DE60016288T2

DE60016288T2 - Isolierung von vorläuferzellen und deren verwendung zum wiederaufbau von bindegewebe

Info

Publication number: DE60016288T2
Application number: DE60016288T
Authority: DE
Inventors: Frank Luyten; Cosimo De Bari; Francesco Dell'accio
Original assignee: Tigenix NV
Current assignee: Tigenix NV
Priority date: 1999-10-06
Filing date: 2000-10-06
Publication date: 2005-12-01
Anticipated expiration: 2020-10-07
Also published as: PT1282690E; DE60016288D1; US20110158960A1; ES2230157T3; CA2386506C; EP1282690A1; EP1282690B9; WO2001025402A1; AU7634400A; DE20023640U1; CA2386506A1; DK1282690T3; ATE283349T1; US20090123927A1; US7863045B2; EP1282690B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet des "tissue engineering" im allgemeinen und insbesondere die Identifizierung von Skelett-Vorläuferzell-Populationen für die Reparatur von Bindegeweben, einschließlich Skelettgeweben in vivo.
Hintergrund der Erfindung
Knorpel ist ein Gewebe, bestehend aus einem zellulären Bestandteil, Chondrozyten und einer extrazellulären Matrix, die typischerweise reich an Collagen-Typ-II sowie hoch sulfatierten, hochmolekularen Proteoglycan-Aggregaten ist. Die letztere Eigenschaft verleiht dem Knorpel seine besonderen histochemischen Eigenschaften, die die folgenden sind: starke Anfärbung mit Elsassblau bei niedrigem pH (von 0,2 bis 2,5) und Metachromasie mit Toluidinblau und Safranin O. Der Überfluss an Typ-II-Collagen, Bindungsprotein (link protein), und Proteoglycan-Aggrekan, zusammen mit der Gegenwart von selteneren Collagenen, wie z.B. Typ-IX- und Typ-XI-Collagen sind typische Eigenschaften von Knorpelgewebe. Bei postnatalen Säugern trägt Knorpel zu der Struktur etlicher Organe und Systeme bei, wie z.B. der artikulären Oberfläche von Diarthroidal-Gelenken und anderen Gelenk-assoziierten Strukturen, wie z.B. dem Meniskus, dem Ohr, der Nase, dem Kehlkopf, der Trachea, den Bronchien, Strukturen der Herzventile, Teile der Rippen, Synchondrosen, Enthesen usw. An einigen der erwähnten Stellen (z.B. den Enthesen, dem Annulus fibrosus der Intervertebralscheiben, dem Meniskus, der Insertion von Ligamenten usw.) wird er im Hinblick auf den Überfluss an Collagenen (im wesentlichen Typ-I-Collagen) als Faserknorpel bezeichnet. An anderen Stellen (z. B. der Ohrmuschel, Epiglottis usw .) ist der Knorpel besonders reich an Elastin und wird elastischer Knorpel genannt. Bei allen anderen Strukturen, einschließlich artikulärem Knorpel, wird er aufgrund seines semitransparenten klaren Aussehens hyaliner Knorpel genannt.
Während der Embryogenese der langen Knochen aggregieren und differenzieren Mesenchymzellen, um Knorpelanlagen zu bilden, die die Form der zukünftigen langen Knochen bereitstellen. Diese Knorpel-Matrizen entwickeln sich in der Entwicklung weiter, durchlaufen eine endochondrale Knochenbildung über eine Kaskade von Ereignissen, einschließlich einer Chondrozyten-Hypertrophie, vaskulärer Invasion, Mineralisierung und werden schließlich durch Knochen ersetzt, außer einer dünnen Schicht an den Extremitäten der Knochenelemente, die sich in die artikuläre Oberfläche von Diarthroidalgelenken differenzieren wird. An diesen Stellen bleibt Knorpelgewebe über die gesamte Lebenszeit eines Individuums hyalin. Es ist bekannt, dass im Alter der artikuläre Knorpel einen Prozess der Alterung durchläuft, was seine mechanischen Eigenschaften und seine innewohnende Elastizität beeinflusst.
Die gängige Therapie für einen Verlust von Knorpelgewebe ist der Ersatz mit einem Prothesematerial, wie z.B. Silikon, für kosmetische Reparaturen oder Metallegierungen für eine Gelenksverbesserung. Die Platzierung prothetischer Vorrichtungen ist jedoch ein sehr künstlicher Weg der Reparatur und ist in der Regel mit einem Verlust von darunterliegendem Knochen assoziiert, ohne Wiedergewinnung der vollständigen Funktion, die das ursprüngliche Knorpelgewebe ermöglicht hat. Schwerwiegende Langzeit-Komplikationen, assoziiert mit der Gegenwart eines ständig vorliegenden Fremdkörpers, können eine Infektion, Erosion und Instabilität beinhalten. Die Implantation von sterilisierten Knochen Oder Knochenpulver mit chirurgischem Stahl, eingesät mit Knochenzellen, war im wesentlichen nicht erfolgreich und zwar aufgrund der nicht degradierbaren Natur der Zellträger.
Das US-Patent Nr. 4,609,551 offenbart, dass Fibroblasten, die in vitro mindestens drei Tage gegenüber einem löslichen Knochenprotein exponiert wurden, in der Lage sind, eine chondrogene Reaktion in vitro und/oder in vivo zu stimulieren. Die aktivierten Fibroblasten werden dann, indem sie mit einer bioabbaubaren Matrix kombiniert werden oder durch intraartikuläre Injektion oder Anheftung an Eigentransplantate und prothetische Vorrichtungen in vivo übertragen. Der Nachteil dieses Verfahrens ist der, dass sich die Chondrogenese nicht in Kurzzeitkulturen entwickeln kann und man muss sich in unerwünscht deutlicher Weise auf die exponierten Fibroblasten an der Implantationsstelle für die Knorpelsynthese verlassen. EP-A-739,631 offenbart die Erzeugung eines biologischen Materials, umfassend rekonstituiertes Knorpelgewebe durch Anzüchten von Chondrozyten auf einem flexiblen Blatt aus entmineralisierten natürlichen Knochen mit einer Dicke von 1,5 mm. Dies wird sich jedoch nur dann als nützlich erweisen, wenn der Knochen nicht selbst abgeleitet ist, da die Ernte von selbst abgeleitetem Knochen komplizierte und schmerzhafte Eingriffe erforderlich macht.
Gelenkoberflächen-Defekte können das Ergebnis verschiedener Äthiologien sein, wie z.B. entzündlicher Prozesse, Neoplasien, posttraumatischer und degenerativer Ereignisse usw. Was immer der Grund sein mag, heilt Knorpel aufgrund seiner begrenzten Fähigkeit zur Reparatur nur schlecht mit bestenfalls Narbenbildung oder faserknorpeligem Gewebe. Diese Teilreparatur der artikulären Oberfläche führt zu einer Osteoarthritis und einer schweren funktionellen Dysfunktion. Basierend auf der Tiefe der Verletzung werden zwei Arten von Gelenkoberflächendefekten definiert, nämlich die osteochondralen (oder "full-thickness" oder vollschichtigen) und die oberflächlichen (oder teilschichtigen).
Osteochondrale (oder vollschichtige) Gelenk-Oberflächendefekte beinhalten Schäden an dem artikulären Knorpel, dem darunterliegenden subchondralen Knochengewebe und der verkalkten Schicht des Knorpels, lokalisiert zwischen dem artikulären Knorpel und dem subchondralen Knochen. Sie ergeben sich typischerweise durch schwere Traumata der Gelenke oder während der späten Stufen von degenerativen Gelenkerkrankungen, z.B. während der Osteoarthritis. Da das subchondrale Knochengewebe sowohl innerviert als auch vaskularisiert ist, kann ein Schaden an diesem Gewebe schmerzhaft sein. Osteochondrale Defekte verlassen sich auf extrinsische Mechanismen für ihre Reparatur. Die extrinsische Heilung verlässt sich auf mesenchymale Elemente aus dem subchondralen Knochen oder Gelenk-assoziierten Geweben zur Teilnahme an der Bildung von neuem Bindegewebe, einschließlich Skelettgewebe. Dieses Reparaturgewebe kann zur Bildung von Faserknorpel metaplastische Veränderungen durchlaufen, der jedoch dann nicht dieselbe biochemische Zusammensetzung oder mechanischen Eigenschaften, wie gewöhnlicher artikulärer Knorpel oder subchondraler Knochen zeigt und mit der Verwendung degeneriert.
Oberflächliche oder teilschichtige Verletzungen von artikulärem Knorpel, die nicht in den subchondralen Knochen vordringen, können sich nur auf einen intrinsischen Mechanismus für die Reparatur verlassen. Chondrozyten, die den verletzten Oberflächen benachbart sind, zeigen kurz nach einer oberflächlichen Verletzung einen kurzen Ausbruch mitotischer Aktivität, assoziiert mit einem Anstieg der Stoffwechsel-Aktivität und Matrixsynthese. Trotz dieser Reparaturversuche gibt es keinen deutlichen Anstieg der Masse von Knorpelmatrix und der Reparaturprozess ist bei der Heilung der Defekte nur selten effektiv. Obwohl sie anfänglich manchmal schmerzlos sind, können teilschichtige Defekte häufig zu einer Osteoarthritis des betroffenen Gelenks degenerieren.
Dia Reparatur von artikulären Knorpeldefekten mit Suspensionen von Chondrozyten wurde bei einer Vielzahl von Tiermodellen durchgeführt und wird nun bei Menschen verwendet (Brittberg et al. N Engl J Med.; 331 (14): 889–95). Autologe Chondrozyten, die von dem nicht betroffenen Bereich des Gelenks erhalten wurden, werden freigesetzt, in vitro in Gegenwart von autologem Serum expandiert und darauffolgend unter einen Periostlappen injiziert, vernäht, um den Knorpeldefekt abzudecken. Dieses Verfahren hat zu einer bewiesenen, zumindest symptomatischen Verbesserung geführt. Dieser vielversprechende Ansatz hat jedoch immer noch weite Bereiche, die verbessert werden können, da bekannt ist, dass die in-vitro-Expansion von Chondrozyten nach einer begrenzten Anzahl von Zellteilungen zu einem Verlust ihrer phänotypischen Stabilität führt (definiert durch die Fähigkeit von Chondrozyten, in vitro, aber auch in vivo hyalinen Knorpel zu bilden), was dazu führt, dass die zu injizierende Zellsuspension nicht verlässlich ist.
Drei alternative Ansätze wurden in einem Versuch entwickelt, die Erfolgsrate bei der Behandlung von artikulären Knorpeldefekten bei Säugern zu verbessern. Bei dem ersten Ansatz werden synthetische Trägermatrizes mit Chondrozyten imprägniert und dann in den Knorpeldefekt implantiert, wo man hofft, dass sie Bestandteile produzieren und sezernieren, die zur extrazellulären Matrix gehören, um artikulären Knorpel an der Stelle des Defekts zu bilden. Eine Vielzahl synthetischer Trägermatrizes wurde bis jetzt verwendet und diese beinhalten dreidimensionale Collagengele (z.B. US-Patent Nr. 4,846,835), rekonstituierte Fibrin-Thrombin-Gele (z.B. US-Patent Nrn. 4,642,120; 5,053,050 und 4,904,259), synthetische Polymermatrizes, enthaltend Polyanhydrid, Polyorthoester, Polyglykolsäure und Copolymere davon (US-Patent Nr. 5,041,138) und auf Hyaluronsäure basierende Polymere. Sobald eine mitotisch expandierte Population von Chondrozyten erhalten wird, können die Zellen entweder zurück in dasselbe Subjekt implantiert werden, von dem die Elternzellen ursprünglich abstammten (autologe Implantation), oder in ein anderes Subjekt (heterologe Implantation). Zusätzlich kann die heterologe Implantation Chondrozyten verwenden, die von verwandten oder nicht verwandten Individuen derselben Art (allogen), oder von einer anderen Art (xenogen) erhalten wurden. Alternativ können Chondrozyten von einer etablierten Langzeitzellinie, die entweder allogen oder xenogen ist, erhalten werden.
Die autologe Implantation macht es nötig, dass Chondrozyten von einem nicht betroffenen Bereich der Gelenkoberfläche von dem Patienten geerntet und dann in einer in-vitro-Kultur zu einer ausreichenden Zahl oder Dichte für eine effektive Implantation expandiert werden. Die benötigte Zeitmenge für eine solche ausreichende Expansion kann jedoch die effektive Verwendung einer autologen Kultur ausschließen, da einige Knorpelreparaturen sofort oder innerhalb einer kurzen Zeitspanne nach dem Auftreten der traumatischen Verletzung durchgeführt werden sollten. Eine andere Begrenzung ist das mitotische Potenzial der Zellen, da es eine Begrenzung der Anzahl von Malen gibt, die Zellen expandiert werden können und da die ultimative Quantität von Zellen, die für eine Therapie erzeugt werden, begrenzt sein kann. Wenn zusätzlich eine schwere schädigende Gelenkstörung zu einem generellen Abbau von Knorpelgewebe im gesamten Körper des Patienten führt, nämlich z.B. bei älteren Leuten, kann nur sehr wenig nicht betroffenes Knorpelgewebe zur Verfügung stehen, von dem aus man eine Chondrozytenkultur beginnen könnte. Die Einführung heterologer Chondrozyten in einen Patienten kann andererseits eine unerwünschte Immunreaktion stimulieren, die gegen das implantierte Material gerichtet ist, was zu einer potenziellen Abstoßung des neu gebildeten und transplantierten Knorpelgewebes führen kann. Zusätzlich beinhaltet die heterologe Implantation das Risiko einer Übertragung infektiöser Mittel, die in dem Gewebe oder der Zellinie vorliegen können, an den Betroffenen.
Wenn außerdem synthetische Trägermatrizes verwendet werden, kann Neoknorpel um die Peripherie des Implantats gebildet werden und verhindert dadurch die Integration des Implantats in den Knorpeldefekt. Die Überwachung der Bildung und Entwicklung des resultierenden synthetischen Knorpels in situ ist in der Durchführung schwierig und involviert in der Pegel eine arthroskopische oder offene Gelenküberprüfung. Weiterhin können Implantate, die synthetische Polymerbestandteile enthalten, für die Reparatur großer Knorpeldefekte ungeeignet sein, da die in-situ-Polymerhydrolyse die Bildung von Knorpel und/oder seine Integration in den Defekt inhibiert.
