DE69104380T2

DE69104380T2 - Vom genom des papillomavirus-hpv-39 abgeleitete dns-sequenzen, deren anwendung in der in vitro-diagnose und zur herstellung einer immunogenenzusammensetzung.

Info

Publication number: DE69104380T2
Application number: DE69104380T
Authority: DE
Inventors: Gerard F-92330 Sceaux Orth; Rolf E. D-65189 Wiesbaden Streeck; Christoph D-6200 Wiesbaden Volpers
Original assignee: Institut Pasteur de Lille; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1990-12-20
Filing date: 1991-12-20
Publication date: 1995-02-09
Anticipated expiration: 2011-12-21
Also published as: FR2670797A1; CA2098819C; WO1992011369A1; CA2375673C; CA2375673A1; EP0563255B1; DK0563255T3; CA2098819A1; ATE112316T1; US5656423A; FR2670797B1; JP3859696B2; DE69104380D1; ES2062887T3; US5665535A; JPH06504672A; EP0563255A1

Description

Die Erfindung betrifft vom Genom des Papillomavirus HPV39 abgeleitete DNS-Sequenzen, einschließlich der Sequenz, die ihrem gesamten Genom entspricht sowie rekombinante DNS, insbesondere Vektoren, die diese DNS-Sequenzen enthalten. Die Erfindung betrifft gleichermaßen Zellkulturen, die mit den genannten rekombinanten DNS unter Bedingungen transformiert sind, die ihnen erlauben, die entsprechenden vom Genom von HPV39 abgeleiteten Sequenzen in Form von entsprechenden Proteinen zu exprimieren. Die Erfindung betrifft schließlich die Proteine, in gereinigter Form, wie sie aus den Zellkulturen erhalten wurden. Schließlich bezieht sich die Erfindung auf die Herstellung von immunogenen Zusammensetzungen, die diese Proteine oder Proteinfragmente enthalten.
Die folgende Beschreibung nimmt Bezug zu den begleitenden Figuren in denen:
Fig. 1: eine Nukleotidsequenz des zur mRNS analogen DNS- Stranges von HPV39 darstellt. Position 1 auf dem ringförmigen Genom wurde durch Vergleich mit HPV16 und 18 bestimmt.
Fig. 2: die Verteilung der Startcodons (Striche oben) und der Stopcodons (Striche unten) in den drei Ableserastern der beiden DNS-Stränge von HPV39 darstellt. (a) zur mRNS analoger Strang (b) komplementärer Strang. Die ORF in (a) wurden durch Vergleich mit anderen Typen von HPV identifiziert. Die Numerierung entspricht der von Figur 1.
Fig. 3: Hauptkennzeichen der nichtcodierenden Region darstellt. Die Baugruppen der folgenden Sequenzen der NCR sind vom Nukleotid 7158 bis zum Nukleotid 106 angegeben: stellt das Palindrom von 12 bp dar, die für den Papillomavirus spezifisch sind (die zweite und dritte Baugruppe sind degeneriert), stellt den Ort der Polyadenylierung dar, stellt die TATA-Box dar, stellt das angenommene Promotorelement dar, stellt das Glucocorticoid-Response-Element dar, stellt die Verstärkersequenz des Kerns dar, stellt die wahrscheinliche Bindungsstelle des Kernfaktors I dar, stellt die angenommene Bindungsstelle des Aktivatorproteins 1 dar, stellt die Bindungsstelle des mit dem Verstärker des Papillomavirus assoziierten Faktors dar.
Fig. 4: einen Vergleich der wahrscheinlichen Glucocorticoid-Response-Elemente (GRE) von HPV39 verglichen mit den GRE von HPV16 und 18 und mit einer Consensus-Sequenz GRE/PRE darstellt. Die mit der Consensus-Sequenz identischen Nukleotide sind unterstrichen.
Die Erfindung beruht auf der Aufklärung von speziellen Sequenzen, die in HPV39 vorhanden sind, Sequenzen, die einzigartig sind und die besonders feine Nachweise von Papillomaviren vom Typ HPV39 erlauben. Diese Sequenzen oder Fragmente dieser Sequenzen sind zur Ausbildung von besonders empfindlichen Hybridisierungssonden verwendbar, insbesondere von Ansätzen, die Analysen durch das PCR-Verfahren erlauben. Bevor die Beschreibung dieser Sequenzen oder Sequenzfragmente weiter vertieft wird, wird ein kurzer Rückblick auf den Stand der Technik und danach eine ausführliche Beschreibung des Genoins von HPV39 gegeben.
Unter den 60 oder mehr verschiedenen Typen von Papillomaviren beim Menschen stehen einige in Verbindung mit Neoplasien und Karzinomen des Genitalapparates (1). Die DNS von HPV16 und HPV18 wurden in 50 % und 20 % der Biopsien von Krebsen der Cervix, der Vulva und des Penis nachgewiesen (2,3). Die HPV31, 33, 35, 39 und 45 wurden in solchen Erkrankungen weniger häufig gefunden (1,4). Unter Verwendung der DNS von HPV6 als Hybridisierungssonde unter schwach stringenten Bedingungen wurde HPV39 zuerst mit Biopsieproben von Papeln des Bowen-Syndroms am Penis geklont, die virale DNS in episomaler Form enthielten. Dagegen wurde virale DNS im Innern des Zellgenoms von invasiven Karzinomen integriert gefunden (5). Bei einer jüngeren Untersuchung, die an 365 mit HPV infizierten Patienten durchgeführt wurde, wurde DNS von HPV39 in 3,9 % der Gewebeproben nachgewiesen.
