CN113308433A - 一种胰岛体外培养表面杂细胞处理方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种胰岛体外培养表面杂细胞处理方法，具体为向培养胰岛的胰岛培养基中加入适当浓度的碘乙酸并培养一段时间。本发明利用了碘乙酸对细胞膜有极强的破坏作用以及碘乙酸对细胞糖酵解作用的抑制能力，通过对培养基中的碘乙酸浓度的调节、处理时间的控制，来处理胰岛表面的杂细胞(尤其是成纤维细胞)，从而减少后续实验步骤，减少细胞损伤。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种胰岛体外培养表面杂细胞处理方法。
背景技术
胰岛是指分布于胰腺外分泌部的腺泡间的内分泌细胞团。胰岛表面包被一层由薄层网状纤维组成的被膜，但不同的物种被膜并不一定完全。胰岛可以通过胶原酶热消化胰腺并结合密度梯度离心纯化操作来获取。即通过胰管往胰腺中灌注适量浓度的胶原酶溶液，然后摘取灌注起来的胰腺浸泡到胶原酶溶液，37℃水浴孵育一定时间使胰腺被胶原酶消化成细砂状，终止胶原酶的消化作用后，进行密度梯度离心法初步纯化出胰岛，可通过手挑胰岛进行二次纯化来获取极高纯度的胰岛。为了获取高活性的完整胰岛，胶原酶消化时间不宜过长，因此，纯化出的胰岛表面一般会含有少量的杂细胞，包括成纤维细胞、腺泡细胞及导管细胞等。
成纤维细胞等杂细胞都比胰岛(细胞)贴壁生长迅速，过多增长的杂细胞显著影响胰岛体外培养的贴壁、生长状态，同时，也不利于对胰岛的研究工作的开展。因此，如何有效的抑制杂细胞(尤其是成纤维细胞)的增长对胰岛体外培养非常重要。多次转板培养可以较好的减少杂细胞的比例，但操作比较费时费力，不适合大规模体外培养胰岛，且密集的操作也会对胰岛的生长状态造成很大的不利影响。
因此，现有技术存在缺陷，需要改进。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提供一种胰岛体外培养表面杂细胞处理方法，去除杂细胞对胰岛的影响。
本发明的一个技术方案如下：提供一种胰岛体外培养表面杂细胞处理方法，包括：以下步骤；
S1：将层粘连蛋白铺在培养容器中，确保层粘连蛋白溶液均匀地分布在表面上，然后放到CO2培养箱孵育。
S2：挑选待培养的分离纯化后的胰岛铺到孵育后的层粘连蛋白上。
S3：向培养容器中加入含0.5ng/ml-1μg/ml碘乙酸的胰岛培养基，培养0.5h-120h。
S4：培养结束后，去除含0.5ng/ml-1μg/ml碘乙酸的胰岛培养基，便获得纯净胰岛。
碘乙酸可以破坏杂细胞以及胰岛中的细胞的细胞膜，但由于胰岛为团聚在一起的细胞团，因此通过调节碘乙酸的浓度和培养的时间，使得杂细胞被破坏后，胰岛表面的细胞也被破坏，但胰岛中的大部分细胞仍然存活，依然为胰岛，因此提高了胰岛的纯度，方便对胰岛的后续操作。
所述胰岛培养基是在RPMI 1640培养基中添加以下成分：1.2g/L葡萄糖、10mmol/LHEPES、10mg/L丙酮酸钠，10％v/v胎牛血清、1％v/v青-链霉素；RPMI 1640培养基可市售购买，如购自美国sigma公司，货号为R1383；上述的葡萄糖可市售购买，如购自美国sigma公司，货号为G7021；上述的HEPES可市售购买，如购自美国sigma公司，货号为V900477；上述的丙酮酸钠可市售购买，如购自美国sigma公司，货号为P5280；上述胎牛血清可市售购买，如购自以色列BIOLOGICAL INDUSTRIES公司，货号为REF03-031-1B；上述青-链霉素可市售购买，如购自以色列BIOLOGICAL INDUSTRIES公司，货号为04-001-1ACS。
在步骤S1中，层粘连蛋白基质不能变干。
步骤S2中的分离纯化后的胰岛为通过消化胰腺并经过纯化操作后得到的细胞团，在挑选前，先在CO2培养箱培养过夜，让胰岛在分离纯化时受到的损伤得到调节、恢复。
在步骤S3中，所述碘乙酸的浓度为1ng/ml-100ng/ml，培养时间为5h-72h。
在步骤S4中，去除含碘乙酸的胰岛培养基后，换成胰岛培养基进行培养。
本发明的另一个技术方案如下：提供一种胰岛体外培养表面杂细胞处理方法，其特征在于，包括以下步骤；