In dem zweiten Ansatz wird der Defekt mit einer biokompatiblen, bioabbaubaren Matrix gefüllt, die chemotaktische und mitogene Wachstumsfaktoren enthält, um das Einwandern von Chondrozyten-Vorläuferzellen in die Matrix in situ zu stimulieren. Die Matrizes enthalten optimalerweise Poren von ausreichenden Dimensionen, um das Einwandern und die Proliferation der Chondrozyten-Vorläufer in die Matrix zu erlauben. Die Matrix kann auch Wachstumsfaktoren enthalten, um die Differenzierung von Chrondrozyten-Vorläuferzellen zu Chondrozyten zu stimulieren, die wiederum extrazelluläre Matrixbestandteile sezernieren, um Knorpel an der Stelle des Defekts in situ zu bilden (z.B. US-Patente Nrn. 5,206,023 und 5,270,300 und EP-A-530,804). Dieser Ansatz führt jedoch zu ähnlichen Problemen wie denen, die mit dem oben beschriebenen ersten Ansatz assoziiert sind. Weiterhin gibt es bis jetzt keine Daten, dass artikulärer Knorpel chondrozytische Vorläufer enthält, die für eine Reparatur von teilschichtigen Defekten zur Verfügung stünden.
In einem dritten Ansatz können die Chondrozyten in vitro kultiviert und expandiert werden, um dadurch synthetisches knorpelähnliches Material zu bilden, das darauffolgend in den Knorpeldefekt implantiert wird. Dies hat gegenüber den vorherigen Verfahren den Vorteil, dass die Entwicklung von synthetischem Knorpelmaterial durch morphologische und biochemische Charakterisierung vor der Implantation überwacht werden kann. Das Anzüchten chondrogener Zellen kann entweder in anchor-abhängiger oder anchor-unabhängiger Weise geschehen. Bei dem letzteren können die chondrogenen Zeilen als Kolonien in einem Agarosegel kultiviert werden. Bis jetzt wurden nur kleine Stücke von Knorpelgewebe von undefinierter Form unter Verwendung dieser Möglichkeit erzeugt. Weiterhin verbleibt der resultierende Knorpel in einer Gelmatrix eingebettet, was ihn für eine Implantation bei Säugern weniger geeignet macht. In einem weiteren, anchorunabhängigen Verfahren können die Chondrozyten als Kolonien in Suspensionskultur gezüchtet werden. Die resultierenden Teilchen, enthaltend synthetisches, Knorpel-ähnliches Material, sind jedoch in der Regel klein und von undefinierter Form, was sie für eine Implantation und Reparatur eines bestimmten Knorpeldefekts unbrauchbar macht. Dies würde statt dessen zu etlichen kleinen Stücken von Knorpel führen, die vollständig voneinander getrennt sind und weit davon entfernt, untereinander und in dem umgebenden knorpelartigen Gewebe gut integriert zu sein.
Bei dem anchor-abhängigen Verfahren werden Primärkulturen von chondrogenen Zellen, isoliert aus Primärgewebe, als Monolayer, angehaftet an die Oberfläche einer Zellkulturflasche, gezüchtet (z.B. US-Patent Nr. 4,356,261). Die direkt von Explantatgewebe abgeleiteten Primärzellen behalten ihre Fähigkeit, extrazelluläre Bestandteile zu produzieren und zu sezernieren, die für natürlichen Knorpel charakteristisch sind, insbesondere Typ-II-Collagen und sulfatierte Proteoglycane. Es ist jedoch wohlbekannt, dass während der in-vitro-Expansion in Monolayer die Chondrozyten dedifferenzieren und ihre Fähigkeit zur in-vivo-Organisation von hyalinem Knorpel verlieren. Bis jetzt war es nicht möglich, große Stücke von artikuläre Knorpeln aus kleinen Stücken von Biopsiegewebe während der anchor-abhängigen Verfahren von US-Patent Nr. 4,356,261 herzustellen.
Um die obigen Probleme zu lösen, stellt US-Patent Nr. 5,723,331 ein Verfahren zur in-vitro-Herstellung von großen Mengen synthetischer Knorpel aus kleinen Proben von Biopsiegewebe bereit, das, basierend auf der Entdeckung, dass chondrogene Zellen aus einer Vielzahl von Geweben isoliert werden können, z.B. vorher existierendem Knorpel, perichondrialem Gewebe oder Knochenmark und in-vitro vor der Knorpelbildung expandiert werden können, eine erste Aussaat beinhaltet und zwar von nackten (d.h. von enzymatisch oder mechanisch desaggregiertem Gewebe isolierten) chondrogenen Zellen, proliferiert ex vivo, in eine vorher geformte Vertiefung mit einer zellkontaktierenden, zell-adhäsiven Oberfläche und dann Kultivierung der proliferierenden chondrogenen Zellen in der Vertiefung für eine ausreichende Zeit, damit die Zellen eine extrazelluläre Matrix sezernieren können, um dadurch einen dreidimensionalen, vielzellschichtigen Flecken aus synthetischem Knorpel zu bilden.
Ein weiterer Nachteil dieser Verfahren ist derjenige, dass die Chondrozyten von dem Patienten, typischerweise durch eine Biopsie erhalten, in Kultur expandiert und dann auf eine Matrix implantiert werden müssen. Dies ist bei Labortieren relativ einfach, führt jedoch beim Menschen zu größeren logistischen Problemen, wenn ein Defekt durch eine Biopsie erzeugt wird, die benötigt wird, um Zellen für eine Reparatur eines anderen Defekts bereitzustellen. Wenn der Defekt weiterhin einen Teil des darunterliegenden Knochens beinhaltet, wird dies unter Verwendung von Chondrozyten nicht korrigiert, die bereits differenziert sind und keine neuen Knochen bilden werden. Der Knochen ist nötig, um den neuen Knorpel zu stützen.
Die Verwendung von Mesenchymzellen wurde ebenfalls für die Reparatur etlicher Gewebe, einschließlich Knorpel, vorgeschlagen. Mesenchymstammzellen sind eine potenzielle alternative Quelle für Knorpel-produzierende Zellen. Sie sind im allgemeinen als pluripotente Zellen anerkannt, die sich vielfach teilen können, um Vorläuferzellen zu erzeugen, die schließlich zu Bindegeweben werden können, einschließlich Knorpel, Knochen, Sehnen, Ligamenten, Knochenmarkstroma. Per definitionem sind sie nicht auf eine bestimmte Anzahl mitotischer Teilungen begrenzt.
Stammzellen sind als Zellen definiert, die nicht differenziert sind, die sich ohne Begrenzung teilen können, um Zellen zu ergeben, die entweder Stammzellen sind oder Zellen, die sich weiter differenzieren, um verschiedene Arten von Vorläuferzellen, einschließlich Mesenchym-Stammzellen zu ergeben. Diese Mesenchym-Stammzellen sind pluripotente Zellen, die in der Lage zu einer Differenzierung zu jeder Art von spezifischen Mesenchym- oder Bindegeweben sind, einschließlich Skelettgeweben. Mesenchym-Stammzellen wurden aus Knochenmark oder anderen Quellen, wie z.B. dem Periost, der Plazenta, der Nabelschnur, der Haut und dem Blut (z.B. in US-Patent Nr. 5,811,094) isoliert. Pluripotente Mesenchym-Stammzellen wurden auch aus dem Muskel (Pate et al., Proc. 49th Ann. Sess. Forum Fundamental Surg. Problems Oktober 1993, 587-9), dem Herzen (Dalton et al., J. Cell Biol. 1993, 119 R202) und Granulierungsgewebe (Lucas et al., J. Cell. Biochem. 1993, 122 R212) isoliert. Die Pluripotenz wurde unter Verwendung eines nicht-spezifischen Induktors, Dexamethason, demonstriert, der eine Differenzierung der Stammzellen zu Chondrozyten (Knorpel), Osteoblasten (Knochen), Myoblasten (myotubes) (Muskeln), Adipozyten (Fett) und Bindegewebszellen hervorruft.
Unglücklicherweise gibt es keinen bekannten spezifischen Induktor der Mesenchym-Stammzellen, der nur Knorpel ergibt, obwohl es sehr wünschenswert wäre, Stammzellen zu haben, die aus einer Muskel- oder Hautbiopsie einfach erhalten werden können, kultiviert werden können, um große Anzahlen zu ergeben und dann verwendet werden können als Quelle für Chondrozyten oder Osteoblasten oder Myozyten, In-vitro-Studien, worin eine Differenzierung erreicht wird, ergeben eine Mischung von Zelltypen. In den US-Patenten Nrn. 5,226,914 und 5,197,985 wurden die Zellen in poröse Keramikblöcke ausgesät und – subkutan in Nacktmäuse implantiert – ergaben sie im wesentlichen Knochen. US-Patent Nr. 5,906,934 offenbart jedoch, dass unter sehr spezifischen Bedingungen Mesenchym-Stammzellen in einem geeigneten polymeren Träger (wie z.B. einem Polyglykolsäuresieb), implantiert in einen Knorpel und/oder Knochendefekt, genau nach Wunsch, zur Bildung von Knorpel und/oder Knochen differenzieren. Außerdem offenbart US-Patent Nr. 5,919,702 Chondrozyten-Vorläuferzellen, isoliert aus Nabelschnurquellen, z.B. von Wharton's Jelly, die kultiviert werden, um zu Chondrozyten zu werden, die Knorpelgewebe produzieren können. In einem weiteren Versuch, die Nachteile von den gegenwärtigen Knorpel- und Knochen-Reparaturtechniken zu vermeiden, die zu Blutungen führen und die Verwendung von mechanisch schwachen, nicht selbst abgeleitetem Material involvieren, schlägt US-Patent Nr. 5,866,415 die Behandlung von Knorpel- oder Knochendefekten mit einem biologischen Material vor, erhalten durch in-vitro-Anbindung von Knorpel- oder Knochen-bildenden Zellen an ein Periost von geeigneter Größe, um den Defekt zu behandeln.
WO/96/41523 und WO96/41620 beschreiben die Verwendung von FGFR3 als Marker für Mesenchym-skelettalen Vorläuferzellen. Solche Zellen exprimieren jedoch FGFR3, von dem durch die gegenwärtigen Erfinder festgestellt wurde, dass er eine Differenzierung in nicht-pluripotente Zellen vom Prächondroblastentyp beim Menschen indiziert. Daher unterscheiden sich durch diese bekannten Verfahren selektierte Zellen von den Vorläuferzellen, die gemäß der vorliegenden Erfindung selektiert werden.
1 zeigt die hierarchische Kaskade von Zellen im Differenzierungsprozess schematisch, ausgehend von den nichtdifferenzierten Mesenchym-Stammzellen, bis hin zu den vollständig differenzierten Skelettzellen. US-Patent Nr. 5,811,094 beschreibt Verfahren zur Identifikation, selektiven Isolierung und Anreicherung von mesenchymalen Stammzellen durch Kulturexpansion. Dieses Patent stellt keine Verfahren für eine Isolierung, Reinigung und kulturelle Expansion von skelettalen Vorläuferzellen bereit, den Verfahren, die der Zweck der vorliegenden Erfindung sind. Unsere Bemühungen fokussierten sich auf die skelettalen Vorläuferzellen, wie hiernach definiert, wobei die molekulare Kaskade von Ereignissen, die den Differenzierungswegen zugrunde liegen, die zu den spezialisierten Zellen der Skelettgewebe führen, aufgedeckt wurden, wobei der Erzeugung stabiler Chondrozyten besondere Aufmerksamkeit gewidmet wurde. Es wird angenommen, dass stabile Chondrozyten stabile Knorpel in vivo und/oder in vitro unter den geeigneten Bindungen bilden können. Unter stabilem Knorpel wird verstanden, dass keinerlei Zeichen einer Knochenbildung vorliegen, selbst nach längeren Zeitspannen.
Transformations-Wachstumsfaktor-beta ("TGF-β") bezeichnet eine Familie verwandter dimerer Proteine, die das Wachstum und die Differenzierung vieler Zelltypen regulieren. Mitglieder dieser Familie beinhalten TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, TGF-β5, morphogene Proteine ("MP") wie z.B. MP-121 und MP-52, Inhibine/Aktivine (wie offenbart z.B. in EP-A-222,491), osteogene Proteine ("OP"), Knochenmorphogenetische Proteine (hiernach bezeichnet als "BMP"), Wachstums/Differenzierungsfaktoren ("GDF"), wie z.B. GDF-1, GDF-3, GDF-9 und Nodal. TGF-β wurde zunächst im Hinblick auf seine Wirkungen auf die Zellproliferation charakterisiert. Es stimulierte das anchor-unabhängige Wachstum von Rattennieren-Fibroblasten und inhibierte auch das Wachstum von Affen-Nierenzellen. Es wurde gezeigt, dass TGF-β-Familienmitglieder viele unterschiedliche biologische Wirkungen zeigen, z.B. regulieren sie die Knochenbildung, induzieren Patten-Muskelzellen zur Produktion von knorpelspezifischen Makromolekülen, inhibieren das Wachstum früher hämatopoetischer Vorläuferzellen, T-Zellen, B-Zellen, Maus-Keratinozyten und etlicher menschlicher Krebszellinien. TGF- β-Familienmitglieder erhöhen die Synthese und Sekretion von Collagen und Fibronektin, beschleunigen die Heilung von Schnittwunden, unterdrücken die Caseinsynthese bei Maus-Brust-Explantaten, inhibieren die DNA-Synthese bei Rattenleber-Epithelzellen, stimulieren die Produktion von BFGF-Bindungs-Proteoglykanen, modulieren die Phosphorylierung des epidermalen Wachstumsfaktor ("EGF") -Rezeptors und die Proliferation von Epidermoid-Karzinomzellen und können zu einer Apoptose bei Gebärmutter-Epithelzellen, kultivierten Hepatozyten und sich rückbildender Leber führen. TGF-βs können eine Kardioprotektion gegen eine Reperfusionsverletzung durch Inhibition der neutrophilen Adhärenz an das Endothel vermitteln und schützen gegen experimentelle Autoimmunerkrankungen bei Mäusen. Insgesamt sind die Proteine der TGF-β-Familie multifunktionelle, hormonell aktive Wachstumsfaktoren und weisen auch verwandte biologische Aktivitäten auf, wie z.B. eine chemotaktische Attraktion von Zellen, eine Unterstützung der Zelldifferenzierung und gewebsinduzierende Fähigkeiten. Unterschiede in ihrer Struktur und in ihrer Affinität für Rezeptoren führen zu bemerkenswerten Variationen im Hinblick auf ihre exakte biologische Funktion.
