UA127310C2 - Спосіб очищення і активації ботулінічного нейротоксину - Google Patents
Спосіб очищення і активації ботулінічного нейротоксину Download PDFInfo
- Publication number
- UA127310C2 UA127310C2 UAA201812420A UAA201812420A UA127310C2 UA 127310 C2 UA127310 C2 UA 127310C2 UA A201812420 A UAA201812420 A UA A201812420A UA A201812420 A UAA201812420 A UA A201812420A UA 127310 C2 UA127310 C2 UA 127310C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- mtmna
- vomt
- matrix
- binding
- polypeptide
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 129
- 108030001720 Bontoxilysin Proteins 0.000 title claims abstract description 65
- 231100001103 botulinum neurotoxin Toxicity 0.000 title claims abstract description 64
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims abstract description 62
- 230000004913 activation Effects 0.000 title description 30
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 124
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims abstract description 123
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims abstract description 114
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 101
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 82
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 81
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 73
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 72
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims abstract description 39
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 27
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 25
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims abstract description 14
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 claims abstract description 12
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 claims abstract description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 92
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 87
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 87
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 76
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 claims description 36
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 claims description 35
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 27
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 22
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 claims description 22
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 21
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 20
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 20
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 19
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 19
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 19
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 claims description 18
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 18
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 claims description 18
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 claims description 18
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 18
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 18
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 17
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 16
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 16
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 16
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 15
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 14
- 239000008187 granular material Substances 0.000 claims description 14
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 11
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 11
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 claims description 9
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 claims description 9
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 7
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 claims description 7
- 102000000584 Calmodulin Human genes 0.000 claims description 6
- 108010041952 Calmodulin Proteins 0.000 claims description 6
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 claims description 6
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 claims description 6
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 6
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims description 6
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 claims description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims 9
- 244000025361 Ficus carica Species 0.000 claims 2
- 235000008730 Ficus carica Nutrition 0.000 claims 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 claims 2
- GMYRVMSXMHEDTL-UHFFFAOYSA-M 1,1'-diethyl-2,2'-cyanine iodide Chemical compound [I-].C1=CC2=CC=CC=C2N(CC)C1=CC1=CC=C(C=CC=C2)C2=[N+]1CC GMYRVMSXMHEDTL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 240000004246 Agave americana Species 0.000 claims 1
- 235000008754 Agave americana Nutrition 0.000 claims 1
- 240000005220 Bischofia javanica Species 0.000 claims 1
- 235000010893 Bischofia javanica Nutrition 0.000 claims 1
- 240000000425 Chaenomeles speciosa Species 0.000 claims 1
- 235000005078 Chaenomeles speciosa Nutrition 0.000 claims 1
- 241000277301 Esociformes Species 0.000 claims 1
- 239000007821 HATU Substances 0.000 claims 1
- 235000003332 Ilex aquifolium Nutrition 0.000 claims 1
- 241000209027 Ilex aquifolium Species 0.000 claims 1
- 241001026509 Kata Species 0.000 claims 1
- 241000824268 Kuma Species 0.000 claims 1
- 241001142635 Lema Species 0.000 claims 1
- 241000234435 Lilium Species 0.000 claims 1
- 241000531897 Loma Species 0.000 claims 1
- 241001436793 Meru Species 0.000 claims 1
- 102100026933 Myelin-associated neurite-outgrowth inhibitor Human genes 0.000 claims 1
- 241001442654 Percnon planissimum Species 0.000 claims 1
- 240000005546 Piper methysticum Species 0.000 claims 1
- 235000016787 Piper methysticum Nutrition 0.000 claims 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 claims 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000010813 municipal solid waste Substances 0.000 claims 1
- 229910052754 neon Inorganic materials 0.000 claims 1
- GKAOGPIIYCISHV-UHFFFAOYSA-N neon atom Chemical compound [Ne] GKAOGPIIYCISHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000004071 soot Substances 0.000 claims 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 claims 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 22
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 abstract description 4
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 abstract description 4
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 78
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 71
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 71
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 70
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 59
- 238000001994 activation Methods 0.000 description 29
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 17
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 17
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 14
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 14
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 13
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 12
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 12
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 12
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 12
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 11
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 11
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 11
- 241001112695 Clostridiales Species 0.000 description 10
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 10
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 description 9
- OIPILFWXSMYKGL-UHFFFAOYSA-N acetylcholine Chemical compound CC(=O)OCC[N+](C)(C)C OIPILFWXSMYKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 7
- 239000002581 neurotoxin Substances 0.000 description 7
- 231100000618 neurotoxin Toxicity 0.000 description 7
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 6
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 6
- PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 16-Epiaffinine Natural products C1C(C2=CC=CC=C2N2)=C2C(=O)CC2C(=CC)CN(C)C1C2CO PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241001112696 Clostridia Species 0.000 description 5
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 5
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 5
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 5
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 210000000715 neuromuscular junction Anatomy 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 4
- 101710138657 Neurotoxin Proteins 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 4
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 4
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 4
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 231100001102 clostridial toxin Toxicity 0.000 description 4
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 4
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 4
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N nickel Substances [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 210000002504 synaptic vesicle Anatomy 0.000 description 4
- IJJWOSAXNHWBPR-HUBLWGQQSA-N 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]-n-(6-hydrazinyl-6-oxohexyl)pentanamide Chemical group N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)NCCCCCC(=O)NN)SC[C@@H]21 IJJWOSAXNHWBPR-HUBLWGQQSA-N 0.000 description 3
- 208000003508 Botulism Diseases 0.000 description 3
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 description 3
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 3
- 108010088842 Fibrinolysin Proteins 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 3
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 3
- 108010030518 arginine endopeptidase Proteins 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 3
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 3
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 3
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 108010003052 omptin outer membrane protease Proteins 0.000 description 3
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 3
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 3
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 3
- 206010024264 Lethargy Diseases 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 2
- 208000029578 Muscle disease Diseases 0.000 description 2
- 208000021642 Muscular disease Diseases 0.000 description 2
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 2
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 2
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 2
- 241001505332 Polyomavirus sp. Species 0.000 description 2
- 101710118538 Protease Proteins 0.000 description 2
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 2
- 208000004350 Strabismus Diseases 0.000 description 2
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 2
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 2
- 229960004373 acetylcholine Drugs 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 238000006352 cycloaddition reaction Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 208000010118 dystonia Diseases 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 210000001097 facial muscle Anatomy 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 210000002161 motor neuron Anatomy 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 230000001508 neuroinhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 208000018360 neuromuscular disease Diseases 0.000 description 2
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 2
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 2
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 229910000077 silane Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000005062 synaptic transmission Effects 0.000 description 2
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 230000007888 toxin activity Effects 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 2
- 230000037303 wrinkles Effects 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N 2-(2-cyanopropan-2-yldiazenyl)-2-methylpropanenitrile Chemical compound N#CC(C)(C)N=NC(C)(C)C#N OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GRNHLFULJDXJKR-UHFFFAOYSA-N 3-(2-sulfanylethyl)-1h-quinazoline-2,4-dione Chemical compound C1=CC=C2C(=O)N(CCS)C(=O)NC2=C1 GRNHLFULJDXJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQEBBZSWEGYTPG-UHFFFAOYSA-N 3-aminobutanoic acid Chemical compound CC(N)CC(O)=O OQEBBZSWEGYTPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150082201 ASIP gene Proteins 0.000 description 1
- 241000256111 Aedes <genus> Species 0.000 description 1
- 241001116389 Aloe Species 0.000 description 1
- 101100136993 Arabidopsis thaliana PME5 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000002804 Ataxia Telangiectasia Mutated Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 241000486634 Bena Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 101000985023 Clostridium botulinum C phage Botulinum neurotoxin type C Proteins 0.000 description 1
- 244000117499 Colubrina elliptica Species 0.000 description 1
- 241000611750 Coregonus kiyi Species 0.000 description 1
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 1
- 241000283014 Dama Species 0.000 description 1
- 241000388186 Deltapapillomavirus 4 Species 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 238000005698 Diels-Alder reaction Methods 0.000 description 1
- 240000008570 Digitaria exilis Species 0.000 description 1
- 235000005459 Digitaria exilis Nutrition 0.000 description 1
- 241001397104 Dima Species 0.000 description 1
- 101100075837 Drosophila melanogaster Mabi gene Proteins 0.000 description 1
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 description 1
- 241000701867 Enterobacteria phage T7 Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N Ethyl urethane Chemical compound CCOC(N)=O JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010017943 Gastrointestinal conditions Diseases 0.000 description 1
- 101710171457 Glycoprotein O Proteins 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 241000825469 Haemulon vittatum Species 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102100020870 La-related protein 6 Human genes 0.000 description 1
- 108050008265 La-related protein 6 Proteins 0.000 description 1
- 101710128836 Large T antigen Proteins 0.000 description 1
- 101800001509 Large capsid protein Proteins 0.000 description 1
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001214257 Mene Species 0.000 description 1
- 238000006845 Michael addition reaction Methods 0.000 description 1
- 208000019695 Migraine disease Diseases 0.000 description 1
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 description 1
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 1
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 1
- 102100038750 Myc-associated zinc finger protein Human genes 0.000 description 1
- 101710146400 Myc-associated zinc finger protein Proteins 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- 101800001775 Nuclear inclusion protein A Proteins 0.000 description 1
- 241000207836 Olea <angiosperm> Species 0.000 description 1
- 241000277269 Oncorhynchus masou Species 0.000 description 1
- 208000033952 Paralysis flaccid Diseases 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 235000010575 Pueraria lobata Nutrition 0.000 description 1
- 102000015799 Qa-SNARE Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010010469 Qa-SNARE Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010005730 R-SNARE Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229910019567 Re Re Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000003976 Ruta Nutrition 0.000 description 1
- 240000005746 Ruta graveolens Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000218998 Salicaceae Species 0.000 description 1
- 241000124033 Salix Species 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 208000034713 Spontaneous Rupture Diseases 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002215 Synaptobrevin Human genes 0.000 description 1
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- -1 aldol carbonyl chemical compounds Chemical class 0.000 description 1
- 150000007824 aliphatic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 235000011399 aloe vera Nutrition 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010461 azide-alkyne cycloaddition reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004082 barrier epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- HSJKGGMUJITCBW-UHFFFAOYSA-N beta-hydroxybutyraldehyde Natural products CC(O)CC=O HSJKGGMUJITCBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 229940053031 botulinum toxin Drugs 0.000 description 1
- CREMABGTGYGIQB-UHFFFAOYSA-N carbon carbon Chemical compound C.C CREMABGTGYGIQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011203 carbon fibre reinforced carbon Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000007248 cellular mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 229910001429 cobalt ion Inorganic materials 0.000 description 1
- XLJKHNWPARRRJB-UHFFFAOYSA-N cobalt(2+) Chemical compound [Co+2] XLJKHNWPARRRJB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical class N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 239000000412 dendrimer Substances 0.000 description 1
- 229920000736 dendritic polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- JNSGIVNNHKGGRU-JYRVWZFOSA-N diethoxyphosphinothioyl (2z)-2-(2-amino-1,3-thiazol-4-yl)-2-methoxyiminoacetate Chemical compound CCOP(=S)(OCC)OC(=O)C(=N/OC)\C1=CSC(N)=N1 JNSGIVNNHKGGRU-JYRVWZFOSA-N 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- PCHPORCSPXIHLZ-UHFFFAOYSA-N diphenhydramine hydrochloride Chemical compound [Cl-].C=1C=CC=CC=1C(OCC[NH+](C)C)C1=CC=CC=C1 PCHPORCSPXIHLZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 1
- 230000004890 epithelial barrier function Effects 0.000 description 1
- 150000002118 epoxides Chemical class 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 208000028331 flaccid paralysis Diseases 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 125000001072 heteroaryl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 231100000171 higher toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical group 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001092 metal group alloy Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000325 methylidene group Chemical group [H]C([H])=* 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004220 muscle function Effects 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-phenylpropan-2-amine Chemical compound CNC(C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002071 nanotube Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 230000003957 neurotransmitter release Effects 0.000 description 1
- 229910001453 nickel ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 239000005022 packaging material Substances 0.000 description 1
- 239000000123 paper Substances 0.000 description 1
- 208000003154 papilloma Diseases 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 244000144985 peep Species 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- VYMDGNCVAMGZFE-UHFFFAOYSA-N phenylbutazonum Chemical compound O=C1C(CCCC)C(=O)N(C=2C=CC=CC=2)N1C1=CC=CC=C1 VYMDGNCVAMGZFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 1
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 230000007026 protein scission Effects 0.000 description 1
- 231100000654 protein toxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000007142 ring opening reaction Methods 0.000 description 1
- 201000005404 rubella Diseases 0.000 description 1
- 235000005806 ruta Nutrition 0.000 description 1
- 235000015067 sauces Nutrition 0.000 description 1
- HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N schardinger α-dextrin Chemical compound O1C(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(O)C2O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC2C(O)C(O)C1OC2CO HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KGBPIIYKHSGTAJ-UHFFFAOYSA-M sodium;8-ethoxyquinoline-5-sulfonate Chemical compound [Na+].C1=CN=C2C(OCC)=CC=C(S([O-])(=O)=O)C2=C1 KGBPIIYKHSGTAJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000024033 toxin binding Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 210000001635 urinary tract Anatomy 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 210000004916 vomit Anatomy 0.000 description 1
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 1
- YYCPSEFQLGXPCO-UHFFFAOYSA-N xi-p-Menth-3-ene Chemical compound CC(C)C1=CCC(C)CC1 YYCPSEFQLGXPCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/33—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Clostridium (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/24—Metalloendopeptidases (3.4.24)
- C12Y304/24069—Bontoxilysin (3.4.24.69), i.e. botulinum neurotoxin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Винахід стосується способу виділення і очищення білка ботулінічного нейротоксину (BoNT) або поліпептиду, який містить рецепторзв'язуючий домен BoNT, з розчину. Вказаний спосіб включає в себе приведення в контакт розчину, який містить білок або поліпептид, з матриксом, який має прикріплений до нього нетоксичний негемаглютинін (NTNHA), в умовах, які підходять для зв'язування, промивання матриксу, щоб тим самим видалити матеріали, які не зв'язались, і елюювання білка або поліпептиду з допомогою розчину, який дисоціює зв'язаний білок від NTNHA. Умови, які необхідні для зв'язування, являють собою рН менше ніж 7,5. Умови, які підходять для дисоціації, являють собою рН, яке перевищує або дорівнює 7,5. Також розкрита композиція, специфічна для заявленого способу.
Description
Винахід стосується способу виділення і очищення білка ботулінічного нейротоксину (ВОоМТ) або поліпептиду, який містить рецепторзв'язуючий домен ВоОМТ, з розчину. Вказаний спосіб включає в себе приведення в контакт розчину, який містить білок або поліпептид, з матриксом, який має прикріплений до нього нетоксичний негемаглютинін (МІТМНА), в умовах, які підходять для зв'язування, промивання матриксу, щоб тим самим видалити матеріали, які не зв'язались, і елюювання білка або поліпептиду з допомогою розчину, який дисоціює зв'язаний білок від
МТМНА. Умови, які необхідні для зв'язування, являють собою рН менше ніж 7,5. Умови, які підходять для дисоціації, являють собою рнН, яке перевищує або дорівнює 7,5. Також розкрита композиція, специфічна для заявленого способу.
ПЕРЕХРЕСНЕ ПОСИЛАННЯ НА СПОРІДНЕНІ ЗАЯВКИ
Ця заявка заявляє пріоритет за попередньою заявкою США Мо 62/336958, поданою 16 травня 2016 року, вміст якої включено в цей документ з допомогою посилання в повному об'ємі.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
Ця специфікація посилається на Перелік послідовностей (поданий в електронному вигляді як.їхі файл з назвою "0342941-0584 51.ТХТ" 16 травня 2017 року). Файл.їхі був створений 16 травня 2017 року, і має розмір 96153 байта. Весь вміст Переліку послідовностей тим самим включений з допомогою посилання.
ГАЛУЗЬ ВИНАХОДУ
Цей винахід відноситься до галузі терапевтичного застосування нейротоксинів.
РІВЕНЬ ТЕХНІКИ
Ботулінічні нейротоксини (ВОоМТ) є найбільш токсичними речовинами, які відомі людині. Було ідентифіковано сім серотипів ВОМТ (А-С); з багатьма підтипами в кожному серотипі. ВОМТ - це білки близько 150 кДа, які продукуються різними штамами бактерії Сіозіідійт Боїшціпит (Мопіаї! 2010). Ці токсини викликають ботулізм у тварин - важке неврологічне захворювання, яке проявляється у вигляді вкрай млявого паралічу і можливої смерті. Молекулярна основа цієї токсичності полягає в здатності ВОМТ зв'язуватися з і проникати в моторні нейрони, і вивільняти в цитозоль свій ферментативний домен, який розщеплює клітинну машинерію, відповідальну за злиття синаптичних бульбашок в нервово-м'язових з'єднаннях (НМ3), і пригнічує нейротрансмісію, блокуючи виділення ацетилхоліну.
Нейро-інгібуюча функція ВОМ була досліджена в якості стратегії лікування багатьох м'язових порушень, починаючи від косоокості і закінчуючи контролем безлічі дистоній (Мазиуег еї а)І., 2014 року), не кажучи вже про різке збільшення косметичних застосувань ВоМТт (А) для індукції млявого паралічу в лицьових м'язах, щоб розгладити зморшки. Ринок ВоМт наближається до 2 мільярдів доларів і продовжує зростати швидкими темпами.
На даний момент існує декілька проблем у виробництві ВОМТ. ВоОМТ необхідно продукувати в бактеріях і виділяти з бактеріальних лізатів. Існуючі терапевтичні ВОМТ все ще продукують і виділяють з використанням старих методик, подібних тим, які мали місце більше 50 років тому, коли була описана перша партія приготованого в лабораторії ВОМТ/А (Вопуепіте 5 Кетре 1959;
Зо Ріскенй 2014 року). Ці способи зазвичай включають в себе тривалу інкубацію/ферментацію природних бактеріальних штамів, які продукують ці токсини (спороутворюючі штами клостридій), і багато наступних трудомістких етапів хроматографії. Крім технічних проблем і проблем стримування, ці процеси можуть також знизити кінцевий вихід, ефективність і відтворюваність препаратів ВОМТ.
В останні роки було досліджено експресовані ВоОМТ рекомбінантно в загальноприйнятих системах господарів, які застосовуються для виробництва білка в промисловості, таких як Е. сої і клітини комах. Афінний тег, такий як Ніз-6 (5ЕО ІЮО МО: 1) або 25Т, зазвичай з'єднують з ВОМТ для полегшення очищення з допомогою афінної очистки. Хоча виділення рекомбінантного ВОМТ з допомогою афінних тегів спрощує етапи очищення, воно призводить до нових проблем. Тег може мати негативний вплив на біологічну активність токсину та/або мати небажану антигенність. В результаті тег повинний бути вилучений після очищення, що пов'язано з додатковими стадіями ферментативної обробки і очищення. Крім того, часто залишаються додаткові залишки, прикріплені до токсину, які залишилися від відщепленного тега, що створює нерідні М- або С-кінці, які можуть впливати на активність або призводити до імунологічних наслідків у пацієнта.
Виділення природних форм ВОМ є набагато кращим, але залишається процесом, який є трудомістким і займає багато часу.
Очищені ВоМТ повинні бути додатково активовані з допомогою обмеженого протеолізу перед застосуванням. Рекомбінантні ВоМТ зазвичай активують після очищення шляхом інкубації з ендопротеїназою, такою як трипсин. Така активація може викликати неспецифічну деградацію і вимагає додаткової стадії очищення для видалення активуючої ендопротеїнази, і те і інше знижує активність токсину і вихід.
СУТНІСТЬ ВИНАХОДУ
Як буде очевидно фахівцям в цій галузі техніки при читанні цього розкриття винаходу, цей винахід охоплює усвідомлення проблеми щодо композицій і способів продукування, очищення та/або активації ботулинічних нейротоксинів (ВОоМТ), або їх частин, або їх фрагментів. Серед іншого, цей винахід позначає труднощі забезпечення матеріалів і процедур, які полегшують продукування, очищення та/або активацію ВоОМІ з бажаними характеристиками (наприклад, відносно незмінна біологічна активністьх обмежене внесення небажаної антигенності; 60 обмеження по забруднюючим речовинам, таким як небажані ендопротеїнази та/або продукти розпаду, і також високу якість, ефективність та/або відтворюваність бажаного ВоМТ), одночасно зменшуючи обмеження попередніх підходів (наприклад, обмежена ефективність продукування, часозатратні та/або трудомісткі кроки та/або жорсткі умови).
Один аспект винаходу відноситься до молекули, яка містить поліпептид нетоксичного негемагглютиніна (МТМНА), ковалентно зв'язаний з гетерологічним афінним фрагментом. В одному варіанті здійснення, МІТМНА і афінний фрагмент експресуються у вигляді гібридного білка. В одному варіанті здійснення розкритих в цьому документі композицій, афінний фрагмент розташований в позиції, яка вибрана з групи, що складається з: М-кінця амінокислотної послідовності МТМНА, С-кінця амінокислотної послідовності МТМНА, і всередині по відношенню до амінокислотної послідовності МІТМНА. В одному варіанті здійснення розкритих в цьому документі композицій, афінний фрагмент ефективно зв'язує мішень зв'язування в умовах від близько рН 6 до близько рН 8. В одному варіанті здійснення розкритих в цьому документі композицій, афінний фрагмент вибирають з групи, яка складається з: глутатіон-5-трансферази (5), тега С-птус, домену який зв'язує хітин, білка який зв'язує стрептавідин (5ВР), домену який зв'язує целюлозу, пептиду який зв'язує кальмодулін, 5-тега, бігер-тега ІІ, РГА, білка А, білка С, гістидинового афінного тега (НАТ), полі-Ніє і білка який зв'язує мальтозу (МВР). В одному варіанті здійснення розкритих в цьому документі композицій, МІМНА походить з серотипу А, В, С1, 0, Е, Е або а. В одному варіанті здійснення розкритих в цьому документі композицій, МТМНА походить з серотипу В. В одному варіанті здійснення розкритих в цьому документі композицій, молекула знаходиться в комплексі з сумісним ботулінічним нейротоксином (ВоМТ) або поліпептидом, який містить його рецептор-зв'язуючий домен. В одному варіанті здійснення розкритих в цьому документі композицій, ВОМТ або поліпептид містить модифікований рецептор-зв'язуючий домен Сіовігідіа! роїшіпит серотипу В (В-Не). В одному варіанті здійснення розкритих в цьому документі композицій, молекула додатково зв'язана з мішенню зв'язування через афінний фрагмент. В одному варіанті здійснення розкритих в цьому документі композицій, мішень зв'язування стабільно прикріплена до матриксу.
Інший аспект винаходу відноситься до водного розчину, який містить одну з описаних в цьому документі молекул.
Інший аспект винаходу відноситься до нуклеїнової кислоти, яка кодує гібридний білок одного з функціональних МТМНА і афінного фрагмента, описаних в цьому документі.
Інший аспект винаходу відноситься до вектору експресії, який містить нуклеїнову кислоту, яка кодує гібридний білок одного з функціональних МТМНА і афінного фрагмента, описаних в цьому документі.
Інший аспект винаходу відноситься до клітини-господаря, яка містить і експресує нуклеїнову кислоту, яка кодує гібридний білок одного з функціональних МТМНА і афінного фрагмента, описаних в цьому документі. В одному варіанті здійснення, клітина-господар додатково експресує сумісний ботулінічний нейротоксин (ВоМТ). В одному варіанті здійснення описаних в цьому документі клітин-господарів, ВОМТ містить модифікований рецептор-зв'язуючий домен
Сіовігідіа! боїшіїпит серотипу В (В-Не). В одному варіанті здійснення описаних в цьому документі клітин-господарів, клітина-господар є прокаріотичною або еукаріотичною.
В одному варіанті здійснення описаних в цьому документі клітин-господарів, клітина- господар являє собою бактеріальну клітину, дріжджову клітину, клітину ссавця, клітину комахи, рослинну клітину або клітину земноводного.
Інший аспект винаходу стосується способу очищення ботулінічного нейротоксину (ВОоМТ), який включає контактування ВоМІ з сумісним нетоксичним негемагглютиніном (МТМНА) в умовах, які підходять для зв'язування МІТМНА з ВоМТ для того, щоб сформувати комплекс
МТМНА-ВоМТ. В одному варіанті здійснення, ВОМ знаходиться в розчині, і МТМНА прикріплюють до матриксу, при цьому розчин приводять у контакт з матриксом, щоб таким чином з'єднати ВОМТ з МТМНА. В одному варіанті здійснення способів, описаних в цьому документі, спосіб додатково включає в себе промивання матриксу, щоб тим самим видалити матеріали які не зв'язались, і елюювання ВОМ з матриксу шляхом контактування матриксу з водним розчином, який дисоціює ВОМТ з комплексу МІГМНА-ВоМТ. В одному альтернативному варіанті здійснення способів, описаних в цьому документі, після контактування розчину ВОМТ з матриксом МТМНА, спосіб додатково включає в себе: промивання матриксу, щоб тим самим видалити матеріали які не зв'язались, приведення в контакт матриксу з протеазою в умовах, які зберігають комплекс МІТМНА-ВоМТ і підходять для розщеплення ВоМІ в комплексі МТМНА-
ВоМТ, промивку матриксу, щоб тим самим видалити протеазу і незв'язані матеріали, і елюювання ВоОоМІ з матриксу шляхом контактування матриксу з водним розчином, який 60 дисоціює ВОМТ з комплексу МІТМНА-ВоМТт. В одному варіанті здійснення способів, описаних в цьому документі, МТМНА ковалентно зв'язаний з афінним тегом, матрикс зв'язаний з мішенню зв'язування афінного тега, а МІМНА нековалентно зв'язаний з матриксом з допомогою взаємодій афінного фрагмента і мішені зв'язування. В одному варіанті здійснення способів, описаних в цьому документі, МТМНА ковалентно зв'язаний з матриксом. В одному варіанті здійснення способів, описаних в цьому документі, ВОМТ містить модифікований рецептор- зв'язуючий домен Сіозігліаїа! Боїшцітіт серотипу В (В-Не). В одному варіанті здійснення способів, описаних в цьому документі, водний розчин, який дисоціює ВОМТ з комплексу МІТМНА-ВОоМТ, має рН 2 7,5. В одному варіанті здійснення способів, описаних в цьому документі, розчин, який містить ВОМТ, являє собою очищений клітинний екстракт з клітин які експресують ВоМТ. В одному варіанті здійснення способів, описаних в цьому документі, очищений клітинний екстракт додатково містить 1 мМ фенілметилсульфонілфториду (РМ5БЕ). В одному варіанті здійснення способів, описаних в цьому документі, умови, які підходять для зв'язування, включають в себе контактування ВоМТ в складі зв'язуючого буфера, який має фізіологічну іонну силу і рН « 7,5. В одному варіанті здійснення способів, описаних в цьому документі, промивку проводять промивним буфером, який має фізіологічну іонну силу з рН « 7,5. В одному варіанті здійснення способів, описаних в цьому документі, буфер зв'язування та/або промивний буфер містить між 100-200 мМ КС або Масі. В одному варіанті здійснення способів, описаних в цьому документі, буфер зв'язування та/або промивний буфер має рН близько 6. В одному варіанті здійснення способів, описаних в цьому документі, буфер зв'язування та/або промивний буфер містить 50
ММ МЕБ5, 150 мМ Масі, рН 6. В одному варіанті здійснення способів, описаних в цьому документі, водний розчин, який дисоціює ВОМТ з комплексу МІТМНА-ВоМТ, являє собою буфер для елюювання близько 50 мМ Тріс, 150 мМ Масі. В одному варіанті здійснення способів, описаних в цьому документі, водний розчин являє собою буфер для елюювання з рН близько 8.
В одному варіанті здійснення способів, описаних в цьому документі, афінний фрагмент вибирають з групи, яка складається з: глутатіон-5-трансферази (51), тега С-птус, домену який зв'язує хітин, білка який зв'язує стрептавідин (ВР), домену який зв'язує целюлозу, пептиду який зв'язує кальмодулін, 5-тега, бЗігер-тега ІІ, ЕГА, білка А, білка С, гістидинового афінного тега (НАТ), полі-Нізв і білка який зв'язує мальтозу (МВР).
В одному варіанті здійснення способів, описаних в цьому документі, афінний фрагмент
Зо являє собою С5Т, а мішенню зв'язування є глутатіон.
В одному варіанті здійснення способів, описаних в цьому документі, МТМНА присутній в молярному співвідношенні між близько 1:1 і близько 10:11 до ВоМТ, наприклад близько 2:71, 3:1, 41 або 5:11 до ВоМТ. В одному варіанті здійснення способів, описаних в цьому документі, ВОМ і
МТМНА ко-експресуються в одній і тій же клітині-господарі, наприклад Е. соїї. В одному варіанті здійснення способів, описаних в цьому документі, ВОМТ і МТМНА експресуються в різних клітинах-господарях. В одному варіанті здійснення способів, описаних в цьому документі, ВОМТ продукують рекомбінантним способом в гетерологічній клітині-господарі, такому як Е. сої. В одному варіанті здійснення способів, описаних в цьому документі, ВОМТ продукують в його нативній клостридіальній клітині. В одному варіанті здійснення способів, описаних в цьому документі, МІМНА продукують рекомбінантним способом в гетерологічній клітині-господарі, такій як Е. соїї. В одному варіанті здійснення способів, описаних в цьому документі, МТМНА продукують в його нативній клостридіальній клітині.
В одному варіанті здійснення способів, описаних в цьому документі, протеаза вибрана з трипсину, пепсину, ендопротеїнази Іуз-С, ендопротеїнази Іуз-М, аргінільної ендопептидази, плазміну, омптина і клостридіальної протеази, як описано в ЕР2524963. У бажаному варіанті здійснення, протеаза являє собою трипсин або ендопротеїназу І уз-С. В одному варіанті здійснення, протеаза є протеазою, яка розщеплює нативний (тобто екзогенний) сайт розщеплення ВоОМТ. У таких клостридіальних токсинах нативний сайт розщеплення протеазою (також відомий як сайт активації) модифікують або замінюють сайтом розщеплення протеазою, який не є нативним для даного клостридіального токсину. Ненативні протеази, які можуть бути застосовані, включають в себе ентерокіназу (0ООБОК), (ЗЕО ІО МО: 2)), фактор Ха (ІЕС) (ЗЕО
ІО МО: 3) ІРОН) (ЗЕО ІО МО: 4)), ТЕМ (Торассо Ес міги5) (ЕМ МЕО Са (ЗЕО ІО МО: 5)), тромбін (ГМРАа5 (ЗЕО ІО МО: 6)) і Ргебсівзвіоп (І ЕМ ЕОДСОР (ЗЕО ІО МО: 7)).
В одному варіанті здійснення способів, описаних в цьому документі, протеазу додають в молярному співвідношенні від близько 1:2 до близько 1:1000 до МТМНА, бажано від близько 1:5 до близько 1:100 до МТМНА, наприклад, близько 1:10, 1:20, 1:30, 1:40 або 1:50. В одному варіанті здійснення способів, описаних в цьому документі, протеазу додають в молярному співвідношенні від близько 1:2 до близько 1:1000 до ВоМТ, бажано від близько 1:5 до близько 1:100 до ВоМТ, наприклад близько 1:10, 1:20, 1:30, 1:40 або 1:50. Придатні умови для конкретної бо протеази, що застосовується, будуть визначені фахівцем в цій галузі техніки. Тривалість дії протеази також буде варіювати в залежності від протеази, концентрації, що застосовується, і температури. В одному варіанті здійснення способів, описаних в цьому документі, протеазу приводять у контакт з матриксом при температурі від близько 2 "С до близько 40 "С, більш бажано від близько 4 "С до близько 37 "С, наприклад при 4 "С, 16 "С, 20 "С або 37 "С. В одному варіанті здійснення способів, описаних в цьому документі, протеазу приводять у контакт з матриксом при кімнатній температурі (близько 20-22 С). В одному варіанті здійснення способів, описаних в цьому документі, протеазу приводять у контакт з матриксом впродовж від близько хвилин до близько 18 годин, бажано від близько 30 хвилин до близько 5 годин, наприклад, близько 30 хвилин, 1 години, 2 годин, З годин, 4 годин або 5 годин. В одному варіанті здійснення 10 способів, описаних в цьому документі, протеазу приводять у контакт з матриксом при рН від близько 5,5 до близько 8,5, бажано від близько 6 до 8, наприклад, при рН близько 6, 7 або 8. В одному варіанті здійснення, протеазу вибирають з протеаз: трипсин і ендопротеїназа І уз-С, і приводять у контакт з матриксом при кімнатній температурі впродовж близько від 30 хвилин до 2 годин, при рН від Є до 7.
В одному варіанті здійснення способів, описаних в цьому документі, протеазу додають в молярному співвідношенні близько 1:10 до МТМНА. В одному варіанті здійснення способів, описаних в цьому документі, протеазу приводять у контакт з матриксом при кімнатній температурі. В одному варіанті здійснення способів, описаних в цьому документі, протеазу приводять у контакт з матриксом впродовж близько від 30 хвилин до 12 годин.
Інший аспект винаходу стосується способу очищення ботулінічного нейротоксину (ВОоМТ), який включає в себе: приведення в контакт очищеного клітинного екстракту, який містить ВОМТ, з матриксом, покритим глутатіоном, який має прикріплений до нього сумісний нетоксичний негемагглютинін (МТМНА), злитий з глутатіон-5-трансферазою, в буфері для зв'язування з рн близько 6, щоб тим самим сформувати комплекс МІТМНА-ВоМТт; промивку матриксу промивним буфером з рН близько б, щоб таким чином видалити незв'язаний матеріал; приведення в контакт матриксу з протеазою в буфері з рН близько 6, щоб тим самим розщепити ВОМ в комплексі МІТМНА-ВоМТ; промивку матриксу промивним буфером з рН близько 6, щоб таким чином видалити протеазу і матеріал який не зв'язався; і елюювання ВоМТт з матриксу, шляхом приведення в контакт матриксу з буфером для елюювання, який має рн г 7,5, щоб таким чином дисоціювати ВоОМТ з комплексу МІТМНА-ВоОоМТ. В одному варіанті здійснення способів, описаних в цьому документі, ВОМ містить модифікований рецептор-зв'язуючий домен Сіовігіаіа! рошіїпит серотипу В (В-Не). В одному варіанті здійснення способів, описаних в цьому документі, буфер зв'язування та/"або промивний буфер містить 50 мМ МЕ5, 150 мМ Масі. В одному варіанті здійснення способів, описаних в цьому документі, буфер зв'язування додатково містить 1 мМ фенілметилсульфонілфториду (РМ5БЕ). В одному варіанті здійснення способів, описаних в цьому документі, буфер для елюювання містить 50 мМ Тріс, 150 мМ Масі, і має рН близько 8. В одному варіанті здійснення способів, описаних в цьому документі, матрикс, покритий глутатіоном, являє собою зв'язані з глутатіном агарозні гранули. В одному варіанті здійснення способів, описаних в цьому документі, матрикс, покритий глутатіоном, являє собою колонку. В одному варіанті здійснення способів, описаних в цьому документі, матрикс, покритий глутатіоном, має близько 5 мг/мл зв'язаного МІТМНА. В одному варіанті здійснення способів, описаних в цьому документі, протеаза являє собою трипсин або ендопротеїназу І уз-0.
