurde mit Hilfe des durch Finer J. und Nagasawa A. (Plant Cell, Tissue and Organ Culture 15 (1988), 125-136) beschriebenen Verfahrens mittels der Genbeschuss-Methode (C.M. Particle Gun System, Rehbock Co., Tokyo, Japan: Yang N.-S., Christou P., Particle Bombardment Technology for Gene Transfer, W.H. Freeman and Co. Publishers, New York, S. 52-59) induziert und kultiviert. Goldpartikel (Tokuriki Honten Co., Ltd., Japan) von 0,5-1 μm wurden mehrere Male mit Ethanol gewaschen und mit sterilem Wasser in Form einer Suspension von 60 mg/ml Goldpartikel zubereitet. 50 μl der Goldpartikel-Suspension, 50 μl 2,5 M CaCl₂ und 20 μl 0,1 M Spermidin wurden mit 20 μl der pBICR16G6P-Vektorsuspension (0,5 μg/ml) gemischt. Nach Stehenlassen für 30 Minuten bei Raumtemperatur wurden die Goldpartikel durch Zentrifugation bei 9000 UpM für 10 Sekunden gewonnen und in 65 μl 75%igem Ethanol suspendiert. Die Goldpartikel wurden durch Zentrifugation bei 9000 UpM für 10 Sekunden gewonnen und in 300 μl 100%igem Ethanol resuspendiert. Diese Goldpartikel-Suspension wurde mit Ultraschall behandelt (Tomy Seiko Co., Ltd.), und 20 μl der Suspension wurden auf das Projektil (Rehbock Co., Ltd., Tokyo, Japan) aufgebracht und getrocknet (10 μl der Suspension wurden zweimal aufgebracht). Diese Goldpartikel wurden zweimal auf das expandierte Blatt oder den somatischen Embryo der Soja bohne auf MS-Agarmedium unter den Bedingungen von 110 mmHg, 335 m/sec geschossen.
Für das Kontrollexperiment wurden pBI121 und pBI221 (Clontech Laboratories, Inc.), wie beschrieben, auf das expandierte Blatt oder den somatischen Embryo der Sojabohne geschossen. Nach dem Genbeschuss ließ man das expandierte Blatt oder den somatischen Embryo der Sojabohne bei 25°C für 24 h stehen und weichte sie anschließend in GUS-Färbepuffer (1 mM X-Gluc, 0,5 mM K₃Fe(CN)₆, 0,5 mM K₄Fe(CN)₆, 0,3% Triton X-100) bei 37°C über Nacht ein. Nach dem Entfärben mit 100%igen Ethanol bei Raumtemperatur wurden sowohl in dem somatischen Embryo als auch in dem expandierten Blatt blaue Flecken beobachtet, welche aus einer GUS-Expression resultieren. Auf diese Weise wurde eine starke GUS-Aktivität des pBICR16G6P-Vektors sowohl für das expandierte Blatt als auch den somatischen Embryo der Sojabohne bestätigt.
Beispiel 6: Konstruktion eines Vektors, welcher einen Promotor und einen Terminator der vorliegenden Erfindung enthält
(1) Konstruktion eines Ti-Plasmid-Derivats (pBIΔ)
Um den Pflanzenexpressionsvektor zu konstruieren, der einen Promotor und einen Terminator der vorliegenden Erfindung enthält, wurde in einem ersten Schritt ein Ti-Plasmid-Derivat (pBIΔ) konstruiert, wie in 4 gezeigt ist. Die Oligonucleotide P und Q mit den folgenden Nucleotidsequenzen, die Restriktionsenzym-Erkennungsnucleotidsequenzen für die Clonierung enthalten:
Oligonucleotid P: 5'-GGGAA TTCTC AGATT GTCGT TTCCC GCCTT CAG-3' (33-Mer)
Oligonucleotid Q: 5'-CAGAT CTGGG GAACC CTGTG GTTG-3' (24-Mer),
wurden synthetisiert und als Primer verwendet, um eine PCR (40 Inkubationszyklen bei 94°C für 1 min, dann bei 55°C für 2 min und weiter bei 74°C für 3 min pro Zyklus) unter Verwendung von 5 ng des Vektors pBI101 (Clontech Laboratories, Inc.) als eine Matrize durchzuführen. Das amplifizierte DNA-Fragment wurde mit 30 E EcoRI und 30 E SphI behandelt, um es vollständig zu spalten, und ein Teil des Spaltprodukts wurde dann auf einem 4,0%igen Nusieve-Agarosegel (FMC BioProducts) fraktioniert. Die DNA-Bande mit einer Größe von 186 bp wurde ausgeschnitten, und die in dem Gelstück enthaltene DNA wurde unter Verwendung von Glaskügelchen (Bio-Rad Laboratories) gereinigt. Zwei μg des Vektors pBI101 (Clontech Laboratories, Inc.) wurden mit 10 E EcoRI und 10 E SphI gespalten. Anschließend wurden eine Phenolbehandlung und eine Ethanolfällung durchgeführt, wie vorstehend beschrieben wurde, um die Vektor-DNA zu gewinnen. Die Vektor-DNA und das vorstehende DNA-Fragment wurden einer Ligierungsreaktion unter Verwendung eines Ligierungskits unterzogen, und das Ligierungsprodukt wurde anschließend in kompetente Zellen des E. coli-Stamms HB101 (Takara Shuzo Co., Ltd.) eingebracht, und die transformierten Bakterienzellen wurden auf LB-Medium, enthaltend 50 μg/ml Kanamycin, gezüchtet. Aus den wachsenden Clonen wurden die Plasmid-DNAs isoliert, mit den Restriktionsenzymen EcoRI und SphI gespalten und durch eine Agarosegel-Elektrophorese analysiert, um ein Plasmid (pBIΔ) zu selektieren, welches das vorstehend beschriebene 186 bp-DNA-Fragment enthält. Die EcoRI-Stelle ist die einzige Restriktionsenzym-Erkennungsstelle in der T-DNA-Region dieses Plasmids.
(2) Einführung von HindIII- und XbaI-Erkennungsstellen in gCR16G6P, enthaltend einen Promotor der vorliegenden Erfindung
Die Oligonucleotide R und S mit den folgenden Nucleotidsequenzen, die Restriktionsenzym-Erkennungsnucleotidsequenzen für die Clonierung enthalten:
Oligonucleotid R: 5'-GGTCT AGAGA TCTTT AGAAT GTGAT TGCTG-3' (30-Mer)
Oligonucleotid S: 5'-AACAA TGTAT GTCCG GTGTA CATCT ATGAC-3' (30-Mer),