Gegenüber den vorstehenden Berichten über die Fähigkeit von TGF-β zur Induktion der Erzeugung von Knorpel-spezifischen Makromolekülen in Muskelzellen und Chondrozyten wurde festgestellt, dass TGF-β synergistisch mit dem Fibroblasten-Wachstumsfaktor zur Inhibition der Synthese von Collagen-Typ-II durch Hühner Sternum-Chondrozyten und bei Ratten-Chondrozyten wirkt. Tatsächlich hat sich TGF-β als prototypischer Inhibitor der Proliferation der meisten normalen Zelltypen in vitro wie auch in vivo erwiesen und übt eine bemerkenswerte Diversität einer biologischen Aktivität aus. TGF-β 1 wurde aus menschlichen und Schweineblut-Thrombozyten gereinigt und rekombinantes TGF-β 1 ist zur Zeit erhältlich.
Innerhalb der Subfamilie von BMPs wurden die Strukturen von BMP-1 bis BMP-13 bereits früher erhellt. Die einzigartigen induktiven Aktivitäten dieser Proteine, zusammen mit ihrer Gegenwart im Knochen, legen nahe, dass sie wichtige Regulatoren von Knochen-Reparaturprozessen sind und an dem normalen Erhalt von Knochengewebe beteiligt sein könnten. Kürzlich wurde gezeigt, dass die BMP-12-verwandte Unterfamilie von Proteinen, einschließlich BMP-13 und MP52 (siehe z.B. WO93/16099 und US-Patent Nr. 5,658,882) in Zusammensetzungen für die Induktion von Sehnen/Ligament-ähnlicher Gewebsbildung und Reparatur geeignet sind. Das US-Patent Nr. 5,902,785 offenbart, dass BMP-12-verwandte Proteine insbesondere für die Induktion von Knorpelgewebe nützlich sind und dass BMP-9 für die Erhöhung der Proteoglykan-Matrix-Synthese und daher den Erhalt von Knorpelgewebe nützlich ist. Es beschreibt auch Zusammensetzungen, umfassend ein BMP-12-verwandtes Protein und zusätzlich beinhaltend ein oder mehr TGF-β-Proteine, die sich als osteogen erwiesen haben, vorzugsweise BMP-2, -4, -5, -6 und/oder BMP-7 als nützlich für die Regeneration von multiplen Gewebstypen (z.B. einer Grenzfläche oder Bindung zwischen Geweben) und insbesondere für die Behandlung von artikulärem Knorpel, worin die artikuläre Oberfläche, Knorpel, subchondraler Knochen und/oder "Tidemark"-Grenzfläche zwischen Knorpel und Knochen repariert werden müssen. Dasselbe Patent beschreibt weiterhin Zusammensetzungen, umfassend ein BMP-12-verwandtes Protein, zusammen mit einem Protein, das für den Erhalt von Chondrozyten oder Knorpelgewebe geeignet ist, wie z.B. BMP9, wobei diese Zusammensetzungen insbesondere für die Induktion und den Erhalt von Knorpelgewebe an einer Stelle, die einer Knorpelreparatur bedarf, wie z.B. an einem artikulären Knorpeldefekt, nützlich sind.
W096/14335 offenbart unter Verwendung einer mRNA, hergestellt von artikulärem Knorpel von Neugeborenen, die Isolierung von zwei Mitgliedern der BMP-Familie, bezeichnet als Knorpel abgeleitete morphogenetische Proteine-1 und -2 (CDMP-1, CDMP-2). Insbesondere offenbart W096/14335 einen gereinigten Knorpelextrakt, der eine lokali Knorpelbildung stimuliert, wenn er mit einer Matrix kombiniert und in einen Säuger implantiert wird, wobei der Extrakt durch den Erhalt von Knorpelgewebe, Homogenisieren des Knorpelgewebes in Gegenwart von chaotropen Agenzien unter solchen Bedingungen, die eine Abtrennung der Proteine aus Protoglykanen ermöglicht, Abtrennen der Proteine von den Proteoglykanen und Erhalt der Proteine erzeugt wird. Es offenbart auch ein isoliertes DNA-Molekül, kodierend ein Protein mit einer chondrogenen Aktivität in vivo, jedoch substanziell ohne osteogene in-vivo-Aktivität. Die Rolle von CDMP-1 als Regulator des Skelettwachstums ist nun gut dokumentiert. Storm et al. (1994) in Nature 368, 639-43 und Chang et al. (1994) in J. Biol. Chem. 269, 28227-34 etablierten unabhängig, dass CDMP-1 nahe an dem Brachypodismus locus auf Chromosom 2 bei Mäusen kartiert werden konnte und an dem Brachypodismus-Phänotyp beteiligt sein kann. Die Expressionsmuster von CDMP's legen auch eine wichtige Rolle für diese Gene in der Gelenk-Morphogenese nahe. W098/59035 offenbart auch ein Verfahren zum Erhalt eines knorpelartigen Phänotyps in Chondrozyten in vitro, umfassend das Kultivieren der Chondrozyten in serumfreiem Medium, enthaltend ein CDMP und/oder BMP. Tabelle 1 unten fasst die BMP-Superfamilienmitglieder bei Säugern zusammen (Reddi AH, Nature Biotechnol. 1998, 16: 247-52).
Tabelle 1
Andere Familien von Wachstumsfaktoren spielen offensichtlich eine Rolle bei der Knorpel-Differenzierung und ihrem Erhalt. Unter diesen sind die Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (FGFs) eine Familie von Polypeptid-Wachstumsfaktoren, die in einer Vielzahl von Aktivitäten involviert sind. Einer ihrer Rezeptoren, FGF-Rezeptor 3 (FGFR-3) (Keegan K. et al., 1991 Proc. Nat. Acad. Sci. 88: 1095-99) spielt bekanntlich eine Schlüsselrolle bei der Chondrogenese. Punktmutationen im fgfr3-Gen, die zu einem Liganden-unabhängigen konstitutiv aktiven Protein führen (was bedeutet, dass die FGF-Signalbildung auch in Abwesenheit des Liganden immer aktiv ist) führen zu Skelett-Abnormalitäten, wie einer Achondroplasie und einer thanatophoren Dysplasie.
Wie bereits oben ausgeführt, hat die autologe Chondrozyten-Transplantation ("ACT"), obwohl sie zu einer breit akzeptierten Technik zur Reparatur von Gelenkoberflächen-Defekten ("JSD") führt, immer noch etliche Nachteile. Im Detail impliziert dieses Verfahren eine in-vitro-Expansion – in Gegenwart von autologem Serum – von autologen Chondrozyten, erhalten aus einem nicht betroffenen Bereich der Gelenkoberfläche, gefolgt von einer Implantation der Chondrozyten-Suspension, unter einem Periostlappen vernäht, um den Gelenkoberflächen-Defekt zu versiegeln. Eine Zellexpansion ist notwendig, um aus einer kleinen Knorpel-Biopsie eine Anzahl von Zellen zu erhalten, die für die Reparatur des Knorpeldefekts ausreicht. Es ist jedoch, wie vorher erklärt, wohlbekannt, dass die in-vitro-Expansion von Chondrozyten zu einer Zell-De-Differenzierung führt. Dies legt nahe, dass die Chondrozyten-Expansion den Preis für den Verlust der phänotypischen Stabilität zahlt. Daher ist eine Qualitätskontrolle für expandierte Chondrozyten, die für eine ACT verwendet werden sollen, nötig. Am Ende der Zellexpansion besteht die Chondrozyten-Population aus einigen Zellen, die ihre phänotypische Stabilität beibehalten haben und anderen, die noch immer proliferieren können, jedoch nicht mehr zur Knorpelreparatur beitragen werden. Um eine konsistente Zellsuspension für ACT zu erhalten ist es wünschenswert, stabile Chondrozyten innerhalb der expandierten Zellpopulation zu selektieren. Chondrozyten sind Skelettzellen, die in der Lage sind, in anchor-unabhängigen Agarosekulturen zu wachsen. Die Fähigkeit von Chondrozyte zum Wachstum unter anchor-unabhängigen Bedingungen ist kritisch für diese Zellen zum Überleben und zum Organisieren von Knorpelgewebe, sobald sie als Zellsuspension für eine Reparatur von JSD injiziert wurden, ist jedoch vermutlich nicht das einzige nötige phänotypische Kennzeichen.
Daher besteht ein Bedarf auf dem Gebiet an einer Identifikation und Selektion einer einfach zugänglichen und expandierbaren Quelle pluripotenter skelettaler Vorläuferzellen. Es besteht ein Bedarf auf dem Gebiet zur Lösung der verschiedenen Probleme, die bei den bekannten Knorpel-Reparaturverfahren angetroffen werden. Es besteht auch ein Bedarf auf dem Gebiet zur Entwicklung von Reparaturtechniken für Bindegewebe einschließlich Knorpel, z.B. für medizinische Probleme, wie z.B. die rheumatoide Arthritis und die Osteoarthritis und ein lang gespürter Bedarf an einer Qualitätskontrolle für Chondrozyten-Populationen, die für solche Zwecke verwendet werden. Es gibt eine Anzahl von Vorschlägen im Stand der Technik, dass einige Mesenchym-Stammstellen spezifisch Knorpel ergeben könnten oder, falls nötig, andere Bindegewebe. Knochenmark enthält z.B. Populationen pluripotenter Mesenchym-Stammzellen mit einer Fähigkeit zur Differenzierung in einen breiten Bereich von Zelltypen der mesenchymalen, hämatopoetischen und Stroma-Zellinien. Es ist auch bekannt, dass in vitro kultivierte Mesenchym-Stammzellen zu einer Differenzierung in Knorpel oder Knochen in vivo und in vitro induziert werden können, abhängig von der Gewebsumgebung oder dem Kulturmedium, in das die Zellen platziert werden. Bis jetzt wurden jedoch nur sehr wenige gemeinsame Zellmarker oder Differenzierungsantigene identifiziert. Beispiele für solche Marker beinhalten Ly-6-Antigene für murine Osteoblasten (siehe Horowitz et al. (1994) in Endocrinology, 135, 1032-43) und CD34 für menschliche hämatopoetische Zelltypen. Andererseits ist es bekannt, dass das Periost und Knochenmark die gewöhnlichsten Quellen für Vorläuferzellen mit osteogenem Potenzial sind. Insbesondere wurde gezeigt, dass Zellen aus dem Knochenmark, wenn sie durch das Kulturverfahren von Friedenstein isoliert und expandiert wurden, Knochen, Knorpel und fibröses Gewebe bilden werden, wenn sie implantiert werden. Friedenstein gab jedoch in Calcif. Tiss. Int. (1995) 56(S):S 17 zu, dass Hindernisse, wie z. B. der Bedarf an einer Kultivierung über etliche Passagen und der Entwicklung eines Verfahrens zur Transplantation solcher Zellen überwunden werden müssen, bevor die klinische Nützlichkeit dieser Entdeckung bestätigt werden kann. Daher besteht ein Bedarf auf dem Gebiet für eine gute Identifizierung pluripotenter skelettaler Vorläuferzellen in einem breiten Bereich von einfach zugänglichen und expandierbaren Quellen. Diese Ziele und andere Zwecke werden durch die folgenden Aufgaben der vorliegenden Erfindung erreicht.
Zusammenfassung der Erfindung
Eine erste Ausgabe der vorliegenden Erfindung ist die Identifizierung und Charakterisierung von skelettaler Vorläuferzellen in einem breiten Bereich von einfach zugänglichen und expandierbaren Quellen. Einfach zugängliche Gewebe beinhalten unter anderem Periost, Knochenmark und die Synovialmembran. Die Lösung für dieses Problem gemäß der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von einem Satz molekularer Marker. Diese molekularen Marker können entweder positive Marker sein, die Vorläuferzellen anzeigen, die pluripotent sind oder negative Marker, die anzeigen, dass die Zellen sich differenziert haben und nicht mehr pluripotent sind. Die Abwesenheit eines negativem Markers kann als positiver Marker verwendet werden. Eine zweite Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung solcher skelettaler Vorläuferzellen und molekularer Marker für die Reparatur eines breiten Bereichs von Bindegeweben. Eine dritte Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung solcher skelettaler Vorläuferzellen als Quelle für Transformations-Wachstumsfaktoren ("TGF"), verbunden mit der phänotypischen Stabilität einer bestimmten Zellpopulation, die in einem bestimmten Differenzierungsweg involviert ist, wie z.B. Mitglieder der TGF-β-Familie, die positiv mit der phänotypischen Chondrozyten-Stabilität assoziiert sind. Eine vierte Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung solcher skelettaler Vorläuferzellen und molekularer Marker als Matrix, die Zellen bei tissue-engineering-Verfahren erzeugt. Eine fünfte Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Coimplantation von expandierten skelettalen Vorläuferzellen und Chondrozyten für eine in-vivo-Knorpelreparatur.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine schematische Darstellung der hierarchischen Kaskade von Zellen in den Differenzierungswegen.
2 ist ein Bild, das die skelettalen Vorläuferzellen zeigt, die CDMP-1 exprimieren.
3 zeigt, wie der Phänotyp von skelettalen Vorläuferzellen nicht von der Zellpassagenzahl oder dem Alter des Donors abhängt. Periost-abgeleitete Zellen bei P5 und P15 von vier Donoren mit unterschiedlichem Alter zeigen ein vergleichbares molekulares Profil, wie bewertet durch eine semiquantitative RT-PCR.
4 besteht aus zwei histologischen Bildern, die zeigen, dass skelettale Vorläuferzellen anchorunabhängig wachsen können und ihre phänotypische Stabilität in vivo beibehalten.
5 ist ein Bild, das zeigt, dass das aus einem Maus-Muskel gewonnene Implantat durch menschliche Zellen gebildet wird.
6 besteht aus Bildern, die demonstrieren, dass die chondrogene Differenzierung unabhängig vom Altern der Donoren erhalten wird,
7 zeigt histologische Bilder von aus menschlichen skelettalen Vorläuferzellen in vitro erhaltenem Knorpelgewebe.