Інший аспект винаходу стосується способу очищення поліпептиду, який містить рецептор- зв'язуючий домен (Но-поліпептид) ботулінічного нейротоксину, який включає стадії: приведення в контакт розчину, який містить поліпептид Нс, з матриксом, який має прикріплений до нього сумісний нетоксичний негемагглютинін (МТМНА), в умовах, які підходять для зв'язування МІМНА з поліпептидом Нс, щоб таким чином сформувати поліпептидний комплекс МТМНА-Нсе; промивку матриксу, щоб тим самим видалити матеріали які не зв'язались; і елюювання поліпептиду Не з матриксу шляхом приведення в контакт матриксу з водним розчином, який дисоціює Нос- поліпептид з поліпептидного комплексу МТМНА-Нс. В одному варіанті здійснення способів, описаних в цьому документі, рецептор-зв'язуючий домен поліпептиду Нс являє собою модифікований рецептор-зв'язуючий домен Сіовігаїа! роїшійпит серотипу В (В-Не). В одному варіанті здійснення способів, описаних в цьому документі, поліпептид Нс являє собою поліпептид ботулінічного нейротоксину (ВОоМТ). В одному варіанті здійснення способів, описаних в цьому документі, поліпептид Нс являє собою химерний поліпептид ботулінічного нейротоксину (ВОМ).
Інший аспект винаходу відноситься до застосування описаної в цьому документі молекули в способі очищення поліпептиду ботулінічного нейротоксину (ВОМТ).
КОРОТКИЙ ОПИС ГРАФІЧНИХ МАТЕРІАЛІВ
Цей патент або файл заявки містить щонайменше один графічний матеріал, виконаний в кольорі. Копії цього патенту або публікації патентної заявки з кольоровими графічними матеріалами будуть надані Управлінням по запиту і з оплатою необхідного мита.
Фіг. 1А і Фіг. 18 - ілюстрація варіанту здійснення принципу очищення і протоколу для ВоМТ, як описано в цьому документі. Фіг. ТА) Схематична ілюстрація рН-залежного бімолекулярного комплексоутворення ВоМТт і МТМНА. ЛЛ: легкий ланцюг, НМ: домен транслокації, НОМ, НСС: М- кінцева і С-кінцева частини рецептор-зв'язуючого домену, відповідно. МІТМНА має такий же доменний вміст, як і ВоОМтТ, показано як злитий з СТ білок (глутатіон-5-трансфераза) іммобілізований на глутатіон-агарозній смолі. Фіг. 18) Блок-схема, яка описує повний протокол очищення, активації і елюювання ВОМТ із застосуванням їх природного партнера по зв'язуванню
МТМНА.
Фіг. 2А і Фіг. 28 - зображення гель-фракціонованих білків.
Експериментальні результати вказують на успішне очищення ВоМТт/В із застосуванням
МТМНА/В в якості модельного комплексу для ВоМТт. Фіг. 2А) Застосовується моноклональне антитіло до ВоОМТ/В для контролю наявності ВОоМТ/В на кожній стадії очищення, які показані на
Фіг. 18 (за винятком того, що зразки тут не оброблялися трипсином). Фіг. 28) Гель ДСН-ПААГ електрофореза вибраних зразків, пофарбованих Кумассі, показує чистоту очищеного ВОМТ/В, як показано на панелі А. Основна смуга (близько 150 кДа), яка відповідає ВОМТ/В, спостерігається в елюйованій фракції.
Фіг. ЗА і фіг. ЗВ - зображення двох наборів гель-фракціонованих білків.
Експериментальні результати показують, що ВоМТ/В ефективно активується в комплексах
МТМНА/В:ВоОМТ/В. Фіг. ЗА) Ілюстративний імуноблот МТМНА-зв'язаного ВоМТ/В, активованого трипсином, який розділяє ВОМІТ/В на два фрагмента (100 кДа і 50 кДа відповідно). Два фрагменти ВОоМТ/В залишаються зв'язаними один з одним одним дисульфідним зв'язком. Вони відокремлюються один від одного при додаванні ДТТ, для руйнування дисульфідного зв'язку.
Фіг. 38). Пофарбована Кумассі елюйована фракція показує смуги токсинів, які відповідають фрагментам розщепленого токсину (на 100 ї 50 кДа, відповідно). Смуга 150 кДа є частиною повнорозмірного токсину, який ще має бути розщеплений.
Фіг. 4 являє собою зображення гель-фракціонованих білків.
Зо Експериментальні результати підтверджують успішне очищення химерного токсину
ВОоМТ/АТВ із застосуванням МТМНА/В. Поліклональні антитіла до ВоМТ/А застосовували для спостереження за стадіями очищення химерного токсину ВоМТ/АТВ, який був складений з легкого ланцюга і транслокаційної області ВоМТ/АТ, і рецептор-зв'язуючого домену з ВоМТ/В.
Повнорозмірний ВоМТ/АТВ (смуга 150 кДа в елюйованій фракції) був успішно очищений і елюйований із застосуванням МТМНА/В. Відзначимо, що чітка смуга на 100 кДа є продуктом руйнування цього химерного токсину, який, ймовірно, розщеплюється ендогенними протеазами в Е. сої.
Фіг. БА-5І (ЗЕО ІЮО МО: 22-30) являють собою список амінокислотних послідовностей різних серотипів МТМНА та їх варіантів.
Фіг. бА-6С є ілюстрацією варіанта здійснення принципу очищення і протоколу для ВОоМТ, як описано в цьому документі. Фіг. бА) Схематична ілюстрація рН-залежного бімолекулярного комплексоутворення ВОМ і МТМНА. ЛЛ: легкий ланцюг, Нм: домен транслокації, Нем, Нос: М- кінцева і С-кінцева частини рецептор-зв'язуючого домену, відповідно. МІТМНА має такий же доменний вміст, як і ВОМТ, і показано як злитий з СОТ білок (глутатіон-5-трансфераза) може бути іммобілізований на глутатіон-агарозній смолі. Взаємодія між ВоМТт і МТМНА в слабокислих умовах (наприклад, близько рН б) може бути порушена шляхом змін буферних умов в сторону нейтрально-лужного рн. Фіг. 68) Протокол виділення і активації ВОМТ. Блок-схема, яка описує стратегію очищення, активації і елюювання тегованих і нетегованих ВОМ з сирих лізатів із застосуванням МТМНА. Фіг. 6С) ДСН-ПААГ електрофорез аналіз типового виділення неактивного ВОМТ (ВоМТ/В(ву)) з фільтрованого лізату Е. соїї, із застосуванням С5Т-МТМНА/В, іммобілізованого на глутатіон-агарозних гранулах. Стадії зв'язування і промивання проводили при рН 6 іелюювали шляхом заміни буфера до рн 8.
Фіг. 7А і Фіг. 7В показують, що ВоМТ/В, виділений із застосуванням іммобілізованого МТМНА,
Є чистим і зв'язує його канонічний нейронний рецептор. Фіг. 7А). Аналіз ДСН-ПААГ електрофорез (ліворуч) показує три елюйовані фракції, які об'єднують і концентрують (лунка 5).
Моноклональне антитіло до ВоМТ/В для виявлення токсину на всіх стадіях (ВБ, справа).
Елюйовані фракції містять неактивований ВоМТ/В в якості основної смуги на близько 150 кДа, що відповідає одноланцюговому токсину ВоОМТ/ВБВ(ву. Фіг. 7В). Зв'язування, виявлене з допомогою анізотропії: елюйований повнорозмірний токсин показує подібну афінність до РІТО- бо міченого фрагменту його канонічного рецептора синапротогаміна 1 синаптичної везикули (БУ 1)
з його рекомбінантним доменом Несе; ВоМТ/А Не не зв'язує Буї. Планки похибки являють собою середнє значення ї- СПС З зразків.
Фіг. 8А-8С показують, що ВОМ в комплексі ефективно активується, і в той же час захищений від неспецифічного розщеплення. Фіг. 8А) Трипсин-опосередкована активація (розщеплення) ВоОоМІМВ(ну, візуалізована з допомогою 8595 ДСН-ПААГ електрофорезу.
Розщеплення з часом одноланцюгового (50) токсину призводить до появи двох фрагментів: важкого ланцюга (НС) і легкого ланцюга (І С), з'єднаних одним дисульфідним зв'язком. Фіг. 88)
Аналіз ВБ показує, що активація ВоОМТ/В в комплексі з МТМНА/В захищає його від неспецифічної трипсинізації дозволяючи ефективно промивати і видаляти ендопротеїназу. Фіг. 8С)
Ендопротеїназа І уз-С також може бути застосована в якості специфічного активатора для продукування активних, дволанцюгових токсинів, застосовуючи цей спосіб.
Фі. 9 показує виділення химерного токсину ВОМТ/А1В1 із застосуванням МТМНА/В.
Поліклональне антитіло до ВоМТ/А застосовують для спостереження за очищенням химерного токсину, складеного з ВОМТ/А (І Св, Нм), злитого з доменом ВоМТ/В Не. Елюйовані фракції містять неактивований білок ВОМТ/АТВІ на близько 150 кДа. Явна смуга на близько 70 кДа, ймовірно, є фрагментом МІ/МНА/В, який розпізнається поліклональним антитілом.
ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС ДЕЯКИХ ВАРІАНТІВ ЗДІЙСНЕННЯ ВИНАХОДУ
Ботулінічні нейротоксини (ВоМТ) являють собою сильнодіючі білкові токсини, які продукуються спороутворюючою Сіозігіаішт пошіїпит. В останні кілька десятиліть ці смертельні агенти були визнані корисними при лікуванні численних нервово-м'язових порушень і в естетичних цілях, блокуючи вивільнення нейротрансмітера в ін'єктованих м'язах. На даний момент визнані як терапевтичні агенти, ВОМТ широко виробляються у великих масштабах декількома виробниками по всьому світу. Наявні дані свідчать про те, що виробничі процедури засновані на способах багаторічної давності, в яких застосовуються спороутворюючі штами, а виділення токсинів проводять з допомогою численних трудомістких і неефективних стадій масового очищення. Є необхідним удосконалений спосіб прямого очищення і активації терапевтичних ВоОМТ.
Ботулінічні нейротоксини (ВОоМТ) є найбільш токсичними речовинами, які відомі людині. Сім серотипів білків ВОМТ (А-Сї) були ідентифіковані як близько 150 кДа продукти різних штамів
Зо бактерії Сіовзігіаійт роїшіїпит (Мопіа! 2010). Ці токсини викликають ботулізм у тварин - важке нервово-м'язове захворювання, яке проявляється у вигляді вкрай млявого паралічу.
Молекулярна основа цієї токсичності полягає в здатності токсинів ефективно зв'язуватися з рецепторами на моторних нейронах в нервово-м'язовому з'єднанні (НМ3), поглинатись з допомогою ендоцитозу, і проходити ендосомну мембрану, вивільняючи свій ферментативний ланцюг в цитозоль. Потім вивільнена протеаза розщеплює клітинну машинерію (білки 5МАВЕ), відповідальну за злиття синаптичних бульбашок в НМ3, тим самим пригнічуючи нейропередачу, блокуючи вивільнення ацетилхоліну (Віазі єї аІ. 1993; Вогаєп І асу еї аЇ. 1998; Воззено вї аї. 2014 року).
Ботулінічні нейротоксини (ВоОМТ) також можуть бути застосовані в якості інструментів для локального контролю м'язових функцій, особливо неконтрольованих дій або порушень внаслідок м'язової еластичності (Мазиуеєг єї аї!., 2014 року). Ця нейро-інгібуюча функція ВОМТ була вивчена в якості стратегії лікування багатьох м'язових порушень, включаючи косоокість, і для контролю безлічі дистоній і дисфункцій нижніх сечових шляхів (І ОТО) (ЧапКоміс 4. Вгіп 1991;
Ттцопуд й добі 2006; Мівсо єї аі. 2012; діапуд єї а). 2015). В якості терапевтичного та/або косметичного агента ВоМТ можуть застосовувати для паралізації лицьових м'язів з метою розгладження зморшок (Нехзеї еї аї., 2011). Додаткові застосування токсинів спрямовані на полегшення депресії і профілактичне лікування мігрені (Ріпгі 5 Возепіна! 2014; УЧасквоп еї аї., 2012). Клінічні застосування токсину викликають великий суспільний інтерес (5інепіп 2017).
Ботулінічні нейротоксини (ВОоМТ) можуть бути виділені з культури спороутворюючого штаму клостридій і потім очищені до кінцевого продукту (Ріскей 2014 року). Наявні дані про виробничі процеси і виділення ВоОМТ дозволяють припустити, що виробники застосовують способи умов культивування і вирощування нативних штамів, які аналогічні тим, які використовувались десятиліття назад (РісКейй 4 Регтом/ 2009; Зпіре 6 бБоттег 1928; Юий, МУтідні, еї аІ. 1957; Бий,
Кіегег, вї а. 1957; Вопумепігте 5 Кетре 1959; 5спапі» 6. доНп5оп 1992; РісКеїйї 2014). Такі способи обмежені по ефективності, при яких нативний штам клостридії може продукувати токсин, і зазвичай включають в себе тривалі періоди ферментації природного джерела токсину (спороутворюючих штамів клостридій), після чого слідують трудомісткі процедури виділення токсинів, часто в жорстких умовах з кількома кислотними/спиртовими осадженнями, кристалізаціями та/або численними стадіями хроматографії (СазСиріа 8 Вогоїї 1967; Т5е 6ї аї. 60 1982; Зспапіг в допп5оп 1992; Маїїгіо єї аї. 2000).
Виробництво тегованих ВоМТ рекомбінантно можливе з включенням афінного тега (наприклад, Нізвх або СЗТ -вбудування) для полегшення очищення токсинів застосовуючи афінні хроматографії. Проте, такі підходи мають недоліки, наприклад, при застосуванні ВОМТ в якості терапевтичних біологічних препаратів. Наприклад, афінні теги можуть мати негативний вплив на біологічну активність токсину талабо мати небажану антигенність. Видалення тега після очищення також вимагає додаткових стадій ферментації і очищення, в результаті одержуючи не-нативні М- або С-кінці в кінцевому продукті. Додатково, рекомбінантні ВоМТ необхідно активувати з допомогою ендопротеїнази після очищення, для отримання функціональних і ефективних дволанцюгових токсинів. Ця протеолітична стадія призводить до неспецифічного руйнування, що робить необхідними додаткові стадії очищення для видалення ендопротеїназ та/або продуктів руйнування. Крім інженерних проблем і проблем безпеки виробництва токсинів з спороутворюючих штамів, і наступних очищень (Маїїгіо єї аї., 2000; Ріскей 2014 року), ці рекомбінантні підходи можуть порушити більшість властивостей кінцевого продукту, починаючи від якості і активності до ефективної відтворюваності. Нова стратегія безпечного і ефективного виділення активних терапевтичних ВОМТ буде корисна для широкомасштабного виробництва і легкого виділення ВоМТ.
Дослідження біохімічних властивостей і клітинних механізмів, з допомогою яких клостридіальні нейротоксини проникають в цитозоль нейронів, забезпечили деяке розуміння структурних, молекулярних і механістичних функцій клостридіальних нейротоксинів (Віабі єї аї. 1993; Вогаєп І асу єї а. 1998; опо еї а. 2006; Новззейцо 6вї аї!. 2014 року). Ботулізми, пов'язані з харчовими продуктами, вимагають проходження інтактних токсинів та інших продуктів бактерій через шлунково-кишковий тракт господаря. Молекулярна і структурна основа такої можливості уникати руйнування залишалась загадкою до недавнього часу, коли більші комплекси, названі "комплекси попередників токсинів" (КПТ), були охарактеризовані як такі, що складають весь токсичний агент, з яким стикається організм-мішень. На додаток до протеолітично активного токсину, ці мультибілкові комплекси зазвичай складаються з серотип-специфічного білка нетоксичного негемагглютиніна (МТМНА) і трьох гемагглютинінових білків (НА) (І єе евї аї., 2014 року). Раніше розглядались як такі, що сприяють функціям токсину (Зспапі? в доппзоп 1992),
КПТ тепер, як відомо, фізично затуляють і захищають ВоМТ від суворого шлунково-кишкового
Зо середовища для безпечного досягнення його мішеней: спочатку епітеліальних бар'єрів, а потім
НМЗ3, де він може бути поглинений в цитозоль через механізми рециркуляції синаптичних везикул. У структурному дослідженні (С1и єї а!., 2012) Си ії колеги вказали на атомні елементи мінімально ефективного РТС (т-РТС) в нековалентному комплексі ВоМТ/А:"МТМНА/А. Ко- кристалічна структура комплексу токсин':МТМНА показала рН-залежне формування комплексу.
Повідомлялося, що ВОоМТ/А і МТМНА/А можуть утворювати щільний комплекс з афінністю наномолярного рівня в злегка кислих умовах (близько рН 6). Однак таке формування комплексу, як було сказано, не відбувається при нейтрально-лужному рн.
В цьому документі розкриті композиції і способи, які відносяться до очищення ВоОМТ, які використовують природну афінність молекули ВОМ до білка нетоксичного негемагглютиніна (МТМНА). ВоМТ природним чином формує димерний комплекс з білююм шаперон МТМНА і захищений від протеази і кислотного руйнування в шлунково-кишковому тракті. Зв'язування є оборотним і залежить від рН, зв'язуючись при рН більше 7, і дисоціюючи при рН менше 7,4.
Білок МТМНА додають до суміші, яка містить ВОоМТ, при рН, який сприяє зв'язуванню. Комплекс
ВОМ: МТ МНА виділяють з інших компонентів суміші шляхом іммобілізації МТМНА в комплексі.
Після промивання ВоМІ вивільняють з комплексу шляхом підвищення рН для сприяння дисоціації. Можуть бути очищені немічені форми токсину, оскільки цей спосіб не залежить від афінної модифікації ВОМТ.
Описані в цьому документі способи очищення також дозволяють активувати ВоМТ в комплексі ВОМТ:МТМНА. Після активації ВОМТ може бути вивільнений з комплексу, тим самим отримуючи очищену активовану форму токсину.
Аспекти винаходу відносяться до способу очищення ВоМТ. Зазвичай ВоМТтТ знаходиться в складі водного розчину, який містить забруднюючі компоненти, такого як клітинний екстракт.
Спосіб включає в себе об'єднання розчину з молекулою МТМНА в умовах, які підходять для зв'язування ВОМТ з МТМНА. Фактично це може включати об'єднання молекули МТМНА з водним розчином (наприклад, клітинним екстрактом або очищеним клітинним екстрактом). ВОМТ може бути виділений з допомогою молекули МТМНА. В цілому, як правило, це досягається шляхом іммобілізації МІТМНА на матриксі. Незв'язані матеріали видаляють з комплексу, наприклад, шляхом промивання матриксу (наприклад, застосовуючи кількість промивного буфера у вигляді 3-4 об'ємів матриксу). Після промивання ВОМ вивільняють з комплексу, наприклад, шляхом бо елюювання з матриксу зв'язаного МТМНА для отримання очищеного поліпептиду.
ВОоМТт може бути активований до вивільнення з комплексу шляхом розщеплення протеазою.
Це може бути досягнуто шляхом приведення в контакт зв'язаного з матриксом комплексу з протеазою в умовах, придатних для розщеплення ВОМ, які в решті не руйнують комплекс (наприклад, зберігають необхідний рН). Протеазу видаляють разом з іншими матеріалами які не зв'язались шляхом промивання матриксу (наприклад, промивним буфером). Потім активований очищений ВоМТ може бути елюйований шляхом приведення в контакт матриксу з водним розчином, який дисоціює ВОМТ з комплексу МТМНА (наприклад, за допомогою буфера для елюювання). У деяких варіантах здійснення, активація поліпептиду не потрібна або не бажана.
МТМНА, який застосовується в способі, повинний бути сумісний з ВОоМТ.
Термін "сумісний" при використанні щодо МТМНА і ВоМТ відноситься до молекул, здатних формувати щільний і стабільний комплекс одна з одною. В одному варіанті здійснення, ВоМТ і
МТМНА є компонентами одного і того ж природного білкового комплексу серотипу ВОМТ. Це відбувається, коли послідовності, які кодують ВоМТ і МТМНА, походять з одного і того ж оперона. Оскільки термін "серотип" застосовується в цьому документі для опису молекули
МТМНА, бути "з серотипу" відноситься до молекули МТМНА, отриманої з оперона, який кодує певний серотип ВОоМТт. Сумісність може також відноситись до ВоОМТ або химерного поліпептиду, який має область (наприклад, область Нс), яка сумісна з МТМНА. В одному варіанті здійснення,
МТМНА і область Несе ВоМТ отримані з одного і того ж природного комплексу серотипу ВОоМТ.
Іммобілізація МІТМНА на матриксі може відбуватися до або після зв'язування ВоМТ. В одному варіанті здійснення, МТМНА прикріплюють до матриксу, і до матриксу додають розчин, який містить ВОМТ, щоб таким чином привести в контакт поліпептид Не з МТМНА, і забезпечити формування комплексу. В одному варіанті здійснення, МІТМНА ії ВоМТ знаходяться в комплексі до приєднання МТМНА до матриксу.
В одному варіанті здійснення, афінний фрагмент вносять в білок МТМНА (наприклад, шляхом експресії у вигляді гібридного білка), і тегований білок застосовують для зв'язування і виділення ВОоМТ в умовах, які забезпечують зв'язування ВОМТ:МТМНА. Комплекс ВОМТ:МТМНА виділяють шляхом афінного очищення МТМНА в комплексі.
Буфери для зв'язування, буфери для інкубації, буфери для промивання і буфери для розщеплення протеазою будуть забезпечувати умови, які підходять для формування і
Зо збереження комплексу Не-МТМНА. Це включає, без обмеження, наявність рН, який забезпечує формування комплексів. Зазвичай рН буде менше ніж 7,5, наприклад менше ніж 6. В одному варіанті здійснення, рН буфера становить від 2 до 8. В одному варіанті здійснення, рН буфера становить від 5 до 7. В одному варіанті здійснення, рН становить близько 5, близько 6 або близько 7. Буфери для зв'язування, буфери для інкубації, буфери для промивання можуть бути дуже схожими або однаковими. Буфери можуть додатково містити додаткові компоненти, які відрізняються від зазначених в цьому документі. В одному варіанті здійснення, буфер додатково містить стабілізуючий агент поліпептиду ВОМТ (наприклад, сироватковий альбумін, полісахарид, трегалозу або поверхнево-активну речовину). рН буферів може бути оптимізований для різних компонентів в межах зазначених діапазонів. Фахівцю в цій галузі техніки буде зрозуміло, що рН буфера повинний зберігати загальну структуру білка, уникаючи рН, який наближається до РІ (ізоелектрична точка) білка, який може осаджувати білок.
Буфери бажано матимуть фізіологічну іонну силу (наприклад, в межах 100-200 мМ КСІ або
Масі). Для створення необхідної іонної сили доступні різні солі. Занадто високі концентрації солі можуть порушити взаємодію, внаслідок полярних/онних впливів. В одному варіанті здійснення, концентрація солі становить 400 мМ або менше. Очікується, що умови низької концентрації солі також будуть адекватними. В одному варіанті здійснення, концентрація солі становить 150 мМ.
В одному варіанті здійснення, буфер містить 50 мМ МЕ5, 150 мМ Масі їі має рН 6. В одному варіанті здійснення, буфер, в якому відбувається зв'язування (буфер для зв'язування), додатково містить один або більшу кількість інгібіторів протеаз (наприклад, фенілметилсульфонілфторид (РМ5Е)).В одному варіанті здійснення, буфер для зв'язування містить РМ5Е в концентрації від близько 0,1 до 1 мМ. В одному варіанті здійснення, РМЕ5 становить близько 1 мМ.
Промивання може бути виконане, наприклад, застосовуючи промивний буфер. Типовою кількістю для промивання є 3-4 об'єму матриксу.
Молекула ВОМ містить кілька доменів і зв'язується з молекулою МТМНА через свій рецептор-зв'язуючий домен (інакше названий домен Нс). Таким чином, описані в цьому документі способи можуть бути застосовані для очищення будь-якого поліпептиду, який містить рецептор-зв'язуючий домен (поліпептид Нс) ботулінічного нейротоксину (наприклад, повнорозмірний ВоМТ або його фрагмент, який містить поліпептид Нс, або химерний 60 поліпептид, який містить домен Не).
В одному варіанті здійснення способів, описаних в цьому документі, МТМНА присутній в молярному співвідношенні між близько 1:11 і близько 10:11 до ВоМТ або його рецептор- зв'язуючого домену, наприклад близько 2:1, 3:11, 411 або 5:11 до ВоМТ або його рецептор- зв'язуючого домену.
Активація зв'язаного ВОМТ або його фрагмента досягається шляхом приведення в контакт комплексу ВОоМТ:МТМНА (наприклад, зв'язаного з матриксом) з відповідною протеазою. В одному варіанті здійснення, протеаза розщеплює білок після залишку лізину. В одному варіанті здійснення, протеаза являє собою, без обмеження: трипсин, пепсин, ендопротеїназу ІГуз-С, ендопротеїназу ГІ увз-М, аргінільну ендопептидазу, плазмін, омптин або клостридіальну протеазу, як описано в ЕР 2524963. Бажані умови не призведуть до суттєвого руйнування МТМНА, будь- яких асоційованих афінних фрагментів або їх мішені зв'язування. Умови, які підходять для розщеплення, включають в себе відповідну концентрацію протеази і придатні умови для активності протеази (наприклад, температуру, час інкубації, буферні компоненти і т. д.). Такі умови можуть бути досягнуті, застосовуючи придатний буфер для розщеплення протеазою.
Кількість протеази, що застосовується, може бути визначена кількістю молекули МТМНА або кількістю молекули ВоМТ. В одному варіанті здійснення, протеаза присутня в молярному співвідношенні від близько 1:2 до близько 1:1000 до молекули МТМНА. В одному варіанті здійснення, протеаза присутня в молярному співвідношенні від близько 1:5 до близько 1:100 до молекули МТМНА, наприклад близько 1:10, 1:20, 1:30, 1:40 або 1:50. В одному варіанті здійснення способів, описаних в цьому документі, протеазу додають в молярному співвідношенні від близько 1:2 до близько 1:1000 до ВоМТ (наприклад, від близько 1:5 до близько 1:100 до ВоМТ) або близько 1:10, 1:20, 1:30, 1:40 або 1:50.
Придатні умови для конкретної протеази, що застосовується, будуть визначені фахівцем в цій галузі техніки. Тривалість дії протеази також буде варіювати в залежності від протеази, концентрації, що застосовується, і температури. В одному варіанті здійснення, протеазу приводять в контакт при температурі між 2 "С і 40 "С, бажано між 4 "С і 37 "С, наприклад, 4 "С, 16С, 20 С, або 37 С). В одному варіанті здійснення, протеазу приводять в контакт при кімнатній температурі (близько 20-22 75).
В одному варіанті здійснення, протеазу приводять у контакт впродовж від близько 10 хвилин до близько 18 годин, бажано від 30 хвилин до 5 годин (наприклад, близько 30 хвилин, 1 годину, 2, 3, 4 або 5 годин). В одному варіанті здійснення, протеазу приводять у контакт впродовж близько 4 годин. В одному варіанті здійснення, протеаза являє собою ендопротеазу І убз-С, а час інкубації становить близько 30 хвилин.
В одному варіанті здійснення, протеазу приводять у контакт з матриксом при рН від близько 5,5 до близько 8,5. В одному варіанті здійснення, протеазу приводять у контакт з матриксом при рН від близько 6 до близько 8 (наприклад, близько 6, 7 або 8).
В одному варіанті здійснення, протеазу вибирають з протеаз трипсин і ендопротеїназа І увз-
С, і приводять у контакт з матриксом при кімнатній температурі впродовж близько від 30 хвилин до 2 годин при рН між 6 і 7.
Елюювання ВОМТ з комплексу ВОМТ-МТМНА здійснюють, застосовуючи водний розчин з рн, який сприяє дисоціації комплексу (названий в цьому документі буфером для елюювання).
Бажано буфер для елюювання руйнує комплекс ВОМТ-МТМНА тим що має придатний рн, в той час як в решті по суті зберігає цілісність поліпептиду Не і, по суті, зберігає іммобілізацію МІМНА (наприклад, зберігає зв'язування МТМНА з матриксом). Буфер для елюювання додатково бажано матиме фізіологічну іонну силу. Для застосування підходять різні доступні буфери (наприклад, Тріс, МОРБ5, НЕРЕ5, фосфатний буфер і т. д.). В одному варіанті здійснення, буфер для елюювання є таким же, як і буфер для зв'язування та/або промивання, який відрізняється лише рН. В одному варіанті здійснення, буфер для елюювання являє собою близько 50 мМ
Тріс, 150 мМ Масі з відповідним рН, який обговорюється в цьому документі (наприклад, рН 8).
Буфер який застосовується для елюювання (наприклад, описаний в цьому документі), може мати рН від близько 7 до близько 11. В одному варіанті здійснення, рН становить 7,5 або більше. В одному варіанті здійснення, рН становить близько 8. Буфер для елюювання може додатково містити додаткові компоненти, які відрізняються від зазначених в цьому документі. рН буфера для елюювання може бути оптимізованим для різних компонентів в ньому.
Зазвичай ВОМТ очищують з клітинного екстракту. В одному варіанті здійснення, клітинний екстракт є очищеним клітинним екстрактом. Термін "очищений клітинний екстракт" відноситься до того, що екстракт по суті не містить жодної речовини у вигляді частинок, так як їх видаляють шляхом центрифугування та/або фільтрації.
ВОоМТт ії МТМНА можуть бути ко-експресовані в одній і тій же клітині-господарі, наприклад Е. бо соїї. Спосіб може використовувати МІТМНА експресований в ній з ВоМТ. Альтернативно, ВоМТ і
МТМНА можуть бути експресовані в різних клітинах-господарях. Відповідні клітинні екстракти можуть бути застосовані для отримання/виділення відповідних білків. ВОМ! може бути продукований рекомбінантним способом в гетерологічній клітині-господарі, такій як Е. соїї, або продукований в його нативній клостридіальній клітині МТМНА може бути продукований рекомбінантним способом в гетерологічній клітині-господарі, такій як Е. соїї, або продукований в його нативній клостридіальній клітині.
Термін "очищення" або "очищений", як застосовується в цьому документі, відноситься до
ВоМТ або його фрагменту, який є "по суті чистим" по відношенню до інших компонентів препарату (наприклад, до інших поліпептидів). Він може відноситись до ВОМТ або фрагменту, який щонайменше на близько 50 95, 60 Зо, 70 906 або 7595, бажано щонайменше на близько 85 95, більш бажано щонайменше на близько 90 95 і найбільш бажано щонайменше на близько 95 95 чистий, по відношенню до інших компонентів. Повторно, терміни "по суті чистий" або "по суті очищений" щодо ВоОМТ або фрагмента відносяться до препарату, який містить менше ніж близько 20 95, більш бажано менше ніж близько 15 95, 10 95, 8 95, 7 96, найбільш бажано менше ніж близько 5 95, 495, З Зо, 2 У, 1 956, або менше ніж 1 95, одного або більшої кількості інших компонентів (наприклад, інших поліпептидів або клітинних компонентів).
Інші аспекти винаходу відносяться до компонентів, які застосовуються в описаних в цьому документі способах. Один аспект винаходу відноситься до поліпептиду МТМНА, який застосовується для зв'язування ВоОМТ. Поліпептид МІТМНА може являти собою повнорозмірний
МТМНА або його функціональний фрагмент. Передбачається, що функціональний фрагмент
МТМНА зберігає властивість зв'язування з сумісним доменом Не ВОМ і захищає ВоМТт від руйнування, роблячи можливою активацію. Поліпептид МТМНА може додатково містити додаткові гетерологічні амінокислоти. Як термін застосовується в цьому документі, гетерологічний відноситься до молекули іншого походження. Наприклад, гетерологічний афінний фрагмент відрізняється від будь-яких внутрішніх афінних фрагментів, природно присутніх в молекулі МТМНА.
Гетерологічні послідовності можуть бути ковалентно зв'язані з МТМНА (наприклад, шляхом експресії у вигляді гібридного білка або шляхом посттрансляційної модифікації молекули
МТМНА). В одному варіанті здійснення, додаткові гетерологічні амінокислотні послідовності
Зо являють собою гетерологічний афінний фрагмент.
Гетерологічні амінокислотні послідовності можуть бути присутніми на М-кінці, С-кінці або всередині. Такі послідовності, коли представлені, повинні бути сконструйовані таким чином, щоб зберегти взаємодію МТМНА з доменом Не ВоМТ. В одному варіанті здійснення, гетерологічна послідовність являє собою афінний фрагмент, і між афінним фрагментом і послідовністю
МТМНА немає вбудованої послідовності В одному варіанті здійснення, гетерологічні амінокислоти розташовані на М-кінці МТМНА.
В одному варіанті здійснення, гетерологічні амінокислоти не мають функціонального білкового сайту розщеплення, такого як ті, які зазвичай застосовують для видалення афінного тега з гібридного білка. В одному варіанті здійснення, винахід виключає поліпептид МТМНА, який містить тус-тег, злитий з М-кінцем, наприклад, МТМНА-А!1 (Си еєї аї!., 5сіепсе 335: 977-981 (2012)).
