DE3586773T2

DE3586773T2 - Verfahren zur beseitigung von n-endaminosaeureresten aus eukaryotpolypeptidanlagen und so erzeugte polypeptide.

Info

Publication number: DE3586773T2
Application number: DE8585904198T
Authority: DE
Inventors: Meir Daniela Ben; Shmaryahu Blumberg
Original assignee: Savient Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Savient Pharmaceuticals Inc (ndgesd Staates
Priority date: 1984-08-16
Filing date: 1985-08-09
Publication date: 1993-03-18
Anticipated expiration: 2005-08-10
Also published as: IL76107A; JPH0822240B2; EP0191827B1; DE3586773D1; ATE81673T1; EP0489711B1; IL76107A0; EP0489711A3; DE3588249D1; DE3588249T2; LU91064I2; AU4773985A; CA1318869C; DE122004000009I2; HK143096A; AU591464B2; DE122004000009I1; ATE251217T1; ZA856194B; EP0191827A4

Description

Hintergrund der Erfindung

Die DNA-Rekombinationstechnologie erlaubt die Herstellung im großen Maßstab von eukaryotischen Proteinen in Bakterien. Die so hergestellten Proteine zeichnen sich jedoch häufig durch die Anfügung eines zusätzlichen Methioninrestes an ihrem N-Terminus aus. Dies kommt daher, weil die Translation stets an dem AUG-Codon beginnt, das für Methionin codiert. In Procaryoten wird das N-terminale Methionin häufig enzymatisch entfernt. Für viele eukaryotische, in Bakterien produzierte Proteine scheint dies jedoch nicht der Fall zu sein. Möglicherweise liegt dies daran, daß die Proteine stark überproduziert werden und so die bakteriellen Prozessierungs-Fähigkeiten überfordern. Eine weitere mögliche Erklärung ist die, daß die bakteriellen Prozessierungs-Enzyme die fremden, eukaryotischen Proteine nicht als ihre Substrate erkennen.
In Eukaryoten fehlt es reifen Proteinen häufig an N-terminalem Methionin, da sie sich einer starken Prozessierung durch Endopeptidasen und Exopeptidasen während des Transportes von der Synthesestelle zu ihrer letztlichen Lokalisierung unterziehen müssen.
Da das Vorliegen eines N-terminalen Methionins bei eukaryotischen Proteinen eine Immunreaktion nach Verabreichung an Eukaryoten verursachen kann, wäre es wünschenswert, eukaryotische, in Bakterien produzierte Proteine zur Entfernung des N-terminalen Methionins zu prozessieren, wodurch das reife eukaryotische Protein hergestellt würde. Die meisten verfügbaren Aminopeptidasen sind Zink-Metallenzyme.
Sie sind aus mehreren Untereinheiten zusammengesetzt und haben große Molekulargewichte (vgl. als Überblick, Delange und Smith, The Enzymes, 3. Ausgabe, Herausgeber Boyer, P.D., 3. Bd. (1971), 81-118). So haben Leucin-Aminopeptidasen von Schweineniere und Rinderlinse Molekulargewichte von 255000 bzw. 320000. Obwohl die exakte Rolle dieser Enzyme nicht bekannt ist, ist es wahrscheinlich, daß Enzyme mit solch hohen Molekulargewichten vorwiegend auf Peptide wirken. Vorliegend wird gezeigt, daß eine solche Leucin-Aminopeptidase unfähig ist, das N-terminale Methionin von humanem Methionyl-Wachstumshormon (Met-hGH) selektiv zu entfernen. Einige Säugetier-Gehirn-Aminopeptidasen, die auf Peptide niedrigen Molekulargewichts wirken können, sind entweder Membran-gebundene oder lösliche Enzyme, wobei letztere Molekulargewichte von etwa 100000 aufweisen. Diese Enzyme enthalten oft 5H-Gruppen zusätzlich zu dem essentiellen Metallatom und sie sind sehr instabil. Alle diese Enzyme scheinen einen eher kleinen praktischen Wert zu haben, Methionyl-Polypeptid-Derivate zu reifen Polypeptiden zu prozessieren.
Aeromonas-Aminopeptidase wurde durch Prescott und Wilkes /Methods in Enzymology 46 (1976), 530-543/ und Wilkes et al., /Eur. J. Biochem. 34 (1973), 459-466/ gereinigt und charakterisiert. Obgleich es scheint, daß sie die Freisetzung von Aminosäuren vom N-Terminus mehrerer Polypeptide und Proteine zeigen, wird die Abspaltung von N-terminalem Methionin von Proteinen nicht gezeigt. Die Abspaltung von N-terminalem Methionin wird für ein Oligopeptid von 11 Resten gezeigt, viele andere Reste werden jedoch zusätzlich zu dem Methionin auch entfernt. Darüber hinaus wird keine Aktivität für das Enzym auf nicht-denaturierte Hormone eines Molekulargewichts größer als 10000 gezeigt. Auch gibt es keinen Hinweis darauf, ob die von Wilkes und Prescott durchgeführten Reaktionen quantitativ sind. Während die Arbeit auch auf mehrere "Stoppsignale" für die Aminopeptidase hinweist, wird nicht angegeben, daß die Stoppsignale Asp oder X-Pro, wo X jegliche Aminosäure außer Prolin ist, auch Stoppsignale sind, wenn das Enzym mit Proteinen reagiert. Darüber hinaus weisen erste Ergebnisse darauf hin, daß nicht alle Proteine für einen Angriff von Aeromonas proteolytica-Aminopeptidase empfänglich sind. Es scheint, daß reife eukaryotische Proteine in einer Konformation "verschlossen" sind derart, daß der N-Terminus für die Aminopeptidase nicht zugänglich ist. Die Methionyl-Form des eukaryotischen Proteins hat jedoch ein Methionin, das für die Entfernung durch die Aminopeptidase zugänglich ist. Ähnlich werden eukaryotische Protein-Derivate, die mehrere zusätzliche Aminosäuren an ihrem N-Terminus haben, für die Entfernung durch das gleiche Enzym zugänglich sein. Vorliegend wurde gefunden, daß Aeromonas-Aminopeptidase in der Lage ist, das N-terminale Methionin von humanem Met-Wachstumshormon (Met-hGH) und von Rinder-Methionin-Asp-Gln- Wachstumshormon (Met-Asp-Gln-bGH) zu entfernen. Vorliegend wurde auch gezeigt, daß Aeromonas-Aminopeptidase in der Lage ist, das N-terminale Methionin und sein benachbartes Leucin von Met-Leu-hGH zu entfernen. Die Reaktion ist quantitativ und es tritt kein weiterer Abbau der Proteine ein.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur sequentiellen Entfernung eines oder mehrerer Aminosäure-Rest(e)s vom N-Terminus eines Polypeptid-Analogons eines natürlich vorkommenden eukaryotischen Polypeptids zur Gewinnung eines Polypeptids mit der biologischen Aktivität des natürlich vorkommenden Polypeptids durch Inkontaktbringen des Polypeptid-Analogons mit einer Aeromonas-Aminopeptidase unter Bedingungen, die die sequentielle Entfernung des einen bzw.
der mehreren Aminosäure-Rest(e)s vom N-Terminus des Polypeptid-Analogons gestatten, wobei das Polypeptid- Analogon
(a) in einem mikrobiellen Wirt synthetisiert wurde,
(b) eine Aminosäuresequenz aufweist, die sich von der Aminosäuresequenz des natürlich vorkommenden eukaryotischen Polypeptids durch Deletion oder Addition einer oder mehrerer Aminosäure(n) am N-Terminus des natürlich vorkommenden Polypeptids unterscheidet, und
(c) einen Aminosäure-Rest oder eine Sequenz von Aminosäure-Resten mit der Fähigkeit zum Stoppen der Wirkung der Aeromonas-Aminopeptidase enthält.
In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist der fremde Wirt, in dem die eukaryotischen Polypeptid-Analoga produziert werden, ein Bakterium.
Das verwendete Aeromonas-Aminopeptidaseenzym ist vorzugsweise stabil bei einer Temperatur bis etwa 65ºC und stabil und aktiv bei neutralem pH, nämlich bei etwa 7,0 und bei einem alkalischen pH, nämlich von etwa pH 8,0 bis etwa pH 10,0. Die Aminopeptidase hat vorzugsweise ein Molekulargewicht von weniger als etwa 100000 und ist bakteriellen Ursprungs. Das Enzym kann eine extrazelluläre Aminopeptidase sein. In speziellen Ausführungsformen kann eine Aminopeptidase verwendet werden, die in Wasser unlöslich ist. Die Aminopeptidase kann auch verwendet werden, während sie an einen festen Träger gebunden ist, oder am Ende der Reaktion unter Verwendung eines Affinitätsharzes entfernt werden.
Das eukaryotische Polypeptid-Analogon kann ein Protein oder irgendein anderes Peptidmolekül, wie Apolipoprotein E, Interferon, insbesondere gamma-Interferon, oder Somatomedin, insbesondere Somatomedin C, sein. Das Polypeptid kann auch ein Hormon, Lymphokin, Wachstumsfaktor oder ein Derivat davon sein.