wurden synthetisiert und als Primer verwendet, um eine PCR (40 Inkubationszyklen bei 94°C für 1 min, dann bei 55°C für 2 min und weiter bei 74°C für 3 min pro Zyklus) unter Verwendung des Plasmids mit der in SEQ ID NO: 7 gezeigten Nucleotidsequenz, welches in Beispiel 1 erhalten wurde, als eine Matrize durchzuführen. Das amplifizierte DNA-Fragment wurde mit 50 E XbaI behandelt, um es vollständig zu spalten, und ein Teil des Spaltprodukts wurde dann auf einem 4,0%igen Nusieve-Agarosegel (FMC BioProducts) fraktioniert. Die DNA-Bande mit einer Größe von etwa 250 bp wurde ausgeschnitten, und die in dem Gelstück enthaltene DNA wurde unter Verwendung von Glaskügelchen (Bio-Rad Laboratories) gereinigt. Zwei μg des Vektors pCR16G6P mit der in SEQ ID NO: 7 gezeigten Nucleotidsequenz, welcher in Beispiel 1 erhalten wurde, wurden mit 10 E XbaI gespalten und ferner mit alkalischer Phosphatase behandelt, um eine Dephosphorylierung durchzuführen. Anschließend wurden eine Phenolbehandlung und eine Ethanolfällung durchgeführt, wie vorstehend beschrieben wurde, um die Vektor-DNA zu gewinnen. Die Vektor-DNA und das gewonnene 250 bp-DNA-Fragment wurden einer Ligierungsreaktion unter Verwendung eines Ligierungskits unterzogen, und das Ligierungsprodukt wurde anschließend in kompetente Zellen des E. coli-Stamms HB101 (Takara Shuzo Co., Ltd.) eingebracht, und die transformierten Bakterienzellen wurden auf LB-Medium, enthaltend 50 μg/ml Kanamycin, gezüchtet. Aus den wachsenden Clonen wurde die Plasmid-DNA isoliert, mit dem Restriktionsenzym XbaI gespalten und durch eine Agarosegel-Elektrophorese analysiert, um ein Plasmid zu selektieren, welches das vorstehend beschriebene 250 bp-DNA-Fragment enthält. Ferner wurde unter Verwendung des selektierten Plasmids als eine Matrize und unter Verwendung des oben erwähnten Oligonucleotids S als einen Primer:
Oligonucleotid S: 5'-AACAA TGTAT GTCCG GTGTA CATCT ATGAC-3' (30-Mer),
die in dem selektierten Plasmid enthaltene Nucleotidsequenz auch mit Hilfe des Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (PE Biosystems) und eines Fluoreszenz-Sequenzanalysengeräts analysiert. Als Ergebnis wurde bestätigt, dass dieses Plasmid, pBICR16G6P-2 (4), den Promotor der vorliegenden Erfindung stromaufwärts von dem β-Glucuronidase-Gen enthält.
(2) Konstruktion des Vektors, welcher einen Terminator der vorliegenden Erfindung enthält
pCR16G6T-2, enthaltend eine Terminator-Nucleotidsequenz der vorliegenden Erfindung, in welchen SacI- und EcoRI-Erkennungsstellen für die Genclonierung eingeführt sind, wurde unter Verwendung von pCR16G6T, enthaltend das in SEQ ID NO: 2 gezeigte DNA-Fragment, konstruiert. 50 ng pC16-Plasmid-DNA (Plant Cell Physiology 38 (9) (1997), 1080-1086; JP 07-188288) wurden mit 50 E DraI und 50 E SacI behandelt, um sie vollständig zu spalten, und ein Teil des Spaltprodukts wurde dann auf einem 4,0%igen Nusieve-Agarosegel (FMC BioProducts) fraktioniert. Die DNA-Bande mit einer Größe von etwa 189 bp wurde ausgeschnitten, und die in dem Gelstück enthaltene DNA wurde unter Verwendung von Glaskügelchen (Bio-Rad Laboratories) gereinigt.
Die Oligonucleotide T und U mit den folgenden Nucleotidsequenzen, welche Restriktionsenzym-Erkennungsnucleotidsequenzen für die Clonierung enthalten:
Oligonucleotid T: 5'-TTCAT AATTT ACAGA GTGAG TGACA GTCAG-3' (30-Mer)
Oligonucleotid U: 5'-GGGAA TTCCT GAAAA GGAAG TTCAT CGATC TATC-3' (34-Mer),
wurden synthetisiert und als Primer verwendet, um eine PCR (40 Inkubationszyklen bei 94°C für 1 min, dann bei 55°C für 2 min und weiter bei 74°C für 3 min pro Zyklus) unter Verwendung von 5 ng pCR16G6T, enthaltend das in SEQ ID NO: 2 gezeigte DNA-Fragment, als eine Matrize durchzuführen. Das amplifizierte DNA-Fragment wurde mit 20 E EcoRI und 20 E DraI gespalten, um es vollständig zu spalten, und ein Teil des Spaltprodukts wurde dann auf einem 4,0%igen Nusieve-Agarosegel (FMC BioProducts) fraktioniert. Die DNA-Bande mit einer Größe von 800 bp wurde ausgeschnitten, und die in dem Gelstück enthaltene DNA wurde unter Verwendung von Glaskügelchen (Bio-Rad Laboratories) gereinigt. Zwei μg des Vektors pUC18 (Takara Shuzo Co., Ltd.) wurden mit 20 E EcoRI und 20 E DraI gespalten. Anschließend wurden eine Phenolbehandlung und eine Ethanolfällung durchgeführt, wie vorstehend beschrieben wurde, um die Vektor-DNA zu gewinnen. Die Vektor-DNA und die vorstehenden zwei DNA-Fragmente wurden einer Ligierungsreaktion unter Verwendung eines Ligierungskits unterzogen, und das Ligierungsprodukt wurde anschließend in kompetente Zellen des E. coli-Stamms JM109 (Takara Shuzo Co., Ltd.) eingebracht, und die transformierten Bakterien wurden auf LB-Medium, enthaltend 100 μg/ml Ampicillin und 40 μg/ml X-Gal, gezüchtet. Aus den weißen Kolonien wurden die Vektor-DNAs isoliert, mit den Restriktionsenzymen EcoRI und SacI gespalten und durch eine Agarosegel-Elektrophorese analysiert, um einen Vektor (pCR16G6T-2) zu selektieren, welcher ein 989 bp-DNA-Fragment enthält.
(4) Konstruktion eines Ti-Plasmid-Vektors enthaltend einen Promotor und einen Terminator der vorliegenden Erfindung