В одному аспекті винаходу, поліпептид МТМНА стабільно прикріплений до матриксу.
Стабільне приєднання відноситься до прикріплення, яке не порушується умовами різних буферів, описаних в цьому документі. Приєднання до матриксу може здійснюватися через ковалентні або нековалентні взаємодії. В одному варіанті здійснення, приєднання до матриксу здійснюється з допомогою взаємодії гетерологічного афінного фрагмента на поліпептиді МГМНА з відповідним зв'язуючим фрагментом на матриксі (наприклад, афінного фрагмента 251 на
МТМНА з глютатіоном на матриксі).
В одному варіанті здійснення, поліпептид МІМНА в різних формах, описаних в цьому документі (наприклад, зв'язаний з афінним фрагментом та/або стабільно прикріплений до матриксу), додатково знаходиться в комплексі з сумісним ВоМТт або поліпептидом, який містить його рецептор-зв'язуючий домен (Нс). В одному варіанті здійснення, ВоОМТ або Нс є нативним білком. В одному варіанті здійснення, ВОМТІ або Не є генетично модифікованим рецептор- зв'язуючим доменом (наприклад, з підвищеним зв'язуванням до конкретного рецептора).
В одному варіанті здійснення, поліпептид МТМНА, який містить афінний фрагмент, додатково зв'язується з мішенню зв'язування через зв'язування афінним фрагментом. Мішень зв'язування може додатково бути стабільно прикріплена до матриксу.
Інший аспект винаходу відноситься до водного розчину, який містить описаний в цьому документі поліпептид МТМНА. Поліпептид МТМНА в розчині може бути будь-якої форми, бо описаної в цьому документі, такий як з'єднаний з афінним фрагментом, стабільно прикріпленим до матриксу та/або зв'язаним з мішенню зв'язування через афінний фрагмент, кожна з яких може бути додатково з'єднана з сумісним ВоМТ.
Нуклеотидні послідовності, які кодують гібридний білок МТМНА ії афінного фрагмента, які описані в цьому документі, також охоплюються винаходом. Нуклеотидні послідовності, які кодують білки, можуть бути оптимізовані для експресії в Е. соїї. В одному варіанті здійснення, нуклеотидні послідовності представлені в контексті вектора (наприклад, вектора експресії).
Вектори повинні бути сумісні з клітинами-господарями, в яких як передбачається нуклеїнові кислоти будуть розмножені та/або експресовані.
МТМНА
МТМНА являє собою білок 140 кДа, синтезований Сіозітаіт роїшіпит.
Гени МТМНА зустрічаються в межах оперонів, які кодують білок ВОМТ конкретного серотипу.
ВОМ ії МТМНА, отримані з одного і того ж оперона, є компонентами одного і того ж природного білкового комплексу ВОоМТ і формують тісний, стабільний комплекс один з одним. МІТМНА зв'язує ВОМТ з Ка приблизно 30,8 нМ при стехіометрії 1:11 (Зпепуап сеї аї., 5сіепсе 335: 977-981 (2012)). Бажано МІТМНА отримують з того ж штаму Сіозігідішт роїшіїпит, який продукує той серотип (і підтип) ВОМТ або фрагмент Нс, який будуть очищати (А, АТ, А2, АЗ, А4-А, А4-В, типи
В, С, С1, 0, Е, Е або С). Можна очікувати деякий збіг зв'язування між серотипами.
Кваліфікованому фахівцеві доступні амінокислотні послідовності різних білків МТМНА, як і кодуючі нуклеотидні послідовності, наприклад білків МТМНА, отриманих з оперонів, які кодують серотипи ВоМТ: А (МР 001253341.1), А2 (М/Р 012704905), В (МУР 003404192.1),. С1 (УР 398515.1), Ю (ВАА75083.1), Е (МУР 003409842), Є (МР 001390122.1) ії 2 (СААбЄ1228.1). В одному варіанті здійснення, винахід виключає в себе застосування молекули МТМНА/А (МТМНА/АТ) і кодуючих її нуклеїнових кислот.
ВОМ
У цій галузі техніки відомі різні серотипи ботулінічних нейротоксинів - (А-С), і також існує багато підтипів (АТ, А2, АЗ, А4-А, А4-В). Способи, описані в цьому документі, можуть бути застосовані для очищення нативного ВоМТ (виділяється клостридіальними бактеріями) або рекомбінантного білка. Рекомбінантний ВОМТ може продукуватись в будь-якому іншому типі господаря, такому як інші прокаріотичні клітини, еукаріотичні клітини, тканини або організми.
Зо Можуть також бути виділені мутовані варіанти ВОМ (наприклад, в результаті амінокислотних замін, вставок або делецій). В одному варіанті здійснення, варіант має підвищену токсичність (наприклад, шляхом збільшення зв'язування з клітинними рецепторами).
Такі мутовані варіанти можуть містити "модифікований рецептор-зв'язуючий домен" або "модифікований Несе". Модифікований Нс, як цей термін застосовується в цьому документі, має одну або більшу кількість неприродних мутацій-замін, які посилюють зв'язування молекули нейротоксину С. роїшіпит, в яку вона включена, до рецептора нейротоксину С. рошіїпит, розташованого на поверхні клітини мішені. Таку молекулу зазвичай створюють з допомогою технології генетичної рекомбінації. Модифікований Не має зв'язуючу активність до рецептора нейротоксину С роїшіпит, яка сильніше, ніж у його аналога дикого типу. Приклади модифікованих рецептор-зв'язуючих доменів розкриті в заявці на патент США 2015/166972, вміст якої включено в цей документ з допомогою посилання. Винахід додатково придатний для виділення будь-якої молекули, яка має або зберігає біологічну активність ботулінічного нейротоксину, такої як гібридний (або химерний) білок, усічений білок, фрагмент білка, або мутований варіант ботулінічного нейротоксину, такої як білок, який має одну або більшу кількість доданих, видалених або заміщених амінокислот.
В одному варіанті здійснення, ВОМТ, виділений способами, описаними в цьому документі, володіє активністю токсину. Активність ВоМТ може бути визначена шляхом вимірювання протеолітичної активності на відповідному субстраті. А і Е типи ботулінічного нейротоксину розщеплюють білок ЗМАР-25. В, 0, Е ї йб7ллтипи ботулінічного нейротоксину розщеплюють зв'язаний з везикулами мембранний білок (МАМР, названий синаптобревіном). Ботулінічний нейротоксин типу С1 розщеплює як ЗМАР25, так і білок синтаксин. Аналізи, які можуть бути застосовані для визначення цієї активності, відомі в цій галузі техніки, наприклад, як описано в
МО 95/33850, вміст якого включено в цей документ з допомогою посилання.
Афінні фрагменти
МТМНА може бути приєднаний до афінного фрагменту. Афінний фрагмент специфічно зв'язує мішень зв'язування в умовах способів, описаних в цьому документі (наприклад, від близько рН 6 до близько рн 8). Різні афінні фрагменти відомі в цій галузі техніки і доступні для застосування у винаході. Афінний фрагмент може бути членом специфічної пари зв'язування, таким як епітоп, який специфічно розпізнається антитілом. Коли епітоп застосовують як афінний бо фрагмент, антитіло застосовують в якості мішені зв'язування. Такі численні комбінації афінний фрагмент:антитіло відомі в цій галузі техніки і комерційно доступні. Приклади включають в себе, без обмежень, с-тус (Воїй еї аї, (1991) У. СеїІ Віої. 115:587-596), тус (ЕОКІ ІЗЕЕОІ. (5ЕО І МО: 8); Ємап С І, єї а). (1985) Мої. СеїІ Віої. 5:3610-3616; Мипго 5. апа Ренат Н А В, (1987) Сеї 48:899-907; Вопгідіп у. апа Маїнапз .)., (1994) 269:14715-14727; Зтій О у, (1997) ВіоТесппіднев 23:116-120), ЕГ АС.ВТМ. (патенти США Мо 4703004; 4851341 і 5011912), НА, отриманий з білка гемагглютина вірусу грипу (Міїзоп І А, єї аї!., (1984) СеїІ, 37:767; РівЇй 4. єї а. Мої. Сеї! Віо!. (1988) 8:2159-2165; Хи У, єї а. (2000) Мої Сеї Вісі. 20:2138-2146), ІА5 (АМІН5З (ЗЕО ІО МО: 9); Папа С еї аї. (1996) 329:208-214; | цо М/ єї. аї. (1996) АгсН. Віоспет. Віорпуз. 329:215-220), АШОТ ії АОБ (ОТУВМІ (ЗЕО ІО МО: 10) ТОРГУК (ЗЕО ІЮО МО: 11)); іт Р 5 евї аї. (1990) 9. Інтесі. бів. 162:1263- 1269; Сюоїавівїп О У єї аї. (1992) 190:889-893; Когаїпік І У еї аї. (1993) 9. Мікої. 67:2360-2366), аїи- дій (9 амінокислотний епітоп з середнього антигену Т поліомавірусу (ЕЕЕЕММРМЕ (ЗЕО ІО МО: 12)); Спивзептеуеє", Т. єї аі. (1985) РМАБ5. ОБА 82:7952-7954; Вибіптєї!д. В. єї аї. (1991) Сеї 65:1033-1042), КТЗ (11 амінокислотний епітоп з великого Т-антигену 5440 (КРРТРРРЕРЕТ (5ЕО
ІО МО: 13)); МасАпниг Н. апа УУайнег а. (1984) У, Мігої. 52:483-491; Мапіп С А єї а. (1990) 63:843- 849; рі Раоіо С єї аї. (1997) 272:5175-5182), 17 (11 амінокислотний лідерний пептид з великого капсидного білка Т7 (МАЕМТИаСООМОИ (5ЕБО ІО МО: 14))), 5-ТАСї, Н5М (11 амінокислотний пептид з глікопротеїну О вірусу просто герпесу (ОРЕ АРЕЮОРЕОС (5ЕО І МО: 15))), М5У-а (11 амінокислотний епітоп з карбоксильного кінця глікопротеїну вірусу везикулярного стоматиту, (УТОІЕММАГ ОК (ЗЕО ІЮ МО: 16)); Ктєїз Т. (1986) ЕМВО 3. 5:931-941; Тигпег У В еї а! (1996) 271:7738-7744), Апіі-Хргевз5 (8 амінокислотний епітоп, (0 МО0БОК (5ЕО ІО МО: 17))), і 5 (14 амінокислотний епітоп з парамоксивіруса 5У5, (Я4ЙКРІРМРІ СОТ (5ЕО ІО МО: 18))).
Інший епітоп, який звичайно застосовується в якості афінного фрагмента, являє собою
НГ Аа.АТМ. Ця послідовність зазвичай складається з ПУКООООК (ЗЕО ІО МО: 19), але будь-яка комбінація з 3-6 залишків аспарагінової або глутамінової кислоти також вважається послідовністю РІ АС.АТМ. Афінний тег РІ Дс.А!ТМ. ефективно застосовувався в різних системах експресії для очищення рекомбінантних гібридних білків (Вгі27ага еї а!. (1994) ВіоТеснпіднез 16: 730-735; І еє єї аї. (1994) Майте 372: 739-746; Хи єї а!. (1993) ОємеІюортепі 117: 1223-1237; Оепі еї а). (1995) Мої. Сеї! Віої!. 15: 4125-4135; Віїспіє вї а!. (1999) ВіоСнет дошттаї 338: 305-10.).
Існує також багато афінних фрагментів, в основі яких не лежить епітоп, і вони також можуть
Зо бути застосовані у винаході. СТ (глутатіон-5-трансфераза) являє собою афінний фрагмент, передбачений для застосування в цьому винаході (патенти США Мо 5654176; Мо 6303128 та Мо 6013462). Полігістидиновий афінний фрагмент являє собою неприродну послідовність підряд амінокислотних залишків гістидину, включаючи будь-які відповідні пептиди, розкриті в патентах
США Мо 5284933 та Мо 5310663. Зазвичай такі послідовності містять від чотирьох до десяти залишків гістидину (ЗЕО ІО МО: 20).
В одному варіанті здійснення, афінний фрагмент являє собою: глутатіон-5-трансферазу (а5т), тег С-пус, домен який зв'язує хітин, білок який зв'язує стрептавідин (5ВР), домен який зв'язує целюлозу, пептид який зв'язує кальмодулін, 5-тег, бБігер-тег ІІ, ЕГА, білок А, білок С, гістидиновий афінний тег (НАТ), полі-Нів і білок який зв'язує мальтозу (МВР). В одному варіанті здійснення, афінний фрагмент не являє собою: С5Т, тег С-тус, домен який зв'язує хітин, 5ВР, домен який зв'язує целюлозу, пептид який зв'язує кальмодулін, 5-тег, зігер-тег ІЇ, НІ А, білок А, білок С, НАТ, полі-Ніх і біллк МВР. В одному варіанті здійснення, афінний фрагмент являє собою АміТад м, У5, Мус, 77, ГГ АС, НОМ, У5У-О, полі Нів (зазвичай Нівзв (5ЕО ІО МО: 1)), біотин, або 5ТВЕР (М/УЗНРОРЕЕК (5ЕО ІО МО: 21)). В одному варіанті здійснення, афінний фрагмент не являє собою АміТад м, У5, Мус, Т7, НАС, НОМ, М5У-О, полі Нів, біотин, або ЗТВЕР.
Члени пари зв'язування, які взаємодіють з або виявлені природно в організмі ссавця (людини), такі як антитіла, які природно зв'язуються з МТМНА, або молекули, які розпізнаються транспортерами в печінці та/або нирках, виключені з композицій, описаних в цьому документі.
Мішені зв'язування для афінних фрагментів
Мішені зв'язування застосовують для іммобілізації поліпептиду МТМНА через зв'язування афінного фрагмента. Мішень зв'язування зазвичай буде специфічною для даного афінного фрагмента. Мішені зв'язування прикріплені до матриксу таким чином, що зберігається їх афінність зв'язування до афінного фрагменту. Наприклад, мішень зв'язування для епітопного тега являє собою антитіло, яке специфічно зв'язує епітопний тег. Мішенню зв'язування для 5 є глутатіон. Мішенню зв'язування для біотину є авідин або стрептавідин. Мішенню зв'язування для ЗІВЕР є 5ігер-їасіпй. Мішенню зв'язування для полі-Ніх є бівалентний іон нікелю або кобальту. Мішенню зв'язування для білка Сї є Ес-частина Ідс. Мішенню зв'язування для білка А
Є Ес-частина імуноглобуліну різних видів.
Матрикс
Як матрикс у винаході можуть застосовуватися різні інертні речовини, які звичайно використовуються для іммобілізації молекули з допомогою фізичного прикріплення. Матрикс, який інакше називають субстратом, може бути виготовлений з широкого спектру матеріалів і може приймати різні форми. Матеріали включають в себе, без обмеження, метал, металевий сплав, полімер, пластик, папір, скло, тканину, пакувальний матеріал, біологічний матеріал, такий як клітини, тканини, гідрогелі, білки, пептиди, нуклеїнові кислоти і будь-які їх комбінації.
Форми, які може приймати матрикс, включають в себе, без обмеження, гранули (включаючи полімерні мікрогранули, магнітні мікрогранули і т.п.), фільтри, волокна, сітки, комірку, трубки, порожнисті волокна, каркаси, плашки, канали і будь-яку їх комбінацію. Інші приклади субстратів матриксів, які відомі в цій галузі техніки, включають в себе, але не обмежуються лише цими: каркаси нуклеїнових кислот, білкові каркаси, ліпідні каркаси, дендримери, мікрочастинки або мікрогранули, нанотрубки і мікротитрувальні плашки. В одному варіанті здійснення, матриксні компоненти мають форму колонки.
В одному варіанті здійснення, поліпептид МТМНА приєднаний до матриксу шляхом зв'язування афінного фрагмента, присутнього на МТМНА, з мішенню зв'язування, присутньою на поверхні матриксу. Для застосування доступні різні афінні фрагменти і мішені зв'язування, приклад яких обговорюється в цьому документі. В одному варіанті здійснення, матрикс покритий глутатіоном в якості мішені зв'язування (наприклад, глутатіон-агарозні гранули). В одному варіанті здійснення, покритий глутатіоном матрикс має форму колонки.
В одному варіанті здійснення, поліпептид МТМНА кон'югують безпосередньо з поверхнею матриксу з допомогою ковалентної або нековалентної взаємодії. Це може відбуватися через М- кінець, С-кінець або внутрішню частину молекули. Додатково може бути корисно включити лінкер в поліпептид МТМНА, щоб полегшити прикріплення до субстрату.
Кон'югування з субстратом може бути здійснене застосовуючи різні способи в цій галузі техніки. Приклади ковалентного прикріплення включають в себе, без обмежень, силановий зв'язок (УУеєїаїї, 15 Адм. Мої. Сеї! Віої. 161 (2008); М/ееіаїї, 44 Меїнез. Епгутої. 134 (1976)), і застосування реакції МНО або агента кон'югації. Нековалентне прикріплення може бути засноване на іонних взаємодіях, ван-дер-ваальсових взаємодіях, диполь-дипольних взаємодіях, водневих зв'язках, електростатичних взаємодіях та/або взаємодіях за типом розпізнавання
Зо форми. Без обмежень кон'югація може включати в себе або стабільний, або лабільний зв'язок, або агент кон'югації. Ілюстративні сполуки включають в себе, але не обмежуються лише цими: ковалентний зв'язок, амідний зв'язок, додавання до вуглець-вуглецевих кратних зв'язків, азид- алкінове циклоприєднання, реакцію Дільса-Альдера, дисульфідний зв'язок, складноефірний зв'язок, додавання Майкла, силановий зв'язок, уретан, реакції розкриття нуклеофільного кільця: епоксиди, безальдольні карбонільні хімічні сполуки, реакції циклоприєднання: 1,3-дипольне циклоприєднання, чутливий до температури, чутливий до випромінювання (Ії (інфрачервоне випромінювання), ближнє ІІ, УФ) зв'язок або агент кон'югації, рН-чутливий зв'язок або агент кон'югації, нековалентні зв'язки (наприклад, формування комплексу іонних зарядів, водневий зв'язок, пі-пі-взаємодії, циклодекстрин/жорстка взаємодія типу гість-господар) і тощо. Як застосовується в цьому документі, термін "агент кон'югації" позначає органічний фрагмент, який з'єднує дві частини сполуки. Лінкери зазвичай містять прямий зв'язок або атом, такий як кисень або сірку, групу, таку як МА1, С(О), С(О)МН, 50, 502, 5О2МН або ланцюжок атомів, де один або більша кількість метиленів можуть перериватися або закінчуватись О, 5, 5(0), 502, МН,
С(ОМ(ВІ1)2, С(О), розщеплюваною лінекерною групою, заміщеним або незаміщеним арилом, заміщеним або незаміщеним гетероарилом, зміщеним або незаміщеним гетероциклом; де ВІ1 являє собою водень, ацил, аліфатичну або заміщену аліфатичну сполуку.
Різні хімічні сполуки для кон'югації доступні для кон'югації двох молекул разом і можуть бути застосовані для з'єднання поліпептиду МТМНА з матриксом. Ілюстративні з'єднуючі молекули та/або функціональні групи для кон'югації щонайменше однієї сконструйованої мікроб-націленої молекули з субстратом включають в себе, але не обмежуються лише цими: поліетиленгліколь (ПЕГ, МН2-РЕСХ-СООН, який може мати ПЕГ-спейсер різної довжини Х, де ї«Х«100, наприклад, ПЕГ-2К, ПЕГ-5К, ПЕГ-1ОК, ПЕГ-12К, ПЕГ-15К, ПЕГ-20К, ПЕГ-40К їі тощо), агент кон'югування малеїімід, РАбилювання, НЕбилювання, агент кон'югації біс(сульфосукцинімідил)усуберат (зирегаїє), ДНК агент кон'югування, пептидний агент кон'югування, агент кон'югування силан, полісахаридний агент кон'югування, агент кон'югування який гідролізується, і будь-які їх комбінації.
Кількість МТМНА, зв'язана з матриксом, може бути визначена і оптимізована фахівцем- практиком. В одному варіанті здійснення, матрикс має близько 20 мг/мл поліпепгиду МТМНА. В одному варіанті здійснення, матрикс має близько 5 мг/мл поліпептиду або близько 2 мг/мл 60 поліпептиду.
Протеази
Будь-яка протеаза, яка буде розщеплювати ВоМТ, може бути застосована в описаних в цьому документі способах. Такі протеази включають в себе без обмеження: трипсин, пепсин, ендопротеїназу І уз-С, ендопротеїназу І уз-М, аргінільну ендопептидазу, плазмін, омптин і клостридіальну протеазу, як описано в ЕР 2524963. В одному варіанті здійснення, протеаза являє собою трипсин або ендопротеїназу І уз-С. В одному варіанті здійснення, протеаза є протеазою, яка розщеплює нативний (тобто екзогенний) сайт розщеплення ВоМТ. У таких клостридіальних токсинах нативний сайт розщеплення протеазою (також відомий як сайт активації) модифікують або замінюють сайтом розщеплення протеазою, який не є нативним для даного клостридіального токсину. Ненативні протеази, які можуть бути застосовані, включають в себе ентерокінази (000ОК)|(5ЕО ІО МО: 2)), фактор Ха (ІБСВ)|(5ЕО І МО: 3)/ ІПЯА)(5ЕО І
МО: 4)), ТЕМ (вірус гравірування тютюну) (ЕМІ МЕО С (ЗЕО ІЮ МО: 5)), тромбін І МРА|а5 (5ЕО
ІО МО: 6)) і Ргебсівзвіоп (І ЕМ ЕОР (ЗЕО ІО МО: 7)), (| позначає сайт розщеплення).
Нуклеотидні вектори
Інший аспект винаходу відноситься до нуклеотидного вектору, який містить молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує описаний в цьому документі поліпептид МТМНА. Вектор може бути вектором виключно для збільшення кількості копій послідовності в організмі або клітині, або може також бути для експресії нуклеотидної послідовності у вигляді поліпептиду в цьому організмі або клітині.
В одному варіанті здійснення, вектор являє собою вектор експресії. Такий вектор експресії згадується в цьому документі як конструкція експресії і містить молекулу нуклеїнової кислоти, розкриту в цьому документі, функціонально зв'язану з вектором експресії, корисну для експресії молекули нуклеїнової кислоти в клітині або безклітинному екстракті. Для експресії молекули нуклеїнової кислоти, яка кодує описаний в цьому документі поліпептид МТМНА, можна застосовувати широкий спектр векторів експресії, які включають в себе, без обмеження: вірусний вектор експресії (наприклад, ретровіруси, вірус осповакцини, адено-асоційований вірус, віруси герпесу або вірус папіломи великого рогатої худоби), прокаріотичний вектор експресії, еукаріотичний вектор експресії, такий як, наприклад, вектор експресії в дріжджах, вектор експресії в комахах, вектор експресії в ссавцях і вектор експресії в безклітинному
Зо екстракті. В одному варіанті здійснення, вектор експресії являє собою бакуловірусний вектор експресії. Придатні вектори експресії включають в себе, без обмеження, вектор експресії КкаНК
Окаяма-Берг реОМм1 (Рпаптасіа), рВішйезсіірі (5ігаїадепе), РСОМ8, рАс/СМУ, рсОМА!Т, рсрМАЗ (Іпийтодеп) або рРоРОНВТІ (Іпмийгодеп) або вектор, отриманий з бакуловірусів. Вектори експресії, отримані з вірусів, можуть бути використані для доставки нуклеїнових кислот цього винаходу в популяцію клітин-мішеней. Ряд векторів експресії для отримання гібридних білків з афінними фрагментами, такими як описані в цьому документі, доступні в цій галузі техніки. Вибір, створення та застосування відповідного вектора експресії є рутинними процедурами, що проводяться досвідченим фахівцем.
Клітини-господарі
Інший аспект винаходу відноситься до клітини, в якій збільшується кількість копій та/або експресується одна або декілька описаних в цьому документі молекул (наприклад, поліпептид
МТМНА та/або поліпептид ВоМТ). Така клітина називається клітиною-господарем. Клітини- господарі можуть бути генетично модифіковані для експресії описаних в цьому документі молекул, наприклад, шляхом трансфекції вектором, який кодує білки, та/або можуть експресувати одну або більшу кількість молекул (наприклад, ВОМТ) природним чином. В одному варіанті здійснення, клітина-господар містить нуклеїнову кислоту, яка кодує поліпептид МІМНА (наприклад, у складі вектора). В одному варіанті здійснення, клітина-господар експресує нуклеїнову кислоту (наприклад, з вектора експресії). У деяких варіантах здійснення, клітини, які застосовуються згідно цього винаходу, включають в себе прокаріотичні клітини і еукаріотичні клітини. Необмежуючі приклади прокаріотичної клітини являють собою клітини ЕзспНегісніа сої, клітини Сіовігідійт бБоїшіпит, клітини Сіозігдійит іеїапі, клітини Сіозігдійт бБегайі, клітини
Сіовігідіит Бшугсит, або клітини Сіозійдіит рептіпдеп5. Необмежуючими прикладами еукаріотичних клітини є клітини комах, дріжджові клітини, клітини амфібій, клітина ссавця, рослинні клітини. Необмежуючі приклади клітин комах являють собою клітини бродорієга їгидірегда, клітини Аедез аїЇрорісіи5, клітини Тгіспоріивіапі, клітини Евбідтепе астеа, клітини
Вотрух тоїгі сеї і клітини Огозорніа теїІаподавієгї. Необмежуючі приклади дріжжових клітин являють собою клітини Засспаготусез сегемізіає, клітини 5спігозасспаготусев ротрбе, клітини
Ріспіа равіюгі5, клітини Напзепша роїутогрна, клітини Кіпумеготусев Іасії5 і клітиниМатом/іа
Проїуїїса.
Якщо не вказано інше в цьому документі, наукові і технічні терміни, які застосовуються у зв'язку з цією заявкою, повинні мати значення, які зазвичай розуміються фахівцями в цій галузі техніки. Додатково, якщо інше не вимагається за контекстом, терміни іменників в однині повинні включати їх множину, а іменники в множині повинні включати їх однину.
Слід розуміти, що цей винахід не обмежується конкретною методологією, протоколами і реагентами і т. д., описаними в цьому документі і, як такі, можуть варіюватися. Термінологія, яка застосовується в цьому документі, призначена лише для опису конкретних варіантів здійснення і не призначена для обмеження об'єму цього винаходу, який визначається виключно формулою винаходу.
За винятком випадків, коли в робочих прикладах або де-небудь ще вказано інакше, всі числа, які виражають кількості інгредієнтів або умови реакції, які застосовуються в цьому документі, слід розуміти як модифіковані у всіх випадках терміном "близько". Термін "близько" при застосуванні в описі цього винаходу, стосовно відсотків, може означати ж1 95, або «5 5 95, абог10 об.
В одному відношенні, цей винахід відноситься до описаних в цьому документі композицій, способів і їх відповідного компоненту(тів), які Є істотними для винаходу, але відкритими для включення невказаних елементів, істотних чи ні ("містить"). У деяких варіантах здійснення, інші елементи, які повинні бути включені в опис композиції, способу або їх відповідного компонента, обмежені тими, які не чинять істотного впливу на основну і нову ознаку(ки) винаходу ("складається в основному 3"). Це в рівній мірі відноситься до стадій описаного способу, а також до композицій і компонентів в такому. В інших варіантах здійснення, винаходи, композиції, способи і їх відповідні компоненти, описані в цьому документі, призначені виключати будь-який елемент, який не вважається істотним елементом для компонента, композиції або способу ("складається 3").
Всі патенти, заявки на патент і вказані публікації прямо включені в цей документ з допомогою посилання для цілей опису і розкриття, наприклад, методологій, описаних в таких публікаціях, які можуть бути застосовані в зв'язку з цим винаходом. Ці публікації надаються виключно для їх розкриття до дати подачі цієї заявки. Ніщо в цьому відношенні не повинно тлумачитися як визнання того, що винахідники не мають права претендувати на більш ранню
Зо дату такого розкриття винаходу в силу попереднього винаходу або з будь-якої іншої причини.
Всі заяви по даті або поданні щодо змісту цих документів засновані на інформації, доступної для заявників, і не становлять допущення про правильність дат змісту цих документів.
Винахід додатково ілюструється наступними прикладами, які не слід тлумачити як додаткове обмеження.
ПРИКЛАДИ
Приклад 1
Новий спосіб очищення і активації ВОМТ
В цьому документі пропонується новий спосіб очищення і активації природних форм ВоМтТ без тегів з допомогою простих стадій афінного очищення. Цей спосіб заснований на унікальній особливості ВОМТ: ці токсини природним чином формують димерний комплекс з їх білком- шаперон, відомим як МТМНА. Біологічна ціль цього димера полягає в захисті токсинів від протеаз і жорсткого кислотного середовища в шлунково-кишковому тракті (СІ). Взаємодії між
ВОоМТ ї МТМНА залежать від рн: вони зв'язуються при рН менше ніж 7, і відокремлюються один від одного при рН більше ніж 7,4. Тому внесення афінного тега в МТМНА може бути застосоване для виділення природних форм ВоМТ в розчинах з рН більше ніж 7. Зв'язані ВОМТ можуть потім бути вивільнені шляхом простого підвищення рН розчину до рН більше ніж 7,4. Іншими словами, замість того, щоб розміщати афінний тег на ВоМТ, може бути тегований його партнер по зв'язуванню. Це дозволяє отримувати природні форми ВоМТ шляхом зручного способу афінного очищення.
На додаток до очищення, ВоМТ необхідно активувати обмеженим протеолізом.
Рекомбінантні ВоОМТ зазвичай активують, після очищення, з допомогою ендопротеїнази (такої як трипсин). Цей спосіб має кілька недоліків: 1) є ймовірність неспецифічного розрізання ендопротеїназою, що ставить під загрозу активність токсину і вихід; 2) ендопротеїназа повинна бути видалена після завершення реакції, що вимагає додаткової стадії розділення, яка ставить під загрозу вихід і активність токсинів.
Сайт активації ВОМТ як і раніше експонований на поверхні комплексу ВОМТ-МТМНА, тоді як інші сприйнятливі сайти ВОМТ часто захищені в комплексі. Це надає можливість обробляти токсини ендопротеїназою, тоді як токсин все ще знаходиться в комплексі з МТМНА. Цей підхід вирішує обидві проблеми в попередніх способах: 1) МТМНА захистить токсини від бо неспецифічного розрізання ендопротеїназою; 2) ендопротеїназа може бути легко видалена на одній стадії промивання разом з усіма іншими нетоксичними білками, які не зв'язуються з
МТМНА.
Результати
У кожного природного ВоОоМІ є свій природний партнер МТМНА. ВоМтТ/В ії МТМНА/В застосовувались в якості прототипів для визначення здійсненності нашого підходу. Якщо коротко, то МТМНА/В експресували у вигляді гібридного білка з тегом 251 (глутатіон-5- трансфераза), що зазвичай використовувається. СОТ-МТМНА/В очищали, іммобілізували на гранулах глутатіону і потім врівноважували буфером для зв'язування з токсином (рН - 6). Потім цю смолу додавали до лізату клітин Е. соїї, який містив рекомбінантно експресований ВоМТ/В, та інкубували впродовж 1 години при 4 "С, щоб забезпечити формування комплексів в умовах рН 6. Потім зв'язаний з гранулами комплекс був промитий буфером для зв'язування для видалення неспецифічних забруднювачів і незв'язаних білків. Зв'язаний ВоОМТ/В або елюювали з кульок, застосовуючи буфер для елюювання рн 8, або піддавали дії трипсину для активації.
Принцип і стадії очищення схематично проілюстровані на Фіг. 1А і Фіг. 18.
Результати показали, що ВоМТ/В може бути ефективно очищений від сирих бактеріальних лізатів застосовуючи цей спосіб (Фіг. 2А) з високим виходом і чистотою кінцевого білка (Фіг. 2В).
Частину смоли, яка містила комплекс МТМНА/В:ВОоМТ/В, піддавали трипсин-опосередкованому розщепленню. Результати, показані на Фіг. ЗА і Фіг. ЗВ, демонструють, що ВоОМТ можуть бути ефективно активовані впродовж декількох годин на гранулах в комплексі і згодом елюйовані з кульок для отримання нативного, активного токсину.
Зокрема, досліджували рецептор-зв'язуючий домен для того, щоб з'ясувати чи можна застосовувати МТМНА, специфічний до одного серотипу, для очищення химерних токсинів, які містять частину цього токсину. Рецептор-зв'язуючий домен опосередковує більшість взаємодій між МТМНА ї ВоМТ. Результати, показані на Фіг. 4, вказують на успішне застосування МТМНА/В для очищення гібридного токсину (ВоМТ/А1В), який містить рецептор-зв'язуючий домен ВоМТ/В.
Ці експериментальні результати є доказом концепції способу, який може бути застосований для очищення терапевтичного токсину, що широко використовується: ВоМТ/А (з допомогою
МТМНА/А) ії ВоМТ/В (з допомогою МТМНА/В), очищення інших серотипів ВОМТ (з допомогою відповідного МТМНА), очищення рекомбінантних ВОМТ, які містять мутації, очищення химерних
Зо ВОМ (з допомогою МТМНА, який зв'язується з рецептор-зв'язуючим доменом або специфічно розробленими химерними білками МТМНА). Перевагами цього способу є: 1) здатність очищати
ВоМТт з допомогою природних М- і С-кінців, які експресуються рекомбінантно, зручним афінним очищенням, 2) м'які буферні умови (рН 6-8) мінімізують можливе пошкодження токсинів, 3) специфічне рН-залежне зв'язування і елюювання дозволяють отримати дуже чисті токсини, що зменшує необхідність в подальшому очищенні, 4) захист МТМНА знижує неспецифічне розщеплення активуючої протеази під час стадії активації, і 5) активація протеазою до елюювання токсинів усуває необхідність окремо видаляти протеазу.
Матеріали і способи
Експресія і очищення білка. МІТМНА/В експресували в Е. соїї у вигляді гібридного білка глутатіон-5-трансферази (С5Т-МТМНА/В), з 451, злитою з М-кінцем білка МТМНА/В; ВоМТт/В експресували в Е. соїї з С-кінцевим Нібзв-тегом (ЗЕО ІО МО: 1). Бактеріальні культури (1 л) вирощували при 37 градусах, а експресію білка індукували додаванням ізопропіл-В-О-1- тіогалактопіранозиду (ІРТО) (250 мкм), коли оптична щільність культури при 600 нм (ОЮвоо) досягала близько 0,6 А. Культури потім переносили в струшуючий інкубатор з 20 градусами для експресії впродовж ночі (близько 16 годин). Бактерії збирали центрифугуванням при 5500 х д і отримані осади заморожували до очищення.
