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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft DNA-Moleküle, die für gereinigtes Human-Papillomavirus
Typ 18 und Derivate davon kodieren.
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Kurzbeschreibung der Zeichnungen
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1 zeigt die Nukleotidsequenz
und abgeleitete Aminosäuresequenz
von HPV18-L1.
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2 ist eine Liste von Aminosäurevariationen
innerhalb des L1-Proteins von HPV18.
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3 zeigt die Nukleotidsequenz
und abgeleitete Aminosäuresequenz
von HPV18-L2.
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4 zeigt einen Immunblot
von HPV18-L1-Protein, das in Hefe exprimiert wurde.
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5 zeigt einen Immunblot
von HPV18-L2-Protein, das in Hefe exprimiert wurde.
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6 ist eine elektronenmikroskopische
Aufnahme von virusähnlichen
Partikeln, gebildet von HPV18-L1-Protein, das in Hefe exprimiert
wurde.
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Hintergrund der Erfindung
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Papillomavirus
(PV)-Infektionen treten bei einer Vielzahl von Lebewesen, einschließlich von
Menschen, Schafen, Hunden, Katzen, Kaninchen, Affen, Schlangen und
Rindern, auf. Papillomaviren infizieren Epithelzellen, wobei sie
im allgemeinen gutartige epitheliale oder fibroepitheliale Tumore
an der Infektionsstelle induzieren. Papillomaviren sind speziesspezifische
infektiöse
Agenzien; ein Human-Papillomavirus kann kein nicht-menschliches
Lebewesen infizieren.
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Papillomaviren
können
auf Grundlage des Wirts, den sie infizieren, in verschiedene Gruppen
eingeteilt werden. Human-Papillomaviren (HPV) werden weiterhin auf
der Grundlage von DNA-Sequenzhomologie in mehr als 70 Typen eingeteilt.
Papillomavirus-Typen scheinen insofern typspezifische Immunogene
darzustellen, als eine neutralisierende Immunität gegen Infektion durch einen
Typ von Papillomavirus keine Immunität gegen einen anderen Typ von
Papillomavirus verleiht.
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Beim
Menschen verursachen verschiedene HPV-Typen unterschiedliche Erkrankungen.
Die HPV-Typen 1, 2, 3, 4, 7, 10 und 26–29 verursachen gutartige Warzen
bei sowohl normalen als auch immungeschwächten Individuen. Die HPV-Typen
5, 8, 9, 12, 14, 15, 17, 19–25,
36 und 46–50
verursachen flache Läsionen
bei immungeschwächten
Individuen. Die HPV-Typen 6, 11, 34, 39, 41–44 und 51–55 verursachen gutartige Condylome
der Schleimhäute
der Genitalien oder Atemwege. Die HPV-Typen 16 und 18 verursachen
eine Epithel-Dysplasie der Genitalschleimhaut und sind mit der Mehrheit
von in situ- und invasiven Karzinomen des Gebärmutterhalses, der Vagina,
Vulva und des Analkanals assoziiert.
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Papillomaviren
sind kleine (50–60
nm), nicht von einer Hülle
umgebene, ikosaedrische DNA-Viren, welche
für bis
zu acht frühe
und zwei späte
Gene kodieren. Die offenen Leserahmen (ORF) der Virusgenome werden
als E1 bis E7 und L1 und L2 bezeichnet, wobei "E" früh bedeutet
und "L" spät bedeutet.
L1 und L2 kodieren für
Virus-Kapsidproteine. Die frühen
(E) Gene sind mit Funktionen wie viraler Replikation und zellulärer Transformation
assoziiert.
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Das
L1-Protein ist das Haupt-Kapsidprotein und besitzt ein Molekulargewicht
von 55–60
kD. Das L2-Protein ist ein weniger häufiges Kapsidprotein, welches
ein vorausgesagtes Molekulargewicht von 55–60 kD und ein scheinbares
Molekulargewicht von 75–100
kD, wie mittels Polyacrylamidgelelektrophorese bestimmt, aufweist.
Immunologische Daten legen nahe, daß sich der größte Teil
des L2-Proteins innerhalb des L1-Proteins im viralen Kapsomer befindet.
Der L1-ORF ist bei verschiedenen Papillomaviren hoch konserviert. Die
L2-Proteine sind bei verschiedenen Papillomaviren weniger hoch konserviert.
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Die
L1- und L2-Gene wurden als gute Ziele für für die Immunprophylaxe identifiziert.
Studien in den Baumwollschwanzkaninchen-Papillomavirus (CRPV)- und
Rinder-Papillomavirus (BPV)-Systemen haben gezeigt, daß Immunisierungen
mit den L1- und L2-Proteinen, exprimiert in Bakterien oder unter
Verwendung von Vaccinia-Vektoren, Tiere vor einer Virusinfektion
schützten.
Die Expression von Papillomavirus-L1-Genen in Baculovirus-Expressionssystemen
oder unter Verwendung von Vaccinia-Vektoren führte zur Assemblierung von
virusähnlichen
Partikeln (VLP), welche zur Induktion von virus-neutralisierenden
Antikörperreaktionen
mit hohem Titer, die mit dem Schutz vor einer viralen Herausforderung
korrelieren, eingesetzt wurden.
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Nach
HPV Typ 16 ist HPV18 der zweithäufigste
HPV-Typ, der bei Gebärmutterhalskarzinomen
gefunden wird. HPV18 wurde in 5–20
% von Gebärmutterhalskrebs-Biopsien,
die aus verschiedenen Teilen der Welt gesammelt wurden (Ikenberg,
H., 1990, Human papilloma virus DNA in invasive genital carcinomas,
in Genital Papillomavirus Infections, G. Gross et al., Hrsg., S.
85–112)
nachgewiesen. Es scheint eine geographische Abhängigkeit der Infektion mit
HPV18 zu geben, da Tumor-Biopsien von afrikanischen und südamerikanischen Frauen
HPV18 häufiger
als ähnliche
Biopsien von europäischen
und nordamerikanischen Frauen aufweisen. Die Gründe für diese geographischen Unterschiede
sind nicht bekannt. Die Entwicklung eines Vakzins gegen eine HPV18-Infektion
wird äußerst wichtig,
da HPV18 auch mit aggressiver wachsenden Krebsarten assoziiert ist
und selten bei den milderen Vorläuferläsionen,
CIN I–II,
gefunden wird.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft DNA-Moleküle, die für die in 1 und 3 gezeigten
gereinigten Human-Papillomavirus Typ 18 (HPV Typ 18; HPV18)-L1-
und L2-Proteine kodieren, und Verwendungen der DNA-Moleküle.
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Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft DNA-Moleküle, die für die in 1 und 3 gezeigten
gereinigten Human-Papillomavirus Typ 18 (HPV Typ 18; HPV18)-L1-
und -L2-Proteine kodieren, Peptide und Proteine, die von der DNA
kodiert werden, Vakzine, welche die DNA umfassen, oder Vakzine,
welche von der DNA kodierte Proteine umfassen, immunologische Zusammensetzungen,
welche die DNA oder die von der DNA kodierten Proteine umfassen,
Kits, welche die DNA oder von der DNA abgeleitete RNA oder von der
DNA kodierten Proteine enthalten.
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Pharmazeutisch
geeignete Zusammensetzungen, welche die in 1 und 3 gezeigte(n)
DNA oder Proteine umfassen, können
nach bekannten Verfahren formuliert werden, wie z.B. durch die Zumischung eines
pharmazeutisch annehmbaren Trägers.
Beispiele solcher Träger
und Formulierungsverfahren sind in Remington's Pharmaceutical Sciences zu finden.
Zur Bildung einer pharmazeutisch annehmbaren Zusammensetzung, die
für eine
wirksame Verabreichung geeignet ist, werden solche Zusammensetzungen
eine wirksame Menge der DNA oder des Proteins oder VLP enthalten.
Solche Zusammensetzungen können
DNA oder Proteine oder VLP enthalten, die von mehr als einem HPV-Typ
stammen.
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Therapeutische
oder diagnostische Zusammensetzungen der Erfindung werden einem
Individuum in ausreichenden Mengen verabreicht, um PV-Infektionen
zu behandeln oder zu diagnostizieren. Die wirksame Menge kann entsprechend
einer Vielfalt von Faktoren, wie z.B. dem Zustand, Gewicht, Geschlecht
und Alter des Individuums, variieren. Andere Faktoren umfassen den
Verabreichungsmodus. Im allgemeinen werden die Zusammensetzungen
in Dosen verabreicht werden, die von etwa 1 μg bis etwa 1 mg reichen.
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Die
pharmazeutischen Zusammensetzungen können dem Individuum auf einer
Vielfalt von Routen, wie z.B. subkutan, topisch, oral, mukosal,
intravenös
und intramuskulär,
verabreicht werden.
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Die
Vakzine der Erfindung umfassen DNA, RNA oder Proteine, die von der
DNA kodiert werden, welche die antigenen Determinanten enthalten,
die zur Induktion der Bildung neutralisierender Antikörper in
dem Wirt erforderlich sind. Solche Vakzine sind auch sicher genug,
um ohne Gefahr einer klinischen Infektion verabreicht zu werden,
besitzen keine toxischen Nebenwirkungen, können auf einem effektiven Weg
verabreicht werden, sind stabil und kompatibel mit Vakzin-Trägern.
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Die
Vakzine können
auf einer Vielfalt von Routen verabreicht werden, z.B. oral, parenteral,
subkutan, mukosal, intravenös
oder intramuskulär.
Die verabreichte Dosis kann mit dem Zustand, Geschlecht, Gewicht und
Alter des Individuums, dem Verabreichungsweg und dem PV-Typ des
Vakzins variieren. Das Vakzin kann in Dosierungsformen wie Kapseln,
Suspensionen, Elixieren oder flüssigen
Lösungen
eingesetzt werden. Das Vakzin kann mit einem immunologisch annehmbaren
Träger
formuliert werden.