Der N-terminale Aminosäure-Rest kann jegliche Aminosäure sein. In speziellen Ausführungsformen der Erfindung ist der N-terminale Aminosäure-Rest Methionin oder Methionin gefolgt von Leucin. Der N-terminale Aminosäure-Rest oder eine Sequenz von Aminosäure-Resten ist an das N-terminale Ende eines Aminosäure-Restes oder einer Sequenz von Resten gebunden, die als Stoppsignal fungieren und die Wirkung der Aminopeptidase stoppen. In der Ausführungsform, in der Aeromonas-Aminopeptidase verwendet wird, kann das Aminosäure-Stoppsignal ein Asparaginsäure-Rest, ein Glutaminsäure-Rest oder eine Sequenz von Resten sein, die einen anderen Rest als Prolin gebunden an das N-terminale Ende eines Prolin-Restes umfassen. In einer speziellen Ausführungsform umfaßt das Aminosäure-Stoppsignal einen Phenylalanin-Rest gebunden an das N-terminale Ende eines Prolin-Restes.
Eine spezielle Ausführungsform der Erfindung umfaßt die Entfernung von N-terminalen Methionin-Resten von in Bakterien hergestellten Wachstumshormon-Analoga oder Derivaten davon. N-terminale Methionin-Reste werden von Met-hGH, Met-Asp-Gln-bGH, Met-bGH und Met-pGH durch Inkontaktbringen dieser Wachstumshormon-Analoga mit einer Aminopeptidase unter geeigneten Bedingungen entfernt, die die Entfernung des N-terminalen Methionin-Rests erlauben.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung umfaßt die Entfernung von Methionin- und Leucin-Resten von den N-terminalen Enden von durch Bakterien hergestellten Wachstumshormon-Analoga oder Derivaten davon. Ein N-terminaler Methionin-Rest und sein benachbarter Leucin-Rest werden von Met-Leu-hGH entfernt, indem dieses Wachstumshormon-Analogon mit einer Aminopeptidase unter geeigneten, die Entfernung der zwei Reste erlaubenden Bedingungen in Kontakt gebracht wird.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Anfügung von N-terminalen Aminosäure-Resten an ein Polypeptid-Molekül, bei dem das Polypeptid-Molekül mit einer Aminopeptidase und einem ausreichenden Überschuß der freien, anzufügenden N-terminalen Aminosäure unter geeigneten, die Anfügung der Aminosäure an den N-Terminus des Polypeptids erlaubenden Bedingungen in Kontakt gebracht wird. Aeromonas-Aminopeptidase ist die bevorzugte Aminopeptidase für die Verwendung in der erfindungsgemäßen Ausführungsform.
In speziellen Ausführungsformen der Erfindung kann die Aeromonas-Aminopeptidase durch Metallsubstitutionen des Coenzyms hyperaktiviert sein. In bevorzugten Ausführungsformen wird Zink(II) teilweise durch Kupfer(II) und Zink(II) teilweise durch Ni(II) ersetzt.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Analoga eukaryotischer Polypeptid-Moleküle, bei dem ein erstes Analogon in Bakterien durch Expression eines das Analogon des eukaryotischen Polypeptids codierenden Gens hergestellt, der N-terminale Methionin-Rest und sein benachbarter Aminosäure-Rest durch die erfindungsgemäßen Verfahren mit einer Aeromonas-Aminopeptidase entfernt und das erhaltene Analogon gesammelt werden. Das Sammeln des Analogons kann optimiert werden, indem der N-terminale Methionin-Rest und der benachbarte Aminosäure- Rest, die durch die Aminopeptidase abgespalten werden, unter Verwendung einer Ultrafiltration oder Dialyse entfernt werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt den Zeitverlauf der Freisetzung des N-terminalen Methionins von Met-hGH durch Aeromonas proteolytica-Aminopeptidase, wie in Beispiel 1 beschrieben. Zum Vergleich ist auch die Freisetzung von Leucin gezeigt.
Fig. 2 zeigt den Zeitverlauf der Freisetzung des N-terminalen Methionis von Met-Asp-Gln-bGH durch Aeromonas proteolytica-Aminopeptidase, wie in Beispiel 2 beschrieben. Zum Vergleich ist auch die Freisetzung von Leucin gezeigt.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur sequentiellen Entfernung eines oder mehrerer Aminosäure-Rest(e)s vom N-Terminus eines Polypeptid-Analogons eines natürlich vorkommenden eukaryotischen Polypeptids zur Gewinnung eines Polypeptids mit der biologischen Aktivität des natürlich vorkommenden Polypeptids durch Inkontaktbringen des Polypeptid-Analogons mit einer Aeromonas-Aminopeptidase unter Bedingungen, die die sequentielle Entfernung des einen bzw. der mehreren Aminosäure-Rest(e)s vom N-Terminus des Polypeptid-Analogons gestatten, wobei das Polypeptid-Analogon:
(a) in einem mikrobiellen Wirt synthetisiert wurde,
(b) eine Aminosäuresequenz aufweist, die sich von der Aminosäuresequenz des natürlich vorkommenden eukaryotischen Polypeptids durch Deletion oder Addition einer oder mehrerer Aminosäure(n) am N-Terminus des natürlich vorkommenden Polypeptids unterscheidet, und
(c) einen Aminosäure-Rest oder eine Sequenz von Aminosäure-Resten mit der Fähigkeit zum Stoppen der Wirkung der Aeromonas-Aminopeptidase enthält.
Der Aminosäure-Rest oder die Sequenz von Resten, die die Wirkung der Aminopeptidase stoppen, liegt an einer anderen Position als der N-Terminus des Polypeptid-Analogons.
Der fremde Wirt, in dem das Analogon des eukaryotischen Polypeptids synthetisiert wird, kann ein Bakterium oder jeder andere Mikroorganismus oder Organismus sein, der mittels DNA-Rekombinationstechniken in der Lage ist, ein das Analogon codierende Gen zu exprimieren und das erhaltene Polypeptid zu produzieren.
Die Aeromonas-Aminopeptidase ist vorzugsweise ein Enyzm, das bei einer Temperatur bis etwa 65ºC stabil bleibt. Die Aminopeptidase sollte auch bei einem neutralen pH von etwa 7,0 und vorzugsweise bei einem alkalischen pH von etwa 8,0 bis etwa 10,0 stabil und aktive sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung hat die Aeromonas-Aminopeptidase ein Molekulargewicht von weniger als etwa 100000 und ist bakteriellen Ursprungs. Die Aminopeptidase kann auch extrazellulär, in Wasser unlöslich oder an einen festen Träger, wie Agarose, oder an eine andere polymere Substanz gebunden sein. In speziellen Ausführungsformen der Erfindung kann ein Affinitätsharz zur Entfernung überschüssiger Aminopeptidase aus dem Reaktionsgemisch verwendet werden.
Geeignete Bedingungen, die die Entfernung des N-terminalen Aminosäure-Restes erlauben, sind dem Fachmann bekannt und umfassen eine wäßrige Lösung mit alkalischem pH von etwa 9,5 und einer Temperatur von etwa 37ºC.
Das eukaryotische Polypeptid-Analogon kann jegliches Polypeptid oder Analogon eines Polypeptids sein, wie ein Hormon, Lymphokin oder ein Wachstumsfaktor. Geeignete eukaryotische Polypeptide sind Apolipoprotein E, Interferon, insbesondere gamma-Interferon, und Somatomedin, insbesondere Somatomedin C. Spezielle Ausführungsformen der Erfindung betreffen die Entfernung von N-terminalen Aminosäuren von Analoga von eukaryotischen Wachstumshormonen, wie vom Menschen, Rind, Schwein, Huhn, oder von anderen tierischen Wachstumshormonen. In diesen Ausführungsformen wird ein N-terminales Methionin an die Analoga dieser Polypeptid- Wachstumshormone angefügt, wenn diese durch DNA-Rekombinationsverfahren in Bakterien produziert werden. Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren bereit, bei dem das N-terminale Methionin und seine benachbarte Aminosäure von Menschen-, Rinder-, Schweine- und Hühner-Wachstumshormon-Molekülen oder Analoga solcher Moleküle entfernt wird, nachdem diese in Bakterien produziert worden sind.
In speziellen Ausführungsformen der Erfindung liegt der Aminosäure-Rest oder die Sequenz von Resten, die die Wirkung der Aminopeptidase stoppen, neben dem N-terminalen Methionin. In diesem Fall entfernt die Aminopeptidase nur den N-terminalen Methionin-Rest.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung liegt der Aminosäure-Rest oder die Sequenz von Resten, die die Wirkung der Aminopeptidase stoppen, neben dem Leucin in dem Molekül Met-Leu-hGH. In diesem Fall entfernt die Aminopeptidase den N-terminalen Methionin-Rest und den Leucin-Rest.
In weiteren Ausführungsformen der Erfindung ist der Rest oder die Sequenz von Resten, die die Wirkung der Aminopeptidase stoppen, von dem N-terminalen Methionin durch ein oder mehrere Aminosäure-Reste getrennt. In dieser Ausführungsform entfernt die Aminopeptidase auch diese weiteren, dem Stoppsignal vorhergehenden Aminosäure-Reste, nachdem sie das N-terminale Methionin entfernt hat.