Осади ВоМТ/В відтавали і солюбілізували в буфері для зв'язування (50 мМ МЕ5, 150 мМ
МасСі, рН б) з 5 мл/г сухого бактеріального осаду; осади МТМНА/В розморожували і солюбілізували в іншому буфері для зв'язування (50 мМ Тріс, 150 мМ Масі, рН 8). іммМ фенілметилсульфонілфториду (РМ5Е) додавали перед лізисом ультразвуком на льоду (Вгапхоп бопійег 250) впродовж 15 хв (3 х 5 хв, 50 95 потужності). Неочищений лізат потім очищали центрифугуванням (30000ха, 15 хв) і супернатант фільтрували з використанням 0,45 мкм шприцевих фільтрів (МаЇдепе).
Очищення (5Т-МІТМНА/В. 600 мкл глутатіон-агарозних гранул Рієтсе (5095 суспензія,
ТНнегто), врівноважених буфером для зв'язування, додавали до близько 20 мл супернатанту а5Т-МТМНА/В і залишали для зв'язування впродовж 1 години при 4 градусах. Гранули виділяли центрифугуванням (700х9) і двічі промивали 3 об'ємами смолистих гранул буфера для зв'язування(50 мМ Трис, 150 мМ Масі, рн 8). Оцінена концентрація очищеного С5Т-МТМНА/В становила близько 0,6 мг/мл (аналіз ВСА і аналіз ДСН-ПААГ електрофорез).
рН-залежне комплексоутворення; активація протеазою; і елюювання очищеного ВоМТт.
Агарозні гранули, які містили Я5Т-МТМНА/В, додавали до близько 5 мл очищеного ВоМТт/В лізату Е. соїї для масового зв'язування впродовж 2 годин при 4 градусах в конічній колбі, яку колихали. Гранули збирали (700х9) і двічі промивали З об'ємами смолистих гранул буфера для зв'язування (50 мМ МЕ5, 150 мм масі, рН 6).
Трипсин або ендопротеїназу І уб-С (бЗідта-АІдгісп) додавали в молярному співвідношенні 1:10 при рН 6 (на гранулах) для активації МІТМНА-зв'язаного токсину в кінцевому об'ємі 500 мкл.
Реакцію продовжували на платформі яка гойдалась при кімнатній температурі і контролювали впродовж 4 годин шляхом відбору невеликих аліквот для подальшого аналізу. Смолу двічі промивали буфером для зв'язування, для видалення протеаз і незв'язаних домішок. Очищений і активований ВоМТ елюювали двома об'ємами смоли буфера з високим рН (50 мМ Тріс, 150 мМ масі, рн 8).
Аналіз ДСН-ПААГ електрофорез і Вестерн-блоттинг. 10 мкл всіх зразків (з або без відновлюючого агента ДТТ) наносили на 9 95 гелі ДСН-ПААГ електрофорезу. Після розділення гель фарбували барвником Кумассі або піддавали стандартному аналізу імуноблотингом. Для виявлення ВоМТ/В застосовували людське моноклональне антитіло, і для виявлення ВОМТ/АІВ химерного токсину застосовували поліклональне антитіло кролика.
Приклад 2
Легке, пряме виділення рекомбінантних ВОоМТт з неочищених бактеріальних лізатів
Об'єднання між ВоМТ і МТМНА полегшується численними сенсорами рН на двох молекулах, які утворюють специфічну поверхню розпізнавання (Си єї аї!., 2012). Цей комплекс, який взаємно зв'язується, захищає активний токсин від жорсткого кислотного середовища, через яке він повинен пройти, щоб досягїти своїх місць призначень в клітині.
Цей приклад підтверджує можливість виділення рекомбінантного повнорозмірного ВоМТ (неактивного ВоМТ/В, далі називається як ВоМТ/Ву(ву)), який експресується в Б. соїї, як описано в цьому документі. Партнер по комплексу, який полегшує виділення токсинів, є (351 -міченим сумісним серотином його рекомбінантного партнера по комплексу - МГМНА/В. Молекулу С15Т- тегованого МІТМНА-В з ВоМТ/В(іву)у експресували окремо в господарях Е. соїї, а виробництва білка досягали застосовуючи стандартні способи автоіндукції (5щшаїег, 2005). Для виділення
Зо а5Т-МТМНА-В проводили одностадійне масове очищення глутатіон-агарозними гранулами, як описано в способах. Іммобілізований (35Т1-МІМНА-В був стабільним при короткому- середньостроковому зберіганні при 4 градусах впродовж близько одного тижня, хоча більш тривале зберігання призводило до можливої спонтанної появи розривів, як повідомлялося раніше (Задапе єї аї!., 2002; би еї аЇ,, У 2012). Потім цей реагент був використаний для виділення ВОМ /Вву і химерного ВоМТ/Ат(вуВ1 в простому технологічному потоці (Фіг. 6В), де агарозні гранули були пасткою для захоплення рекомбінантних токсинів з неочищених лізатів в сприятливих умовах (наприклад, рН 6,0, 150 мМ Масі). Аналіз ДНО-ПААГ електрофорезу відповідних фракцій зі схеми очищення показаний на Фіг. 6С. Виділений С5Т-МТМНА/В після елюювання можна легко застосовувати в іншому циклі очищення для виділення більш сумісних токсинів зі свіжих або альтернативних екстрактів. Елюйований повнорозмірний токсин селективно вивільняють з комплексу при буферному обміні на гранулах, і може бути візуалізований на ДНО-ПААГ або аналізом вестерн-блоттингу (ВБ) (Фіг. 7А). Більш того, такі м'які умови для виділення повнорозмірних (РІ) токсинів з більшою ймовірністю зберігають його протеазну активність і функціональні ролі в зв'язуванні його клітинних цілей. Як показано, канонічний нейронний рецептор для ВОоМТ/В, тегований пептид, отриманий з синаптогаміна, взаємодіє з виділеним повнорозмірним токсином в іп міто флуоресцентному анізотропному аналізі зв'язування (Фіг. 7 В).
Токсин в комплексі ефективно активується екзогенними протеазами
Як дволанцюгові (АВ) токсини, ВОоМТ експресуються у вигляді одного поліпептидного ланцюга, який піддається активації з утворенням функціональної молекули, з'єднаної дисульфідним містком між важким і легким ланцюгами. "Нікування" екзогенними або ендогенними протеазами, які розщеплюють поліпептидний ланцюг між двома консервативними цистеїнами, які підтримують ковалентний місток між І С ї НС, можуть підвищувати активність, і можуть вимагатись для максимальної активності (Фіг. б6А). В цьому Прикладі описано, що додавання таких протеаз (наприклад, зокрема екзогенної протеази) може бути включене в технологічні процеси протоколу очищення, як описано в цьому документі, і в деяких варіантах здійснення може допомогти максимізувати виділення активних токсинів. Наприклад, С51-
МТМНА/В:ВоМТ/В(вух в комплексі може бути розщеплений каталітичними кількостями трипсину або ендопротеїнази І уб-С в м'яких умовах при кімнатній температурі, а нікований токсин може бо бути селективно вивільнений в буфер з більш високим рн. Фіг. ВА-8С показують часові проміжки активації сформованого в комплекс одноланцюгового ВоОМТ//В(вуу для вивільнення протеазного домену (ІС) близько 50 кД ії НС близько 100 кДа в зразках, які містять дитіотрейтол (ДТТ).
Умови зв'язування з більш низьким рН і більш низька активність протеаз (Каззе!тта 8. І аїа|ег, 1969; УеКеї! єї аї., 1983) відіграють захисну роль від неспецифічного/надмірного руйнування токсину та/або МТМНА (Фіг. 88). Чистота і ступінь нікування токсину можуть бути візуалізовані або на гелі ДНС-ПААГ електрофорезу, або детектовані з допомогою аналізу Вестра-блоттинга (Фіг. А та Фіг. 80).
Химерні рекомбінантні токсини можуть бути виділені застосовуючи спільний серотип МГІМНА
Цей приклад підтверджує, що химерний рекомбінантний ботулінічний нейротоксин може бути очищений застосовуючи протокол очищення на основі комплексоутворення, як описано в цьому документі, із застосуванням різних мішеней, які можуть слугувати в якості терапевтичних основ для майбутніх біологічних препаратів. Рецептор-зв'язуючий домен ВоМТ опосередковує більшість полярних контактів з МТМНА (Си єї аї., 2012). Цей Приклад підтверджує, що рекомбінантний ботулотксин може бути очищений шляхом формування комплексів з МТМНА.
Химерний рекомбінантний білок (ВоМТ/АтТ(виВ1), який сконструйований з неактивних ВОМТ/А
І С, ВоМТ/А Ну, і ВоМТ/В Не, був застосований як доказ концепції. Застосовуючи той же самий рекомбінантний 25Т-МТМНА/В, комплексоутворення і збагачення химерного токсину на гранулах МІТМНА можна було виявити не дивлячись на низькі рівні експресії токсину (Фіг. 9).
Очищений лізат для химерного токсину містив продукти розкладання і великі домішки, які часто перешкоджають ефективному комплексоутворенню з іммобілізованим МТМНА. Отже
ВоМТ/АтТіяюВі лізат пропускали один раз і елюювали зі смоли Мі-МТА до експонування іммобілізованих МІТМНА на агарозній смолі. Наступні профілі активації з цим химерним токсином можуть бути схожими на профілі активації ВОМТ/В(ву), можливо які будь відрізнятись ефективністю.
Обговорення
Цей приклад демонструє виділення рекомбінантно експресованих ВоМТ застосовуючи
МТМНА/В в якості нековалентного партнера- попередника по комплексу. Обидва ВоМТ/Врву) і
МТМНА/В були надекспресовані окремо в господарях Е.соїї. МІГМНА/В експресували у вигляді гібридного білка з тегом 251, приєднаним до його М-кінця в якості афінного фрагмента до твердої глутатіон-агарозної смоли. ВОоМТ/Ві(ву) (і химерний ВоМТ/АтТ(кюВІ1) були експресовані у вигляді послідовностей дикого типу, за винятком інактивуючої мутацій і С-кінцевого тега Ніввх.
Лізис бактерій в буфері з низьким рН вивільняв ці токсини в лізат, який інкубували з агарозними гранулами, які несуть на собі 45Т-МТМНА/В. Після формування комплексу, тверде середовище інтенсивно промивають для видалення забруднюючих речовин; після чого токсини можуть бути елюювані шляхом обміну з буфером з високим рН, або активовані з допомогою додаткової стадії, в якій екзогенна ендопротеаза застосовується до зв'язаного зі смолою комплексу.
Як підтверджено результатами, описаними в цьому Прикладі, це розкриття винаходу пропонує рішення для ефективного виділення активних терапевтичних ВоМТ з різних джерел в м'яких умовах. Удосконалена методика виділення, активації і елюювання очищених ВОМТ може бути надзвичайно корисна, наприклад, при крупномасштабному виробництві терапевтичних
ВоМТ. Потенційні переваги включають наступне: 1) ефективне виділення рекомбінантних ВОМТ з неочищених лізатів в м'яких умовах, на відміну від тих, які застосовуються в сучасній практиці (Маїїліо єї аі., 2000; Оопомап 2007); 2) активовані токсини високої чистоти можуть бути отримані застосовуючи єдину схеми очищення, так як це дозволяє проводити більш інтенсивну промивку і уникати декількох етапів хроматографії; 3) іммобілізований МІТМНА може належним чином захистити від неспецифічного розщеплення токсину на стадії активації, яка може бути легко включена в протокол очищення (на відміну від звичайної активації після очищення). Це може збільшити кінцеві виходи і однорідність кінцевого активованого токсину; і 4) іммобілізований а5Т-МІМНА може використовуватися впродовж кількох послідовних очищень, оскільки він відновлюється в кінці кожного циклу з невеликими втратами; і 5) така методологія може бути розширена до виділення химерних терапевтичних токсинів з сумісними рецептор-зв'язують доменами.
Матеріали і способи Експресія і очищення білка.
МТМНА/В був експресований у вигляді гібридного білка глутатіон-5-трансферази (Сс25127-
МТМНА/В) у векторі раєХ; ВоМТ/В(вя і ВоМТ/АтТ(вуВ1 були експресовані з С-кінцевим тегом (Нізвех) у векторі рЕТ32-а в Е.соїї (В 210ЕЗ). Клітинні культури (зазвичай 300 мл) вирощували в середовищах з автоіндукцією (Гоппедіит "М, ОК) у 2 л ребристих колбах при 37 "С інтенсивному перемішуванні (2250 об/хв). Коли культури досягали ОО близько 0,6, культури клітин переносили в перемішуючий інкубатор з 20 "С для експресії впродовж ночі (близько 16 годин).
Клітини збирали центрифугуванням при 5500х4 і отримані осади заморожували при -20 "С до очищення.
ВоМТ/Вгвх) клітинні осади розморожували і солюбілізували в буфері для зв'язування (50 мМ
МЕ5, 150 мМ Масі, рн б) з 5 мл/грам сухого клітинного осаду. С5Т-МТМНА/В клітини розморожували і солюбілізували в ТВО буфері для зв'язування (50 мМ Трис, 150 мМ Масі, рн 8). Фенілметилсульфонілфторид (РМ5Е) додавали до солюбілізованих клітин до кінцевої концентрації 0,1 мМ, до лізису шляхом обробки ультразвуком на льоду (Вгапзоп бопійег 250) впродовж 15 хвилин (3 х 5 хв); 3095 потужності. Неочищений лізат потім очищали центрифугуванням (30000х9, 15 хв) і супернатант фільтрували з використанням 0,45 мкм шприцевих фільтрів (МаїЇдепе).
Очищення С5Т-МТМНА/В 600 мкл глутатіон-агарозних гранул Рієгсе (5095 суспензія, Ппегто), врівноважували буфером для зв'язування, додавали до близько 20 мл супернатанту п5Т-МТМНА/В і залишали для масового зв'язування впродовж 1 години при 4"С на платформі з плавним перемішуванням. Гранули виділяли центрифугуванням (700х9) і двічі промивали З об'ємами смолистих гранул буфера для зв'язування (1Х ТВ5). Оцінена концентрація очищеного С51-
МТМНА/В зазвичай становила близько 0,5 мг/мл (аналіз ВСА і аналіз ДНС-ПААГ електрофорез).
Зв'язування, активація та елюювання очищених ВОМТ
Агарозні гранули, які несли на собі 45Т-МТМНА/В, додавали до 10-25 мл ВоМТ/В(ву або
ВоМТ/АтТ(ву7В1 очищених лізатів (в МЕ5, рН 6) буфера і дозволяли масове зв'язування впродовж 2 годин при 4 "С в 50 мл конічній колбі на платформі з перемішуванням. Гранули збирали (700х9) і двічі промивали З об'ємами смолистих гранул буфера для зв'язування (МЕ5, рН 6).
Якщо активація не потрібна, зв'язані очищені токсини можуть бути елюйовані на цьому етапі, як описано нижче.
Трипсин або ендопротеїназу І уб-С (бЗідта-АІдгісп) додавали в молярному співвідношенні 1:10 ендопротеїназа: С5Т-МТМНА/В при рн 6 (на гранулах) для активації зв'язаного токсину в кінцевому об'ємі 500-1000 мкл. Реакція протікала на платформі з обертаннями при кімнатній температурі і контролювалася (або впродовж 2-4 годин, як на Фіг. А та Фіг. 8С, або впродовж ночі при 4 "С, як на Фіг. 88) шляхом відбору невеликих аліквот для подальшого аналізу. Смолу
Зо двічі промивали буфером для зв'язування, для видалення протеаз і незв'язних забруднюючих речовин. Очищений і активований ВоМТ/В(івуу елюювали двома об'ємами смоли буфера з високим рН (ТВ: 50 тМ Трис, 150 тм Масі, рн 8).
Аналіз ДСН-ПААГ електрофорез і Вестерн-блоттинг 10 мкл всіх зразків (з або без відновників ДТ або ВМЕ) були застосовані до 8-12 95 гелів
ДНО-ПААГ електрофорезу. Після розділення гелі фарбували барвником Кумассі або піддавали стандартній процедурі Вестерн-блоттинга. Для виявлення ВоМТ/В(в5у застосовували моноклональне антитіло кролика (1:5000), а для виявлення ВоОоМТ/Аї(вУ.Ві застосовували поліклональне антитіло кролика (1:2000), отримане проти ВОМТ/А.
Анізотропія флуоресценції
Пептид (АА 33-53), похідний від синаптотагаміна 1 (5уї 1) людини синтезували з М-кінцевою міткою РІТС (Сепзсетірі, Піскатуей Нью-Джерсі) і використовували як рецептор в експерименті зв'язування в кількості 50-00 нМ. Елюйовані повнорозмірні токсини були сконцентровані на фільтрувальних установках Мімазріп 6 1О0К МУУСО, СЕ). Експерименти по зв'язуванню (50 мкл) вимірювали в чорній 96-лунковій плашці (Согпіпд) застосовуючи зчитувач плашок на основі фільтрів (збудження/випромінювання 485/520 нм). ВоМТ/А і ВоМТ/В Не окремо експресували і очищували, і застосовували в якості негативного і позитивного контролів, відповідно.
Джерела інформації:
Віаві, 9. еї аї., 1993. Воїшіїпит пешигоїохіп А зеїесіїмеІу сіваме5 Ше зупаріїс ргоївіп БМАР-25.
Маїшиге, 365(6442), рр. 160-163.
Вопмепіге, Р.Р. 5 Кетре, І.Г., 1959. РНузіоіоду ої хіп ргодисіп ру Сіовігідіит роїшіпит їуре5 А апа В. ПП. ЕпМесі ої рН апа їетрегаїшге дигіпуд іпсибрайоп оп доли, ашоїувів. апа їохіп рюодисіюп. Арріїед тісгобіоіоду, 7, рр. 374-377.
Вогаеп І асу, 0. еї аї., 1998. Стувіа! вігисішге ої роїшіїпит пешгоїохіп їуре А апа ітріїсайопв ог їохіспу. Маїиге зігисіига! є тоїІесшіаг ріоіоду, 5(10), рр. 898-902.
Разсиріа, В.В. 4. Вогоїї, 0.А., 1967. Спготаїйодгарніс ізоїанйоп ої петаддішіпіп-їтеє пешгоїохіп їот сгувіаїїїпе їохіп ої Сіозітіашт рошіїпит їуре А. Віоспітіса єї Біорпузіса асіа, 147(3), рр. 603- 65. ропо, М. еї аі., 2006. 5М2 із Те ргоївїп гесеріог ог Боїціпит пешгоїохіп А. бсіепсе, 312(5773), рр.592-596.
БОопомап, 5., 2007. Воїшіпит їохіп ргодисіоп о теїйой. 5 Раїепі. Амайаріє аї: пЕрзв/Лимли.дооаіе.сот/раїепів/057189541 (Ассеззейд Магсй 10, 2017). рий, 9.тТ., М/гідні, с.с., еї а)І., 1957. Біцаїєв оп іттипйу го їохіп5 ої Сіовігіаінт роїшіпит. І. А вітрійієа ргоседитге ог ізоїайоп ої їуре А хіп. дошттаї ої Ббасіепіоіоду, 73(1), рр. 42-47. рий, 9.Т., КІегег, «., еї аіІ., 1957. 5іадіе5 оп іттипйу о їохіпв ої Сіовійаішт роїшіпит. ІІ.
Ргодисіюп апа рипіїсайноп ої їуре В юхіп Тог Ююхоїа. Уоитаї ої Басієгіоіоду, 73(5), рр. 597-601.
Еіпгі, Е. б ВНовепіпаІ, М.Е., 2014. Туєайтепі ої дергебзбвіоп м/йй опароїшіпитіохіпА: а гапдоті?еа, доиріе-Біїпа, ріасеро сопіго!Ієд іаї. дошцгпаї ої рзуспіайніс гезвєагси, 52, рр. 1-6.
Си, 5. еї аіІ., 2012. Воїшіпит пешгоїохіп ів в5пієїдей Бу МТМНА іп ап іпіепосКей сотріех.
Зсієпсе, 335(6071), рр. 977-981.
Нехзеї, С еї аї., 2011. Вошіїпит їохіп їуре А ог адіпд Тасе апа аезіпеїйс ивзез. Юептаюіодіс
Іегару, 2А4(1), рр. 54-61.
Уаскзоп, 9.Г., Кипуата, А. є Науавзпіпо, У., 2012. Воїшіїпит хіп А ог ргорНуїасіїс єеаїтепі ої тідгаіїйпе апа їепбвіоп пеадаснпев іп адийв: а теїа-апаїувів. ОАМА: Ше |оитта! ої Ше Атегісап
Меадіса! А55зосіайоп, 307(16), рр. 1736-1745.
УапКоміс, 9. є Вгіп, М.Р., 1991. Тнегарешіїс изев5 ої рбоїшіїпит їохіп. Те Мем Епдіапа іошитпаї ої теадісіпе, З24(17), рр. 1186-1194.
Уекеї, Р.А., МУ/евіег, М/.У. в Веіпіета, 9.9У., 1983. Ове ої епаоргоївїпазе І уз-С тот І узобасієг епгутодепез іп ргоїєїп зедиепсе апаїувів. Апапуїїса! біоспетівігу, 134(2), рр. 347-354.
Уапо, М.-Н., Мао, С.-Н. б Кио, Н.-б., 2015. Ситепі апа роїепіїйа! игоіодіса! арріїсайоп5 ої роїшіїпит хіп А. Маїшге геміем/в5. Огоіоду, 12(9), рр. 519-533.
Каззеї!та, Н.Р. 8 І аідієг, К.У., 1969. рН ЕнНесів іп ігурзіп сайа|увів. Сападіап |ошигаї ої спетівігу, 47(21), рр. 4021-4029.
І ее, К. еї аї., 2014. МоіІесшаг Ббавів Тог дівгирійоп ої Е-саднНетіп адпезіоп Бу боїшіїпит пешигоїюхіп
А сотрієх. 5сіепсе, 344(6190), рр. 1405-1410.
Маїїгіо, С.9., аоодпоцди, М.С. 4 доппзоп, Б.А., 2000. Ригіїісаноп ої Сіовігідійт роїціпит їуре
А пешйгоїохіп. Меїйодз іп тоіесшіаг Біоіоду, 145, рр. 27-39.
Мавзиуег, Са. єї аІ., 2014. Епдіпеетейд рошіїпит пешгоїохіп5 аз пем/ Іпегареціїсв. Аппиаї! гемівм ої рпнаптасоіоду апа іохісоіоду, 54, рр. 27-51.
Зо Мопіаї, М, 2010. Вошіїпит пешигоїохіп: а тагуеї! ої ргоївїп де5ідп. Аппиаї гемієм/ ої Біоспетів гу, 79, рр. 591-617.
Ріскей, А., 2014. Воїціпит Тохіп аз5 а Сіїпіса! Ргодисі: Мапиїасійге апа РНаптасоіоду. Іп
Сіїпіса! Арріїсайопв ої Воїшіїпит Мешгоїюхіп. Ситепі Торісв іп Мешйгоїохіспу. Зргіпдег Мем мок, рр. 7-49.
РісКей, А. б Реітом, К., 2009. Сотровійоп апа Моїесшіаг 5іг2е ої Сіовігідійт роїшіпит Туре А
Тохіп-Нетаддішіпіп Сотрієх. Те ргоївєїп |оигпаї, 28(5), рр. 248-249.
Воззецйо, О., Рігаггіпі, М. 5 Мопівесиссо, С., 2014. Воїшіїпит пешгоїохіп5: депеїїс, вігисішга! апа теспапівійс іпбідніб5. Майте геміємув. Містобіоіоду, 12(8), рр. 535-549. зЗадапе, У. єї аІ., 2002. Зропіапеои5 МісКіпуд іп Ше Мопіохіс-Моппетададішіпіп Сотропепі ої
Ше Сіовійаішт Боїшіпит Тохіп Сотріех. Віоспетіса! апа Бріорпузіса! гезвагс!! соттипісайопв, 292(2), рр. 434-440.
Зепапіг, Е.). 5 доппзоп, Е.А., 1992. Ргорепієв5з апа изе ої рошіїпит їохіп апа оїпег тісгобіа пешгоїохіпз іп тедісіпе. МістобріоІодіса! гемівемув, 56(1), рр. 80-99.
ЗіНепіп, А. 2017. Воїох: Те Огид Тнаге Тгєайпоа Емегуїпіпу. Тіте. Амаїйаріеє аї: пор/Літе.сот/4623409/роїох-агид-ігеайіпд-емегуїпіпд/ (Ассеззей Магсп 10, 20171. зЗпіре, Р.Т. 5 Боттетг, Н., 1928. Зщшаїев оп рошіїпив їохіп 3. Асіа ргесірітайоп ої рошіїпив юхіп.
Те уоитпаї ої іпт'есійоив5 дізеазев, 43(2), рр. 152-160. зіцаїєг, ЕМ., 2005. Ргоївїп ргодисійоп ру ашо-іпдисіоп іп підн-деп5йу зпакіпу сипйигев. Ргоївїп ехргеввіоп апа ринітісайоп, 41(1), рр. 207-234.
БО Тгнопа, 0.0. б дові, МУ.Н., 2006. Вошіїпит юхіп: сіїпіса! изе. РаКіпзопівт є; геіаїєй аїізогаегв, 12(6), рр. 331-355.
Тве, С.К. єї аї., 1982. Ргерагайоп апа сНагасієгізайоп ої потодепеоив пешгоїохіп їуре А їтот
Сіозіаійшт Броїціїпит. Не іппірйогу асіп оп пешопаїЇ геІєазе ої асеїуіІсНоїїпе іп (Те арзепсе апа ргезепсе ої реїа-бипдагоїюхіп. Еигореап іоитаї ої рбіоспетівігу / РЕВ5, 122(3), рр. 493-500.
Мівсо, А.(1. еї аї.,, 2012. Апііспоїїпегдіс (ШТегару м5. опароїшіпитіохіпа їог игдепсу шгіпагу іпсопіїпепсе. Те Мем Епдіапа іоигпаї ої тедаісіпе, 367(19), рр. 1803-1813.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«110» Президент і члени Гарвардского колледжа «120» СПОСІБ ОЧИЩЕННЯ І АКТИВАЦІЇ БОТУЛІНІЧНОГО НЕЙРОТОКСИНУ бо -130» 0342941-0584
-1505» 62/336,958 -1515» 2016-05-16 «160» 30 «170» Раїепійп версія 3.5 «-2105 1 «-21156 «-212»5РВТ 213» Штучна послідовність «2020» «221» джерело «223» /примітка-"Опис штучної послідовності: синтетичний тег бхНів" «4005» 1
НОТ Не із Мі Ні ї 5 «-21052 «-21155 «212» РВТ 213» невідомо «2020» «221» джерело «223» /примітка-"Опис невідомого: пептид ентерокінази" «4005» 2
АЩУАХВ АБ АЮ ГУХ
«21053 «-21154 «212» РВТ 213» невідомо «2020» «221» джерело «223» /примітка-"Опис невідомого: пептид фактора Ха" «400» З «21054 «21154 «212» РВТ 213» невідомо «2020» «221» джерело «223» /примітка-"Опис невідомого: пептид фактора Ха" «400» 4
Ме Аве у А 21055 -21157 «212» РВТ -213» Вірус гравірування тютюну «4005 5 сів атіви Б еве і Оу -21056 «-21156 «-212»5РВТ 213» невідомо «2020» «221» джерело
«223» /примітка-"Опис невідомого: пептид тромбіну" «400» 6 їв уві ро Ат у ат ї їх «-21057 -21158 «212» РВТ «213» невідомо «2020» «221» джерело «223» /примітка-"Опис невідомого: пептид Ргезсіввіоп" «400» 7 вно Угекеи ВНЕ СМу Бо «21058 -211510 «212» РВТ «213» невідомо «2020» «221» джерело «223» /примітка-"Опис невідомого: пептид тус" «400» 8 ші іп ів іви Пе Бек м МО Аве ї В 10 «21059 «-21155 «212» РВТ «213» невідомо «2020» «221» джерело «223» /примітка-"Опис невідомого: пептид ІН" «400» 9
Агв Тут Не АгЕ бе ї З «2105 10 «-21156 «212» РВТ «213» бичачий папіломавірус «4005» 10
Аза ТНе Тує Ати Ту Не 13 5 «-210511 «-21156 «212» РВТ «213» бичачий папіломавірус 1 «400» 11
ТВ Аво Бе ви Туг іу5 1 х «-2105 12 «-21159 «212» РВТ -213» Вид поліомавірусів «4005 12 «ВО ВЕ а а ТуУЄ МК БО Я С «210513 -211511 «212» РВТ
«213» Вірус мавп 40 (540) «4005 13 іа та ТВ вра Рута ва ОО Рез І Тв 1 5 То «2105» 14 «211511 «2125» РАТ «213» Фаг Т7 ентеробактерії «400» 14
Мет АВ ОК Ме Тв НУ СПК С ОМ ВЕ КНУ 1 в 10 «210515 «211512 «2125» РАТ -213» Вірус простого герпесу «4005 15 їі все ен ма Ра іш бар Бгто и АМСУ і З 40 «210516 «211511 «2125» РАТ -213» Вірус везикулярного стоматиту «4005 16
ТУ ТвеАхо ПЕ ОВ Мер Аза АТ Сен У Їх і 5 15 «210517 «21157 «2125» РАТ «213» невідомо «220» «221» джерело «223» /примітка-"Опис невідомого: пептид Апії-Хрге55" «4005 17 а5а ер тує ор Аа АБУ зо А В «2105 18 «2115 14 «2125» РАТ «213» Параміксовірус 5У5 «4005 18 су ук Ра Пе го Аза го ен ви СНУ Без; Ав Бах ТВ ї З М «2105 19 «21158 «2125РАТ 213» Штучна послідовність «220» «221» джерело «223» /примітка-"Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид" «4005 19 о тут іуз АХ АЮ Ло А КУВ ї 5 «2105» 20 «211510 «2125» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «221» джерело «223»/примітка-"Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид"
«221» МІЗС ЕГЕАТОВЕ «2222(1)...(10) «223» /примітка-"Ця послідовність може охоплювати 4-10 залишків" «400» 20
В НЕ МБ МІВ НІХ іх Нік Мі: ВИЗ НІВ ії З 10 -210521 -21158 «212» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «221» джерело «223»/примітка-"Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид" «4005» 21
Ток Биз й КНе рув
ХЕ й 210522 «2115 1193 «212» РАТ «213» Сіовігідіит роїшіпит «4005» 22
Меч Аха ПЕ Ахв Ав лав ів заг Пе Ах а зе МУ хо Ав іуе ї 5 10 і
Афв ча У Мах Уа! Ат дів Ат ух ТВЕ АБ ТЕ ма вве Ух АВ ве 5 КА
Не Був уз Ар Ро Аби Не то Уві Ма Без СН Ага Туг ТУР ему
Сів Без зах Пе Ахо БО Туг у М АВБУЄТУ СТУ НЕ ТуУє 5 55 БО
Акр зе Ав Ре ву Бег шт Абе бек о уз крім вне ем ій
Дів ее ТВг іо ім Бу5 Атв Не дев бек ТИг Ап Ав Оу ЗО іухівнівн ет іви Не Бер ТУ Аіз ес РУ Ре то ТУГУ Тут ї100 це ще
Не єіу ФК У Туг Тут Дів Рго Ап Міві Не ТвЕ рве Оу Бах ДЗ
ЗКУ ї30 135
Без ух ет Ап ух уз іо дев г Бе Не Хек бе ТВ Пе орто в 135 ща
2 сек ик із кві їк Кри жо: Жіу кор тк мі ак ЗК; Дт вне бго тує Ав у Туг Аг СМ ТВ? хв Тук ви ее ер ЄМО АВ 135 ї5О 155 50 х ї 3 Жук Ді Как кт ей іо вх І ух ТІВ; Ді
Ахвітаеє рве Тук Аз Заг Аби НЕ Уа Но БНе спу то У Ав 155 У 175 вм Не Ущі іс Ас А НО Ма! Ва тег іув Ах мн АБО АВС ї8О 155 130 допону Мен уУ КЕ ТЕ ПЕ т Не ів то Нв іви т
Б І в
Тег Ту ба БІ: Бе тек Не Аа Руб ма пе сін бе Не Бух з1о іх Же их ; «Зі Ки і дхіз Кур ім ок: З Я и 1: Уч бок й хе сс іви ву егівн ТУЮ Ве ви Гуго Не бує ус ов Ахр хх у - хх тут я ЗО ІВ а і Ма о г» ТеУ Діма вет Кв іі в хи Па ові йадіви ві йе то ту АТ ів Ат За МІН Те Си АЗИ НЕ НИ
Я Ка ах
Ж Со і см:і Ді ж Б Ки і5у ід: ді «зу і Я Я Ав їутзегатівв Аз пе Уж АіВН ЕВ Ц УЗ ЗВ ОНУ СУ ПВ АКЕ ва ве ав ї їх п «Жне ке гу Жов тр ВМ ве из тез в ех газі Рве Не Ав г Яо го Бук Бер ББе ТВ Аве Ази Тег вва а 75 « ЩО т х х : са з Ен; Акт Ех й бога Би Же 2 чех зве дан Ав ух ух У КЕ СНИ АБО НЯ АТ Ав ПЕ ОБУЄ НУ ТА,
КО ав щюЮ г із гів і; й сит із Бе; хе вені іні ват а
Ще Не (чи Б; Аза Ази діа Не СУ Аза АВ Пе Бу Це АТВ ви ох ех тя пра
Зк що Зх ЗО і сві Кве Атв Не Ася Не Аби Ав Пе тро ви АБО Ем і з ї де ке; Ком Акт ЇННх да « сх ЖШіе влас я; іо Єопк Й ЗЕ Ваг Ме х Ма ТЕ ЕХ не Ах
Ал тує ВВЕ Зег Буз НИ Бе зе Пе Мег мек го Ач 355 з45 5 тру З вк с» Асху Біде і ув ВВа бен і ів ік ЕВ А МІ
АХА аз іух НІ Ка ТуУг Арі Нньгує тує Ех У 55 ЗО зБХ ся Тут хат Не Ах Є ЕБе УЗ Аа ЗВ ів Не дев АВ
Бгто із АНІ Тук дат НЕ Ах НУ Ве УВА МУ В зу 75 ЗО ї ій ба Не Не ев і чо Буд БА ї . Я г М у кс ак ку й і ї х сті Ки СНИ цівіви бєегівн зег Ах Ач АН С Азо Не Пе Ав Ку 35 350 КУ МО ів і Ахп СУ Ахп Ай Марті М АТ ЗЕГ сів пе Пе Ап івц ви ДУ Оу Ах Ати мае? ев М АГЕ
Що | я «КК Зх 805 835 15 - зр. 15 дер ах ОВна Тефт бех че йо тує іу дев СУ ви і ух Хе Тр ові дар Азова ТУР з
А Не тугу АсрВ Ну и уз вк ТВ УЗ Ар Ар у а ат аг
ЗУ 425 ЧУ й і ху туш Мега , Я Тут Асі Ата Дів Ту НН ТУ НВ РНе ой Аки аа Тукіув не Рг Ту? Ав Ате АВ Тук НО РУК ВХ Не ди 35 дк дак х : я 5 ії Миж ЛК : сер Ееи Аа йсп ма сп ей у Уві Не ев дп меха ог Багіву а Ас ЯМ Ада Пе У Ух Ащ
Я ака
Ні 455 зо чк, : хх ху ги сг х і вів в дз Уві дв че чі Ук ін й Су вк МУЗ
Не вто м: Не пе дв УАЗ Бе Тег ух пін Ах Су Ї с «че яка аа 430 я ЗВО
Бах Ма ів ух Пе ТВ Те Ав Си Пе Ава ТЕ Ай
Ве ет УНН ух Не Тв в Ге Ат НИ Пе.
