DE69631906T2 - Verfahren zur herstellung von richtig gefaltetem, biologisch aktivem, rekombinantem protein - Google Patents

Verfahren zur herstellung von richtig gefaltetem, biologisch aktivem, rekombinantem protein Download PDF

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung eines korrekt gefalteten, biologisch aktiven Rekombinations-Proteins oder-Polypeptids, umfassend die Stufen des Exprimierens des Proteins in prokariontischen Zellen, Ernten der Zellen, direktes Löslichmachen der Zellen in einem Puffer bei pH 8 bis 11 und anschließendes Verdünnen mit Wasser und einem Verdünnungsmittel.
  • EINFÜHRUNG
  • Ein allgemeines Hauptproblem, wenn Rekombinations-Proteine in effektiven bakteriellen Expressionssystemen überproduziert werden, hängt mit der Faltung der Proteinprodukte in ihre nativen Konformationen zusammen. Ein sehr starkes Expressionsystem in Escherichia coli führt zur Bildung von Aggregaten von denaturierten Proteinen, sogenannten Einschlußkörpern, die in einigen Fällen zu dem erwünschten nativen Protein rückgefaltet werden können. Es wurden allgemeine Methoden gefunden, um die Rückfaltung zu erleichtern und effektiv zu machen. Eine ist die Anwendung von Hitzeschock-Proteinen (HSP) und die andere sind Faltungsenzyme. Bei Anwendung von HSP wird die Aggregation vermieden und bei Anwendung der Faltungsenzyme wird die Geschwindigkeit der Rückfaltung erhöht.
  • Nicht alle Proteine sind jedoch diesen Methoden zugänglich und es wurden andere Lösungen zur Erhöhung der Rückfaltungs-Ausbeuten angegeben. In einem Artikel von J.D. Carlson et al. in Biotechnology, Bd. 10, Januar 1992 ist die Verwendung von monoklonalen Antikörpern während der Protein-Rückfaltung, um die Ausbeute an nativem Protein, insbesondere S-Protein, zu erhöhen, angegeben.
  • Eine andere angegebene Methode zur Rückgewinnung des nativen Proteins ist das Löslichmachen des Einschlußkörper-Proteins mit einem denaturierenden Mittel, wie Guanidin oder Harnstoff, und, soweit erforderlich, eine Reduktion der Disulfid-Bindung. Durch Verdünnen oder Dialyse und Reoxidation kann das Protein zu dem nativen Protein rückgefaltet werden.
  • Ein erfolgreiches Rückfalten ohne Bildung von neuen Einschlußkörpern ist bei hohen Konzentrationen an dem Rekombinations-Protein im allgemeinen schwierig. Die beste Ausbeute wird im allgemeinen bei Konzentrationen von etwa 20 bis 200 μg/ml erreicht. Die Rückfaltung wird daher als eine sehr teuere Produktionsform angesehen, die ein kostenintensives Arzneimittel erfordert.
  • Die Ausbeute eines Rückfaltungs-Verfahrens ist jedoch nicht voraussehbar, da das Proteinprodukt häufig Aggregate bildet oder modifiziert wird. Außerdem enthält die lösliche rückgefaltete Fraktion bei IGF-I und II fehlgefaltete Arten und die Gesamtausbeute an korrekt gefaltetem Wachstumsfaktor ist ziemlich gering (Samuelsson, E. et al. (1991) Biotechnology Bd. 9, S. 363).
  • Um die Ausbeute an korrekt gefaltetem IGF-I zu erhöhen, sind unterschiedliche Methoden angegeben worden.
