DE69630972T2

DE69630972T2 - Wachstum von adulten langenhans-zellen des pankreas mit laminin-5

Info

Publication number: DE69630972T2
Application number: DE69630972T
Authority: DE
Inventors: Craig Halberstadt; Michael Zimber; J. John GRZESIAK
Original assignee: Cythera Inc
Current assignee: Cythera Inc
Priority date: 1995-10-06
Filing date: 1996-09-23
Publication date: 2005-04-07
Anticipated expiration: 2016-09-24
Also published as: WO1997012961A3; ATE255631T1; DE69630972D1; CA2233859A1; JPH11513253A; AU706581B2; AU7367296A; EP0859830B1; ES2211988T3; US5681587A; EP0859830A2; WO1997012961A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das verstärkte Wachstum von erwachsenen inselartigen Pankreas-Zellen, wenn dieselben im Kontakt mit Lamin 5 kultiviert werden.
Hintergrund der Erfindung
Nahezu zwei Millionen Amerikaner leiden an dem Diabetes vom Typ I (dem insulinabhängigen Diabetes), bei dem die Bauchspeicheldrüse ihre Fähigkeit verloren hat, Insulin abzusondern, und dies ist auf eine Störung des Eigenimmunsystems zurückzuführen, bei dem die das Insulin absondernden Beta-Zellen, welche innerhalb der Inselzellen des Pankreas gefunden werden, zerstört sind. Obwohl Einspritzungen von Insulin die Zerstörung der Betazellen kompensieren können, können die Werte des Blutzuckerspiegels dennoch dramatisch schwanken. Die verminderte Fähigkeit, Glukose aus dem Blut aufzunehmen, führt zu Nebenwirkungen bei denen sich toxische Produkte anhäufen, was Komplikationen zur Folge hat, einschließlich Blindheit, Nierenkrankheiten, Nervenschädigungen und was im äußersten Fall zum Koma und zum Tod führt.
Forscher haben es mit kleineren, häufiger verabreichten Dosen von Insulin und mit mechanischen Pumpen versucht, welche die Wirkung des Pankreas nachahmen, aber die Ergebnisse sind weit von dem idealen Verhalten entfernt geblieben. Eine andere Möglichkeit, nämlich eine Transplantation des Pankreas, erfordert eine größere chirurgische Behandlung und ist mit Komplikationen verbunden. Zusätzlich lässt die begrenzte Verfügbarkeit von Spendern einer Bauchspeicheldrüse eine beträchtliche Anzahl von Diabetikern ohne Hoffnung auf eine Transplantation.
Die am meisten versprechende Option ist demnach eine Transplantation von Inselzellen unter Verwendung eines Gewebes, welches entweder von Leichen oder von menschlichen Föten abgeleitet worden ist. Dieses Verfahren ist mäßig erfolgreich gewesen. Unter den weltweit durchgeführten von Leichen herrührenden Transplantaten überlebte das transplantierte Gewebe während eines vollen Jahr bei etwa 20 der Empfänger. Zehn von diesen Empfängern sind jetzt insulinunabhängig, während andere einen erheblich verminderten Bedarf an Insulin haben. Die mit einer Transplantation von Inselzellen verbundenen Hauptprobleme umfassen die Abweisung durch das Immunsystem und die ursächliche Störung des Autoimmunsystems selbst, welches, wenn man es ungeprüft bleibt, auch die transplantierten Inselzellen zerstören wird. Zusätzlich ist eine angemessene Ausdehnung von erwachsenen Pankreasinselzellen in einer Kultur nicht erzielt worden.
Fötales Gewebe vom Pankreas ist auch verwendet worden als eine Quelle für Inselzellen (Voss et al., Transplantation Proc., 21: 2751–2756, 1989). Frühere Versuche zum Kultivieren von Pankreasinselzellen wurden durch eine Verunreinigung des Fibroblastes verkompliziert (Leach et al, J. Endocrinol., 59: 65–79, 1973). Obwohl ein teilweise zersetztes fötales Pankreas dazu verwendet worden ist, um Zellcluster (ICCs = Islet Cell Clusters) zu erzeugen, die ähnlich sind wie die Pankreasinseln, ist die klinische Anwendung dieser Cluster begrenzt, weil nur 100-200 pro Pankreas erzielt werden können (Sandler et al., Diabetes, 34: 1113–1119, 1985; Otonkoski et al., Acta Endocrinol., 118: 68–76, 1988). Kover und Moore (Diabetes, 38: 917–924, 1989) erzielten 200–300 Inselzellen aus einem 17 Wochen alten, fötalen Pankreas, was jedoch noch nicht genug ist, um klinisch zur Anwendung kommen zu können. Schließlich erzeugten Simpson et al. (Diabetes, 40: 800–808, 1991) Insulin absondernde, von Fibroblasten freie Einschichten von menschlichem, fötalen Pankreas, was auf eine Rinderhornhautmatrix (BCM = Bovine Corneal Matrix) auf einer Platte aufgebracht wurde, obwohl eine angemessene Anzahl von Zellen für eine klinische Transplantation nicht erzielt wurde. Obwohl sich nur eine geringe Anzahl von Zellen innerhalb der Cluster eine positive Verfärbung für die verschiedenen, pankreatischen Hormone ergab, so differenzierten sie sich doch wirksam in reife, endokrine Zellen, anschließen an die Transplantation in nackte Mäuse (Sandler et al., Diabetes, 34: 1113–1119, 1985).
Peck et al. (PCT WO95/29988) kultivierten pluripotente, pankreatische Stammzellen in vitro. Nach mehreren Wochen bildete sich eine Stromazellenschicht. Die Differenzierung der Inselzellen wurde durch erneute Ernährung mit einem Medium mit einem hohen Gehalt an Aminosäure in die Wege geleitet, ergänzt mit einem homologen, normalen Serum, welches Glukose enthält. Nach einer zusätzlichen Wachstumsperiode wurden funktionale Inselzellen durch Standardtechniken zurückgewonnen.