Im Falle der erfindungsgemäß verwendeten Aeromonas- Aminopeptidase kann der Aminosäure-Rest, der die Wirkung des Enzyms stoppt, Asparaginsäure oder Glutaminsäure sein. Zusätzlich kann eine Restsequenz, die eine andere Aminosäure als Prolin gebunden an den N-Terminus eines Prolins enthält, auch als Stoppsignal fungieren. In speziellen Ausführungsformen umfaßt dieses Stoppsignal die Aminosäure Phenylalanin gebunden an das N-terminale Ende von Prolin. Diese Phe-Pro-Sequenz ist der N-Terminus vieler natürlicher, tierischer Wachstumshormon-Moleküle. In einer speziellen Ausführungsform der Erfindung wird das N-terminale Methionin von tierischen, durch DNA-Rekombinationstechniken in Bakterien produzierten Wachstumshormon-Molekülen entfernt, die dann als Ergebnis einer solchen Produktion eine Met-Phe-Pro-Sequenz an ihrem N-Terminus haben. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden das N-terminale Methionin und sein benachbarter Leucin-Rest von tierischen, durch DNA-Rekombinationstechniken in Bakterien produzierten Wachstumshormon-Molekülen entfernt, die dann als Ergebnis einer solchen Produktion eine Met-Leu-Phe-Pro-Sequenz an ihrem N-Terminus haben.
In speziellen Ausführungsformen der Erfindung sind die eukaryotischen Polypeptide Analoga von Rinder-Wachstumshormon (bGH). Diese Analoga enthalten die Sequenzen Met-Asp-Gln oder Met-Phe als ihre N-terminale Sequenz. Das Methionin wird an den N-Terminus dieser Wachstumshormone angefügt, wenn diese durch DNA-Rekombinationstechniken in Bakterien produziert werden. Nach der Entfernung des N-terminalen Methionins durch die Aeromonas-Aminopeptidase werden Asp-Gln-bGH bzw. bGH erhalten. Das in diesem Experiment verwendete bGH war die Phenylalanin-Form von bGH, die einen Phenylalanin-Rest an ihrem N-Terminus in ihrer natürlichen Form enthält. Diese Verfahren finden aber auch Anwendung, das N-terminale Methionin von dem der Alanin- Form von bGH zu entfernen, die ein Alanin an dem N-Terminus ihrer natürlichen Form enthält, obgleich in diesem Falle der Alanin-Rest auch entfernt werden kann.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Entfernung des N-terminalen Methionin-Rests von einem eukaryotischen, durch Expression eines das Hormon codierenden Gens in Bakterien produzierten Wachstumshormon- Analogons, wie tierische und menschliche Wachstumshormon- Analoga, bei dem das Wachstumshormon-Analogon mit Aeromonas-Aminopeptidase unter geeigneten Bedingungen in Kontakt gebracht wird, die die Entfernung des N-terminalen Methionin-Rests oder des N-terminalen Methionin-Rests und seines benachbarten Leucin-Rests erlauben.
Eine spezielle Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Entfernung des N-terminalen Methionin-Rests von einem humanen, durch Expression eines das Hormon codierenden Gens in Bakterien produzierten Wachstumshormon- (hGH)-Analogons, wobei das humane Wachstumshormon-Analogon einen Methionin-Rest angefügt an den N-Terminus von authentischem, humanen Wachstumshormon aufweist, bei dem das Analogon mit Aeromonas-Aminopeptidase unter geeigneten, die Entfernung des N-terminalen Methionin-Rests erlaubenden Bedingungen in Kontakt gebracht wird.
Eine weitere spezielle Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Entfernung des N-terminalen Methionin-Rests und seines benachbarten Leucin-Rests von einem humanen, durch Expression eines das Hormon codierenden Gens in Bakterien produzierten Wachstumshormon (hGH)-Analogons, wobei das humane Wachstumshormon-Analogon einen Methionin-Rest gefolgt von einem Leucin-Rest angefügt an den N-Terminus von authentischem, humanen Wachstumshormon aufweist, bei dem das Analogon mit Aeromonas-Aminopeptidase unter geeigneten, die Entfernung des N-terminalen Methionin- Rests und seines benachbarten Leucin-Rests erlaubenden Bedingungen in Kontakt gebracht wird.
Eine weitere spezielle Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Entfernung des N-terminalen Methionin-Rests von einem Rinder, durch Expression eines das Rinder-Wachstumshormon-Analogon codierenden Gens in Bakterien produzierten Wachstumshormon-Analogon, wobei das Rinder-Wachstumshormon-Analogon einen Methionin-Rest angefügt an seinen N-Terminus hat, bei dem das Analogon mit Aeromonas-Aminopeptidase unter geeigneten, die Entfernung des N-terminalen Methionin-Rests erlaubenden Bedingungen in Kontakt gebracht wird.
Eine weitere spezielle Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Entfernung des N-terminalen Methionin-Rests von einem Interferon-Analogon, wie gamma-Interferon, das in Bakterien durch Expression eines das Interferon-Analogon codierenden Gens produziert wurde, bei dem das Interferon-Analogon mit Aeromonas-Aminopeptidase unter geeigneten, die Entfernung des N-terminalen Methionin-Rests erlaubenden Bedingungen in Kontakt gebracht wird.
Eine weitere spezielle Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Entfernung des N-terminalen Methionin-Rests von einem Somatomedin-Analogon, wie Somatomedin C, das in Bakterien durch Expression eines das Somatomedin-Analogon codierenden Gens produziert wurde, wobei das Somatomedin-Analogon einen Methionin-Rest angefügt an den N-Terminus aufweist, bei dem das Analogon mit Aeromonas-Aminopeptidase unter geeigneten, die Entfernung des N-terminalen Methionin-Rests erlaubenden Bedingungen in Kontakt gebracht wird.
Eine weitere spezielle Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Entfernung des N-terminalen Methionin-Rests von einem Apolipoprotein E-Analogon, das in Bakterien durch Expression eines das Analogon codierenden Gens produziert wurde, wobei das Analogon einen Methionin-Rest angefügt an den N-Terminus aufweist, bei dem das Analogon mit Aeromonas-Aminopeptidase unter geeigneten, die Entfernung des N-terminalen Methionin-Rests erlaubenden Bedingungen in Kontakt gebracht wird.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Anfügung eines N-terminalen Aminosäure-Rests an ein Polypeptid-Molekül, bei dem das Polypeptid-Molekül mit einer Aeromonas-Aminopeptidase und einem ausreichenden Überschuß an dem freien, anzufügenden N-terminalen Aminosäure-Rest unter geeigneten Bedingungen in Kontakt gebracht wird, die die Anfügung der Aminosäure an den N-Terminus des Polypeptids erlauben.
Aeromonas-Aminopeptidase ist bevorzugt. Die Aminopeptidase ist in der Lage, jeglichen Aminosäure-Rest an den N-Terminus des Polypeptids anzufügen, solange die Aminosäure nicht als Stoppsignal für das Enzym fungiert und sie fügt vorzugsweise eine Aminosäure an den N-Terminus an, der als Stoppsignal fungiert. Da die Aminopeptidase-Reaktion eine reversible Reaktion ist, sind die Bedingungen für die Anfügungsreaktion die gleichen wie für die Abspaltungsreaktion, außer für die Konzentration der freien, anzufügenden Aminosäure.
Die Aktivität der Aeromonas-Aminopeptidase kann durch Metallsubstitutionen erhöht werden. Die größte Zunahme der Aktivität tritt ein, indem teilweise oder gemischte Metallsubstitutionen im wesentlichen gemäß der Verfahren von Prescott, J.M. et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, Bd. 114, Nr. 2 (1983), 646-652 durchgeführt werden. Die teilweisen oder gemischten Metallsubstitutionen können Kupfer(II) für Zink(II) oder Nickel(II) für Zink(II) sein.
Die Erfindung betrifft auch durch die erfindungsgemäßen Verfahren produzierte Polypeptid-Analoga, wie Menschen-, Rinder-, Schweine- und Hühner-Wachstumshormone oder Wachstumshormon-Analoga, wie Asp-Gln-bGH.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Analogon eines eukaryotischen Polypeptids, bei dem ein erstes Analogon durch Expression eines das Analogon des eukaryotischen Polypeptids codierenden Gens in Bakterien bereitgestellt wird. Der N-terminale Methionin- Rest oder ein N-terminaler Methionin-Rest und sein benachbarter Leucin-Rest dieses Analogons werden dann durch das erfindungsgemäße Verfahren mit einer Aminopeptidase, z. B. Aeromonas-Aminopeptidase, entfernt. Das erhaltene Analogon wird dann unter Verwendung von dem Fachmann bekannter Verfahren gesammelt.
Das Sammeln des Analogons kann optimiert werden, indem die freien, von dem Polypeptid-Analogon durch die Aminopeptidase abgespaltenen N-terminalen Methionin- und Leucin-Reste entfernt werden. Die Entfernung der freien Aminosäuren treibt die Reaktion zur Vollständigkeit. Die Entfernung kann jegliches dem Fachmann bekannte Verfahren, z. B. Ultrafiltration oder Dialyse, sein. Die Erfindung betrifft auch durch erfindungsgemäße Verfahren hergestellte eukaryotische Polypeptide, wie Wachstumshormone, z. B. Menschen-, Rinder- und Schweine-Wachstumshormon.