  • Der menschliche insulinartige Wachstumsfaktor I (IGF-1) ist ein einkettiger Peptid-Wachstumsfaktor aus 70 Aminosäuren, der ursprünglich aus Serum isoliert worden ist. IGF-I wird positiv reguliert durch Wachstumshormon (GH) und zeigt mitogene Wirkungen auf viele Zellarten. Daher wird angenommen, daß IGF-1 viele der das Wachstum fördernden Effekte von GH vermittelt. In den Homologie-Bereichen sind IGF-1 und Insulin 49% homolog, einschließlich der sechs Cysteinreste, die drei Disulfid-Bindungen ergeben. Die dreidimensionale Struktur von IGF-I wurde auf der Grundlage der Röntgenstruktur von Insulin als Modell aufgebaut und dieses Modell wurde in jüngster Zeit in den Disulfid-Brücken-Bereichen bestätigt durch Abstandsertordernisse, die erhalten wurden durch 2-D-NMR-Spektroskopie von IGF-I (für eine Übersicht über IGF s. insulinlike growth factors I and II, Humbel R.E., Eur. J. Biohem. 190, 445-462, 1990).
  • Menschliches Rekombinations-IGF-I wurde als sekretiertes Produkt sowohl in Escherichia coli als auch in Saccharomyces cerevisiae produziert. In isoliertem Material von beiden Arten findet sich IGF-I hauptsächlich als fehlgefaltete Formen mit intermolekularen Disulfiden. Außerdem hat ein Rückfalten von reduziertem IGF-1 in vitro in Gegenwart von Sauerstoff gezeigt, daß sich natives fehlgepaartes und zusammengeballtes IGF-1 ansammelt, selbst unter verdünnten Rückfaltungs-Bedingungen.
  • Die Ausbeute an Rekombinations-IGF-I beim Rückfalten wurde wesentlich verbessert durch Anwendung eines fusionierten Fusionspartners, bestehend aus zwei IgG-Bindungsdomänen (ZZ), abgeleitet von Staphylokokken-Protein A (Samuelsson, E. et al. (1991) Biotechnology Bd. 9, S. 363). Der ZZ-Fusionspartner wird angewandt, um fehlgefaltete Moleküle vor, während oder nach der Reduktion und Reoxidation löslich zu machen. Es hat sich gezeigt, daß die Ausbeute an korrekt gefaltetem IGF-I wesentlich erhöht wird, aber es liegt noch eine signifikante Menge an fehlgefaltetem IGF vor.
  • In Patentschriften und Patentanmeldungen ist ebenfalls das Problem von fehlgefaltetem IGF erwähnt und es sind verschiedene Verbesserungen vorgeschlagen worden. Die WO91/02807 (Amgen) (=US-PS 5 158 875) beschreibt ein Verfahren zum Rückfalten von IGF-I in Gegenwart einer fusionierten kurzen positiv geladenen Leitsequenz, in der Aminosäuren wie Lysin, Arginin und Histidin an dem N-Terminus von IGF-1 fusioniert sind. Einschlußkörper werden isoliert und mit Harnstoff löslich gemacht. In der WO93/11240 (Genetech) wird eine Methode zum Rückfalten von unlöslichem und nicht richtig gefaltetem IGF-1 beschrieben, umfassend das Löslichmachen von Einschlußkörpern und Rückfalten in einem einzigen Puffersystem.
  • Die US-PS 5 151 501 (American Cyanamid) gibt ein Verfahren an zum Löslichmachen und Naturieren von Somatotropinen (Wachstumshormonen) durch Dispergieren von brechenden Somatotropin-Körpern in einer Lösung, die Sulfolan enthält, und anschließendes Verdünnen.
  • In der WO93/19084 (Synergen) wird eine Methode zum Erzeugen von aktivem IGF-I beansprucht, umfassend die Stufen des Exprimierens in prokariontischen Zellen, Zugeben eines Denaturierungsmittels (z.B. Harnstoff), Zugeben eines Oxidationsmittels (z.B. oxidiertes Glutathion oder Cystein) und Zugeben eines zweiten Reduktionsmittels (z.B. DTT, Cystein usw.) Es wird Met-IGF-I exprimiert.
  • Die WO95/06064 beschreibt ein Verfahren zur Erhöhung der Ausbeute an korrekt rückgefaltetem Polypeptid, bei dem ein Kupfer- oder Mangansalz während der Rückfaltungsstufe zugegen ist, und die WO95/06059 (Genentech) beschreibt ein Verfahren zum Isolieren von Zellen durch Zugabe einer phasenbildenden Art, um mehrere wäßrige Phasen zu bilden.
