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Die
Erfindung betrifft die Herstellung chimärer Zellkulturen. Sie ist insbesondere
auf die Herstellung chimärer
Epidermiszellkulturen, die für
eine Hauttransplantation verwendet werden sollen, gerichtet.
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STAND DER
TECHNIK FÜR
DIE ERFINDUNG
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Intaktes
Körpergewebe
und intakte Körperorgane
bestehen aus verschiedenen Zelltypen und extrazellulären Matrizen,
welche Zell-, Gewebe- und Organfunktionen beeinflussen. Eine nicht
angeborene Verletzung von Zellen und Gewebe verursacht Wunden und
löst übliche Wundheilungsmechanismen
an allen Stellen im Körper
aus (Robbins, S. L. et al. (Hrsg.) "Pathologic Basis of Disease", 2. Aufl., Philadelphia,
W. B. Saunders, 55–106
(1979)). Wichtige Komponenten eines Wundverschlusses umfassen die
Wiederherstellung eines stabilen vom Ektoderm abgeleiteten Gewebes
(Epithel oder Endothel) und einer einheitlichen Gefäßversorgung
im angrenzenden vom Mesoderm abgeleiteten Gewebe. Für einen optimalen
Verschluss brauchen Wunden, die von einer traumatischen Verletzung
oder einem gewählten chirurgischen
Eingriff verursacht worden sind, eine schnelle Wiederherstellung
der normalen Gewebeanatomie, ohne dass eine Infektion stattfindet
(Bucknell, T. E. et al. (Hrsg.) "Wound
healing for surgeons", Philadelphia,
Bailliere Tindall, 42–74
(1984)).
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In
den vergangenen zehn Jahren haben technologische Fortschritte bei
der in-vitro-Kultivierung humaner Epithelzellen aufgrund ihrer therapeutischen
Verwendung ein beträchtliches
Interesse auf sich gezogen. Dabei ist die durchschlagendste praktische
Verwendung zweifellos der erfolgreiche Einsatz von in vitro kultivierten Epithellappen
als Autotransplantat bei Patienten, die einen umfangreichen Hautdefekt
erlitten haben (Green, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76,
5665 (1979) und Gallico, G. et al., N. Eng. J. Med., 31, 448 (1984)).
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Dabei
hat es sich gezeigt, dass eine durch Biopsie erhaltene Probe von
1 bis 2 cm2, wenn sie in vitro kultiviert
wird, in der Fläche
um den Faktor 10 000 vergrößert werden
kann.
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Die
frühzeitige
Entfernung von verbrannter Haut über
ihre gesamte Dicke mit anschließender Transplantation
eines autologen Maschentransplantats hat die Sterblichkeitsrate
von Patienten, die an großen
Verbrennungswunden leiden, gesenkt (Heimbach, D. M., M. D., Surg.
Clin. North. Am., 67, 93 (1987)). Falls jedoch die Verbrennungen
mehr als 50% der gesamten Körperoberfläche ausmachen, führt das
zu einer sehr hohen Sterblichkeitsrate, die direkt mit der begrenzten
Verfügbarkeit
von Spenderstellen für
gespaltene Epithelmaschentransplantate zusammenhängt.
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In
vitro rekonstruiertes humanes Epithel wird seit 1981 bei der Behandlung
großflächiger Verbrennungen
erfolgreich verwendet (O'Connor
et al., Lancet, 75, 10. Januar 1981). Dieses Verfahren ist bei Brandopfern
sehr erfolgreich, bei denen mehr als 50% der Körperoberfläche verbrannt ist. Jedoch ist der
lange Zeitraum (3 bis 5 Wochen), der für das Zellwachstum und die
Herstellung transplantierbarer Lappen erforderlich ist und in welchem
der Patient immer kränker
werden kann, ein großer
Nachteil dieses Verfahrens. Deshalb liegt der Erfindung als eine Aufgabe
zugrunde, schnelle und sichere Verfahren für die Hauttraumatherapie bereitzustellen.
Diese wichtige Aufgabe kann von der anschließend beschriebenen Erfindung
gelöst
werden.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zum in-vitro-Züchten und -Erzeugen von chimärem Epithel
zur Behandlung von Hauttraumen. Dabei ist ein neues erfindungsgemäßes Merkmal
die Verwendung allogener Zellen bei der Herstellung transplantierbarer Epidermislappen.