Zwei μg pCR16G6P-2, beschrieben in Beispiel 6 (2), wurden mit 20 E EcoRI und 20 E SalI behandelt, um es vollständig zu spalten, und ein Teil des Spaltprodukts wurde dann auf einem 0,8%igen Agarosegel (Dojindo Laboratories) fraktioniert. Die DNA-Bande mit einer Größe von 2 kb wurde ausgeschnitten, und das in dem Gelstück enthaltene DNA-Fragment G wurde unter Verwendung von Glaskügelchen (Bio-Rad Laboratories) gereinigt. In gleicher Weise wurden 2 μg pCR16G6T, beschrieben in Beispiel 6 (3), mit 20 E EcoRI und 20 E SalI vollständig gespalten, und ein Teil des Spaltprodukts wurde dann auf einem 4,0%igen Nusieve-Agarosegel (FMC BioProducts) fraktioniert. Die DNA-Bande mit einer Größe von 1 kb wurde ausgeschnitten, und das in dem Gelstück enthaltene DNA-Fragment H wurde unter Verwendung von Glaskügelchen (Bio-Rad Laboratories) gereinigt. Außerdem wurde der pBluescript KS-Vektor (Clontech Laboratories, Inc.) mit EcoRI behandelt, um ihn vollständig zu spalten, und anschließend mit alkalischer Phosphatase behandelt, um eine Dephosphorylierung durchzuführen. Im Anschluß daran wurden eine Phenolbehandlung und eine Ethanolfällung durchgeführt, wie vorstehend beschrieben wurde, um die Vektor-DNA zu gewinnen. Die Vektor-DNA und die vorstehenden zwei DNA-Fragmente H und G wurden einer Ligierungsreaktion unter Verwendung eines Ligierungskits unterzogen. Das Ligierungsprodukt wurde in kompetente Zellen des E. coli-Stamms JM109 (Takara Shuzo Co., Ltd.) eingebracht, und die transformierten Bakterien wurden auf LB-Medium, enthaltend 100 μg/ml Ampicillin und 40 μg/ml X-Gal, gezüchtet. Aus den weißen Kolonien wurden die Vektor-DNAs isoliert, mit dem Restriktionsenzym EcoRI gespalten und durch eine Elektrophorese auf einem 0,8%igen Agarosegel analysiert, um einen Vektor zu selektieren, der ein 3 kb-DNA-Fragment enthält. Dieser Vektor wurde dann mit 20 E EcoRI behandelt, um ihn vollständig zu spalten. Andererseits wurde pBIΔ, beschrieben unter (1), mit 20 E EcoRI behandelt, um es vollständig zu spalten, und anschließend mit alkalischer Phosphatase (Takara Shuzo Co., Ltd.) behandelt, um eine Dephosphorylierung durchzuführen. Die Vektor-DNA und das 3 kb-DNA-Fragment wurden einer Ligierungsreaktion unter Verwendung eines Ligierungskits unterzogen Das Ligierungsprodukt wurde anschließend in kompetente Zellen des E. coli-Stamms HB101 (Takara Shuzo Co., Ltd.) eingebracht, und die transformierten Bakterienzellen wurden auf LB-Medium, enthaltend 50 μg/ml Kanamycin, gezüchtet. Aus den wachsenden Clonen wurden die Vektor-DNAs isoliert, mit den Restriktionsenzymen EcoRI oder EcoRI und SalI gespalten und durch eine Elektrophorese auf einem 0,8%igen Agarosegel analysiert, um einen Vektor (pBICR16G6PT) zu selektieren, welcher das 3 kb-DNA-Fragment oder ein DNA-Fragment von etwa 2 kb bzw. 1 kb enthält.
(5) Deletion der HindIII-Erkennungsstelle aus pBICR16G6PT
Ein μg des Vektors pBICR16G6PT wurde mit HindIII behandelt, um ihn vollständig zu spalten, und die DNA wurde mittels Ethanolfällung gewonnen. Im Anschluß daran wurde das DNA-Fragment mit 5 E der T4-DNA-Polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.) behandelt, um glatte Enden zu erzeugen, und anschließend wurden eine Phenolbehandlung und eine Ethanolfällung durchgeführt, wie vorstehend beschrieben wurde, um das DNA-Fragment zu gewinnen. Das DNA-Fragment wurde einer Ligierungsreaktion unter Verwendung eines Ligierungskits unterzogen. Das Ligierungsprodukt wurde in kompetente Zellen des E. coli-Stamms HB101 (Takara Shuzo Co., Ltd.) eingebracht, und die transformierten Bakterien wurden auf LB-Medium, enthaltend 50 μg/ml Kanamycin, gezüchtet. Aus den wachsenden Clonen wurden die Vektor-DNAs isoliert, mit dem Restriktionsenzym HindIII gespalten und durch eine Elektrophorese auf einem 0,8%igen Agarosegel analysiert, um einen Vektor (pBICR16G6PTΔ) zu selektieren, der die HindIII-Erkennungsstelle verloren hat.
Beispiel 7: Nachweis der Expression des Transgens
(1) Einführung eines GUS-Gens in pBICR16G6PTΔ
Zwei μg pBI221-Plasmid-DNA (Clontech Laboratories, Inc.) wurden mit 20 E SmaI und 20 E SacI behandelt, um sie vollständig zu spalten, und die DNA wurde mittels Ethanolfällung gewonnen. Im Anschluß daran wurde das DNA-Fragment mit 5 E der T4-DNA-Polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.) behandelt, um glatte Enden zu erzeugen, und anschließend wurden eine Phenolbehandlung und eine Ethanolfällung durchgeführt, wie vorstehend beschrieben wurde, um das DNA-Fragment zu gewinnen. Das DNA-Fragment wurde anschließend auf einem 1,0%igen Agarosegel (Dojindo Laboratories) fraktioniert. Die DNA-Bande mit einer Größe von etwa 1,7 kb wurde ausgeschnitten, und das in dem Gelstück enthaltene GUS-Gen wurde unter Verwendung von Glaskügelchen (Bio-Rad Laboratories) gereinigt. Außerdem wurden 2 μg des pBluescript KS-Vektors (Clontech Laboratories, Inc.) mit 20 E SmaI behandelt, um ihn vollständig zu spalten, und anschließend mit alkalischer Phosphatase behandelt, um eine Dephosphorylierung durchzuführen. Anschließend wurden eine Phenolbehandlung und eine Ethanolfällung durchgeführt, wie vorstehend beschrie ben wurde, um das Vektor-DNA-Fragment zu gewinnen. 50 μg der Vektor-DNA und 100 ng des vorstehenden 1,7 kb-GUS-Gen-Fragments wurden einer Ligierungsreaktion unter Verwendung eines Ligierungskits unterzogen. Das Ligierungsprodukt wurde in kompetente Zellen des E. coli-Stamms JM109 (Takara Shuzo Co., Ltd.) eingebracht, und die transformierten Bakterienzellen wurden auf LB-Medium, enthaltend 100 μg/ml Ampicillin und 40 μg/ml X-Gal, gezüchtet.
Die Oligonucleotide M und K mit den folgenden Nucleotidsequenzen, die eine Nucleotidsequenz basierend auf pBluescript KS (Oligonucleotid M) und dem GUS-Gen (Oligonucleotid K) enthalten:
Oligonucleotid M: 5'-GTAAA ACGAC GGCCA GT-3' (17-Mer)
Oligonucleotid K: 5'-ACATG TGGAG TGAAG AGTAT-3' (21-Mer),