Das U.S. Patent No. 5,541,106 beschreibt die Induzierung einer Hemidesmosombildung in Epithelzellen, die im Kontakt mit einer extrazellularen Matrix kultiviert werden, welche durch die Zelllinien 804G und NBT-II des Harnblasenkarzinoms der Ratte erzeugt werden. Hemidesmosome mit ihren assoziierten Strukturen, einschließlich der intermediären Filamente und der verankernden Fibrillen, bilden einen Haftkomplex, welcher eine Wechselwirkung zwischen den Epithelzellen und der darunter liegenden, extrazellularen Matrix vermittelt.
Das U.S. Patent No. 5,422,264 offenbart das Kultivieren von Epithelzellen im Kontakt mit einem löslichen 804G Matrixäquivalent, welches in das Kulturmedium hinein abgesondert wird. Diese 804G lösliche Matrix enthält Proteinuntereinheiten, die ähnlich sind wie diejenigen, die in der extrazellularen Matrix vorhanden sind, welche durch 804G Zellen abgelegt wird, was durch SDS-PAGE und durch eine immunologische Überkreuzreaktivität bestimmt wird.
Das U.S. Patent No. 5,510,263 beschreibt die Vergrößerung des Wachstums von fötalen, Pankreasinseln ähnlichen Zellclustern, welche im Kontakt mit einer extrazellularen Matrix kultiviert werden, welche durch 804G oder NBT-II Zellen abgesondert wird.
Menschliche Zellmatrixmoleküle, welche strukturell ähnlich wie die 804G Matrix sind, wenn sie nicht sogar identisch sind, wurden auch beschrieben. Rouselle et al. (J. Cell Biol., 114:567-576, 1991) und Burgeson et al. (PCT WO92/17498; PCT WO94/05316) beschreiben ein Molekül, welches Kalinin genannt wird, welches durch menschliche Keratinozyten in das Zellkulturmedium abgesondert wird und die Zellbefestigung vergrößert. Carter et al. (Cell, 65:599-610, 1991; PCT WO95/06660) beschreiben einen Epithelligandenkomplex, welcher Epiligrin genannt wird und welcher in der extrazellularen Matrix der menschlichen Keratinozyten gefunden wird. Zusätzlich umfasst ein 600 kDa Basismembranglycoprotein (BM600), welches durch menschliche Keratinozyten in das Kulturmedium abgesondert wird (Verrando et al., Biochim. Biophys. Acta., 942:45-56, 1988; Hsi et al., Placenta 8:209-217, 1987), Proteinkomponenten, welche ähnlich sind wie diejenigen, die in der 804G Matrix gefunden werden. Obwohl Kalinin und Epiligrin die Zellbindung stimulieren, ist über sie nicht berichtet worden, dass sie die Bildung von Hemidesmosomen veranlassen.
Somit besteht ein Bedarf für ein einfaches, reproduzierbares, wirksames Verfahren zur Vergrößerung des Pools der verfügbaren Pankreasinselzellen für die Transplantation in Diabetikerpatienten. Die vorliegende Erfindung befriedigt diesen Bedarf.
Zusammenfassung der Erfindung
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht in einem Verfahren für die Zucht von erwachsenen den Pankreasinseln ähnlichen Zellclustern (ICCs = Islet Cell Clusters), wobei das Verfahren den Schritt des Züchtens der ICCs in einem Kulturmedium im Kontakt mit Laminin 5 umfasst. Vorzugsweise ist das Laminin 5 die extrazellulare Matrix, welche durch die 804G Zellen und durch die NBT-II Zellen aus dem Harnblasenkarzinom von Ratten erzeugt wird, und die Matrix umfasst drei Polypeptide mit Molekulargewichten von etwa 150 kD, 140 kD und 135 kD, wobei die Matrix gekennzeichnet ist:

(a) durch eine Förderung eines erhöhten Wachstums der ICCs im Vergleich zu ICCs, welche in Abwesenheit der Matrix gezüchtet werden;
(b) durch ein Vorhandensein der Fähigkeit, eine Hemidesmosombildung in den Epithelzellen zu fördern, welche auf denselben gezüchtet werden;
(c) durch ein Binden von Concanavalin; und
(d) durch ein Gebundensein durch polyklonale Antikörper, die gegen die Matrix erzeugt werden.

Vorzugsweise stammen die ICCs von einem Säugetier; am meisten wird es bevorzugt, wenn die ICCs von einem Menschen stammen. Gemäß einem anderen Aspekt dieser bevorzugten Ausführungsform wird die Matrix durch die 804G oder NBT-II Zellen auf einem Substrat abgelegt, die 804G oder NBT-II Zellen werden von der Matrix entfernt, und die ICCs werden auf der Matrix gezüchtet. In vorteilhafter Weise wird die Matrix durch die 804G oder NBT-II Zellen in das Kulturmedium abgesondert. Das Verfahren kann auch das Reinigen der abgesonderten Matrix von dem Kulturmedium umfassen. In vorteilhafter Weise wird die Matrix durch die 804G Zellen aus dem Harnblasenkarzinom von Ratten erzeugt. Vorzugsweise werden die Polypeptide von einer rekombinanten DNA erzeugt; mit dem größten Vorzug rührt die rekombinante DNA von einem Menschen her. Gemäß einem anderen Aspekt dieser bevorzugten Ausführungsform besteht das Lamin 5 aus Kalinin oder Epiligrin. Alternativ ist das Lamin 5 die von MCF 10A Zellen erzeugte extrazellulare Matrix.
Kurze Beschreibung der Figuren
Die 1 illustriert die Ausdehnung von erwachsenen Inselzellen vom Schwein durch das Züchten auf der extrazellularen Matrix, welche von den 804G Zellen abgelegt worden ist. Die anfängliche Anzahl der zur Zucht ausgesetzten Zellen lag bei etwa 7 × 10⁵ und sie wurde auf etwa 1,46 × 10⁹ durch die Passage 3 ausgedehnt. Die Passagenummer wird auf der x-Achse gezeigt und die gesamte Anzahl von Zellen wird auf der y-Achse gezeigt.
Die 2 zeigt die Ausdehnung von erwachsenen Inselzellen vom Schwein auf verschiedenen Substraten. T.C., FBS und Gosp. entsprechen einer Plastikgewebekultur, einer die Plastikgewebekultur, welche vorher beschichtet worden ist mit einem fötalen Rinderserum und einer löslich gemachten, abgelegten 804G Matrix. G-25 ist eine rohe lösliche Zubereitung einer löslichen 804G Matrix. Verdünnungen des 95 % reinen Proteins sind gezeigt als 1:30, 1:90, 1:270 und 1:810.