Die biologische Studie von HPV wurde durch das Fehlen eines Gewebekultursystems für die Virusvermehrung in vitro eingeschränkt. Die Analyse der Sequenz einer gewissen Anzahl von Genomen von Papillomaviren (2,3,6-14) bildete die Grundlage für das Verständnis ihrer genetischen Organisation und ihrer Regulation zur Expression einzelner Gene und der Erzeugung von Antiseren und zur Bestimmung der phylogenetischen Zusammenhänge zwischen den zahlreichen Typen von HPV.
Es wurde die vollständige Nukleotidsequenz des Genoms von HPV39 bestimmt. Die aus dem ursprünglichen Klon (5) isolierte DNS von HPV39 wurde unter Verwendung der einen EcoRI-Stelle und der beiden BamHI-Stellen in pUC18 in drei Fragmente von ähnlicher Größe weiterkloniert. Die für eine Sequenzierung eines DNS-Stranges geeigneten Klone wurden unter Bildung einer Reihe von Nachweisen mit Hilfe der Exonuklease III nach den Verfahren von Henikoff (15) erzeugt. Der zweite Strang wurde unter Verwendung von synthetischen komplementären Oligonukleotiden des ersten Stranges als Anfangsstücke sequenziert. Die Sequenzierung des doppelsträngigen Plasmids wurde unter Verwendung des Verfahrens von Sanger et al. (16,17) zur Terminierung von Dideoxyketten durchgeführt.
Die DNS von HPV39 umfaßt 7833 bp (Fig. 1) und weist einen Gehalt von G/C von 40 % auf. Die von der Sequenz abgeleitete Restriktionskarte wurde durch Abbau der DNS bestätigt. Sie stimmt mit der von Beaudenon et al. (5) veröffentlichten Restriktionskarte überein init der Ausnahme einer zusätzlichen HindII-Stelle, einer zusätzlichen PvuII-Stelle und vier weiteren AvaII-Stellen. Eine AavaII-Stelle (in der Position 3592) ist gegen Spaltung nach Klonierung in E. coli resistent aufgrund einer Überlappung mit der Erkennungssequenz der Methylase dcm von E. coli.
HPV39 weist eine Anordnung von offenen Leserastern (Open Reading Frames: ORF) auf, die bei allen bis jetzt sequenzierten HPV konserviert sind (Fig. 2a, Tabelle 1). Die ORF, die für die als Prä-Protein angenommenen Proteine und für die Bestandteile des Kapsids codieren, sind auf demselben DNS- Strang lokalisiert; sie sind durch eine nichtcodierende Region (Non coding region: NCR) von 782 Basenpaaren (base pairs: bp) getrennt. Die von HPV39 und anderen genitalen Papillomaviren geteilten Kennzeichen des Genoms sind dargestellt durch Überlappungen zwischen den ORF E1 und E2, L2 und L1, den Einschluß von E4 im Inneren von E2, die Lokalisation von E7 unmittelbar oberhalb von E1 (3) und das Fehlen des Startcodons ATG in E4, wie es zuvor für HPV16, 31 und 33 beschrieben wurde (2,4,12).
Die komplementären DNS-Stränge aller bis jetzt sequenzierten Genome enthielten keine ORF, die eine Größe von 0,6 bis 0,8 kb überschritten. Die funktionelle Bedeutung dieser ORF wurde durch das Fehlen jeglicher nachweisbarer Regulationssequenz dementiert. Außerdem konnte nicht bewiesen werden, daß sie in den von HPV transformierten oder von BPV befallenen Zellen transkribiert wurden (7,9,18,19). Jetzt wurde ein großer CRF mit 1,3 kb auf diesem DNS-Strang von HPV39 (Nukl. 2050-776) gefunden, der ein ATG-Codon und eine potentielle Akzeptorstelle für das Spleißen (splicing) (GCTGCTACAGG, Nukl. 1871- 1861) nahe dem 5'-Ende aufweist (Fig. 2b). Weiter oberhalb im selben DNS-Strang liegt vor einem kleinen ORF (Nukl. 4204-3875) eine TATA-Sequenz in einer Distanz von 23 bp (Nukl. 4227) und eine Bindungsstelle für den Kernfaktor I (Nukl. 4271) (20,21). Am 3'-Ende des ORF mit 1,3 kb kann ein Polyadenylierungssignal AATAAA (Nukl. 411) zur Reifung eines primären Transkriptionsprodukts dienen (22). Weitere Versuche sollen zeigen, ob dieser ORF in vivo transkribiert wird.
Die nichtcodierende Region HPV39 ist durch drei vollständige Versionen und zwei degenerierte Versionen des für Papillomaviren spezifischen Palindroms ACCGNNNNCGGT in drei Segmente unterteilt (Nukl. 43, 59, 7456, 7625, 7798), wobei eine Verstärkergruppe (Enhancer) E2-abhängig ist (23,24). Diese Segmente entsprechen Sektionen von ähnlicher Größe in den Genomen von HPV16, 18 und 33 (3). Es gibt zwei TATA-"Box"- Sequenzen (TATA box sequences) in der nichtcodierenden Region, von denen eine oberhalb des ORF E6 lokalisiert ist. Diese letztere bildet wahrscheinlich einen Teil des Promotors E6 und anderen Prä-Genen in Verbindung mit einem konservierten Promotor AAAGGGAGTA, der oberhalb der zu zweit repetierten Sequenzen des Palindroms von 12 bp angeordnet ist (25- 27). Die angenommene Polyadenylierungsstelle für die viralen Post-Transkriptionsprodukte ist an einem Ort lokalisiert, der ungefähr 100 Basenpaare unterhalb des Stopcodons L1 liegt. Ein anderes AATAAA Element, das unterhalb des ORF E5 liegt, kann als Polyadenylierungssignal für die Prä-Transkriptions produkte dienen (18).