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Die
Vakzine werden in therapeutisch wirksamen Mengen verabreicht, d.h.,
in ausreichenden Mengen, um eine immunologisch schützende Reaktion
hervorzurufen. Die therapeutisch wirksame Menge kann entsprechend
dem PV-Typ variieren. Das Vakzin kann in Einzeldosen oder mehreren
Dosen verabreicht werden.
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Die
DNA der vorliegenden Erfindung kann bei der Formulierung immunogener
Zusammensetzungen verwendet werden. Solche Zusammensetzungen sind,
bei Einführung
in einen geeigneten Wirt, zur Induktion einer Immunreaktion in dem
Wirt in der Lage.
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Die
DNA der vorliegenden Erfindung kann zur Serotypenbestimmung einer
HPV-Infektion und zum HPV-Screening eingesetzt werden. Die DNA,
rekombinanten Proteine, VLP eignen sich zur Formulierung von Kits,
die für
den Nachweis und die Serotypenbestimmung von HPV geeignet sind.
Ein solcher Kit würde
einen aufgeteilten Träger
umfassen, der dazu geeignet ist, in festem Einschluß mindestens
einen Behälter
zu enthalten. Der Träger
würde ferner
Reagenzien wie HPV18-DNA, rekombinantes HPV-Protein oder VLP oder
Anti-HPV-Antikörper, die
sich zum Nachweis einer Vielfalt von HPV-Typen eignen, umfassen.
Der Träger
kann auch Nachweismittel, wie z.B. markiertes Antigen oder Enzym-Substrate
oder dgl., enthalten.
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Die
DNA und abgeleiteten Proteine, die in 1 und 3 gezeigt sind, eignen sich
auch als Molekulargewichts- und Molekulargrößenmarker.
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Aufgrund
der Degeneration des genetischen Codes kann mehr als ein Codon zur
Kodierung einer speziellen Aminosäure verwendet werden und deshalb
kann die Aminosäuresequenz
von irgendeinem aus einem Satz ähnlicher
DNA-Oligonukleotide kodiert werden. Nur ein Mitglied des Satzes
wird mit der HPV18-Sequenz identisch sein, wird jedoch in der Lage
sein, mit HPV18-DNA sogar in Gegenwart von DNA-Oligonukleotiden mit
Fehlpaarungen unter geeigneten Bedingungen zu hybridisieren. Unter
alternativen Bedingungen können die
fehlgepaarten DNA-Oligonukleotide immer noch mit der HPV18-DNA hybridisieren,
um eine Identifizierung und Isolierung von für HPV18 kodierender DNA zu
ermöglichen.
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Die
gereinigte HPV18-DNA der Erfindung kann zur Isolierung und Reinigung
von Homologen und Fragmenten von HPV18 aus anderen Quellen eingesetzt
werden. Um dies zu erreichen, kann die erste HPV18-DNA mit einer
Probe, welche DNA, kodierend für
Homologe von HPV18, enthält,
unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen gemischt werden. Der
hybridisierte DNA-Komplex kann isoliert und DNA, welche für die homologe
DNA kodiert, kann daraus gereinigt werden.
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Eine
Vielfalt von Verfahren kann zur molekularen Klonierung von HPV18-DNA
eingesetzt werden. Diese Verfahren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf,
direkte funktionelle Expression der HPV18-Gene nach der Erstellung
einer HPV18-enthaltenden cDNA-Bank oder genomischen DNA-Bank in
einem geeigneten Expressionsvektorsystem. Ein weiteres Verfahren
ist das Screenen einer HPV18-enthaltenden cDNA-Bank oder genomischen
DNA-Bank, die in
einem Bakteriophagen oder Plasmid-Shuttle-Vektor erstellt wurde,
mit einer markierten Oligonukleotid-Sonde, die anhand der Aminosäuresequenz
des HPV18 konstruiert wurde. Ein weiteres Verfahren besteht im Screenen
einer HPV18-enthaltenden cDNA-Bank oder genomischen DNA-Bank, die
in einem Bakteriophagen- oder Plasmid-Shuttle-Vektor erstellt wurde, mit einer
partiellen DNA, die für
das HPV18 kodiert. Diese partielle DNA wird erhalten durch die spezifische
Polymerasekettenreaktions (PCR)-Amplifizierung
von HPV18-DNA-Fragmenten durch die Konstruktion degenerierter Oligo nukleotid-Primer
anhand der Aminosäuresequenz
von gereinigtem HPV18. Ein weiteres Verfahren ist die Isolierung
von RNA aus HPV18-produzierenden Zellen und Translation der RNA
in ein Protein über
ein in vitro- oder ein in vivo-Translationssystem. Die Translation
der RNA in ein Peptid oder ein Protein wird zur Produktion mindestens
eines Teils des HPV18-Proteins
führen,
welches beispielsweise durch die Aktivität des HPV18-Proteins oder durch
immunologische Reaktivität
mit einem Anti-HPV18-Antikörper
identifiziert werden kann. Bei diesem Verfahren können Pools
von RNA, die aus HPV18-produzierenden Zellen isoliert wurden, hinsichtlich
der Anwesenheit einer RNA, die für
mindestens einen Teil des HPV18 kodiert, analysiert werden. Eine
weitere Fraktionierung des RNA-Pools kann erfolgen, um die HPV18-RNA
von Nicht-HPV18-RNA zu reinigen. Das nach diesem Verfahren hergestellte
Peptid oder Protein kann analysiert werden, um Aminosäuresequenzen
bereitzustellen, welche wiederum zur Bereitstellung von Primern
für die
Produktion von HPV18-cDNA eingesetzt werden, oder die für die Translation
eingesetzte RNA kann analysiert werden, um Nukleotidsequenzen, die
für HPV18
kodieren, bereitzustellen und Sonden für das Screening einer HPV18-cDNA-Bank
zu ergeben. Diese Verfahren sind im Stand der Technik bekannt und
sind beispielsweise in Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T.,
in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, zu finden.
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Es
ist ersichtlich, daß andere
Typen von Banken, sowie Banken, die aus anderen Zellen oder Zelltypen erstellt
wurden, zur Isolierung von DNA, die für HPV18 kodiert, geeignet sein
können.
Andere Typen von Banken umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf,
cDNA-Banken, die
von anderen Zellen oder Zellinien stammen, die HPV Typ 18 enthalten,
und genomische DNA-Banken.
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Die
Erstellung von cDNA-Banken kann nach einer Vielfalt von Techniken
erfolgen. Verfahren zur Erstellung von cDNA-Banken sind in Sambrook
J., et al., oben, zu finden. Es ist ersichtlich, daß für HPV18
kodierende DNA auch aus einer geeigneten genomischen DNA-Bank isoliert
werden kann. Die Erstellung von genomischen DNA-Banken kann nach
einer Vielfalt von Techniken durchgeführt werden. Verfahren zur Erstellung
genomischer DNA-Banken sind in Sambrook, J., et al., oben, zu finden.
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Die
klonierte HPV18-DNA, welche mit den hier beschriebenen Verfahren
erhalten wurde, kann durch molekulare Klonierung in einen Expressionsvektor,
der einen geeigneten Promotor und andere geeignete regulatorische
Transkriptionselemente enthält,
rekombinant exprimiert und in prokaryotische oder eukaryotische Wirtszellen überführt werden,
um rekombinantes HPV18 zu bilden. Techniken für solche Manipulationen werden
vollständig
in Sambrook, J., et al., oben, beschrieben und sind im Stand der
Technik bekannt.
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Expressionsvektoren
sind hier definiert als DNA-Sequenzen, welche für die Transkription klonierter Kopien
von Genen und die Translation ihrer mRNAs in einen geeigneten Wirt
erforderlich sind. Solche Vektoren können zur Expression eukaryotischer
Gene in einer Vielfalt von Wirten, wie z.B. Bakterien, blaugrünen Algen,
Pflanzenzellen, Insektenzellen, Pilzzellen und Tierzellen, eingesetzt
werden. Speziell konstruierte Vektoren erlauben das Shuttling von
DNA zwischen Wirten wie Bakterien-Hefe oder Bakterien-Tierzellen
oder Bakterien-Pilzzellen oder Bakterien-Invertebratenzellen. Ein
geeignet konstruierter Expressionsvektor sollte enthalten: einen
Replikationsursprung für
autonome Replikation in Wirtszellen, selektierbare Marker, eine
begrenzte Anzahl geeigneter Restriktionsenzymstellen, ein Potential
für eine
hohe Kopienzahl und aktive Promotoren. Ein Promotor ist definiert
als eine DNA-Sequenz, welche RNA-Polymerase zur Bindung an DNA und
zur Initiierung von RNA-Synthese veranlaßt. Ein starker Promotor ist
einer, welcher die Initiierung von mRNAs mit hoher Frequenz veranlaßt. Expressionsvektoren
können
einschließen,
sind jedoch nicht beschränkt
auf, Klonierungsvektoren, modifizierte Klonierungsvektoren, speziell
konstruierte Plasmide oder Viren.
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Eine
Vielfalt von Säuger-Expressionsvektoren
kann zur Expression der HPV18-DNA in Säugerzellen eingesetzt werden.
Im Handel erhältliche
Säuger-Expressionsvektoren,
welche für
die rekombinante HPV18-Expression geeignet sein mögen, umfassen,
sind jedoch nicht beschränkt
auf, pcDNA3 (Invitrogen), pMC1neo (Stratagene), pXT1 (Stratagene),
pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2-neo (ATCC 37593), pBPV-1(8-2) (ATCC
37110), pdBPV-MMTneo (342–12)
(ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198), pSV2-dhfr
(ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460) und λZD35 (ATCC 37565).
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Eine
Vielfalt von bakteriellen Expressionsvektoren kann zur Expression
der HPV18-DNA in Bakterienzellen eingesetzt werden. Im Handel erhältliche
bakterielle Expressionsvektoren, welche geeignet sein mögen, umfassen,
sind jedoch nicht beschränkt
auf, pET11a (Novagen), Lambda gt11 (Invitrogen), pcDNAll (Invitrogen),
pKK223-3 (Pharmacia).