Experimentelle Einzelheiten

Materialien und Verfahren

Met-hGH und Met-Asp-Gln-bGH wurden durch DNA-Rekombinationstechniken hergestellt. Coomassie Blue-Färbungen von Polyacrylamidgelen (15 % Gele) der Proteine, die in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat und 2-Mercaptoethanol elektrophoretisch aufgetrennt wurden, zeigen: (a) eine Hauptbande mit einem MG von etwa 22000, die dem Met-Asp-Gln-bGH entspricht und eine sehr schwache Bande mit einem etwas höheren (Charge 108-) (Bio-Technology General (Israel) Ltd.) oder etwas niedrigeren (Charge 113D) (Bio-Technology General (Israel) Ltd.) Molekulargewicht für die Met-Asp-Gln-bGH-Moleküle; (b) eine Hauptbande mit einem MG von etwa 22000 und eine sehr schwache Bande mit einem etwas kleineren MG für das Met-hGH (Charge 1/100)-Molekül (Coomassie Blue). Scanning der SDS-Gele zeigt eine 88 bis 93 % Reinheit für beide Proteine. Eine Reinheit von 95 % und größer wurde in anderen Präparationen erreicht. Keine erkennbare, kontaminierende Endopeptidase-Aktivität lag vor, wie durch Elektrophorese der Proteine in SDS-Polyacrylamidgelen nach 24-stündiger Inkubation bei 37ºC abgeschätzt.
Aeromonas-Aminopeptidase wurde aus dem extrazellulären Filtrat von Aeromonas proteolytica, erhalten von der American Type Culture Collection (ATCC 15338), nach im wesentlichen dem Verfahren von Prescott, J.M. und Wilkes, S.H., Methods and Enzymol. 46 (1976), 530-543 präpariert. Das Reinigungsverfahren umfaßte die folgenden Schritte: Sedimentation und Filtration der Bakterien, Ammoniumsulfatpräzipitation des Filtrats (367 g/l),Acetonfraktionierung (43,7 % bis 70 % Aceton), Hitzebehandlung bei 70ºC (8 Stunden) zur Zerstörung von Endopeptidase-Aktivität, Gelfiltration an Sephadex-G-75 und Ionenaustauschchromatographie an DEAE-Sephadex A-50. In allen Experimenten ersetzte ein 10 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,0 einen von Prescott und Wilkes verwendeten 10 mM Tricin-Puffer, pH 8,0. Vorequilibrierung und Eluierung aus der G-75-Säule wurden in Gegenwart von 5 uM ZnCl&sub2; durchgeführt, was in der Originalvorschrift verwendet wurde. Die Reinigung an der DEAE-Sephadex A-50-Säule wurde durchgeführt, indem die Säule mit 5 uM Zn Cl&sub2; enthaltendem 0,1M NaCl in 10 mM Tris-CHl, pH 8,0 vorequilibriert, die Probe aufgetragen und eine Gradienten-Eluierung mit 0,6M NaCl in dem gleichen Puffer (enthaltend 5 uM ZnCl&sub2;) durchgeführt wurden. Nachdem die Salzkonzentration auf etwa 0,5M zugenommen hatte, wurde die Säule mit 0,7M NaCl in dem gleichen Puffer eluiert. Der aus der Säule eluierte Hauptpeak wurde gesammelt und gegen 5 uM ZnCl&sub2; enthaltendes 10 mM Tris-HCl, 0,1M NaCl, pH 8,0 dialysiert und dann bei -20ºC eingefroren gehalten.
Vor der Reaktion mit den Wachstumshormonen wurde die Enzymlösung 2 Stunden bei 70ºC inkubiert, um alle möglichen Spuren von Endopeptidase-Aktivität zu inaktivieren, die in der Präparation erhalten geblieben und nach langer Lagerung reaktiviert sein könnten. Für Experimente in großem Maßstab wurde das Enzym 3 Stunden vor der Reaktion mit dem Hormon bei 70ºC inkubiert.
Eine Aminosäure-Analyse wurde auf einem Dionex D-502 Aminosäure-Analysator durchgeführt. Eine Aminosäuresequenz- Analyse wurde mit einem Applied Biosystems Gas Phase Sequencer, gefolgt von einer HPLC der PTH-Aminosäuren durchgeführt.

Beispiel I

Zeitabhängigkeit der Freisetzung von freiem Methionin von Met-hGH durch Aeromonas-Aminopeptidase

Vor der Reaktion mit Met-hGH wurde eine Probe der von der DEAE-Sephadex A-50 Säule eluierten Aminopeptidase (0,63 mg/ml in 10 mM Tris-HCl, 0,1M NaCl, pH 8,0) 2 Stunden bei 70ºC inkubiert, um Spuren von Endopeptidase-Aktivität zu inaktivieren. Das Enzym wurde dann 3 : 1 mit 2M Tris-HCl, pH 9,5 auf eine Endkonzentration von 0,4725 mg/ml Enzym verdünnt.
Met-hGH wurde auf 8 mg/ml (Gewicht) in 10 mM NA Borat, pH 9,5 gelöst.
900 ul Met-hGH Lösung und 19 ul der Aminopeptidase-Lösung wurden gemischt und bei 37ºC inkubiert. 50 ul Aliquote wurden nach 2 Minuten, 5 Minuten, 10 Minuten, 15 Minuten, 30 Minuten, 60 Minuten, 2 Stunden, 4 Stunden und 22 Stunden entnommen und präzipitiert, indem ein gleiches Volumen von einer 3 % Sulfosalicylsäure-Lösung in Wasser zugegeben wurde, die Aliquote bei 37ºC 15 Minuten inkubiert und dann in einer Eppendorf-Tischzentrifuge zentrifugiert wurden. 50 ul Proben des Überstandes wurden für eine direkte Aminosäure-Analyse (ohne Säurehydrolyse) entnommen. Kontrollexperimente wurden gefahren, indem eine Met-hGH-Lösung (8 mg/ml) alleine, direkt nach Lösung bei Zeit t&sub0; oder nach 4-stündiger und 22-stündiger Inkubation bei 37ºC präzipitiert wurde. Ebenfalls wurden für alle Kontrollen 50 ul einer Hormonlösung mit einem gleichen Volumen von 3 % Sulfosalicylsäure präzipitiert und 50 ul des Überstandes für eine Aminosäure-Analyse entnommen. Unter Annahme eines Molekulargewichts von etwa 21800 und daß 85 % dieses Materials ein Hormon sind (5%-10 % Wasser, 90%-95 % Hormonreinheit), entspricht jede Analyse einer 7,63 nMol eines Met-hGH Ausgangsmaterials. Die Mengen von Methionin und mehreren anderen durch das Enzym freigesetzten Aminosäuren sind in Tabelle 1 aufgelistet.
Die Freisetzung von Methionin und jene von Leucin sind als Funktion der Zeit in Fig. 1 dargestellt. Die N-terminale Sequenz von Met-hGH ist in Tabelle IV gezeigt. Eine Polyacrylamidgel-Elektrophorese der Produkte weist auf keinen erkennbaren Abbau des hGH hin. Tabelle I Analyse von Methionin und einiger anderer von Met-hGH durch Verdauung mit Aeromonas-Aminopeptidase freigesetzter Aminosäuren (nMol pro 50 ul Probe) weniger als * Höchstwahrscheinlich eine Kontamination der Analysenproben Neutrale Proteasekontaminanten von Aminopeptidasen spalten bevorzugt interne Peptidbindungen auf der Aminoseite von hydrophoben Aminosäuren. Dies zeigen beispielsweise Leu- und Ile-Reste, die dann durch die Aminopeptidasen freigesetzt werden. Die Freisetzung anderer, nicht aufgeführter Aminosäuren ist auch unbedeutend.

Beispiel II

Zeitabhängigkeit der Freisetzung von freiem Methionin von Met-Asp-Gln-bGH durch Aeromonas-Aminopeptidase

Vor der Reaktion mit Met-Asp-Gln-bGH wurde eine von der DEAE-Sephadex A-50 Säule eluierte Probe der Aminopeptidase bei 70ºC erhitzt und wie in Beispiel I beschrieben verdünnt.
Met-Asp-Gln-bGH wurde auf 8 mg/ml (Gewicht) in 10mM Na Borat, pH 9,5 gelöst.
750 ul einer Met-Asp-Gln-bGH Lösung und 32 ul der Aminopeptidase-lösung wurden gemischt und bei 37ºC inkubiert. 50 ul Aliquote wurden nach 5 Minuten, 10 Minuten, 15 Minuten, 30 Minuten, 60 Minuten, 2 Stunden, 4 Stunden und 22 Stunden entnommen und präzipitiert, indem ein gleiches Volumen einer 3% Sulfosalicylsäure-Lösung in Wasser zugegeben, die Aliquote bei 37ºC 15 Minuten inkubiert und in einer Eppendorf-Tischzentrifuge zentrifugiert wurden. Erneut wurden 50 ul Proben für eine Aminosäure-Analyse entnommen. Kontrollexperimente wurden gefahren, indem eine Met-Asp-Gln-bGH Lösung (8 mg/ml) allein direkt nach Lösung bei t&sub0; oder nach einer 22 stündigen Inkubation bei 37ºC inkubiert wurde. Die Proteinpräzipitation und die Aminosäure-Analyse des Überstandes wurden wie in Beispiel I beschrieben durchgeführt. Unter Annahme eines Molekulargewichts von etwa 22000 und daß 85% dieses Materials ein Hormon (5-10% Wasser, 90-95% Hormonreinheit) sind, entspricht jede Analyse 7,41 nMol Met-Asp-Gln-bGH Ausgangsmaterial. Die Mengen von Methionin und mehreren anderen freigesetzten Aminosäuren sind in Tabelle II aufgelistet.
Die Freisetzung von freiem Methionin wie auch jene von Leucin sind als Funktion der Zeit in Fig. 2 dargestellt.
Die N-Terminussequenz Met-Asp-Gln-bGH ist in Tabelle IV gezeigt. Eine Polyacrylamidgel-Elektrophorese weist auf keinen erkennbaren Abbau des bGH Analogons hin. Tabelle II Analyse von Methionin und einiger anderer von Met-Asp-Gln-bGH durch Verdauung mit Aeromonas-Aminopeptidase freigesetzter Aminosäuren (nMol pro 50 ul Probe) weniger als Neutrale Proteasekontaminanten von Aminopeptidasen spalten bevorzugt interne Peptidbindungen auf der Aminoseite von hydrophoben Aminosäuren. Dies zeigen beispielsweise Leu- und Ile-Reste, die dann durch die Aminopeptidasen freigesetzt werden. Die Freisetzung anderer, nicht aufgeführter Aminosäuren ist auch unbedeutend.