Diese Hauttransplantate können zur
Behandlung einer Vielfalt von Hauttraumen, insbesondere Brandwunden,
aber auch einschließlich anderer
Zustände
wie eines großen
angeborenen Muttermals, einer chronischen Geschwürbildung, nicht heilende Wunden
und anderen Arten eines traumatischen Hautverlustes, der einen therapeutischen Hautersatz
erforderlich machen kann, verwendet werden. Bei Patienten mit massiven
Verbrennungen ist die Verfügbarkeit
von Spenderhaut der begrenzende Faktor für die Wundbedeckung und das Überleben.
Dabei lässt
sich vorhersagen, dass durch die Verwendung allogener Zellen viel
Zeit (bis zu 50%) bei der in-vitro-Produktion des chimären Epithels
eingespart würde,
da sich die allogenen Zellen in einer Hautbank aufbewahren lassen.
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Dementsprechend
wird erfindungsgemäß ein Verfahren
zur Herstellung einer Kultur chimärer Zellen bereitgestellt,
welche zur Transplantation auf einen Wirt geeignet ist, wobei das
Verfahren das Kultivieren von Epithelzellen, welche im Hinblick
auf den Wirt autolog sind, mit Epithelzellen, welche im Hinblick
auf den Wirt nicht autolog sind, unter Bedingungen umfasst, welche
zur Förderung
des Wachstums der Zellen geeignet sind, worin sowohl die autologen als
auch die nicht autologen Zellen vom gleichen Zelltyp sind.
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Erfindungsgemäß wird auch
eine Kultur chimärer
Zellen, welche zur Transplantation auf einen Wirt geeignet ist,
bereitgestellt, umfassend ein Gemisch aus Epithelzellen, welche
im Hinblick auf den Wirt autolog sind, und Epithelzellen, welche
im Hinblick auf den Wirt nicht autolog sind, worin sowohl die autologen
als auch die nicht autologen Zellen vom gleichen Zelltyp sind. In
einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform
sind beide Zelltypen Epidermiszellen, speziell Keratinozyten.
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Erfindungsgemäß wird weiterhin
die Verwendung der wie zuvor beschriebenen Kultur chimärer Zellen
für die
Herstellung eines Präparates
zur Verwendung als Hauttransplantat bereitgestellt.
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Erfindungsgemäß wird außerdem die
Verwendung der wie zuvor beschriebenen Kultur chimärer Zellen
für die
Herstellung eines Präparats
zur Behandlung von Verbrennungen bereitgestellt.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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In 1 ist
die Durchflusszytometrie verschiedener Keratinozytenkulturen gezeigt.
Dabei zeigt Feld (a) den Prozentsatz H-2d-positiver
Zellen in einer reinen Balb/c-Keratinozytenkultur.
Feld (b) zeigt den Prozentsatz H-2k-positiver Zellen
in einer reinen C3H/HeN-Keratinozytenkultur.
Feld (c) zeigt den Prozentsatz von H-2d-positiven
und H-2k-positiven Zellen in einer Kultur
chimärer
Keratinozyten.
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2 zeigt
die Gewebeanalyse von (a) einem Isotransplantat, (b) allogenen und
(c) chimären Transplantat
auf C3H/HeN-Mäusen
14 Tage nach der Transplantation.
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In 3 ist
die Immunofluoreszenz-Anfärbung
eines chimären
Transplantats und eines Isotransplantats 30 Tage nach der Transplantation
auf C3H/HeN gezeigt. Feld (a) ist ein mit H-2k angefärbtes Isotransplantat,
Feld (b) ist ein mit H-2k angefärbtes chimäres Transplantat
und Feld (c) ist ein mit H-2d angefärbtes chimäres Transplantat.
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AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG EINER
BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM
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Im
Folgenden wird beispielhaft eine erfindungsgemäße Ausführungsform beschrieben, in
welcher chimäre
Mausepidermiszellkulturen hergestellt und auf Mäuse als Wirte transplantiert
wurden.
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Herstellung
und Kultivierung von Epidermiszellen
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Ursprüngliche
Kulturen von Mausepidermiskeratinozyten wurden aus der Haut von
neugeborenen Balb/c- und C3H/HeN-Mäusen gemäß dem Verfahren
von Yuspa und Harris (Exp. Cell. Res., 86, 95 (1974)) gewonnen.