  • Es wurde nun eine neue einfachere Methode zur Erzeugung von korrekt gefalteten biologisch aktivem Rekombinations-Protein oder-Polypeptid entwickelt. Insbesondere wird auf Rekombinations-IGF-I nach der Expression von Z-IGF-I Bezug genommen. Es wird hier auf die EP-230-869, insbesondere die Beispiele, verwiesen. Mit Escherichia coli , das das hybride Protein Z-IGF-I exprimiert, wurden sehr hohe Expressionswerte (bis zu 15 g/l Fermentation) erreicht. Obwohl die Methode hier mit IGF-I als bevorzugtes Polypeptid beschrieben wird, kann sie auch angewandt werden zur Rekombinations-Herstellung von anderen Polypeptiden, wenn fehlgefaltete Arten (vorliegen) und die Gesamtausbeute an korrekt gefaltetem Polypeptid ziemlich gering ist.
  • Mit der beanspruchten Methode können die Stufen des mechanischen Aufbrechens der Zellen und die Isolierung und das Waschen von brechenden Körpern vermieden werden.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren ist leichter (durchzuführen) als die früher beschriebenen und ergibt eine gute Ausbeute.
  • DIE ERFINDUNG
  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung eines korrekt gefalteten biologisch aktiven Rekombinations-Proteins oder -Polypeptids, umfassend die folgenden Stufen:
    • a) Exprimieren des Proteins in prokariontischen Zellen,
    • b) Ernten der Zellen,
    • c) direktes Löslichmachen der Zellen in einem Puffer bei pH 8 bis 11 vorzugsweise 8, mit einem chaotropen Mittel und einem Reduktionsmittel und
    • d) Verdünnen mit Wasser und einem Verdünnungsmittel, bestehend aus Ethanol und gegebenenfalls Guanidin-hydrochlorid.
  • Das Protein könnte z.B. IGF-1, IGF-II oder GH sein.
  • Wenn das Protein IGF-I ist, umfaßt das Verfahren vorzugsweise die folgenden Stufen:
    • a) Exprimieren eines IGF-I-Fusionsproteins in einem prokariontischen Zellsystem, vorzugsweise E. coli,
    • b) Ernten der Zellen,
    • c) direktes Löslichmachen der Zellen in einem Puffer bei pH 8 bis 11, vorzugsweise 8, mit einem chaotropen Mittel und einem Reduktionsmittel und
    • d) Verdünnen mit Wasser und einem Verdünnungsmittel, bestehend aus Ethanol und gegebenenfalls Guanidin-hydrochlorid,
    • e) Zugabe eines Spaltungsmittels und
    • f) Reinigen zur Erzeugung des biologisch aktiven IGF-I.
  • Das IGF-I-Fusionsprotein ist vorzugsweise ein hybrides Z-IGF-I. Der Puffer in Stufe c) könnte z.B. Tris (Tris[hydroxymethyl]aminomethan-hydrochlorid) oder Glycin sein.
  • Das chaotrope Mittel in Stufe c) ist vorzugsweise Guanidin oder Harnstoff und Guanidin könnte in einer Konzentration von 3 bis 7 M, vorzugsweise 5 M, verwendet werden.
  • Das Reduktionsmittel in Stufe c) könnte z.B. DTT (DL-Dithiothreitol) oder Cystein sein und das Verdünnungsmittel in Stufe d) könnte Ethanol sein.
  • Nach Stufe d) wird der pN-Wert vorzugsweise auf unter pH 6 und insbesondere auf pH 3 oder darunter verringert.
  • Zur Herstellung von IGF-I wird der pH-Wert zwischen den Stufen d) und e) vorzugsweise auf pH 3 oder darunter verringert.
  • Eine Konzentrationsstufe und ein Pufferaustausch zwischen den Stufen d) und e), wobei vorzugsweise Chromatographie und/oder Ionenaustausch angewandt werden, wird ebenfalls beansprucht.