8A–8F zeigen die histochemische und immunhistochemische Analyse von entweder unbehandelten (A, B, H) oder mit TGF-β-1 behandelten Mikromassen.
9 zeigt die Genexpressionsdynamik durch RT-PCR während der Chodrogenese in CDMP-1-markierten skelettalen Vorläuferzellen.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Bezeichnungen, die in dieser Offenbarung verwendet werden, sind wie folgt definiert:
Chondrozyten-Stabilität
Die Fähigkeit einer Zellsuspension (entweder von einem Knorpelgewebe oder von irgendeinem anderen Gewebe erhalten, das Zellen mit chondrogenem Potenzial enthält), um bei Injektion in einen nicht-menschlichen Säuger (in vivo), wie z.B. immundefizienten Mäusen in einem Zeitrahmen von 2–3 Wochen ein echtes (hyalines) Knorpelimplantat ohne Zeichen einer vaskulären Invasion oder einer endochondralen Knochenformation oder in vitro zu erzeugen.
Chondrogen
Die Fähigkeit, das Knorpelwachstum zu unterstützen oder zu stimulieren, wie angewandt auf Chondrozyten und auf Zellen, die sich in Chondrozyten differenzieren. Die Bezeichnung betrifft auch bestimmte Wachstumsfaktoren, wie z.B. TGF-β, die die Knorpel-Differenzierung unterstützen.
Co-Expression
Unter Co-Expression wird im Kontext der vorliegenden Erfindung verstanden, dass ein Faktor immer dann exprimiert wird, wenn ein anderer Faktor oder Marker in oder auf einer Zelle exprimiert wird. Wenn z.B. ein morphogenes Protein als Marker verwendet wird und insbesondere das Knorpelabgeleitete morphogene Protein CDMP-1 oder ein Homolog davon exprimiert wird/werden, benötigt die Co-Expression, dass ein co-exprimierter Marker nur vorliegt oder exprimiert wird, wenn der morphogene Marker exprimiert wird. Der Faktor ist daher mit demselben spezifischen postnatalen Differenzierungsweg wie das morphogene Protein, mit dem es co-exprimiert wird, wie z.B.CDMP-1, verbunden. Es wird vorzugsweise zusammen mit dem Marker auf- oder abreguliert. Es wird z.B. herabreguliert, wenn die Vorläuferzellen eine Differenzierung, wie z.B. zu dem chondrozytischen Phänotyp, durchlaufen. Ein solcher co-Expressionsmarher wird weiterhin vorzugsweise in detektierbaren Niveaus exprimiert. Ein solcher co-exprimierter Faktor kann ein erkennbarer Zelloberflächenmarker sein, nachweisbar über polyklonale oder monoklonale Antikörper und/oder spezifische Liganden. Der co-exprimierte Faktor kann auch jedes funktionelle oder strukturelle Homolog von CDMP-1 beinhalten.
Bindegewebe
Wie hier verwendet jede Zahl von Strukturgeweben im Körper eines Säugers, einschließlich Knochen, Knorpel, Ligamenten, Sehnen, Meniskus, Dermis, Hyperdermis und Gelenkkapsel.
Differenzierung
Ein biologischer Prozess, durch den primitive, nicht spezialisierte Zellen durch Zellteilungen zu Nachkommen mit spezialisierteren Funktion(en) werden. Terminale Differenzierung stellt eine hoch spezialisierte Zelle mit einzigartigen funktionellen, genetischen und phänotypischen Eigenschaften bereit.
Heterolog
Betrifft jedes Gen, Promotor, Polypeptid oder andere Molekül, das in einer Wildtyp-Version einer bestimmten Zelle nicht natürlich vorliegt, oder nicht nativ ist. Ein E. coli-β-Galactosidasegen wird z.B. als heterolog für eine menschliche Skelett-Vorläuferzelle betrachtet.
Mesenchymale Stammzelle
Ein primitiver Zelltyp mit einer Fähigkeit zur Selbstregeneration und zur Differenzierung durch eine Reihe von Zellinien zur Erzeugung von Nachkommenschaftszellen mit einer breiten phänotypischen Vielfältigkeit, einschließlich Bindegeweben, Knochenmarkstroma, Adipozyten, Dermis und Muskeln.
Marleerprotein
Ein Polypeptid, das eine Zelle (oder einen Satz von Zellen) von einer anderen Zelle (oder einem Satz von Zellen) in einer Population von Zellen unterscheidet. Ein Polypeptid, das z.B. auf der Oberfläche von skelettalen Vorläuferzellen, jedoch nicht auf anderen Zellen einer Zellpopulation exprimiert wird (entweder natürlich oder künstlich, z.B. durch Gentechnik eingeführt) dient als Markerprotein für die skelettalen Vorläuferzellen. Typischerweise ist das Markerprotein ein Zelloberflächenantigen ist, wie z.B. ein Wachstumshormonrezeptor, so dass Antikörper, die das Markerprotein binden, in Zellsortierungsverfahren verwendet werden können, um z.B. eine Population von Zellen zu produzieren, die für Zellen angereichert sind, die das Markerprotein exprimieren. Alternativ können intrazelluläre Proteine als Markerproteine verwendet werden. Fluoreszierende oder lumineszierende Proteine, wie z.B. grün fluoreszierendes Protein, z.B. Aequorin (GFP von Aequoria victoria) (Tanahashi et al (1990), Gene 96:249–255) kann z.B. als Markerprotein verwendet werden und kann die Zellsortierung erleichtern, z.B. durch FACS. Es können auch Enzyme verwendet werden, unter der Voraussetzung, dass die Aktivität des Enzyms nachgewiesen werden kann. β-Galactosidase ist z.B. gut zur Verwendung als Markerprotein geeignet; dieses Enzym kann durch Einführung eines Substrats (von Substraten) in die Zelle nachgewiesen werden, das ein fluoreszierendes Produkt (Produkte) bei Spaltung durch das Enzym freisetzt (erhältlich z.B. von Molecular Probes). Ein anderes geeignetes Enzym ist Catechol-2,3-dioxygenase, das von xylE von Pseudomonas putida kodiert wird (Domen et al (1986), Anal Biochem 155:379–384).
Operabel gebunden
Die Verbindung einer Kodierungssequenz und (einer) regulatorischen Sequenz (Sequenzen) (z.B. einem Promotor) auf derartige Weise, dass eine Genexpression möglich wird, wenn die geeigneten Moleküle (z.B. transkriptionale Aktivatorproteine) an die regulatorische Sequenz (Sequenzen) gebunden sind.
Osteogen
Die Fähigkeit, die Produktion von Knochen zu unterstützen oder zu erzeugen. Die Bezeichnung kann auf Osteoblasten angewendet werden, die die Fähigkeit zur Unterstützung des Knochenwachstums aufweisen oder auf Zellen, die selbst in der Lage sind, sich in Osteoblasten zu differenzieren. Die Bezeichnung würde auch auf Wachstumsfaktoren angewandt werden, die die Fähigkeit zur Unterstützung des Knochenwachstums aufweisen.
Phänotypische Stabilität
Erhalt der Fähigkeit von jeder Zelle, in vivo oder in vitro die Struktur eines spezifischen Gewebes zu organisieren oder wieder zu organisieren, entweder des ursprünglichen Gewebes, aus dem die Zellen genommen wurden oder eines anderen Gewebes, das die Zellen unter spezifischen Bedingungen gezwungen werden, zu bilden.
Vorläuferzelle
Eine Zelle mit der Fähigkeit, eine Differenzierung zur Leistung einer spezifischen Funktion zu durchlaufen.
Promotor
Eine Nukleotidsequenz, die genügt, um eine Transkription einer Kodierungssequenz zu dirigieren und/oder zu regulieren. Eingeschlossen innerhalb der Erfindung sind diejenigen Promotoren, die durch externe Signale oder Mittel induzierbar sind; solche Elemente können in den 5'- oder 3'-nicht-translatierten Bereichen (UTR) und den Introns des nativen Gens lokalisiert sein. Ein "CDMP-3-Promotor" ist jede Sequenz in cis-Stellung, die ausreicht, um die Expression von CDMP-1 in skelettalen Vorläuferzellen zu dirigieren und/oder zu regulieren. Es wird anerkannt, dass in genetischen Konstrukten, die einen CDMP-1-Promotor enthalten (z.B. denjenigen Konstrukten, die auch ein Reportergen enthalten oder ein Gen, kodierend ein Markerprotein), geringe Abweichungen (z.B. Deletionen, Punktmutationen und ähnliches) in der Sequenz des CDMP-1-Promotors durchgeführt werden können, ohne seine Fähigkeit in den skelettalen Vorläuferzellen und nicht in anderen Chondrozyten aktiv zu sein, nachteilig zu beeinflussen. Daher sind CDMP-1-Promotoren, die solche geringfügige Variationen aufweisen ohne die Spezifität des Promotors für skelettale Vorläuferzellen nachteilig zu beeinflussen, durch die Bezeichnung "CDMP-1-Promotor" umfasst. Zusätzlich können multiple Kopien des CDMP-1-Promotors, die in Tandem angeordnet sind, verwendet werden, um die Genexpression zu dirigieren.
Relevant
Relevant bezeichnet im vorliegenden Kontext die Tatsache, dass das zur Identifizierung von skelettalen Vorläuferzellen verwendete Genprodukt ein Produkt sein muss, das mit dem postnatalen Skelettweg verbunden ist, wie in dem Fall von CDMP-1.
Reportergen
Jedes Gen, für das eine Expression überwacht werden kann. Allgemein verwendete Reportergene beinhalten, z.B. Gene, die die Chloramphenicol-Acetyltransferase, die alkalische Phosphatase, die Luciferase und grün fluoreszierendes Protein kodieren.
Skelett-Vorläuferzelle
Eine Zelle, die nicht mehr undifferenziert ist, sondern bereits in Richtung auf einen Differenzierungsweg des Skelettgewebes festgelegt ist. Die Zelle ist immer noch pluripotent und kann sich in irgendeines der Bindegewebe oder eine Untergruppe davon differenzieren.
Skelettgewebe
Skelettgewebe beinhalten Zähne, Knochen, Knorpel, Meniskus, Ligamente, Intervertebralscheiben und Muskelgewebe.
Stabiler Knorpel
Knorpel, der sich nicht schließlich in Knochen umwandelt, d.h. Knorpel, der frei ist von irgendwelchen Zeichen einer Vaskularisierung. Im Gegensatz zu dem stabilen Knorpel wird transienter Knorpel am Ende Knochengewebe werden. Im Kontext der vorliegenden Erfindung wird Knorpel als stabil betrachtet, wenn selbst nach z.B. sieben Wochen alle Zeichen einer Knochenbildung abwesend sind.
Stammzelle
Pluripotente Vorläuferzelle mit der Fähigkeit, sich selbst zu erneuern und eine Vielzahl von differenzierten Zelltypen zu erzeugen. Echte Stammzellen können sich unbegrenzt teilen. Unter embryogenen Stammzellen werden die pluripotenten Zellen mit normalem Karyotyp verstanden, abgeleitet von einer inneren Zellmasse eines Säugers oder einem Blastozyst.
Detaillierte Beschreibung
Die vorliegende Erfindung wird im wesentlichen unter Bezugnahme auf skelettale Vorläuferzellen beschrieben, jedoch ist die Erfindung nicht hierauf begrenzt. Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung embryonaler Marker, die identifizieren, dass bestimmte Vorläuferzellen in einen postnatalen Differenzierungsweg eingetreten sind. Es wird angenommen, dass die vorliegende Erfindung nicht auf irgendeinen Zelltyp festgelegt ist, unter der Voraussetzung, dass diese mit Organismen mit differenziert Zellen assoziiert sind. Beispiele sind Tiere, insbesondere Säuger. Die vorliegende Erfindung ist insbesondere im Hinblick auf Säuger-Vorläuferzellen geeignet, insbesondere skelettale Vorläuferzellen, noch genauer skelettale Vorläuferzellen von Menschen und Pferden, jedoch nicht darauf begrenzt. Die vorliegende Erfindung bedient sich tellembryonaler Marker, von denen angenommen wird, dass sie auf allen differenzierten Zellen oder Vorläuferzellen solcher differenzierter Zellen in jeder differenzierten Lebensform zur Verfügung stehen oder in diesen vorliegen. Solche embryonalen Marker werden als notwendiger Teil eines notwendigen Teils der Embryogenese betrachtet oder als damit assoziiert angesehen, da der wachsende Organismus während der Differenzierung ebenfalls eine Notwendigkeit zur Identifizierung differenzierter oder teilweise differenzierter Zellen hat und dies biochemisch erreichen muss. Daher hat die vorliegende Erfindung eine breite Anwendung.
Die vorliegende Erfindung basiert auf überraschenden Entdeckungen, die eine allgemeine Relevanz für die Entwicklung aller differenzierten Lebensformen, insbesondere von Säugern, wie Menschen oder Pferden, haben.
Zunächst können pluripotente menschliche skelettale Vorläuferzellen in verlässlicher Weise durch einen Satz molekularer Marker identifiziert werden. Die Marker können sowohl positiv sein und damit die Gegenwart pluripotenter Vorläuferzellen angeben oder negativ, und damit Zellen anzeigen, die differenziert sind und nicht mehr Vorläuferzellen darstellen. Die Abwesenheit eines negativen Markers kann ein positiver Marker sein. Insbesondere beinhaltet die vorliegende Erfindung Zellen mit einer Abwesenheit eines negativen Markers, wie z.B. FGFR3, kombiniert mit der Gegenwart eines positiven Markers. Zweitens sind solche skelettale Vorläuferzellen unter konsistenten und geeigneten Bedingungen in der Läge, verschiedene Bindegewebe, einschließlich Knorpel, zu erzeugen und zu reparieren, wenn sie entweder allein oder in Assoziation mit Chondrozyten verwendet werden. Und drittens können solche skelettale Vorläuferzellen induziert werden, um Gene zu exprimieren, die mit spezifischen Geweben verbunden sind.