Кк іс ак
ЩІ Я
: ; зу дк хм їх у: д фу к ікрі Ззііт Аси чок т З В
Пе бе тр без Не Ази туге он АВ ИЙ Ав ПРАХ дав
ОО ЩО 10 їх рве свківц ет бер Ав Не УМ Нм уд Уві бе вгі у Ї ї - се. дк м 51 ща аз аЕТуєбея НВ ви зер ап Уві Ме ВНе бек бе АНо ув Багісь У Ту дет не Їви З ду ВЕ МН Не та ї «м 535 щі 5 аз т)
дек вуз Ар Ака ет Кто Не аа ТУ АЗВічвіув ук ТеУгіви
Ттвізи Ат Це не дн Ах тУг баг Вве Аве Пе ТВА Те пис не Ав ТУ Ас Сук СУ Не Ас іус МЕ Ма ВЕТО вве
Зх ЗВО М
Сі фу Аів іо аа ефе дов ГВт Зег ца бе Ве УЗ НО СВ
КО що що не бін а5а бен ЦЕ Віз Пе бере Пе Ас Без Кук ОН Ап ів ее 15 АЙ ет Ме бро Не Не Зак Тук ТЕ Не т мя Зо Ма Те СНУ
БІв о ща ЩО ви т їви Аква ів Ах Ота у ів Ве хи Не туф ер ух
БИ ОО 5 дайте Аз Ту рве ух ух Не ТУ Тек Аще вва ев Ав ТВ
БОБИ що У їго Те Тує Гук би Св Ту На Ахр ву Пе Ку Мі АЇВ уз
Ав бек УНН ви АВ ЗНЗ Бе ен Не ух АТ Не Не ЗТ Кує ща щх МК
Гуківк ет у еи Не біу Ах меР Ах Не бе баг А АВ КВ
Дін ів Ме? Аза бен Тв Те Тв де Тео Ат Авріїв Заг Ав тв Б т я. Жук Ті; -- КІ Ку хх вух Й ст ко ТІ сх жк й Хом. см щег ів Не Діз Ме деп Ахп Узі Во ве вне іїви Азп Аа Аа
З 795 З ж ЕВ т 1 Ми боках онук її их - уки й й ТК
В Не Су Уа пе сим зе АЗИ ТУ г іфя вне Не зе КЕ т зо лк
У ТИ ті бух бу Ак й Пи дк іх хм жу іа с, ГРУ її клеї Ну іп Су Пе Аза Аа Не Аа Не туз ТВгіУ єни рве Не
ТО ТВ ТщО з а чн У жу ТУ Ану МОУ: мах ехо КО ук 15 й оком піп бує Ку ТВ Азл Не ам Аа БІ ув во СНО Бач В Ази тях Б ах ІЗ а зх ие хх ом Слух і зх А мух Мох УТ. Є сої ку: й Ух їх ті со Їх «пащу не да БВгіеН Ах Ве ЯН вва бан ха НВ ан АЖИ ха іск Кк іму Бех Ск Кме Мід Тек Ава іт іка й гео Ех
Ме гу легівн Рі ее ет ЗБ ТБ АВ ері а ув ов но 5 я
Ку Кк кю Кк Жов туї сек сах їх г ак вв ЖЕ
Кгітвта турі УЗ Бен Тег АВ Вп іч с Ра ОТ АХА я ЕНН Ах дат а у п із Ку лі М і Масу й 53: іх Ка
Ас Уа Не му Во Аа Бе су бує Аки ТВ Акт НЕО Ту Ак і Ух ії ж й СК се вх са ую т з уз схе
УЗ АБИ НЕЦУ іви Уві тугу ПЕ Аква Бе АВ АВ іо Тут ін дхт в: Кухе су у Кз бік Жок Моз Су Аг й су Діна Міна ямі Ме
Вп ну бег АФ сна бег Не Бе Бе Ж Ах АБО Ве ВАВ ОВ Ада тм Тк о йсзх Кк Міг» Мак Муз Тс Бін Геї соку й Какії 1 суїва ВА Ве дек Не ук Бе гри Аг лап Ви У
КН що З і А Пе ух Бек іфух ко Не у дет Ге 1) ВО АЗИ СУ су гум чи щі АВ НАВ ге от Кі їх ок Ба КБ ких. ї хг 0 КУ КУ КН
С то Ов в Ту пе бі Аа Тв єту бо Мен Ве А АЛет Не
Як ім Арк Кс ду іа хі міт іх т ух: Ме х хЕ- хх г. ихух
Ат бе ле іу о сві У Ази Не Туг ів бек Ахро уві звг йон ах Зк п ЗО дою КО юю Ж г і и фін Ж м шо дою В їх ТЕ гі
АФфа бек то Ні Тук Не ТВЕН УЗ АХ АТЕ ем ух СН НВ
З СІВ тах ак: Ве но іх йо хе М хз: ІК ду ди а Кок іх м ів іви не сне Не Аа Ав дя Це У Ав деп са Бег Не іух
ЗО ЗК яв
ЕН АТ Не Тк бекоєг Аме Не ері фев бегй т ї00О ТК
А АЇІ Кто бе Бе Нею сну їв ТВ вів АХ ув ра их тр Бе о ці МБО і що. пса В й те с, Жим г лу ак же Ух
Ти їВт Зебсма С уз йен ме Ам Тут ВВ СІ УЗ Бхи АХА 1435 НК 35
К Б ху й Си ку с км см: Ку ен Ар дове ТУ ПВ АТ АВ АМЬО ід Атв ви ЄМО ух Ал
Зо Мо мимо іс Ж т і ха Буг дну Ж В Кк Док вк ку їх іу5 Ве ТУугбвікв ТУгАз їуг У еп Баг АМа Тує Бо Не
М за що
КУ Ни Уві іп А Ах Аа Ле Гм БНО ТВЕ Пе АКА АЗИ
КО Ух Мо
ТЕ З ї : з хм Хе ще хи Зі З З сх їх Хо
ТБ Аз дапіви Ав чо авг бує Ба фу Би жи ові 105 що 1055 : х, З й оУк се КТ у лі і іх їм Кк іа Хі їх педа Вт Ах кух Тут Уві ЖНп бух во яв са УВІ що 1305 З : Се ек м дах. б КВ: їх Хі і дик бін ку Ох
Че бег Уа ізн Ахр Аз АН СН; бух Ту Пе Аве Пе ет у
За 1150 1155 х. Ох Ж с пе хуя и Дикі й Кг ось ду АХ теж цк
А хв тв ін ін іа НЕ Аква Бук ва дея АВ ін ух 1155 1135 МО
Мене Небвх Ахв Аби Це Бне ее Ах Сує Кеи ТВКіви
Іа Її 1155
Заг Ук Ап ну ух Ту Не Сузів) зе Мейітю дор єм вав зво ТЕ ЗО
Ніх Аби Ту МЕН Не Су До Ай Аа М бЗегіує Ту Цвцу Тук
МВ ТО 1155 (ви іто БеЕРнаїух
Трю 210523 -21151159 «2125» РАТ «213» Сіозійаішт роїшіїпит «400» 23
М УЮ НЕ АХА АВА АСВ КВе Аа Не хо зер ев Не Ахо Ахп АТЕ 3 х в 15
Ар УВА Пе М Аве СТУ АВ ЦЕ ТР АХЮ ТВ ББе РН ув я 5 Зо
Не ст Узі Ав г Ахв Не Тез Пе АВ ко стю Ат Гук ТУКОПУ
КІ З 45 си Берг іви Ап Не деп КН Або ОН ух ЗК бар у СТУ Не Тех в кх І
Азр бег дей НВ іс ет ТВ АБИ кр Зі ук А НО Бе ве КВ во В ТО 5
Ав ТЕ УВ ух Не би Б Аг в Аа вав Ах УВІ Не У ДІВ 55 З ще іувівв ен ові ее? ПН Ді пе Бгто ве то Бук І ТУ щю Тк що
ГУБ то МУ Або Бук АтВ Не Те АВ Тугіво Уві бек Бе АЗО АК
Те ще 1-5 сп МІХ Тук Тут ТНг Віа далпіво уві це БВе су Ра СПУ ТВ деп 13 135 І
Нет сно Ват АБИ АВ Не Бут Бук ох БУ СНИ Ахр ек ВІ Ах 145 ЩО НЯ 15 сту ек юте Нн АЯе ег ори ето Вес та ВБе те ТБ ту 165 ТВ 75 іу5 ТУ ОіЖ ін Ве Туг Уві 5 рих АВ Ви С Ме Не ув СуХ їх 185 Тв цеч Пе рух ер фен Гук Бук ев Ту у Пе бу ро ет Ахр АФ що КН
Кеи ег Пе бю Тут Ат Бе: Ат оч С їжи вжи ек ВНе СИ Ту му іі а МЕ Не Ар Ре о Ме баг опу СУ ПЕ БВ ТУ іух ів ів Ази Пт Ап ко Туютто ВВе ТВ Ах Аза Тук Ве в
КБ 53 хр Вів Ризір а НВ Уа Тугіух До АФ ТУ ЄСВ ТВ БУХ з а щУй
Не бух Ал доп йзо Аве Не АБ Ах ет Ве бух ви Буг Кв В
І ух Ре ух ТВР АУА АВ ЄМО АЗІ Не То СЮ Мем Ах жи Бе о 295 МК
ТубВвБебаег ТВ НИ КВе сів Не АЯе ЕК Ме Рго спі Не Не дп Аа ще що З 3о ач іец а Не Тут Тут ач ікс тує Буг УЗ Не дор тує Бе
Був ВВ ук вхо Не Ап НУ вва Не ал ТУ сій Не бує Те в зва За З
Мам РУ ке аг ув Буг АБ Бу АБИ Не Не деп і у РО 1 вИ 353 ЩО зх ча Уа Ах ба Не Аза м ака ай Пт м бен Ме ух г ЗВ
БЕ я ЗВО за! тую Не Ар их ви Де Су Те МЕ АхОо де Не Тег Ав вів
ЗВ БО в щі
ТУуєіто Не вто Ту Ада Не СТУ Аа бін ТУг Ні Не Ах Туг ех ап5 ай 5
Туєівц Ахл Ап Уа ха У СВ и Пе Ази Ав Пе го бро Не а За 430 ази Аве ліз Аве Пе Тут го Туг Ак Гу« а5о баг Ах рто Ве Не зай 45 ема туге ТУ БВ Те уз Бо Не ха Ве ТВ Тв та ща 455 5
Бема УВА РУК Ееу НІ АВ ЗІ ЯМ ТРАСИ ЗВ А АК НЕ нг ЗУ їо
Зегіви ме Заг Аз Не Зегімх Уві Не зер вт 1уз Ар Ат Зах 485 43 до іа Уа Ту Ривіви Азов АВ ТВ; Не Ах Тут ів вар ех В
Б ща що
Кух ТУР Ав и го Ве Ар Не АБО ух бух ТУР Бук Бе Тур Меу
ЗІ ко ЗО і сів Пе не в АЗОВ Ту бек не Ав ЯК ТВЕ СТЬ Те бій С
У МЮ
УМ АВ то Ку сну ПЕ Ахо Гуз УЗ Ма Роз тп ів Су ух ща М 555 ЗБ
А ен Аза Не ву Аза Пе пу дало? НЕ бе щу а Ве ех
У ЗА пУ5 бе вен «му Бгто Ме бегем НЕ АХ бух ее СН Ахо Не ТЕ Ме
Бут у Не СН Ве АВ Не то Ах ет МВС Бан Ахпівн а м щі щО5 вне бух йхріви зак бів Аква ви Рі Ап Атк Ве баг у кп аа
БІВ БІ ЩО
Баг тує КЕНЕ Зі Ух ПЕ Тує Тук Аза Не ви Ав ІН Ттв ТТ Вт
Ку Б 3 во
СИТЕТУ Тука ОН Тує Бе Аевівн Не Сує Мої ія БУХ ух Як
ЩО БМ Б
Не ен Аве сни ТВгіво Не бух бух Не Не сно ух Бу КЕ
ВО ВО Ге
Хек тує ЦО Не су Алое Аво Не бег Бек доні ев ме АВ ем
Мі духо бе Те ТЕ ТВ АТ Ме Ат й Пе бат Ах СЯ Заг
БО 5 НА с Пе АВ Ме Ам Ас У Ав ет Ве ев А ак дів Ав Не
МЕ 30 І тт тек За ох г се ваз вх тек бух фази с б дк (у ісуУк КТ
Су Ве КО СНУ вет Не Тут бегі ух Бе Пе ет Ве Ме їі Ж; й: ка ту. хх кг її ек Ку Мем їі, іх Кк щіп суне хв Аа Не Ап ух Аби ПН АВ СНЬ вве Не ів у у ї: УЖ су 4 зав т стук вч ча Ук Ті фоже нах Ка и ян т Тл ко суб ТЕ Ав Не Тр С; Ака ів бух бев ОБ Бе о Пе дп іп Аж 55 ТБ ТБ
Кї сх Сдю уМ с Ж жу її Астахов РуУ очі Мука він ЕВ А схе фу
НеРвеетБаегів АЗОВ АЦЬКЬЕ Це Аза Не о Аза Це бух сСду ім: Бва Каховка тк іа ії б кмі ЇМ бно 3 КХ тке Ук
Хебівн рве бака сів ТЕ Віз ів ем ве УФ сн Бін Не Зег т 55 ВО ги тк де вік зі А су Кіз і Мі Кі Ку у й ко всіх г вп іУу с іво Ма фе те? Ма па СН ВЕ Ахо да аа Ма хі ма ке дм її с Же б Б у У Кому и ух
Не АОо вів ог АН У А БР ОКЕ НО КН Ту ет В хе пох пу Тула
ВО ще 0 іх й ух а ВЕ Ті хх ку Кхи й ке Ах кі Кік хз: й ше ТІК
Нелі ви ма ТУ НУ Пе АХА БК А Дія ви Тугіви Ап у
ІБ ще Ма ме дев й ес Не дег ква бат Ак Абр вКе КВе ВЕ А СУ ем п. 2 Сави Ха си фе їх Зі Ж доеех м ух Її сугу се
Те Ах ба не Бех Не Тут Бе Прі АТ дл іео Сі бу А
Кік ах в ги ах кі зу Зх КА зе ож. уч в ум тк Ку
ТУ Не іме бегіух ви Не бі Зег уз В Аза доп Ку Су ТВ се : якос гаї ше. Кс і ії ху 2 ЇВ хо - сенж ХУ ще і НеЕ би вве сіп Ав г У ви Уві бве Або МЕЧ Не др Бе
Зо МН З
Мп іх хг їх із дм іх лук сх Кезв уї іі С оУУ плуг Й ек
Ав НУ АБА ОВ Ук АсА Не Туківи ве? хо Узі бе Ас ВявВ 5еї
Тез мі Тек Не Твг Пе ву УЗ АВ АтЕ ви БУХ ЄМО СИП і ев
З За о
Ме вбе Не ар Ябв Ах би Узі дів Ап о бек Не ух Си Пе іо ау Не Туг хек Баг Ав Не пе ку ви бен Баг и Ав Аа
ЗБ Зо Зв їзкиУ ви Живі В щ Зк фі ж сві Мт бі ук Же ди ве хе Ту Пе З Сиу Бе те Не бе аа БУХ ВТО ТВ ТНЕ ау
ЗВО 85 ж тн із Ані їжі ду хх Те вх біз КА б еіі А ках окр Су Ж у зійсім Ум іец Аза йо ук НЕ ух Уві бан Акт аби. ет Тук Не нн Не дух й Ку й в г у Кум «ку КМ: Ті Кк а жі ту ді
АтЕ Асв Зег ап са СІ АЛІ Бен ИН Тук йхи фу ТО Туг сни
КЕ м що іжн тує Аза Тут Уві не ек Авріз бро пе Суб Си Уві ув ач ос и п ху 1055 1 МО
ОНА Аза а Не Ту ібвц ТВ Аа Ахп ГВт Ахп Аа Гео
НІ Мне 3105
Ху їм У. вчкучуж Можу а зи Сх гу хек хе Кс ії Ве сажа ух авівц ів то Загіух КВЕ фувіви ви Бе НЕ Ах Заг А
ТОБ Дах з шо ВУЖ Зх ни яву зе ЗУ ша і ї- бу У Же и В суха
СУА Ту уві бів ух РНе Ав бів УЗ Не Не ек в фен
МО 1075 ї1Ово сі Аза Меси іуз Тут Не А) Небек ін А) А5а Ат бен зщих ЗУ ЗІ, за ще ЩО співи Не АТ А ув аха СУ АВ усі Ме Пе не бег зе го но
Аза А Мегріе не ага Суб іви ТВі ве Су су СУ
ЗБ їцо 1335
Ку тує Пе Сук ев бег Меї фут ар Б АБ НІХ Аза Гр МеВ п із Кай
Пе Ку ба Ам Ар Меса ух ТугКес Туєівмн Тр зе; Бе ака 1 1155
Ку «2105» 24 «2115 1197 «2125» РВТ «213»Сіовігідійт роїшіпит «400» 24
МЕ Аза Пе А АВ АВ бе ПВ А ЗВУ Рео уві Аа Акт ух
Ав мн уд Уа У АВ АВ АН У ТВЕР АТР УВІ Ка Гу АВ
КВе ух Уа! Ав Рго Аза Не тр Уві АВ Ре ПО Аг ТУ Туг СНУ
Шінзегіви бе Не ар сти Ві тугі Уа АХ ЄТУ ОБУ НЕ Ту
АхвбегАєн Нв іви Баг Ко Або ук хр ує Ве їжа Й ще та їв що дів Не Не Твківм ец е Ате Не бо баг Те ах А ОМ ЕН
Сухі ем егіви Не ет Те Аа Не баз вне бе Буг Оу Тут 3 їх це
Зб несу НУ Тук Тут Аа го дал МЕ Пе ТВ Ре у Зеє дів ї3О 125
Буш фу« т АВ фу у ви дал ев Не бек ет ТВ Не Вга
ТО ії іо ее: Ту А В СНУ Гук АгЕ Син Те ахя Тук Бец бе бек ОВ Ав її 150 155 її ха букет пе ух Дів ек А Пе УЗ Пе КБе сну Ра ту віз 155 170 175 х «Б и Ту х Дещо Кк У Мних Жук бує «Оу: пе ді Кі
Дер Не Уві и Аза Ав Тк Уві вне тує хх ух СН А5о Дів ЗИ її 155 Іо
Аза сну Мей іх Те Ме ТВР СТЬ Пе Таз ве бій го ве яв ТВ 185 МК КБ
Тує іже Ту Ащ ЗВЕР НЕ ТУ Ів Аве го Лів Не тв бе Не ух ам І5 а
Сухіви Пе був бегіви ТУ БНк ів Тує ЗУ Пе бу» то Хе Ар ай 3 245 я ще івц уві Ме го Ту Агента бек о ви и вх Пе СВ зх З 55
Тераве ові Ал в УВІ АВ ев ча ек СУ СУ Пе АБО о ее КУ
Ргзіук не Не Ах ТВг АБО РИ ТУ То вве Тв АХА Тую Ве 5 ака КЕ
ВЕ АХА АВ ух у У Ре МИ АБЮ МІ: АВ АХА НЕ ТУ СНИ ТВ
МЕ Я мо
СНИ НЕ ЧОІв СНУ Або Авл вів Пе Ну АБа Ав пе бух Пен Аг Гео
ЗЕ Зв ще я
Ге в ух Ве Агов в Ам Не Аза др Пе То С ів Аха ви дов гуєрве ет іув сі пе Зег Не МЕ МЕ РО АБО АТЕ пе Ах
ЗО 345 5
А АЇВ Кен Ку Ні ве Туг Ага Бук СНИ Тук Туг ім Те ВО Тех 55 350 355
ХНУ ліз їз ож Мох ух хх Ки Їм ія й ех о хі їх ку туї
РРО і Ав Тук Ба Не Аа КНУ Ве мі Ахп се НА Пе лап уві 370 35 ЗВ ік івн авг іви ЗЕ АЦЕАТВ Азов Ар Не БАБА Ух РУ МН се ее АБ ев іви Ап Оу дха ди Уві но Бен Ме Ат ОБ
З З що
А ПЕТу Оу Ар зі мені зак ТУ М АБО КО НО Гук заг я 25 КО дев ук бух Пе бу Буг ал Ав Дів ТУ Са тує І ТІ Ал Ак пен й звук Же ее Кк Се мії Ду Міг 253 г ат: ха і ех Ех ат Ахп АБИ Берг Баг іец Ахо вх уві Яхи Не сту Ул Пе Ар АХА г 4 ЗБ
Не гомо пе не Ав уві далокто Тег ув СИ Ас Су Ав ух «Ух жл АТ ЗО
Роезег го Уа ОБ ух Пе Пов ТВ АТ ОНІ Ле Ах ТА Ла
ЯщЕ Б 95
Не га тот Пе дей Туга са Аа с дей ВЕ АХА ло сТВ ще 5 У ірхкВаесхегівзи зве Берн Узі СНО Уві У Заг Бер у АВ ща Ах ітеегівн Уа Тек а вне ів ет ах УМ леї Бе тугі АХ
Б 55 що
ЗагНПеіуєАхраби ект Не до ТВ Азвіу« іа Тугіує ви
Я 5 555 БО
Тер ів ат си Нерве Ат аАньтує бек Ве АЩаІ бе ТВ АВ ТВ 555 5 5
СНІ Не А ТУ Кар Кух СНУ Б Ази бух Уа Ущі Те тв Не ще КУ
СУ уз Ав сви вхо Не їво АНТ бе Ав бе ве УВЕСНМу СНУ
ОО 5
Ве Св АБИ Бе МУ то Пе зе іє Не дом У У НО АК ЦВМ що ІЗ БІВ мак Яеї го Не Пе бів Не сток У Бе б А А МЕТ ви СУ 5 Б 5 їм іви тв Бен АВ Ав іви Ач Сі і ін Ве Аза Пе тугі ух
Б ме 055 дев Не їси Ту ВВ усі Уві Тут Не Або РНе ви а5в ів те
НІ Бо ВУ
Та вес и тує Ту БеР ІЙ Ту РН Ар іви Пе Сух МЕ АВ ув сна ее ен А ЗІБ В увів Не бух ів Нелі ст АХА
ЩІ Бах яю
Кубівц ий хр іви Не Кув ів А НЕ ОВ МЕ АФ бує еВ А
КН о ті т
ІОН Ав вм АКМа Те щі ге вве пені ви Бе а СН 85 ТА 3
Заг сп Пе із Не Аа еп пе хо Дер вне фен Ав Бу о АВ її та т
Не суху Вве ахо ТНК Аза ПЕ Тук бут вує Мне Не баг Рих Ме
Та Ба То5
ЗВО Ку Не А заг Узі діа хек Аза УЗ ТР аАна Ва НЕ СА тУй тУ5 ВО ей жа ем ЖК и кун КВ іс уки Й шує би зкофамх іх ух ПТ А Не ТВЕН Ав ОН уз ви са Бе Пе ув їви 75 кю ща що дав ТВ вне Ме Аж Не зо Рева бів ВВе вне Ахо Не я Заг ів їх му дук: З Же мк г ю У ве с зи М і КТ, іт в ео Не ТВе ба? С) тн аАхріян пе фу С С ГУ ме АСВ и Ас іви ВН івц не Твен си АХ АВ Ан ух зе зах зак 3х Я ка і її їх: кт а Єв І іх ка і сі й зе Тк Кк Аг
ЧА НЕ НИ Ар Не ек іі АХА Нв Уа уо Ту Заг Ав
Бек Пе бер ів Уві ТА Ма АВ ТУ АЗВ АБО ТуК ІВЦ ух
Кі: КУ, чо ух їх пе а Ме шах б ї. фев Кос
СН РРО АБ ОН ЗО УВЕЗег рве Заг ах ух Ма вве ИН АФА КНУ аг бум кеВ. щих ща ах
Кви Пе Аза ек Ве ех Пе Кух БКе тт ви АуЕ Ав ем СНУ
ЩЕ Зоб ща
Ав Не Не Ту Хек уз во Не СН деп бу Аз Азов Аза Кух іх що ЗО 5 беру КТ ос Кі «Зоо уза «ліки В зі с Же ом й
ТСН Не Ту ве сін ха Ап су ви У вва бек бе УЗ АХ 3 ча що г х оку Ін ик М Мі Й г ік Кун хі: Са Ме м ду Ку вх
Сує Дей КМУ Меп і На дои Пе Турів бе Ар Уві Пе бот Гух мас веж зво деп то Ту Туг Пе ек пе ет Не Ащо Агвівц Ат Аа Вів ев
З З У цви Не вва в Ах Азов ух і Ме дів Аа бій Заг бе а ців
ЗВО ЗВ За
Ме бви дув Не Туг бек Бег аха Те Не бегіви УЗ Ав СЯе Ак ще НО шо
Ав Бе НЕ Ту НЕ ЗБ Оу ів сег Не іви Ази дет бе ЦЕ
Нннио 1515 Мо
Ту ває а опи ен узі Ах вхо ТУ Не лим Тук ів; Ази ха
МН З ККУ
Заг Тук Не Аг АБО Нв бек СТУ ОО Агв йво СИ ТУ АХВ Дух но че МК
ТВ ТУЮ С ів Ту Ачн Ту УВІ Ка Рго На А Зегіво Тук 1055 НО 5
Си ТР Сі АВ Аби Ахп Не Тут Беца? Не 1у5 Ав ГНЕ но 10975 3О8О
Ахп дал ви б5п Б НУ ав у Кв іух ів Не Аква На
НЕ цю Не
Аза вхпітоів тує ма Зі уз тв ар СТ Уві Уві
НН зе Мо
Сухівн ів ж АХ ОО Зуб ТУР Уві АхОо Не БЕР бер це То 11х5
АвьАзав ме йесівік у АвеЗеріух Азот АВ уз АтВ мо 155 що
Не ВН Ах де Ахр ве вве я Роз АХ СУХ ЦБ ТО ВВЕ 1145 о 1155
Дів у да АБ ух Тугіви дегієн бвгівц АТ АФ АВ ВКА їщх 1105 КЕ
ТукАхло те Ме Пе Сух Ай АБ АХ Ач АХА Ме Во ух Дід о 155
Ман ер АЕН є сту Пе
ЕІ їм «210525 -21151196 «212»РВТ 5 «213» Фаг клостридії с-51 «400» 25
М АХ НЕ АВ Ав дер ки Ап Це Ас Заг его МВ Ак да Дух ї 5 16 ї5
Аші Уві Уві Пе Уві ЯН АВ Ав бух Пт Аза ПН ВЕБ ВН Бу КВ 2 5 за
Вк ув Уві Дів Кто Ал Пет У АВ Рез ОВЕАНЕ ТУ Ту СНУ
В 4 45
Сів Кто їжи А5о бе Аа Са БІВ Гугіуз ен Або СУ МУ Не Кук
Ази ет ази Кретов ак бів Ахо Зак ОЛІ Аге СО Ачв Ве ен Ой
Ба Ж 25 ВО
Ареце пе Пе іеніво бує АСВ Пе АБИ Аква ТВЕН Бек КУ ув
Сійівц ви бек йви Не бе Те Ав бе Ре Ре бо Бук СНУ ТУ
Не То5 що
Пе сну САНУ Гук зе? бек то Аза Ме Ве Тв БпеЕ СНУ Бу ТВ 115 2 135 о їух богові ув ім ні хи ек фе УвЕ Те ТЕ Не Рео 133 135 що
ВЕ то Ве У су РЕ АТО ТА Аа Тек НВ С: Бего Агов 145 13 15 15 епі Ас ЕН Туг Аа Заг ах Не Пе Пе Не «у го Ту Заг 155 її 175
Аза Не У Ол АЗЕ АХА УВІ Пе Ту Туг ух Гу еді АХО А І 18 155 1 доп ім МЕ СПУ ТВ Ме із Ве за ве сі вто фев ів ТВ 135 з 205
Тугіує те Аза Дивне Ту Не А го Аа МЕ СТЬ Ме ТВ ув ж 15 я пе ваціві ввів ТУ Вваіво ТУ оо а фу Ви ве де
Сугіви не уз баг іви Туг бе ви ук су Пе вух Вт бек А хювівн у Віто 1 Ак і ес Ат т Вг ОН ів А АТ БУВ ОЙ
За зо жБ55
Бре бег сій Бен Ав Не НЕ АЗВідніво Не Бек сну У Уві Дер
БО чех 27
Бе а вне Не вв ГВт АВ РУ ТУуЄ тт вве КНТ Ав бах тую Бе
Кг Аха бат Не гук Ме Бе Біо уз Бук ух Али Не ТугЕУє ТвЕ
КН а У
КЕ с ве хе іх ех сі кв ду кісок іму Де -
ОВ Ме Ну Ак Або Аа Не у хв АБО НЕ уз Це Атв СЕМ
ЩЕ що ЗІ 320 іх вів ве ой Не Ас УМ ТИ Ахо Не те Аа ен Ав Бо
З ве дав Туг Ве Сук Сп. хег Ре Ам бе Не Пе Був Ар дге На бек
З 5 ЗО
Асв АВ Цео ух Ніх Не Ту? Ат Був СА Ту Му ТВ АН Ар тук
З ЗИ Зо
ТАБ АЖА Гук Ап Не Авп У СНе Маг Ані СИУ 5 Не да ПЕ зл 175 зо ітБ ви БР ви Заг Ах бух Ака Тег Ав Не Не ет ух Во В
З5 35 ща НК із В УВІ Аза без МН Аза СНВІ Аа Ач Не хегіви Мет і у ех ях ща 415
Аа Не ут ЗУ Ав біу фео куму Пи Те НО Ар Ве тує же 43о 25 Бе
ТНЕ тує УКВ го Ту Аква сив Се Тук сів Ту Ага Ене Ахп Ахр а15 НІ зах
Маг А АщН вве га тен Ап Аа Не ЗВ Не сів и УЗ АХо БЕг м 455 ЗА
Че Бу Ми Не Не Ах Не Авн Кто Тує Кух Або Авп ак Ар Ав що ат Зо меш ув РВе Тит ой Не ТБебер Ме тве ів і УВІ ТВ Не вх ав щи ач
Тпе дів ви заг Пе Ази Ту ів ців ів бів пе ТВК Аза А СНІ ай Не нів ет зег АХ ВНЕ Ви ух Уві Уві Аег Бвг Бук АХВ 5 53о за з Ки са ої Жак ак ММ пні йоші Деу се й с Ка Ж сут й іч чу ев ма БОМ вве ВН АЗОВ ОВ Це МУ Бе Бе КВ ха ва мо
Твге ух АБИ АВ ОВУ КО Пе АБО ТВ АБУ КУ Бу Гук тугу
З ЗБЕ Б ба й смі їу , иЗ Ток Бас гу и Кок Сх пе б бу ка Ге
Ттрівніух о ча Не був дк Гук бег Ве Авц Не Аа Би ТВ ще Вт КВ
З КАН з гм Коу КВ ГА іі г вн Жив жк Ве
Са и Пе Ахрбет Ме Су НУ Не дсп бів ма уяву га ве щікіч Аізівц дв Не їву ве ТВ: Бета лег Ве Уві ої с
Туга Ав оег ОК АВ Не егцен Пе бегіух ук Ахв Ав Би
БІВ БІВ вай і у т ТІ Ж оучку ек «Кам у ск нх яву
Аг Зі Вго Да Пе Со Не Азю ер е Хек Аза ет Би зе Ну
БІ. їі Ба Бе ів ч ВПБі АВ Ам А ТУ ВИ Тура Не тує ву ух що 5 Бо
АМі Не Ум Ту пе бує уз Не Ту» РНа баг ВБе ем Ахо вів то
ОБО їз вто
Зк ти ту тю жу ік ТЕЖ ТТ ТТїх кі б йог Кк ді лу
Тв Тео Ту Тут Берг НВ Бу КВН ви Не Сух Меє дів ух
БУХ їн ОЖ5 сів чек Не о АМЯ ЄНИ Зо З ви Мабі ую Не УВС дев в ща щи іме Ті довів лег вує ВІЗ Зв Це Кто Рг йо Твківи ух
Ох З ТІ ТД зви Не дув в Те ТЕ На у ТВ Ве Пе А цец бат АВ Но
ТІВ т У
Хек и Пе ру МЕ Ах ТЕ Уві АХо АН ВОК во дез уз дів ет
БЕ т4Х я несу за ев УМ Не Ав Не Бут Без у ве Не бат Тук Я за ТО Та а бух Тег Не Ах Ап Не аха ПЕ у ТВ Ат СН рве Не КА
ТУ Т75 зо дев 'ЄУВ ПК Аза Не АБИ Ар А Он фу ет Не бен Не Ахп За
Що я У ОО
ТукТБгРавіцх Ту Не Ахо Бе ух Вів фен Ахо Ве ій Заг Не кох Во ВІ іх Ам рне КНе Ахо вт в маг вої Уві Месіух нн Не фен о ще я вк Бе ТУю опт іеві ен ре лік бве УСНУ Рг АП ОМ АЙ ща ДНІ ЧО
Ме не Ба хр пе зе СНУ ух Аза ТВг ем Ме сн Тук ТВ ов бат Не сін за Уа Ту, СУ Уві Ази У Се Зег ів Туг вв ух
Баг го Ай З ТВгвБіу вне бе Асі ВЕ Не ТВ Аа СОУ іх Те Аа Ані КН ТВ? Пе Су Ве трете Ві Те у ух
ЗО я АК