  • Das Spaltungsmittel in Stufe e) bei der Herstellung von IGF-1 könnte Nydroxyl amin, ein Enzym oder irgendein anderes Spaltungsmittel sein.
  • Die Reinigungsstufe zur Erzeugung des reinen Proteins oder Polypeptids umfaßt z.B. Kationenaustausch, RP-HPLC und/oder hydrophobe Wechselwirkungs-Chromatographie (HIC).
  • Wenn IGF-I als Z-IGF-I hergestellt wird, hat IGF-I eine bessere Löslichkeit, was bedeutet, daß eine höhere Konzentration an reduziertem IGF-I in Lösung vorliegen kann, was zu einer größeren Menge an richtig gefaltetem IGF-I führt, was von größter Bedeutung für eine industrielle Methode zur Erzeugung von IGF-I ist.
  • BEISPIELE
  • Das in den Versuchen verwendete menschliche Rekombinations-IGF-I (rhIGF-I) wurde in E. coli nach der in der EP 230 869 , Beispiel VIII beschriebenen Methode (aber in einem Fermenter), umfassend ein 20 h langes Wachstum bei 37°C, produziert.
  • Beispiel 1
  • Löslichmachen
  • Die Zellen wurden nach der Fermentation durch Zentrifugieren oder Kreuzstromfiltration geerntet.
  • Anschließend wurden die Zellen gelöst in:
    • 13 I Zell-Lösung, Naßgewicht 498 g/l
    • 5 mol/l Guanidin-hydrochlorid
    • 97 mmol/l Tris-Base
    • 159 mmol/l Tris-HCl
    • 2 mmol/l Ethylen-dinitro-tetraessigsäure-dinatriumsalz-dihydrat (EDTA)
    • 4 mmol/l Dithiothreitol (DDT)
    • Gesamtvolumen: 16,9 1.
  • Der pH-Wert wurde auf 8,1 gehalten, das Löslichmachen wurde 3 h unter Rühren bei 15°C durchgeführt.
  • Rückfalten
  • Die Lösung von dem Löslichmachen wurde mit 33,8 I 22,5%iger Ethanol-Lösung, Verdünnungsfaktor 3, verdünnt.
  • Der pH-Wert wurde unter Rühren bei 15°C bei 8,1 gehalten.
  • Das Rückfalten wurde nach 20 h durch Zugabe von konzentrierter Salzsäure bis der pH-Wert der Lösung <3,1 war, abgebrochen.
  • Die RP-HPLC-Analyse der Konzentration an Z-IGF-1 in der Rückfaltungslösung ergab 3,249 g korrekt gefaltetes Z-IGF-I/I.
  • Beispiel 2
  • Löslichmachen
  • Die Zellen wurden nach der Fermentation durch Zentrifugieren oder Kreuzstromfiltration geerntet.
  • Anschließend wurden die Zellen gelöst in:
    • 154 ml Zell-Lösung, Naßgewicht 450 g/l
    • 4,5 mol/l Guanidin-hydrochlorid
    • 400 mmol/l L-Glycin
    • 0,2% Tween 20
    • 2 mmol/l Ethylen-dinitro-tetraessigsäure-dinatriumsalz-dihydrat (EDTA)
    • 3 mmol/l Dithiothreitol (DDT)
    • Gesamtvolumen: 200 ml.
  • Der pH-Wert wurde auf 10,0 gehalten, das Löslichmachen wurde 3 h unter Rühren bei Raumtemperatur durchgeführt.
  • Rückfalten
  • Die Lösung von dem Löslichmachen wurde mit 125 ml Ethanol-Lösung, 400 ml Wasser, 66,8 g Guanidin-hydrochlorid, Verdünnungsfaktor 4, verdünnt.
  • Der pH-Wert wurde unter Rühren bei Raumtemperatur bei 10,0 gehalten.
  • Das Rückfalten wurde nach 20 h durch Zugabe von konzentrierter Salzsäure bis der pH-Wert der Lösung <3,1 war, abgebrochen.