Es werden Beweise dargelegt, dass die Expression von CDMP-1 eine bestimmte Kultur- expandierte Zellpopulation als skelettale Vorläuferzellen qualifiziert. Dies ist ein unerwartetes Ergebnis, da es immer bekannt war, dass CDMP-1 die chondrogene Differenzierung unterstützt und dieses nie mit dem Phänotyp von skelettalen Vorläuferzellen verbunden war. Unabhängig von der Quelle werden die Zellen in Kultur expandiert und durch RT-PCR-Analyse im Hinblick auf die Expression von CDMP-1 bewertet. Nur die CDMP-1 exprimierenden Zellen können erfolgreich verarbeitet werden, um zu einem spezifischen Differenzierungsweg von jedem Skelett-Bindegewebe aus gerichtet zu werden, einschließlich dem Knorpel. Interessant ist, wann immer eine Skelett-Vorläuferzelle, wie definiert durch die Expression in RT-PCR von CDMP-1, eine Differenzierung zu einem chondrozytischen Phänotyp durchläuft, geht dem Eintritt in einen spezifischen Differenzierungsweg immer die Herabregulierung der Expression von CDMP-1 voran.
Eine erste Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht aus der Verwendung von Knorpel-abgeleitetem morphogenem Protein CDMP-1 oder einem Transformations-Wachstumsfaktor mit mindestens 80 % Homologie zu CDMP-1 als positivem Marker von skelettalen Vorläuferzellen von jedem Teil eines Säugerkörpers oder die Verwendung eines Faktors oder Markers, der mit CDMP-1 co-exprimiert oder co-nachweisbar ist. Anders ausgedrückt wird, unabhängig von der Quelle der Zellen, CDMP-1 oder ein Homolog davon oder ein co-exprimierter Marker oder Faktor selektiv durch skelettale Vorläuferzellen exprimiert und wird herabreguliert, sobald die Skelett-Vorläuferzelle einen Differenzierungsschritt zu irgendeiner reifen Zellinie durchläuft. Wenn z.B. skelettale Vorläuferzellen in die Chondrozyten differenzieren, geht der Expression von Knorpelmarkern, wie z.B. Typ-II-Collagen, FGFR3, Typ-IX-Collagen oder Typ-XI-Collagen immer das Verschwinden von CDMP-1 voran, Marker, wie z.B. FGFR3, Typ-II-Collagen, Typ-IX-Collagen oder Typ-XI-Collagen oder Marker oder Faktoren, die mit diesen Markern co-exprimiert werden oder co-detektierbar sind, sind negative Marker. Relevante Genprodukte, die mit CDMP-1 oder einem CDMP-1-verwandten Gen co-exprimiert werden, können gemäß der vorliegenden Erfindung zur positiven Identifikation von skelettalen Vorläuferzellen innerhalb einer Referenzpopulation verwendet werden. Die Abwesenheit eines negativen Markers kann als positiver Macker gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Diese erste Ausführungsform basiert auf der Charakterisierung von menschlichen skelettalen Vorläuferzellen von Donoren mit unterschiedlichem Alter (im Bereich von 9 bis 95 Jahre) über eine große Anzahl von Passagen durch molekulare Marker. Unter Verwendung der Reversen Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion ("RT-PCR") -Analyse wurde beobachtet, dass skelettale Vorläuferzellen über serielle Passagen phänotypisch stabil sind, ihren Phänotyp und ihr Potenzial für die Differenzierung selbst nach einem Einfrieren in flüssigem Stickstoff für 18 Monate beibehalten. Die Identifizierung von CDMP-1-positiven Zellen kann auf dem DNA, RNA oder Proteinniveau geschehen, direkt über das Gen und Genprodukte von CDMP-1 oder indirekt über funktionelle Homologe oder über Faktoren oder Macker, die mit CDMP-1 co-exprimiert werden.
Eine zweite Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht aus der weiteren Verwendung von Reagenzien, Liganden und/oder Antikörpern, die spezifische Faktoren erkennen, die mit den in Frage stehenden morphogenen Proteinen co-exprimiert werden, wie Zell-Oberflächen-Marker. Solche Marker können für das Sortieren eines heterogenen Säugerzellpools, Skelett-Vorläuferzell-Subpopulation, für die weitere Verarbeitung durch geeignete Behandlung, wie eine weitere Differenzierung entlang einer spezifischen Zellinie, z.B.
Differenzierung in Chondrozyten und vorzugsweise stabile Chondrozyten verwendet werden. Das Zellsortieren basiert auf der Verwendung autologer oder heterologer Markerproteine. Das heterologe Markerprotein kann von viralem, prokaryontischem, eukaryontischem oder synthetischem Ursprung sein. Das Markerprotein kann ein Marker sein, der, wenn er exprimiert wird, zu einem bevorzugten Überleben von Zellen führt, die den Marker exprimieren, wobei eine Antibiotika-Resistenz ein solches Beispiel ist. Der selektierbare Marker kann auch ein Marker sein, dessen Expression zu einer bevorzugten Abtötung von Zellen führt, die den Marker exprimieren. In diesem Fall wird der Marker in anderen Zellen als den skelettalen Vorläuferzellen exprimiert. Typischerweise ist das Markerprotein jedoch ein Polypeptid, das auf der Zelloberfläche exprimiert wird. Beispiele für geeignete Markerproteine beinhalten CD8, β-Galactosidase, Catechol-2,3-dioxygenase, Aequorin (grün fluoreszierendes Protein von Aequorea victoria) und Influenzavirus Hämagglutinin. Die Gene, die diese und andere geeignete Markerproteine kodieren, sind auf dem Gebiet bekannt. Konventionelle Zellsortierungsverfahren (z.B. Fluoreszenz-aktiviertes Zellsortieren (FACS)) können verwendet werden, um jene Zellen zu isolieren, worin die Zelloberflächenmarker, co-nachweisbar mit CDMP-1 oder einem Homolog davon, exprimiert werden. Dann wird ein Fluoreszenz-markierter Antikörper verwendet, um spezifisch ein Zelloberflächen-Polypeptid zu binden, das als heterologer Marker verwendet wird. Alternativ kann ein nichtmarkierter Antikörper verwendet werden, um das Zelloberflächen-Polypeptid spezifisch zu binden und ein zweiter markierter Antikörper kann verwendet werden, um den ersten Antikörper spezifisch zu binden. Die Fluoreszenzmarkierten Vorläuferzellen können dann von anderen Zellen in der Probe, z.B. durch FACS, sortiert werden. Andere Techniken, wie z. B. die Verwendung Protein-konjugierter magnetischer Kügelchen, die selektiv bestimmte Zellen binden, können ebenfalls verwendet werden. Geeignete Kits sind kommerziell erhältlich. Allgemein verwenden solche Kits einen markierten Antikörper (z.B. einen Biotin-markierten Antikörper), um das Zelloberflächen-Markerprotein zu binden. Diese Antikörper-gebundenen Zellen werden mit dem magnetische Kügelchen-Proteinkonjugat kontaktiert, wobei der Proteinanteil des Kügelchen-Proteinkonjugats den markierten Antikörper spezifisch bindet. Zum Beispiel kann ein Streptavidin-magnetisches Kügelchen-Konjugat verwendet werden, um den Biotin-markierten Antikörper zu binden, um einen Komplex zu produzieren, der das magnetischen Kügelchen-Protein-Konjugat, den markierten Antikörper und die Zelle, die das Markerprotein exprimiert, enthält. Solche Komplexe können von anderen Zellen durch temporäre Anhaftung des Komplexes an einen Magneten und Abtrennung der angehafteten Zellen von anderen Zellen getrennt werden (d.h., eine Population von Zellen, denen z.B. skelettale Vorläuferzellen fehlen). Magnetische Kügelchen, die kovalent an einen sekundären Antikörper gekoppelt sind, sind kommerziell erhältlich. Andere, auf Antikörpern basierende Verfahren zum Sortieren von Zellen, wie z.B. der Verwendung einer Affinitätschromatographie oder den Rückhalt von Zellen, die bestimmte Zolloberflächen-Proteine exprimieren, über Petri-Schalen, beschichtet mit Antikörpern, die gegen die letzteren gerichtet sind, sind ebenfalls auf dem Gebiet bekannt und können in der Erfindung verwendet werden. Ein nützliches, kommerziell erhältliches Affinitäts-Zellseparations-Kit "CEPRATE LC" kann von CellPro (CellPro, Inc. Bothell, WA 98021) erhalten werden. Verfahren zum Anzüchten von IgM- oder IgG-Antikörpern sind auf dem Gebiet wohlbekannt und werden z.B. beschrieben in Ausubel et al (Herausgeber), Short Protocols in Molecular Biology, 4. Auflage, John Wiley & Sons, New York, und insbesondere den Einheiten 11.3, 11.4 und 11.5; in Paul (Herausgeber), Fundamental Immunology, 4. Auflage, Lippincott-Raven Publishers, New York, und insbesondere Kapitel 4, Seite 101 ef; de St, Groth und Scheidegger (1980), J immunol Methods 35:1–21; French et al (1986), Immunol Today 7:344–346; Langone und Vunakis (1986), Methods in Enzymology, Band 121, Immunochemical Techniques.
Teil I, Hybridoma technology and monoclonal antibodies, Orlando: Academic Press; Hammerling et al (1981), Monoclonal antibodies and T-cell hybridomas. Perspectives and technical advances, Amsterdam: Elsevier/Nord-Holland Biomedical Press; Yokoyama (1995) In Coligan et al (Herausgeber), Current protocols in immunology, Wiley & Sons, New York, 2.5.1-2.2.17; Kohler und Milstein (1975), Nature 256: 495–497. Es ist auch möglich, skelettale Vorläuferzellen über Reportergene unter der Kontrolle eines Promotors zu selektieren, der nur in den Vorläuferzellen exprimiert wird oder auch andererseits in allen Zellen, jedoch nicht den betrachteten Vorläuferzellen. Solche Reporterkonstrukte können z.B. verwendet werden, um z.B. sicherzustellen, ob Zellen mit einem bestimmten aktiven Promotor die gewünschten Eigenschaften besitzen. Ein genetisches Konstrukt (Reporterkonstrukt) kann daher in die Referenz-Population der Zellen eingeführt werden. Das genetische Konstrukt beinhaltet dann z.B. einen CDMP-1-Promotor, der operabel an ein Gen gebunden ist, das ein Markerprotein kodiert. Das Markerprotein ist ein Protein, das zu den Wildtypzellen der Referenzpopulation heterolog ist und das vorzugsweise in der Wildtyp-Referenz-Population nicht exprimiert wird und insbesondere den skelettalen Vorläuferzellen. Zellen, die das Markerprotein exprimieren (d.h. Zellen, in denen der CMDP-1-Promotor aktiv ist) werden dann isoliert, um eine Population an Zellen zu erzeugen, die im Hinblick auf chondrogene skelettale Vorläuferzellen angereichert ist. Durch Entfernung der CDMP-1-exprimierenden Zellen aus der Zellpopulation kann dieses Verfahren natürlich verwendet werden, um eine Population von Zellen zu erzeugen, denen die chondrogenen skelettale Vorläuferzellen fehlen. Verfahren zur Herstellung des Reporter-Konstrukts und zur Einführung desselben in die Referenzpopulation sind auf dem Gebiet bekannt. Es können z.B. Zellen; die aus dem Periost, der Synovialmembran oder dem Knochenmark erhalten wurden, mit einem Plasmid transduziert werden, worin die Expression der konventionellen dominanten, selektierbaren Marker, wie z.B. denjenigen, die eine Resistenz gegenüber Antibiotika verleihen, z.B. Neomycinphosphotransferase, von lumineszenten oder fluoreszenten oder Proteinen, wie Luciferase oder grün fluoreszierendem Protein (z.B. Aequorin), andere nachweisbare Enzyme, wie z.B. β-Glucuronidase oder von Zelloberflächen-Proteinen wie CD8 unter die Kontrolle des menschlichen CDMP-1-Promotors gebracht wird. Ein putativer Promotor von CDMP-1 ist in Sugiura T. et al, Biochem Biophys Res Comm 1999,263:707-13 offenbart. Zusätzlich wurden BAC-Klone, isoliert aus dem Maus-CDMP-1 (GDF-5) -Lokus durch homologe Rekombination in Bakterien modifiziert. Die resultierenden Konstrukte trieben die Expression der exogenen Reportergene bei der Entwicklung von transgenen Mäusen an, Rountree R. et al. International Conference on Bone Morphogenetic Proteins, 7. bis 11. Juni 2000. Die Menge an G418, die die nichttransformierten Zellen töten würde, variiert abhängig von den spezifischen Eigenschaften der verwendeten Zellen. Im allgemeinen liegt die Konzentration zwischen 100 und 1.000 μg/ml aktivem G418.
Geeignete Selektionsverfahren sind auf dem Gebiet wohlbekannt. Solche Selektions- oder Anreicherungsprotokolle werden die unangenehme Eventualität anderer kontaminierender Gewebe, die sich aus einem Pool von skelettalen Vorläuferzellen ergeben, vermeiden. Sobald sie angereichert sind, können diese Zellen in jede Richtung irgendeines Differenzierungsweges, wie z.B. dem chondrogenen Weg, gerichtet werden, indem sie unter konsistenten und geeigneten Bedingungen mit oder ohne morphogene/Wachstumsfaktoren kultiviert werden, um in einer homogenen Zellpopulation zu münden, wie z.B. Chondrozyten mit einer phänotypischen Stabilität. Insbesondere zeigt die vorliegende Erfindung, dass das Periost, Knochenmark und die Synovialmembran CDMP-1-exprimierende skelettale Vorläuferzellen enthalten, die unter Verwendung geeigneter Kulturbedingungen in Richtung einer Chondrogenese gerichtet werden können. Im Gegensatz zu den vorherigen Studien von Nakahara et al. (1991), J. Orthop.
Res. 9:465-76 zeigt die vorliegende Erfindung, das unabhängig vom Alter des Donors die menschlichen skelettalen Vorläuferzellen einfach zugänglich und expandierbar sind und konsistent zur Differenzierung zu Chondrozyten induziert werden können.