Die 3 zeigt die Glukoseantwort von erwachsenen Inselzellen vom Schwein, welche ein- oder zweimal auf der 804G extrazellularen Matrix passagiert sind.
Die 4 zeigt die Glukoseantwort von erwachsenen Inselzellen vom Schwein, welche auf beiden gezüchtet worden sind, nämlich sowohl auf der abgelegten 804G Matrix als auch auf der mit der löslichen 804G Matrix beschichteten Plastikgewebekultur.
Die 5 stellt den zellularen Insulininhalt dar, welcher gemessen worden ist von einer ELISA für primär erwachsene Inselzellen vom Schwein und für Inselzellen vom Schwein, welche durch Züchten auf einer 804G extrazellularen Matrix ausgedehnt worden sind. Die Passagenummer ist auf der x-Achse gezeigt und der zellulare Insulininhalt ist auf der y-Achse gezeigt.
Die 6 zeigt den intrazellularen Insulininhalt von erwachsenen Inselzellen vom Schwein, welche auf beiden gezüchtet worden sind, nämlich sowohl auf der abgelegten 804G Matrix als auch auf der mit der löslichen 804G Matrix beschichteten Plastikgewebekultur.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung umfasst die Entdeckung, dass bestimmte Zelllinien eine extrazellulare Matrix erzeugen, welche dazu in der Lage ist, das Wachstum von erwachsenen Pankreasinselzellen, welche auf derselben Matrix gezüchtet worden sind, zu stimulieren. Eine solche Zelllinie ist die Zelllinie 804G der Zellen aus dem Harnblasenkarzinom von Ratten. Diese Zelllinie wurde von Izumi, et al., Cancer Res. (1981); 41:405-409 beschrieben und sie wird als eine Hinterlegung unter dem Budapester Vertrag in der amerikanischen Kulturtypensammlung (ATCC = American Type Culture Collection), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, aufbewahrt und zwar unter der Zugangsnummer ATCC 11555, ausgestellt am 24 Februar 1994. Eine andere solche Zelllinie ist die Zelllinie NBT-II der Zellen aus dem Harnblasenkarzinom von Ratten, welche als eine Hinterlegung unter dem Budapester Vertrag in der ATCC aufbewahrt wird und zwar unter der Zugangsnummer ATCC 11556, ausgestellt am 24 Februar 1994. Alle Beschränkungen hinsichtlich der Verfügbarkeit der hinterlegten Zellen für die Öffentlichkeit werden bei der Erteilung eines Patentes unwiderruflich aufgehoben. Die MCF 10A Zelllinie ist verfügbar in der ATCC (ATCC CRL 10317).
Man sollte sich merken, dass der Ausdruck "Laminin 5", so wie er hierin verwendet wird, sich sowohl auf die bevorzugte Zellmatrix bezieht, welche auf einem Substrat abgelegt oder in das Kulturmedium durch die 804G und NBT-II Zellen aus dem Harnblasenkarzinom von Ratten abgesondert worden ist, als auch auf die strukturell verwandten menschlichen Moleküle Kalinin (Rouselle et al., J. Cell Biol., 114:567-576, 1991; PCT WO92/17498; PCT WO94/05316), Epiligrin (Carter et al., Cell, 65:599-610, 1991; PCT WO95/06660), BM600 (Verrando et al., Biochim. Biophys. Acta., 942:45-56, 1988; Hsi et al., Placenta 8:209-217, 1987) und das dem Laminin ähnliche 804G Matrixäquivalent, das von der menschlichen MCF 10A epithelialen Säugetierzelllinie erzeugt wird. Diese Zelllinie ist von Soule et al. (Cancer Res., 50:6075-6086, 1990) und von Tait et al. (Cancer Res., 50:6087-6094, 1991) beschrieben worden. Der Ausdruck "Laminin 5" wird verwendet, um sich generisch gesehen auf irgendwelche der mit der 804G Zellmatrix im Zusammenhang stehenden Moleküle, die oben beschrieben worden sind.
So wie dies in dem U.S. Patent No. 5,541,106 beschrieben worden ist, sind äußerst strukturierte Daten entwickelt worden, was zeigt, dass die 804G Matrix in der Lage ist, eine Anzahl von Zellen dazu zu veranlassen, reife Hemidesmosomen zu entwickeln und sie an ihrem Wachstumssubstrat zu befestigen. Weiterhin ist entdeckt worden, dass die 804G extrazellulare Matrix laminähnliche Moleküle enthält, welche sich an dem Hemidesmosomzusammenbau beteiligen. Drei von diesen Molekülen sind aus einer 804G cDNA Bibliothek von Ratten geklont worden und sie verschlüsseln Proteine mit Molekulargewichten von annähernd 150, 140 und 135 kDa.
Somit kann die von solchen Zellen, wie den 804G und den NBT-II Zellen erzeugte extrazellulare Matrix die Organisation von hemidesmosomalen Antigenen in nicht damit zusammenhängenden Zellen, welche darauf beibehalten werden, modulieren. Diese Wirkung erscheint spezifisch zu sein gegenüber hemidesmosomalen Elementen, da Adhäsionsplaquekomponenten ihre Lokalisierung offensichtlich in den Zellen nicht ändern, welche auf der Matrix der vorliegenden Erfindung beibehalten werden.
Die Ausdehnung von erwachsenen Pankreasinselzellen entweder in vitro oder in vivo ist bisher nicht gezeigt worden. Obwohl Verfahren, welche sich auf die Ausdehnung von erwachsenen Pankreasinselzellen durch Züchtung auf der 804G Zellmatrix beziehen, spezifisch offenbart worden sind, so kann doch erkannt werden, dass irgendeine Zellmatrix mit der Fähigkeit, die Ausdehnung von Pankreasinselzellen auf derselben zu unterstützen, innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung liegt, ohne Rücksicht auf ihre Fähigkeit, die Hemidesmosombildung zu stimulieren. Solche Matrizen umfassen Kalinin, Epiligrin, die MCF 10A Matrix und BM600. Weil die extrazellulare Matrix, welche durch beide Zellen abgesondert worden ist, nämlich sowohl durch die 804G Zellen als auch durch die NBT-II Zellen, ähnliche Proteinkomponenten enthält, wie durch die Immunoblotexperimente bestimmt worden ist, wird die NBT-II Matrix auch die Ausdehnung von reifen Pankreasinselzellen, welche auf derselben gezüchtet worden sind, unterstützen.