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Eine
Vielfalt von Pilzzell-Expressionsvektoren kann zur Expression des
HPV18 in Pilzzellen eingesetzt werden. Im Handel erhältliche
Pilzzell-Expressionsvektoren, welche geeignet sein mögen, umfassen,
sind jedoch nicht beschränkt
auf, pYES2 (Invitrogen), Pichia-Expressionsvektor (Invitrogen) und
Hansenula-Expression (Rhein Biotech, Düsseldorf, Deutschland).
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Eine
Vielfalt von Insektenzell-Expressionsvektoren kann zur Expression
der HPV18-DNA in Insektenzellen eingesetzt werden. Im Handel erhältliche
Insektenzell-Expressionsvektoren, welche geeignet sein mögen, umfassen,
sind jedoch nicht beschränkt
auf, pBlue Bac III (Invitrogen) und pAcUW51 (PharMingen, Inc.).
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Ein
Expressionsvektor, welcher die in 1 und 3 gezeigte, für HPV18
kodierende DNA enthält, kann
zur Expression der HPV18-Proteine in einer Zelle, in Geweben, Organen
oder Tieren eingesetzt werden. Wirtszellen können prokaryotisch oder eukaryotisch
sein, einschließlich,
jedoch nicht beschränkt
auf, Bakterien wie E. coli, Pilzzellen wie Hefe, Säugerzellen,
einschließlich,
jedoch nicht beschränkt
auf, Zellinien von Menschen, Rindern, Schweinen, Affen und Nagetieren,
und Insektenzellen, einschließlich,
jedoch nicht beschränkt auf,
von Drosophila und Seidenraupe abgeleitete Zellinien. Zellinien,
die sich von Säugerspezies
ableiten, welche geeignet sein mögen
und im Handel erhältlich
sind, schließen
ein, sind jedoch nicht beschränkt
auf, L-M(TK–)-L-Zellen
(ATCC CCL 1.3), L-M-L-Zellen (ATCC CCL 1.2), 293 (ATCC CRL 1573),
Raji (ATCC CCL 86), CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7
(ATCC CRL 1651), CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3
(ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C1271 (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC
CCL 26) und MRC-5 (ATCC CCL 171).
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Der
Expressionsvektor kann in Wirtszellen mit irgendeiner aus einer
Vielzahl von Techniken eingeführt werden,
einschließlich,
jedoch nicht beschränkt
auf, Transformation, Transfektion, Lipofektion, Protoplastenfusion
und Elektroporation. Die Zellen, welche Expressionvektor enthalten,
werden klonal vermehrt und individuell analysiert, um festzustellen,
ob sie HPV18-Protein
produzieren. Die Identifizierung von HPV18-exprimierenden Wirtszellklonen
kann auf verschiedene Weise erfolgen, einschließlich der, jedoch nicht beschränkt auf
die, immunologische(n) Reaktivität
mit Anti-HPV18-Antikörpern,
und Anwesenheit von wirtszell-assoziierter HPV18-Aktivität, wie z.B.
HPV18-spezifische Ligandenbindung oder Signaltransduktion, definiert
als eine Reaktion, welche durch die Wechselwirkung von HPV18-spezifischen
Liganden mit den exprimierten HPV18-Proteinen vermittelt wird.
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Die
Expression von HPV-DNA kann auch mit Hilfe von in vitro hergestellter
synthetischer mRNA oder nativer mRNA durchgeführt werden. Synthetische mRNA
oder aus HPV18-produzierenden
Zellen isolierte mRNA kann sowohl effizient in verschiedenen zellfreien
Systemen translatiert werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf,
Weizenkeimextrakte und Retikulozytenextrakte, als auch effizient
in Systemen auf Zellbasis translatiert werden, einschließlich, jedoch
nicht beschränkt
auf, Mikroinjektion in Frosch-Oozyten, wobei die Mikroinjektion
in Frosch-Oozyten bevorzugt ist.
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Nach
der Expression des/der HPV18-Proteine) in einer Wirtszelle kann
HPV18-Protein gewonnen werden, um HPV18 in gereinigter Form bereitzustellen.
Mehrere HPV18-Reinigungsverfahren sind verfügbar und zur Anwendung geeignet.
Wie hier beschrieben, kann rekombinantes HPV18-Protein aus Zellysaten
und Extrakten durch verschiedene Kombinationen von oder individuelle
Anwendung von Salzfraktionierung, Ionenaustauschchromatographie,
Größenausschlußchromatographie,
Hydroxylapatit-Adsorptionschromatographie und Chromatographie hydrophober
Wechselwirkung gereinigt werden.
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Darüber hinaus
kann rekombinantes HPV18 von anderen zellulären Proteinen mit Hilfe einer
Immunaffinitätssäule, die
mit monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern hergestellt wurde, welche
für naszierendes
HPV18 voller Länge
oder Polypeptid-Fragmente von HPV18 spezifisch sind, abgetrennt
werden.
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Es
können
Kits hergestellt werden, welche die HPV18-DNA, HPV18-RNA oder das
HPV18-Protein enthalten.
Solche Kits werden zum Nachweis von DNA eingesetzt, welche mit HPV18-DNA
hybridisiert, oder zum Nachweis der Anwesenheit von HPV18-Proteinen)
oder -Peptidfragmenten in einer Probe. Eine solche Charakterisierung
ist für
eine Vielzahl von Zwecken von Nutzen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, gerichtsmedizinische
Analysen und epidemiologische Studien.
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Für eine Kombinationsbehandlung
mit mehr als einem Wirkstoff, wobei die Wirkstoffe in separaten
Dosierungsformulierungen vorliegen, können die Wirkstoffe gleichzeitig
verabreicht werden oder sie können
jeweils zu separaten versetzten Zeiten verabreicht werden.
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Der
Dosierungsplan wird entsprechend einer Vielfalt von Faktoren ausgewählt, welche
Typ, Spezies, Alter, Gewicht, Geschlecht und medizinischen Zustand
des Patienten, die Schwere des zu behandelnden Krankheitszustandes,
den Verabreichungsweg, die Nieren- und Leberfunktion des Patienten
und die speziell eingesetzte Verbindung einschließen. Ein
durchschnittlich befähigter
Arzt kann unschwer die wirksame Menge des Arzneiwirkstoffes, welche
zur Verhinderung, Entgegenwirkung oder zum Stillstandbringen des
Krankheitsfortschritts erforderlich ist, bestimmen und verschreiben.
Eine optimale Präzision
bei der Erzielung von Arzneiwirkstoffkonzentrationen innerhalb des
Bereichs, der eine Wirksamkeit ohne Toxizität ergibt, erfordert einen Plan,
der auf der Kinetik der Verfügbarkeit
des Arzneiwirkstoffs für
Zielstellen basiert. Dies beinhaltet eine Berücksichtigung der Verteilung,
des Gleichgewichts und der Eliminierung eines Arzneiwirkstoffs.
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BEISPIEL 1
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Klonierung des HPV18-Genoms
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Genomische
Gesamt-DNA wurde aus der von einem Human-Gebärmutterhalskarzinom abgeleiteten Zellinie
SW756 (Freedman, R.S., et al., 1982, In Vitro, Bd. 18, S. 719–726) nach
Standardverfahren hergestellt. Die DNA wurde mit EcoR1 verdaut und
einer Elektrophorese durch ein 0,8%iges präparatives Agarosegel mit niedriger
Schmelztemperatur unterworfen. Eine Gelscheibe wurde ausgeschnitten,
welche DNA-Fragmenten von etwa 12 kb Länge entsprach. Die Agarose
wurde mit Hilfe von AgaraseTM-Enzym (Boehringer
Mannheim, Inc.) verdaut und die größenfraktionierte DNA wurde
gefällt,
dephosphoryliert und mit EcoR1-verdauten
Lambda-EMBL4-Armen (Stratagene, Inc.) ligiert. Die Lambda-Bank wurde
mit Hilfe des Gigapack II Gold-Verpackungsextrakts (Stratagene,
Inc.) verpackt. HPV18-positive Klone wurden mit Hilfe einer 700
bp langen HPV18-L1-DNA-Sonde identifiziert, welche mittels Polymerasekettenreaktion
(PCR) unter Einsatz von SW756-DNA als Matrize und Oligonukleotid-Primern,
welche auf Grundlage der veröffentlichten HPV18-L1-DNA-Sequenz
(Cole und Danos, 1987, J. Mol. Biol., Bd. 193:599–608; Genbank-Zugangs-Nr. X05015)
konstruiert worden waren, hergestellt wurde. Ein HPV18-positiver
Lambda-Klon, welcher ein 12-kb-EcoR1-Fragment-Insert enthielt, wurde
isoliert und als # 187–1
bezeichnet.
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BEISPIEL 2
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Konstruktion von Hefe-Expressionsvektoren
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Der
offene Leserahmen (ORF) von HPV18-L1 wurde mittels PCR unter Verwendung
des Klons # 187–1
als Matrize, von Vent-Polymerase
TM (New
England Biolabs, Inc.), 10 Amplifizierungszyklen (94° C, 1 Min.;
50° C, 1
Min.; 72° C,
2 Min.) und den folgenden Oligonukleotid-Primern, welche flankierende
Bglll-Stellen (unterstrichen) enthalten, amplifiziert: Sense-Primer:
Antisense-Primer:
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Der
Sense-Primer führt
eine untranslatierte Hefe-Leadersequenz (Kniskern, et al., 1986,
Gene, Bd. 46:135–141)
unmittelbar stromaufwärts
des HPV18-L1-Initiations-Methionin- Codons (in Fettdruck hervorgehoben)
ein. Das 1,5-kbp-L1-PCR-Produkt wurde mit Bglll verdaut und gelgereinigt.