wurden synthetisiert und als Primer verwendet, um eine PCR (40 Inkubationszyklen bei 94°C für 1 min, dann bei 55°C für 2 min und weiter bei 74°C für 3 min pro Zyklus) mit einer Suspension der weißen Kolonien der vorstehenden Transformanten durchzuführen. Das amplifizierte DNA-Fragment wurde dann auf einem 4,0%igen Nusieve-Agarosegel (FMC BioProducts) fraktioniert. Der Clon, welcher die Amplifikation eines 410 bp großen DNA-Fragments zeigte, wurde für die weitere Konstruktion ausgewählt. Zwei μg der gereinigten Plasmid-DNA wurden mit 20 E SalI und 20 E BamHI gespalten, um sie vollständig zu spalten, und das DNA-Fragment wurde dann auf einem 0,8%igen Agarosegel (Dojindo Laboratories) fraktioniert. Die DNA-Bande mit einer Größe von etwa 1,7 kb wurde ausgeschnitten, und das in dem Gelstück enthaltene DNA-Fragment wurde unter Verwendung von Glaskügelchen (Bio-Rad Laboratories) gereinigt. Zwei μg pBICR16G6PTΔ wurden mit 20 E SalI und 20 E BamHI gespalten, und anschließend mit alkalischer Phosphatase (Takara Shuzo Co., Ltd.) behandelt, um eine Dephosphorylierung durchzuführen. 50 ng der Vektor-DNA und 20 ng des vorstehenden 1,7 kb-DNA-Fragments wurden einer Ligierungsreaktion unter Verwendung eines Ligierungskits unterzogen. Das Ligierungsprodukt wurde in kompetente Zellen des E. coli-Stamms HB101 (Takara Shuzo Co., Ltd.) eingebracht, und die transformierten Bakterien wurden auf LB-Medium, enthaltend 50 μg/ml Kanamycin, gezüchtet.
Die Oligonucleotide U und K mit den folgenden Nucleotidsequenzen, wie beschrieben:
Oligonucleotid U: 5'-GGGAA TTCCT GAAAA GGAAG TTCAT CGATC TATC-3' (34-Mer)
Oligonucleotid K: 5'-ACATG TGGAG TGAAG AGTAT-3' (21-Mer),
wurden synthetisiert und als Primer verwendet, um eine PCR (40 Inkubationszyklen bei 94°C für 1 min, dann bei 55°C für 2 min und weiter bei 74°C für 3 min pro Zyklus) mit einer Suspension der weißen Kolonien der vorstehenden Transformanten durchzuführen. Das amplifizierte DNA-Fragment wurde dann auf einem 0,8%igen Agarosegel (Dojindo Laboratories) fraktioniert. Der Clon, welcher die Amplifikation eines etwa 1,1 kb großen DNA-Fragments zeigte (pBICR16G6PTΔ-G), wurde für das weitere Experiment ausgewählt. Der Bakterienclon, der den Vektor pBICR16G6PTΔ-G trägt, wurde über Nacht bei 37°C in 2 ml LB-Medium, enthaltend 50 μg/ml Kanamycin, gezüchtet. Anschließend wurde die Vorkultur auf 500 ml LB-Medium, enthaltend 50 μg/ml Kanamycin, überimpft und über Nacht bei 37°C gezüchtet. Die Bakterienzellen wurden durch Zentrifugation bei 8000 UpM für 10 Minuten gewonnen, und die Vektor-DNA wurde unter Verwendung des Plasmidreinigungskits von Qiagen (Qiagen, Inc.) gereinigt.
(2) Nachweis der GUS-Gen-Expression mittels Genbeschuss
pBICR16G6PTΔ-G wurde gemäß der Methode von Morikawa et al. (C.M. Particle Gun System, Rehbock Co., Tokyo, Japan), wie in Beispiel 5 beschrieben, in einen somatischen Embryo der Sojabohne eingebracht. Für das Kontrollexperiment wurde pBI221 (Clontech Laboratories, Inc.) in der gleichen Weise eingeschleust. Der beschossene somatische Embryo der Sojabohne wurde bei 25°C für 24 h stehengelassen und in GUS-Färbepuffer bei 37°C über Nacht eingeweicht. Für den mit pBICR16G6PTΔ-G beschossenen somatischen Embryo der Sojabohne wurde ein deutliches GUS-Färbemuster nachgewiesen.
Beispiel 8: Einführung einer Mutationsstelle in einen Promotor der vorliegenden Erfindung
(1) Einführung einer Mutationsstelle in den Promotor
(1-1) Deletion der SacI-Erkennungsstelle in einem Promotor der vorliegenden Erfindung
Zwei μg pBICR16G6P werden mit 20 E SacI behandelt, um eine vollständige Spaltung zu ergeben. Anschließend wird das DNA-Fragment ferner mit 5 E der T4-DNA-Polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.) behandelt, um glatte Enden herzustellen, und dann werden eine Phenolbehandlung und eine Ethanolfällung durchgeführt, wie vorstehend beschrieben wurde, um das DNA-Fragment zu gewinnen. Das DNA-Fragment kann dann auf einem 1,0%igen Agarosegel (Dojindo Laboratories) fraktioniert werden. Die DNA-Banden mit einer Größe von etwa (a) 3,9 kb und (b) 880 bp werden ausgeschnitten, und die in den Gelstücken enthaltenen DNA-Fragmente (a) und (b) werden unter Verwendung von Glaskügelchen (Bio-Rad Laboratories) gereinigt. 50 ng des DNA-Fragments (a) und 100 ng des DNA-Fragments (b) werden einer Ligierungsreaktion unter Verwendung eines Ligierungskits unterzogen. Das Ligierungsprodukt wird in kompetente Zellen des E. coli-Stamms JM109 (Takara Shuzo Co., Ltd.) eingebracht, und die transformierten Bakterienzellen werden auf LB-Medium, enthaltend 100 μg/ml Ampicillin, über Nacht gezüchtet.
Die Oligonucleotide M und G mit den folgenden Nucleotidsequenzen, enthaltend die Nucleotidsequenz, wie vorstehend beschrieben:
Oligonucleotid M: 5'-GTAAA ACGAC GGCCA GT-3' (17-Mer)
Oligonucleotid G: 5'-GGAAG CTTCA TGTGT GCCCT ACAGC ACA-3' (28-Mer),
werden synthetisiert und als Primer verwendet, um eine PCR (40 Inkubationszyklen bei 94°C für 1 min, dann bei 55°C für 2 min und weiter bei 74°C für 3 min pro Zyklus) mit einer Suspension der gewachsenen Kolonien der vorstehenden Transformanten durchzuführen. Das amplifizierte DNA-Fragment wird dann auf einem 0,8%igen Agarosegel (Dojindo Laboratories) fraktioniert. Der Clon, welcher die Amplifikation eines etwa 2 kb großen DNA-Fragments zeigt, wird ausgewählt, und die Plasmid-DNA wird unter Verwendung des Qia-Präp-Spin-Kits (Qiagen, Inc.) gereinigt. Die gereinigten Plasmid-DNAs werden mit SacI gespalten und durch eine Elektrophorese auf einem 1,0%igen Agarosegel analysiert, um ein Plasmid zu selektieren, welches die SacI-Erkennungsstelle verloren hat. Die Gen-Nucleotidsequenz, welche in SEQ ID NO: 3 gezeigt ist, ist ein Beispiel für das Plasmid, welches die SacI-Erkennungsstelle verloren hat.