Neugeborene Mäuse
wurden durch Genickbruch getötet
und anschließend
dreimal mit 70%igem Ethanol, kaltem Proviodin bzw. 70%igem Ethanol
gewaschen. Gliedmaßen
und Schwanz wurden amputiert, und es wurde vom Schwanz bis zur Schnauze
ein Längseinschnitt
angebracht und die Haut mit Pinzetten entfernt. Die Epidermis wurde
von der Dermis nach Aufschwimmen der Haut auf einer 0,25%–20 μg/ml Trypsin-DNase-Lösung in
phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) über Nacht
bei 4°C
getrennt. Die abgelösten Epidermislappen
wurden aseptisch auf ein Medium übertragen,
das ein Serum enthielt, um die Wirkung restlicher Enzyme zu inhibieren
und die Epidermiszellen mechanisch abzulösen. Einzelzellensuspensionen
wurden zweimal gewaschen und die Pellets erneut in 5 ml 10 FCS-Medium
suspendiert. Die Epidermiszellsuspensionen wurden auf Lympholyt-M-Gradienten
(Cedarlane Laboratories Limited, Kanada) aufgebracht und bei Raumtemperatur
und 300 g 30 min lang geschleudert. Das erhaltene Pellet, das Keratinmaterial
und andere Rückstände enthielt,
wurde verworfen. Die Grenzschicht, die nucleierte Epidermiszellen
enthielt, wurde gesammelt, zweimal gewaschen und erneut in der Dulbecco-Vogt-Modifizierung von
Eagles Medium (DME), gemischt mit Hams F-12, im Verhältnis 3
: 1 (Flow Labs, Mississauga, Ontario, Kanada), suspendiert. Das
Medium wurde mit 5 μg/ml
Insulin, 10–10 M
Choleratoxin (Schwarz/Mann, Cleveland, OH, USA), 24,3 μg/ml Adenin,
5 μg/ml
humanem Transferrin, 2 × 10–9 M
3,3',5'-Triiod-L-Thyronin
(Sigma Chemicals), 0,4 μM
Hydrocortison (Calbiochem, La Jolla, CA, USA), 100 IU/ml Penicillin
G, 25 μg/ml
Gentamicin (Schering Canada Inc.), 10 ng/ml Epidermiswachstumsfaktor
(EGF, Chiron Corp., Emeryville, CA, USA) und 10% Rinderfötusserum (FCS,
Flow Lab) ergänzt.
Lebensfähigkeit
der Zellen und Zählung
der Epidermiszellsuspension wurden durch das Trypanblau-Ausschlussverfahren
durchgeführt.
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Zellkultivierung
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Balb/c-(BK-)
oder C3H-(CK-)Keratinozyten wurden einzeln oder mit einem Verhältnis von
50% BK-50% CK zusammen in Kulturkolben gezüchtet. Die Brutzellenkonzentration
betrug 105 Zellen/cm2. Die
Kulturen wurden 24 h lang in einer feuchten Atmosphäre mit 5%
CO2 bei 37°C ankleben gelassen und anschließend auf
31°C abgekühlt, und
der Epidermiswachstumsfaktor (EGF) wurde zu dem Medium zugegeben.
Das Medium wurde alle zwei Tage gewechselt. In den ersten 48 Stunden
Kultivierung wurde die Mg2+-Konzentration
des Mediums auf 2 mM eingestellt und anschließend auf 5 mM erhöht (Molloy,
C. J. und Laskin, J. D., Differentiation, 37, 86 (1988)).
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Immunofluoreszenz-Anfärben von
kultivierten chimären
Zellsuspensionen
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Konfluente
Kulturen wurden mit 0,01%–0,05%
Trypsin-EDTA-Lösung behandelt,
um Zellsuspensionen herzustellen. Die Zellen wurden anschließend mit
einem Anti-H-2k-monoklonalen Antikörper (spezifisch für C3H/HeN-Zellen)
45 Minuten lang bei 4°C
behandelt. Nach zwei Waschungen mit PBS, die 1% Rinderserumalbumin
(BSA) und 0,1 Natriumazid (Az) enthielt, wurden die Zellen einem
Ziegen-Anti-Maus-IgM-IgG-Fluorescein-(FITC-)Konjugat (1/300 Verdünnung) 45
Minuten lang in der Dunkelheit bei 4°C ausgesetzt. Die Zellen wurden
gewaschen und anschließend
mit einem Anti-H-2d-monoklonalen Antikörper (spezifisch
für Balb/c-Zellen),
gekoppelt an Phycoerytrin (PE), 45 Minuten lang bei 4°C in der
Dunkelheit behandelt. Nach dieser Inkubation wurden die Zellen dreimal
mit PBS-1% BSA-0,1% Az gewaschen. Danach wurde jedes Pellet in 1
ml 1% Paraformaldehydlösung
erneut suspendiert und durch Durchflusszytometrie (Becton Dickinson,
Montreal, Qc., Kanada) analysiert. Als Kontrollen wurden reine Balb/c-
und C3H/HeN-konfluente Keratinozytenkulturen enzymatisch erneut
suspendiert und anschließend
separat mit einem Anti-H-2d-PE-markierten
bzw. H-2k plus IgM-IgG-FITC-monoklonalen
Antikörper
angefärbt.