Азй Азов Ахвіух ВР АіВи Пе су Азвіч У АВ АМКУ СОУ ин ЕН я
Тевов Ме тую Ве і Азрв АН НУ Ви Маг вВе НЕ НЕ АБО чо 35 що
ВР АХ У АВ І ОН НУ УдЕ Тег вв Бе хв Не Не Ах АБО
Зах З 5 ЗБ
Аза го Ту Буг Не Зег Не бат У Аква ев У Авр ін ев
З ЧУ ЗВ
Кер пе РБе Не Аза Ар фух Аан Ма Аа Ах Уві Бе Не Ар А
ВО Зк ВН
Неївновє Не Тут дет Тв аби Бе пе бег фе Ущі Ам іух А же НИ це
Аще баг Ме Ту; У СНИ ців ет ДВ Бен АВ Аза вто Не 1015 115 що
Тведег ЗіБ ОМ Я Ж АТЕ Ася Ту РНе зе Тут ЦеЦ АВ АХА мо 1350 нище
Заг ук Не Аге Аз Заг Бег ук ет івв БЦ НИ ТугАМЕБух що ць 1
Ах Тут ЗР Еео Туб бхп тує ВВЕ вто спа ву ву бе Тут 4055 МО що и У Азп АБ А АЛ ух Зегтугівн дегівн Гуз Ах ТВ 1 125 МО
ЗБК не доп Не бег ек УМ Ре су а Не хр Не 1085 1090 цк
Аврю Зегіча Уві Ту У ів 5 то АЗВ ВІ Су ТЕ Не
КЕ ую МО
СУ5 М еп Ав СОУ ТЕ в іувТуківь ащо На Хе Ре Ой
ТЗ 15 125 каз Аа Аг Не сів цем Уві бе зе Туз Ав дов дів Кух Сув
Не її Узі да ТВЕАбЗвВіви ВВеАТРО АСУ Не ТА; ЕНЕ мах що це
Хег ТУ ве ахріук ТУ РАВ баків дегіви АТ дор пу Во
БО 165 То
ТУРА іт Мене Су Ав Вр Ам АЧИ БУВ МВ Бр БУ Оу 15 мо ТНБ
АНІ во ТРо Пе Сен Об ек «210526 -21151196 «212» РАТ «213» аг Сіовігідіит роїшіїпит Ю «400» 26
МАЗІ В АХ АЩ АЗО З Ап Пе до ау му ві АщІ доп Бу 1 5 19 ї5 ва ма У пе ма Аг АБАРВ Бух ТВА Тв вве Не бух Аа вне мух УВІ Ав Рго А5и Не Тева АВ Вко Бо ВЕ ТУ Тук СУ а Б ах дім бівівц Абр Не АБО З гу ін Ар СУ СУ НЕ Бут
Аа Зег а бле бец дет і хр зе а Аг СН хи ве ме и 5 ве 75 ВО дів Пе Не Не бе Це БЖ Аг Не ап Яма Ті Не бек сі іух не за ке
Піпівніко зеківц Нехет не і це Бгто Не то ТУ КНУ ТУк
МЕ 105 о
І У СТУ МУ Тут бек Зат Був Аква Пе Бе ївЕ бе Си фує ТВ 335 120 125
Рго бух зегАВ уві іви йхп заг ец мате а Пн пе ба
ВЕ та Ве пу (НУ Тек Ат НО Ада Ту НВ зів Хег ій АБИ
То 155 150
Авіа Кве Тк лів Зег Ази пе УЗ Не КНе СТУ Вт у дек лап це УВС дев АБИ УВІ Не Тут Туг ух Гуз Ап Ав А 150 МВ 150
Авп оту МЕТУ ТВ Ме АЇВ сив Пе Уві ве в ув ев ви ВГ ща ЗО 5
Туг ух Ту дов іуа НЕ Ту Пе А що Бе Віз МН СИН Ге ТНК ке ів Кі
Сувіви Нвіз оагіви Тур ВВ їви Ту СмМу Не бух Бгто м Аа
ЗВ а ЗІ 40 дайпівн Ма Ма Рез ук Ат ем де ТР і» Ахр Аа ух НИ зах 2 855
ВнЕ бебінва вн ака Не Пе АБО ки Не бер У НУ УЗ Ахр ів щі рве Не дев Ве АН ККО Ту Тео» ве ТНК А бек Буг НЕ їх ек хе в є фу я ух Ку ах их Її: Ккує От
Бгто дози Зек Пе ух Ме пе ін БУ тує Був АСВ Не тугу ТВ, а У Зо оч Ак и ЗАКЦИНЯ хек АЇ я г КІ й до ак швгу й усе ще
ОВ Пе ЕН Те вки яп АН е Сі хи АБ Не т ухвівн тів уз ів Бу БНе зе ва УНН АФ Не Гов А Це АВ че дм пк
Ж З ДУ дай тує Бне Сухі бат РНе Аби дек пе Не вто Або Ага ВН бе
За Зх Б
Аа АВ Бен у М Ва ту АгВ УК ЄМО тує ут ТВ М АБО ТуУх
У ут ем и ем В йхи ті іо й их ел Ті й й ге
Те Ар дев Ту де НЕ Ах У Не уві АСУ ДИВ Пе АБ я ау ке іувіви Р іви ет Ах іує ака ТВ АВ НЕ Не беріз те ан
З85 390 35 щ кинув їси хуй дому КВ кед М жи і ак ку КА : че іх МВ Ма АВ ЕН УМ А ВІ АХ АЗИ НЕ ОЗ хи КИеК ім ле
Аа Пе Ту ОО АВ оту ІВ жа сИж о ТВК ОА КН тує ек го 425 435
ТВеТукічУє Не го бус дев НО Ки Тут З Тут ме вве Ав АХИ
З35 Б а
Зег АБ Аа Ве Рг ву Аа Ас Не Бех НЕ СН КН Уа Ав ех а а55 о
Не кчУоВ Е пеЕАхЬ НЕ АН ККУ БУХ А АВТ БЕ АЩЕ АКА івец Уві бве ТВе са Не Те бах МА Ве сів сни Уві ТРУ ТВЕН а Я 5
ТВ АВ Мем бек Не Ав туге СВ АТО А НЕО ТЕ Ав Ахв и
БЮ в БУВ ха КВе Тнківи бек бе Азо Не ек іух Уві Узі Хар баг ух Ав
ЗІЗ ЗО ВІВ іже Бегіви Уві тує ее Ве іє хв Ал ви Ме бе Ту Бей
Те Не ух ака дев сну го Не Ав ТКе Аз ех ух Ту Тут ез
То во уз о ма Рв іу Ахв Тут Бе Ве Аза Пе Ав іен ТВ 565 БО 575
АЮ Не Аве МНН Суб СНУ Не АН СНИ Уа МВ ен тв ВН
БО ЗНА ОО их ї Н ще як ін сх Ко Кк ки Кох вих К іі і. соту іч Аа іо и пе іво Ав т ве Баг доп бег еве ха НН Ну
У БО КЗ
Ви са Ар хеР Оу АБ Пе бе Бу Пе бег іс ух вав АХ ви що іх БО х ЩІ. Тк и іс» Хі біо лк й іх біз Де іме кл «мі3 Щі
АТ СИ Бгто Ах пе СО Не АХО Аза Пе бег Ах баків ів Оу
БАХ 5 ві їм) іви ет Рв і віп в Ах іт фен ги Не тує бевідя ав Не МВ ТУ ее ух бух Пе Тут Кі баг БВ ви Аврозів тр
У х ;
Те те Би Тує Тук баг а Ту ВВЕ С ів Ве ух М АВ ув
ВУ ЩО о мів зак Нв фе дів о о ог іво Уві уз СНО еЕОУ А СТА ЯАКН
МюЮ 35 ТО
Куб Ве ТВг Азов ви бегіує дів бе Не Бе Бу Ахв ТВг ву ух
М 73 ТІ ДО іец пе Аг НВ ТВ ПН Но Бу Ве Ве в ахрвіви ет Ах с
ТВ У аа зе Ще Баг аг АХ АВ УВІ Ако В вв іви ен у МІЖ аа т та
Ве Су Уа На УМ спи Ав Не Тут Ризі Ве Не бет Тук Ме 7Т55 ТО ТОВ сви Кує Тут Не Аа АЗИ Не Ах Не ух ТВ АтВ СО БЕ БЕ СН
У) Т75 То
Ат Су ТВ АХ НЕ Ап А Аза сив ух ет Не фен Не вал ЗЕ
Т85 З а ВОЮ
Чі Жфе Кв вк У іо в ке Мах бік іх хі; ве Кк тує Те вне у т Пе Ахо Бе ух Ве ївь ар Нв ід бе Не
Кох ВЗ кіз їх йому су ЗЕ без Жах в ку зі Как із 2315 іх хі іжі хв вве Бе Як Заг Ой У СН СНО Уві ек уч ОЗ Вів мах Б туго іецівоівц вве Аа хаті сі Ру Ав ву Дол її Мі ЕК ки Се Ін хи Ма Ки ма М г Ки Кв ух
НЕТ У АБО Пе бе ту ух ден Те Без ове єна Бук ТРК СЛ
ВК я В
Щек пе сін ув теє ОБ У Ас у ПО бБегіео увів ух а рез да НВР БУ Ве ет Ап Ку ВВ БП ТВЕ А Оу ї ек жк пу Ж іх з хг у їм: Аонуу КІ Ех Ох чи іЇвиа Тед дк Ве Те Пе Су Не Тур ви Ап Вр Ве сНуУ ух
В ЗО5 що
Жіцу Ма п и и В НН НН ах Авв Ах ім Те Атвіви Не сну бал БУ УЗ АХ АВ СУБ СНУ 33 ах т. се; ку тех п зе ет ни «КЕ ЖЕКи Кат; їх Н
Тане Не тує БВ НИ дар Ав бу ем УВІ Не КН Не Не Ав
З 5 ЩО
Се вт во ке М Си Зі У і смі Ка с «кг» й г АХА Ту Ах сій Се У Тут бе ет Ах Не пе АХА АБО
Зк З чо ЗЕ ж Єехк Гінн Ти ії Мк їз Се 3 дух А хі 25ОЇАХ С і дов ігр Ту Тут Не аг Пе а? У АВ АВ ТВО У АЗОВ МВ ів за зо З ів в вве Пе Аза А щі Ах УМ АВ АНА УВІ Заг НВ Ахр В
Зк ще З
Кф скаї Сак ба СТУ ЖК Тік й ким ке ку і ка: 1 ду із их
Не жи ат Не Тук ет Тег Ах Не пе баків У Ав Ух Ав
З що ее
Ан Заг Не Б МН СНО СНО ви баг уз ів Азов Ап Бгто Бе що МИ миО
Тнгоет Св Фін Уа Не Ат Ах ут РНа Бе ут ви Ав АхВ 1055 МО 5 бек їує Пе ме Ах ет ове фу гів ен Ту Ак ук
М 1145 ЩО
Ав Ту» ців ек Туг Аа Бу Уа ВБе бен ТЕ ее Тук нах ОБО їі055
БМ АсптАр АВ ап імх ЗУ уг ів тіні Ач ЇНг
Ар НЕ Ап Пе бер ек У іУх во іух емо Пе Але ця що Щк
Анни ЗБУТУ ВЕ с ув ТЗ АК І Сук Не Не їНю 15 ЦО се Уці и йо Бім ТР; фу Тек іви Аа Нв бат то и 15 о 1125
Азп Ази Ате Пес ів узі Заг бе ір5 Аве Ак дів ух вує що ІЗя ї
Не тн Уві Ахи Тіт дв ви ВБе те Рга А Сух Пе РН вве мя ТО ца
БЕт тут Аз Ажріує Тура Загіву зЕтівн Аг А5ОМУ Ар
Її 55 МО
Ту АФ Тр Мене су А АВ ААУ УМ БО Бук Му 175 мВ 1155
Аіа Ні сен Тра це ем у Бех «210527 -21151163 «212» РАТ «213» Сіозійаішт Бшутісит «4005 27
Ме ее Ак У АФ ен АФ Не воно ен ВО УВІ Ах Аа ух 1 із щ їх сп Уа А Не УЖ Ат Заг АТ ух Же АВ У ЕВ Ве ух АВ з 85 З
ВНе Зі ча АВ го дей Пе Ттр бе Аіз Бгто БІ АТО Туб Ту НУ «8 45
КХЗ.: Ку мії Їх и т Ті; г іх Кох де пе хіх Зк тт сін бегівн ув Не Аби о Ас куа ЗВТ Лав ОР СИХ Пе тує
БВ, в ВО
Ха Кук Мои МЕ з Си Кін й и У І ває и іі КТ ся Км
Аврбю Ахл ЕНе іео хек ТП Аза Ав СН у Аов Ви Нв фе сів
Ба то 75 КО хі Кк бін век фаху; і ек Ах у Аа М їх
Аа Не тгУухіву Без СВ Яна в Аби Ахо дк УВУ СПУ АВ щ ща З жі г зх Кв ві зе Кк лі су Б їі іш ак ім Мох ізхівніви беген Не ве Твг АВ пе то БнЕ БТ тує СНО Аа цю ць це хау Жук фонує ери щу ккд Ж тик Ж й сії нак ех же
Аза ТВ с вер Туг АТ ОН Або Тугівц зер ак ух АКА Ав
ЗА а ї25 тезу із ту че Ж Кі окт хг УР ую ох їде хви ех «а НЕ Тук Ту ТЕ АВ аліви УзеНе РВЕ у РОН У бат деп 13 13 МН ііж ій ой ях З язки Же у вк ак Мі і, ух
Не пвіу АЗИ АФ ВЕ НЕ ТУ Туг Бус у Тут Ма ОН Ав
М що і ЩЕ
СК й жі й в, ще сок ки уд ки Му Кс В хау Ж їй»
Се Ме ТНе Мегіви ін Пе в вве сів то не іви Тег Не г «жу дк КУ кі су А ам їв Ді їх СВУ мі В Віто іа Тег Аза С ВНе Тег Уві Ащ ето АВ во На ви НЕ ую ух
Її ан о зва іх оо і ха Тік Ме дік ск Іо їх зм Му бе усю іа івіровг ви Тег Ту ін Гегоїж Не бує та АКА Дао АФ
Її З 5 іа й ів Жук ою у сів: и А ся ота Ме а 3 ін Ах НЕ ер ти Ат іви ма а ши Кпе АТО БИ НМ ГУ
Бе зе туз я Її «3 шк
Є Кі: З пут М дух ск Моск. Ку хг бу Жде Кт І по тт ух зе ін АХ МЕС АЗОВ КВ ББЦ Пе З СНУ СНУ НВ А ТУ зі5 3 35 Я іузівмівц А Те Аза Бо бу то КНе Не Ар ха Гук Ве Це хр ответ АФ Не М Бут Гн БУ АХА Ас Буг Не вух а5О ВВ й
Не ух Аті АВ АЗИ ТУ Це АР Ап Ж Не бух Бе туге СНІ
Фк зщО 55
Хв Кз ЕМ фіг ем 1 ках соус в бю 7 на: Ве ча: Кум
Ні не ру ЦЕ АВК Ух АФ НВ Тер і Ген Ази бву бет ач ке ЗО
ЗК: ЖЕ Кох і Ті, Во Ті чи Мк кс ЕТ; доечх В ходжх
ТуббнвВ ов Еух СЬ КВа жна Не М Ме Кго Си Аг Гук Акв УЗ
МЕ ЗІ Зі ЗО
ЗХ їз сус М тосту Ж Шоу тк В ук жу і їв Ку і и
А ЕВо ЛЕВ НІ ТУ Тук АТ ДУУ С Тує Бех МІВ АКІ ТУЄ ВВЕ іу5 дал ук дев Не деп у КРБ Був ав у С Не гу ТК ух ера ет у Тугай сук НО Пе не Ах Бу Ко Ну ЩІ
Ки ЗО ЗБ
Пемн АНІ Не Ах НУ АВ ТВ УВІ ец МЕ у ЗЕу ДВ
Не Ту СУ АЗОВ МУ ви уз СНУ ТР УВ Ав Ахв ВВЕ Тек бог Аа
ЗБ МюЮ ЗНУ о
Зк лі іх Ки ек Мк ка: Мету ик се аа и ик Кр шу
Гук в пе го Туг Ахп БЕН АХА Тут Но МОР Пе Аа Тук мА
БО ща З15
ТУ ЦЗ Ац Аза Уві Аза Не о со пе о Бус Пе го ре Не
Аа А о Ар Не ТУ БО Ту? Аг У АЗИ Вів АхХОо ТЕ еНе Не
Бо Уа Ту Аа Пе ТВ ув Аа бух ми Не йон ТВ Те ТР то ях я це Рг Уві сп Ту" Бе СН АН Зі Ме Не Авробе лені Яка Не щоб 47о 475 а пін му деко Ве фе фу: У Пе Бека уз сіре Це ака КК ще
Ма Тут Хек Нв ів кот Ах Тк ЕВ Ахр Тугівн опо Не Пе бух ща Бо ів
Тубахвіюв го Не Азов ВЕ АБО у Ух Бек Буг кує Тер Бач рух
Ак Не РКе Агв АБ Гук за бви Аа Не ве жНь ТВ о кН Не 53 ца АЙ
ЗЕ АЧС РН о ТВ ух Бена Бгто Тер Не У АР АВ ах ва 55 БО ів Ав Не їву бо ТОг Аз ам На У і ін ве бух Аби
БО ЗВ ТВ ів У Вуз Не бет ам Не Авт і яз 5 СВО Аз Не Вт Не Ро цу Не Гу5 Не Ар Му НЕ го Хег ов МЕЖ зо Аза НЕ Бак КВВ
БЕ ЩЕ ще
БУ АФІН ВегіО ВУЗів Ве АФ Не Тут Сух Гу5 Хай Аа Бе ща віз БІО тугі бух ус Не Бук Бук би Вне іа Дер сети Те ВГ ОІВ
ІВ БО 5 вай
Тук ук багна Тук Бе АБИ без Несусє МЕС діа бегіт с Уві
ЩО що БІ
У Ки сі віх г ж і їх ОТ У Зсугї ду вна св сві івн бе іїухіуківа Не іп і сив ва Ат
Ту Ви Ме ОТ Ах зву дов це зер ок Тв АзЗпів Не во Не
Мат її схі В т вх Чі хх: й хо лу, і МУК й ту і Кк Кік дзп ви Тег ТВЕР Аха ТВ бу атв АЗОо Пен АБИ СИ ХВк бій
Не А Пе Ас АХ Не Ав у Ве ВН АВ АВ АВ АВ МЕ СХ
Ох я Ті ТО ме ее сін аа Ам Не гг го бух Ве ТВ бах Не Ме ми СИНА
ІВ АТ ТУ
Су» Пе бух ази Не Ап ух бек ТВт Був и Рве петев і уя Сух то 345 ща
ТВ Аква Не Адл оц ТВЕН тв ет Ве ви Не Мет На Аа бер т т т гне беглапівц АБО Не А ве ів Азо Пе З Ах Ме ух ув
ТО тт ТВО іва йбе Ав зер Ту Тв пе ері Пе ух Но бів ТЕ Бек ге 55 ЕЕ БЕ ВО і тва Киї у в ізуї Жаге йіч і і т в дет жк мі Ка
Не бе ау Бен Тук Ав Бе са іа ій ар АБИ Вей Уві Це ті. Кі Крос ЕЕ и жк Ж ії Ка ХК Те ких г ее
КНУ А ТНЕУ ух Ам ГГ іео Ус тут го ус АБО Не
СУ ен ба Берг се Пе ав Ах де Аа пе іх ни ТВе і АВ
А іх т кі дату і дю Кк «т дауї Жею СОУ їі: Кс фе кож КК
Ав сів Аз Пе у вве Тв ха дор Тук ле ін Ан БУ ен ТВ
Х с Сх дз їх им А сх зак: щи г ну М а доз М бух
Ав Ах Кре Зв Пе Тут Ре то іви АТЕ АХ ів АК СВ АБ ТВ т са мг пет їі тк Кон цу КУ ех є тіки КУМ Ту ско
ПЕ ув ую ец ПЕ Оу Зак БУХ СНО ор Ам СУух СНУ Ти ЄМО че сю Ті же Ми Зх УЖ. у й щі Ка ії е х м Ух ем
Ме бува Б АБ Ал в іа Ві БЕ Ав Не Не Аз ех Ай
За ще що ст х ті з йду Й См щі си фа іх Хі м Ко ж
ОР ахВОвщіукаАа ПЕ тугі зег А Пе ж Ас іуз ВЕК НО
Мі бук Пер У Не бег Пе Ав Ан ев Ух АН ів ки па пе НВ аЗо дев Пе лки Уа із ах Сн Ав Ме бух КН НЕ Цец 45 З5О 55 З
Аа Не Гук ЗБ? Баг Ар Ме Не Звгіяцїви т Яр АБ Аді Ам ох БО ЗУБ ча тує Не спо у бе бет Уві Ген Аза Ма ТВе Не Аоп ек Ай я З55 як з ік ямі іч шт Жах їз Сх ет імі Мом Кк Саму Кіт ю бе
ОМ Не іви ТР АБО тує Бе ет АФ ее ом ап ет Бук Пе АТЕ ж МО 1005 хи сам атуч Кх с хе 3: ХВ с Ки а Мк См я дазп нє Ах са Но Не бен сту АЖ АТЕ БР ТУК В Бе ко ких Ме кс ох Може в Ко. тиж Її Б в Во Фе б ТХ сао
РБкедовй Тука Еве Бу сно Не лів Бе Ах це Не свя КН 1-х М МЕ
Дай Ащі Яхве Ту іво бег без Аа АННИ Ас бегізи хв. о 15 з
Бе ух Бгто ієнізе Ве ух фен іви Ази ТВ АБи Бгто Ах Ку пох це МБ5
Зі тує Ма ій уз Тер аер о УВЕ Не вве ех Ма жа
МБО 175 МО
У ТВ Св ух Туківо Авр Це бек Не Зав А Аква Ат Не
На Кк 1035
Сів УВІ Аа Ап Бе Аве Ахо Ав у ТК Ре Нв Не Ав
То Не ЦО аа АБЕ Не Бе Ме бе Аква Сухіви Твгіва Ту Туг Ахп Дей що 12о що
У аа Уві Тукієн ек Це ту Аа А Або ТУ Ав ТВ яд ще ТУ МО
НесСух Арі АБИ Ні АхВ пе то уві аг Тугфен тр цях Та 105
Пів ух Ав Це що 210528 «2115 1165 «2125» РВТ «213» Сіовігідіит рошіїпит «400» 28
М іш Не Ах Ав Ар во Ах НЕ Ап оч Бгто Ма Аза Ал ух ї 5 щ їх дама Уа Не узі аге Аа АР ух ТВА Не Не рве ух АВ вес У АВ го Азов ПВ тр УМ Аа КО НО Аг Тут Туг СУ
Щи го би Аза Не ек Ах ОН ОН Бу Зве В5О У СУ Не Ту? що 55 5
АкрУН Ави БЕ ен ух СО АН его Мк В а Не бе; ОІВ ца та Ук йо
АВ Не фе ви ге ув Ате Це Ал Ак Ав Пе Не сну як З ЗБ іузбвиц ів Бе ЧЕ Ме Сух Тк Бек в Ру Бе во НВ В Тут цю ще що
Фк Хі Ех де о Кк Ві ку є току ся КВ Кі го жах будує
ТУТ КОН АБИ Буг АТ ТЛ МН ВЛ Кут Кв у ау Су А ЕН 5 То 125
Стук ук ег АВ Ах Не ма Не бБе сну та у Бек ази
Не у іує Ах аж ТВЕН Бук Буг хх Куз дану Ві Аів Сім Ав 5 5 155 50
Су Мет сну ВР Меє А ОВ Пе іо вве діа кто Бе йо Тве Туг ї55 Тв 175
Гек я Ахв кни РВе Ту? Аз Дер го мМ Бен с вн ПВ ую Сує іец Пе ух дів Не ук Бе бен Тук Оу Пе бує Рез ЗВ АЗИ АКА їх КА ще івмаА Не Рг тує Ат іви АгЕ ах МО пе г Ах УВС ТУТ дет Бі а Ази Па Пе А на це Пе бег сту Сі Не Дер гуг і ее не дав ТВгАе ета тує тр ВНе Не Ар Ан Ту РН Пе 245 ЗО аа зов У вго ух УВС БУВ Ні Ух Ак Аве ТУ ОО в Ах з зО5 о кет Аха Ал заго Не су ПЕ Б Пе тує т вцу Ту ГЕН Кі ав зо З сп а Вед ТВг Ат У сп А е То ів ве АБ ів бе
Туг вне бер був сну Ве Не люк мех Бго Ну Бук МН АХ ДВ
ККУ з 315 З дів ен у НІ Тут Ту Ат у на тує Гуго Не Ах Тук Бу
ЗІ З ах іч тег Ав Не зп ОБ Ве Ум Аха сі іа Не Аа ТВгіух
За З ЗО івцівнівц г сін Бу Ав ов ТУ НВ Не Ай ух то пні ви
Пе Не лан іву Не Ахп у: ек Аза дев Загівц ін МЛе зує бе дха Пе туго Аз Ну во Аа У ТВ ТВ Ар Аа Ве тує АтВ 385 З ва щюЮ щи Гук Гує Пе РРО хо Авц Пе АТ Ту СА тує МУ Бгто Ази АМА ти брів Ас аАБАа Уві аа ПЕ Си Са Не дель АФ Пе ро Сів
НЕ ТВТ Ар АВ АБО Не Тут то тує ТВ Аза Ап Су Ахо ПУ вна 435 ам ав
Ме вто Не Туг Ав Не Тр ема ет Агв она ПЕ АХА ПН Ту Уві
Без Тук хат Це Аза Туг ів бій бег КА Пе Мій Ахв бат Ахр Аа 455 БЕН Б якщо
А Мах Кк и У Тр Ст у хх че і г Кг у м їх
Не твгіво ег баг Ах Ве Твін УВЕ УВІ Сухе Ав хр ія
ВВ а Я
Зегіви Уа тує ет ТуУгіви А АКА УВЕ НЕ АУА Тут Кен Акроеє ща ЩО М
Не зух АВ Аз ТВі та Не Ап ТРУ АвВіфтує тує Тукіснітр 5і5 Ба 5и5 і її: 23 3 вах жк ех Жуху Сами МНК Ко Же ві ін івціуощ Не вне Аг Аза Тур ову РКе дор Не тв лів НО
З 535 щі
Б НЕ ТНК Тео Суху Не дк івх пе Уа его ВВЕ су з Б Бе 5 ст і ія хе и с кет жу дим У Сяфе Ева ЕТ іч іа вве Ася Не ви Аа ВЕ ав Аа ме ВН іде ПЕС Ве пе ов є віз Не дів ізц бе алі у Ах ан Не Не
ВО ах а
Не Бгто уз Не С Не А СМ МЕН то ази БВ? Меч іви Ав во 5935 БОМ БО ще вве Арі АН Сіпівц тую бе Пе Тук бек уз й
Ії БІ і тю пе б хх ке В ру СК ск Ен г ес ух ТУ мух
Не тп тує ве уз їух Не Тут Тугай Вк ев Аз НВ то го
БУХ 3 ча ща
Твгспо Тує Тук баг іа Ук Не звів пе су МНН АВ БУ ух їмМіУ Бе 5 зер вен вів СОВА ем Не був бух ПЕ Бе СНР уз бух що (ЩО Б
Не бат Тук в Пе СТУ Ав Хет бха Пе го Ав Ав Не бе Ма
Уа Ме Аг ін тве Те ТВЕ АВ ТЕ ее Атв Ахо Не Бе М СТВ
Бе а т
Заг она Не вів М ах Ап іо АБ Ал ре і; вх ух Ав лів
КНУ Уїй 15 То
Ме Кух у КНе ів заг Авп Не ук вл іух Впе Не ет Ве МОЄ
Та БЕН З
В Су Не ух НІ Пе АБ гук ех ТВ Бу 16 б БВ Нв
ТО 7а5 75 іт Суб їв Аза Не Ав В Тени був ев ой цен Не Ме о
ЗО ТК
Аза ет Ве щен Аіпіви хо Ве Ази РБе ен Ав Пе ів Аа Ме
КУ вопіви вве деп ек Тує ТНК С ев ва бе Ук Си СТВ
ТЕ 79 т95 я его турі фен бегіви Туг АВ Ре о СТУ ій АЗО Авт АТ магне сце Аква АВ Бек у ух АБИ ЇВ Еец Ма! и Гук го с Не свшіви УЗ ТУ СНУ Не Ай хв баг АВ ен Туг іви Ах
СУ Заг АФС бе Не ПВ Ба вх Ав дв Тут РН ОЇ Аква у я 55 ВИ
Зіеи Тве ха Щек Ре бек Не Туе Не Тев Бен Атк ди дво СУ а
Ав Те Пе ех ет Був іец це Су ет у СО ТУР Аз Су У
Трон Не тут ЕВ СН СНИ Не у Мі уві Ре Ази Ме Не АБО ч ще що
ЗВ Авт СТУ Ав Сі У Аве Не Тут Гео ет АХ Уа ОВ Ап АхВ
ЕК Тео НІ Тує НЕ СТВРІН АК МИ АТО АТЕ Се Бу В НВ БЕ)
А аж Зо ів не ве Аз АзО Ат і ви Уві УВІ дхп с іц бат Де ух АЮ ах ЗО 55 З
Пе фен АН НЕ Гук бе Бер Ас Пе Не бег ія Дер ет Ахр дви
Зак аУо 75 іУ5 Аа ха? Тут Не бі пу ви ТНЕ ВВ ів Аза бує Бу Те ТВ
З зи що зна У ів Аг АХ Ту БНе ув Ах ви АВ Аа бат Тук за Зо Не
Уві Ате ар ет бхп АВ си Атвівц і Тут Ах у ТЕ Тут
Но цк ОО
ТО їм: Тк Дих Кік зок ЖІ ее Мету Аг ет На б і ливі
Св фу Туб АБИ Ту МВ КВ Без Або Аза КО Не Суб СО Я 1035 ве Ма
Гузій Аве хв Ах Не Тут Тео Тв Пе Ази Аве Не Ах дал
Мч Ме 1053 івм Аха Мебіухє бо сухі Бе туіввівинзвг Не Ам нм
Це МБО 5 деп вух СВ ТУ УЗ Ні ув Тв АзВ'євема Не Не бек уд
МО 1025 ЩО іа бут або ТБ із ут Ум Сух Не Баг Ах ВІ АХ АЖ 15 МО 1095
ВЕБ УВІ ух Не Ле Азов АХА Гуз Не Ме бій Уа ув ве Це їа що ми
Нехет Аж до Ше ве Не Зебра Ствівц Те НЕ АНІ: м УА 5
Ав Ах ух Те Не Су Бу бек Ме ух Ав си дей Тука
ТО 1135 о
Тто Ме Не сСує хв ал ов бетАхв Не го ух у Аа тує ца5 5 1155 ви кро Пеїво бух Зі УВІ
ЦКМ зМ1Б5 «210529 «21151198 «212» РАТ «213» Сіозійаішт роїшіїпит «400» 29
МЕС іуУх Не АЗИ Зо А В ТВ Б Аха вт Вт Не Ах А Ух ії 5 за їх
Аква Уві Уа не уві Ат АВ АТЕ СО ТЕ у ВН Ві Гуз АВ
Ре фуз УВА то Ав Пе Ткр Уві Ава ро Сі Ате Туг Ту єну 35 Б Зх сін бек ва бек Не Сн сна ер іув іх Увага ОК У УВІ Тут
Бек да Бе ви ет ЗІР Аа АТ СН у Азов іду ввів Кв
Ба т 75 щі
Аа Не пе ТВг іо ви ух Аг Не Ав бат Анд Не Аа СНУ СМ 5 5 а
Сухі івн бегіем Уві бек ТУ А Не го Ве то Тк СПУ Тег цю ць То
Наст еНУ у Гук Гук СУ Кто Аза Пе Уві Ве бе спе є ТВх що КУ 135
Неїу5 Ту ахп ук іує Не ха бе ів Не ет Ге Вк Не бно 1:30 ІБ 140
ВЕ те ТУГО У Туга Б Аби Тут ен бе Зеу ух ДВ 150 І155 Не
Теги Аа Не тує із Ма Азов НЕ Ма Не Весну бро сту. ВВ 155 о ї75
Аа Не Уві СН Авт Ахо ТВК Уві ВНе Тут ув бух СНО Ар АВ У зж;Е а Укх Ек 15о 155 що да цу Ме о Тне Ме Ав и Пе Сус Ве СО Вто Вів бе ТВ
Тубіує ТУЄ АВ ЗВ Ве Тука АБ вто Аз ву цем ВОМ у 15 М
Пухівн вів ве бує Ме їв ТОР Су Не Був та Ат Б 23 235 я ха ви ТВ Ма! Рез Туг Ате Цен аге вав Спи Бен ет Ак Не КИ
Ж Ж Ой
Ре зако дец Бе Пе У Ахр во ев Не бег оту СНУ Пе АВ
БО аб У жегіух РНе Пе АБИ ПН АХО то Ту ТР РНе Не Дер бе Тут ВНЕ 45 АВ Ме щак аа А ух ТВ Тв ВНе НО СМ НИ бух баг Пе Ту ові Те 290 295 Зоо
С БЕ КУ СПУ Ам Ави Аа Це КУ АБ АВ НО Бук ен Ат Бо ще що 15 ЗО
ТУ сла Бу вва Мт ВР УМ МЕ Ана Не гр кн Бе Ап ки