SS1：对培养容器进行TC处理，备用。
SS2：挑选待培养的分离纯化后的胰岛铺到TC处理的培养容器。
SS3：向步骤SS2中的培养容器中加入含0.5ng/ml-1μg/ml碘乙酸的胰岛培养基，培养0.5h-120h。
SS4：培养结束后，去除含0.5ng/ml-1μg/ml碘乙酸的胰岛培养基，便获得纯净胰岛。
和前面的方案相同，碘乙酸可以破坏杂细胞以及胰岛中的细胞的细胞膜，但由于胰岛为团聚在一起的细胞团，因此通过调节碘乙酸的浓度和培养的时间，使得杂细胞被破坏后，胰岛表面的细胞也被破坏，但胰岛中的大部分细胞仍然存活，依然为胰岛，因此提高了胰岛的纯度，方便对胰岛的后续操作。
所述胰岛培养基是在RPMI 1640培养基中添加以下成分：1.2g/L葡萄糖、10mmol/LHEPES、10mg/L丙酮酸钠，10％v/v胎牛血清、1％v/v青-链霉素；RPMI 1640培养基可市售购买，如购自美国sigma公司，货号为R1383；上述的葡萄糖可市售购买，如购自美国sigma公司，货号为G7021；上述的HEPES可市售购买，如购自美国sigma公司，货号为V900477；上述的丙酮酸钠可市售购买，如购自美国sigma公司，货号为P5280；上述胎牛血清可市售购买，如购自以色列BIOLOGICAL INDUSTRIES公司，货号为REF03-031-1B；上述青-链霉素可市售购买，如购自以色列BIOLOGICAL INDUSTRIES公司，货号为04-001-1ACS。
步骤SS2中的分离纯化后的胰岛为通过消化胰腺并经过纯化操作后得到的细胞团，在挑选前，先在CO2培养箱培养过夜，让胰岛在分离纯化时受到的损伤得到调节、恢复。
在步骤SS3中，所述碘乙酸的浓度为1ng/ml-100ng/ml，培养时间为5h-72h。
在步骤SS4中，去除含碘乙酸的胰岛培养基后，换成胰岛培养基进行培养。
采用上述方案，本发明提供一种胰岛体外培养表面杂细胞处理方法，利用了碘乙酸对细胞膜有极强的破坏作用以及碘乙酸对细胞糖酵解作用的抑制能力，通过对培养基中的碘乙酸浓度的调节、处理时间的控制，来处理胰岛表面的杂细胞，从而减少后续实验步骤，减少细胞损伤。
附图说明
图1为本发明的实施例1培养得到的胰岛的照片；
图2为对比例1培养得到的胰岛的照片；
图3为本发明的实施例2培养得到的胰岛的照片；
图4为对比例2培养得到的胰岛的照片。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例，对本发明进行详细说明。
实施例1
本实施例提供一种胰岛体外培养表面杂细胞处理方法，包括：以下步骤；
S1：将层粘连蛋白铺在培养容器中，确保层粘连蛋白溶液均匀地分布在表面上，然后放到CO2培养箱孵育。在本步骤中，层粘连蛋白基质不能变干。
S2：挑选待培养的分离纯化后的胰岛铺到孵育后的层粘连蛋白上。
S3：向培养容器中加入含5ng/ml碘乙酸的胰岛培养基，培养20h。
S4：培养结束后，去除含5ng/ml碘乙酸的胰岛培养基，便获得纯净胰岛，向纯净胰岛中加入不含碘乙酸的胰岛培养基进行培养。
所述胰岛培养基是在RPMI 1640培养基中添加以下成分：1.2g/L葡萄糖、10mmol/LHEPES、10mg/L丙酮酸钠，10％v/v胎牛血清、1％v/v青-链霉素；RPMI 1640培养基可市售购买，如购自美国sigma公司，货号为R1383；上述的葡萄糖可市售购买，如购自美国sigma公司，货号为G7021；上述的HEPES可市售购买，如购自美国sigma公司，货号为V900477；上述的丙酮酸钠可市售购买，如购自美国sigma公司，货号为P5280；上述胎牛血清可市售购买，如购自以色列BIOLOGICAL INDUSTRIES公司，货号为REF03-031-1B；上述青-链霉素可市售购买，如购自以色列BIOLOGICAL INDUSTRIES公司，货号为04-001-1ACS。
步骤S2中的分离纯化后的胰岛为通过消化胰腺并经过纯化操作后得到的细胞团，在挑选前，先在CO2培养箱培养过夜，让胰岛在分离纯化时受到的损伤得到调节、恢复。
对比例1