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Herstellung
von chimären
Lappen
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Es
wurden Epidermislappen hergestellt, nachdem die ursprünglichen
Keratinozytenkulturen die Konfluenz erreicht hatten. Die Kulturen
wurden zweimal mit steriler PBS gewaschen, anschließend wurden
5 ml Dispase (Sigma) mit 2,5 mg/ml jedem Kolben zugegeben und 20
bis 30 Minuten lang bei 37°C
inkubiert, um diese Lappen von der Innenfläche des Kolbens abzulösen. Die
Lappen wurden zweimal gewaschen, auf eine Vaselinegaze (Ethicon
Ltd, Johnson and Johnson, Peterborough Ont., Kanada) mit der basalen
Seite nach oben übertragen
und mit Ligaclips (Sherwood Medical Industries Ltd, Markham, Ont.,
Kanada) befestigt. Diese Lappen wurden bis zur Transplantation in
dem geeigneten Medium eingetaucht gelassen.
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Transplantationsverfahren
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Die
Empfängermäuse, die
in den Transplantationsversuchen verwendet wurden, waren Balb/c- und
C3H/HeN-Mäuse.
Der jeweilige Stamm erhielt Transplantate aus Epidermislappen, die
zu der Maus, die das Transplantat erhielt, (a) isolog, (b) allogen oder
(c) chimär
waren. So wurden beispielsweise Balb/c-Mäuse mit Epidermislappen transplantiert,
die von (a) Balb/c-Mäusen
(isologes Transplantat oder Isotransplantat), (b) C3H/HeN-Mäusen (allogenes Transplantat)
oder (c) sowohl Balb/c- als auch C3H/HeN-Mäusen (chimäres Transplantat) abgeleitet
waren.
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Inzuchtmausstämme wie
Balb/c- und C3H/HeN-Mäuse
repräsentieren
eine homogene Population, in welcher alle Mitglieder eines Stamms eine
identische genetische Ausstattung haben. Deshalb kann angenommen
werden, dass ein Isotransplantat als ein experimentelles Äquivalent
zu einem Autotransplantat betrachtet werden kann, da in beiden Situationen
sowohl der Empfänger
als auch das Transplantat dieselbe genetische Ausstattung haben. Für die Zwecke
der erfindungsgemäßen Versuche wurden
anstelle von Autotransplantaten Isotransplantate verwendet, da die
Mäuse,
von welchen die Epidermislappen hergestellt worden waren, getötet wurden,
nachdem die Epidermiszellen isoliert waren.
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Die
Empfängermäuse wurden
mit einer intramuskulären
Injektion von Ketaminxylazin mit 0,05 ml/10 g Gewicht betäubt. Der
Mausrücken
wurde für die
Transplantation vorbereitet, indem eine Fläche rasiert und mit Proviodin
und 70% Ethanol gewaschen wurde. Die Haut wurde über die gesamte Dicke bis zum
Muskel herausgeschnitten. Es wurde eine Fusenig-Transplantationskammer
(Fusenig, N. E. et al., "Tissue
Culture in Medical Research",
Bd. 2, Richard, R. G. und Rayan, K. (Hrsg.), Oxford, Pergamon, 87
(1980)) installiert und auf dem Muskel ein homogener oder chimärer Lappen
aufgebracht. Danach wurde die Vaselinegaze vorsichtig entfernt.
Die Oberseite der Transplantationskammer wurde angebracht und mit
vier Hautstichen (Seide 4–0
von Ethicon Ltd, Peterborough, Ont.) fünf Tage lang befestigt und
anschließend
entfernt. 14 und 30 Tage nach Transplantation wurde Biopsiematerial
für die
histologische und die immunohistochemische Analyse entnommen.