Beispiel III

Vergleich von Aeromonas-Aminopeptidase und Leucin-Aminopeptidase (microsomal von Schweineniere, Sigma L5006)

Aeromonas-Aminopeptidase (0,63 mg/ml in 10 mM Tris-HCl, 0,1M NaCl, pH 8,0) wurde 2 Stunden bei 70ºC zur Inaktivierung von Spuren von Endopeptidase-Aktivität inkubiert. Das Enzym wurde dann 3 : 1 mit 2M Tris-HCl, pH 9,5 auf eine Endkonzentration von 0,4725 mg/ml verdünnt.
100 ul Leucin-Aminopeptidase (Schweineniere, microsomal, Sigma L5006) (1 mg/ml Suspension in 3,5M (NH&sub4;)&sub2; SO&sub4;, 10 mM MgCl&sub2;, pH 7,7) wurden mit 25 ul 0,5M Tris HCl, pH 9,5, 150 ul H&sub2;O und 25 ul 0,025M MnCl&sub2; gemischt und das Gemisch wurde 2 Stunden bei 37ºC inkubiert.
Met-hGH wurde auf 11 mg/ml in 10 mM NaBorat, pH 9,5 gelöst.
(1) 290 ul Met-hGH-Lösung (11 mg/ml + 110 ul 10 mM NaBorat, pH 9,6) +17 ul Aeromonas-Aminopeptidase-Lösung (Enzym-Endkonzentration: 19,3 ug/ml),
oder
(2) 400 ul Met-hGH Lösung (11 mg/ml + 85 ul Leucin- Aminopeptidas, aktiviertes Enzym) + 85 ul 0,125M MgCl&sub2; (inkubierte Enzym-Endkonzentration 49,7 ug/ml),
wurden bei 37ºC inkubiert und 75 ul Aliquote wurden nach 5 Minuten, 3 Stunden und 22 Stunden entnommen und mit einem gleichen Volumen von 3% Sulfosalicylsäure präzipitiert. Nach 15 minütiger Inkubation bei 37ºC wurde das Gemisch zentrifugiert und 50 ul des Überstandes wurden für eine direkte Aminosäure-Analyse entnommen. Unter Annahme eines Molekulargewichts von etwa 21800 und daß 85% dieses Materials das Hormon sind, entspricht jede Analyse 7,46 nMol, bzw.- 7,53 nMol Met-hGH Ausgangsmaterial zur Reaktion mit dem Aeromonas-Enzym bzw. der Schweine-Leucin-Aminopeptidase.
Kontrollexperimente wurden gefahren, indem Met-hGH mit einem gleichen Volumen von 3% Sulfosalicylsäure nach Lösung oder nach 22 stündiger Inkubation bei 37ºC präzipitiert wurde. Das präzipitierte Gemisch wurde 15 Minuten bei 37ºC inkubiert, zentrifugiert und 50 ul des Überstandes wurden für eine direkte Aminosäure-Analyse entnommen. Die Ergebnisse des Experiments sind in Tabelle III angegeben. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Leucin-Aminopeptidase das N-terminale Methionin nicht entfernt und daß die kleine Menge von freigesetztem Methionin wahrscheinlich von der Freisetzung kleiner, durch Kontaminanten der Endopeptidase-Aktivität (vgl. Mengen von Ile und Leu) erzeugten Peptide herrührt. Dieser Schluß wird durch eine Polyacrylamidgel-Elektrophorese bestätigt, die einen gewissen Abbau des Hormons durch das Enzym nach 22 stündiger Inkubation bei 37ºC zeigt. Tabelle III Freisetzung von N-terminalem Methionin von Met-hGH durch Aeromonas-Aminopeptidase und durch Schweinenieren-Leucin-Aminopeptidase (microsomal) (nMol pro 50 ul Probe) weniger als Aeromonas-Aminopeptidase Leucin-Aminopeptidase Neutrale Proteasekontaminanten von Aminopeptidasen schneiden bevorzugt interne Peptidbindungen auf der Aminoseite von hydrophoben Aminosäuren. Dies zeigen beispielsweise Leu- und Ile-Reste, die dann durch die Aminopeptidasen freigesetzt werden.

Beispiel IV

Entfernung von N-terminalem Methionin von Met-Asp-Gln-bGH und Herstellung der Probe für eine Seqenz-Analyse

2,5 ml Met-Asp-Gln-bGH (8 mg/ml in 10 mM NaBorat pH 9,5) wurden mit 106 ul Enzym (0,4725 mg/ml in 0,5M Tris-HCl, pH 9,5) 22 Stunden bei 27ºC inkubiert. Zur Bestimmung der terminalen Aminosäuresequenz wurden 2 ml des Gemisches 1 : 1 mit 10 mM NaBorat, pH 9,5, verdünnt und 1 ml 15% Sulfosalicylsäure wurde zugegeben und das Gemisch 15 Minuten bei 37ºC inkubiert und durch Zentrifugation präzipitiert. Das Pellet wurde in 5 ml 3% Sulfosalicylsäure resuspendiert und erneut zentrifugiert. Das Pellet wurde in 5 ml 10 mM NaBorat, pH 10,5 suspendiert und dreimal gegen 2 Liter Wasser, das 1 ml, 0,3 ml bzw. 1 ml konzentriertes Ammoniumhydroxid enthielt, dialysiert und dann gegen Wasser dialysiert. Die Probe wurde auf 20% Essigsäure (durch Eisessig) eingestellt und für die Sequenzanalyse verwendet. Die in Tabelle IV angegebenen Daten der Sequenz-Analyse zeigen, daß mehr als 95% der Moleküle die N-terminale Sequenz Asp-Gln-Phe-Pro aufweisen. Tabelle IV N-terminale Sequenzen von Wachstumshormon-Derivaten von und nach der Entfernung von N-terminalem Methionin durch Aeromonas-Antipeptidase Wachstumshormon-Derivat N-terminale Sequenz&sup4; N-Terminus (%)&sup5; ¹ Rinder-Wachstumshormon-Analogon. ² Erhalten von Derivat (1) in Beispiel IV. ³ Erhalten von Derivat (3), wie in Beispiel V beschrieben. &sup4; Aminosäuresequenz-Analyse wurde mit einem Applied Biosystems Gas Phase Sequencer, gefolgt von einer HPLC der PTH-Aminosäuren durchgeführt. &sup5; bestimmt durch Sequenz-Analyse. &sup6; Die Methioninmenge am N-Terminus der Ausgangsprodukte wurde durch die Menge von freiem, durch die Reaktion mit der Aeromonas-Aminopeptidase freigesetzten Methionin nach Präzipitation mit Sulfosalicylsäure und der Analysierung des Überstandes durch eine Aminosäure-Analyse bestimmt. &sup7; Die am N-Terminus der Produkte vorliegende Aminosäure wurde durch eine PTH-Aminosäure-Analyse der ersten Runde der Sequenz-Analyse bestimmt.

Beispiel V

Verwendung einer Ultrafiltration oder einer Dialyse zur Reaktionsförderung

Die durch das Enzym durchgeführten Reaktionen sind reversibel. Somit wird die Entfernung eines der Produkte die Reaktion zur Vollständigkeit treiben. Wir haben dies gezeigt, in dem der freigesetzte Methionin-Rest während des Reaktionsverlaufes entfernt wurde, wodurch die Reaktion zu einer weiteren Produktion von hGH getrieben wurde. Der freigesetzte Methionin-Rest wurde durch Ultrafiltration entfernt.
12 g Met-hGH in 1500 ml 10 mM NaBorat, pH 9,5 wurden mit 12,4 ml Enzym (0,4725 mg/ml in 0,5M Tris-HCl, pH 9,5) 2 Stunden bei 37ºC inkubiert. Eine zusätzliche Menge von 6,2 ml der gleichen Enzymlösung wurde zugegeben und die Inkubation 3 1/2 Stunden bei 37ºC fortgesetzt. Die Lösung wurde für eine Ultrafiltration bereitgestellt und etwa 50 Liter 10 mM NaBorat, pH 9,5 wurden durch das Material innerhalb von 4 Stunden geleitet, wodurch freies Methionin entfernt und die enzymatische Reaktion zur Vollständigkeit getrieben wurde. Die Inkubation bei 37ºC wurde dann 12 1/2 Stunden fortgesetzt. Die Gesamtdauer der Inkubation und Ultrafiltration beträgt 22 Stunden. Das Material wurde an DEAE-Sephacel absorbiert und das Harz mit 10 mM NaBorat, pH 9,0 und dann mit 25 mM NaCl, 50 mM NaCl bzw. 75 mM NaCl enthaltendem 10 mM NaBorat, pH 9,0, gewaschen. Das Hormon wurde mit 100 mM NaCl enthaltendem 10 mM NaBorat, pH 9,0 eluiert. Das eluierte Hormon wurde konzentriert, durch Ultrafiltration dialysiert und lyophilisiert. Eine Probe wurde in 20% Essigsäure gelöst und einer Sequenz-Analyse unterzogen. Die Ergebnisse der Analyse sind in Tabelle IV angegeben. Die Ergebnisse zeigen, daß in mehr als 99% der Moleküle das N-terminale Methionin entfernt wurde und daß es keinen weiteren Abbau des Proteins gab.

Beispiel VI

Zeitabhängigkeit der Freisetzung von freiem Methionin und freiem Leucin von Met-Leu-hGH durch Aeromonas-Aminopeptidase

Vor der Reaktion mit Met-Leu-hGH wurde eine Probe der von der DEAE-Sepadex A-50 Säule eluierten Aminopeptidase bei 70ºC erhitzt und wie in Beispiel I beschrieben verdünnt.
Met-Leu-hGH wurde auf 8 mg/ml (Gewicht) in 10 mM NaBorat Puffer, pH 9,0 gelöst. Der pH wurde auf 10,6 erhöht, dann auf 8,8 gesenkt und das Gemisch wurde letztlich zentrifugiert, wodurch eine kleine Präzipitatmenge entfernt wurde. Die Überstandslösung wurde für die Reaktion verwendet.
1000 ul der Met-Leu-hGH-Lösung und 21 ul der Aeromonas-Aminopeptidase wurden gemischt und bei 37ºC inkubiert. 75 ul Aliquote wurden nach 2 Minuten, 5 Minuten, 10 Minuten, 30 Minuten, 60 Minuten, 2 Stunden und 22 Stunden entnommen und präzipitiert, indem ein gleiches Volumen einer 3% Sulfosalicylsäure-Lösung in Wasser zugegeben, die Aliquote bei 37ºC 15 Minuten inkubiert und dann in einer Eppendorf-Tischzentrifuge zentrifugiert wurden. 50 ul Proben des Überstandes wurden für eine direkte Aminosäure-Analyse (ohne Säurehydrolyse) entnommen. Kontrollexperimente wurden gefahren, indem die Met-Leu-hGH Lösung (8 mg/ml) alleine mit einem gleichen Volumen von 3% Sulfosalicylsäure zu dem Zeitpunkt t&sub0; oder nach 22-stündiger Inkubation der Met-Leu-hGH Lösung bei 37ºC präzipitiert wurde. Erneut wurden 50 ul der Überstandslösung für eine direkte Aminosäure-Analyse entnommen. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Tabelle V zusammengefaßt. Die N-terminale Sequenz von Met-hGH ist in Tabelle IV gezeigt. Eine Polyacrylamidgel-Elektrophorese der Produkte weist auf keinen erkennbaren Abbau des hGH hin. Tabelle V Analyse von Methionin und Leucin wie auch von einigen anderen von Met-Leu-hGH durch Verdauung mit Aeromonas-Aminopeptidase freigesetzten Aminosäuren (nMol pro 50 ul Probe) weniger als * Höchst wahrscheinlich ein Pipetierfehler. Die Freisetzung anderer, nicht aufgelisteter Aminosäuren ist auch unbedeutend.