(1-2) Deletion der SphI-Erkennungsstelle in einem Promotor der vorliegenden Erfindung
In gleicher Weise, wie in Abschnitt (1-1) beschrieben, kann die SphI-Erkennungsstelle in dem in SEQ ID NO: 7 gezeigten DNA-Fragment deletiert werden. Zwei μg pBICR16G6P werden mit 20 E SphI behandelt, um eine vollständige Spaltung zu ergeben. Anschließend wird das DNA-Fragment außerdem mit 5 E der T4-DNA-Polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.) behandelt, um glatte Enden herzustellen, und im Anschluß daran werden eine Phenolbehandlung und eine Ethanolfällung durchgeführt, wie vorstehend beschrieben wurde, um das DNA-Fragment zu gewinnen. Das DNA-Fragment kann dann auf einem 0,8%igen Agarosegel (Dojindo Laboratories) fraktioniert werden. Die DNA-Banden mit einer Größe von etwa (c) 3,0 kb und (d) 1,6 kb werden ausgeschnitten, und die in den Gelstücken enthaltenen DNA-Fragmente (c) und (d) werden unter Verwendung von Glaskügelchen (Bio-Rad Laboratories) gereinigt. 50 ng des DNA-Fragments (c) und 100 ng des DNA-Fragments (d) werden einer Ligierungsreaktion unter Verwendung eines Ligierungskits unterzogen. Das Ligierungsprodukt wird in kompetente Zellen des E. coli-Stamms JM109 (Takara Shuzo Co., Ltd.) eingebracht, und die transformierten Bakterienzellen werden auf LB-Medium, enthaltend 100 μg/ml Ampicillin, über Nacht gezüchtet.
Die Oligonucleotide M und N mit den folgenden Nucleotidsequenzen, enthaltend die Nucleotidsequenz, wie beschrieben:
Oligonucleotid M: 5'-GTAAA ACGAC GGCCA GT-3' (17-Mer)
Oligonucleotid N: 5'-AGGAC GACTT AGGTG AATAC-3' (20-Mer),
werden synthetisiert und als Primer verwendet, um eine PCR (40 Inkubationszyklen bei 94°C für 1 min, dann bei 55°C für 2 min und weiter bei 74°C für 3 min pro Zyklus) mit einer Suspension der gewachsenen Kolonien der vorstehenden Transformanten durchzuführen. Das amplifizierte DNA-Fragment wird dann auf einem 0,8%igen Agarosegel (Dojindo Laboratories) fraktioniert. Der Clon, welcher die Amplifikation eines etwa 1,6 kb großen DNA-Fragments zeigt, wird ausgewählt, und die Plasmid-DNA wird unter Verwendung des Qia-Präp-Spin-Kits (Qiagen, Inc.) gereinigt. Die gereinigten Plasmid-DNAs werden mit SphI gespalten und durch eine Elektrophorese auf einem 1,0%igen Agarosegel analysiert, um ein Plasmid zu selektieren, welches die SphI-Erkennungsstelle verloren hat. Die Gen-Nucleotidsequenz, welche in SEQ ID NO: 4 gezeigt ist, ist ein Beispiel für die Plasmid-Nucleotidsequenz, welche die SphI-Erkennungsstelle verloren hat. Der Promotor, welcher die SphI-Erkennungsstelle verloren hat, kann auch dazu verwendet werden, um weiterhin die SacI-Erkennungsstelle zu deletieren, wie in Abschnitt (1-1) beschrieben ist.
(1-3) Deletion der XbaI-Erkennungsstelle in einem Promotor der vorliegenden Erfindung
In gleicher Weise, wie in Abschnitt (1-1) und (1-2) beschrieben, kann die XbaI-Erkennungsstelle in dem in SEQ ID NO: 7 gezeigten DNA-Fragment deletiert werden. Zwei μg pBICR16G6P werden mit 20 E XbaI behandelt, um eine vollständige Spaltung zu ergeben. Anschließend wird das DNA-Fragment außerdem mit 5 E der T4-DNA-Polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.) behandelt, um glatte Enden zu ergeben, und im Anschluß daran werden eine Phenolbehandlung und eine Ethanolfällung durchgeführt, wie vorstehend beschrieben wurde, um das DNA-Fragment zu gewinnen. Das DNA-Fragment kann dann für die DNA-Banden mit einer Größe von etwa (e) 7,0 kb auf einem 0,8%igen Agarosegel (Dojindo Laboratories) und für die DNA-Bande mit einer Größe von etwa (f) 250 bp auf einem 4,0%igen Nusieve-Agarosegel (FMC BioProducts) fraktioniert werden. Die DNA-Fragmente in den Gelstück werden unter Verwendung von Glaskügelchen (Bio-Rad Laboratories) gereinigt. 50 ng des DNA-Fragments (e) und 20 ng des DNA-Fragments (f) werden einer Ligierungsreaktion unter Verwendung eines Ligierungskits unterzogen. Das Ligierungsprodukt wird in kompetente Zellen des E. coli-Stamms JM109 (Takara Shuzo Co., Ltd.) eingebracht, und die transformierten Bakterienzellen werden auf LB-Medium, enthaltend 100 μg/ml Ampicillin, über Nacht gezüchtet.
Die Oligonucleotide M und 0 mit den folgenden Nucleotidsequenzen, enthaltend die Nucleotidsequenz, wie vorstehend beschrieben:
Oligonucleotid M: 5'-GTAAA ACGAC GGCCA GT-3' (17-Mer)
Oligonucleotid O: 5'-ATACA TCTTT TCAAA TTTCA-3' (20-Mer),
werden synthetisiert und als Primer verwendet, um eine PCR (40 Inkubationszyklen bei 94°C für 1 min, dann bei 55°C für 2 min und weiter bei 74°C für 3 min pro Zyklus) mit einer Suspension der gewachsenen Kolonien der vorstehenden Transformanten durchzuführen. Das amplifizierte DNA-Fragment wird dann auf einem 4,0%igen Nusieve-Agarosegel (FMC BioProducts) fraktioniert. Der Clon, welcher die Amplifikation eines etwa 250 bp großen DNA-Fragments zeigt, wird ausgewählt, und die Plasmid-DNA wird unter Verwendung des Qia-Präp-Spin-Kits (Qiagen, Inc.) gereinigt. Die gereinigten Plasmid-DNAs werden mit XbaI gespalten und durch eine Elektrophorese auf einem 1,0%igen Agarosegel analysiert, um ein Plasmid zu selektieren, welches die XbaI-Erkennungsstelle verloren hat. Die Gen-Nucleotidsequenz, welche in SEQ ID NO: 5 gezeigt ist, ist ein Beispiel für die Plasmid-Nucleotidsequenz, welche die XbaI-Erkennungsstelle verloren hat. In gleicher Weise kann der Promotor, welcher die XbaI-Erkennungsstelle verloren hat, auch verwendet werden, um ferner die SacI-Erkennungsstelle oder die SphI-Erkennungsstelle zu deletieren, wie in Abschnitt (1-1) bzw. (1-2) beschrieben ist.