Eine dritte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der positiv markierten, z.B. CDMP-1-markierten skelettalen Vorläuferzellen zur Erzeugung oder Reparatur von Bindegewebe im allgemeinen, einschließlich Trachea, Herzventile, Stimmbändern und ähnlichem. Diese weitere Verwendung basiert auf der Fähigkeit solcher skelettaler Vorläuferzellen, das intrinsische Potenzial einer Multi-Zellinien-Differenzierung beizubehalten, was sie zu guten Kandidaten für tissue-engineering-Protokolle macht. Die Isolierung, Expansion und Sortierung von Zellpopulationen unter Verwendung der spezifischen Marker der Erfindung führt zu einem geeigneten Zellpool, der für solche Reparaturverfahren geeignet ist. Insbesondere wurden unter Verwendung von positiv markierten, z.B. CDMP-1-markierten, skelettalen Vorläuferzellen geeignete Kulturbedingungen entwickelt, die zu der Induktion und Bildung von Knorpel in vitro führten. Bei der vorliegenden Erfindung wird unter anderem die Bildung von "stabilem Knorpel" angedacht. Stabiler Knorpel in vivo ist z.B. aus jungem Periost abgeleiteten Zellen (PDCs) erhältlich. Unter jungen PDCs wird verstanden, dass die Zellen von Individuen abstammen, die jünger sind als 20 Jahre, insbesondere jünger als 16 und besonders jünger als 10. Es ist wichtig festzuhalten, dass die Behandlung von skelettalen Vorläuferzellen in einer Monolayerkultur mit verschiedenen Wachstumsfaktoren nicht zu irgendeiner Reaktion im Hinblick auf die Osteogenese und/oder Chondrogenese führte, wie bewertet durch RT-PCR-Analyse im Hinblick auf Knochen und Knorpelmarker, durch Elsass Blau und von Kossa-Färbung und durch die alkalische Phosphatase-Aktivität. Für eine erfolgreiche Induktion von Knorpel scheint es notwendig, CDMP-1-markierte skelettale Vorläuferzellen mit sehr hoher Zelldichte zu kultivieren, z. B, eine Zelldichte von mindestens 10⁵ Zellen/ml und vorzugsweise in der sogenannten Mikromasse-Kultur mit einer Zelldichte von ungefähr 2 × 10⁷ Zellen/ml. Für eine erfolgreiche Induktion von Bindegewebe ist es weiterhin ratsam, einen Faktor, der die Differenzierung der skelettalen Vorläuferzellen in die Art des Bindegewebes, die erzeugt oder repariert werden soll, zuzufügen (in vitro) oder zu verabreichen (in vivo), z.B. einen transformierenden Wachstumsfaktor-β, wie z.B. TGF-β 1, TGF-β 2 oder TGF-β 3, vorzugsweise in einer Rate von ungefähr 10 ng/ml in einem chemisch definierten serumfreien Medium, zu oder zusammen mit den kulturexpandierten CDMP-1-markierten skelettalen Vorläuferzellen. Menschliche PDCs von jungen Donoren zeigen z.B. eine spontane chondrogene Aktivität, jedoch war die Induktion einer chondrogenen Reaktion bei älteren Zellen durch Kombination von Mikromasse-Kulturen mit z.B. TFG-β 1-Behandlung, unabhängig von der Anzahl der Zellpassagen oder dem Alter der überprüften Donoren möglich.
Eine vierte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von positiv, z.B. CDMP-1-markierten skelettalen Vorläuferzellen als Quelle für Wachstumsfaktoren, insbesondere Transformations-Wachstumsfaktoren-β ("TGF-β") und Knochen-morphogenen Proteinen (BMP"), von denen bekannt ist, dass sie für die Stimulierung und den Erhalt des Knorpel-Phänotyps wichtig sind. Dies kann z.B. der Chondrozyten-in-vitro-Expansion helfen, indem es die Chondrozyten an einer Dedifferenzierung über serielle Passagen hindert. Dies kann für die in-vitro-Expansionsverfahren menschlicher Chondrozyten für die Transplantation unter Verwendung eines Mediums, abgeleitet von autologen skelettalen Vorläuferzellen, nützlich sein.
Eine fünfte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von positiv markierten, z.B. CDMP-1-markierten skelettalen Vorläuferzellen als Matrix erzeugende Zellen.
Gemäß dieser Ausführungsform sind menschliche skelettale Vorläuferzellen, behandelt mit geeigneten Wachstumsfaktoren (wie in der oben beschriebenen dritten Ausführungsform) in der Lage, eine extrazelluläre Matrix zu erzeugen, die an hyalinen Knorpel erinnert. Die behandelten Zellen können daher als Matrixzufuhr für die Anhaftung und das Wachstum von Chondrozyten in Gelenkoberflächendefekten ("JSD") -Reparaturen verwendet werden und für tissue-engineering Verfahren des Knorpelskeletts im allgemeinen, z.B. für die Behandlung einer subglottischen Stenose, Tracheopathia, Chondropathia patellae, Osteoarthritis und traumatischen Läsionen, z.B. unter Verwendung bioresorbierbarer Polymere (wie z.B. Polymilchsäure oder Polyglykolsäure), die lokal angewendet werden, um die Läsion aufzufüllen. Bei einer solchen Verwendung stellen die behandelten Zellen einen geeigneten Träger für die Anhaftung und das Zellwachstum bereit, unter Umständen beschichtet oder vermischt mit Wachstumsfaktoren. Solche Kombinationen von Zellen, Polymermatrizes und Wachstumsfaktoren werden auch bei der orthopädischen rekonstruktiven Chirurgie geeignet sein. Eine Alternative für diese Ausführungsform ist ein Verfahren zur Verbesserung der Implantation einer prosthetischen Vorrichtung in einem Bindegewebe, umfassend den Schritt der Implantation einer Prothesevorrichtung mit skelettalen Vorläuferzellen, die daran angehaftet sind, unter geeigneten Bedingungen für eine Differenzierung der Zellen in das gewünschte Bindegewebe.
Eine sechste Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Co-Implantation positiv markierter, z.B. CDMP-1-markierter skelettaler Vorläuferzellen und Chondrozyten für die JSD-Reparatur und tissue engineering Verfahren des Knorpelskeletts im allgemeinen. Diese Ausführungsform basiert auf der überraschenden Beobachtung, dass die Zugabe von expandierten skelettalen Vorlauferzellen zu einer Chondrozyten-Suspension für die Knorpelreparatur eine dramatische Wirkung auf die Fähigkeit der Knorpelbildung durch Chondrozyten sowohl in vitro als auch in vivo aufweist. Diese Co-Implantation ist in der Lage, die Anzahl von benötigten Chondrozyten für eine erfolgreiche JSD-Reparatur substanziell zu reduzieren und führt auch zu einer deutlichen Erhöhung der erzeugten Knorpelmenge. Diese Beobachtungen können es uns erlauben, frisch isolierte Chondrozyten oder nur minimal expandierte Chondrozyten zu verwenden anstelle der beeinträchtigten in-vitro-expandierten chondrozytischen Zellen und dadurch das Problem zu umgehen, das mit dem Verlust einer Knorpel bildenden Fähigkeit von Chondrozyten, die sich aus einer in-vitro-Expansion ergibt, zu umgehen. Wie auf dem Gebiet wohlbekannt, ist die in-vitro-Zellexpansion tatsächlich ein kritischer Step bei der autologen Chondrozyten-Transplantation und kann die Wirksamkeit der injizierten Zellen für die Erzeugung von Knorpel behindern.
Zusätzlich zu den vielzähligen vorher zitierten Verwendungen haben die positiv markierten, z.B. CDMP-1-markierten skelettierten Vorläuferzellen der vorliegenden Erfindung den Vorteil, dass sie für bis zu mindestens 18 Monate in Zellbanken unter Lagerbedingungen, einschließlich einer Lagertemperatur unterhalb von –100°C, z.B. in flüssigem Stickstoff und im Fall der Notwendigkeit aufgetaut, in geeigneter Weise behandelt und in dasselbe Individuum an einer Stelle implantiert werden können, an der neues Bindegewebe gewünscht wird. Trypsin-freigesetzte PDC-Kulturen wurden z.B. in flüssigem Stickstoff in DMEM mit 20 % FBS und 10 % Dimethylsulfoxid (DMSO; Sigma) kryokonserviert. Diese Lagerstabilität von Vorläuferzellen ist überraschend, da andere Zellen, einschließlich Chondrozyten, ihren Phänotyp verlieren, wenn sie selbst für eine kurze Zeitspanne unter denselben Bedingungen gelagert werden.
Die positiv markierten, z.B. CDMP-1-markierten skelettalen Vorläuferzellen können auch für die heterologe Transplantation in Fällen von HLA (menschlichen Leukozyten-Antigen) -Kompatibilität oder für Gewebe, bei denen das Risiko einer Abstoßung minimal ist, und einfach pharmazeutisch verhindert werden kann, verwendet werden.
Positiv markierte gellen gemäß der vorliegenden Erfindung können auch die Abwesenheit eines negativen Markers zeigen. Die oben beschriebenen Zellsortierungsverfahren können zur Produktion von im wesentlichen reinen Vorläuferzellen verwendet werden.
Ein vollständigeres Verständnis der vorliegenden Erfindung wird durch Bezugnahme auf die folgenden illustrativen Beispiele erhalten werden.
Beispiel 1 – Isolierung von skelettalen Vorläuferzellen aus dem Periost, der Synovialmembran und dem Knochenmark
Periost von menschlichen Donoren mit verschiedenem Alter wurde aseptisch aus der proximalen medialen Tibia geerntet, entweder innerhalb von 12 bis 24 Stunden nach dem Tod oder von Patienten, die einer chirurgischen Knie-Ersatz-Operation unterzogen wurden. Das Periost wurde zweimal mit Hank's balancierter Salzlösung ("HBSS") gespült, erhältlich von Life Technologies, supplementiert mit antibiotischerantimykotischer Lösung (100 Einheiten/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 0,25 μg/ml Amphotericin B, ebenfalls erhältlich von Life Technologies), fein zerkleinert und mit 0,2 % Collagenase (Life Technologies) in hochglulcosehaltigem Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium ("DMEM") (Life Technologies), enthaltend 10%iges fötales Rinderserum (FBS) (erhältlich von BioWhittaker) und Antibiotika verdaut. Nach einer Inkubation bei 37°C über Nacht wurden die Periostzellen durch Zentrifugation gesammelt, zweimal gewaschen, in hoch-glukosehaltigem DMEM, supplementiert mit 10 % FBS und Antibiotika resuspendiert, in einem T25-Kulturkolben plattiert und man ließ sie für 4 Tage anhaften. Nach dieser Zeitspanne wurden nicht anhaftende Zellen durch Änderung des Mediums entfernt.
Synovial-Membranen von menschlichen Donoren mit verschiedenem Alter wurden aseptisch aus den Kniegelenken innerhalb von 24 Stunden nach dem Tod geerntet und folgend demselben Protokoll wie oben für das Periost, verarbeitet.
Heparin-behandelte Knochenmarkproben von menschlichen Donoren mit verschiedenem Alter wurden mit HBSS verdünnt, auf Lymphoprep (1,077 g/ml, erhältlich von Nycomed, Oslo) geschichtet und bei 300 × g für 20 Minuten zentrifugiert. Zellen aus der Gradienten-Grenzfläche wurden gesammelt, dreimal in HBSS gewaschen und im Medium für die Kultur resuspendiert.
Beispiel 2 – In-vitro-Zellexpansion
Zellen, die gemäß Beispiel 1 isoliert wurden, wurden in Monolayer in hoch-glukosehaltigem DMEM, enthaltend 10 % FBS und Antibiotika, bei 37°C in 95 % angefeuchteter Luft und 5 CO₂ kultiviert und das Medium wurde alle 3 Tage ersetzt. Nach 10 bis 20 Tagen einer Primärkultur, wenn die kaum angehafteten Zellen eine Konfluenz erreichten, wurden sie zweimal mit Calcium- und Magnesium-freier phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und durch Behandlung mit Trypsin-EDTA (0,25 % Trypsin, 1 mM EDTA; Life Technologies) geerntet und durch eine 1:4-Verdünnung für die erste Subkultur wiederum ausplattiert. Die Zellpassagen wurde auf dieselbe Weise mit einer 1:4-Verünnung alle 6 bis 12 Tage und noch bevorzugter alle 7 bis 8 Tage, wenn die Zellen eine Konfluenz erreichten, fortgesetzt.
Beispiel 3 – CDMP-1 als Marker für skelettale Vorläuferzellen
Zellen, die wie in Beispiel 1 aus Periost, Synovialmembran und Knochenmark isoliert wurden und wie in Beispiel 2 beschrieben, expandiert wurden, wurden nach unterschiedlichen Passagen durch RT-PCR-Analyse, wie hiernach beschrieben, zusammen mit anderen Zellen charakterisiert, wie z.B. menschlichen Haut-Fibroblasten. Es wurde festgestellt, dass CDMP-1 nur von Skelett-Vorläufer-Zellpopulationen in allen Passagen bis zu 18 Passagen, die untersucht wurden, exprimiert wurde, jedoch nicht durch andere Zellpopulationen. Wir demonstrierten tatsächlich, dass nur die CDMP-1-markierten Kultur expandierten Zellen unter spezifischen Bedingungen, z.B. in Richtung einer Chondrogenese differenzieren können, während die CDMP-1-negativen Zellen unter denselben Bedingungen nicht in der Lage sind, irgendeinen Skelett-Differenzierungsweg zu beschreiten. Weiterhin geht dem Auftreten von Knorpelmarkern immer die Herabregulation der Expression von CDMP-1 voran.
2A zeigt die RT-PCR-Analyse für die Expression von CDMP-1, normalisiert auf die Expression von β-Actin in unterschiedlichen Zellpopulationen, nummeriert von 1 bis 4.

– Spur 1: Menschliche Periost-abgeleitete skelettale Vorläuferzellen;
– Spur 2: Menschliche, von einer Synovialmembran abgeleitete skelettale Vorläuferzellen;
– Spur 3: Menschliche, vom Knochenmark abgeleitete skelettale Vorläuferzellen;
– Spur 4: Menschliche Haut-Fibroblasten.

2B zeigt die RT-PCR-Analyse für CDMP-1 und Typ-II-Collagen, normalisiert auf die Expression von β-Actin bei menschlichen Haut-Fibroblasten (Spuren 1 und 2) und menschlichen, vom Periost abgeleiteten skelettalen Vorläuferzellen (Spuren 3 und 4) in Mikromassekultur, entweder unbehandelt (Spuren 1 und 3) oder 6 Tage mit 10 ng/ml TFG-β 1 behandelt (Spuren 2 und 4).

– Spur 1: Menschliche unbehandelte Haut-Fibroblasten;
– Spur 2: Menschliche Haut-Fibroblasten, behandelt mit 10 ng/ml TGF-β 1;
– Spur 3: Menschliche unbehandelte skelettale Vorläuferzellen;
– Spur 4: Menschliche skelettale Vorläuferzellen, behandelt mit 10 ng/ml TGF-β 1.