Die zuvor sequenzierten langen Kontrollregionen der genitalen HPV enthielten Bindungsstellen für zahlreiche Transkriptionsfaktoren und es wurde gezeigt, daß sie als spezifische Verstärker vom zellulären Typ für HPV6, 11, 16 und 18 funktionieren (28-30). Die Regulationsregion von HPV39 enthält vier mögliche Bindungsstellen für den Kernfaktor I (NFI) (21,31), zwei für das Aktivatorprotein 1 (AP1) (21,32), eine Bindungsgruppe für den unlängst beschriebenen "mit dem Verstärker des Papillomavirus assoziierten Faktor" (papillomavirus enhancer associated factor: PVF) (31) und eine "Kernverstärkersequenz", die in SV40 und in anderen Viren konserviert ist (33) (Fig. 3). Ein potentielles Glucocorticoid-Response-Element (glucoprotein response element: GRE) gleicht denen, die sich in den NCR von verwandten HPV-Typen finden (27). Ein zusätzliches im ORF (Nukl. 6367) gefundenes konserviertes GRE- Element besitzt in anderen Typen von HPV kein Äquivalent (Fig. 4). Es steht in Überlappung mit einer Bindungsstelle AP2, die man gleichermaßen in den Verstärkern von SV40 und BPV wiederfindet (34). Dies weist auf das Vorhandensein einer Regulationsfunktion für die unterhalb von NCR gelegene Region hin. Eine kooperative Wirkung von NFI und AP1 sowie von NP1 mit dem Glucocorticoid-Rezeptor wurde für den Verstärker von HPV16 beschrieben (30). Die Wechselwirkung von zahlreichen Faktoren mit den potentiellen Bindungsstellen in der NCR und in LI von HPV39 muß noch aufgeklärt werden. Die Donator- (Nukl. 233) und Akzeptorstellen (Nukl. 408) für das Spleißen sind unterhalb von NCR lokalisiert. Es wurde gezeigt, daß sie für die Erzeugung von mRNS E7 in den onkogenen Typen von HPV wichtig sind (4,35).
Vergleiche der Sequenzen von einzelnen ORF zeigen, daß HPV39 die höchste Homologie mit HPV18 aufweist. Er zeigt entferntere Übereinstimmung mit anderen genitalen Papillomaviren und noch weniger mit einem Vertreter des Types der Haut-HPV, HPV8 (Tabelle 2). HPV39 gehört auch zu einer Untergruppe von genitalen HPV, die ein beträchtliches onkogenes Potential aufweisen, umfassend HPV18, HPV45(1) und einen neuen Typ, der eine starke Homologie mit HPV39 aufweist, der jüngst aus einer Zellinie des Karzinoms ME180 der Gruppe HPV16/31/33 geklont wurde.
Die ORF E6 und E7 werden gewöhnlich in den Zellinien des Krebses der Cervix und des Karzinoms transkribiert (36) und die Produkte ihrer Gene sind mit der Immortalisierung und der Transformation von primären Epithelzellen und Fibroblasten verbunden (37). Vier Cys-X-X-Cys-Gruppen im Protein E6 in allen Papillomavirussequenzen, die an der Bindung von DNS durch Bildung von Strukturen vom Typ "Zinkfinger" ("zinc finger") beteiligt sein können (38), sind gleichermaßen in HPV39 vorhanden. Dagegen kann nur das erste der beiden konservierten Elemente Cys-X-X-Cys im Protein E7 wiedergefunden werden. Beim zweiten Element ist ein Cystein durch ein Tyrosin substituiert. Die Mutationsanalyse des ORF E7 von HPV16 hat ermöglicht zu zeigen, daß ein Zinkfinger ("zinc finger") für die Transformationsfähigkeit ausreicht (39), das Protein E7 von HPV39 bleibt wahrscheinlich funktionell. Außerdem enthält das Protein E7 von HPV39 eine "Zellteilungsprotein"- Baugruppe (cd), die zahlreichen Genprodukten gemeinsam ist, die an der Transformation beteiligt sind, wie das Antigen T von SV40, E1A des Adenovirus, das Protein myc und die Proteine E7 der bösartigen genitalen HPV, aber nicht von HPV6 oder HPV11 (4):
asp/asn-x-x-cys-x-ser/thr/glu-x-(1-8)-asp/glu-asp/glu/ser/thr-asp/glu (die aminierten Säuren von E7 von HPV39 sind unterstrichen). Die cd-Baugruppen des großen Antigenes T von SV40 und das Protein des Adenovirus scheinen für die Bindung des antionkogenen Produktes des Retinoblastoms verantwortlich zu sein (40). Die Transformationsaktivität von E7 kann gleichermaßen einer Protein-Protein-Wechselwirkung über die cd- Sequenz zugeschrieben werden.
Die Erfindung betrifft insbesondere die Sequenz, die dem großen ORF von 1,3 kb entspricht, die sich vom Nukleotid 2050 bis Nukleotid 776 der Figur 1 erstreckt oder jedes Fragment, das in dieser Sequenz enthalten ist, oder das davon abgeleitet ist, wobei dieses Fragment mindestens 15 Nukleotide umfaßt.
Die Erfindung betrifft gleichermaßen insbesondere auch die Sequenz, die dem kleinen ORF entspricht, daß sich vom Nukleotid 4204 bis Nukleotid 3875 erstreckt ja sogar von Nukleotid 4227 bis Nukleotid 3875 oder Sequenzen, die von diesen letzteren abstammen oder abgeleitet sind.