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Der
pGAL1-10-Hefe-Expressionsvektor wurde konstruiert durch Isolierung
eines 1,4-kbp-Sphl-Fragments
aus einem bidirektionalen pUC18/GAL-Promotorplasmid, welches die
divergenten Saccharomyces cerevisiae-GAL1-GAL10-Promotoren aus dem
Plasmid pBM272 enthält
(zur Verfügung
gestellt von Mark Johnston, Washington University, St. Louis, MO).
Die divergenten Promotoren sind auf jeder Seite von einer Kopie des
Hefe-ADH1-Transkriptionsterminators,
einer BamHl-Klonierungsstelle, die sich zwischen dem GAL1-Promotor
und einer ersten Kopie des ADH1-Transkriptionsterminators befindet,
und einer zwischen dem GAL10-Promotor und der zweiten Kopie des
ADH1-Transkriptionsterminators befindlichen Smal-Klonierungsstelle
flankiert. Ein Hefe-Shuttle-Vektor, bestehend aus pBR322, dem Hefe-LEU2d-Gen
und dem Hefe-2μ-Plasmid
(Gabe von Benjamin Hall, University of Washington, Seattle, WA),
wurde mit Sphl verdaut und mit dem 1,4-kbp-Sph1-Fragment des divergenten GAL-Promotors
ligiert, was zu pGAL1-10 führte.
pGAL1-10 wurde mit BamHl linearisiert, welches zwischen dem GAL1-Promotor
und dem ADH1-Transkriptionsterminator spaltet.
Der mit BamH1 verdaute Vektor und das mit Bglll verdaute HPV18-L1-PCR-Fragment
wurden ligiert und zur Transformation von E. coli-DH5-Zellen (Gibco
BRL, Inc.) eingesetzt. Ein pGAL1-10-Plasmid, welches das HPV18-L1-Gen
enthält,
wurde isoliert und erhielt die Bezeichnung p191-6.
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Ein
Hefe-Expressionsvektor, welcher die HPV18-L1- und -L2-Gene beide
koexprimiert, wurde konstruiert. Das Plasmid p191-6 (pGAL1-10 +
HPV18-L1) wurde mit Smal verdaut, welches zwischen dem GAL10-Promotor
und dem ADH1-Transkriptionsterminator spaltet. Das 1,4-kbp-HPV18-L2-Gen
wurde mittels PCR wie oben beschrieben amplifiziert unter Verwendung
der folgenden Oligonukleotid-Primer, welche flankierende Smal-Stellen
(unterstrichen) enthalten: Sense-Primer:
Antisense-Primer:
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Der
Sense-Primer führt
eine untranslatierte Hefe-Leadersequenz (Kniskern et al., 1986,
oben) unmittelbar stromaufwärts
des HPV18-L2-Initiations-Methionin-Codons (in Fettdruck hervorgehoben)
ein. Das PCR-Fragment wurde mit Smal verdaut, gelgereinigt und mit
dem Smal-verdauten p191-6-Plasmid ligiert. Ein pGAL1-10-Plasmid,
welches die HPV18-L1- und -L2-Gene beide enthielt, wurde isoliert
und als p195-11 bezeichnet.
-
BEISPIEL 3
-
Typenbestimmung klinischer
Proben
-
Gebärmutterhalsbiopsie-Proben
wurden am Veterans Administration Medical Center in Indianapolis, IN
(Gefälligkeit
von Dr. Darron Brown) und am Albert Einstein Medical Center in Philadelphia,
PA (Gefälligkeit von
Dr. Joan Adler) gesammelt und bei –20° C eingefroren. DNA wurde isoliert
wie von Brown of al., 1993 (Brown, D., of al., 1993, J. Clin. Microbiol.,
Bd. 31:2667–2673)
beschrieben. In Kürze,
die klinischen Proben wurden mit einem Braun-Mikro-Dismembrator II (B.
Braun Instruments, Melsungen, Deutschland) aufgearbeitet und in
Puffer solubilisiert, der 10 mM EDTA und 0,6 % (Gew./Vol.) Natriumdodecylsulfat
(SDS) enthielt. Die Proben wurden auf 20 mM Tris, pH 7,4, eingestellt
und Protein wurde mit 50 μg/ml
Proteinase K in Gegenwart von 0,1 μg/ml RNase A verdaut, gefolgt
von Extraktion mit Phenol/-Chloroform/Isoamylalkohol.
DNA wurde ethanolgefällt
und durch Spektrophotometrie quantitativ bestimmt.
-
Die
DNA-Proben wurden mittels PCR und Southernblot-Analysen hinsichtlich
der Anwesenheit von HPV18 gescreent. Ein 256-bp-Segment des HPV18-L1-ORF
wurde mittels PCR unter Verwendung der folgenden Oligonukleotid-Primer
amplifiziert: Sense-Primer:
Antisense-Primer:
-
-
Die
PCR-Bedingungen waren entsprechend den Empfehlungen des Herstellers
für den
AmpIiTaqTM-DNA-Polymerase/GeneAmpTM-Kit (Perkin Elmer Corp.), mit Ausnahme
dessen, daß 0,5 μl klinischer Proben-DNA
als Matrize eingesetzt wurden und sich 10 pmol eines jeden Primers,
2 mM dNTPs und 2,0 mM MgCl2 in der endgültigen Reaktionsmischung
befanden. Einem Denaturierungsschritt von 2 Min. bei 94° C folgten
40 Zyklen Amplifizierung (94° C,
1 Min.; 45° C,
1 Min.; 72° C,
1 Min.).
-
Die
PCR-Produkte wurden einer Elektrophorese durch ein 3,0%iges Agarosegel
unterworfen, auf Nylonmembranen geblottet und mit einer 32P-markierten HPV18-L1-spezifischen Oligonukleotid-Sonde
hybridisiert.
-
BEISPIEL 4
-
DNA-Sequenzierung von L1-
und L2-Genen
-
Die
HPV18-L1- und -L2-Gene in den Klonen # 187-1, p191-6 und p195-11
wurden mit Hilfe des PRIZM-Sequenzierungskits und des automatischen
DNA-ABI-Sequenzierers # 373A (Applied Biosystems) sequenziert. Um
eine Konsensus-HPV18-Sequenz zu erhalten, wurden Teile der L1-Gen-DNA
mittels PCR aus humanen klinischen Isolaten amplifiziert, sequenziert
und mit den beanspruchten und veröffentlichten Sequenzen verglichen.
Ein 256-bp-Fragment (Nukleotide 817–1072) wurde von jedem klinischen
DNA-Isolat für
diesen Zweck unter Verwendung der in Beispiel 3 beschriebenen Oligonukleotide
und Erwärmungszyklen
amplifiziert. Die folgenden Primer
![Figure 00130001](https://patentimages.storage.***apis.com/53/0c/bc/798b64d92c1164/00130001.png)
wurden zur Amplifizierung
eines aminoterminalen 432-bp-Abschnitts von L1-DNA (Nukleotide 1-431)
unter Anwendung der in Beispiel 3 beschriebenen Erwärmungszyklen
eingesetzt. Beide PCR-Produkte wurden separat mit dem Plasmid pCRll
(Invitrogen Corp.) und Verwendung der vom Hersteller empfohlenen
Reagenzien und Prozeduren ligiert. Plasmid-DNA wurde aus den Transformanten
isoliert und diejenigen, welche EcoRl-Inserts enthielten, wurden
sequenziert.
-
BEISPIEL 5
-
Analyse von DNA-Sequenzen
und abgeleiteten Aminosäuresequenzen
-
Die
Nukleotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz (AS) des beanspruchten
HPV18-L1 sind in 1 gezeigt. Die DNA-Sequenz
wurde von einem Konsensus der Klone # 187-1, p191-6 und p195-11
abgeleitet. Ein Vergleich der beanspruchten HPV18-L1-Nukleotidsequenz
mit der veröffentlichten
HPV18-L1-Sequenz (Genbank-Zugangs-Nr. X05015) identifizierte 20
by Abweichungen von 1524 bp. Fünf
der Nukleotidaustausche (C zu G bei Position 89, C zu A bei 263,
C zu G bei 848, G zu A bei 967 und C zu G bei 1013) resultieren
in Aminosäuresubstitutionen.
Die Unterschiede von fünf
Resten gegenüber
der veröffentlichten
Sequenz sind P zu R an den AS-Positionen 30, 283 und 338, T zu N
bei AS 88 und V zu I bei AS 323 (2).
Die Positionen 88 und 323 stellen konservative Austausche dar, während die
drei P-zu-R-Austausche die physikalischen Eigenschaften des exprimierten
L1-Proteins substantiell
verändern
können.
-
Ein
Vergleich der von klinischen Isolaten (Nrn. 354, 556, 755, 697,
795 und 23) erhaltenen Aminosäuresequenzen
mit der beanspruchten Sequenz und der veröffentlichten Sequenz ist in 2 gezeigt. Es gibt vier
Positionen, an denen sich die klinischen Isolate und die beanspruchte
Sequenz von der veröffentlichten Sequenz
unterscheiden. Die Positionen 30, 283 und 338 kodieren für Arginin
(R) in allen bisher gefundenen Isolaten, einschließlich der
beanspruchten Sequenz. Dies steht in scharfem Gegensatz zur veröffentlichten
Sequenz, die Proline (P) an jeder dieser Stellen aufweist. Ferner
ist Position 88 ein Asparagin (N) in den Isolaten und der beanspruchten
Sequenz, jedoch ein Threonin (T) in der veröffentlichten Sequenz. Die letzte
Abweichung, Position 323, wurde als Valin (V) in vielen der klinischen
Isolaten und der veröffentlichten
Sequenz gegenüber
einem Isoleucin (I) in der beanspruchten Sequenz und einem der Isolate
(# 23) befunden. Die Schlußfolgerung
ist, daß die
beanspruchte Sequenz die überwiegenden
viralen Sequenzen reflektiert, welche mit klinischen Infektionen
assoziiert sind, und die Abwesenheit von Isolaten, welche an irgendeiner
der Positionen 30, 283 oder 338 Proline der veröffentlichten Sequenz enthalten,
legt nahe, daß der
veröffentlichte
Klon entweder ein Artefakt oder ein irrelevanter Subtyp ist.