  • Die RP-HPLC-Analyse der Konzentration an Z-IGF-I in der Rückfaltungslösung ergab 1,38 g korrekt gefaltetes Z-IGF-I/I.
  • Beispiel 3
  • Löslichmachen
  • Die Zellen wurden nach der Fermentation durch Zentrifugieren oder Kreuzstromfiltration geerntet.
    • Anschließend wurden die Zellen gelöst in:
    • 900 ml Zell-Lösung, Naßgewicht 720 g/l
    • 6 mol/l Guanidin-hydrochlorid
    • 97 mmol/l Tris-Base
    • 159 mmol/l Tris-HCI
    • 2 mmol/l Ethylen-dinitro-tetraessigsäure-dinatriumsalz-dihydrat (EDTA)
    • 3 mmol/l Dithiothreitol (DDT)
    • Gesamtvolumen: 1,17 l.
  • Der pN-Wert wurde auf 8,0 gehalten, das Löslichmachen wurde 3 h unter Rühren bei 15°C durchgeführt.
  • Rückfalten
  • Die Lösung von dem Löslichmachen wurde mit 547 ml Ethanol, 1786 ml Wasser, Verdünnungsfaktor 3, verdünnt.
  • Gesamtvolumen: 3,6 1.
  • Der pH-Wert wurde unter Rühren bei 15°C bei 8,1 gehalten.
  • Das Rückfalten wurde nach 21 h durch Zugabe von konzentrierter Salzsäure bis der pH-Wert der Lösung <3,1 war, abgebrochen.
  • Die RP-HPLC-Analyse der Konzentration ergab 1,32 g korrekt gefaltetes Z-IGF-I/I.
  • Ausbeute
    • Solubilisierung: 74% (des ZIGF-I aus dem Fermenter)
    • Gesamt: Löslichmachen und Rückfalten: 41 %.
  • Es wurde gezeigt, daß endgültig gereinigtes IGF-I biologische Aktivität z.B. in dem Oberschenkel von Kückenembryos und RRA (Radio-Rezeptor-Assay) besaß.
  • Beispiel 4, Erste Reinigungsstufe
  • Eine Lösung aus der Rückfaltungsstufe wurde mit WFI (Wasser zur Injektion), Verdünnungsfaktor 3, verdünnt und auf einer Kreuzstrommembran geklärt, bevor sie auf einen Kationenaustauscher (Pharmacia Biotech BPG 200/500, SP-Sepharose FF, 9,5 l, Betthöhe 0,33 m) aufgebracht wurde.
  • Es wurden die folgenden Puffer verwendet:
  • Figure 00080001
  • Die Säule wurde mit 1 Säulenvolumen (CV) WFI gewaschen, die Säule wurde mit 3 CV Äquilibrierungspuffer behandelt und die Probe wurde dann auf die Säule aufgebracht.
  • Die Säule wurde zunächst mit 3 CV Waschpuffer 1 und anschließend mit 4 CV Waschpuffer 2 gewaschen.
  • Das Produkt wurde mit 5 CV Eluierpuffer eluiert und die Säule mit 2 CV Regenerierpuffer und 2 CV Hygienepuffer behandelt.
  • Entsprechend der RP-HPLC-Analyse betrug die Ausbeute über die Reinigungsstufe 98% korrekt gefaltetes IGF-I.
  • Beispiel 5, Spaltungsstufe
  • Nach der ersten Reinigungsstufe auf einer Säule mit einem Kationenaustauscherharz wurde die Abspaltung von Z von IGF-I durchgeführt.
  • In ein Gefäß wurden 40,0 l aus dem Kationenaustauscherpool, 1428 g Natriumdiphosphat und 4,0 l Hydroxylamin, 50%ige Lösung, gegeben.
  • Der pH-Wert wurde (mit NaOH) auf 9,55 eingestellt und die Temperatur wurde auf 40°C gehalten.