Beispiel VII

Entfernung von Met von einer käuflichen Preparation von Met-gamma-Interferon

30 ul gamma-Interferon (Amgen; Interferon-gamma-4A; ARN 3010, Charge 1) mit der authentischen Sequenz des Lymphokins und einer spezifischen Aktivität von 1-5·10&sup7; Einheiten/mg wurden einer Mikrosequenz-Analyse unterzogen. Eine Analyse der ersten drei Aminosäuren ergab, daß das Material Met-gamma-Interferon mit der N-terminalen Sequenz Met-Gln-Asp (mit einer kleinen in der dritten Runde gefundenen Spur von Arg) enthält.
Dieses gamma-Interferon-Derivat setzte unter der Wirkung der Aeromonas-Aminopeptidase ein freies Methionin frei, wie durch eine Aminosäure-Analyse unter Verwendung eines besonders sensitiven Aminosäure-Analysators mit picomol Sensitivität und Ortho-Phthalaldehyd-Nachsäurederivatisierung bestimmt. Es wird darauf hingewiesen, daß alle anderen Aminosäure-Analysen in der Anmeldung bei nanomol-Sensitivitäten unter Verwendung eines Dionex D-502 Aminosäure-Analysators durchgeführt wurden. Alle Sequenz-Analysen wurden auf einem Applied Biosystems Model 470A Proteinsequenz-Analysator, gefolgt von einer HPLC der PTH-Aminosäuren durchgeführt. Das Verfahren zur Methionin- Entfernung ist wie folgt:

Methionyl-gamma-Interferon:

Interferon-gamma4A ARN 3010, Charge 1, 107 Einheiten/ml (1-5·10&sup7; Einheiten/ml) in 0,04M Tris-HCl, pH 7,0.

Aeromonas-Aminopeptidase:

(Charge 2), 0,5 mg/ml in 0,1M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 5 uM ZnCl&sub2;, pH 8,0 wurde zwei Stunden bei 70ºC vor Verwendung erhitzt. Es wurde dann 1 : 9 mit 0,1M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 5 uM ZnSO&sub4;, pH 8,0 auf 0,05 mg/ml Enzym verdünnt.

Durchführung:

12 ul der gamma-Interferon Lösung und 3 ul der Enzymlösung (0,05 mg/l) wurden 35 Minuten bei 37ºC inkubiert und das Gemisch wurde auf Eis abgekühlt. Nach 30 Minuten wurden 14 ul des Gemisches durch Lyophilisierung getrocknet und ohne weitere Behandlung auf eine Aminosäure- Analysensäule gegeben. Kontrollexperimente wurden gefahren, indem 12 ul des gamma-Interferons alleine und 3 ul des Enzyms alleine 35 Minuten bei 37ºC inkubiert, die Proben wie oben getrocknet und auf eine Aminosäure-Analysensäule gegeben wurden.
Die Menge von freigesetztem Methionin betrug 96 pmol und der Hintergrund anderer Aminosäuren war ziemlich normal: Asp, 15 pmol; Thr, 24 pmol; Ser, 39 pmol; Glu, 8 pmol; Gly, 53 pmol; Ala, 23 pmol; Val, 10 pmol; Leu, 8 pmol und Phe, 11 pmol. Es gab auch einen weiteren kontaminierenden Peak an der Stelle, wo die Enzymreferenz ebenfalls einen Peak zeigte. Relativ große Hintergrund-Peaks von Ser und Gly wurden auch bei der gamma-Interferon-Referenz gesehen. Unter Annahme, daß die spezifische Aktivität der Probe 5·10&sup7; Einheiten/mg ist und das Molekulargewicht für gamma-Interferon etwa 17000 beträgt, beläuft sich die Menge des freigesetzten Methionins auf 73% des theoretischen Werts. Ist die spezifische Aktivität des Materials niedriger als der oben zugesicherte Wert, kann die prozentuale Entfernung von Met niedriger sein.
Dieses Experiment zeigt, daß das N-terminale Methionin selektiv und wirksam von Met-gamma-Interferon durch Aeromonas-Aminopeptidase entfernt werden kann.

Beispiel VIII

Entfernung eines N-terminalen Met von einem Interferon

Ein rekombinantes Interferon-Analogon mit einem Met an seinem N-Terminus wurde gemäß des erfindungsgemäßen Verfahrens prozessiert. Met wurde selektiv von dem N-Terminus des Moleküls durch die Aeromonas-Aminopeptidase entfernt.

Beispiel IX

Entfernung eines N-terminalen Met von einem Somatomedin-C-Polypeptid

Ein rekombinantes Somatomedin C-Polypeptid mit einem Met an seinem N-Terminus wurde gemäß des erfindungsgemäßen Verfahrens prozessiert. Met wurde selektiv von dem N-Termius des Moleküls durch die Aeromonas-Aminopeptidase entfernt.

Beispiel X

Entfernung von Met von Schweine-Met-Wachstumshormon (PGH) und Nicht-Entfernung von N-terminalem Ala von reifer rekombinanter Cu&sub2;-Zn&sub2;-Superoxid-Dismutase

Aeromonas-Aminopeptidase (Charge 2, 0,5 mg/ml (in 0,1M NaCl, 10 mM Tris HCl, pH 8,0)) wurde 2 Stunden bei 70ºC vor Verwendung erhitzt und dann 3 : 1 mit 2M Tris HCl, pH 9,5 verdünnt.
Met-PGH (Charge 5/100) und humane Cu&sub2;Zn&sub2;-Superoxid- Dismutase (SOD, Charge 1) wurden durch Rekombinationstechniken hergestellt. Letztere hat die authentische N-terminale Sequenz des reifen Proteins, außer, daß das N-terminale Ala nicht N-acetyliert ist.

Durchführung:

Das Protein wurde auf 8 mg/ml in 10 mM NaBorat, pH 9,5 gelöst. 600 ul der Proteinlösungen wurden 34 ul der Enzymlösung zugegeben und die Gemische wurden bei 37ºC inkubiert. Proben wurden mit der Zeit entnommen und mit gleichem Volumen an 3% Sulfosalicylsäure präzipitiert und 15 Minuten bei 37ºC inkubiert und dann zentrifugiert. 50 ul der Überstandslösungen wurden für eine Aminosäure-Analyse entnommen. Kontrollexperimente wurden gefahren, indem die Proteine alleine 22 Stunden bei 37ºC inkubiert und den obigen Aminosäure-Analysen unterzogen wurden. Unter Annahme eines 85% Gehalts an diesen Proteinen und von Molekulargewichten von 22000 bzw. 16000 (pro Untereinheit) für Met-PGH bzw. Cu&sub2;Zn&sub2;-Superoxid- Dismutase, sind die theoretischen Werte von N-terminalen Resten in jeder Analyse 7,31 nMol bzw. 10,17 nMol. Die Mengen von freigesetztem Met und Ala sind in Tabelle VI gezeigt. Tabelle VI Freisetzung von Met von Met-PGH und Ala von rekombinanter, humaner Cu&sub2;-Zn&sub2; Superoxid-Dismutase durch Aeromonas- Aminopeptidase freigesetztes Met (Kontrolle) Rekombinante, humane Superoxid-Dismutase freigesetztes Ala
Unter gleichen Bedingungen war die Freisetzung von Met von Met-hGH innerhalb von 3 Stunden im wesentlichen quantitativ.
Für die nicht-stöchiometrische Entfernung von Met von Met-PGH (im Vergleich zu der stöchiometrischen Entfernung von Met von Met-hGH) könnte es mehrere Gründe geben. Eine Erklärung könnte sein, daß die Moleküle als nicht-kovalent assoziierte Dimere vorliegen und daß das N-terminale Methionin von nur einem der Moleküle in dem Dimer für den Enzymangriff zugänglich ist, während das N-terminale Methionin des anderen Moleküls in dem Dimer sterisch gehindert ist. Aus diesem Grund wurden nur etwa 50% bis 60% der N-terminalen Methionin-Reste entfernt. Met-hGH ist auf der anderen Seite ein Monomer. Eine weitere Möglichkeit ist die, daß in Met-PGH ein Teil der Moleküle noch formyliert ist und das Enzym ein Formyl-Methionin nicht entfernt. Zur Überprüfung einer dieser oder anderer Möglichkeiten sind weitere Experimente notwendig.

Beispiel XI

Entfernung von Met, Lys und Val von Apolipoprotein E durch Aeromonas-Aminopeptidase

Methionyl-Apolipoprotein E (Charge CC 017) mit der N-terminalen Sequenz Met-Lys-Val-Glu wurde in E. coli hergestellt und gereinigt. Es wurde als Lösung von 2,53 mg/ml in 5 mM NH&sub4;HCO&sub3; verwendet.

Aminopeptidase:

Aeoromonas-Aminopeptidase (Charge 2) wurde in dem Experiment verwendet. Das Enzym (0,5 mg/ml in 0,1M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 5 uM ZnCl&sub2;, pH 8,0) wurde 2 1/2 Stunden von der Reaktion mit dem Protein erhitzt.