Ebenso betrifft die Erfindung noch Sequenzen von mindestens 15 Nukleotiden, die von der gesamten Sequenz von HPV39 abstammen oder abgeleitet sind und mindestens 15 Nukleotide umfassen und das konservierte Element GRE enthalten, das die Sequenz GACA im konservierten Element GRE auf Höhe des Nukleotids 6367 aufweist und insbesondere mit Bezug auf Figur 4. Schließlich betrifft die Erfindung besonders die nachfolgend identifizierten 3 Nukleotidsequenzen:
Consensus: GGTACANNNTGTTCT
HPV39 (NCR): TCTACATTTTATACT
HPV39 (L1): GGGACAGTATGTTCT
Sie betrifft ferner alle Fragmente, deren Größe die der zuvor definierten Fragmente nicht übersteigt, wobei die ersten dadurch gekennzeichnet sind, daß sie unter strikten Bedingungen (Tm -20 ºC) mit den zweiten hybridisieren, insbesondere wenn man unter den folgenden Bedingungen arbeitet:
Die Hybridisierung wird bei 42 ºC in einer Lösung ausgeführt, die enthält: 50 mM Natriumphosphatpuffer pH = 6,5; 5XSSC (1xxSSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Na-Citrat); 50 % Formamid; 200 ug/ml RNS aus Transfer von Hefe; 0,02 % Denhart-Lösung.
Ferner sind die Fragmente, die zu denselben Typen gehören, Teil der Erfindung, insbesondere dadurch, daß sie Prozentanteile bei der Kreuzhybridisierung mit den oben spezifisch definierten Fragmenten von 50 % aufweisen.
Die Verwendung der einen oder anderen der oben genannten Sequenzen oder Nukleinsäuren, die sie enthalten, sind insbesondere zur Herstellung einer Hybridisierungssonde geeignet, die den Nachweis von mit HPV39 verwandter Papillomavirus-DNS in einer biologischen Probe erlaubt.
Allgemein betrifft die Erfindung gleichermaßen jede rekombinante DNS, die die genannte HPV-DNS enthält oder Fragmente dieser HPV-DNS, insbesondere mit diesen rekombinanten DNS gebildete Hybridisierungssonden, die speziell für den Nachweis einer Infektion mit HPV39 oder einer Variante oder einem Untertyp dieses Papillomavirus angepaßt sind. Diese Sonden können entweder selbst markiert sein oder auf Höhe bestimmter Nukleotide, insbesondere in Hinblick auf ihre Kopplung, direkt oder indirekt mit einem bestimmten Marker modifiziert sein. Es versteht sich von selbst, daß in diesen Sonden die der DNS des Papillomavirus entsprechenden Nukleotidsequenz fremden Teile, und die normalerweise-von einem Klonierungsvektor herstammen, derart sind, daß sie unter den stringenten Bedingungen mit den anderen Nukleinsäuren nicht hybridisieren, die eventuell in der auf ihren eventuellen Gehalt an DNS des entsprechenden Papillomavirus oder einer seiner Varianten geprüften Probe enthalten sind.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Diagnose in vitro an einer biologischen Probe, die normalerweise von einem menschlichen Patienten stammt und auf eine Infektion durch einen Papillomavirus zu prüfen ist, die eine genitale Neoplasie herbeiführen kann oder herbeigeführt hat, insbesondere einen Krebs der Cervix, der Vulva oder des Penis, ist gekennzeichnet durch in Kontakt bringen einer Sonde, wie sie oben definiert ist, mit den Nukleinsäuren dieser Probe, die gegebenenfalls zuvor für die Sonde zugänglich gemacht wurden, bevorzugt unter bestimmten Hybridisierungsbedingungen und durch Nachweis des zwischen der gesuchten Virus-DNS, die eventuell in der Probe vorhanden ist, und der genannten Sonde gebildeten Hybrids.
Jede der erfindungsgemäßen Sonden oder die Mischungen, die die genannte Sonde enthalten, können insbesondere in Folge verwendet werden, wobei es sich natürlich versteht, daß die beschriebenen diagnostischen Versuche nicht als Beschänkung der Anwendungsbedingungen, unter denen diese Sonden oder Mischungen von Sonden verwendet werden können, zu betrachten sind.
In dem angegebenen Beispiel handelt es sich beispielsweise um die Identifizierung eines HPV in einer Biopsie, in durch Abschaben von Läsionen erhaltenen Zellen oder in Biopsieschnitten, die durch Carnoy-Gemisch (Ethanol, Chloroform, Essigsäure 6 : 3 :1) fixiert und in Paraffin eingeschlossen sind. Die Prüfung erfordert die vorherige Extraktion der DNS der Proben nach Verfahren, deren Prinzip bekannt ist, und beeinhaltet die Analyse dieser DNS durch molekulare Hybridisierungsversuche, die unter strikten oder weniger strikten Bedingungen mit Hilfe von radioaktiven Sonden (markiert mit ³²P oder ³&sup5;S) durchgeführt werden, die aus HPV gemäß der Erfindung oder aus Mischungen von DNS oder HPV, die sie enthalten, präpariert wurden.