-
Die
Nukleotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz von HPV18-L2 wurden
von einer Konsensussequenz der Klone # 187-1 und p195-11 abgeleitet
und sie sind in 3 gezeigt.
Ein Vergleich der L2-Nukleotidsequenz mit der veröffentlichten
HPV18-Sequenz (Genbank-Zugangs-Nr.
X05015) identifizierte 40 by Abweichungen von 1389 bp. Die Basenpaarunterschiede
resultieren in 14 Änderungen
auf der Aminosäureebene:
P zu S bei AS 29, P zu N bei AS 33, A zu S bei AS 177, D zu E bei
AS 266, D zu N bei AS 270, D zu G bei AS 346, M zu 1 bei AS 355,
V zu M bei AS 359, S zu P bei AS 365, F zu S bei AS 369, F zu V
bei AS 371, F zu S bei AS 372, K zu T bei AS 373 und S zu P bei
AS 409.
-
BEISPIEL 6
-
Herstellung von HPV18-L2-Antiserum
-
HPV18-L2-spezifische
Antikörper
wurden in Ziegen unter Verwendung eines in E. coli exprimierten trpE-HPV18-L2-Fusionsproteins
hergestellt. Der Vollängen-L2-ORF
wurde mittels PCR unter Verwendung von Oligonukleotid-Primern, die
Hindlll- und BamHl-Stellen bereitstellten, welche die 5'- bzw. 3'-Enden flankierten, amplifiziert.
Das L2-Fragment wurde in das mit Hindlll-BamHl verdaute Expressionsplasmid
pATH23 (Koerner et al., 1991, Meth. Enzymol. Bd. 194:477–490) inseriert.
Das Fusionsprotein wurde in E. coli-RR1-Zellen (Gibco BRL, Inc.)
nach Induktion mit 3-β-Indolacrylsäure exprimiert.
Die unlösliche
Fraktion wurde mittels SDS-PAGE, gefolgt von Anfärbung mit Coomassieblau, analysiert.
Das trpE-L2-Fusionsprotein
machte den größten Teil
der unlöslichen
E. coli-Fraktion aus. Ziegen wurden mit dem trpE-L2-Fusionsprotein
nach dem Standardprotokoll von Pocono Rabbit Farm und Laboratory,
Inc. für
Fusionsproteinantigene (Protein Rabbit Farm, Canadensis, PA) immunisiert.
-
BEISPIEL 7
-
Herstellung des Hefestamms
U9
-
Der
Saccharomyces cerevisiae-Stamm 2150-2-3 (MATalpha, leu2-04, ade1,
cir°) wurde
von Dr. Leland Hartwell (University of Washington, Seattle, WA)
erhalten. Zellen des Stamms 2150-2-3 wurden über Nacht bei 30° C in 5 ml
YEHD-Medium (Carty et al., J. Ind Micro 2 (1987), 117–121) vermehrt.
Die Zellen wurden dreimal in sterilem, destilliertem Wasser gewaschen,
in 2 ml sterilem destilliertem Wasser resuspendiert und 0,1 ml Zellsuspension
wurde auf jede von sechs 5-Fluorotsäure (FOA)-Platten ausplattiert,
um hinsichtlich ura3-Mutanten
zu selektionieren (Cold Spring Harbor Laboratory Manual for Yeast
Genetics). Die Platten wurden bei 30° C inkubiert. Das Medium enthielt
auf 250 ml destilliertes Wasser: 3,5 g Difco-Hefe-Stickstoffbase
ohne Aminosäuren
und Ammoniumsulfat, 0,5 g 5-Fluorotsäure, 25 mg Uracil und 10,0
g Dextrose.
-
Das
Medium wurde mittels Filtration durch 0,2-μm-Membranen sterilisiert und
dann mit 250 ml 4%igem Bacto-Agar (Difco), gehalten bei 50° C, 10 ml
einer 1,2-mg/ml-Lösung
von Adenin und 5 ml L-Leucin-Lösung (180
mg/50 ml) gemischt. Das resultierende Medium wurde mit 20 ml pro
Petrischale aufgeteilt.
-
Nach
5 Tagen Inkubation waren zahlreiche Kolonien erschienen. Einzelkolonien
wurden isoliert durch erneutes Ausstreichen von Kolonien von den
ursprünglichen
FOA-Platten auf frische FOA-Platten, welche dann bei 30° C inkubiert
wurden. Eine Anzahl Kolonien von dem zweiten Satz von FOA-Platten
wurde durch Replika-Plattierung auf sowohl YEHD-Platten als auch
Uracil-Minus-Platten hinsichtlich der Anwesenheit der ura3-Mutation
getestet. Das gewünschte
Ergebnis war gutes Wachstum auf YEHD- und kein Wachstum auf Uracil-Minus-Medium. Ein Isolat
(U9) wurde erhalten, welches diese Eigenschaften zeigte. Es wurde
als eingefrorene Glycerinstammlösung
(Stamm # 325) bei –70° C für die spätere Verwendung
gelagert.
-
BEISPIEL 8
-
Herstellung eines Vektors
für die
Unterbrechung des Hefe-MNN9-Gens
-
Zur
Herstellung eines Vektors für
die Unterbrechung des MNN9-Gens war es erforderlich, zuerst das MNN9-Gen
aus genomischer S. cerevisiae-DNA zu klonieren. Dies wurde erreicht durch
eine Standard-Polymerasekettenreaktion (PCR)-Technik. Ein 5'-Sense-Primer und
ein 3'-Antisense-Primer
für die
PCR der für MNN9
kodierenden Vollängen-Sequenz
wurden auf Grundlage der veröffentlichten
Sequenz für
das Hefe-MNN9-Gen konstruiert (Zymogenetics: EP-Patentanmeldung
Nr. 88 117 834.7, Veröffentlichungsnummer 0-314-096-A2).
Es wurden die folgenden Oligodesoxynukleotid-Primer eingesetzt,
welche flankierende Hindlll-Stellen (unterstrichen) enthielten:
![Figure 00160001](https://patentimages.storage.***apis.com/47/d4/0e/bfd886085b4ca7/00160001.png)
Das initiierende
Methionincodon für
das MNN9-Gen ist in Fettdruck hervorgehoben. Die PCR erfolgte unter Verwendung
von genomischer DNA aus dem S. cerevisiae-Stamm JRY188 als Matrize,
Taq-DNA-Polymerase (Perkin Elmer) und 25 Amplifizierungszyklen (94° C, 1 Min.,
37° C, 2
Min., 72° C,
3 Min.). Das resultierende 1,2-kbp-PCR-Fragment wurde mit Hindlll
verdaut, gelgereinigt und mit Hindlll-verdautem, mit alkalischer
Phosphatase behandeltem pUC13 (Pharmacia) ligiert. Das resultierende
Plasmid wurde als p1183 bezeichnet.
-
Zur
Unterbrechung des MNN9-Gens mit dem Hefe-URA3-Gen wurde das Plasmid
pBR322-URA3 (welches
das 1,1-kbp-Hindlll-Fragment, kodierend für das S. cerevisiae-URA3-Gen,
in die Hindlll-Stelle von pBR322 subkloniert enthält) mit
Hindlll verdaut und das 1,1-kbp-DNA-Fragment, welches das funktionelle URA3-Gen
trug, wurde gelgereinigt, mit T4-DNA-Polymerase glattendig gemacht und dann
mit dem Pmll-verdauten Plasmid p1183 (Pmll spaltet innerhalb der
für MNN9
kodierenden Sequenz) ligiert. Das resultierende Plasmid p1199 enthält eine
Unterbrechung des MNN9-Gens durch das funktionelle URA3-Gen.
-
BEISPIEL 9
-
Konstruktion des U9-Derivat-Stammes
1372 welcher eine Unterbrechung des MNN9-Gens enthält
-
Zur
Unterbrechung des MNN9-Gens in dem Stamm U9 (# 325) wurden 30 μg des Plasmids
p1199 mit Hindlll verdaut, um eine lineare mnn9::URA3-Unterbrechungskassette
zu schaffen. Zellen des Stamms 325 wurden mit der Hindlll-verdauten
p1199-DNA nach dem Sphäroplasten-Verfahren
(Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929–1933) transformiert
und Transformanten wurden auf einem synthetischen Agarmedium, dem
Uracil fehlte und das 1,0 M Sorbit enthielt, selektioniert. Das
synthetische Medium enthielt pro Liter destilliertes Wasser: Agar,
20 g, Hefe-Stickstoffbase w/o Aminosäuren, 6,7 g, Adenin, 0,04 g,
L-Tyrosin, 0,05 g, Sorbit, 182 g, Glucose, 20 g, und Leucin-Minus-Lösung #2,
10 ml. Leucin- Minus-Lösung #2
enthält
pro Liter destilliertes Wasser: L-Arginin, 2 g, L-Histidin, 1 g,
L-Leucin, 6 g, L-Isoleucin, 6 g, L-Lysin, 4 g, L-Methionin, 1 g,
L-Phenylalanin, 6 g, L-Threonin, 6 g, L-Tryptophan, 4 g.
-
Die
Platten wurden bei 30° C
fünf Tage
lang inkubiert, zu welchem Zeitpunkt zahlreiche Kolonien erschienen
waren. Chromosomale DNA-Präparationen
wurden von 10 Kolonien hergestellt und dann mit EcoRl plus Hindlll
verdaut. Die DNA-Verdauungen wurden dann mittels Southernblots (J.
Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) unter Verwendung des 1,2-kbp-Hindlll-Fragments, welches
das MNN9-Gen (isoliert aus dem Plasmid p1199) trägt, als Sonde beurteilt. Ein
Isolat wurde identifiziert (Stamm # 1372), welches die erwarteten
DNA-Banden-Verschiebungen
auf dem Southernblot sowie die extreme Klumpigkeit zeigte, die typischerweise
von mnn9-Mutanten gezeigt wird.
-
BEISPIEL 10
-
Konstruktion eines Vektors
für die
Unterbrechung des Hefe-HIS3-Gens
-
Zur
Konstruktion einer Unterbrechungskassette, bei der das S. cerevisiae-HIS3-Gen
durch das URA3-Gen unterbrochen wird, wurde das Plasmid YEp6 (K.
Struhl et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 76:1035) mit BamHl
verdaut und das 1,7-kbp-BamHl-Fragment, welches das HIS3-Gen trägt, wurde
gelgereinigt, mit T4-DNA-Polymerase glattendig gemacht und mit pUC18
ligiert, welches zuvor mit BamHl verdaut und mit T4-DNA-Polymerase
behandelt worden war. Das resultierende Plasmid (als p1501 oder
pUC18-HIS3 bezeichnet) wurde mit Nhel verdaut (welches innerhalb
der für
HIS3 kodierenden Sequenz spaltet) und das Vektorfragment wurde gelgereinigt,
mit T4-DNA-Polymerase glattendig gemacht und dann mit alkalischer
Kalbsdarm-Phosphatase behandelt. Das URA3-Gen wurde aus dem Plasmid
pBR322-URA3 durch Verdauung mit Hindlll isoliert und das 1,1-kbp-Fragment,
welches das URA3-Gen trug, wurde gelgereinigt, mit T4-DNA-Polymerase
glattendig gemacht und mit dem obigen pUC18-HIS3-Nhel-Fragment ligiert.
Das resultierende Plasmid (als pUC18-his3::URA3 oder p1505 bezeichnet)
enthält
eine Unterbrechungskassette, bei der das Hefe-HIS3-Gen durch das
funktionelle URA3-Gen unterbrochen ist.
-
BEISPIEL 11
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Konstruktion eines Vektors
für die
Unterbrechung des Hefe-PR81-Gens durch das HIS3-Gen
-
Das
Plasmid FP8ΔH,
welches das S. cerevisiae-PRB1-Gen trägt, wurde von Dr. E. Jones
von der Carnegie-Mellon University (C. M. Moehle et al., 1987, Genetics
115:255–263) zur
Verfügung
gestellt. Es wurde mit Hindlll plus Xhol verdaut und das 3,2-kbp-DNA-Fragment,
welches das PRB1-Gen trug, wurde gelgereinigt und durch Behandlung
mit T4-DNA-Polymerase
glattendig gemacht. Das Plasmid pUC18 wurde mit BamHl verdaut, gelgereinigt
und durch Behandlung mit T4-DNA-Polymerase glattendig gemacht. Das
resultierende Vektorfragment wurde mit dem obigen PRB1-Gen-Fragment
ligiert, um das Plasmid pUC18-PRB1
zu ergeben. Das Plasmid YEp6, welches das HIS3-Gen enthält, wurde
mit BamHl verdaut. Das resultierende 1,7-kbp-BamHl-Fragment, welches
das funktionelle HIS3-Gen trägt,
wurde gelgereinigt und dann durch Behandlung mit T4-DNA-Polymerase
glattendig gemacht. Das Plasmid pUC18-PRB1 wurde mit EcoRV plus
Ncol verdaut, welches innerhalb der für PRB1 kodierenden Sequenz
spaltet und die aktive Stelle der Protease B und flankierende Sequenz
entfernt. Das 5,7-kbp-EcoRV-Ncol-Fragment, welches die restlichen
5'- und 3'-Abschnitte der für PRB1 kodierenden
Sequenz in pUC18 trägt,
wurde gelgereinigt, durch Behandlung mit T4-DNA-Polymerase glattendig
gemacht, mit alkalischer Kalbsdarm-Phosphatase dephosphoryliert
und mit dem oben beschriebenen glattendigen HIS3-Fragment ligiert.
Das resultierende Plasmid (als pUC18-prbl::HIS3 bezeichnet, Stamm #
1245) enthält
das funktionelle HIS3-Gen anstelle des PRB1-Gen-Abschnitts, welcher
oben deletiert worden war.
-
BEISPIEL 12
-
Konstruktion eines U9-verwandten
Hefestammes der Unterbrechungen sowohl des MNN9-als auch des PRB1-Gens enthält
-
Der
U9-verwandte Stamm 1372, welcher eine MNN9-Gen-Unterbrechung enthält, wurde
in Beispiel 9 beschrieben. Klonale Isolate des Stammes 1372 wurden
einer Passage auf FOA-Platten
(wie in Beispiel 7 beschrieben) unterworfen, um ura3-Mutanten zu
selektionieren. Eine Anzahl von ura3-Isolaten des Stammes 1372 wurde
erhalten und ein spezielles Isolat (Stamm 12930-190-S1-1) wurde
für die
nachfolgende Unterbrechung des HIS3-Gens ausgewählt. Der pUC18-his3::URA3-Genunterbrechungsvektor
(p1505) wurde mit Xbal plus EcoRl verdaut, um eine lineare his3::URA3-Unterbrechungskassette
zu schaffen, und zur Transformation des Stammes 12930-190-S1-1 nach
dem Lithiumacetatverfahren [Methods in Enzymology, 194:290 (1991)] verwendet.
Ura+-Transformanten wurden auf synthetischem
Agarmedium ohne Uracil selektioniert, für klonale Isolate auf demselben
Medium erneut ausgestrichen und dann auf Medium, dem entweder Uracil
oder Histidin fehlte, replikaplattiert, um hinsichtlich derjenigen
Isolate zu screenen, welche sowohl Ura+ als
auch His– waren. Ein
Isolat (Stamm 12930-230-1) wurde für die anschließende Unterbrechung
des PRB1-Gens ausgewählt.
Der PRB1-Genunterbrechungsvektor (pUC18-prb1::HIS3, Stamm # 1245)
wurde mit Sacl plus Xbal verdaut, um eine lineare prb1::HIS3-Unterbrechungskassette zu
schaffen, und zur Transformation des Stammes 12930-230-1 nach dem
Lithiumacetat-Verfahren
eingesetzt. His+-Transformanten wurden auf
Agarmedium ohne Histidin selektioniert und auf demselben Medium
für klonale
Isolate erneut ausgestrichen. Genomische DNA wurde aus einer Reihe
der resultierenden His+-Isolate präpariert,
mit EcoRl verdaut und dann auf 0,8%igen Agarosegelen elektrophoresiert.
Southernblot-Analysen erfolgten dann mit Hilfe einer radioaktiv markierten
617-bp-Sonde für
das PRB1-Gen, welche mittels PCR unter Verwendung der folgenden
Oligodesoxynukleotid-Primer hergestellt worden war:
-
-
Es
wurden 11 Isolate erhalten, welche die erwartete Hybridisierung
der Sonde mit einem prb1::HIS3-DNA-Fragment von 2,44 kbp zeigten.
Dies stand im Gegensatz zur Hybridisierung der Sonde mit dem 1,59-kbp-Fragment
für das
Wildtyp-PRB1-Gen. Eines dieser Isolate, enthaltend die gewünschte prbl::HIS3-Unterbrechung,
wurde für
die weitere Verwendung ausgewählt
und als Stamm # 1558 bezeichnet.
-
BEISPIEL 13
-
Expression von HPV18-L1
und -L2 in Hefe
-
Die
Plasmide p191-6 (pGAL1-10 + HPV18-L1) und p195-11 (pGAL1-10 + HPV18-L1
+-L2) wurden zur Transformation des S. cerevisiae-Stammes # 1558
(MATa, leu2-04, prbl::HIS3, mnn9::URA3, adel, cir°) eingesetzt.
Klonale Isolate wurden bei 30° C
in YEHD-Medium, enthaltend 2 % Galactose, für 88 Stunden gezüchtet. Nach
dem Ernten der Zellen wurden die Zellpellets mit Glasperlen aufgebrochen
und die Zellysate hinsichtlich Expression von HPV18-L1- und/oder
HPV18-L2-Protein durch Immunoblot-Analyse analysiert. Proben, die
25 μg zelluläres Gesamtprotein
enthielten, wurden auf 10%igen Tris-Glycin-Gelen (Novex, Inc.) unter
denaturierenden Bedingungen elektrophoresiert und auf Nitrocellulosefilter
elektrogeblottet. Das L1-Protein wurde mit Hilfe von Kaninchen-Antiserum,
das gegen ein trpE-HPV11-L1-Fusionsprotein induziert worden war,
als primärem
Antikörper
(Brown of al., 1994, Virology 201:46–54) und an Meerrettich-Peroxidase
(HRP) gekoppeltem Antikaninchen-Esel-IgG (Amersham, Inc.) als sekundärem Antikörper immunologisch
nachgewiesen. Die Filter wurden mit dem chemolumineszierenden ECLTM-Detection Kit (Amersham, Inc.) auf-gearbeitet.
Eine L1-Protein-Bande von 50–55
kD wurde sowohl in den L1- als auch den L1+L2-Coexpressor-Hefeklonen
(Stämme 1725
bzw. 1727) und nicht in der negativen Kontrolle (pGAL1-10 ohne L1-
oder L2-Gene) nachgewiesen (4).
-
Das
HPV18-L2-Protein wurde mittels Western-Analyse unter Verwendung
von polyklonalem Ziegen-Antiserum, induziert gegen ein trpE-HPV18-L2-Fusionsprotein,
als primärem
Antikörper,
gefolgt von HRP-konjugiertem Antiziegen-Kaninchen-IgG (Kirkegaard
and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) nachgewiesen. Die Filter
wurden wie oben beschrieben aufgearbeitet. Das L2-Protein wurde
als eine 75-kD-Proteinbande in dem L1+L2-Coexpressor-Hefeklon (Stamm
1727), jedoch weder in der negativen Kontrolle noch in dem L1-Expressorklon nachgewiesen
(5).