Durchführung:

600 ul Methionyl-Apolipoprotein E und 12,25 ul Enzym wurden bei 37ºC inkubiert und 90 ul Aliquote des Gemisches mit der Zeit entnommen und mit 10 ul 15% Sulfosalicylsäure in Wasser präzipitiert. Das Gemisch wurde 15 Minuten bei 37ºC inkubiert und zentrifugiert. 50 ul des Überstandes wurden für eine direkte Aminosäure-Analyse (ohne Säurehydrolyse) entnommen. Ein Kontrollexperiment wurde gefahren, in dem das Protein alleine ohne das Enzym 22 Stunden inkubiert und der obigen Analyse unterzogen wurde. Die von-dem Protein freigesetzten Mengen von Methionin, Lysin und Valin sind in Tabelle VII angegeben. Tabelle VII Freisetzung von Met, Lys und Val von Methionyl-Apolipoprotein E durch Aeromonas-Aminopeptidase (nMol freigesetzte Aminosäure) (Kontrolle) weniger als
Die Menge von freigesetztem Methionin, Lysin und Valin stimmt mit der theoretischen, erwarteten Menge überein, die auf der speziellen Konzentration der Probe basierte und von einem Molekulargewicht von etwa 35000 für das Protein (nämlich jeweils 3,19 nMol) ausging. Die Entfernung der dritten Aminosäure, Val, ist jedoch etwas langsamer als die der anderen Aminosäuren. Innerhalb der ersten Reaktionsstunde konnte keine Freisetzung von Glutaminsäure beobachtet werden, was auf den Stopcharakter dieser Aminosäure für die Aminopeptidase hindeutet. Nach 22-stündiger Inkubation konnte in einer Polyacrylamidgel- Elektrophorese in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat (SDS) und 2-Mercaptoethanol eine kleine Abbaumenge des Proteins beobachtet werden. Dies könnte Spuren von Endopeptidase-Aktivität in dem Substrat oder dem Enzym wiederspiegeln. Die SDS-Gele zeigen, daß das neue ApoE-Derivat ohne die drei Aminosäuren Met, Lys und Val etwas schneller als das Ausgangsprotein wandert. Interessanterweise verlor das Enzym in dem Reaktionsgemisch nach 22-stündiger Inkubation seine Aktivität, was wahrscheinlich durch das Apolipoprotein E bedingt ist, das cytotoxisch ist und auch das Enzym inaktivieren kann. Bei allen anderen, bisher getesteten Substraten blieb die Enzym-Aktivität in dem Reaktionsgemisch nach 22-stündiger Inkubation bei 37ºC gut erhalten.

Beispiel XII

Entfernung von Met von Met-bGH

Dieses Beispiel zeigt die Entfernung von N-terminalem Methionin von Methionyl-bGH, wobei bGH die Phenylalanin-Form von bGH mit der N-terminalen Sequenz Met-Phe-Pro ist.
Met-bGH (Charge 178) wurde in E. coli für die Zwecke der vorliegenden Experimente hergestellt.

Aminopeptidase:

Aeromonas-Aminopeptidase (Charge 2) (0,5 mg/ml in 0,1M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 5 uM ZnCl&sub2;, pH 8,0) wurde 2 Stunden vor Verwendung bei 70ºC vorerhitzt und dann 3 : 1 mit 2M Tris-HCl, pH 9,5 auf eine Endkonzentration von 0,375 mg/ml verdünnt.

Durchführung:

Das Hormon wurde in 10 mM NaBorat-Puffer, pH 9,5 auf 8 mg/ml suspendiert, und der pH wurde mit 1M NaOH auf 12 erhöht, dann mit 1M NaCl auf pH 9,4 gesenkt und die Suspension wurde zur Entfernung einer kleinen Präzipitatsmenge zentrifugiert und es wurde eine Lösung von etwa 7 mg/ml erhalten.
1000 ul der Met-bGH Lösung und 56,3 ul der Enzymlösung wurden bei 37ºC inkubiert und 75 ul Aliquote des Gemisches wurden mit der Zeit entnommen und mit einem gleichen Volumen an 3% Sulfosalicylsäure präzipitiert. Nach 15-minütiger Inkubation des Gemisches bei 37ºC wurde das Präzipitat zentrifugiert und 50 ul des Überstandes wurden für eine direkte Aminosäure-Analyse (ohne Säurehydrolyse) entnommen. Kontrollexperimente wurden gefahren, indem das Hormon alleine bei Zeit 0 oder nach 22-stündiger Inkubation bei 37ºC präzipitiert und obigen Analysen unterzogen wurde. Die Ergebnisse des Experimentes sind in Tabelle VIII angegeben. Tabelle VIII Freisetzung von Met von Methionyl-bGH durch Aeromonas- Aminopeptidase (nMol Met/50ul Probe) Kontrolle
Das Experiment zeigt, daß die Reaktion von Aeromonas-Aminopeptidase mit Met-bGH sehr rasch verläuft, da bei 20 ug/ml Enzym der größte Teil der Reaktion nach 2 Minuten abgeschlossen ist.
Die Stöchiometrie der Reaktion beträgt etwa 65% im Gegensatz zu Stöchiometrien von 90-100%, die für die Reaktion des Enzymes in mehreren Reaktionen mit zwei verschiedenen Chargen von Met-hGH, mit Met-Asp-Gln-bGH und mit Met-Apolipoprotein E wie auch mit Met-gamma-Interferon und Met-Somatomedin beobachtet wurden. Auf der anderen Seite zeigte die Reaktion mit Met-Leu-hGH und Met-bGH nur etwa 65% von freigesetztem Met/Mol Substrat und mit Met-pGH nur etwa 50 bis 60%. Vorliegend wurde kürzlich beobachtet, daß mit neuen Chargen von Met-Asp-Gln-bGH die Stöchiometrie ebenfalls im Bereich von 50 bis 60% liegt. Vorliegend wurde zunächst vermutet, daß diese Teilstöchiometrie bedingt sein könnte durch (a) nicht vollständig reine Materialien; (b) unvollständige Entfernung des N-Formylrests durch das bzw. die E. coli Wirts-deformylierenden Enzyme; und/oder (c) eine Dimerbildung einiger Hormone und eine Zugänglichkeit des Enzyms für nur eines der Monomere in dem Dimer. Wir fanden Hinweise für eine weitere mögliche Erklärung für die unvollständige Stöchiometrie, nämlich, daß das E. coli Wirts-prozessierende Enzymsystem teilweise das N-terminale Methionin, z. B. in Met-pGH und Met-bGH, vor der Reinigung der Proteine entfernt.

Beispiel XIII

Biologische Aktivität von authentischem, rekombinanten hGH erhalten von Met-hGH durch Entfernung von Met mit Aeromonas- Aminopeptidase

Das authentische rekombinante hGH, das von Met-hGH durch Reaktion mit Aeromonas-Aminopeptidase nach im wesentlichen den gleichen in den Beispielen I und V beschriebenen Verfahren, einschließlich der Verwendung von Ultrafiltration zur Entfernung von freiem Methionin erhalten wurde, ist biologisch aktiv und zeigt eine hohe Aktivität. Somit hat die Chargenpräparation von hGH, beschrieben in den Beispielen I und II (Charge 2/100), die von Met-hGH, Charge 1/100 stammt, ein N-terminales Phe. Seine Immunreaktivität ist die gleiche, wie jene eines Hypophysenhormons von eingefrorenen Drüsen und seine biologische Aktivität in einem Radiorezeptor-Bindungstest ist 2,1 IU/mg. Zusätzlich wurde eine weitere Chargenpräparation von Met-hGH (Charge 4.1.1), die auf eine Anionenaustauschersäule zur Entfernung von deamidierten Formen des Hormons gegeben, dann mit der Aeromonas-Aminopeptidase behandelt, wobei die Ultrafiltrationstechniken zur Entfernung von freiem, während der Reaktion freigesetzten Methionin verwendet wurden, wodurch die Reaktion zur Vollständigkeit getrieben wurde, dann auf eine weitere Anionenaustauschersäule gegeben und lyophilisiert wurde, mit der Chargennummer 4.2.1 bezeichnet und analysiert. Die Ergebnisse waren folgende:
(a) Die ersten 38 Aminosäuren des N-Terminus waren identisch mit jenen des natürlichen, von der Hypophyse stammenden Produkts, wobei die Aminosäure am N-Terminus Phe (mindestens 99%) war.
(b) Der C-terminale Rest war Phe, und damit ebenfalls identisch mit jenem von der Hypophyse stammenden Produkt.
(c) Die Immunreaktivität ist 1,35 mal höher als jene eines käuflichen Präparats aus der Hypophyse.
(d) Die Aktivität im Radiorezeptor-Bindungstest ist 2,5 Einheiten/mg Protein.