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Histologische
Untersuchungen
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14
Tage nach der Transplantation wurde Biopsiematerial von dem Isotransplantat,
allogenen und chimären
Transplantat entnommen, in Bouin-Lösung befestigt und in Paraffin
eingebettet. Danach wurden 4- bis 5-μm-Schnitte mit Hämatoxylin,
Phloxin und Safran angefärbt
und unter einem Lichtmikroskop (Nikon Optiphot, Japan) betrachtet.
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Für eine indirekte
Immunofluoreszenz wurde intaktes Biopsiematerial 30 Tage nach der
Transplantation von dem Isotransplantat und den chimären Transplantaten
entnommen in OCT-Verbindung (Miles, Elkhart, IN) eingebettet, in
flüssigem
Stickstoff eingefroren und bei –70°C bis zur
Verwendung aufbewahrt. 4-μm
Kryostatschnitte wurden aus jeder Biopsie präpariert, mit Anti-H-2d- oder Anti-H-2k-monoklonalen Antikörpern 45
Minuten lang bei Raumtemperatur in einer Kammer mit 95% Luftfeuchte
angefärbt
und gründlich
mit PBS-BSA-Az gespült,
wonach FITC-konjugierte-Ziegen-Anti-Maus-IgM-IgG 45 Minuten lang
wie weiter oben in der Dunkelheit darüber gelegt wurden. Nach einem
weiteren Spülvorgang mit
PBS-BSA-Az wurden die Querschnitte in einer 30% Glycerin-2% Glycin-PBS-Lösung befestigt,
mit einem Deckglas abgedeckt, mit einem Fluoreszenzmikroskop (Nikon
Optiphot) untersucht und mit Kodak Tmax 400 ASA-Film fotografiert.
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Ergebnisse
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Von
den Erfindern ist ein neues Epithelzellenkultivierungsverfahren
für die
Herstellung chimärer
transplantierbarer Lappen, die aus zwei verschiedenen Keratinozytentypen
aufgebaut sind, unter Verwendung eines Mausmodellversuchs entwickelt
worden. Diese transplantierbaren Lappen sollten bei der Behandlung
und Beschleunigung einer Therapie von Verbrennungen sowie bei der
Behandlung anderer dermatologischer Traumata Verwendung finden.
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Die
chimären
Kulturen, die ein 50 : 50-Gemisch aus Balb/c- und C3H/HeN-Keratinozyten
umfassten, wurden bis zur Konfluenz cokultiviert. Die konfluenten
Kulturen wurden entweder (I) angefärbt, um den Prozentsatz eines
jeden Zelltyps in diesen transplantierbaren chimären Lappen unter Verwendung
spezifischer Anti-H-2d-(für Balb/c)
und/oder Anti-H-2k-(für C3H/HeN)monoklonaler Antikörper zu
bewerten, oder es wurden (II) Epithele aus konfluenten Kulturen
durch Dispase-Behandlung und Transplantation auf 6 bis 8 Wochen
alte empfangende männliche
Balb/c- oder C3H/HeN-Mäuse
erhalten. 1 zeigt, dass die chimäre Kultur
etwa dieselben Anteile an jedem Zelltyp nach drei Tagen Kultivierung
enthält,
wenn sie sowohl mit Anti-H-2d- und Anti-H-2k-monoklonalen Antikörpern zusammen als auch mit
jedem Antikörper
einzeln bewertet wurden. Wie in Feld (c) gezeigt, betrug der Prozentsatz
an Balb/c-Keratinozyten in der chimären Kultur 40%, während der
Prozentsatz an C3H/HeN-Keratinozyten 42%
betrug. Diese Immunoanfärbung
zeigt keine Wachstumshemmung der Balb/c-Keratinozyten-(BK-)Vermehrung,
wenn sie mit den C3H/HeN-Keratinozyten (CK) und umgekehrt cokultiviert
wurden. Weiterhin waren die zur Transplantation bereiten Epithellappen
aus den zwei Zelltypen im Wesentlichen in demselben Verhältnis wie
zu Beginn der Kultivierung zusammengesetzt. Die negative Kontrolle
repräsentiert
eine ausschließliche
Anfärbung
mit dem zweiten Antikörper,
Anti-Maus-IgG-FITC.