Eine 1.500-fache Ausdehnung von erwachsenen Pankreasinselzellen vom Schwein, welche auf der 804G Matrix gezüchtet worden sind, wurde nach drei Passagedurchläufen in der Zuchtkultur erhalten. Es sollte bemerkt werden, dass der Ausdruck "erwachsene Pankreasinselzellen" sich auf jene voll differenzierten Pankreaszellen bezieht, welche zur Absonderung von Insulin fähig sind. Wie hierin definiert, umfasst die "804G Matrix" eine oder mehrere Proteinkomponenten, die von den 804G Zellen aus dem Harnblasenkarzinom von Ratten abgelegt worden sind, was das Wachstum von Pankreasinselzellen, welche in Kontakt mit der Matrix gezüchtet werden, ermöglicht. Die Verwendung der strukturell ähnlichen Moleküle Kalinin, Epiligrin, MCF 10A Matrix und BM600 liegt auch innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung. Der Ausdruck "804G lösliche Matrix" bezieht sich auf das lösliche Matrixäquivalent, welches die Veranlassung zur Hemidesmosombildung einleitet und welches durch die 804G Zellen in das Kulturmedium abgesondert wird. Strukturell gleichwertige löslichen Matrixmoleküle umfassen Kalinin und die lösliche Matrix, welche durch die MCF 10A Zellen in das Kulturmedium abgesondert wird.
Die 804G lösliche Matrix (95 % Reinheit; DESMOS, Inc., San Diego, CA) stimulierte auch das Wachstum von erwachsenen Inselzellen vom Schwein, welche auf einer mit einer löslichen Matrix beschichteten Plastikgewebekultur gezüchtet werden, wie dies durch eine Zunahme bei dem intrazellularen DNA Gehalt beurteilt werden kann. Die herkömmliche gereinigte lösliche Matrix wurde gereinigt mit Hilfe von herkömmlichen Verfahren zum Reinigen von Proteinen, welche den auf diesem Gebiet tätigen Fachkräften bekannt sind. Weiterhin setzten die ausgedehnten Inselzellen Insulin frei als Antwort auf eine Glukoseherausforderung und sie zeigten einen Anstieg bei dem intrazellularen Insulingehalt. Die optimale Verdünnung des 95 % reinen Materials betrug 1:30. Die Experten werden erkennen, dass irgendeine Verdünnung auf ihre Fähigkeit hin getestet werden kann, die Ausdehnung von Inselzellen zu unterstützen, wie dies in dem Beispiel 3 beschrieben wird.
Die 804G Zellmatrix förderte auch ein vermehrtes Wachstum von den auf derselben gezüchteten Pankreasinselzellen. Nach einer Passage durch die Kultur wurde ein deutlicher Anstieg der Anzahl von erwachsenen Inselzellen erzielt, was ähnlich ist zu dem, was beobachtet worden war mit den ausgedehnten Inselzellen vom Schwein nach einer Passage die Kultur.
Ein Substrat, auf dem Pankreasinselzellen gezüchtet werden sollen, ist beschichtet mit der Matrix, welche von der durch die 804G Zellen abgesonderten löslichen Matrix abgelagert worden ist, oder mit irgendeinem von den anderen hierin beschriebenen strukturell und funktional ähnlichen Molekülen. Die 804G Matrix wird so hergestellt, wie dies in dem U.S. Patent No. 5,541,106 beschrieben worden ist. Eine lösliche 804G Matrix ist in dem U.S. Patent No. 5,422,264 beschrieben. Kalinin und Epiligrin sind in dem konditionierten Medium der menschlichen Keratinozyten vorhanden. Das konditionierte Medium selbst kann als eine Quelle von Kalinin und Epiligrin verwendet werden. Kalinin kann von dem konditionierten Medium immungereinigt werden unter Verwendung einer Immunaffinitätssäule, welche gegen dessen BM165 Antigen gerichtet ist (Rouselle et al., (J. Cell Biol., 125:205-214, 1994). Epiligrin ist auch in der Zellmatrix vorhanden, welche von menschlichen Keratinozyten abgesondert wird, und es kann durch ein dreistufiges Extraktionsverfahren isoliert werden, welches 1 % W/V TRITON X-100^® umfasst, um die Membran und die Zytoplasmakomponenten löslich zu machen; 2 M Harnstoff und 1 M NaCl, um Kernkomponenten und zytoskelettale Komponenten zu beseitigen; und 8 M Harnstoff, um die restlichen Komponenten löslich zu machen. 0,5 % (W/V) Natriumdodecylsulfat (SDS) wird dann hinzu gegeben und die Matrix wird durch Abkratzen entfernt (Carter et al., Cell, 65:599-610, 1991; PCT WO95/06660). Die MCF 10A Matrix wird hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben. Man wird erkennen, dass der Gebrauch von irgendeinem löslichen oder unlöslichen Laminin 5 innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung liegt.
Die Zellen, welche gezüchtet werden sollen, werden dann auf das mit der Matrix beschichtete Substrat plattiert oder darauf aufgetragen, und zwar unter Verwendung von herkömmlichen Techniken zur Gewebekultur, gefolgt von dem Passieren in dem standardmäßigen Zellwachstumsmedium. Irgendein Medium, welches fähig ist, das vermehrte Wachstum von erwachsenen Inselzellen auf dem mit der Matrix beschichteten Substrat zu unterstützen, liegt innerhalb des Umfangs der Erfindung. Solche Zellen, einschließlich der menschlichen Zellen in vitro und in vivo, werden in einer organisierten Art und Weise auf dem Substrat wachsen und sie werden ein deutlich vergrößertes Wachstum zeigen im Vergleich mit den Pankreasinselzellen, welche auf herkömmlichen Matrizen gezüchtet worden sind, wie etwa auf der Rinderhornhautmatrix (BCM). Es stellt sich heraus, dass die Organisation der Inselzellen, welche auf der 804G Matrix wachsen, deutlicher weiter vorangeschritten ist und mehr gewebeähnlich ist als Zellen, welche in der Abwesenheit solch einer 804G Matrix wachsen.