Diskussion

Die vorstehend aufgeführten Experimente und Resultate haben klar gezeigt, daß Aeromonas-Aminopeptidase rasch den N-terminalen Methionyl-Rest von durch DNA-Rekombinationstechniken hergestelltem Met-hGH, Met-Asp-Gln-bGH, Met-gamma-Interferon, Met-Somatomedin C, Met-pGH, Met-Apolipoprotein E und Met-bGH-Molekülen entfernt. Ebenso kann die Aminopeptidase den N-terminalen Methionin-Rest und seinen benachbarten Leucin-Rest von durch DNA-Rekombinationstechniken hergestelltem Met-Leu-hGH entfernen. Die zur Vermeidung von Endopeptidase-Aktivität des Substrats und der Aminopeptidase getroffenen Vorsorgemaßnahmen haben sich als erfolgreich dahingehend gezeigt, daß die Enzymreaktionen nur wenige, wenn überhaupt, Endopeptidase-Spaltungen (Fig. 1 und 2 und Tabellen I-VIII) selbst nach 22-stündiger Inkubation der Hormone mit der Aminopeptidase aufweisen. Somit liegen direkt Bedingungen vor, unter denen die Enzymreaktion vollständig ist, ohne daß eine bedeutsame Endopepetidase-Aktivität auftaucht.
Zusätzlich zeigen die Ergebnisse von Beispiel VI, daß Aeromonas-Aminopeptidase rasch mehrere Aminosäuren von eukaryotischen Polypeptid-Analoga, und nicht nur einen Methionyl-Rest entfernen kann. Insbesondere wurde gezeigt, daß die N-terminalen Methionyl- und Leucyl-Reste von Met-Leu-hGH entfernt werden können, wodurch authentisches, humanes Wachstumshormon erhalten wird.
Der äußerst bemerkenswerte Schluß aus dem Experiment von Beispiel VI ist der, daß die Menge von freigesetztem Methionin und Leucin die gleiche ist, selbst nach nur 2-minütiger Reaktion. Dies liegt daran, daß der Leucin-Rest wahrscheinlich mit einer schnelleren Geschwindigkeit als der Methionin-Rest entfernt wird. Somit stellt ein rekombinantes DNA-Produkt des Modells Met-Leu-hGH, wo Leu Met folgt, sicher, daß das Endprodukt hGH mit keinem erkennbaren Vorliegen von Leu-hGH Molekülen sein wird.
Dieses Experiment zeigt, daß das authentische Molekül nicht nur von einem Methionyl-Derivat, sondern auch von einem Methionyl-X-Derivat, wo X eine andere Aminosäure ist, erhalten werden kann. Ähnlich wird ein authentisches Molekül von einem (X)n-Derivat erhalten, wo n größer 2 ist.
Die Enzymreaktion ist spezifisch. In den zwei untersuchten Reaktionen gibt es klare Asp- und X-Pro-Stops der Aminopeptidase, die mit der Spezifität des Enzyms gegenüber kleinen Peptiden übereinstimmen.
Die untersuchten Reaktionen sind quantitativ. Eine Bestätigung dieses Schlusses wurde teilweise durch eine frühere Sequenz-Analyse erreicht, wo mindestens 99% bzw. 95% der N-terminalen Reste der Produkte einer Aminopeptidase- Reaktion mit den Hormonen Phe bzw. Asp für humanes bzw. Rinder-Wachstumshormon waren. Die Bestätigung des quantitativen Aspekts der Reaktion steht den offensichtlichen Nachteilen des Sequenzierungsverfahrens (Sensitivität, Rauschen, Nebenprodukte und Trennungsgrenzen) entgegen und die tatsächlichen Figuren könnten sogar noch höher sein, als die oben angegebenen.
In diesem Zusammenhang wird darauf hingewiesen, daß die Enzymreaktion Met-Protein Met + Protein reversibel ist und im Prinzip zur Synthese hin durch Hinzufügung von überschüssigem Methionin oder zur vollständigen Hydrolyse durch kontinuierliche Entfernung der Aminosäure getrieben werden kann. In einem der Beispiele (Beispiel V), die eine Chargenherstellung von hGH zeigen, wurde in der Tat eine Ultrafiltration für mehrere Stunden in einem fortgeschrittenen Stadium der Reaktion eingesetzt, wodurch freies Methionin entfernt und die Vollständigkeit der Reaktion gefördert wurde.
Eine Entfernung der Aminopeptidase von dem umgesetzten Hormon wird durch selektive Absorption und Desorption des Hormons an ein Anionenaustauscherharz erreicht. Andere Möglichkeiten zur Entfernung der Aminopeptidase nach ihrer Reaktion mit dem Hormon könnten die Verwendung eines wasser-unlöslichen Enzymderivats in einem Batch oder verpackt in einer Säule wie auch die Verwendung eines Affinitätsharzes für das Enzym sein, woran es am Ende der Reaktion absorbieren würde.
Das für Met-hGH, Met-Asp-Gin-bGH-, Met-Leu-hGH, Met-gamma-Interferon, Met-Somatomedin C, Met-pGH, Met-Apolipoprotein E und Met-bGH verwendete Verfahren sollte für andere Wachstumshormone und Polypeptide anwendbar sein. Verfahren zur Erzielung der Aminopeptidase können verbessert werden (z. B. wirtschaftlicheres Verfahren zur Isolierung oder rekombinanten Herstellung des Enzyms oder zur Entwicklung von Aminopeptidase überproduzierenden Mikroorganismen und von Endopeptidase-freien Mutanten der Mikroorganismen.)
Zusätzlich zu ihrer Wirkung auf Wachstumshormone kann die Aminopeptidase bzw. können die Aminopeptidasen auch für andere rekombinante DNA-Produkte, wie Hormone, Wachstumsfaktoren und Enzyme verwendet werden, die N-terminale Sequenzen gemäß der Spezifität des Enzyms oder der Enzyme, z. B. Somatomedine, Interleukin 3, Interferone, Apolipoprotein E, haben. Darüberhinaus können die rekombinanten DNA-Produkte in einer Weise entworfen werden, die die Entfernung mehrerer Aminosäuren von dem N-Terminus zusätzlich zu dem Methionin-Rest erlaubt. Beispielsweise führen Derivate, wie Met-Lys-bGH, Met-Leu-Tyr-bGH und Met-Phe-Asp-Gln-bGH nach Angriff der Aminopeptidase zu hGH, bGH bzw. Asp-Gln-bGH. Es ist auch möglich, das Enzym zur Anfügung einer Aminosäure zu verwenden, indem ein Überschuß der Aminosäure in dem Inkubationsgemisch verwendet wird, wodurch die Synthesereaktion vorangetrieben wird.

Claims

1. Verfahren zur sequentiellen Entfernung eines oder mehrerer Aminosäurerest(e)s vom N-Terminus eines Polypeptidanalogen eines natürlich vorkommenden eukaryotischen Polypeptids zur Gewinnung eines Polypeptids mit der biologischen Aktivität des natürlich vorkommenden Polypeptids durch Inberührungbringen des Polypeptidanalogen mit einer Aeromonas-Aminopeptidase unter Bedingungen, die die sequentielle Entfernung des einen bzw. der mehreren Aminosäurerest(e)s vom N-Terminus des Polypeptidanalogen gestatten, wobei das Polypeptidanaloge

(a) in einem Mikrobenwirt synthetisiert wurde;

(b) eine Aminosäuresequenz aufweist, die sich von der Aminosäuresequenz des natürlich vorkommenden eukaryotischen Polypeptids durch Wegfall oder Addition einer oder mehrerer Aminosäure(n) am N-Terminus des natürlich vorkommenden Polypeptids unterscheidet, und

(c) einen Aminosäurerest oder eine Sequenz von Aminosäureresten mit der Fähigkeit zum Stoppen der Wirkung der Aeromonas-Aminopeptidase enthält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Mikrobenwirt um ein Bakterium handelt.

3. Verfahren nach Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem eukaryotischen Polypeptid um ein Hormon, ein Lymphokin, einen Wachstumsfaktor, Interferon, Somatomedin oder Apolipoprotein E handelt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Hormon um ein Wachstumshormon handelt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Wachstumshormon um ein menschliches oder ein tierisches Wachstumshormon handelt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem tierischen Wachstumshormon um ein Rinderwachstumshormon oder Schweinewachstumshormon handelt.

7. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der N-terminale Aminosäurerest aus Methionin besteht.

8. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das eukaryotische Polypeptidanaloge an seinem N-Terminus die Sequenz Met- Phe-Pro aufweist.

9. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Rinderwachstumshormonanaloge an seinem N-Terminus die Sequenz Met-Asp-Gln aufweist.

10. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Aminosäurerest oder die Sequenz von Resten, der bzw. die die Wirkung der Aminopeptidase stoppt, dem N-terminalen Methionin benachbart angeordnet ist.

11. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Aminosäurerest oder die Sequenz von Resten, der bzw. die die Wirkung der Aminopeptidase stoppt, von dem N-terminalen Methionin durch einen oder mehrere Aminosäurerest(e) getrennt ist.

12. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Aminosäurerest, der die Wirkung der Aminopeptidase stoppt, aus Asparaginsäure oder Glutaminsäure besteht.

13. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz von Aminosäureresten, die die Wirkung der Aminopeptidase stoppt, einen von Prolin verschiedenen, an den N-Terminus eines Prolinrestes gebundenen Aminosäurerest umfaßt.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Aminosäurerest aus Phenylalanin besteht.

15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Aeromonas- Aminopeptidase durch Metallsubstitutionen hyperaktiviert ist.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Metallsubstitutionen einen Teilersatz von Cu(II) für Zn(II) als Coenzym umfassen.

17. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Metallsubstitutionen einen Teilersatz von Ni(II) für Zn(II) als Coenzym umfassen.

18. Verfahren zur Addition eines N-terminalen Aminosäurerestes an den N-Terminus des Polypeptidanalogen nach Ansprüchen 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 17 durch Inberührungbringen des Polypeptids und der Aeromonas-Aminopeptidase mit einem Überschuß an dem freien Aminosäurerest umgekehrt wird.

19. Verfahren zur Herstellung eines natürlich vorkommenden eukaryotischen Polypeptids, umfassend

(a) die Produktion eines Polypeptidanalogen desselben mit einem an seinem N-Terminus haftenden Methionin in einem Bakterium durch Exprimieren eines Gens mit Codierung für das Polypeptidanaloge;

(b) die Gewinnung des derart produzierten Analogen aus dem Bakterium;

(c) die Entfernung des N-terminalen Methionins aus dem unter Benutzung des Verfahrens nach Anspruch 1 gewonnenen Analogen und

(d) die Gewinnung des erhaltenen eukaryotischen Polypeptids.

20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß das eukaryotische Polypeptid aus einem Wachstumshormon besteht.

21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß das eukaryotische Polypeptid aus einem menschlichen Wachstumshormon oder Rinderwachstumshormon besteht.

22. Verfahren nach Anspruch 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Entfernung des N-terminalen Methionins durch Entfernen des freien Methioninrestes durch Dialyse optimiert wird.