Es können mehrere Hybridisierungverfahren angewendet werden. Man kann beispielsweise das Tüpfel-Hybridisierungsverfahren anwenden. Dieses Verfahren umf aßt nach Denaturierung der DNS, das Aufbringen einer Probenmenge DNS auf Membranen (Nitrozellulose oder "Genescreenplus"), die Hybridisierung jeder Membran unter üblichen Bedingungen mit einer Mischung von Sonden und den Nachweis von radioaktiven Hybriden durch Kontakt der Membranen mit einem radiographischen Film. Man kann auch ein replizierendes Hybridisierungsverfahren anwenden. Dieses Verfahren umfaßt die elektrophoretische Trennung von DNS-Fragmenten in Agarosegel, die nach Behandlung der DNS mit Restriktionsenzymen erzeugt wurden, den Transfer der Fragmente nach alkalischer Denaturierung auf Membranen (Nitrozellulose, "Genescreenplus") und ihre Hybridisierung unter üblichen Bedingungen mit einer geeigneten Mischung von Sonden. Die Bildung von radioaktiven Hybriden wird nach Kontakt der Membranen mit einem radiographischen Film nachgewiesen.
Die radioaktiven Sonden sind gebildet aus DNS von HPV, die nach dem Verfahren der Translation durch Schnitt ("Nick- Translation") markiert sind oder durch RNS, die durch Transkription von in einen Vektor eingesetzten Virus-DNS präpariert wurden, zum Beispiel von Typ SP6. Die Verwendung von radioaktiven Sonden hat den Vorteil einer großen Empfindlichkeit, dies schließt aber die Verwendung von nichtradioaktiven Sonden nicht aus, zum Beispiel von biotinylierten Sonden, die von Antikörpern erkannt werden können, die entweder selbst markiert sind oder selbst von Antikörpern erkannt werden, die einen enzymatischen, fluoreszierenden usw. Marker tragen.
Die Erfindung betrifft gleichermaßen kompetente Zellkulturen, die mit den rekombinanten DNS vom oben genannten Typ transformiert wurden, insbesondere jene, in denen die der DNS oder der DNS-Sequenz von HPV39 entsprechende Nukleotidsequenz unter die Kontrolle von Transkriptions- und Regulationselementen dieser Nukleotidsequenz in der genannten Zellkultur gestellt ist.
Folglich betrifft sie gleichermaßen die Expressionprodukte dieser rekombinanten DNS in entsprechenden kompetenten Zellwirten und die entsprechenden Antikörper, die gegen diese Expressionsprodukte gebildet werden können.
Die Erfindung betrifft auch die Polypeptide, die insbesondere aus den jeweiligen Expressionen der Gene E1, E2, E4, E6, E7, L1, L2 von HPV39-DNS entstehen.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Produktion dieser Polypeptide umfaßt folglich die Transformation von kompetenten Zellkulturen mit rekombinanten DNS, die die von HPV39 herstammenden Nukleotidsequenzen enthalten, so daß die einem der genannten Proteine entsprechende Nukleotidsequenz in diesem Zellwirt exprimiert werden kann, die Aufnahme dieser Polypeptide aus den durch den kompetenten Zellwirt synthetisierten Produkten und die Reinigung (zum Beispiel durch in Kontakt bringen der Expressionsprodukte, die zuvor aus Zellkulturen oder aus dem Milieu, in dem sie sich entwickelt haben, extrahiert wurden, mit den zuvor gegen solche Polypeptide gebildeten Antikörpern).
Die Expressionsprodukte der Sequenzen L2 jedes der Genome des Papillomavirus gemäß der Erfindung weisen indessen ein ganz besonderes Interesse auf, indem sie selbst zur Produktion von Antikörpern in vivo verwendet werden können, die die Expressionsprodukte des Gens L2 in biologischen Proben erkennen können, die von einem Papillomavirus vom Typ HPV39 oder einer Variante davon betroffen sind, und dies insbesondere, wenn die Präparate der fraglichen Art zuvor fixiert wurden.
Die Erfindung betrifft noch hybride Polypeptide, die die genannten Polypeptide enthalten und entsprechend von HPV39 abgeleitet wurden, zum Beispiel das mit anderen Polypeptidsequenzen fusionierte Protein L2, insoweit als diese die immunogenen Eigenschaften des Proteins L2 nicht wesentlich modifizieren. Das Vorhandensein dieser anderen Polypeptidfragmente kann insbesondere aus der angewendeten Produktionsweise dieser hybriden Polypeptide herrühren, zum Beispiel durch Gentechnik. Zum Beispiel enthalten diese hybriden Polypeptide eine Sequenz, die von der β-Galactosidase abgeleitet sind. Solche Produkte können insbesondere durch Transformation von E. coli mit geeigneten Vektoren (Phagen oder Plasmide) erhalten werden, die ganz oder teilweise durch das Lactoseoperon modfiziert sind und außerdem unterhalb des Promotors für das Lactoseoperon (oder jedem anderen geeigneten Promotor zum Beispiel des Phagen λ) eingesetzt, die vom Gen L2 von HPV39 abgeleitete Nukleotidsequenz aufweisen. Vorteilhafterweise werden Plasmide oder Phagen vom Typ, der mindestens einen Teil des Gens der β-Galactosidase des Lactoseoperons aufweist, verwendet.