  • Nach 3 h wurde die Reaktion durch Herabsetzen der Temperatur auf 25°C und Zugeben von 40,0 l konzentrierter Essigsäure (HAc) und 160 l WFI abgebrochen.
  • Der pH-Wert wurde auf 3,30 eingestellt.
  • Entsprechend der RP-HPLC-Analyse betrug die Ausbeute über diese Stufe 84% korrekt gefaltetes nicht oxidiertes IGF-I.
  • Beispiel 6, Spaltungsstufe
  • Nach der ersten Reinigungsstufe auf einer Säule mit einem Kationenaustauscherharz wurde die Abspaltung von Z von IGF-I durchgeführt.
  • In ein Gefäß wurden 18,6 l aus dem Kationenaustauscherpool, 664 g Natriumdiphosphat und 2,17 l Hydroxylamin, 50%ige Lösung, gegeben.
  • Der pH-Wert wurde (mit HAc) auf 9,5 eingestellt und die Temperatur wurde auf 40°C gehalten.
  • Nach 3 h wurde die Reaktion durch Herabsetzen der Temperatur auf 25°C und Zugeben von 22,3 l konzentrierter HAc und 93 l WFI abgebrochen.
  • Der pH-Wert wurde auf 3,35 eingestellt.
  • Entsprechend der RP-HPLC-Analyse betrug die Ausbeute über diese Stufe 61 korrekt gefaltetes nicht oxidiertes IGF-I.

Claims (16)

  1. Verfahren zur Erzeugung eines korrekt gefalteten biologisch aktiven Rekombinations-Proteins oder -Polypeptids, umfassend die folgenden Stufen: a) Exprimieren des Proteins oder Polypeptids in prokariontischen Zellen, b) Ernten der Zellen, c) direktes Löslichmachen der Zellen in einem Puffer bei pH 8 bis 11 mit einem chaotropen Mittel und einem Reduktionsmittel und d) Verdünnen mit Wasser und einem Verdünnungsmittel, bestehend aus Ethanol und gegebenenfalls Guanidin-hydrochlorid.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Protein IGF-I, IGF-II oder GH ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Protein IGF-I ist und das die folgenden Stufen umfaßt: a) Exprimieren eines IGF-I-Fusionsproteins in einem prokariontischen Zellsytem, vorzugsweise E. coli, b) Ernten der Zellen, c) direktes Löslichmachen der Zellen in einem Puffer bei pH 8 bis 11 mit einem chaotropen Mittel und einem Reduktionsmittel und d) Verdünnen mit Wasser und einem Verdünnungsmittel, bestehend aus Ethanol und gegebenenfalls Guanidin-hydrochlorid, e) Zugabe eines Spaltungsmittels und f) Reinigen zur Erzeugung des biologisch aktiven IGF-I.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 , wobei das IGF-I-Fusionsprotein hybrides Z-IGF-I ist.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Puffer in Stufe c) Tris oder Glycin ist.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der pH-Wert in Stufe c) 8 ist.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das chaotrope Mittel in Stufe c) Guanidin oder Harnstoff ist.
  8. Verwendung nach Anspruch 7, wobei Guanidin in einer Konzentration von 3 bis 7 M verwendet wird.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Reduktionsmittel in Stufe c) DTT oder Cystein ist.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Verdünnungsmittel in Stufe d) Ethanol ist.
  11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei der pH-Wert nach Stufe d) verringert wird, vorzugsweise unter pH 6, insbesondere auf pH 3 oder darunter.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei der pH-Wert zwischen den Stufen d) und e) auf pH 3 oder darunter verringert wird.
  13. Verfahren nach Anspruch 3, wobei zwischen den Stufen d) und e) eine Konzentrations-Stufe und, ein Puffer-Austausch durchgeführt werden.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei Chromatographie und/oder Ionenaustausch angewandt werden.
  15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei das Spaltungsmittel in Stufe e) Hydroxylamin ist.
  16. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Reinigungs-Stufe f) einen Kationenaustausch, RP-HPLC und/oder hydrophobe Wechselwirkungs-Chromatographie (HIC) umfaßt.
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