-
BEISPIEL 14
-
Fermentation von HPV18-L1
(Stamm 1725) und 18-L1+ΔL2
(Stamm 1727)
-
Das
Oberflächenwachstum
einer Plattenkultur der Stämme
1725 und 1727 wurde steril auf ein leucin-freies flüssiges Medium überführt, das
(pro 1) enthielt: 8,5 g Difco-Hefe-Stickstoff-Base ohne Aminosäuren und Ammoniumsulfat, 0,2
g Adenin, 0,2 g Uracil, 10 g Bernsteinsäure, 5 g Ammoniumsulfat, 40
g Glucose, 0,25 g L-Tyrosin, 0,1 L-Arginin, 0,3 g L-Isoleucin, 0,05
g L-Methionin, 0,2 g L-Tryptophan, 0,05 g L-Histidin, 0,2 g L-Lysin,
0,3 g L-Phenylalanin; dieses Medium wurde vor der Sterilisation
mit NaOH auf pH 5,0–5,3
eingestellt. Nach Wachstum bei 28° C,
250 UpM, auf einem Rotationsschüttler
wurden eingefrorene Kulturgefäße vorbereitet
durch Zugabe von sterilem Glycerin bis zu einer Endkonzentration
von 17 % (Gew./Vol.) vor der Lagerung bei –70° C (1 ml pro Kryogefäß). Impfgüter wurden
im gleichen Medium (500 ml pro 2-1-Kolben) entwickelt und gestartet
durch Überführung des
aufgetauten Inhalts eines eingefrorenen Kulturgefäßes und
Inkubation bei 28° C,
250 UpM, auf einem Rotationsschüttler
für 29
h. Bei den Fermentationen eines jeden Stammes wurde ein New Brunswick
SF-116-Fermenter mit einem Arbeitsvolumen von 10 l nach der Animpfung
verwendet. Das Produktionsmedium enthielt (pro l): 20 g Difco-Hefeextrakt,
10 g Sheffield-HySoy-Pepton, 20 g Glucose, 20 g Galactose, 0,3 ml
Union Carbide UCON LB-625-Antischaummittel;
das Medium wurde vor der Sterilisation auf pH 5,3 eingestellt. Der
gesamte Inhalt (500 ml) des 2-1-Impfkolbens wurde in den Fermenter überführt, welcher bei
28° C, 5
l Luft pro Minute, 400 UpM, 3,5 psi Druck inkubiert wurde. Die mechanische
Bewegung wurde erforderlichenfalls erhöht, um Niveaus an gelöstem Sauerstoff
von mehr als 40 % Sättigung
aufrechtzuerhalten. Der Fortschritt der Fermentation wurde durch
Offline-Glucose-Messungen
(Beckman Glucose 2-Analysator) und Online-Massenspektroskopie (Perkin-Elmer
1200) überwacht.
Nach 66 h Inkubation wurden Zelldichten von 9,5 bis 9,7 g Trockenzellgewicht
pro l erreicht. Die Kulturen wurden durch Hohlfaserfiltration (Amicon H5MP01-43-Kartusche
in einem Amicon DC-10 Filtrationssystem) auf etwa 2 l konzentriert,
mit 2 l phosphatgepufferter Salzlösung diafiltriert und vor dem
Abfüllen
in 500-ml-Zentrifugenflaschen weiter konzentriert (auf etwa 1 l).
Zellpellets wurden durch Zentrifugation bei 8.000 UpM (Sorval GS-3-Rotor)
für 20
Minuten bei 4° C gewonnen.
Nach Dekantierung des Überstands
wurden die Pellets (insgesamt 191 bis 208 g nasse Zellen) bis zur
Verwendung bei –70° C gelagert.
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BEISPIEL 15
-
Reinigung von rekombinanten
HPV Typ 18-L1-Kapsidproteinen
-
Alle
Schritte wurden bei 4° C
durchgeführt,
soweit nicht anders angegeben.
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Die
Zellen wurden bei –70° C eingefroren
gelagert. Eingefrorene Zellen (Naßgewicht = 126 g) wurden bei
20–23° C aufgetaut
und in 70 ml "Aufbruchpuffer" (20 mM Natriumphosphat,
pH 7,2, 100 mM NaCl) resuspendierf. Die Proteaseinhibitoren PMSF
und Pepstatin A wurden bis zu Endkonzentrationen von 2 mM bzw. 1,7 μM zugegeben.
Die Zellaufschlämmung
wurde bei einem Druck von etwa 16.000 psi durch 4 Passagen in einem
M110-Y-Microfluidizer (Microfluidics Corp., Newton, MA) aufgebrochen.
Die aufgebrochene Zellaufschlämmung
wurde mit 12.000 × g
40 Minuten lang zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen. Die Überstandsflüssigkeit,
L1-Antigen enthaltend, wurde gewonnen.
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Die Überstandsflüssigkeit
wurde 1:5 durch Zugabe von Puffer A (20 mM MOPS, pH 7,0) verdünnt und auf
eine Anionenaustausch-Einfangsäule
(9,0 cm ID × 3,9
cm) von Fractogel® EMD-TMAE-650 (M)-Harz
(EM Separations, Gibbstown, NJ), äquilibrierf in Puffer A, aufgetragen.
Nach einem Waschschritt mit Puffer A wurde das Antigen mit einem
Gradienten von 0–1,0
M NaCl in Puffer A eluiert. Die Säulenfraktionen wurden einem Assay
hinsichtlich Gesamtprotein nach dem Bradford-Verfahren unterworfen.
Die Fraktionen wurden dann bei gleichen Gesamtproteinbeladungen
durch Westernblots und SDS-PAGE mit Silberfärbungsnachweis analysiert.
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TMAE-Fraktionen,
die vergleichbare Reinheit und Anreicherung von L1-Protein zeigten,
wurden gepoolt. Das Antigen wurde durch Ammoniumsulfatfraktionierung
konzentriert. Die Lösung
wurde auf 35 % gesättigtes
Ammoniumsulfat eingestellt, indem festes Reagenz unter sanftem Rühren im
Verlauf von 10 Minuten zugegeben wurde. Die Probe wurde auf Eis
gestellt und die Präzipitation
4 Stunden lang fortschreiten gelassen. Die Probe wurde mit 16.000 × g 45 Minuten
lang zentrifugiert. Das Pellet wurde in 20,0 mL PBS (6,25 mM Natriumphosphat,
pH 7,2, 150 mM NaCl) resuspendiert.
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Das
resuspendierte Pellet wurde auf einer Größenausschlußsäule (2,6 cm ID × 89 cm)
von Sephacryl 500 HR-Harz (Pharmacia, Piscataway, NJ) chromatographiert.
Der Laufpuffer war PBS. Die Fraktionen wurden durch Westernblots
und SDS-PAGE mit Silberfärbungsnachweis
analysiert. Die reinsten Fraktionen wurden gepoolt. Der resultierende
Pool wurde in einer 50-ml-Rührzelle
unter Verwendung von 43-mm-YM-100-Flachfolienmembranen (Amicon,
Beverly, MA) bei einem N2-Druck von 4–6 psi konzentriert.
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Das
Endprodukt wurde durch Westernblots und SDS-PAGE unter Einsatz von
kolloidalem Coomassie-Nachweis analysiert. Das L1-Protein wurde
als zu 50–60
% homogen abgeschätzt.
Die Identität
des L1-Proteins wurde durch Westernblots bestätigt. Das Endprodukt wurde
in Aliquots aufgeteilt und bei –70° C gelagert.
Diese Prozedur führte
zu insgesamt 12,5 mg Protein.
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Bradford-Assay hinsichtlich
Gesamtprotein
-
Gesamtprotein
wurde mit Hilfe eines im Handel erhältlichen Coomassie Plus®-Kits
(Pierce, Rockford, IL) nachgewiesen. Die Proben wurden auf geeignete
Niveaus in Milli-Q-H2O verdünnt. Die
erforderlichen Volumina waren 0,1 ml und 1,0 ml für die Standard-
bzw. Mikroassay-Protokolle. Für
beide Protokolle wurde BSA (Pierce, Rockford, IL) eingesetzt, um
die Standardkurve zu erstellen. Der Assay wurde nach den Empfehlungen
des Herstellers durchgeführt.
Die Standardkurven wurden mit Hilfe von CricketGraph®-Software
auf einem Macintosh IIci-Computer graphisch dargestellt.
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SDS-PAGE und Westernblot-Assays
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Alle
Gele, Puffer und elektrophoretischen Apparaturen wurden von Novex
(San Diego, CA) erhalten und nach den Empfehlungen des Herstellers
betrieben. In Kürze,
die Proben wurde auf gleiche Proteinkonzentrationen in Milli-Q-H2O verdünnt
und 1:1 mit Probeninkubationspuffer gemischt, der 200 mM DTT enthielt.
Die Proben wurden 15 Minuten lang bei 100° C inkubiert und auf vorgegossene
12%ige Tris-Glycin-Gele aufgetragen. Die Proben wurden bei 125 V
für 1 h
45 Min. elektrophoresiert. Die Gele wurden unter Anwendung von entweder
Silberfärbung
mit einer Variation des Verfahrens von Heukeshoven und Dernick [Electrophoresis,
6 (1985) 103–112]
oder kolloidaler Coomassiefärbung
unter Verwendung eines im Handel erhaltenen Kits (Integrated Separation
Systems, Natick, MA) entwickelt.
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Für Westernblots
wurden die Proteine bei 25 V für
40 Minuten auf PVDF-Membranen überführt. Die Membranen
wurden mit Milli-Q-N2O gewaschen und luftgetrocknet.