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können gleichermaßen, wenn sie gereinigt sind, in Reinigungstechniken von ihnen entsprechenden Antikörpern eingesetzt werden, insbesondere aus Seren von Tieren, die durch diese Polypeptide immunisiert wurden. Insbesondere können diese Polypeptide auf Affinitätssäulen fixiert werden. Die Arbeiten zur Reinigung von Antikörpern umfassen, das Serum, das sie enthält, in Kontakt mit Affinitätssäulen zu führen, die die genannten Polypeptide tragen. Die selektiv auf diesen Säulen fixierten Antikörper können dann aufgenommen werden durch Dissoziation der Antigen- Antikörperkomplexe mit Hilfe eines geeigneten Puffers, der eine angemessene Ionenstärke aufweist, zum Beispiel eine wäßrige Salzlösung wie Ammoniumacetat. Gleichermaßen kann man angesäuerte Lösungen verwenden.
Die Erfindung betrifft gleichermaßen ein Verfahren zur Herstellung von Antikörpern gegen die genannten Polypeptide, insbesondere gegen die Expressionsprodukte der Gene E6, E7 oder bevorzugt L2 von HPV39, wobei dieses Verfahren die Immunisierung eines geeigneten lebenden Wirtes mit den genannten Polypeptiden umfaßt und die Aufnahme der gebildeten Antikörper aus einem Serum des immunisierten Wirtes, insbesondere durch in Kontakt bringen dieser Seren mit den entsprechenden Polypeptiden in gereinigtem Zustand und durch Aufnahme dieser Antikörper aus den gebildeten Antigen-Antikörperkomplexen.
Insbesondere betrifft die Erfindung die genannten Antikörper, zuvor gereinigt, in Verbindung mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger. Diese Zusammensetzung kann dann zur Behandlung der gegebenen Erkrankung angewendet werden, wenn diese klinisch, am Ende einer diagnostischen in vitro Untersuchung mit einer histologischen oder zytologischen vom Kranken stammenden Probe diagnostiziert worden ist. Diese Zusammensetzung (insbesondere in Form eines Serums) kann bevorzugt auf parenteralem Wege verabreicht werden. Dieses Serum kann dann eine Regression der durch Papillomaviren vom Typ HPV39 ausgelösten Infektionen veranlassen.
Diese Antikörper können insbesondere in diagnostischen Untersuchungen auf eine Infektion durch HPV39 oder einen verwandten Papillomavirus (oder eine Variante dieses Papillomavirus) angewendet werden, wobei histologische Schnitte, die von infizierten Personen stammen, gleichermaßen Expressionsprodukte von bestimmten seiner Strukturgene, insbesondere L2, enthalten können.
Die Erfindung betrifft ferner ein Diagnoseverfahren in vitro, insbesondere auf Neoplasien im Genitalbereich von Krebsen der Cervix, der Vulva oder des Penis, umfassend in Kontakt bringen von histopathologischen Schnitten, die von bei betroffenen Personen ausgelösten Läsionen stammen, unter Bedingungen, die die Ausbildung eines Antigen-Antikörperkoinplexes erlauben und den Nachweis dieses Antigen-Antikörperkomplexes. Mit Vorteil wird der Nachweis auf zuvor unter dissoziierenden Bedingungen fixierten Präparaten durchgeführt, zum Beispiel mit dein Milieu oder der Mischung von CARNOY, die oben schon genannt wurden (auch in der Arbeit von L. LISON mit dem Titel "Histochimie et cytochimie animales" beschrieben).
Die evenutuell fixierten anti-L2-Antikörper können von anderen gegen die ersten gebildeten Antikörpern erkannt werden, wobei diese anderen Antikörper geeignete Marker tragen, bevorzugt nicht radioaktive. Diese Marker sind beispielsweise enzymatischer oder fluoreszierender Natur.
Die so selektionierten Antikörper, wie die oben definierten Hybridisierungssonden, die ihnen entsprechen, können folglich verwendet werden, um in vitro die entsprechenden Arten von Erkrankungen zu diagnostizieren.
Die Erfindung betrifft schließlich Zusammensetzungen von entsprechenden Impfstoffen, die eines oder bevorzugt mehrere andere Proteine L2 enthalten, in Verbindung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger, der für den gewählten Verabreichungsmodus, insbesondere auf parenteralem Wege geeignet ist. Diese Zusammensetzungen sind verwendbar, um Personen, die hohen Risiken einer Infektion durch HPV39 oder entsprechender Typen von Papillomaviren ausgesetzt sind, zu schützen. TABELLE 1 OFFENE LESERAHMEN (in englisch "open reading frames" abgekürzt zu "ORF") DER STRANG ANALOG ZUR mRNS DES GENOMS VON HPV39 ORF erstes Nukleotid erstes ATG Nukleotid vor dem Stopcodon ORF Größe (pb) Molekulargewicht (kD) TABELLE 2 VERGLEICH VON HPV-PROTEINEN MIT HPV39 (Prozentanteil an identischen Aminosäuren)a
aDie Sequenzvergleiche wurden unter Verwendung eines auf einem Algorithmus von Needlemann und Wunsch (41) basierenden Rechenprogrammes durchgeführt.