Die Inselzellen können von dem ursprünglichen Substrat entfernt und auf mehrere neue, mit Laminin 5 beschichtete Substrate übertragen werden, was eine Ausdehnung dieser Zellen im großen Maßstab erlaubt. Die Zellen werden auf ihre Fähigkeit getestet, auf eine Glukoseherausforderung zu antworten, indem man die Spiegelwerte des in das Kulturmedium abgesonderten Insulins nach gut bekannten Verfahren misst. Nach dem Züchten können die Zellen erneut zu dreidimensionalen Strukturen vereinigt werden und entweder in eine immungeschützte Barriere untergebracht werden, etwa in Natriumalginat, in hohlen Fasern oder in Polyethylenglycol (Lonza et al., Transplantation, 56:1067-1072, 1993; Iwata et al., J. Biomed. Materials Res., 28:1003-1011, 1994) oder direkt in vivo für eine Behandlung von Diabetes implantiert werden. Die Zellen werden auch auf ihren Insulingehalt analysiert durch ELISA oder durch Radioimmunversuche, welche den Experten auf dem Stand der Technik bekannt sind.
Das Substrat, auf dem Pankreasinselzellen gezüchtet werden, kann irgendein gewünschtes Substrat sein. Für den Laboratoriumsgebrauch kann das Substrat so einfach wie Glas oder Plastik sein. Alternativ kann irgendein geeignetes Substrat verwendet werden, einschließlich verschiedener geformter Artikel, Gewebe, prothetischer Implantate und dergleichen. Für den Einsatz in vivo kann das Substrat irgendein biologisch kompatibles Material sein, auf dem Pankreasinselzellen wachsen können. Geeignete Substratmaterialien enthalten geformte Artikel, welche hergestellt werden aus bzw. beschichtet sind mit solchen Materialien wie Kollagen; regeneriertes Kollagen; Polymilchsäure; Hyaluronsäure; biokompatible Metalle, wie rostfreier Stahl und Titan; keramische Materialien, einschließlich prothetischer Materialien, wie Hydroxylapatit; synthetische Polymere, einschließlich von Polyester und Nylon; biologische Materialien, welche tatsächlich Teil eines Patienten sind, wie Bindegewebe und andere Organe, und praktisch irgendein anderes Material, an welches biologische Moleküle sich bequem ansetzen können.
Pankreasinselzellen können bei Vorhandensein von Laminin 5 in vitro für eine Transplantation in Diabetikerpatienten gezüchtet werden. Das Wachstum von Pankreasinselzellen bei dem Vorhandensein von Laminin 5 erhöht die Ausbeute an Inselzellen für eine Transplantation und löst damit den lange gespürten, aber ungelösten Bedarf für das Herstellen großer Mengen von diesen Zellen. Der Gebrauch irgendeines "804G Matrix" Proteins als ein Substrat für das Wachstum von Pankreasinselzellen wird vorteilhaft anvisiert, einschließlich aller von den Zelllinien abgesonderter Proteine, welche in der Lage sind, das Wachstum von Pankreasinselzellen zu vergrößern. Zusätzlich zieht man in Betracht, dass die Einbeziehung von einem oder von mehreren Wachstumsfaktoren in das Kulturmedium erwachsener Inselzellen die Ausbeute an Inselzellen weiter erhöhen wird.
Die als Ergebnis anfallenden Inselzellen sind voll funktional nach der Transplantation in Säugetiere, vorzugsweise in den Menschen, und sie werden den Bedarf an Insulineinspritzungen vermindern oder ganz aufheben. Der multiple Anstieg der Anzahl von erwachsenen Inselzellen vom Schwein nach einer Züchtung auf einer 804G Matrix bei drei Passagen beträgt etwa 1500, was für eine Transplantation in einen Diabetikerpatienten ausreichend groß sein kann. Es wird anvisiert, dass nach einer routinemäßigen Optimierung der Wachstumsbedingungen sogar ein größerer Anstieg erzielt werden kann.
Die 804G Matrix der vorliegenden Erfindung umfasst drei Concanavalin bindende, glykosylierte Proteine von annähernd 135 kD, 140 kD und 150 kD, von denen alle von polyklonalen Antikörpern erkannt werden, welche gegen die 804G Matrix erzeugt worden sind. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können praktiziert werden mit der vollständigen, aktiven Matrix von 804G Zellen oder mit einer funktional gleichwertigen "804G" Matrix von anderen Zellen, und sie können auch mit irgendeiner von den einzelnen Proteinkomponenten der Matrix praktiziert werden, welche das vermehrte Wachstum der Inselzellen fördern. Die gleiche Feststellung trifft auf die einzelnen Proteinkomponenten von irgendeinem der anderen hier beschriebenen Laminin 5 Moleküle zu. Zellmatrix und Matrixproteine können leicht auf ihre Fähigkeit hin gescreent werden, das Wachstum von Pankreasinselzellen zu vermehren, wobei die hierin beschriebenen Techniken verwendet werden. Nur eine routinemäßige experimentelle Durchführung ist dazu erforderlich.
Zusätzlich zu den aktiven Molekülen und deren aktiven Komponenten schließt die vorliegende Erfindung auch geformte Artikel mit eine, welche mit diesen Materialien beschichtet worden sind. Vorzugsweise sind diese geformten Artikel aus anderen Materialien als Glas gebildet worden, und sie enthalten solche Formen wie dünne Platten, Gewebe, Prothesen, Metallartikel, bioerodierbare Artikel und implantierbare Artikel.