Der primäre
Antikörper
war polyklonales Kaninchen-Antiserum, das gegen ein TrpE-HPV11-L1-Fusions protein
induziert worden war (Gabe von Dr. D. Brown). Frühere Experimente hatten gezeigt,
daß dieses
Antiserum mit HPV Typ 18-L1 auf Westernblots kreuzreagiert. Die
Antikörperlösung wurde
durch Verdünnung
von Antiserum in Blotting-Puffer (5 % fettfreie Milch in 6,25 mM
Natriumphosphat, pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,02 % NaN3)
hergestellt. Die Inkubation erfolgte für mindestens 1 Stunde bei 20–23° C. Der Blot
wurde für
jeweils 1 Minute in drei Austauschen von PBS (6,25 mM Natriumphosphat,
pH 7,2, 150 mM NaCl) gewaschen. Die Lösung eines sekundären Antikörpers wurde durch
Verdünnen
von Antikaninchen-Ziegen-IgG-Antiserum
als Konjugat verknüpft
mit alkalischer Phosphatase (Pierce, Rockford, IL) in Blotting-Puffer
hergestellt. Die Inkubation erfolgte unter denselben Bedingungen für mindestens
eine Stunde. Die Blots wurden wie zuvor gewaschen und ein Nachweis
mit Hilfe eines einstufigen NBT/BCIP-Substrats durchgeführt (Pierce,
Rockford, IL).
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BEISPIEL 16
-
Elektronenmikroskopische
Studien
-
Für die EM-Analyse
(Structure Probe, West Chester, PA) wurde ein Aliquot einer jeden
Probe auf ein kohlenstoffbeschichtetes 200-Mesh-Kupfergitter plaziert.
Ein Tropfen von 2%iger Phosphorwolframsäure (PTA), pH 7,0, wurde 20
Sekunden lang auf das Gitter plaziert. Die Gitter wurden vor der
Transmissions-Elektronenmikroskopie-Untersuchung lufttrocknen gelassen.
Die gesamte Mikroskopie wurde mit Hilfe eines JEOL-100CX-Transmissions-Elektronenmikroskops
(JEOL USA, Inc.) bei einer Beschleunigungsspannung von 100 kV durchgeführt. Die
gemachten mikroskopischen Aufnahmen haben eine 100.000fache Endvergrößerung.
Virusähnliche
Partikel wurden im Größenbereich
von 50–55
nm Durchmesser in der Hefeprobe beobachtet, welche das HPV18-L1-Expressionsplasmid
beherbergte (6). Keine
VLPs wurden in den Hefe-Kontrollproben beobachtet.
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BEISPIEL 17
-
Subklonierung der HPV18-cDNA
in Expressionsvektoren
-
Die
für HPV18
kodierende cDNA wird in mehrere Vektoren für die Expression des HPV18-Proteins in transfizierten
Wirtszellen und für
die in vitro-Transkription/Translation subkloniert. Diese Vektoren
umfassen pBluescript II SK+ (wobei die Expression durch T7- oder
T3-Promotoren gesteuert
wird), pcDNA I/Amp (wobei die Expression durch den Cytomegalovirus
(CMV)-Promotor gesteuert wird), pSZ9016-1 (wobei die Expression
durch den Promotor des langen terminalen Repeats (LTR) von HIV gesteuert
wird) und den Baculovirus-Transfervektor
pAcUW51 (PharMingen, Inc.) (wobei die Expression durch den Polyhedrin (PH)-Promotor gesteuert
wird) zur Herstellung von rekombinantem Baculovirus, welcher die
für HPV18
kodierende DNA-Sequenz enthält.
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- a) pBluescript II SK+:HPV18: Der Vollängen-HPV18-cDNA-Klon
wird aus Lambda-Bakteriophagen
durch limitierte Eco RI-Verdauung freigesetzt und in Eco RI-gespaltenes,
CIP-behandeltes pBluescript II SK+ ligiert. Es werden separate Subklone
gewonnen, worin die Sense-Orientierung von HPV18 entweder den T7- oder
den T3-Promotoren folgt.
- b) pcDNA I/Amp:HPV18: Zur Erleichterung einer direktionalen
Klonierung wird HPV18 aus einer gereinigten Plasmidpräparation
von pBluescript II SK+:HPV18, worin sich die HPV18-DNA-Sequenz stromabwärts des T7-Promotors
befindet, mit Hilfe von Eco RV und Xba I ausgeschnitten. Das resultierende
Eco RV, Hba I-HPV18-Fragment wird gereinigt und in Eco RV-gespaltenes,
Xba I-gespaltenes, CIP-behandeltes pcDNA I/Amp ligiert, so daß sich die
für HPV18
kodierende DNA stromabwärts
des CMV-Promotors befindet.
- c) pSZ9016-1:HPV18: HPV18 wird aus pBluescript II SK+:HPV18
ausgeschnitten durch limitierte Eco RI-Verdauung und anschließende Reinigung
des 1,3-kb-Fragments aus Agarosegelen. Das resultierende Eco RI-HPV18-Fragment
wird in Eco RI-gespaltenes, CIP-behandeltes pSZ9016-1 ligiert. Es
werden Subklone selektioniert, worin die Sense-Orientierung von
HPV18 stromabwärts
des HIV-LTR-Promotors ist.
- d) pAcUW51:HPV18-L1: Der Vollängen-HPV18-L1-ORF wurde mittels
PCR aus dem Klon # 187-1 mit Hilfe von Oligonukleotid-Primern, welche
flankierende Bglll-Stellen bereitstellten, amplifiziert. Das L1-Gen
wurde in die BamHl-Stelle des Baculovirus-Transfervektors pAcUW51
(PharMingen, Inc.) unter der Kontrolle des Polyhedrin-Promotors
inseriert. Rekombinante Baculoviren, welche die HPV18-L1-Expressionskassette enthielten,
wurden nach den im Pharmingen Manual beschriebenen Prozeduren erzeugt.
Rekombinante Klone wurden durch Grenzverdünnung und Dot-Blot-Hybridisierung
gereinigt.
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BEISPIEL 18
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Expression des HPV18-Polypeptids
durch in vitro-Transkription/Translation und durch Transfektion
in Wirtszellen
-
Vektoren,
die HPV-DNA-Sequenzen enthalten, werden zur Steuerung der Translation
des HPV18-Polypeptids in Kaninchen-Retikulozytenlysaten, Säuger-Wirtszellen
und in baculovirus-infizierten Insektenzellen eingesetzt. Die experimentellen
Prozeduren sind im wesentlichen die in den Anweisungen des Herstellers
angegebenen.
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a)
in vitro Transkription/Translation: pBluescript III SK+:HPV18-Plasmid-DNA
(mit HPV18 in der T7-Orientierung) wird durch Bam HI-Verdauung stromabwärts des
HPV18-Inserts linearisiert. Das linearisierte Plasmid wird gereinigt
und als Matrize für
eine Run-off-Transkription unter Verwendung von T7-RNA-Polymerase
in Gegenwart von m7G(5')ppp(5')G eingesetzt. Die
resultierenden, mit einem Cap versehenen HPV18-Transkripte werden
durch LiCl-Fällung
gereinigt und zur Steuerung der Translation von HPV18 in nuklease-vorbehandeltem
Kaninchen-Retikulozytenlysat in Gegenwart von L-[35S]Methionin
verwendet.
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b)
Expression in Säugerzellen:
Das HPV18-Protein wird in Säugerwirtszellen
nach der Transfektion mit entweder pcDNA I/Amp:HPV18 (unter der
Kontrolle des CMV-Promotors) oder pSZ9016-1:HPV18 (unter der Kontrolle
des HIV-LTR-Promotors) exprimiert. Im letzteren Fall (pSZ9016-1:HPV18)
werden die Zellen mit dem TAT-exprimierenden Plasmid pSZ90161:TAT
cotransfiziert. Für
beide HPV18-Expressionsplasmide werden COS-7-Zellen mittels entweder
DEAE-Dextran oder Lipofektion mit Lipofectamin (BRL) transfiziert.
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c)
Expression in Insektenzellen: Der HPV18-L1-enthaltende Baculovirus-Transfervektor pAcUW51:HPV18-L1
wird zur Produktion von rekombinantem Baculovirus (Autographa californica)
durch homologe Rekombination in vivo eingesetzt. Epitop-markiertes
HPV18-L1 wird dann in Sf9 (Spodoptera frugiperda)-Insektenzellen,
die in Suspensionskultur gezüchtet
wurden, nach Infektion mit dem HPV18-enthaltenden rekombinanten
Baculovirus exprimiert.
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BEISPIEL 19
-
Verbindungen,
welche die HPV18-Aktivität
beeinflussen, können
mit einer Vielfalt von Verfahren nachgewiesen werden. Ein Verfahren
zur Identifizierung von Verbindungen, welche HPV18 beeinflussen,
umfaßt:
-
- (a) Mischen einer Testverbindung mit einer
Lösung,
die HPV18 enthält,
um eine Mischung zu bilden;
- (b) Messen von HPV18-Aktivität
in der Mischung; und
- (c) Vergleichen des HPV18 in der Mischung mit einem Standard.
-
Verbindungen,
welche die HPV18-Aktivität
beeinflussen, können
zu pharmazeutischen Zusammensetzungen formuliert werden. Solche
pharmazeutischen Zusammensetzungen können sich zur Behandlung von
Erkrankungen oder Zuständen
eignen, welche durch eine HPV18-Infektion gekennzeichnet sind.
-
BEISPIEL 20
-
DNA,
welche strukturell mit für
HPV18 kodierender DNA verwandt ist, wird mit einer Sonde nachgewiesen.
Eine geeignete Sonde kann von DNA, welche die Gesamtheit oder einen
Teil der Nukleotidsequenz von 1 oder 3 aufweist, RNA, kodiert
von DNA, welche die Gesamtheit oder einen Teil der Nukleotidsequenz
von 1 oder 3 aufweist, oder degenerierten
Oligonukleotiden, abgeleitet von einem Teil der Sequenz von 1 oder 3, erhalten werden.