(2) Konstruktion eines Pflanzenexpressionsvektors, enthaltend einen mutierten Promotor der vorliegenden Erfindung
Der Expressionsvektor kann durch das in Beispiel 2 beschriebene Verfahren konstruiert werden. Die Oligonucleotide G und H mit den folgenden Nucleotidsequenzen, die Restriktionsenzym-Erkennungsnucleotidsequenzen für die Clonierung enthalten:
Oligonucleotid G: 5'-GGAAG CTTCA TGTGT GCCCT ACAGC ACA-3' (28-Mer)
Oligonucleotid H: 5'-GGTCT AGAGA TCTTT AGAAT GTGAT TGCTG-3' (30-Mer),
werden synthetisiert und als Primer verwendet, um eine PCR (40 Inkubationszyklen bei 94°C für 1 min, dann bei 55°C für 2 min und weiter bei 74°C für 3 min pro Zyklus) unter Verwendung des Plasmids mit der in SEQ ID NO: 3, 4 oder 5 gezeigten Nucleotidsequenz als eine Matrize durchzuführen. Das amplifizierte DNA-Fragment wird mit 10 E HindIII und 10 E XbaI behandelt, um es vollständig zu spalten, und ein Teil des Spaltprodukts wird dann auf einem 0,8%igen Agarosegel fraktioniert. Die DNA-Bande mit einer Größe von etwa 2,0 kb oder die DNA-Banden mit einer Größe von etwa 1,7 kb bzw. 250 bp werden ausgeschnitten, und die in den Gelstücken enthaltenen DNA-Fragmente werden unter Verwendung von Glaskügelchen (Bio- Rad Laboratories) gereinigt. Zwei μg des Vektors plG121HM (vgl. 3), welcher von pBIN19 abgeleitet ist, beschrieben z.B. bei Ohta S. et al., Plant Cell Physiol. 31 (6) (1990), 805-813, und bei Hiei Y. et al., Plant J. 6 (1994), 271-282, werden mit 10 E HindIII und 10 E XbaI gespalten und anschließend mit alkalischer Phosphatase behandelt, um eine Dephosphorylierung durchzuführen. Im Anschluß daran werden eine Phenolbehandlung und eine Ethanolfällung durchgeführt, wie vorstehend beschrieben wurde, um die Vektor-DNA zu gewinnen. Die Vektor-DNA und die vorstehenden zwei DNA-Fragmente (etwa 2,0 kb oder 1,7 kb und etwa 250 bp) werden einer Ligierungsreaktion unter Verwendung eines Ligierungskits unterzogen. Das Ligierungsprodukt wird anschließend in kompetente Zellen des E. coli-Stamms HB101 (Takara Shuzo Co., Ltd.) eingebracht, und der Bakterienstamm, welcher dem Schritt der Einführung unterzogen wurde, wird auf LB-Medium, enthaltend 50 μg/ml Kanamycin, gezüchtet. Anschließend werden aus den wachsenden Clonen die Vektor-DNAs isoliert, mit den Restriktionsenzymen HindIII und XbaI gespalten und durch eine Agarosegel-Elektrophorese analysiert, um einen Vektor zu selektieren, der die vorstehend beschriebenen DNA-Fragmente von 2,0 kb oder 1,7 kb und 250 bp enthält. Anschließend wird unter Verwendung des selektierten Vektors als eine Matrize eine PCR (40 Inkubationszyklen bei 94°C für 1 min, dann bei 55°C für 2 min und weiter bei 74°C für 3 min pro Zyklus) mit Hilfe der oben erwähnten Oligonucleotide G und H:
Oligonucleotid G: 5'-GGAAG CTTCA TGTGT GCCCT ACAGC ACA-3' (28-Mer)
Oligonucleotid H: 5'-GGTCT AGAGA TCTTT AGAAT GTGAT TGCTG-3' (30-Mer),
als Primer durchgeführt. Als Ergebnis wird bestätigt, dass ein DNA-Fragment von etwa 2,0 kb amplifiziert wird, wodurch Ti-Plasmid-Expressionsvektoren erhalten werden, welche einen Promotor der vorliegenden Erfindung mit der in SEQ ID NO: 3, 4 oder 5 gezeigten Nucleotidsequenz stromaufwärts von dem β-Glucuronidase-Gen enthalten. Außerdem kann der NOS-Terminator, welcher in den oben erwähnten Plasmiden enthalten ist, durch den Terminator, welcher von pBICR16G6PT oder pBICR16G6PTΔ, beschrieben in Beispiel 6, abgeleitet ist, ersetzt werden.
Beispiel 9: Konstruktion eines Vektors, enthaltend einen Promotor und einen Terminator der vorliegenden Erfindung, und Nachweis der Expression des Transgens
(1) Einführung eines GUS-Gens in den Expressionsvektor, welcher den Terminator der vorliegenden Erfindung enthält
Das GUS-Gen kann in den Expressionsvektor eingeführt werden, wie in Beispiel 7 (1) beschrieben ist. Zwei μg pBI221-Plasmid-DNA (Clontech Laboratories, Inc.) werden mit 20 E SmaI und 20 E SacI behandelt, um sie vollständig zu spalten, und die DNA wird mittels Ethanolfällung gewonnen. Anschließend wird das DNA-Fragment mit 5 E der T4-DNA-Polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.) behandelt, um glatte Enden zu ergeben, und dann werden eine Phenolbehandlung und eine Ethanolfälung durchgeführt, wie vorstehend beschrieben wurde, um das DNA-Fragment zu gewinnen. Das DNA-Fragment wird dann auf einem 1,0%igen Agarosegel (Dojindo Laboratories) fraktioniert. Die DNA-Bande mit einer Größe von etwa 1,7 kb wird aus beschnitten, und das in dem Gelstück enthaltene GUS-Gen wird unter Verwendung von Glaskügelchen (Bio-Rad Laboratories) gereinigt. In gleicher Weise werden 2 μg des pBluescript KS-Vektors (Clontech Laboratories, Inc.) mit 20 E SmaI behandel, um ihn vollständig zu spalten, und anschließend mit alkalischer Phosphatase behandelt, um eine Dephosphorylierung durchzuführen. Anschließend werden eine Phenolbehandlung und eine Ethanolfällung durchgeführt, wie vorstehend beschrieben wurde, um das Vektor-DNA-Fragment zu gewinnen. 50 μg der Vektor-DNA und 100 ng des vorstehenden 1,7 kb großen GUS-Gen-Fragments werden einer Ligierungsreaktion unter Verwendung eines Ligierungskits unterzogen. Das Ligierungsprodukt wird in kompetente Zellen des E. coli-Stamms JM109 (Takara Shuzo Co., Ltd.) eingebracht, und die transformierten Bakterienzellen werden auf LB-Medium, enthaltend 100 μg/ml Ampicillin und 40 μg/ml X-Gal, gezüchtet.