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Chimäre Lappen
wurden transplantiert und auf dem Empfängerrücken belassen. 14 Tage nach der
Transplantation wurde Biopsiematerial von dem Isotransplantat, allogenen
und chimären
Transplantat zur Gewebeanalyse entnommen. Die Hämatoxylin- und die Phloxin-Anfärbung (2)
zeigten eine gut strukturierte Epidermis mit dem Vorhandensein von
Stratum corneum, Stratum spinosum und Stratum germinativum. In dem
chimären
Transplantat oder dem Isotransplantat wurde keine Monozyteninfiltration
beobachtet. Jedoch zeigten die kultivierten Epithelallotransplantate
unsorganisierte Epithelzellen und eine beträchtliche Monozyten- und polymorphonukleare
Zellinfiltration, die ein Anzeichen für das Abstoßen des Transplantats ist.
Das chimäre
Transplantat und das Isotransplantat wurden nicht abgestoßen.
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Um
die Herkunft der Keratinozyten zu bestimmen, welche die Epidermis
nach der Transplantation eines chimären Lappens bilden, wurde Biopsiematerial
von dem autologen und dem chimären Transplantat
am 30. Tag nach der Transplantation entnommen, in OCT eingebettet
und in flüssigem Stickstoff
eingefroren. Es wurden dünne
Schnitte aus jedem Biopsiematerial präpariert und mit einem Anti-H-2d- oder einem Anti-H-2k-monoklonalen
Antikörper
angefärbt.
Wie in 3 gezeigt, zeigten chimäre Lappen, die zuvor auf Balb/c-Empfängermäuse transplantiert
worden waren, dass die Epidermis nur Balb/c-(BK-)Zellen wie im Isotransplantat
enthielt. Im Transplantierten blieben keine C3H/HeN-(CK-)Zellen zurück. Die
CK-Zellen wurden, ohne die übliche
Abstoßung des
gesamten Transplantats, passiv vom Transplantierten entfernt. Dieselben
Ergebnisse wurden nach der Transplantation chimärer Lappen auf C3H/HeN-Empfängermäuse erhalten.
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Von
den Erfindern ist auch gezeigt worden, dass ähnliche Ergebnisse erhalten
wurden, wenn die chimäre
Kultur aus einem so kleinen Anteil wie 25% isologe Zellen zusammen
mit 75% allogenen Zellen besteht. Deshalb erbringt diese Erfindung
für die
Erzeugung einer chimären
Epidermis unter Verwendung von isologen und allogenen Epidermiszellsuspensionen
qualitativ hochwertige Ergebnisse bei einem Hautersatz.
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Es
wird vorhergesagt, dass durch Anwendung dieser Technologie bei der
Behandlung von Menschen eine signifikante Verkürzung um etwa 50% des Zeitraums
erreicht werden kann, der erforderlich ist, um transplantierbare
Lappen zu erhalten. In Gegenwart einer Nährschicht aus 3T3-Fibroblasten
wachsen frisch isolierte Keratinozyten in Kolonien durch viele Zyklen
der Zellteilung (Rheinwald, J. G. und Green, H., Cell, 6, 331 (1975)).
Dabei nimmt die Größe der Kolonien
mit der Zeit zu, bis sie fusionieren und innerhalb von etwa 10 Tagen
kontinuierliche mehrschichtige Keratinozytenlappen bilden. Zu diesem
Zeitpunkt stoppt die Vermehrung (Tenchini et al., Burns, 18, 11a
(1992)). Parallel dazu können
allogene Keratinozyten, die in einer Zellbank aufbewahrt und zuvor
auf Virusinfektionen und andere Krankheiten getestet worden sind,
aufgetaut und bis zur Konfluenz in Kulturkolben ausgebreitet werden.
Zellsuspensionen können
sowohl von autologen als auch allogenen Kulturen getrennt hergestellt
werden. Die zwei Zelltypen können
dann im richtigen Verhältnis miteinander
vermischt, in neuen Kolben ausgebreitet und für die Herstellung eines transplantierbaren
Lappens inkubiert werden. In diesem Stadium werden die produzierten Epithellappen
für die
Therapie von Hauttraumen wie Verbrennungen verwendet. Verglichen
mit den Standard-Kultivierungsverfahren
können
die chimären
Lappen für
eine Transplantation mit dem ersten Durchgang kultivierter autologer
Keratinozyten verwendet werden, anstatt auf den zweiten oder in
vielen Fällen
auf den dritten Durchgang zu warten. Dieses Verfahren sollte also
eine deutliche Verkürzung
der Dauer der Behandlung einer Hautwunde erlauben.