АВ БУЄ Не Баг ее с ВКе З е Ме Ме РтО Тут Ате НЕ Аа 345 ЗМ
Аза АВ ів гу ТуєТує тує дві Тут Тут ух Не дар ту
ВУ Пи БУ Тут Бех Не АВ НА ВН УВІ АФ КНУ БІЛ Ева АХА ТВЕ
ЗО ах ЗО
З Бео бегієн ав Авіа тує Не Не Аа ух Вч НИ
ЗК Зо Зх ЯЗ із Пе МУ Ас ем Не зго Асп ах Не ее Бен Ме Аге Зо
Б ще У аа Не угоіу Ах СПУ ів ух ук НУ ТвВе А Ал Бе Гук Заг ха 35 «о
ТВеТугіта Не то Тує Ав АтВ АЧа ТУ ЄМ Тут Міх Рпе АБИ Ах 35 440 345
Багет Те бек бегіви си Аа Уві Аза Уві СИН Мо Не дет ДВ що 455 Я
Не бер в Не Не дхр ее Ае го Ту Аув а Ана бат Ахо Не
З аа Бех Зако вве бек бте УВО Аза Пе не 3 Тек фо ОН УВА ТНЕУ я я «95
ТВеРго Тер ве Не Ах Буг із Сп вів сій Пе бе АБ Ав СО
СЕ ЕНЕТВг дви баг Беу А ВКе ет Сб Ум Уа оет Букі ВУ щі Б 5АВ ців ев ів Уві Туг ет Бе ем ек Ав Уві Це бен ТУР ів хо
М 535 4 ме М ух АБр ТЕ Ака го Не Азов ВР АБО ОН БУХ Тут Тук Це
З в х М
Тевіеч аг сі: Не не ат ва тує бак Ве Авре Те Абе
Б ІВ
КИМ Км: Пе Аа Пн бе Стіну Не Аза ух УВУ а Тр вве 5 5 МО
Се уз Ав ви ва Не ви Аби ГНЕ Овес А Зег Бе У У С ще що 5
Не іуз Аа ів ту Різ Пе Зах ее НВ Ап без у СО дал ів
Ів 515 АВ щег М Кто Не бе Зі УВА бів Пе І АХ МО МН ІВЦ ЕМ 5І5 3 віх Ба івцБагігчіухАщіви Аз ін ух ів Ре Аза Пе Тугівц ух ща 5 по да вів Туга узі У ТУР ЕНЕ Не Внеівц Ах Бій ігр 55 Бе ВО
Те тТвеЕО тує те бебі Бо АВ У ви Ме бух Ме АВ хв
БУВ ва БАХ зів Хат йв ів Міз СТ ОВ Ап Бе Пе був Бу Не хв ів ух
Бай 035 Б їх зах кі жк ЩЕ ох зе Ех Кон б ви ВМ Ки ом іх та ему мів зе Ахвієн ок уки У Ав Пе м Аза СО Був ев р о ТІВ УВО
Ав без Ме АХА Бен Те ТБ СНО БУЄ ПТ АВе Не др іі бег Ах б ег Зів Не Віз Ме Ам АХ Не дов Ах вве во Ал Гух ВІВ
У 85 5
Аа пе су ма Рів Оз Баг дея Не Тут Рг а Бе Не Хат Ве
ТВ ТВО зв
Мессі Ту Не лей ха Пе дев Пе бух ве Ве а СБ Не ких фік и Кіа ве іх Ж: и оз суку ОБУ охо ху дк
Ате ух Су РА; Ах Пе Те бух сни Був ів сі ен Не Аа
Ка УВВ що пор ох ЖЕ ЇВ г як іх ки» ік Ті іч я іа Ки Кк сів Ах ТЕ Ве Ап хлів АБО ва СН Не Вце ахо Пе со ТВ во ВІВ щі ес А Ви Цен ТВ Баг бів Те Ах дви Не Не бу МН Був
ТВтбегчо у АВ ЕВцівцівн Ве Бек ба іо А АХ АВ 855 ВО ВА іт Уві Пе ух АзО Пе его ух Аз Тк Тем УВС ух Яр
Хеуз Ту си хз Сами Тк І Я Му МЕ Хі фам їз хм
Ав їй? в ахоіви Зв Туг СНУ Уві Ану Аза АНІіВО Туг ув ів и го Ач ій ет УВЕ Аби Ре баг ДУ АЗИ ПЕ ВКе СНО Ах
Су ви ТНЕахп бек Не баг Пе Сов На тв ви АТЕ Ав ма У
НН БЕНЕЖ ЗІ сп Аа Ав ви бег ау Аза Це Не Сну Ав Не За Аз А КУХ
ЗІ що вах сх то ій Пе бе БВ Но АЗИ Аз У Ви У Кл Баг М УВІ
З ча й
Вар у Ас СНУ Аа НН бух дай Не Буг Св ЗТ хр мае ще
З кН Чак ЗО іже Буг го Туг Буг Не баг Уві зві МВ Ах АТ ви АтВ АБО Був
ЗБЕ я як ів ів Не вве Пе АХ Аз ух Це Не Уві Ах бат Не СНО від Неіви ха Че Ту бек хе Ах Не бе ет ів УВЕАУуТО мНю цю г хх реа 35; фе ів ху Емі су й З ши рух ії їх
Аз Ака о пе Суб Неси сів о ех пе фев а ух Аа
Ух г ух лиху
НО МН МО іем'ївеф Зеє ів о УЗ фен дов бер ук Не ТВР ввів Кен 1055 М 5
Ащ бек Ту Не Аг Ахроет Тегі вів АтВ ев ЄВ ТУ АКА
КМ не МО
КУА Турів тує Ав Туга РВЕ Рез СИМ Аз зак Це іу ОЛЕНІ ту у;
Ех зоБО Но
Тео У ПесваАмАЄ Акта Ме Тугієц ськ Не ув АХА
ОО Ух що
Це ух де Те Аа Не дви СНУ Ав уз Вп ух Це в АУп м5 що цик
ТАЗ Зів бегіжо сни Туб У Оп з ух тв АБО вів У Ме
МН ща змо
НеКСук ага у а г Бу тує АБ Акр Пе Кив АВ її 12 1535
ОУАМ Ас АЦ В ОСВівН УВІ АБИ ББРіує АЮ АХ АВ АТЕ іу« Пе Бе уві Аза Ази Аа Не не Аг го А Суб УЗ 1 145 що 1155 вНебег Тут Ап Азію ув во бегіво бегіву АгЕ АБ АТЕ 1150 13655 ТУ
Ам ТУє ха то МЕ бе Сух Аа Аза Ашиа Зв Ве Петер іух
ІЗ МІВ щу
НАВ Нізіва Тео Неїво фу Не ко 1395 «210» 30 -21151163 «212» РАТ «213» Сіозійаішт роїшіїпит «4005» 30
Ме іух Не Ах СУ деп ви хв Пе Ар ов Бто Уа Ар Ав ух і 5 10 ї5 хв ув АВ Не Уві АгЕ ЕТ АгЕ ув бег Ар мВ ВНе ве ух АВ
ОО 45 30 вне іп узі Аа Вго дев Не то Не Уа его СПО Ат ТУЄ ТУ Оу 30 їх
ОН дегівн бух Пе Ах о лев СВ ух Ре Аз Ну сту Пе Тут що ЕЕ 5
Ахват А ВВЕ ви Зег тву Ав ли Бім ук Яр АФІН во СІВ що а 75 ЩО
Аве не ін во во с АТЕ Не хв 5 АН УЗ Ма КНУ Дід ща в ЗБ їувівніви бек їви Не сер ТВ АБ Пе Рез Два Рг Тук З Ази
М 105 о ам: Ахо Гуг Ат й Трек Туга Бек Зег і ух да Ай
ТІ 130 135 ще БО5 Тук Бук тку ді Алі ви Уві Пе ВББе му Рез СТУ Зак Аз
Ка 135 ще
Не Не бух Аа а5п Уа Не Тег Тут бук у и Гук АВ СТВ Бе
І 150 М 15
СУ МЕЗО ТвЕ мМеБіва С Пе та ВБе й Кта Ве ем Те Ні (5 ук Ар ін ве Ту Уа Ао бро Ді Бач сне Гец Не ух Сух 18 їз ща їви Не гу хетівц Ту Тек во Ту ПУ Не БУТ Ази АМУВН 155 МН ТО
Кене Не Бро Туг Аг ев Ат Ва СН ве Ас бегівц СН ТУк
Зо 215 а
ЗВгіз іви вхр ех Не Ахо Бе ви Не ее СПУ СТУ Не АЗЕ Ту я А ке зо це ен іец Аза Тева Бго ук тр Бе Не хв бує Гук Ре Не
Зах я ВЕ
Афетіке5ег ух АБИ КВ СНИ Бу Тук бух АЖ АВ ТУ СН УЗ
Мету А вапна Тут Не Ав Мхл ет Не бух Сем Тук Мен В 235 ВИ 85 слі вва іже і АКА УЗ Ух ДІ Не Тр Ні; ам Бе ек
ЖЕК ВО
ТУуЄ Не бе ух ВТНЗ З Ве МІВ МК го АТ ТУКА хо Дав що 5 З
Дів ес Аби БНе Ту тує Див Бу Гек Тут Уві Не АхО Тук КВ
Бук вал Гук Аа Не Давно Вел ух Дан СНУ Сів Пе бух ТНК іух
За їх Ящ івч его ів бегіу Гуг Ак ід Св ПЕ Це Ахп уз то Сн Зео 355 З Зв
Не Уві Ахв ан не Аа сій Ап Ай Твт Уві би Мегітє зак дей
Пе тег Оу Азов сіу кві і ТВ У Ас АхА ББе Тугбег Ал 55 ще 55 аю тує пе йо го їУуєдяп і жо деп Бук ін Біб бе Не Аа Туг г За і
Тугіви аз АТМ Аза Пе сМО С Не Бі Бух Не ко Ро В
Б ХВ Б кп Ар сі Асо Не Тут Кто Буг тв ех АЛ АВ АЗОТУ ве в 435 щі НЯ ча У тує дп НЕ ТНг фу Ав бух МН Пе АН ВЕ ТР ВЕ Рго іви бу та Ах Тек во сни АТ Ле Не Ахрв БУ АВ Ар НВ 455 433 435 а
Аспіян алое Аза ва і аціу« У Неслегбзегісе шу загін щЮ 5
ВЕУ баг Ви іви Ас Аза Те Ме Аз тугі ЗВ вне Не бух
Мю ох 5
Тубдхріуе ро не Азрв Тв АБВірх М ТУг Ту іх тв ів ух
Мане вве АР АХО Гук заг Цзи Ахо Не тв ОВ и СНИ Не
КН 53 ща
ЗеРА На МНЕ АЗОВ ТВ Бу Не Пе то То Не КНУ Атв ДІВ
Я МЕ Ух ЕС ізн Аха бе ви Аня Не хв Ази Бег ВВе ув Се і Ве Гу кп це У ЗУ ему Ро Пе ет ем Не ази вух Бу КИ Аза Пе ТЕ Не то
ЗО ЗВх БВ ух Бе ух Пе АЩЗ СНи Ме бу баг кг МБфіви Аха Бе ве СНе ше я ще ВО іу5 Азвіви ог НН Аа Бе Не АБ пе ук ух Ця Ах А НЕ
Мо БІВ ЗНА
Гугівц фу у НЕ Туг Бук ха рев Ар сти Тр тв Тв А
Те тує бек сна тує ТБе аеро Не Су ВЛЄЄ АЕН ог бух бак У 545 п Б ів іа ів Сів іх жи Пе фу іув ів Не сдіпіу бів іо АТЕ
БО Бех БВ їук ви Меси Аа зе Ал Не о зах ТНК АВ пе хи Не 5-5 п БО дк беи Тве В ТВЕ Ай ТНК Сео Ат Ав Не ау КЛ КИМ Бек КН
З КЕ лю
Ме АЖ Не дей Ак НО Кер еВ Не Аха Ам АНІ АВ КСВ лм о Тт15 23
За внезУо да Ах Не ук Бу у вва Тв ет Не МН, СН сне
СУБ В бує Азпо Не дол ух ак ТВ бує ЗІ ВК Не уні кує Су
У 45 КАК
Тк Не Аква Пи Твена бух Бе Мі Це Не Ме бі Ако Заг
КК Те то ве хегАівн Аве Аз Не а Ар Не сій Дал Ме У Ахв т 775 аа іви ве ер авк ук ТВО іец а Не ук си ів ТБ ет га
ТК У Т95 ЗО
Туееійч фен бегіви Тег ІЗ Ва и сни сів Ар аАхо ба ма Не
В КЗ щі1В ех до В Ку, «Ху «ук А Кіа хз іні і б хе Мк Ве
ОТ АБО ТНгестнУу ух АшА ТБ а УНН Зм Туг Кто ув Акр Пе
Оуен Уві Бугу Не Ах Аа вв АВа Не НО СВИ ТВЕ Су АВ 835 ЩО ща вар АЧНе Ух Не ТВ АвА Ар Ту Ре Са аа Ну ви ТВ
Ав аби пе бе Не Бук Бе тв а Ат Ахп еру ОВ Ак ТВ
Не ух бетіух ів Пе Су 5вг Гук хв Аа Су НУ Тто Су
Не тує Ре Зі Ап вав у МБО УМ Ва Ащ Не Не АБО ог Ам
З ХК що
СУ Ва СНО ух АБИ Па Тут Гея ет Аня Не бах Ав Аза ще ТТ о сук У
І З 5 бі Ж щу: і Сім м ДУ ех ха їх Аг ік хх зе їх
НІ Тек Не уз не бат в Ах Ав ів ув АВ І ви еВ
Зо 55 щен
Ве На Ак Ах Це во УЗА Ак 1: Ахо Пе уз а Не їву
Ме о 55 ЗО
АВ ТУ Бек дег Ас Пе Пе Беківнівц Зег АХ В5А АС АХР
ЗБ ай Зв
Уа! ба Неси Зі ее увів Аза су ТВЕР Не Асв Бек Ам
КО А З
КНи Неїец ВЕ Ах угвве бег вх во Ал йхв баг Тук Не дев ща ща МмюЮ5
АБИ НЕ АФ сни су Пе ми Са Ту Аж АЛЕ ТТ Тук Си Ме 103 на МО
РНе хи Тука ке тости Не дів Не асп ух бе Бін БВ
Ме Зо Мо
Ах А Аза Не буб бе баг Пе ааа Аав ЗІ Дай. й ви А що тах цео
БНефу Реоівц фу РНаеїтв ері в Те Аа Ро Аа у що і1о055 щі теє У біві іт АХ Сі УДЕ Не Не чу а ів АЮ 7 Тр 148о
ТЕ ніх їі ар Пет темі азам це
Ме МО ще цівіво У АНА КУ ДВ Ах Ав і Пе Ре Не Пе Ав
НЕ 15 іо аапАсІ ЦЕ рНе Пе вх Ав Сук ів Неї УНР Тер Адв АХА
Те іо ма
Уа Аж Уві тує іви ек Не ух Акв Зі Яр ук Акп їтр Уві що 35 Її
Небух щен АСТМІ Ат НЕ то ув ід ще Тук ів То мя 1150 ї155
Невже Ах Пе
Claims (27)
1. Молекула, яка містить поліпептид нетоксичного негемаглютиніну (МТМНА), який ковалентно зв'язаний з гетерологічним афінним фрагментом для виділення і очищення білка ботулінічного нейротоксину (ВОМТ) або поліпептиду, який містить рецепторзв'язувальний домен ВоМТ, з розчину, де: молекула додатково зв'язана з мішенню зв'язування через афінний фрагмент; і поліпептид МТМНА знаходиться в комплексі з сумісним ботулінічним нейротоксином (ВоМТ) або поліпептидом, що містить його рецепторзв'язувальний домен.
2. Молекула за п. 1, яка відрізняється тим, що МТМНА ії афінний фрагмент експресуються у вигляді злитого білка.
3. Молекула за будь-яким з пп. 1-2, яка відрізняється тим, що: ї афінний фрагмент розташований в позиції, вибраній з групи, яка складається з: М-кінця амінокислотної послідовності МТМНА, С-кінця амінокислотної послідовності МТМНА і всередині амінокислотної послідовності МТМНА; ії) афінний фрагмент ефективно зв'язує мішень зв'язування в умовах від близько рН б до близько рН 8; і/або ії) афінний фрагмент вибирають з групи, яка складається з: глутатіон-5-трансферази (51), тега С-тус, домену, який зв'язує хітин, білка, який зв'язує стрептавідин (5ВР), домену, який зв'язує целюлозу, пептиду, який зв'язує кальмодулін, 5-тега, Зігер-тега ІЇ, ЕГА, білка А, білка б, гістидинового афінного тега (НАТ), полі-Ніз і білка, який зв'язує мальтозу (МВР).
4. Молекула за будь-яким з пп. 1-3, яка відрізняється тим, що: ї) МТМНА походить з серотипів В, А, С1, 0, Е, Е або б; і/або і) МТМНА походить з серотипу В.
5. Молекула за будь-яким з пп. 1-4, яка відрізняється тим, що молекула додатково зв'язана з мішенню зв'язування через афінний фрагмент, де мішень зв'язування стабільно прикріплена до матриксу.
6. Водний розчин, який містить молекулу за будь-яким з пп. 1-5.
7. Нуклеїнова кислота, яка кодує злитий білок МТМНА і афінний фрагмент, описаний в будь- якому з пп. 2-5.
8. Вектор експресії, який містить нуклеїнову кислоту за п. 7.
9. Клітина-хазяїн, яка містить і експресує нуклеїнову кислоту за п. 7 або 8.
10. Клітина-хазяїн за п. 9, яка: ї) додатково експресує сумісний ботулінічний нейротоксин (ВоМТ); ії) є прокаріотичною або еукаріотичною; ії) являє собою бактеріальну клітину, дріжджову клітину, клітину ссавця, клітину комахи, Зо рослинну клітину або клітину земноводного; їм) додатково експресує сумісний ботулінічний нейротоксин (ВоОМТ) і є прокаріотичною або еукаріотичною; або м) додатково експресує сумісний ботулінічний нейротоксин (ВоМТ) і являє собою бактеріальну клітину, дріжджову клітину, клітину ссавця, клітину комахи, рослинну клітину або клітину земноводного.
11. Спосіб очищення ботулінічного нейротоксину (ВоМТ), який містить стадії: а) приведення в контакт ВОМТ з молекулою, яка включає сумісний поліпептид нетоксичного негемаглютиніну (МТМНА), який ковалентно зв'язаний з гетерологічним афінним фрагментом, в умовах, прийнятних для зв'язування МІТМНА з ВоМтТ, для того, щоб сформувати комплекс МТМНА-ВОМТ, де ВоМтТ знаходиться в розчині, і молекулу прикріплюють до матриксу, при цьому розчин приводять в контакт з матриксом, щоб у такий спосіб привести в контакт ВОМТ з МТМНА.
12. Спосіб за п. 11, який додатково включає: р) промивання матриксу, щоб у такий спосіб видалити матеріали, які не зв'язались; і с) елюювання ВоМТ з матриксу шляхом приведення в контакт матриксу з водним розчином, який дисоціює ВОМТ з комплексу МГМНА-ВоМТ; або р) промивання матриксу, щоб у такий спосіб видалити матеріали, які не зв'язались; с) приведення в контакт матриксу з протеазою в умовах, які зберігають комплекс МТМНА-ВОоМТ і придатні для відщеплення ВОоМТ в межах комплексу МІТМНА-ВОоМТ; а) промивання матриксу, щоб у такий спосіб видалити протеазу і матеріали, які не зв'язались; і е) елюювання відщепленого ВОМТ з матриксу шляхом приведення в контакт матриксу з водним розчином, який дисоціює відщеплений ВОМТ з комплексу МІГМНА-ВоМТ.
13. Спосіб за п. 11 або 12, який відрізняється тим, що матрикс з'єднаний з мішенню зв'язування афінного фрагмента, і молекула нековалентно зв'язана з матриксом за допомогою взаємодій афінного фрагмента і мішені зв'язування.
14. Спосіб за п. 12 або 13, який відрізняється тим, що водний розчин має рН 27,5.
15. Спосіб за будь-яким з пп. 11-14, який відрізняється тим, що: ї розчин, який містить ВоМТ, являє собою очищений клітинний екстракт з клітин, які експресують ВОМТ; або її) розчин, який містить ВОМТ, являє собою очищений клітинний екстракт з клітин, які експресують ВоМТ, і очищений клітинний екстракт додатково містить 1 мМ фенілметилсульфонілфториду (РМ5БЕ).
16. Спосіб за будь-яким з пп. 11-15, який відрізняється тим, що умови, прийнятні для зв'язування, включають приведення в контакт ВОМТ в контексті буфера для зв'язування, який має фізіологічну іонну силу і рН «7,5.
17. Спосіб за будь-яким з пп. 11-16, який відрізняється тим, що промивання здійснюють промивальним буфером, який має фізіологічну іонну силу з рН «7,5.
18. Спосіб за п. 16 або 17, який відрізняється тим, що: ї) буфер для зв'язування і/або промивальний буфер знаходиться (має концентрацію) між 100- 200 мМ КСІ або Масі; ії) буфер для зв'язування і/або промивальний буфер має рН близько 6; ії) буфер для зв'язування і/або промивальний буфер містить 50 мМ МЕЗ5, 150 мМ масі, рН 6; їм) водний розчин являє собою елюювальний буфер, який містить близько 50 мМ Трис, 150 мМ масі; і/або м) водний розчин являє собою елюювальний буфер з рН близько 8.
19. Спосіб за будь-яким з пп. 13-18, який відрізняється тим, що: ї) афінний фрагмент вибирають з групи, яка складається з: глутатіон-5-трансферази (О51Т), тега бС-тус, домену, що зв'язує хітин, білка, який зв'язує стрептавідин (ЗВР), домену, який зв'язує целюлозу, пептиду, який зв'язує кальмодулін, 5-тега, Зігер-тега ІІ, ЕГА, білка А, білка сб, гістидинового афінного тега (НАТ), полі-Ніз і білка, який зв'язує мальтозу (МВР); і/або ії) афінний фрагмент являє собою О5Т, а мішень зв'язування являє собою глутатіон.
20. Спосіб за будь-яким з пп. 12-19, який відрізняється тим, що: ї) протеаза являє собою трипсин або ендопротеїназу І уб-0; ії) протеазу додають в молярному співвідношенні від близько 1:2 до близько 1:1000 до МТМНА; ії) протеазу приводять в контакт з матриксом за кімнатної температури; і/або їм) протеазу приводять в контакт з матриксом протягом від близько 10 хвилин до 18 годин.
21. Спосіб за п. 18, в якому: молекулу прикріплюють до матриксу, покритого глутатіоном, і афінний фрагмент являє собою глутатіон-5-трансферазу; і стадія (а) приведення в контакт включає приведення в контакт Зо очищеного клітинного екстракту, який містить ВоМТ, з матриксом в буфері для зв'язування з рн близько 6, щоб у такий спосіб сформувати комплекс МТМНА-ВоМТ; і, додатково, де спосіб включає стадії: р) промивання матриксу промивальним буфером з рН близько 6, щоб у такий спосіб видалити матеріали, які не зв'язались; і с) елюювання ВоМТ з матриксу, шляхом приведення в контакт матриксу з елюювальним буфером, який має рН 27,5, щоб у такий спосіб дисоціювати ВОоМТ з комплексу МТМНА-ВоМТ.
22. Спосіб за п. 18, в якому: молекулу прикріплюють до матриксу, покритого глутатіоном, і афінний фрагмент являє собою глутатіон-5-трансферазу; і стадія (а) приведення в контакт включає приведення в контакт очищеного клітинного екстракту, який містить ВоМТ, з матриксом в буфері для зв'язування з рн близько 6, щоб у такий спосіб сформувати комплекс МТМНА-ВоМТ; і, додатково, де спосіб включає стадії: р) промивання матриксу промивальним буфером з рН близько 6, щоб у такий спосіб видалити матеріали, які не зв'язались; і с) приведення в контакт матриксу з протеазою в буфері з рН близько 6, щоб у такий спосіб відщепити ВОоМТ в межах комплексу МГТМНА-ВоМТ; а) промивання матриксу промивальним буфером з рН близько 6, щоб у такий спосіб видалити протеазу і матеріали, які не зв'язались; і е) елюювання ВоМТ з матриксу, шляхом приведення в контакт матриксу з елюювальним буфером, який має рН 27,5, щоб у такий спосіб дисоціювати ВОоМТ з комплексу МТМНА-ВоМТ.
23. Спосіб за будь-яким з п. 21 або 22, який відрізняється тим, що: ї) буфер для зв'язування і/або промивальний буфер містить 50 мМ МЕ5, 150 мМ Масі; і) буфер для зв'язування і/або промивальний буфер містить 50 мМ МЕЗ5, 150 мМ Масі і буфер для зв'язування додатково містить 1 мМ фенілметилсульфонілфториду (РМ5БЕ); ії) елюювальний буфер містить 50 мМ Трис, 150 мМ Масі і має рН близько 8; їм) матрикс, покритий глутатіоном, являє собою з'єднані з глутатіоном агарозні гранули або матрикс, покритий глутатіоном, являє собою колонку; м) матрикс, покритий глутатіоном, має близько 5 мг/мл зв'язаного МТМНА; і/або мі) протеаза являє собою трипсин або ендопротеїназу І уб-0.
24. Спосіб очищення поліпептиду, який містить рецепторзв'язувальний домен (поліпептид Нс) ботулінічного нейротоксину, який включає наступні стадії: а) приведення в контакт розчину, який містить поліпептид Нс з матриксом, який має прикріплений до нього сумісний нетоксичний негемаглютинін (МТМНА) в умовах, прийнятних для зв'язування МТМНА з поліпептидом Нс, щоб у такий спосіб сформувати комплекс МТМНА- поліпептид Не. р) промивання матриксу, щоб у такий спосіб видалити матеріали, які не зв'язались; с) елюювання поліпептиду Нс з матриксу шляхом приведення в контакт матриксу з водним розчином, який дисоціює поліпептид Не з комплексу МІТМНА-поліпептид Не.
25. Спосіб за п. 24, який відрізняється тим, що поліпептид Нс являє собою поліпептид ботулінічного нейротоксину (ВоОМТ) або поліпептид Нс являє собою химерний поліпептид ботулінічного нейротоксину (ВоМТ).
26. Молекула за будь-яким з пп. 1-5, клітина-хазяїн за п. 9 або 10 або спосіб за будь-яким з пп. 13-25, в яких ВоМТ або поліпептид містить модифікований рецепторзв'язувальний домен з Сіовігідіа! Боїшіїпит серотипу В (В-Не).