S11：将层粘连蛋白铺在培养容器中，确保层粘连蛋白溶液均匀地分布在表面上，然后放到CO2培养箱孵育。在本步骤中，层粘连蛋白基质不能变干。
S12：挑选待培养的分离纯化后的胰岛铺到孵育后的层粘连蛋白上。分离纯化后的胰岛为通过消化胰腺并经过纯化操作后得到的细胞团，在挑选前，先在CO2培养箱培养过夜，让胰岛在分离纯化时受到的损伤得到调节、恢复。
S13：培养20h。
请参阅图1和图2，图1为实施例1培养后得到的胰岛照片，图2为对比例1培养后得到的胰岛照片，图1、图2中的标尺均为100μm，从图1和图2中可以看出，图1中含有极少的杂细胞，而图2中含有较多的杂细胞，从实施例1和对比例1中可以看出，碘乙酸能够有效去除胰岛的杂细胞，方便后续操作。
实施例2
本实施例提供一种胰岛体外培养表面杂细胞处理方法，其特征在于，包括以下步骤；
SS1：对培养容器进行TC处理，备用。
SS2：挑选待培养的分离纯化后的胰岛铺到TC处理的培养容器。
SS3：向步骤SS2中的培养容器中加入含5ng/ml碘乙酸的胰岛培养基，培养30h。
SS4：培养结束后，去除含5ng/ml碘乙酸的胰岛培养基，便获得纯净胰岛，向纯净胰岛中加入不含碘乙酸的胰岛培养基进行培养。
所述胰岛培养基是在RPMI 1640培养基中添加以下成分：1.2g/L葡萄糖、10mmol/LHEPES、10mg/L丙酮酸钠，10％v/v胎牛血清、1％v/v青-链霉素；RPMI 1640培养基可市售购买，如购自美国sigma公司，货号为R1383；上述的葡萄糖可市售购买，如购自美国sigma公司，货号为G7021；上述的HEPES可市售购买，如购自美国sigma公司，货号为V900477；上述的丙酮酸钠可市售购买，如购自美国sigma公司，货号为P5280；上述胎牛血清可市售购买，如购自以色列BIOLOGICAL INDUSTRIES公司，货号为REF03-031-1B；上述青-链霉素可市售购买，如购自以色列BIOLOGICAL INDUSTRIES公司，货号为04-001-1ACS。
步骤SS2中的分离纯化后的胰岛为通过消化胰腺并经过纯化操作后得到的细胞团，在挑选前，先在CO2培养箱培养过夜，让胰岛在分离纯化时受到的损伤得到调节、恢复。
对比例2
SS11：对培养容器进行TC处理，备用。
SS12：挑选待培养的分离纯化后的胰岛铺到TC处理的培养容器。分离纯化后的胰岛为通过消化胰腺并经过纯化操作后得到的细胞团，在挑选前，先在CO2培养箱培养过夜，让胰岛在分离纯化时受到的损伤得到调节、恢复。
SS13：向步骤SS12中的培养容器中加入胰岛培养基，培养30h。
请参阅图3和图4，图3为实施例2培养后得到的胰岛照片，图4为对比例2培养后得到的胰岛照片，图3、图4中的标尺均为100μm，从图3和图4中可以看出，图3中含有极少的杂细胞，而图4中含有较多的杂细胞，从实施例2和对比例2中可以看出，碘乙酸能够有效去除胰岛的杂细胞，方便后续操作。
因此，从实施例1、实施例2、对比例1、对比例2中可以看出，碘乙酸的加入可以有效去除胰岛的杂细胞，方便后续操作。
综上所述，本发明提供一种胰岛体外培养表面杂细胞处理方法，利用了碘乙酸对细胞膜有极强的破坏作用以及碘乙酸对细胞糖酵解作用的抑制能力，通过对培养基中的碘乙酸浓度的调节、处理时间的控制，来处理胰岛表面的杂细胞，从而减少后续实验步骤，减少细胞损伤。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种胰岛体外培养表面杂细胞处理方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将层粘连蛋白铺在培养容器中，确保层粘连蛋白溶液均匀地分布在表面上，然后放到CO2培养箱孵育；
S2：挑选待培养的分离纯化后的胰岛铺到孵育后的层粘连蛋白上；
S3：向培养容器中加入含0.5ng/ml-1μg/ml碘乙酸的胰岛培养基，培养0.5h-120h；
S4：培养结束后，去除含0.5ng/ml-1μg/ml碘乙酸的胰岛培养基，便获得纯净胰岛。
2.根据权利要求1所述的一种胰岛体外培养表面杂细胞处理方法，其特征在于，所述胰岛培养基是在RPMI 1640培养基中添加以下成分：1.2g/L葡萄糖、10mmol/L HEPES、10mg/L丙酮酸钠，10％v/v胎牛血清、1％v/v青-链霉素。