Die Oligonucleotide M und K mit den folgenden Nucleotidsequenzen, enthaltend eine Nucleotidsequenz basierend auf pBluescript KS (Oligonucleotid K) und dem GUS-Gen (Oligonucleotid M):
Oligonucleotid M: 5'-GTAAA ACGAC GGCCA GT-3' (17-Mer)
Oligonucaeotid K: 5'-ACATG TGGAG TGAAG AGTAT-3' (21-Mer),
werden synthetisiert und als Primer verwendet, um eine PCR (40 Inkubationszyklen bei 94°C für 1 min, dann bei 55°C für 2 min und weiter bei 74°C für 3 min pro Zyklus) mit einer Suspension der weißen Kolonien der vorstehenden Transformanten durchzuführen. Das amplifizierte DNA-Fragment wird dann auf einem 4,0%igen Nusieve-Agarosegel (FMC BioProducts) fraktioniert. Der Clon, welcher die Amplifikation eines 410 bp großen DNA-Fragments zeigt, wird für die weitere Konstruktion ausgewählt. Zwei μg der gereinigten Plasmid-DNA werden mit 20 E SalI und 20 E BamHI gespalten, um sie vollständig zu spalten, und das DNA-Fragment wird anschließend auf einem 0,8%igen Agarosegel (Dojindo Laboratories) fraktioniert. Die DNA-Bande mit einer Größe von etwa 1,7 kb wird ausgeschnitten, und das in dem Gelstück enthaltene DNA-Fragment wird unter Verwendung von Glaskügelchen (Bio-Rad Laboratories) gereinigt. Zwei μg pBICR16G6PT werden mit 20 E SalI und 20 E BamHI gespalten und anschließend mit alkalischer Phosphatase (Takara Shuzo Co., Ltd.) behandelt, um eine Dephosphorylierung durchzuführen. 50 ng der Vektor-DNA und 20 ng des vorstehenden 1,7 kb großen DNA-Fragments werden einer Ligierungsreaktion unter Verwendung eines Ligierungskits unterzogen. Das Ligierungsprodukt wird in kompetente Zellen des E. coli-Stamms HB101 (Takara Shuzo Co., Ltd.) eingebracht, und die transformierten Bakterienzellen werden auf LB-Medium, enthaltend 50 μg/ml Kanamycin, gezüchtet.
Die Oligonucleotide U und K mit den folgenden Nucleotidsequenzen, wie beschrieben:
Oligonucleotid U: 5'-GGGAA TTCCT GAAAA GGAAG TTCAT CGATC TATC-3' (34-Mer)
Oligonucleotid K: 5'-ACATG TGGAG TGAAG AGTAT-3' (21-Mer),
werden synthetisiert und als Primer verwendet, um eine PCR (40 Inkubationszyklen bei 94°C für 1 min, dann bei 55°C für 2 min und weiter bei 74°C für 3 min pro Zyklus) mit einer Suspension der weißen Kolonien der vorstehenden Transformanten durchzuführen. Das amplifizierte DNA-Fragment wird dann auf einem 0,8%igen Agarosegel (Dojindo Laboratories) fraktioniert. Der Clon, welcher die Amplifikation eines etwa 1,1 kb großen DNA-Fragments zeigt (pBICR16G6PTG), wird für das weitere Experiment ausgewählt. Der Bakterienclon, welcher pBICR16G6PTG trägt, wird über Nacht bei 37°C in 2 ml LB-Medium, enthaltend 50 μg/ml Kanamycin, gezüchtet. Anschließend wird die Vorkultur auf 500 ml LB-Medium, enthaltend 50 μg/ml Kanamycin, überimpft und über Nacht bei 37°C gezüchtet. Die Bakterienzellen werden durch Zentrifugation bei 8000 UpM für 10 Minuten gewonnen, und die Plasmid-DNA wird unter Verwendung des Plasmidreinigungskits von Qiagen (Qiagen, Inc.) gereinigt. Der Promotor der vorliegenden Erfindung mit der SEQ ID NO: 7, welcher in pBICR16G6PTG oder pBICR16G6PTΔ-G enthalten ist, kann durch die in Beispiel 8 beschriebenen Promotoren, den 35S-Promotor des Blumenkohlmosaikvirus (Nature 313, 810-812) oder den NOS-Promotor (Nucleic Acids Research 11 (2) (1983), 369-385), ersetzt werden.
(2) Nachweis der GUS-Genexpression mit Hilfe einer transgenen Tabakpflanze
Wie in Beispiel 2 (2) beschrieben, wird ein Teil eines steril kultivierten Tabakblatts (0,7 cm²) für 2 Minuten in eine Agrobacterium-Kultur, enthaltend den in Beispiel 8 und 9 beschriebenen Expressionsvektor, getaucht, über Nacht bei 30°C in YEB-Flüssigmedium, enthaltend 50 μg/ml Kanamycin, inkubiert und nach dem Entfernen der überschüssigen Flüssigkeit mit einem sterilen Filterpapier auf MS-NB-Medium gelegt. Nach Cokultivierung für 5 Tage bei 25°C unter den Bedingungen von 16 Stunden Licht und 8 Stunden Dunkelheit wird das Blattstück mit MS-Flüssigmedium gewaschen und auf MS-NBC-Medium gelegt. Nach Kultivieren für weitere 5 Tage wird das Blattstück auf MS-NBCK-Medium, enthaltend einen Selektionswirkstoff, übertragen und für etwa einen Monat stationär kultiviert. Der regenerierte Spross wird von dem Blattstück abgeschnitten und auf MS-CK-Medium subkultiviert. Nach etwa einem Monat werden die Individuen, welche bewurzelt sind, in Erde gepflanzt, um selbstbestäubte Samen zu erhalten. Das GUS-Gen kann in dem vorstehenden transgenen Tabak-Genom nachgewiesen werden, wie in Beispiel 3 beschrieben wurde. Auch kann die auf einem Terminator der vorliegenden Erfindung basierende GUS-Expressionsaktivität durch das in Beispiel 4 beschriebene Verfahren nachgewiesen werden.
(3) Nachweis der GUS-Genexpression mittels Genbeschuss
Die Vektor-DNAs können gemäß der Methode von Morikawa et al. (C.M. Particle Gun System, Rehbock Co., Tokyo, Japan), wie in Beispiel 5 beschrieben, in einen somatischen Embryo der Sojabohne eingebracht werden. Für das Kontrollexperiment kann pBI221 (Clontech Laboratories, Inc.) in der gleichen Weise eingeschleust werden. Der beschossene somatische Embryo der Sojabohne wird bei 25°C für 24 h stehengelassen und in GUS-Färbepuffer bei 37°C über Nacht eingeweicht. Für den somatischen Embryo der Sojabohne, welcher mit den oben erwähnten Vektoren beschossen wurde, wird ein deutliches GUS-Färbemuster nachgewiesen.
Die Zusammensetzungen der in den Beispielen verwendeten Medien waren wie folgt:
(1) Medien für Pflanzen
(i) MS-Agarmedium (für Tabak)