Die extrazellulare Matrix kann geerntet werden (durch Abkratzen, Abreiben oder durch Behandlung mit geringen Konzentrationen von SDS) von den Oberflächen, auf denen geeignete Zellen, welche eine Matrix ablegen, gezüchtet worden sind. Alternativ können die Matrixmaterialien synthetisch oder durch rekombinante DNA Techniken hergestellt werden unter Verwendung von zum Beispiel cDNA Bibliotheken, welche von Ratten oder vom Menschen herrühren, oder durch Reinigung von abgelegtem Matrixmaterial. Die extrazellulare Matrix kann auch in einer löslichen Form isoliert werden, indem man das konditionierte Medium von 804G, NBT-II, MCF 10A oder menschlichen Keratinozyten erntet, welches verwendet werden kann, um Substrate zu beschichten, auf denen die Inselzellen gezüchtet werden. Darüber hinaus kann das besondere Molekül von Interesse von dem konditionierten Medium gereinigt werden und dazu verwendet werden, um das Substrat zu beschichten. Die extrazellulare Matrix, welche durch die Zelllinien abgelegt worden ist, kann auch nach der Entfernung von den Zellen verwendet werden, ohne eine weitere Bearbeitung oder Reinigung. Bei dieser Ausführungsform werden Inselzellen auf der abgelegten Matrix gezüchtet nach der Entfernung von Zellen durch eine Behandlung mit zum Beispiel geringen Konzentrationen an Ammoniumhydroxid, wie dies für die 804G Zellen in dem U.S. Patent No. 5,541,106 beschrieben worden ist.
Lösliches und unlösliches Laminin 5 werden von MCF 10A Zellen isoliert, so wie dies in dem folgenden Beispiel beschrieben wird.
Beispiel 1
Isolation von Laminin 5 aus MCF 10A Zellen
Die unlösliche Matrix wurde hergestellt aus fünf Tage alten MCF 10A Kulturen, so wie dies für 804G Zellen in dem U.S. Patent No. 5,541,106 beschrieben worden ist. Kurz gesagt, einlagige Zellschichten wurden in einer mit Phosphat gepufferten salzigen Lösung (PBS = Phosphat Buffered Saline) gewaschen, dann während einer Zeitdauer von etwa fünf Minuten mit 20 mM NH₄OH behandelt. Zellreste wurden mit PBS von dem Substrat gewaschen.
Beispiel 2
Ausdehnung von Pankreasinselzellen auf einer 804G Matrix in vitro
Erwachsene primäre Inselzellen vom Schwein, welche annähernd 2.000 Zellen pro Insel enthalten (Neocrin, Irvine, CA), wurden auf eine Plastikgewebekultur zur Zucht ausgelegt, welche mit einer durch 804G Zellen abgelegten extrazellularen Matrix beschichtet worden war. Kurz, die 804G Zellen wurden von den Platten mit 20 mM Ammoniumhydroxid entfernt, wobei die abgelegte 804G Matrix auf dem Substrat zurückgelassen wurde. Die Inselzellen wurden in Sechslochgewebekulturplatten zur Zucht ausgelegt, welche die abgelegte Matrix in dem RPMI Medium enthielten, welches 10 % fötales Rinderserum enthielt (FBS = fetale bovine serum). Annähernd 50 Inselzellen wurde es erlaubt, sich an ein Loch von einer Sechslochplatte anzuhaften und die Zellen begannen sich von dem Inselcluster aus innerhalb von 24 Stunden auszudehnen. Nach sieben bis zu 10 Tagen nach der Auslegung zur Zucht hatten die Zellen die Konfluenz erreicht und sie wurden dann mit 0,05 % Trypsin entfernt und entweder zu mehreren Oberflächen weitergeschleust oder sie wurden in situ auf ihre Glukoseansprechbarkeit und auf ihren zellularen Insulingehalt getestet.
Wie man in 1 sieht, erhöhte sich die gesamte Anzahl von Zellen deutlich, wenn auf einer 804G Matrix kultiviert und der Passage unterzogen wurde (etwa 1500-fach).
Beispiel 3
Ausdehnung von Inselzellen unter Verwendung einer 804G löslichen Matrix
Erwachsene Inselzellen vom Schwein wurden auf einer Plastikgewebekultur zur Zucht ausgelegt, welche mit unterschiedlichen Konzentrationen einer 804G löslichen Matrix beschichtet worden war (etwa 95 % rein, so wie durch Dosimetrie von einem Coomassie blau-gefärbten SDS Gel nachgewiesen). Primäre Inselzellen wurden in Sechslochplastikgewebekulturplatten mit 50 Inseln pro Loch in einem RPMI Medium, welches 10 % FBS enthielt, zur Zucht ausgelegt. In drei Löchern wurden 804G Zellen zur Konfluenz gezüchtet und die Zellen wurden entfernt unter Verwendung von Ammoniumhydroxid, wobei die abgelegte Matrix in den Löchern zurückgelassen wurde. Drei Löcher wurden beschichtet mit einer 1:10, 1:30, 1:90, 1:270 und 1:810 Verdünnung des 95 % reinen Proteins (15 Löcher insgesamt, drei pro Verdünnung). Drei Löcher wurden mit FBS beschichtet und drei wurden mit einer rohen SEPHADEX^TM G-25 (Pharmacia, Piscataway, NJ) Säulenfraktion eines von 804G Zellen konditionierten Mediums beschichtet.
Die 95 % reine, lösliche Matrix wurde gefroren in einem Volumen von 250 μl geliefert. Vor dem Auftauen und gerade unmittelbar vor dem Gebrauch wurden dem Protein 12,5 μl FBS und 12,5 μl sterile 100 mM (N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-Ethansulfonsäure]) (HEPES) (pH 6,9) hinzu gegeben. Die Löcher wurden über Nacht bei 4 °C mit einem ml Verdünnungsmittel beschichtet, dann mit PBS gewaschen. Am Tag 10 der Kulturperiode wurde das Medium auf ein niederes Glukosemedium (100 mg/dL) geändert, dies für eine Dauer von drei Tagen.
Am Tag 13 wurden die Einschichtkulturen auf intrazellulares Insulin und auf den DNA Gehalt getestet durch Anwendung des in Beispiel 5 beschriebenen Protokolls.
Das Zellwachstum wurde nach einem erhöhten, intrazellularen DNA Gehalt bewertet. Die Ergebnisse sind in der 2 zusammengefasst. Die 804G Matrix (Gosp.) führte zu dem höchsten intrazellularen DNA Gehalt. Die optimale Verdünnung von 95 % reinem Protein für eine Ausdehnung von Inselzellen betrug 1:30. Diese Verdünnung wurde für die Glukoseherausforderung gewählt und für die unten in den Beispielen 5 und 6 beschriebenen Experimente des intrazellularen Insulingehalts.