3.根据权利要求1所述的一种胰岛体外培养表面杂细胞处理方法，其特征在于，在步骤S1中，层粘连蛋白基质不能变干；步骤S2中的胰岛为通过消化胰腺并经过纯化操作后得到的细胞团，在挑选前，先在CO2培养箱培养过夜，让胰岛在分离纯化时受到的损伤得到调节、恢复。
4.根据权利要求1所述的一种胰岛体外培养表面杂细胞处理方法，其特征在于，在步骤S3中，所述碘乙酸的浓度为1ng/ml-100ng/ml，培养时间为5h-72h。
5.根据权利要求1所述的一种胰岛体外培养表面杂细胞处理方法，其特征在于，在步骤S4中，去除含碘乙酸的胰岛培养基后，换成胰岛培养基进行培养。
6.一种胰岛体外培养表面杂细胞处理方法，其特征在于，包括以下步骤：
SS1：对培养容器进行TC处理，备用；
SS2：挑选待培养的分离纯化后的胰岛铺到TC处理的培养容器；
SS3：向步骤SS2中的培养容器中加入含0.5ng/ml-1μg/ml碘乙酸的胰岛培养基，培养0.5h-120h；
SS4：培养结束后，去除含0.5ng/ml-1μg/ml碘乙酸的胰岛培养基，便获得纯净胰岛。
7.根据权利要求6所述的一种胰岛体外培养表面杂细胞处理方法，其特征在于，所述胰岛培养基是在RPMI 1640培养基中添加以下成分：1.2g/L葡萄糖、10mmol/L HEPES、10mg/L丙酮酸钠，10％v/v胎牛血清、1％v/v青-链霉素。
8.根据权利要求6所述的一种胰岛体外培养表面杂细胞处理方法，其特征在于，步骤SS2中的分离纯化后的胰岛为通过消化胰腺并经过纯化操作后得到的细胞团，在挑选前，先在CO2培养箱培养过夜，让胰岛在分离纯化时受到的损伤得到调节、恢复。
9.根据权利要求6所述的一种胰岛体外培养表面杂细胞处理方法，其特征在于，在步骤SS3中，所述碘乙酸的浓度为1ng/ml-100ng/ml，培养时间为5h-72h。
10.根据权利要求6所述的一种胰岛体外培养表面杂细胞处理方法，其特征在于，在步骤SS4中，去除含碘乙酸的胰岛培养基后，换成胰岛培养基进行培养。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5681587A (en) * | 1995-10-06 | 1997-10-28 | Desmos, Inc. | Growth of adult pancreatic islet cells |
| WO2000078929A1 (en) * | 1999-06-23 | 2000-12-28 | Joslin Diabetes Center, Inc. | Methods of making pancreatic islet cells |
| US20020072115A1 (en) * | 2000-02-18 | 2002-06-13 | The Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research | Pancreatic islet cell growth factors |
| WO2019098944A1 (en) * | 2017-11-15 | 2019-05-23 | National University Of Singapore | Systems for expanding pancreatic islets and transplantation thereof |
-
2021
- 2021-04-27 CN CN202110460519.8A patent/CN113308433A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 张晓春: "降糖孜雅比提片（HZT）对体外培养胰岛细胞的影响", 新疆医科大学硕士论文, no. 09, 15 September 2008 (2008-09-15), pages 5 * |
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