4,4 g Murashige-Skoog-Basalmedium (Sigma Chemical Co.) und 30 g Saccharose wurden in 1 l destilliertem Wasser gelöst, mit 1 N KOH auf einen pH-Wert von 5,8 eingestellt, mit 8 g Agar (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) ergänzt und dann autoklaviert.

(ii) MS-NB-Agarmedium

MS-Agarmedium, ergänzt mit 0,1 μg/ml 1-Naphthalinessigsäure (NAA) und 1,0 μg/ml 6-Benzylaminopurin (BA).

(iii) MS-NBC-Agarmedium

MS-NB-Agarmedium, ergänzt mit 300 μg/ml Cefotaxim.

(iv) MS-NBCK-Agarmedium

MS-NB-Agarmedium, ergänzt mit 100 μg/ml Kanamycin und 300 μg/ml Cefotaxim.

(v) MS-CK-Agarmedium

MS-Agarmedium, ergänzt mit 100 μg/ml Kanamycin und 300 μg/ml Cefotaxim.

(vi) MS-Agarmedium (für Arabidopsis)

4,4 g Murashige-Skoog-Basalmedium (Sigma Chemical Co.) und 20 g Saccharose wurden in 1 l destilliertem Wasser gelöst, mit 1 N KOH auf einen pH-Wert von 6,3 eingestellt, mit 2 g Gellan-Gummi (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) ergänzt und dann autoklaviert.

(vii) CIM-Agarmedium

MS-Agarmedium, ergänzt mit 0,5 μg/ml 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) und 0,05 μg/ml Kinetin.

(viii) SIMC-Agarmedium

MS-Agarmedium, ergänzt mit 5 μg/ml N₆-[2-Isopentenyl]adenin (2-iP), 0,15 μg/ml Indolessigsäure (IAA) und 300 μg/ml Cefotaxim.

(ix) SIMCH-Agarmedium

SIMC-Agarmedium, ergänzt mit 20 μg/ml Hygromycin.

(2) Medien für Bakterien und Phagen
(i) L-Medium

10 g Bacto-Trypton (Difco Laboratories), 5 g Bacto-Hefeextrakt (Difco Laboratories) und 10 g NaCl werden in 1 l destilliertem Wasser gelöst, mit 5 N NaOH auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt und autoklaviert. Falls für Platten verwendet, werden 15 g Agar vor dem Autoklavieren dazugegeben.

(ii) YEB-Medium

5 g Bacto-Rinderextrakt (Difco Laboratories), 1 g Bacto-Hefeextrakt (Difco Laboratories), 5 g Polypepton, 5 g Saccharose und 0,2 ml 10 N NaOH werden in 1 l destilliertem Wasser gelöst, autoklaviert und dann vor dem Gebrauch mit 0,2 ml sterilfiltriertem 1 M MgSO₄ ergänzt. Zur Herstellung des Agarmediums werden 15 g Agar vor dem Autoklavieren dazugegeben

Auswirkungen der Erfindung
Im Einklang mit der vorliegenden Erfindung werden Promotoren und Terminatoren bereitgestellt, welche in der Lage sind, ein Gen von Interesse in Pflanzen wirksam zu exprimieren. Sequenzprotokoll

Claims

Promotor, umfassend die folgende DNA (a) oder (b), dadurch gekennzeichnet, dass er in Pflanzenzellen funktionsfähig ist: (a) DNA, umfassend die Nucleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 7 gezeigt ist, oder (b) DNA, umfassend eine Nucleotidsequenz, in welcher eine oder mehrere Basen in der in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 7 gezeigten Nucleotidsequenz entfernt, ersetzt oder hinzugefügt sind, und welche mehr als 90% Identität zur Nucleotidsequenz einer beliebigen Region bestehend aus 250 bp oder mehr innerhalb der in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 7 gezeigten Nucleotidsequenz hat, wobei die DNA Promotorfunktionen äquivalent zu denen der oben unter (a) genannten DNA hat und hohe Expressionen in Blatt, Wurzel und Stamm vermittelt.
Terminator, umfassend die folgende DNA (a) oder (b), dadurch gekennzeichnet, dass er in Pflanzen funktionsfähig ist: (a) DNA, umfassend die Nucleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 2 gezeigt ist, oder (b) DNA, umfassend eine Nucleotidsequenz, in welcher eine oder mehrere Basen in der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Nucleotidsequenz entfernt, ersetzt oder hinzugefügt sind, und welche mehr als 90% Identität zur Nucleotidsequenz einer beliebigen Region bestehend aus 250 bp oder mehr innerhalb der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Nucleotidsequenz hat, wobei die DNA Terminatorfunktionen äquivalent zu denen der oben unter (a) genannten DNA hat.
Chimäres Gen, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Promotor nach Anspruch 1 und ein gewünschtes Gen umfasst, welche in funktionsfähiger Form miteinander verbunden sind.
Chimäres Gen, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Promotor nach Anspruch 1, ein gewünschtes Gen und einen Terminator nach Anspruch 2 umfasst, welche in funktionsfähiger Form miteinander verbunden sind.
Vektor, dadurch gekennzeichnet, dass er einen Promotor nach Anspruch 1 enthält.
Vektor, dadurch gekennzeichnet, dass er einen Promotor nach Anspruch 1 und ein gewünschtes Gen enthält.
Vektor, dadurch gekennzeichnet, dass er einen Promotor nach Anspruch 1, ein gewünschtes Gen und einen Terminator nach Anspruch 2 enthält.
Verfahren zur Herstellung einer Transformante, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Schritt umfasst, in welchem ein Promotor nach Anspruch 1, ein chimäres Gen nach Anspruch 3 oder 4 oder ein Vektor nach Anspruch 5, 6, oder 7 in eine Wirtszelle eingebracht wird.
Transformante, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Promotor nach Anspruch 1, ein chimäres Gen nach Anspruch 3 oder 4 oder einen Vektor nach Anspruch 5, 6 oder 7 trägt, welche in die Wirtszelle eingebracht sind.
Transformante nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirtszelle eine mikrobielle Zelle oder eine Pflanzenzelle ist.
Verfahren zum Exprimieren eines Gens, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Schritt umfasst, in dem ein Promotor nach Anspruch 1 und ein gewünschtes Gen, welches stromabwärts des Promotors lokalisiert ist, in eine Wirtszelle eingebracht werden, und einen Schritt, in welchem das gewünschte Gen in der Wirtszelle unter der Kontrolle des Promotors exprimiert wird.
Verfahren zum Exprimieren eines Gens, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Schritt umfasst, in dem ein Terminator nach Anspruch 2 und ein gewünschtes Gen, welches stromaufwärts des Terminators lokalisiert ist, in eine Wirtszelle eingebracht werden, und einen Schritt, in welchem das gewünschte Gen in der Wirtszelle unter der Kontrolle des Terminators exprimiert wird.