27. Застосування молекули за будь-яким з пп. 1-5 в способі очищення поліпептиду ботулінічного нейротоксину (ВОМТ). Б ЗІВА хе ЯЗКНА ВНУ х. х х зве Ко : Ж лов Ії ОО М, . З х ЕК ше Б щи в. я і. ЩО В 5 ЩО Ж х ВЖЕ в: ХХ я І Щі ВАК КЧОВВНЕ к ха гравувах Фіг ЛА Ди ДУ АА за і Бони Її, ! гдукеткннвня ОН Іване ро свкка х Кк іван ЕВ Хонннннкюєєтюкннякнх 0 Мнккнмюмхнккююики Ї потом У ї мини 1 ле інкукуаанвня пре Її пуЗг Ж ВІННя Я зи СМР, МНК ВКА , жи У і ли К ще зонти і ІА: ром КК амеих АО КАВІОЮчНя рен Р си еннавакї ук ше У рндкювіни фев на звуеравии Провина Вер НК що г пер лве МАНІ а т о ючваения нн я ЗОМ ЕН В ЦК ТИВ т МОВО лу шк; я і ач
Фіг. 18 сх Ки й У ше : я З У я Ж дО я ще: де ах Ше ОА й «а аб Ка лай я й Замок УК - о ЕЕ Я у г Як Й о Й о о х дя я і ж Щ З Ерюдювані. , КУ о Ей я Кей оцііЕнея «й ШО п о Ох с о - ВЕ г А 5 «в п оо вкя ещ м В ЗЕ о Кн й. НН зи
Фіг. 2А Фіг. 28 ве ММ їх) а Твен» х ож Ж щої ДТ аю жо ща « ПН 5 с Є як по Ко ПК г Ка С зх о. ща ОХ КК . ж У 3 к й ПК ВН -к ОХ Б пово "З й ин - же ук с - шо -я6 о 5 -е її 24 я Мас одини! я - ай Ге ш сю я Е
Фіг. ЗА Фіг. ЗВ
«Їх 2 . ки ях Зоо г ях 3 х ях 7 й ще й я Ка ще В. - Ж ЩЕ хе - г ще де м - «ооо Є г. що ще КЕ я У Зк я ЯЗ де М Є шо зе Є Ж її «її с С В ке - ш як Ко ооо оо Й як Най й Я я ее КО да де Кей де ай че ке . Ж - о с т ко Ся Ко я Є с 7 с на ж Ко х х т т кю. ДЖЕ, ДОК тн оре КЕ я Ж ях ВО У ПИШНЕ ПИШИ БО яе Б ДИНИ. т НИВИ ИИВИ ПМ ИК: ПИТИ ПИЖЖК, ОК т ЕППШИНИШННИ П ПИШИ ПИШИ Я а НН о ЕКО ПЕН о хо ПЕ ООН В -- ХЕ МНК ООН ОХ ВИЙ НА б ж 0 НН ОМВО ВН: ОВ ПН ВК ПОНІ СО о о овНвВЕ - ООН З З зн 0 ООН К У ЗМя НВ соска ОБ КМИН ПИШИ ИИ С хх Осо ек чі Ще НННННИНИНиИІ ИИЖИНИКх. ПИТИ ОК ПК ОК ОАКОМН МО ТИ ПЕН ПОМАННИИ ОТ АК ПИШИНИНИ. ПОжКМНК с ВЕК ц ПИШНИХ, ОО КК З пли ПОКК ПК хх 5-3 СЕМИ ПТЕОКК ОВ НН ПІН ВХ о. ОО с ПН ОІНВНННА 3 у ПЕКНОХ ПИШИИШИИ ОХ: ВО о ПИВ ПНКХ ПИЙШИШИКИ ще НИ КН ння ПИШИ ОО ПЕКЕОоЕ с шо 0 я ОО ВН еВ АН щі
Фіг. 4 венмМ піл екі піде терії В сли, ВЛ СУ іш пліви т тяЖжК І ОМИ: ОО ЧТМА Мі Ши КЕМЛІА ЛІЛІЙ МОБ ЖУХМОЇСМиЗ. ЗТ Мясо ХиМД Ов ОММІ Жх? пове ВВВІХ ЗечпИкКпУти Фати чі Хата УММІУЦИЕ ВЛІВО ИЖИК хі ді роки іх ЕЕ КЕ іфжллЕжии вуБУуаА а біде ЗУ МКУВИ
ШОК. сипких пиЖЖКІА ХНЕУ пушежавней ВлисхувацчіІх Щ1ЕороЖиІ МУ А тех тухи авицжчіксх іх кісІк тщаххаиУ вхакишькх Буш краВ ща ХМК ВІЖніКВцУ ВОЖе ММК ЖБК лк аКЕХ ЕР буки мімцмт воцичівіеї кухієтвтиєч схеіміпкіх Мижківюм о Типи їкитує ЗЕ: фартух лох МУКУ ові Коди ВУКІЖОА УЖЕ МуйУАТУ гл БЕХ ухили луки ц ЗказциМсіх МЕМ фи УМ КИТЕ ЗВ Херечкіаяк піні виВхи КУА ХХІ хвуКІБЕЗАИ ЗУМІВ п) ші хтят МІУВКАКЕ ЖЕН ВИ тісту КЛІК РЕЖИМИ З ласки піді жевлшнртїх дужі Ві ВИрЕКОЛВБХО тпеувиаКях ЖІ ЖХкІшЖАЖМ цеху ТМАЛОВИМу ЗІ іЕкЕ МІЕШЕКЛЯВНХ МІ аАИХ Та о диужиірадяк МофідеУв) схлихатв баком АЖрЕТлекую: промАд лаки ТВ ЖЕТІЧЕЖМИЙО самиці мишею Шізіцевищі Беца цІ1к окр іхі ЖІ ут кару ІдашиКОх ЗЕЖКМ ХРО ШОМЖ ПНІВ ФК УЖ Кя ЖИ хтів ЕжаимМ Марін кі Макет» сім ом Бошобеищех Бехта х ЗЕЛокунтууумх ЖІ ЇХ і слюви ККЗІЩТОВфЕЖ пЛІВІКЮКВИ ВОК КІ ЇЖУ: ВМО давно ІК ЕІ Фупжи Ка ух жеКЕОЖИіиН МУ Х ІІ Зісмімінів сажі шлкиУсдиІ ВИХІЮ МК ВЕЖ ЕВ кІШМІНХХ БІТ) звЕтківнкі Хаскі же покрілавцх соїмУхмактх лома ун ях
Фіг. ЗА
І. а
ВУВВХ БЕ: Пітта рогами Холм киУта ФУ СІК ИЮ (БО 1 ВО доклав иИМи ілі и ЖЕК К КУХОтВецім ВШ пп ЩЕ ОЗа ТЕМИ Хя Ка КМу Кіті пах зво ІшІЕ му ТЕ пухку: УСІВНІЧАКІ шошмаЖЕКИО Зк сМуПКОКИМХ ЕД КРЕЖЕ З бами ве пий смажити ви ко кн ки кий п сих МЕ км І КСТІЮВІККЕ фо Зрукіюкх кіжуєжииви ОБО РНх ЩІ КІМ куки кавер зкекхкосух Кккхиоа ВЖІКЕУХиЦК ККЗ МЕ З зпіжУтівх мечеть зівпууккко тЖвиКОМУВ Мило БіДроАжвЕ МЛ парнкреімУ ПІЇВШИИИУ! еахмхусИї Шу Ктщя ККУ БОЖЕ ТІ ТИХ Іл тпуетави міІтВаахкруУ дане ДіАшю УТ КТАВИМЛУу ПРФБАЯяМХ! ВХ ЕВ ЖІ БівЕнІдЕк хау імую ЕХ піку ЧкжшехОЮх ТК жоКаТКУЕ ЖІ пуєфеотемом інфе візЕ аРпіівойиих пзБІКніце фвіапхеаві вок жо смихКх ско птн УК сим мктои око сито ехо що ЕІ ристик зуаамінІв щшмжхаки куту т ЧЕТ зе ху, СИХ МПа ВІМмию хоп тив івЕЛеіДЖМКІ МУКОБУМ вежа ЗЕД Іва 7Х) субТетювіжВх Гоше сівВ пімкилиий Ева дЖце ХАІ КЕНІЯ УЖЕ «вужа Силу вужі тикц ралі саклсжеи Мат хя НЕ За ілал ЧЕКаКІААК спщдітиаках УХМІЖТУЗВ ЗІКА КОЮ зро іжЕ Мет пок Унхх. Ан тпм Е: сис пла я я. зе щої ми, НЕК суху: папою ЗМЕАМоеояМи УдКлвИвіК 11 ТЕая зх іх ЗЕ дав ДЖ ОВИТІ жчтаанквИ сицЕхінек ХМ ипии вич МЕЖ юну Кріса и ДВІУІВІМИО ЗаІКЕЦрОВІ КІЇБЕИяКи умі, ІНЖІ мадрцуюкуї сука дах ВЖК ЗЕМ Вінкс кя киіакий ІЕЕ жене Кути Ех і ні в
Фіг. ШТ й: Міст тіцім босудіїтим ВТ шов. ПСЖ ІБ СБЗЕЗЯХ ЗІ С зи мм Ва іонизмумі нах хжокиУуу тржикуєикх катери мзркттщцях фвлашиукв і З
Фіг. 5С дж сажки хо сміх Ех дзен штам іх Зі хе Укі суійлежеиуут «Ж баікивмтох зижЖаклАК ох вісі кгій хгпЕйбАхАЙ ліків ву КАЖУ Е К аж чи че хоча ска хоч кока зе хи Коля 153 пеіЕдсови саххінваів стіріруау «хім ішши пахви ЗЖОЮанУТе тки схпепиєюх функ кокс музу меру зе жсгісміщі ші мощі шкі ВУ 185 днптУЖУККІЕ: впустити заз зкух жЗектівЕяі «Заказ кві хі цікорва мой, 4 : х хх сект ук па ис дулі теку у кг, «мега а я «ал ЕмУМм ЖЕ: МіФзфуУТієх злмплвУКЗА паічалацжм: БИК РІвМе «їз уїи зХхчЇвивуМ ШІ зушелачиям ВІЧКА Х ККУ авІКВ іжвінівуа кава лиЦМе їппаХЕВЕУк зЖІ ХхоушкІйОює пвішЧКУма Чіптцівії плівках зізмімУю свіду птух ЕХ деіжхліУч і УуяпухаАрУпт зуБтВЕВсам ВЗ тТиАа хащегнВі Мі Ззаезканих «МО сЕрехкдідн; КЧіптТиЦОвЬ зфМфалееси ххокіхфЖжщиах хмемивии рф тЄ ЖІ туішВІдвЕ Ва НЕКУУХ мішзосЕипЕа ВІ БалТвкяй мова кте кЕщЕнІвЕММ што хай хомут, полян жию о кт хни де уд уамйую их Же єв м м де олег и порах Ха КІХ Ух РУЦІ ИА зАрфАяІчКМ ЖЛУЮАЯЖьЕА пи хі ск жі ще ом КУ хм Фуко опи Дома їде хі ЕІ ХЖЕежАвхі м сетістжицу МСА ци КЛЕМ МЕЖАХ ХаЗАахай беж р мн хо ща : іти хорт КУ жк дж екз шхуєцт я ТЕЛ ідпішиивЕЕ халва пліч Вах зви везе сБиВелНАх. тиї акічкежі с кішка Ка поівВІМівЕ СЗічі й кова хезжуп МЕ Ба піпеоввкЗі віки кі» Кугізіахту тиці ів «руни каклящіиВ Ж офі твіУ цебМАВЕМАХ сиве цімонх Бутамуєх шайкоацене кеди сит іп жі : та пе сх Котюк му кпзз ік ЯЕІ сеттініній гімлчіі КЕ ків ечва Валі ужа БІіЖІУЛЬЬНЕ ііі 155 квітах и впушлусвках ІгЧіцегік тупкауАшнуУ ФЕВ учх ШЕЙК ИХ ЧЕН: ме пцівіс шЕКК ла кекси срітг і ЗсІМіюех фей жо кім окт ди: пдапідбщф «ЖИХУКИлИ пкдеещии фут Ї Миви ХЖМОАЛИНИМ гІдітпакхаУ ж зі тк. спиш Ж дм ка бачків спек зх ахеііхнВАі сушці КЕВЗу микУаВІіЗХ сжшВУВТІСИ ги ИкАля Івін зі нт
Фіг. продовження МТА сії: ФфісптвіЗкіа їмУіжной пі їж залу. Мь ше пок Ві МІТКИ ПУТ ТІ ТБАБКТНТРЄ МЛТБУКЕЧУМ УМЕШИТУЦЕК МЕМОКЕКЦЕ ОСУТЗНКМУ УЛІКВХВУМИи АТТЕМІКНУВ ТЕХНО МІЗТВІВУЖУ пуУМрУМшЕ КАТКИ ІРЕ пЕВКуюлІКЕ МУКУ єИх МиХУЕЖІНОМ МЕНКЖАЖМХІ КН. ШМУДУЕЖИВ ПММ ЕМЕЦНІЛЛЖЕ ЖЯЕКУЛОВЖМ МІТКИ ОЬІЖНХ ТКБЖЦІЖЕН ТКУ ЦЕВСЖЕ КУПКИсУИ. МІіЬміІщ Оп ІМхМо ХЕКТюаУСНХ ВІККуЖЕТЕХ ТУКУВІЖНМХ МУСМОІЖХІ КОМІ ООМИМВ ІМХРНІУЮЕХ ЗЕМ ТХЕ КЕЩАТЖНККИ КУТИ ЖИ ШХУНА ШАТРККОКМ КНаЩІТлЖИй МУУМІИОМИУ ЗІКу ООуКщттТшОК УЕТКВІТТЮМ ЖшУПХКІМУуХ ШУЖНМІЩІЮЕ БУВ ВНАЇВ УБРУЮЦННМ МУЖТИХЕВМУ МЕЗТУНТАЛО ВИВИХУ ЗКВКЖОТИОЕ БЕХУКЕВАМК СУТИКІХ ЕУЦЕВІМЦІК: БУПІПХЕХХЬ ХІКНУРИМИИ МІХ КОУВІИ ПУХ ВИНА КІ ПАшИКУВВИИ ПЕКІН ИЕК КИМІМЕРеТК ХІМНРУХЦИТІУ КМККІМУДУМИ УЖКУВЕМІХХ ХКЕКІТИШКІ» ПеМЕЕТІНОВ ЕБЬАСКеЦЙ 11 УКИ ОЦЕТ ХАТУ ПІБ ТЕХТЕ ХОБЕХКОЦІВ НБН МЕ БЦ ЕУКОЇ ХБЖКІТМК ТТКМУМІЖХВ ЖКІЦНОТНІХ ПБЕВВТІШЙ УТККЕІИУЮК МТИМІЖЕМИ ЩАДУМОИМКИ ВЕДЕ ТОМЕ МЩЕННКЕМТІ ШРІШеНОЖЕЬ сКТЖИІКІХ МПеКОЖуХОх ЗИНЕКНОКИХ Ку ТЬи БТЦОШМОЙУК ЗЕНОТ КІВІ ПМКОМУЄКЕ 2ТЕКНИОЕ БРОНІ МУКУ МИХ ЯМІХІЙІВУЮ БІДНІ КІ МОБМСЬЕУЮХ СИОМЕУВЕМ ХХОМУИ ТУЮ МУТЕЖЖШЕИВ ЗІШЧУТУНеХ ІІ ТМЕКЧОуЬХНИ МЕБКУЄЬТЕУ МОЖУ ЕМТІЕУХМТО МЕЕБІІВІК БУЗОК Ж ПІСУСЦШЕ МІУБІВКЖИХ МІУ ВЕЩЕРУМИТ. ЕЖВЕРІТКВУ МПКЯЕЩЬЛЬК ОПО КаМІСВ СМ юХАм БЕГОЛУХ зі 5 р
Фіг.
МТМНА ТИ «Пе нбвюх» Вюйцітннхх ТКА ТАБУ ЕНЗКО БУ МЕ ЗБ ї які іві двруикижкі туго гЕх ката арихх саректищею фЖіавиЖА МІ одоімікпЕїй пбкахвнххщ піз ків вюзачвавія ЗМбетзаокву зріжувиех РТ чітипгуцкуцЮвк «жкІйпЕкУй ЕБПІОВТрЕИпуУ пВІопудеядя пкЕкІУуВВІКіМ Куті ЧЕ 1й2 литі трикй луги увие іитзві1їхк ахтвиярав віка зоічпакові Її кфтсржиїкт зику клі кінжу УК івівик укікпаеМри віта Іі іконі «Зо іКікХ КОКІЗІпх їмпілівуКУ ЗВІНнлаЮу Та ИАЖЕ Іі Биюшууїимутій мухілжітми «ііі віши кМІлізЕквО КУтпІчУНКНВ іа ЕшаМуУХ ЯХлосвуіваєтняхХ хтів море тів жт Фу іМ длдуюицх «МІ учзІспосвиє сте боповів зіпхАЗацаВп попплпаиВх лихий ЗКУ КАВВХВ З хуінуіхиот віЧсккууІ жішвУЕКихи БИЗмісомоі хмрцалетА жЕтквіві їх ЖИІ битві н оезиівііЗх КоВігедчя Бін Зніо У ЗБК МиУ узітакнітух МІХ ЖХКуттаКІії пиміаужату Кезалтакця заілеліхк ічанЕЖІЖів жачзірутекх тйї о віхаптахий піших ців шпжхОЗивоінк аЕЇКУДУЮО УрЕЇИОУеХ узппаплЬКЕк ТІ яті щужуліг деткжріїва ВІЇ ТЕІ ра китт падтицеихи лілвфешжі 3 хХї свеадорислії сауни декжвісісю оте аірІК ЗшекіКЕви кЕжседікве МЕ ОБрістжлики сх вікихММ длюхипоцхе іт псічЕ Баідхоцися зеуіхпАхмт ЗМ: перрі мію рІЖИЯ ІРЖЬ мЕВИВКИХхі КРІМ Хщ 3 шКюМКУМУх дусі ки 1ПЙл »ушісеюютя жесту Тешу ідекаші їв Уміє и треш мумії РшКІ Кптоіліях жкбкізпіе зкоутцкия свасжміе ХуклівЕеви відетазкцм іх дкЕхавево їхрамацізу важкі зініх «Ерлувиніст пмикжреав іі "
Фіг. »Е МІВЕ» Хі ХісникуЗАЧИ ЇМУуНХАНУМ СТО МОЖЕ СЗЗ 2) ветеаию ВЖЕ ЖІ МО: 23 В ОВЕН ЗрйпкйУа) ситах катода ум ірон ікра ЖІ зір ашнгйх кет і ст жківлішкам митесакл ів Зівуатртрую вопкийтхх ЇБУ зудвекипЕ тус Еа росла кних ЗХУКкеЖжаКИ ЕМВ Е преїких УЩЬ Зутйраівмі коіфажиту)М ушікурасиМ: ММукілсж й хісухева гі ізеау тлі Віленруві ЧЕКИ» пієкукицує ЗБікннтвів вбизкіювицк Еллі М плуга Зір ихив ВІВВхЕкех чі Ек івтЕказік аівіважи ІВ єфРіпдуіУ піфззвите: жЕзвіуцеюкр, ЕцбУЄтКухи тізірумлітує Мвіпетіх ЗТ Уувіссішкін сіюінву сере кішт тпіЖкзиаНіцв Фрі румлкЗ папвійавЗ ЗВ сіни кУКлиЇсуюЕ Чі имінї ЗВУКІВ Мушу) йхпукаНЕїю ЗЕМ КЗеашткОКа Кіз резака Звідси УаВЕкніввх пізикоаій дикі врі зхщінтіткхи ржшещіткірє кидтІшкіх ухтісюрУниц тупу ви полк вх ЖІ МІзВВхІчюх Хеблтвх пил іті Кеш ікдіх збі вЕнмі «хлкопяслво ЗЖА жмІшпОпАркА сетпекжуАКо ЗпкЕІхшКіІ Коспіиех впіфоалів пі ТЖЕЮ пщЕхіфтях ЗІЗ кееже узівіуате алі ЗкийіеуИх сішіих 341 вадпісжсия піку Ут» віх оиу Кіл одое дкевіїщкх сподме іже ЩІ БаціУжтваиЯ дао шпайдакЕхиу ікійівкіКка ЗІ: Феї МИ пеки ьяо Забмпиехіж півнів кий хатці КЕ ЗікреуУюеВХ Звітна ТЗІ теїїхухтрк ізінкісна міхуіхищтє: ВімжвіктЕ Зіпрприкау ххх ІЗ) жита фАя дкаднттьхащі омеаикак лляяАкаше свеа Бус туз цих 1155 шкиеідіілиМі заххктіміХ хна І "
Фіг. зе
ЗМНА КЕ: Сівба їхицінних ток Б ОК ОО ТАТ НЕО ЕКО З шхІнсІр;рувіІсУукхисзІВАБЕТЖТНІЮКЕ папузі": Упин»нІхвскнкх мнп;аіІтУб;ЕнкЕохХЕнВЕКЩВКВпНкІЬОКкКІХ т кхЕтЕвВМІІКІСПСКХВКИТХІУТЬУВОХ ах: уУЕпАКХІсІВвВаеККМУ ім Іст Ми киЕптІнвиООоВиКхЕВх мшктІас:свувеІнПпоІкнІхТХхКІИЕВВМХ хх рІвххивЕЗнуУІїг ВБІК хх: втінІхвЕІВРВІОЗУІУБІВсСЄНКУРпЕХхНнНИИАВМИТЕ мпіхікхвкххЇшВсІЗІ Кк ЕоЕКкІВУСВОІМЕ щоки ох вАВВкКЕУАХХУ скік чВКОохпІПОБгВвиЕІЗІАТТКМ ММК М Ех вк хі1йпхвкЕоьІлІлвІІВКкаКкивВУВКЕХКІВХ 3: хІТпВнУхниІХхІТКкІВІ КНЕУ кв» ІБВХхіІВкВвІввІтТІВвВехуУГУХИКИИВУВ сіІчТХХІсПпОоЕІХхІзЗчУВ ВІННІ авпсІВнАаІвАи мші:тТІіх ен УцакхоокахІсхооит тпів:БиІкКиккБІшЖРоККкихУкА:АКЕТАМУУВВОК вштатУЕ кіш нИгіхіІвУвввніІікниухх хпи;ІухІвнкаВвсніІвІВиІкхнн кА кінехнххоЗзнпіхЕВиУкІхУкинІЧХКЕХ мІіІз"«ххБ:ЕІ:паВнитЕх Іов ссиИХхЕКОоХЬХ шок кІє хх ІК КІдУІЗАІВВІВВОЛІОнКМ ствкітУтІт У кпРрсУхсЗІвИВМВВЕХВкАХ тп ЖЕ пиІуІкЕІПпПкВаІВсІХхВІМККВ тісні кІлкІхОКВкАкАМАБВЕВКЕІВ Ів »УквсІхІтвІвконвувВьЕ зовосзвВіІУІЗВВІАЗЕМУ УК ВЕВІВхщХх мввакньчз,нзанасІптІчвВУрРЕІВОКУТВВКЕ юкіІЗгВОВКІооІУТгкЕАХСсСкІККУХВсВКиВвИІХ кі єовВішихКкиМІЗанищшкКкХхХІчтхцоркхннАХ міч: МІТВвЗОЗВОНИУМЕВІХ ОО щслкхчІшснлує,вЕВАаАЗк кс за сттІтссрЕсхкпихууУкВІЗвІтУУз,хЕоКаВнУх іс туУ усу охклпсвУКкОВВЕс УТ лін: овникхсІспхІхУхкхіІовкІниИЗучциЕковКІ пкт ск ТскВЕУКІХИВКкХМОХ Мп: кивок рІЄКО,ТНнНАНнНЕВЕТчТІпЕХхМЕВХ ххх КІККтТикІкх " я
Фіг. 5055 ЩУКИ о сів фМокцідтме Збісюйкі ім хр неоюві С б ЖК ТТ кг оБАЖАХКВ. І СО ТВО я ВК щеіджніфїй зрідедйаххі хатки К Кетковрийх спввитухуїи ЗзхідлавЕАхц ЗР датудаляія питзовіктіх сії кіїж ік Жзіацехії декуВіртТЮх Зеіфмукуци вті платтів к твиваичніїс ЗКівівуццу колу бестудалих Здоровий ує 181 ледежумвая шжоюуємах іМборіїех усу ещихі хазкаотіймАа ХХ ЮА КИАХ Тк: заїзрукішй віззійштЕці зіхиііїмр ЗБЕ ІпІЗ УюРІДУЮЕИИ ШЕ ВАВХ БІ гтзіюіхцей фіумікакі феклстіомІ змщійлиуа Зенцінюдех Кеваідутух ЖЖІ Меуукісиюе Ху лілій кії Кеуражцкве здУкііний феімжхпіуй 321 делі жітех жВоупавусТ ВуЖУМІиХ ЖтБІЮИУпУЄ ЗАШИЇЕеАЛИЯ ВаджЕюти ЗІ Тммуєентіє шшУЗІКсИМХЕ БУ Мр ви пезЕтІВ мусуаутали Мушка п. хуїййииМфя ріку хі «іхміїсУжи ШОІиШЕЕжІМ піцщівЕтмй міфЕВАПУММИХ ЯпА литих міцвікідих ВелаАжцю хцМішМкіш іхющіавхА Жаівлаштіх кі скат уТії сюхмотувтх Ам лех ВіозцЕпіМЬУ АЖІККІВНАх кашПІлВпаКІ ду паятуєтшик МАН ют) схилі їй жвавим: ІУрКеІялиш шШУТВЗАВАКЕ ТКУ сеЕушкицймі закеавізАаки есть ШЕ ут иі Я сошскасААВ шЕКеОУКТА У ФУ гіф ка ско маині) пуху! Зі: хвої уі бюреміутето киев уки ЖЕ везітахітв стали) Вцедхуцкую пуер Комо вю хек іх МИХ кучутіжуюУ ПеЛКВМХХІТ зінаклктвах КВудіпіуюх зХінітелу рішіжауМекі 1ЖХІ1 нкжієлююні БлюкшВавих МісцЕуєМІї пунпхувуєаух уегушивіют відпливу кх ішжл акніЖИатніі доЖЕМіЇвкп «ЗМмууючхой юхіїшеіции Фатайі фо ккічіетаки ішла омхагхідмими і1їЖжрпиуеї їх тої зіхіі хпулуєюміс брухт МіхіІ вка здо т
Фіг. ЗН
МЕНІ Мі: пПХуолижАМОМШ Зофаімму; ки Ж ОЇ ПЗУ. іБЖО Ж ЩО: ЩІ х вщУмуи Вій Зуіхуймьі ХижріІжИисИ ЩдхЕщеВЕціх ЗтрУгжучех ломи жі ау МІАХ смс ХОоКІіХшККМ ОМВО Зі КОпИЦ ЕЕ АЖі вежах єх зуаміоктя кума івах суху Вжуви дани ЗЕ хуле АЖ: пре ах ЗЕЗІХЖІу: уМІЖМеМіМ сБугіХомМО Зістжаннми ЗА ЖжщАХ хв ОхіпЕуучХ іДКЕЦИІашК жтекуюинк Фк хАв пек Там цтє ЖЕ Амітусеку зсІЕжЕжкути Фу хКиЕ реХМККВуУК ТЕМУ Жир ЗЕ хмудкежіх хіБшдихаті ск иу: Хфсхомттеи УМІБУКІЛТУЄ ББІБУВКМ УЮ ЖД МІ І КЕ МІКЦОМІЦЮВЕ КУЗОВУ ВІКУ ІМ УСІМ ШУ еМХІ Вид ложок ках уйи Іа АЕІ ВЖИ М КУКИ МІШКІ ЖЕОУХІ КТ Зах сажа мукаВ сша вшніия 1ЗІМТОЕКУ ЗаеККУМЩА ЖІ ЕМОВКИХ ДОМ; КІЖюМК НМА ОжемійхТка Лема? МУ уІММЕх ЕМЕЛИЩИХУХ УХИШКАДІКИ везжитІвцх хВІ КіїЖкАкаха сиріховхоі МУ ШЩІЇВІ ПІЦИ пооціьхої ЗИМ ТЖЕ ХІД АУКАХ пи Ки ХОЕМІЖЖЕІ ХсхлоапекиЕ Мох цджтх піша МИц ІМ мадлулихкх запа южажжЕ ТФІЖІКХУщ дух жу ожтУЮи БІДУ УЖЕ піку пІКтОнКХХ пут хіх ТезксІкУє дЕВкЛЕшеКе пе у» ШЕ пифАхЕтоЮЕ зддМкнію) аміжджухми ЗажілеТща УА ЖЕК «зи ЖЖА літня ХО УХАЖ ЕТ ЕКОВ ЖБАМІКЛУХО ЗАКО РЗАЯХ ЖІ УВТХ ХШЖА ЖшМоїМУуИЦОк АМмІМХІМОО ХУ КОМОММ МОЄйКМуЇїКІВ Слім смжекикх 3пжі хурми хуХх іхфйиМІЗШИЕ ММ хаК злаллЕйже лртішжни тЕЖОХІ КВУ паж: пеххмсЗАєОй срхухуїних хаї
Фіг. 5
ІГ. . Зринивьзикне ВМ вка Тем МТВНА вка МТУ НАТО ї 5 Б. а СЕС о. СКК ск «МО ОО КК ке БО ЖК ет. й Я ПИКННННИ НИ оддсеньной . НИКИ «БОКЕ по у Я і. ще м 3 ж 2 8 Ж; У ЩЕ В З
Фіг. БА
ЧІ. ; рено го НЕОН ША ОХ ЕМКОН У колії Хмккхххмююикко Думки зукамкюм ! сп кекохо Мети Кн ржкювних. си Ж самі чех аж ших ях. ФІЛЕ НВК Не ян й х ситі й БМ ЖЕЕНКК М й Ж Троя рака г БУ АЛІ ЗКУІУМНЯ з вкчк ка км а соку ще Є рек х Я жа дер ково, Т дерІНиВеК: З Люпюевх ж вони Ва, Ж омоаносохх же к. се мкнаюн . Зв Х ВОВК КвеКя Ва МКК КК, | ВО З а 5 555 г її 5 і. У Зав видна, зання ПЕН ЖНХ
В .
Фіг. 68
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201662336958P | 2016-05-16 | 2016-05-16 | |
| PCT/US2017/032985 WO2017201105A1 (en) | 2016-05-16 | 2017-05-16 | Method for purification and activation of botulinum neurotoxin |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA127310C2 true UA127310C2 (uk) | 2023-07-19 |
Family
ID=59014734
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UAA201812420A UA127310C2 (uk) | 2016-05-16 | 2017-05-16 | Спосіб очищення і активації ботулінічного нейротоксину |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11242515B2 (uk) |
| EP (1) | EP3458472B1 (uk) |
| JP (1) | JP7060522B2 (uk) |
| KR (1) | KR102567311B1 (uk) |
| CN (1) | CN109641941B (uk) |
| AU (1) | AU2017268285B2 (uk) |
| BR (1) | BR112018073591A2 (uk) |
| CA (1) | CA3024331A1 (uk) |
| EA (1) | EA201892643A1 (uk) |
| ES (1) | ES2904269T3 (uk) |
| MX (1) | MX2018014066A (uk) |
| SA (1) | SA518400443B1 (uk) |
| SG (1) | SG11201809903WA (uk) |
| UA (1) | UA127310C2 (uk) |
| WO (1) | WO2017201105A1 (uk) |
| ZA (1) | ZA201807626B (uk) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BR112015003591B1 (pt) | 2012-11-21 | 2022-02-01 | Ipsen Bioinnovation Limited | Usos de lys-c e métodos para fabricação de um polipeptídeo proteoliticamente processado |
| CN109641941B (zh) | 2016-05-16 | 2023-06-16 | 哈佛大学校长及研究员协会 | 用于纯化和激活肉毒杆菌神经毒素的方法 |
| US11129906B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-09-28 | David Gordon Bermudes | Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria |
| SE542539C2 (en) * | 2018-02-26 | 2020-06-02 | Toxotech Ab | Chimeric botulinum neurotoxin heavy chain binding domain |
| WO2020129027A1 (en) * | 2018-12-21 | 2020-06-25 | King Abdullah University Of Science And Technology | Sliding clamp-based affinity purification systems, methods of making and use thereof |
| CN110208411B (zh) * | 2019-06-10 | 2021-12-24 | 浙江龙传生物医药科技有限公司 | 用于药物代谢检测的羧酸酯酶抑制剂制剂 |
| CN114958887A (zh) * | 2021-02-26 | 2022-08-30 | 重庆誉颜制药有限公司 | 一种经修饰的毒素多肽的制备方法 |
Family Cites Families (26)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4703004A (en) | 1984-01-24 | 1987-10-27 | Immunex Corporation | Synthesis of protein with an identification peptide |
| US5011912A (en) | 1986-12-19 | 1991-04-30 | Immunex Corporation | Hybridoma and monoclonal antibody for use in an immunoaffinity purification system |
| US4851341A (en) | 1986-12-19 | 1989-07-25 | Immunex Corporation | Immunoaffinity purification system |
| CA1340522C (en) | 1987-03-10 | 1999-05-04 | Heinz Dobeli | Fusion proteins containing neighbouring histidines for improved purification |
| US5654176A (en) | 1987-05-28 | 1997-08-05 | Amrad Corporation Limited | Fusion proteins containing glutathione-s-transferase |
| US5599903A (en) | 1992-04-03 | 1997-02-04 | Terrapin Technologies, Inc. | Glutathione analogs and paralog panels comprising glutathione mimics |
| GB9411138D0 (en) | 1994-06-03 | 1994-07-27 | Microbiological Res Authority | Toxin assay |
| AUPN015794A0 (en) | 1994-12-20 | 1995-01-19 | Csl Limited | Variants of human papilloma virus antigens |
| KR20030060150A (ko) * | 2002-01-07 | 2003-07-16 | (주)메디톡스 | 클로스트리디움 보툴리눔 ａ형 독소를 정제하는 방법 |
| EP1531859A4 (en) * | 2002-05-31 | 2005-12-07 | Univ Jefferson | COMPOSITIONS AND METHODS FOR TRANSEPITHELIAL MOLECULAR TRANSPORT |
| US7148041B2 (en) | 2003-09-25 | 2006-12-12 | Allergan, Inc. | Animal product free media and processes for obtaining a botulinum toxin |
| EP2502930B1 (en) * | 2003-12-19 | 2016-06-29 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Method and compositions for detecting botulinum neurotoxin |
| EP1871789B1 (en) * | 2005-03-15 | 2013-11-06 | Allergan, Inc. | Modified clostridial toxins with altered targeting capabilities for clostridial toxin target cells |
| US7985554B2 (en) * | 2005-10-14 | 2011-07-26 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Botulinum neurotoxin A receptor and the use thereof |
| JP2009132686A (ja) | 2007-10-26 | 2009-06-18 | Okayama Univ | ボツリヌス毒素由来のポリペプチド及びボツリヌス毒素の検出方法 |
| JP2010037253A (ja) | 2008-08-04 | 2010-02-18 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | ボツリヌス毒素に対するモノクローナル抗体および該抗体を用いたボツリヌス神経毒素精製方法 |
| US8771707B2 (en) * | 2008-09-30 | 2014-07-08 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Botulinum neurotoxin E receptors and uses thereof |
| KR20120107988A (ko) * | 2009-12-16 | 2012-10-04 | 알러간, 인코포레이티드 | 통합된 프로테아제 절단 부위 결합 도메인을 포함하는 변형 클로스트리듐 독소 |
| EP3162894B1 (en) | 2011-05-19 | 2024-01-10 | Ipsen Bioinnovation Limited | Methods for the manufacture of proteolytically processed polypeptides |
| CN108178801B (zh) * | 2012-05-30 | 2022-05-03 | 哈佛大学校长及研究员协会 | 工程化的肉毒神经毒素 |
| KR101339349B1 (ko) * | 2013-08-02 | 2013-12-09 | 주식회사 대웅 | 보툴리눔 독소의 제조방법 |
| CN109641941B (zh) | 2016-05-16 | 2023-06-16 | 哈佛大学校长及研究员协会 | 用于纯化和激活肉毒杆菌神经毒素的方法 |
| MX2018015254A (es) * | 2016-06-08 | 2019-08-16 | Childrens Medical Center | Neurotoxinas botulinicas modificadas. |
| UA125965C2 (uk) * | 2016-07-08 | 2022-07-20 | Чілдренс Медікал Сентр Корпорейшн | Новий ботулінічний нейротоксин та його похідні |
| KR102463881B1 (ko) * | 2016-10-04 | 2022-11-07 | (주)메디톡스 | 보툴리눔 독소 함유 용액으로부터 보툴리눔 독소를 분리하는 방법 |
| KR102556363B1 (ko) * | 2016-10-20 | 2023-07-18 | 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 | 보툴리눔 신경독소의 활성을 측정하기 위한 시험관내 및 세포 기반 검정 |
-
2017
- 2017-05-16 CN CN201780030496.9A patent/CN109641941B/zh active Active
- 2017-05-16 US US16/302,088 patent/US11242515B2/en active Active
- 2017-05-16 BR BR112018073591A patent/BR112018073591A2/pt unknown
- 2017-05-16 WO PCT/US2017/032985 patent/WO2017201105A1/en unknown
- 2017-05-16 SG SG11201809903WA patent/SG11201809903WA/en unknown
- 2017-05-16 CA CA3024331A patent/CA3024331A1/en active Pending
- 2017-05-16 ES ES17728308T patent/ES2904269T3/es active Active
- 2017-05-16 AU AU2017268285A patent/AU2017268285B2/en active Active
- 2017-05-16 MX MX2018014066A patent/MX2018014066A/es unknown
- 2017-05-16 UA UAA201812420A patent/UA127310C2/uk unknown
- 2017-05-16 EA EA201892643A patent/EA201892643A1/ru unknown
- 2017-05-16 EP EP17728308.2A patent/EP3458472B1/en active Active
- 2017-05-16 JP JP2018560214A patent/JP7060522B2/ja active Active
- 2017-05-16 KR KR1020187033716A patent/KR102567311B1/ko active IP Right Grant
-
2018
- 2018-11-13 ZA ZA2018/07626A patent/ZA201807626B/en unknown
- 2018-11-15 SA SA518400443A patent/SA518400443B1/ar unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR102567311B1 (ko) | 2023-08-16 |
| BR112018073591A2 (pt) | 2019-03-19 |
| MX2018014066A (es) | 2019-04-04 |
| CA3024331A1 (en) | 2017-11-23 |
| AU2017268285B2 (en) | 2021-07-29 |
| US11242515B2 (en) | 2022-02-08 |
| US20190153418A1 (en) | 2019-05-23 |
| KR20190015240A (ko) | 2019-02-13 |
| EP3458472A1 (en) | 2019-03-27 |
| ZA201807626B (en) | 2023-10-25 |
| EA201892643A1 (ru) | 2019-06-28 |
| WO2017201105A1 (en) | 2017-11-23 |
| CN109641941B (zh) | 2023-06-16 |
| CN109641941A (zh) | 2019-04-16 |
| AU2017268285A1 (en) | 2018-11-29 |
| SG11201809903WA (en) | 2018-12-28 |
| ES2904269T3 (es) | 2022-04-04 |
| JP7060522B2 (ja) | 2022-04-26 |
| EP3458472B1 (en) | 2021-10-20 |
| JP2019518447A (ja) | 2019-07-04 |
| SA518400443B1 (ar) | 2022-06-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| UA127310C2 (uk) | Спосіб очищення і активації ботулінічного нейротоксину | |
| Proft | Sortase-mediated protein ligation: an emerging biotechnology tool for protein modification and immobilisation | |
| US20200055900A1 (en) | Split inteins with exceptional splicing activity | |
| E Garcia et al. | Biological activities of natural and engineered cyclotides, a novel molecular scaffold for peptide-based therapeutics | |
| CN105477641A (zh) | 生物合成的脯氨酸/丙氨酸无规卷曲多肽及其用途 | |
| US11236132B2 (en) | Nepovirus coat protein fusion polypeptides and their use | |
| US11345745B2 (en) | Peptide-hinge-free flexible antibody-like molecule | |
| CA2392202A1 (en) | Constructs for delivery of therapeutic agents to neuronal cells | |
| CN110023328A (zh) | 用于蛋白质表达和递送的组合物和方法 | |
| EP3487870A1 (en) | Monomeric streptavidin mutants, methods of using the same and processes of manufacturing proteins | |
| CN110117312A (zh) | 脂质结合蛋白-抗原捕获模块复合物、及其制备方法和应用 | |
| EP3031820A1 (en) | JC Polyomavirus VLP (virus-like particle) with a targeting peptide | |
| LU102572B1 (en) | An artificial protein-cage decorated with particular molecules on the exterior | |
| Zhao et al. | Heterologous expression of the novel dimeric antimicrobial peptide LIG in Pichia pastoris | |
| WO2024027764A2 (en) | Chimeric antigen receptor systems, methods of preparation, and uses thereof | |
| Choppa | In Vivo Non-Ribosomal Protein Synthesis in Mammalian Cells | |
| JP2004081199A (ja) | 組換え抗体の製造方法 | |
| WO2024137866A2 (en) | Methods of treating stroke or other blood clotting disorders using cofilin or derivatives | |
| Azam | Engineering Advanced Materials using Type III Secretion in Salmonella enterica | |
| EA041060B1 (ru) | Способ очистки и активации ботулинического нейротоксина | |
| CN116440281A (zh) | 一种肉毒毒素蛋白组合物 | |
| EP3347459A1 (en) | Nepovirus coat protein fusion polypeptides and their use | |
| Hollingsworth | The synthesis of a maltose responsive switch | |
| NZ711762A (en) | Method of producing an immunoligand/payload conjugate |