RNA-Extraktion und semi-quantitative RT-PCR-Analyse
Gesamt-RNA aus menschlichen Zellen wurde unter Verwendung des S.N.A.P.^TM-Kits (erhältlich von Invitrogen) extrahiert und DNAse-behandelt. 1 μg der Gesamt-RNA wurde revers transkribiert, um cDNA mit Oligo(dT)-Primern unter Verwendung von Thermoscript (Life Technologies) herzustellen. Die Polymerase-Kettenreaktion ("PCR") wurde in einem Volumen von 10 μl durchgeführt, unter Zugabe von 1 μl aus 60 μl der cDNA als Matrize unter Verwendung von Taq-DNA-Polymerase (erhältlich von Eurogentech). Wenn die Sequenz des Gens bekannt war, wurden Primer auf unterschiedlichen Exons entworfen, um die cDNA von einer genomischen DNA-Kontamination zu unterscheiden. Vor der PCR-Analyse wurden die cDNAs auf die Expression des Haushälter (housekeeping) gens-β-Actin abgeglichen. PCR für menschliches β-Actin wurde durchgeführt unter Beendigung der Reaktion bei jedem Zyklus, beginnend vom 17. Zyklus, um sicherzustellen, dass die PCR-Amplifikation sich noch immer in der linearen Phase befand. Die PCR-Produkte wurden in 1%igem Agarosegel in TBE (Tris-Borat/EDTA) Elektrophoresepuffer elektrophoretisch behandelt, mit Ethidiumbromid gefärbt, durch die UV-Transilluminierung sichtbar gemacht und durch Dichtemessung unter Verwendung der Image-Master-Software (erhältlich von Pharmacia-Biotech) analysiert. cDNAs wurden gemäß der relativen Intensitäten der Banden verdünnt. Um auszuschließen, dass β-Actin in den unterschiedlichen zu vergleichenden Proben differenziell reguliert wurde, wurde dieselbe Analyse ebenfalls im Hinblick auf die Expression eines anderen Haushaltergens, Glucose-3-Phosphatdehydrogenase (GAPDH) durchgeführt. Nach Abgleichung auf β-Actin und GADPH wurden alle Proben simultan im Hinblick auf etliche Gene überprüft, einschließlich denjenigen, von denen bekannt war, dass sie an der Chondrogenese und dem Erhalt des Knorpels beteiligt sind. Für jedes Gen wurde die Zyklisierung optimiert, um sicherzustellen, dass die Amplifikation sich immer noch in der linearen Phase befand, wenn die PCR für alle Proben beendet wurde.
Beispiel 4 – Bestimmung der phänotypischen skelettalen Vorläuferzell-Stabilität über die seriellen Passagen
Bei jeder Passage des Expansionsverfahrens gemäß Beispiel 2 wurden skelettale Vorläuferzellen von Donoren mit unterschiedlichem Alter für eine Gesamt-RNA-Extraktion geerntet und eine RT-PCR-Analyse für die Expression von 40 Genen, wie oben beschrieben, durchgeführt. Ihr molekulares Profil blieb über eine serielle Passage von bis zu mindestens 15 Passagen stabil, was anzeigte, dass sie im großen und ganzen ohne Beeinträchtigung ihrer Fähigkeit als Skelett-Vorläufer expandiert werden können.
3 zeigt, dass der Phänotyp von skelettalen Vorläuferzellen nicht von der Zahl der Zellpassagen oder dem Donoralter abhängt. Periost abgeleitete Zellen bei P5 und P15 von vier Donoren mit unterschiedlichem Alter weisen ein vergleichbares molekulares Profil auf, wie bewertet durch semi-quantitative RT-PCR. Die Figur zeigt nur ein repräsentatives Panel der überprüften Gene. In der letzten Spur war Milli-Q-Wasser die Negativkontrolle. Die Matrizen wurden auf die β-Actin-Expression abgeglichen.
Beispiel 5 – Anchor-unabhängiges Wachstum von skelettalen Vorläuferzellen
Das anchor-unabhängige Wachstum von skelettalen Vorläuferzellen aus Beispiel 2 wurde in vitro durch Agarose-Kultur und in vivo durch intramuskuläre Injektion in immundeffiziente Nacktmäuse, wie unten erklärt, überprüft. Die Injektion von erwachsenen skelettalen Vorläuferzellen in Nacktmäuse führte zu einer Bildung von schlecht differenzierten unreifen faserknorpeligem Gewebe von menschlichem Ursprung, wie durch in-situ-Hybridisierung auf eine human-spezifische alu-Sequenz demonstriert.
Agarosekultur
Die Agarosekultur wurde gemäß dem Verfahren von Benya et al., Cell (1982) 30:215-24 durchgeführt. Kurz gefasst wurden Petrischalen mit einem Durchmesser von 35 mm² mit 1%iger steriler Hoch-T_m-Agarose (erhältlich von Life Technologies) beschichtet und auf einer ebenen Oberfläche bei Raumtemperatur platziert, um sich zu verfestigen. Die Zellen wurden durch Trypsinbehandlung freigesetzt, durch den Trypan-Blau-Ausschlußtest gezählt und in 0,5%iger Niedrig-T_m-Agarose (Life Technologies) in DMEM mit einer Dichte von 2 × 104 Zellen/ml resuspendiert. 0,5 ml dieser Zellsuspension wurden zu jeder der Petri-Schalen zugefügt. Nach einem Abkühlen bei 4°C für 15 Minuten wurde DMEM, enthaltend 10 FBS, Antibiotika und 50 μg/ml Ascorbinsäure (Sigma) zugefügt und die Petri-Schalen wurden bei 37°C in 95%ige angefeuchtete Luft und 5 % CO₂ übertragen. Das Medium wurde an jedem zweiten Tag ersetzt.
In-vivo-Assay
Skelettale Vorläuferzellen nach einer unterschiedlichen Passagenzahl aus Beispiel 2 wurden durch eine Trypsin-Behandlung freigesetzt, zweimal in steriler PBS gewaschen und durch den Trypan-Blau-Ausschlußtest gezählt. 5 × 10⁶ lebensfähige Zellen wurden in einem Volumen von 50 bis 100 μl PBS resuspendiert und intramuskulär in den Oberschenkel von weiblichen, 4 bis 5 Wochen alten immunodefizienten Mäusen injiziert. Die Tiere wurden nach 3 Wochen durch Cervix-Dislokation geopfert und der Oberschenkel zum Erhalt des Implantats seziert. Die Implantate wurden gewogen und entweder sofort eingefroren und in flüssigem Stickstoff gelagert oder in frisch angesetztem 4%igem Formaldehyd für 4 Stunden fixiert, Nach der Fixierung wurden die Proben in Paraffin eingebettet, bei 5 μm sektioniert und gemäß den Standardvorschriften gefärbt (Elsass-Blau, pH 2,5, Toluidin-Blau, Masson-Trichrom, Safranin 0) (Manual of Histological Techniques). 4 zeigt Implantate, gewonnen aus Nacktmäusen, 3 Wochen nach einer intramuskulären Injektion von 5 × 106 erwachsenen menschlichen, Periost-abgeleiteten skelettalen Vorläuferzellen. Die Masson-Trichrom (4A) und schwache Elsass-Blau-Färbung bei pH 2,5 (48) zeigte ein schlecht. differenziertes fibröses Gewebe, das stark an Periost erinnerte. Dies zeigt an, dass die skelettalen Vorläuferzellen in vivo anchor-unabhängig wachsen können und ihre phänotypische Stabilität beibehalten.
Die in-situ-Hybridisierung im Hinblick auf die humanspezifische alu-Sequenz wurde auf den gewonnenen Implantaten für eine Identifizierung menschlicher Zellen wie folgt durchgeführt.
In-situ-Hybridisierung auf human-spezifische alu-Repeats
Die in-situ-Hybridisierung wurde, wie von Kuznetsov et al. (1997), J. Bone Min. Res. 12:1335-47 beschrieben, durchgeführt. 4 zeigt, dass das aus dem in-vivo-Assay erhaltene fibröse Gewebe von menschlichem Ursprung ist und nicht von dem Maus-Wirt abstammt.
Beispiel 6 – In-vitro-Bildung von Knorpel mit skelettalen Vorläuferzellen
Die in-vitro-Induktion und Bildung von Knorpel, demonstriert durch Elsass-Blau-Färbung und Molekularanalyse im Hinblick auf Knorpel-Marker durch RT-PCR wurde durch Kombination von Mikromassekulturen von skelettalen Vorläuferzellen aus Beispiel 2 bei hoher Zelldichte und Behandlung der Zellen mit TGF-β 1 oder TGF-β 2 oder TGF-β 3 (R&D-Systems), gelöst in 4 mM HCl, enthaltend 1 mg/ml bovines Serumalbumin (BSA, Serva) durchgeführt und zu dem Kulturmedium in einer Endkonzentration von 10 ng/ml zugegeben. Die chondrogene Differenzierung von skelettalen Vorläuferzellen wurde in allen Donoren erhalten, unabhängig von der Anzahl der Zellpassagen oder dem Alter des Donors, siehe 6A und 6B. Die Anwendung von TGF-β 1 auf skelettale Vorläuferzellen von Donoren mit einem Alter von 24, 30, 62 und 78 erzeugte Chondrozyten, die Collagen-Typ-2 zeigten. Unter denselben Bedingungen erwiesen sich rekombinantes menschliches Knochenmorphogenes Protein (BMP)-2, BMP-4 (Genetics Institute), BMP-7 oder GDF-5 (CDMP-1; Creative Biomolecules), gelöst in 45%igem Acetonitril, 0,1 % Trifluoressigsäure (TFA) und dem Kulturmedium in Endkonzentrationen von 100 bis 300 ng/ml zugefügt als sehr viel weniger effektiv als die TGFβs.
Mikromassakultur
Expandierte skelettale Vorläuferzellen von menschlichen Donoren mit unterschiedlichem Alter nach unterschiedlicher Passagenzahl aus Beispiel 2 wurden durch Trypsin-Behandlung freigesetzt, durch den Trypan-Blau-Ausschlußtest gezählt und in DMEM resuspendiert, supplementiert mit 10%igem FBS und Antibiotika mit einer Zelldichte von 2 × 107 lebensfähigen Zellen pro ml. Mikromassekulturen wurden durch Pipettieren von 20 μl-Tröpfchen der Zellsuspension in individuelle Vertiefungen von Platten mit 24 Vertiefungen erhalten. Nachdem die Zellen sich ohne Medium 3 Stunden lang anbinden durften, wurde chemisch definiertes serumfreies Medium ohne Wachstumsfaktoren zugefügt. Der Tag der Einführung in die Mikromassekultur wurde als Tag 0 bezeichnet. Rekombinantes menschliches TGF-β 1 oder TGF-β 2 oder TGF-β 3 (erhältlich von R & D Systems) wurde in 4 mM HCl, enthaltend 1 mg/ml bovines Serumalbumin (BSA) gelöst und dem Kulturmedium mit einer Endkonzentration von 10 ng/ml jeden Tag, beginnend am Tag 1 zugefügt, wenn das Kulturmedium geändert wurde. Dieselben Mengen an 4 mM HCl, enthaltend 1 mg/ml BSA, wurden zu Parallelkulturen als Kontrolle zugefügt.
Mikromassekulturen wurden nach unterschiedlichen Zeitspannen für die RT-FCR-Analyse und die Elsass-Blau-Färbung, wie unten erklärt, geerntet. Zum Vergleich wurden menschliche Haut-Fibroblasten unter identischen Bedingungen kultiviert.
Für die histochemische und immun-histochemische Analyse wurden Mikromassekulturen, wie unten beschrieben, durchgeführt.
In vitro Elsass-Blau-Färbung
Die Zellen wurden zweimal mit PBS gespült, in Methanol eine Stunde bei –20°C fixiert, mit destilliertem Wasser gewaschen und über Nacht mit Elsass-Blau bei pH 0,2 bedeckt (0,5 % Elsass-Blau 8 GS, erhältlich von Carl Roth, in 1 N HCl). Die quantitative Analyse wurde durch Extraktion von Elsass-B1au-gefärbten Kulturen mit 200 μl 6 M Guanidin HCl in Milli-Q-Wasser für 6 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. Die optische Dichte des extrahierten Farbstoffs wurde dann bei 630 nm unter Verwendung von Spectronic 2000 (Bausch & Lomb) gemessen. Parallel wurden menschliche Haut-Fibroblasten als negative Kontrolle verwendet und menschliche artikuläre Chondrozyten als Positivkontrolle.
7 zeigt eine Elsass-Blau-Färbung bei pH 0,2 von menschlichen skelettalen Vorläuferzellen in Mikromassekultur, entweder unbehandelt (7A) oder 6 Tage mit 10 ng/ml TGF-β 1 behandelt (7B). Die unbehandelten Proben zeigen keine blaue Farbe, während die behandelten Proben eine starke blaue Färbung zeigen.
Histologie und Immunhistochemie
Für histologische und immunhistochemische Analysen wurden 100 μl einer Skelett-Vorläuferzellsuspension in Mikromasse in indivuelle Vertiefungen einer Platte mit 12 Vertiefungen plattiert. Die Mikromassen wurden entweder mit 10 ng/ml TGF-β 1 oder mit derselben Menge einer TGF-β 1-Trägerlösung in dem chemisch definierten serumfreien Medium behandelt. Nach 15 bis 20 Tagen wurden die Mikromassen von den Vertiefungen abgelöst, mit 10 % Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet und bei 5 μm sektioniert. Für die histologische Überprüfung wurden die Sektionen von Paraffin befreit und mit Toluidin-Blau, Safranin 0 oder Elsass-Blau bei pH 2,5 gemäß den Standardprotokollen gefärbt (Manual of Histological Techniques). Im letzteren Fall wurde Neutral-Rot für die Gegenfärbung der Kerne verwendet. Für die immunhistochemische Analyse wurden die Sektionen von Paraffin befreit und mit Chondroitinase ABC (Sigma) mit 50 mU/ml bei Raumtemperatur für eine Stunde vorverdaut, um den Zugang für die Antikörper zu erleichtern. Nicht-spezifische Antikörperbindung wurde durch Inkubation der Objektträger in 5 % BSA in PBS für eine Stunde blockiert. Die Sektionen wurden dann eine Stunde mit einem Maus-Anti-humanen-Typ-2-Collagen monoklonalen Antikörper (erhältlich von Chemicon International), verdünnt 1:5 in 0,5%iger BSA in PBS inkubiert. Die Reaktivität wurde mit einem Fluoreszenzmikroskop nach Inkubation für eine Stunde mit einem Cy3-konjugierten sekundären Antikörper (Ziegen-Anti-Maus-IgG; Jackson ImmunoResearch Laboratorien) nachgewiesen, der in 0,5%iger BSA in PBS 1:500 verdünnt worden war. Die Kerne wurden mit DAPI (4,6-Diamidino-2-phenylindol; ICN) gegengefärbt.