Man zieht auch in Erwägung, dass das lösliche Protein als ein ergänzendes Medium verwendet und zu der Kultur bei der Auslegung zur Zucht hinzu gegeben werden kann.
Beispiel 4
Ausdehnung von Inselzellen unter Verwendung anderer Laminin 5 Moleküle
Das Verfahren von Beispiel 2 wird wiederholt, aber mit der Ausnahme, dass die Zellen in Anwesenheit von entweder einer MCF 10A abgelegten Matrix, einer MCF 10A löslichen Matrix, Epiligrin oder Kalinin gezüchtet werden. Vergleichende Ergebnisse werden erzielt.
Beispiel 5
Glukoseansprechbarkeit von ausgedehnten Inselzellen
Die Glukoseansprechbarkeit von den auf der 804G Matrix und auf der 804G Matrix mit Löslichkeitsfaktor ausgedehnten Inselzellen wurde bestimmt pro Einheit DNA als Antwort auf eine statische Herausforderung durch Glukose / Theophyllin. Die Zellen wurden in einem niederen Glukosemedium (100 mg/dl – RPMI + 2 % Serum) während einer Dauer von mindestens drei Tagen vor einer Glukoseherausforderung inkubiert. Die Zellen wurden dann während einer Dauer von 30 Minuten in entweder einer ruhenden Konzentration von Glukose (50 mg/dl) inkubiert oder mit 325 mg/dl Glukose plus 10 mM Theophyllin stimuliert. Die Zellen wurden aus der Schüssel aufgesammelt, mit Schallwellen behandelt und wie unten beschrieben weiterverarbeitet.
Die 3 und 4 zeigen, dass die auf den beiden Matrizen, nämlich auf der 804G Matrix und auf der 804G Matrix mit Löslichkeitsfaktor, jeweils ausgedehnten Inselzellen auf eine Glukoseherausforderung antworten durch ein Absondern von Insulin in den auf der Zellkultur schwimmenden Anteil und dass sie bei einer Aufhebung der Stimulation auf einen niedrigeren Grad der Insulinabsonderung zurückfallen. Die auf der löslichen Matrix ausgedehnten Inselzellen zeigten einen größeren Grad an Insulinabsonderung als die auf der abgelegten Matrix ausgedehnten Zellen.
Beispiel 6
Bestimmung des intrazellularen Insulingehalts
Der intrazellulare Insulingehalt wurde bestimmt und ausgedrückt als ein Verhältnis von zellularem Insulin / DNA (5 und 6). Nach der Bestimmung der Glukoseansprechbarkeit wurden die geplätteten Zellen einmal mit PBS gewaschen und dann wurde 1 ml Wasser pro Loch hinzu gegeben. Die Löcher, welche die anhaftenden Zellen enthielten, wurden auf –20 °C gefroren. Die Platten wurden aufgetaut und die Zellen wurden durch mechanisches Abkratzen entfernt. Für inselartige Zellcluster oder für wieder angesammelte Zellen beträgt die Konzentration 100 ICCs/ml. Die Zellen wurden mit Schallwellen bei der Stufennummer 3 auf einem Fisher Scientific 60 Dismembrator behandelt, dies während einer Dauer von 10 Sekunden oder so lange, bis keine korpuskulare Materie mehr bei einer groben visuellen Prüfung beobachtet wird. Die Proben wurden dann bei –20 °C gespeichert, bis eine Insulinmessung mit ELISA durchgeführt wurde unter Verwendung eines Kits der Peninsula Laboratories, Belmont, CA. Die 5 stellt dar, dass eine Züchtung auf einer 804G Matrix, nach 1 Passage in der Kultur, den zellularen Insulingehalt nicht beeinflusst, verglichen mit den primären erwachsenen Inselzellen vom Schwein, welche nicht auf der 804G Matrix geplättet sind. Die 6 zeigt, dass eine 1:30 Verdünnung des 95 reinen, löslichen Proteins den intrazellularen Insulingehalt um das Dreifache erhöhte, verglichen mit der abgelegten 804G Matrix.
Der DNA Gehalt wurde bestimmt unter Verwendung eines fluormetrischen Farbstoffes (Hoechst 33258, American Hoechst Co.). Eine Arbeitslösung des Farbstoffes wurde hergestellt unmittelbar vor dem Gebrauch durch Verdünnung einer 1,0 mg/ml Stammlösung eines Farbstoffes um das 2000-fache in einem Farbstoffverdünnungspuffer (10 mM Tris HCl, pH 7,4, 1 mM EDTA, 0,1 mM NaCl), um eine Farbstoffkonzentration von 0,5 μg/ml zu ergeben. Eine Standardlösung der Kalbthymus DNA (100 μg/ml) wurde zubereitet und verdünnt, um Standardlösungen zu erzielen, welche von 0 μg/ml bis 15 μg/ml reichen. Der Test wurde an einzelne Fluorometerküvetten pro Probe angepasst. Ein Turner Model 450 Fluormeter wurde eingestellt auf eine Anregungswellenlänge von 360 nm, auf eine Emissionswellenlänge von 450 nm und auf eine 7 mm Lichtapertur. Zwei ml Farblösung wurden in eine jede Küvette hinein gegeben, gefolgt von einer Zugabe von 250 μl einer Standardlösung oder einer Probelösung. Die Proben wurden inkubiert bei Raumtemperatur während einer Zeitdauer von 30-45 Minuten in der Dunkelheit und dann wurde am Fluorometer bei 360 nm und 450 nm abgelesen. Der DNA Gehalt in den Proben wurde bestimmt durch einen Abgleich des Fluoreszenzeinheitswertes, welchen man für einen jeden Test erzielte, gegen die Steigung der Standardkurve der Fluoreszenzeinheiten gegen die Konzentration.