Literaturquellen

1. De Villiers, E.J. Virol. 63, 4898-4903 (1989).
2. Seedorf, K., Krammer, G., Durst, M., Suhai, S. and Röwekamp, W.G., Virology 145, 181-185 (1985).
3. Cole, S.T.and Danos. O.,J. Mol. Biol. 193. 599-608 (1987).
4. Goldsborough. M.D., DiSilvestre, D., Temple, G.F. and Lorincz, A.T., Virology 171, 306-311 (1989).
5. Beaudenon, S., Kremsdorf, D., Obalek, S., Jablonska, S., Pehau-Arnaudet, G., Croissant, O. and Orth, G., Virology 161, 374-384 (1987).
6. Danos, O., Katinka M. and Yaniv. M., EMBO J. 1, 231-236 (1982).
7. Chen, E., Howley. P.M., Levinson, A.D., Seeburg, P.H., Nature 299, 529-534 (1982).
8. Dartmann, K.,Schwarz, E.,Gissmann, L., and Zur Hausen, H., Virology 151, 124- 130 (1986).
9. Fuchs, P.G., I ner, T., Weniger, J. and Pfister, H., J. Virol. 58, 626-634 (1986).
10. Giri, I., Danos, O. and. Yaniv, M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 1580-1584 (1985).
11. Groff, D.E. and Lancaster, W.D.,J. Virol. 56, 85-91 (1985).
12. Cole, S.T.and Streeck, R.E.,J. Virol. 56, 85-91 (1985).
13. Schwarz, E.,Dürst, M.,Demankowski, C.,Lattermann, O.,Zech, R.,Wolfsperger, E., Suhai, S. and Zur Hausen, H., EMBO J. 2, 2341-2348 (1983).
14. Zachow, K.R., Ostrow, R.S., Faras, A.J., Virology 158, 251-254 (1987).
15. Henikoff, S.,Methods in Enzymology 155, 156-165 (1987).
16. Sanger, F.,Nicklen, S. and Coulson, A.R.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463- 5467 (1977).
17. Zhang, H., Scholl, R., Browse, J. and Somerville, C., Nucl. Acids Res. 16, 1220 (1988).
18. Chow, L.T.,Nasserri, M., Wolinsky, S.M. and Broker, T.R.,J. Virol. 61, 2581-2588 (1987).
19. Engel, L.W.,Heilman, C.A. and Howley, P.M.,J. Virol. 47, 516-528 (1983).
20. Benoist, C. and Chambon, P., Nature 290, 304-310 (1981).
21. Wingender, E.,Nucl. Acids Res. 16, 1879-1902 (1988).
22. Proudfoot, N.,Nature 298, 516-517 (1982).
23. Spaiholz, B.A.,Yang, Y. and Howley, P.M.,Cell 42, 183-191 (1985).
24. Hirochika, H., Broker, T.R. and Chow L.T.,J. Virol. 61, 2599-2606 (1987)
25. Gloss, B., Ching, T. and Bernard, H.-U.,J. Virol. 63, 1142-1152 (1989)
26. Thierry, F., Heard, J.M., Dartmann, K. and Yaniv, M., J. Virol. 61, 134-142 (1987).
27. Chan, W., Klock G. and Bernard, H.-U.,J. Virol. 63, 3261-3269 (1989).
28. Chin, M.T.,Broker, T.R. and Chow, L.T.,J. Virol. 63, 2967-2976 (1989).
29. Cripe, T.P., Haugen, T.H., Turk, J.P., Tabatabai, F., Schmid, P.G., Dürst, M., Gissmann, L.,Roman, A. and Turek, L.P.,EMBO J. 6, 3745-3753 (1987).
30. Chong, T., Chan, W.K. and Bernard, H.-U.,Nucl. Acids. Res. 18, 465-470 (1990).
31. Gloss, B., Yeo-Gloss, M., Meisterernst, M., Rogge, L., Winnacker, E.L. and Bernard, H.-U.,Nucl. Acids. Res. 17, 3519-3533 (1989).
32. Angel, P.,Imagawa, M., Chin, R., Stein, B., Imbra, R.J.,Rahmsdorf, H.J.,Jonat, C.,Herrlich, P. and Karin, M., Cell 49, 729-738 (1987).
33. Weiher, H., König, M. and Gruss, P., Science 219, 626-631 (1983).
34. Imagawa, M., Chin, R. and Karin, M., Cell 51, 251-258 (1987).
35. Smotkin, D., Prokoph, H. and Wellstein, F> O> < J. Virol. 63, 1441-1447 (1989).
36. Smotkin D. and Wellstein, F.O., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 4680-4684 (1986).
37. Münger, K., Phelps, W.C., Bubb, V., Howley, P.M.and Schlegel, R., J. Virol. 63, 4417-4421 (1989).
38. Evans, R.M. and Hollenberg, S.M.,Cell 52, 1-3 (1988).
39. Edmonds, C. and Vousden, K.H.,J. Virol. 63, 2650-2656 (1989).
40. Figge, J. ind Smith. T.F., Nature 334, 109 (1988).
41. Needleman, S.B. and Wunsch, C.D.,J. Mol. Biol. 48, 443-450 (1970).