8 zeigt die histochemische und immunhistochemische Analyse von Mikromassen, entweder unbehandelt (A, B, H) oder mit 10 ng/ml TGF-β 1 für 15 Tage behandelt. CDMP-1-markierte Zellen in Mikromasse mit TGF-β 1 durchlaufen eine Chondrogenese. Die extrazelluläre Knorpelmatrix ist mit Toluidin-Blau (C) und Elsass-Blau (D nach 7 Tagen, F nach 15 Tagen) gefärbt. Die extrazelluläre Knorpelmatrix ist auch Typ-II-Collagen immunogefärbt (G, H nach 15 Tagen).
Beispiel 7 – Verstärkung der Knorpelbildungsfähigkeit von Chondrozyten mit skalettalen Vorläuferzellen
Die Wechselwirkungen von skelettalen Vorläuferzellen und artikulären Chondrozyten wurden sowohl in vitro als auch in vivo bewertet. Für diese Experimente verwendeten wir menschliche skelettale Vorläuferzellen aus Beispiel 2 und artikuläre Schweine-Chondrozyten, erhalten wie unten angegeben, um den relativen Beitrag von zwei unterschiedlichen Zelltypen zu dem Knorpelbildungsprozess zu bestimmen. Wie in Beispiel 5 erklärt, kann der Beitrag von menschlichen Zellen durch Durchführen einer in-situ-Hybridisierung auf human-spezifische alu-Gene sichergestellt werden. Die Zugabe von menschlichen skelettalen Vorläuferzellen aus Beispiel 3 zu artikulären Schweine-Chondrozyten ergab eine dramatische Auswirkung auf das Knorpelbildungspotenzial der Chondrozytenzellen. Insbesondere wurde ein Anstieg der Menge des hergestellten Knorpels und gleichzeitig eine Abnahme des Grenzwerts des in-vivo-Assays (d.h. es waren weniger als eine Million Zellen für die Knorpelbildung und Organisation nötig) beobachtet.
Erhalt von artikulären Schweine-Chondrozyten
Knorpel wurde zu voller Dicke aus dem metatarsalen und metatarso-phalangealen Gelenken eines erwachsenen Schweins geschnitten und in HBSS, supplementiert mit Antibiotika, platziert. Nach zwei Waschschritten in HBSS, enthaltend Antibiotika, für 5 Minuten bei 37°C wurde der Knorpel fein zerkleinert und in eine sterile 0,2%ige rohe Collagenaselösung in hoch glukosehaltigem DMEM, enthaltend 10 % FBS und Antibiotika, platziert. Nach einer Inkubation bei 37°C über Nacht wurden die Zellen zweimal in Kulturmedium (DMEM, enthaltend 10 % FBS und Antibiotika) gewaschen und mit dem Trypan-Blau-Ausschlusstest gezählt, um die Zahl der lebensfähigen Zellen einzustellen,
In-vitro-Co-Kultur
Durch serielle Passagen geführte menschliche skelettale Vorläuferzellen aus Beispiel 2 und frisch isolierte artikuläre Schweine-Chondrozyten wurden in Mikromassekulturen plattiert unter Verwendung der in Beispiel 6 beschriebenen Bedingungen, und zwar in dieselbe Vertiefung einer Platte mit 12 Vertiefungen ohne Zugabe von Wachstumsfaktoren. Als Kontrollen wurden zwei Mikromassen von menschlichen skelettelen Vorläuferzellen in eine Vertiefung und in eine andere Vertiefung zwei Mikromassen von artilculäre Schweine-Chondrozyten pipettiert. In jeder Vertiefung hatten die zwei Mikromassen keinen physikalischen Kontakt. Die Mikromassen wurden für die histochemische Analyse und die Färbeprotokolle geerntet.
In-vivo-Co-Implantation
Durch serielle Passagen geführte menschliche skelettale Vorläuferzellen aus Beispiel 2 und frisch isolierte artikuläre Schweine-Chondrozyten wurden intramuskulär in Nacktmäuse in unterschiedlichen Verhältnissen, wie in Tabelle 2 angegeben, injiziert. Als Kontrollen wurden menschliche skelettale Vorläuferzellen und artikuläre Schweine-Chondrozyten ebenfalls separat injiziert, wobei dieselben Zelldichten verwendet wurden. Die Tiere wurden nach 3 Wochen durch Cervix-Dislokation geopfert. Die Implantate wurden gewogen und entweder sofort eingefroren und in flüssigem Stickstoff gelagert oder in frisch angesetztem 4%igem Formaldehyd für 4 Stunden fixiert. Nach dem Fixieren wurden die Proben in Paraffin eingebettet, bei 5 μm selctioniert und gemäß den Standard-Protokollen gefärbt (Elsass-Blau, pH 2,5, Toluidin-Blau, Masson-Trichrome, Safranin O) (Manual of Histological Techniques). Die in-situ-Hybridisierung für die human-spezifische alu-Sequenz wurde durchgeführt, Um menschliche skelettale Vorläuferzellen von artikulären Schweine-Chrondrozyten in dem Implantat nachzuweisen und zu unterscheiden. Die Ergebnisse waren die folgenden:
Tabelle 2
Alle Zahlen sind in Millionen ausgedrückt.
8 zeigt die Genexpressions-Dynamik, bestimmt durch RT-PCR während der Chondrogenese in CDMP-1-markierten skelettalen Vorläuferzellen.

Spuren 1 und 2: Menschliche Dermis-Fibroblasten

Spur 3: Menschliche skelettale Vorläuferzellen in Monolayer

Spuren 4 bis 12: Menschliche skelettale Vorläuferzellen in Mikromasse
Es kann festgestellt werden, dass CDMP1 stark herabreguliert wird, wenn die skelettalen Vorläuferzellen in die Chondrogenese eintreten und zu dem Chondrozyten-Phänotyp reifen. Der reife Chondrozyten-Phänotyp wird durch das Auftreten von Typ-II-Collagen, Typ-X-Collagen, FGFR3 (Fibroblasten-Wachstumsfaktor 3) und BMP2 angekündigt. Ein positiver Marker gemäß der vorliegenden Erfindung, wie der CDMP-1-Marker oder ein Marker oder Faktor, der mit diesem Marker co-exprimiert wird oder co-nachweisbar ist und ein negativer Marker, wie z.B. die Chondrozyten-Marker Typ-II Collagen, Typ-X-Collagen, FGFR3 und BMP2 oder ein Marker, der mit irgendeinem oder allen diesen Markern co-exprimiert wird oder co-nachweisbar ist, schließen sich gegenseitig aus. Die skelettalen Vorläuferzellen der vorliegenden Erfindung können durch einen positiven Marker identifiziert werden, wie z.B. CDMP-1 (oder einen Marker oder Faktor, der mit CDMP-1 co-exprimiert wird oder co-nachweisbar ist), der nicht zur gleichen Zeit wie ein negativer Marker exprimiert wird, wie z.B. FGFR3 oder ein anderer Faktor oder Marker, der mit FGFR3 co-exprimiert wird oder co-nachweisbar ist.
Obwohl die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf skelettale Vorläuferzellen beschrieben wurde, wird der Fachmann anerkennen, dass die vorliegende Erfindung auf jede Art einer Gewebereparatur angepasst werden kann. Das zu befolgende Verfahren ist die Identifizierung embryonaler Marker oder von Markern, die Vorläuferzellen für spezifische Gewebezellen identifizieren, die repariert werden sollen, um dann Zellen aus dem Organismus zu selektieren, die den Marker zeigen. Die selektierten Zellen können dann ex vivo/in vitro expandiert und darauffolgend zur Reparatur des Gewebes reimplantiert werden.

Claims

Verfahren zur positiven Identifizierung isolierter oder expandierter, lebensfähiger, festgelegter, pluripotenter skelettaler Vorläuferzellen, welche in einen postnatalen Differenzierungsweg eingetreten sind, der zu skelettalem Gewebe oder Bindegewebe führt, welches die folgenden Schritte umfasst: a) Isolierung von Säugetierzellen in eine Zellkultur in vitro, und b) Nachweis des Vorhandenseins der Expression des positiven embryonalen Markers CDMP-1.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, worin das genannte skelettale Gewebe oder Bindegewebe aus Knochen, Knorpel, Band, Sehne, Meniskus, Gelenkkapsel, Bandscheiben oder Zähnen ausgewählt ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, welches den Erhalt einer expandierten Zellpopulation von der in Schritt (a) erhaltenen Zellkultur und den Nachweis des Vorhandenseins der Expression des genannten embryonalen Markers CDMP-1 in der genannten expandierten Zellpopulation umfasst.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 – 3, welches weiterhin den Nachweis der Abwesenheit der Expression eines negativen Markers umfasst.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 – 4, worin der positive Marker ein Gen oder ein Protein der eine mRNA welche von einem Gen in den Vorläuferzellen exprimiert werden oder ein Teil davon ist, und auf m-mRNA-, cDNA- oder Protein-Level und/oder über die Aktivität eines Promotors, welcher diese Genexpression steuert/reguliert und welcher funktionell mit einem heterologen Reportergen verbunden ist, nachweisbar ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 4 oder 5, worin der negative Marker exprimierter FGFR3 ist oder ein Marker oder ein Faktor, welcher mit diesem negativen Marker co-exprimiert wird oder gleichzeitig mit diesem negativen Marker nachweisbar (co-detectable) ist.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 – 6, worin der Schritt des Nachweises des Vorhandenseins des positiven Markers die Verwendung eines an den positiven Marker bindenden Agens für eine isolierte Quelle von Zellen, welche die Vorläuferzellen aufweist, beinhaltet, wobei der Marker die Zelle positiv identifiziert.
Verfahren zur Trennung oder Anreicherung isolierter oder expandierter, lebensfähiger, festgelegter, pluripotenter skelettaler Vorläuferzellen, welche in einen postnatalen Differenzierungsweg eingetreten sind, der zu skelettalem Gewebe oder Bindegewebe führt, aus einem heterogenen Säugetierzellpool, wobei das Verfahren die Verwendung von Reagenzien, Liganden und/oder Antikörpern umfasst, welche die mRNA oder das Protein von CDMP-1 erkennen.
Das Verfahren gemäß Anspruch 8, worin das genannte skelettale Gewebe oder Bindegewebe aus Knochen, Knorpel, Band, Sehne, Meniskus, Gelenkkapsel, Randscheiben oder Zähnen ausgewählt ist.
Verwendung von Reagenzien, Liganden und/oder monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern, welche einen oder mehrere Zelloberflächenmarker erkennen, für die Trennung und Anreicherung von Vorläuferzellen in Zellkultur in vitro, worin der Zelloberflächenmarker CDMP-1 ist.
Kultur von isolierten und expandierten lebensfähigen, differenzierten, pluripotenten Vorläuferzellen, welche in einen postnatalen skelettalen Differenzierungsweg eingetreten sind, der zu skelettalem Gewebe oder Bindegewebe führt, worin die Zellen einen positiven embryonalen Marker exprimieren, welcher CDMP-1 ist.
Die Kultur gemäß Anspruch 11, worin das genannte skelettale Gewebe oder Bindegewebe aus Knochen, Knorpel, Band, Sehne, Meniskus, Gelenkkapsel, Bandscheiben oder Zähnen ausgewählt ist.
Therapeutische Zusammensetzung, welche die Kultur gemäß Anspruch 11 oder 12 umfasst.
Die therapeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 13, welche weiterhin Chondrozyten umfasst.
Die therapeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 13 oder 14, welche weiterhin einen Faktor, der die Differenzierung der skelettalen Vorläuferzellen in die Art von Bindegewebe oder skelettalem Gewebe stimuliert, das produziert oder repariert werden soll, und/oder ein bioresorbierbares Polymer oder einen bioresorbierbaren Träger umfasst.
Die therapeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 15; worin der genannte Faktor ein transformierender Wachstumsfaktor (transforming growth factor) oder ein knochenmorphogenes Protein (bone morphogenic protein) ist.
Die therapeutische Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 13 bis 16, worin die genannte Kultur von isolierten und expandierten lebensfähigen, differenzierten, pluripotenten Vorläuferzellen mit einem Faktor präinkubiert wird, welcher die Differenzierung der skelettalen Vorläuferzellen in die Art von Bindegewebe oder skelettalem Gewebe stimuliert, das produziert oder repariert werden soll.
Die therapeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 17, worin der genannte Faktor ein transformierender Wachstumsfaktor (transforming growth factor) oder ein knochenmorphogenes Protein (bone morphogenic protein) ist.
Verwendung der Zellkultur gemäß Anspruch 11 oder 12 als in vitro-Quelle für transformierende Wachstumsfaktoren ß (transforming growth factors-ß) und Knochenmorphogenes Protein (bone morphogenic proteins).
Implantat umfassend die Zellkultur gemäß Anspruch 11 oder 12, wobei das genannte Implantat geeignet ist für die Implantation von Bindegewebe.
Diagnostisches Mittel für die positive in vitro-Identifizierung eines positiven Markers von lebensfähigen, festgelegten, pluripotenten skelettalen Vorläuferzellen, welche in einen postnatalen Differenzierungsweg eingetreten sind, der zu skelettalen Geweben oder Bindegeweben führt, wobei der Marker CDMP-1 ist.
Das diagnostische Mittel gemäß Anspruch 21, worin das genannte skelettale Gewebe öder Bindegewebe aus Knochen, Knorpel, Band, Sehne, Meniskus, Gelenkkapsel, Bandscheiben oder Zähnen ausgewählt ist.
Das diagnostische Mittel gemäß, Anspruch 21 oder 22, welches weiterhin den Nachweis der Abwesenheit eines negativen Markers umfasst.