Beispiel 7
Ausdehnung von erwachsenen, menschlichen Pankreasinselzellen auf einer 804G Matrix
Eine erwachsene, menschliche Bauchspeicheldrüse von einer Leiche wurde von dem VA Krankenhaus, Los Angeles, CA, erhalten. Die Inselzellen wurden isoliert durch eine Homogenisierung und durch eine Kollagenasebehandlung, Verfahren die nach dem Stand der Technik gut bekannt sind (Otonkoski et al., Acta Endocrinol., 118:68-76, 1988). Die Inselzellen wurden auf der 804G Matrix oder auf der mit einer Verdünnung von 1:30 der 95 % reinen löslichen 804G Matrix geplättet und ausgedehnt, so wie dies in dem Beispiel 2 beschrieben worden ist, und dann einmal einer Passage in der Kultur unterzogen. Man erhält einen deutlichen Anstieg der Anzahl von erwachsenen Inselzellen, ähnlich wie derjenige der bei den ausgedehnten Inselzellen vom Schwein nach einer Passage in der Kultur beobachtet worden ist. Die ausgedehnten, menschlichen Inselzellen sind voll funktional, wie dies durch den Insulingehalt und durch die Antwort auf eine Glukoseherausforderung bestimmt worden ist.
Beispiel 8
Ausdehnung von erwachsenen, menschlichen Pankreasinselzellen auf Laminin 5
Ähnliche Ergebnisse werden erzielt, wenn eine MCF 10A lösliche oder unlösliche Matrix, Epiligrin oder Kalinin an Stelle einer 804G Matrix verwendet werden.
Beispiel 9
Transplantation der Inselzellen in nackte Mäuse
Ausgedehnte Pankreasinselzellen, welche durch das in den Beispielen 2, 3 oder 4 beschriebene Verfahren erzielt worden sind, werden unter der Nierenkapsel von athymischen, nackten Mäusen mit annähernd 6 × 10⁶ Zellen oder annähernd 3 × 10³ ICCs transplantiert und die Implantate werden nach drei Monaten analysiert. Ein angestiegener Spiegel an menschlichem C-Peptid, das nach der Bearbeitung des Vorläufermoleküls des Insulins in das Blut freigesetzt wird, wird in dem Blut der transplantierten Tiere durch das gut bekannte Verfahren des Radioimmunversuches nach einer intraperitonealen Glukoseherausforderung nachgewiesen, was einen Hinweis darauf liefert, dass die transplantierten Zellen in der Lage sind, Insulin zu produzieren. Zusätzlich ergibt die Immunzytochemie von Implantatzellen unter Verwendung eines Antikörpers gegenüber Insulin positive Ergebnisse, was einen Hinweis darauf liefert, dass die Inselzellen funktional sind.
Beispiel 10
Transplantation der Inselzellen in Diabetikerpatienten
Den Patienten vom menschlichen Typ I Diabetes werden annähernd 2–8 × 10⁵ der aus erwachsenen Zellen abgeleiteten Pankreasinselzellen verabreicht, welche gemäß den Beispielen 2,3 oder 4 hergestellt worden sind, dies durch Einkapselung der Zellen in eine immungeschützte Barriere und dann durch Implantieren unter die Nierenkapsel oder durch direkte Einspritzung in die Leber. Zusätzlich wird auch eine Transplantation an andere ektopische Organlagestellen erwogen. Die C-Peptiderzeugung und die Blutglukosespiegel werden über mehrere Monate überwacht, um zu bestimmen, ob transplantierte Inselzellen dabei sind, Insulin zu erzeugen. Den Patienten wird noch während der Zeitdauer der Überwachung Insulin verabreicht.

Claims

Verfahren für die Ausdehnung von erwachsenen inselartigen Pankreas-Zellclustern (ICCs = islet-like cell clusters), wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst – das Züchten der besagten ICCs in einem Kulturmedium im Kontakt mit einer Zellmatrix, die ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus; Laminin 5, Epiligrin und einer Zellmatrix, die durch eine Zelllinie erzeugt wird, welche ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus; 804G, NBT-II und MCF 10A; und – mindestens einmal eine Passage der besagten gezüchteten ICCs im Kontakt mit der besagten Zellmatrix, wodurch die Anzahl der besagten gezüchteten ICCs nach jeder Passage beträchtlich zugenommen hat.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die besagte Zellmatrix durch 804G oder NBT-II Zellen aus dem Harnblasenkarzinom von Ratten erzeugt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei die besagte Zellmatrix aus 804G Zellen erzeugt wird und drei dem Laminin ähnliche Polypeptide mit Molekulargewichten von etwa 150 kD, 140 kD und 135 kD umfasst, wobei die besagte Zellmatrix gekennzeichnet ist: (a) durch eine Förderung eines erhöhten Wachstums der besagten ICCs im Vergleich zu den ICCs, welche in Abwesenheit der Zellmatrix gewachsen werden; (b) durch ein Vorhandensein der Fähigkeit, eine Hemidesmosombildung in den Epithelzellen zu fördern, welche auf denselben gezüchtet werden; (c) durch ein Binden von Concanavalin; und (d) durch die Tatsache, dass sie durch polyklonale Antikörper gebunden ist, die gegen die Zellmatrix erzeugt werden.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die besagten ICCs aus einem Säugetier stammen.
Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die besagten ICCs aus einem Menschen stammen.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei die besagte Zellmatrix, die aus den besagten 804G oder den besagten NBT-II Zellen erzeugt wird, auf einem Substrat abgelegt wird, wobei die besagten Zellen von der besagten Zellmatrix entfernt werden, und wobei die besagten ICCs in Kontakt mit der besagten Zellmatrix gewachsen werden.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei die besagte Zellmatrix durch die besagten 804G oder durch die besagten NBT-II Zellen in das Kulturmedium abgesondert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 7, welches weiterhin das Reinigen der besagten abgesonderten Zellmatrix von dem besagten Kulturmedium umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei die besagte Zellmatrix durch 804G Zellen erzeugt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die besagten Polypeptide von einer rekombinanten DNA erzeugt werden.
Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei die besagte rekombinante DNA aus einem Menschen stammt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die besagten ICCs mindestens zehnmal ausgedehnt werden.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die besagten ICCs mindestens hundertmal ausgedehnt werden.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die besagten ICCs mindestens zweimal passagiert werden, wodurch funktionale, Insulin produzierende, passagierte Zellen erzielt werden.