Claims

1. DNS eines Papillomavirus HPV39 gekennzeichnet durch die Nukleotidsequenz von Figur 1 oder durch einen Teil dieser Sequenz, die aber mindestens 15 Nukleotide enthält, oder auch durch eine Sequenz, die dieser DNS erlaubt, mit der DNS von HPV39 unter bestimmten Bedingungen zu hybridisieren, wobei der genannte Teil der Sequenz:

- in der des großen ORF von 1,3 kb enthalten ist, der sich von Nukleotid 2050 bis Nukleotid 776 in Figur 1 erstreckt;

- oder in der des kleinen ORF enthalten ist, der sich von Nukleotid 4204 bis Nukleotid 3875 erstreckt ja sogar von Nukleotid 4227 bis Nukleotid 3875;

- oder in der Region der Sequenz in Figur 1 enthalten ist, die die Untersequenz GACA im konservierten Element GRE auf Höhe des Nukleotids 6367 enthält, wobei die Untersequenz GACA Teil der genannten Sequenz ist;

- oder in der Sequenz in Figur 1 enthalten ist und selbst eine der folgenden Sequenzen enthält:

Consensus: GGTACANNNTGTTCT

HPV39 (NCR): TCTACATTTTATACT

HPV39 (L1) : GCGACAGTATGTTCT;

- oder in einem der folgenden Gene von HPV39 enthalten ist: E1 (Nukleotid 922 bis Nuklectid 2868), E2 (Nukleotid 2780 bis Nukleotid 3907), E4 (Nukleotid 3393 bis Nukleotid 3674), E6 (Nukleotid 44 bis Nukleotid 580) - E7 (Nukleotid 493 bis Nukleotid 918), L1 (Nukleotid 5610 bis Nukleotid 7157), L2 (Nukleotid 4172 bis Nukleotid 5659) oder in der intergenen Region NC.

2. DNS nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ihre Sequenz der des großen ORF von 1,3 kb entspricht, der sich von Nukleotid 2050 bis Nukleotid 776 in Figur 1 erstreckt oder irgendeinem Fragment, das in dieser Sequenz enthalten oder davon abgeleitet ist, wobei dieses Fragment mindestens 15 Nukleotide umfaßt.

3. DNS nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ihre Sequenz der des kleinen ORF entspricht, der sich von Nukleotid 4204 bis Nukleotid 3875 und sogar von Nukleotid 4227 bis Nukleotid 3875 erstreckt oder Sequenzen, die von diesen letzteren abstammen oder abgeleitet sind.

4. DNS nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens 15 Nukleotide enthält und daß sie die Sequenz GACA im konservierten Element GRE auf Höhe des Nukleotids 6367 aufweist.

5. DNS nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz eine der folgenden Sequenzen enthält:

Consensus: GGTACANNNTGTTCT

HPV39 (NCR): TCTACATTTTATACT

HPV39 (L1): GGGACAGTATGTTCT

6. DNS nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte Fragment einem der folgenden Gene von HPV39 entspricht: E1 (Nukleotid 922 bis Nukleotid 2868), E2 (Nukleotid 2780 bis Nuk1eotid 3907), E4 (Nukleotid 3393 bis Nukleotid 3674), E6 (Nukleotid 44 bis Nukleotid 580)

- E7 (Nukleotid 493 bis Nukleotid 918), L1 (Nukleotid 5610 bis Nukleotid 7157), L2 (Nukleotid 4172 bis Nukleotid 5659) oder die ganze oder ein Teil der intergenen Region NC.

7. Hybridisierungssonde gebildet von einer DNS, die von der DNS nach einem der Ansprüche 1 bis 6 abgeleitet ist.

8. Polypeptid entsprechend dem Produkt der Expression von einem der Gene der Struktur von einer der Papillomavirus-DNS nach einem der Ansprüche 1 bis 6.

9. Polypeptid nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es insbesondere in einem Produkt der Expression der Sequenz L2 des Genoms von Papillomavirus HPV39 besteht.

10. Antikörper, die gegen das Polypeptid nach Anspruch 6 oder nach Anspruch 8 gerichtet sind.

11. Verfahren zum Nachweis einer Infektion durch einen Papillomavirus vom Typ HPV39 auf einer zu prüfenden biologischen Probe in vitro, gekennzeichnet durch in Kontakt bringen einer entsprechenden Sonde, wie sie in Anspruch 7 definiert ist, mit den Nukleinsäuren dieser Probe, die gegebenenfalls zuvor für die Sonde zugänglich gemacht wurden, bevorzugt unter bestimmten Hybridisierungsbedingungen und durch Nachweis des zwischen der gesuchten Virus-DNS, die eventuell in der Probe vorhanden ist, und der genannten Sonde gebildeten Hybrids.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Diagnostik in vitro auf den Nachweis von Neoplasien im Genitalbereich, insbesondere von Krebsen der Cervix, der Vulva und des Penis gerichtet ist.

13. Anwendung von Antikörpern nach Anspruch 8 zur Diagnose in vitro einer Infektion durch einen Papillomavirus eines Typs, der geeignet ist, Neoplasien im Genitalbereich und Krebse des Gebärmutterhalses zu induzieren, gekennzeichnet durch in Kontakt bringen eines Antikörpers, wie in Anspruch 10 definiert, mit einer biologischen Probe, die von einer Person stammt, die sich der in vitro Diagnose unterzieht und durch Nachweis des gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexes.