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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Diagnose von Allergien, insbesondere
Lebensmittelintoleranzen/Allergien und basiert auf der Analyse von
Entzündungsmediatoren
(Markern), die im Dickdarm nach Provokation der Schleimhaut des
Dickdarms durch das Allergen freigesetzt werden. Die Erfindung betrifft
auch ein neues Instrument, das für
diese Art der Diagnose verwendet werden kann, um die Schleimhaut
im Dickdarm zu reizen. Gemäß vorzuziehender
Ausführungsarten
kann das Instrument verwendet werden, um freigesetzte Mediatoren
(Marker) zu der gleichen Zeit wie bei der Reizung der Schleimhaut
zu sammeln.
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Das
Expressionsallergen im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung
ist mit Beschwerden in Form von Nahrungsmittelintoleranz/Allergie
verbunden. Die Expression ist daher nicht zwingend damit verbunden,
dass die Beschwerden IgE-vermittelt sind.
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Mit
Dickdarm ist das Colon und das Rektum gemeint.
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Bekannte Techniken der
Diagnose von Nahrungsmittelintoleranz/Allergie und damit verbundene
Probleme
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Derzeitige
Verfahren der Diagnose von vermuteter Nahrungsmittelintoleranz/Allergie
besitzen entweder einen begrenzten Wert und/oder sind zeitaufwendig.
Im Falle der Gluten-Intoleranz basieren die Verfahren auf dem Nachweis
von Zottenatrophie im Dünndarm
und darauf, dass die Zottenatrophie zurückgeht, wenn Gluten aus der
Diät ausgeschlossen wird.
In dieser Hinsicht wird eine Richtlinie durch die Gegenwart von
Serumantikörpern
gegen Gluten gefunden. Im Hinblick auf andere Formen der Nahrungsmittelintoleranz/Allergien
sind die diagnostischen Verfahren sehr unzulänglich. Aus Biopsiestudien
ist bekannt, dass die Glutenaufnahme eine lokale entzündliche
Reaktion in dem Dünndarm
fördert, obwohl
es kein detailliertes Verständnis
für den
Vorgang gibt. In früheren
Arbeiten wurden Anstrengungen unternommen, die lokale entzündliche
Antwort von Patienten, die an Zöliakie
leiden, durch kontinuierliche Perfusion des Dünndarms, der durch Gluten gereizt
worden ist, zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigen die Entwicklung
einer geringen, aber signifikanten Antwort (B. Lavö, et al,
Gut 31 (1990) 153–7; B.
Lavö, et
al, Am. J. Med. 87 (1989) 655–60;
B. Lavö,
et al, Gastroenterology 99 (1990) 703–7). Die Durchfüh rung der
Dünndarmperfusion
ist jedoch technisch anspruchsvoll und beschwerlich und für die klinische
Diagnose in der Praxis nicht geeignet.
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Die
rektale Provokation von Patienten, die an Zöliakie leiden, in Kombination
mit Biopsiestudien ist früher
beschrieben worden (Dobbins, et al, Gastroenterology 47 (1964) 471–9; Austin,
et al, Gut 29 (1988) 200–5;
Loft, et al, Gastroenterology 97 (1989) 29–37 und Loft, et al, Lancet
335 (1990) 1293–5).
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Es
wurden auch Studien über
die basale, sprich unprovozierte, Freisetzung von Entzündungsmediatoren
von Patienten, die an Colitis ulcerosa, Proctitis, Morbus Crohn
und anderen, nicht näher
bezeichneten Colonerkrankungen leiden, durchgeführt (Y. Raab, et al, Am. J.
Gastroenterology 87 (1992) 1453–9;
Y. Raab, et al, Gut 34 (1993) 1203–6; und Y. Raab, et al, Digestions
55 (1994) 44–9).
Proben wurden durch segmentale Perfusion von Colon und Rektum entnommen.
Die Studien wurden mit Hilfe eines Katheters, der in den colorektalen
Teil des Darmes eingeführt
wurde, möglich
gemacht (Krog, et al, WO-A9108013). Es wird angenommen, dass der
betreffende Katheter eine provozierende Funktion hat, obwohl das
Verfahren und der Zweck dieser Provokation nicht definiert worden
ist.
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So
besteht ein dringender Bedarf für
ein Testsystem, das es ermöglichen
wird, Nahrungsmittelintoleranz/Allergien auf spezifische Nahrungsmittelsubstanzen
auf eine einfache, schnelle und positive Weise nachzuweisen.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 veranschaulicht
ein bekanntes Instrument (Katheter), das in Verbindung mit der Erfindung verwendet
werden kann (Krog, et al, WO-A-9108013).
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2a und b veranschaulichen eine weitere Ausführungsart
des bekannten Instruments (Katheters) und beinhalten auch eine Schnittansicht
von dem Teil, das das Instrument im Darm an Ort und Stelle halten
soll (Krog, et al, WO-A-9108013).
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3 zeigt
das Instrument in 1 (Krog, et al, WO-A-9108013),
eingeführt
in den Dickdarm für die
Provokation mit dem Allergen und/oder Sammlung von freigesetzten
Markern.
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4a, b und c veranschaulichen
eine Ausführungsart
des erfindungsgemäßen Instruments.
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5 zeigt das Instrument von 4,
eingeführt
in das Rektum.
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Diejenigen
Teile mit funktioneller Übereinstimmung
in den verschiedenen Figuren wurden mit den gleichen Verweiszeichen
kenntlich gemacht. Die 4 bis 5 veranschaulichen
das Instrument in einer Größe, die
für erwachsene
Personen geeignet ist.
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Beschreibung der Erfindung
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Wir
haben jetzt herausgefunden, dass die Provokation über das
Rektum mit Allergen eine starke und spezifische lokale Freisetzung
von Entzündungsmediatoren
aus der Dickdarmschleimhaut an das Lumen von Patienten, die an Allergie,
insbesondere Nahrungsmittelintoleranz/Allergie leiden und die gegen
das betreffende Allergen sensibilisiert sind, hervorruft. Gesunde
Personen zeigen keine korrespondierende Freisetzung.
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Unsere
Entdeckung führte
zu einem diagnostischen Verfahren, das die Analyse einer Probe, die
rektal aus dem Dickdarm (Colon oder Rektum) eines Patienten, bei
dem das Leiden an einer Allergie, insbesondere einer Nahrungsmittelallergie,
vermutet wird, entnommen wird, nachdem die Schleimhaut in dem Dickdarm
(Colon oder Rektum) des Patienten rektal mit einem Allergen, gegen
das die vermutete Allergie gerichtet ist, gereizt wurde, mit einbezieht. Das
Verfahren beinhaltet (a) die Entnahme der Probe aus dem Lumen des
Dickdarms (Colon und/oder Rektum); (b) Bestimmung eines Entzündungsmarkers
in der Probe und (c) das als Anzeichen nehmen einer erhöhten Menge
von Marker (erhöhten
Freisetzung) in der Probe, dass der Patient allergisch gegen das
betreffende Allergen ist.
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Der
Vergleich wird mit den Normalwerten gesunder Personen oder mit den
Werten der untersuchten Personen, die durch das gleiche Verfahren,
aber ohne simultane Provokation abgenommen wurden, durchgeführt.
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Relevante
Entzündungsmarker
sind Substanzen, die z. B. von neutrophilen Granulozyten, eosinophilen
Granulozyten, Mastzellen/basophilen Granulozyten stammen. Konkrete
Beispiele sind Cytokine (so wie IL-6 und IL-8) und Myeloperoxidase (MPO),
eosinophiles basisches Protein (ECP), eosinophiles Protein X (EPX),
Histamin, Cathepsin G, Lactoferrin, Lysozym und Elastase und Prostaglandine.
Die Gegenwart von Plasmaproteinen (z. B. Albumin) im dem Lumen dient
auch als Marker, da dies hinweisend auf einen Verlust an das Lumen
ist.
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Die
Probenentnahme wird durch die Hilfe eines Instruments, das rektal
in den Dickdarm, entweder allein in das Rektum oder auch hinauf
in das Colon, eingeführt
wird, bewirkt. Das Instrument beinhaltet Mittel (8) für das Sammeln
freigesetzter Marker und wahlweise auch für die Ermögli chung von Perfusion und/oder
Kontaktpräsentation
des Allergens an die Schleimhaut des Rektums/Colons.
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Die
bereitgestellten Mittel können
so entworfen sein, dass sie Perfusion und Provokation eines vorgegebenen
Teils (z. B. eines Segments) des Rektums/Colons ermöglichen
und die Freisetzung von Entzündungsmarkern
an das Lumen ermöglichen, damit
sie aus diesem Teil des Rektums/Colons gesammelt werden können. Um
sicherzustellen, dass das Instrument an Ort und Stelle im Rektum/Colon bleibt,
wird das Instrument vorzugsweise mit einem durchlaufenden Kanal
(2), der den Teil des Rektum/Colons, der oberhalb des Instrumentes
liegt, mit dem Teil, der unter dem Instrument liegt, verbindet, ausgerüstet. Der
Kanal dient auch dem Ausgleich des Druckes zwischen der Umgebung
und dem Inneren des Darmes und ermöglicht die Entleerung des Darminhaltes.
Die Mittel (8) für
Sammlung, Perfusion und Kontaktpräsentation sind auf dem Instrument
so positioniert, dass sie oberhalb des inneren Sphinkters liegen.
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Ein
in dieser Hinsicht geeignetes Instrument ist der Katheter, der durch
Krog, et al (WO-9108013) bekannt und beschrieben wurde (1, 2 und 3). Dieses
Instrument ist für
die segmentale Provokation und Sammlung freigesetzter Entzündungsmarker
durch Perfusion von Teilen des Colons und Rektums eines Patienten
gut geeignet. Ein wichtiger Bestandteil des Instruments ist ein
Katheterschlauch (1), durch den sich ein Kanal (2)
erstreckt, der sich an beiden Enden des Schlauches öffnet. Der
Kanal (2) dient dem Ausgleich des Druckes zwischen dem Darm
und der Umgebung auf die zuvor beschriebene Weise. Es werden ein
oder mehrere ausdehnbare Vorrichtungen (3 und 3') um diesen
Teil des Katheters, der die Analöffnung
passiert, bereitgestellt, um den Katheter in dem Anus zu fixieren.
Weiter entlang des Katheters werden ausdehnbare Vorrichtungen (4a, b, c und d)
bereitgestellt, die den Katheter umgeben, und die, wenn sie in dem
Rektum/Colon ausgedehnt werden, rektale/Colon-Segmente eingrenzen
(5). Der Katheter beinhaltet auch Kanäle (6), die sich innerhalb
oder entlang der Katheterwand erstrecken, und von denen jeder eine Öffnung in
dem Teil des Katheters hat, der, wenn der Katheter verwendet wird,
extern des Körpers
lokalisiert ist, und die mit einer Öffnung in einer der ausdehnbaren
Vorrichtungen (4), die entlang des Katheterschlauches lokalisiert sind,
versehen sind. Diese Kanäle
(6) dienen als Kontrollmittel für die Ausdehnung der ausdehnbaren Vorrichtungen.
Der Katheter beinhaltet auch einen oder mehrere getrennte Kanäle (7),
von denen jeder eine Öffnung
in dem exter nen Teil des Katheters und eine weitere Öffnung zwischen
den ausdehnbaren Vorrichtungen, die ein rektales/Colon-Segment begrenzen
sollen, besitzt. Diese letzteren Kanäle (7) ermöglichen
es, dass Perfusionsflüssigkeit
zu/von diesen Darmsegmenten (5) geleitet wird, die durch
zwei ausdehnbare Vorrichtungen definiert sind (3' und 4a in 1, 4a und 4b bzw. 4c und 4d in 2a).
So definieren zwei ausdehnbare Vorrichtungen zusammen mit dazwischenliegenden
Kathetersegmenten, die eine Kanalöffnung oder Öffnungen
enthalten, ein Mittel (8), das für Perfusion, Allergenpräsentation und
das Sammeln von freigesetzten Entzündungsmarkern verwendet werden
kann. Für
die Mehrzahl der Allergene kann die Perfusionsflüssigkeit sowohl für die Verabreichung
des Allergens wie auch für
das Sammeln freigesetzter Entzündungsmarker
verwendet werden. In dem Fall bestimmter Allergene, z. B. Gluten,
das teigig und klebrig ist, wird die Provokation vorzugsweise getrennt
verursacht, wobei das Instrument aus dem Rektum/Colon entfernt wird.
Siehe unten. Eine ausdehnbare Vorrichtung (4d in den 1 und 2a)
und der zugeordnete Kontrollkanal sollten immer an dem Ende des
Katheters bereitgestellt werden, der am weitesten aufwärts in das
Rektum/Colon eingeführt
wird.
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Die
ausdehnbaren Vorrichtungen können
die Form aufblasbarer Ballons aufweisen.
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Die
Kanäle
(6 und 7), die sich in der Katheterwand erstrecken,
können
auch die Form von Schläuchen
oder Röhren
aufweisen, die mehr oder weniger fest an oder in der inneren Oberfläche oder äußeren Oberfläche der
Katheterwand befestigt sind.
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Wie
in 2 veranschaulicht, kann eine größere Flexibilität in Hinblick
auf den Teil des Rektums/Colons, der perfundiert/gereizt werden
soll, durch Platzierung der ausdehnbaren Vorrichtungen (4a und 4b),
die das rektale/Colon-Segment (5) definieren sollen, auf
einen Schlauch (9), der über dem Katheterschlauch (1)
geschoben werden kann, erreicht werden. In diesem Fall besitzen
diese Kanäle (6 bzw. 7),
die zu den ausdehnbaren Vorrichtungen und zu den Räumen dazwischen
führen,
vorzugsweise die Form von Schläuchen
oder Röhren,
die axial entlang der äußeren Wand
des Zentralkanals bewegt werden können. Wenn möglich, können die
Kanäle mehr
oder weniger fest in dem verschiebbaren Schlauch verankert sein.
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Das
in den 1 und 2 veranschaulichte
Instrument kann mit Verfahren verwendet werden, die die Perfusion
des Rektums/Colons (des ganzen oder eines Teiles davon) anfangs
mit einem allergenfreien Puffer, Anwen dung einer wässrigen
Allergenzusammensetzung für
die rektale/Colon-Provokation, Entfernung der allergenen Zusammensetzung
aus dem Rektum/Colon, Perfusion desjenigen Teiles des Rektums/Colons,
der gereizt worden ist (die zweite Perfusion) mit einer allergenfreien
Pufferlösung,
beinhalten. Perfusionsflüssigkeit
wird zumindest während des
letzten Perfusionsvorganges für
die Analyse der Flüssigkeit
im Hinblick auf Entzündungsmarker
gesammelt. Die erhaltenen Werte werden mit den Werten, die man von
gesunden Personen erhält,
verglichen. Wenn signifikant erhöhte
Werte beobachtet werden, wird dies als ein Anzeichen dafür genommen,
dass die betroffene Person an Nahrungsmittelintoleranz/Allergie
gegen das Reizallergen leidet. Bei dieser Variante der Erfindung
wird das Instrument aus dem Colon zwischen dem ersten Perfusionsstadium
und dem Provokationsstadium entfernt und vor dem zweiten Perfusionsstadium
wieder eingeführt.
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Bei
einem alternativen Instrument wird das Allergen in einen Perfusionspuffer
eingeschlossen. In diesem Fall wird anfangs ein erstes Perfusionsstadium
durchgeführt,
um diesen Teil des Darmes zu reinigen, der perfundiert werden soll.
In diesem Stadium des Vorganges ist die Perfusionslösung frei
von Allergen. Der Darm wird dann mit einer Allergen enthaltenden
Perfusionslösung
perfundiert. Schließlich wird
der Darm mit einer allergenfreien Perfusionslösung perfundiert. Wenn diese
Alternative angewendet wird, muss das Perfusionsinstrument nicht
aus dem Darm zwischen den verschiedenen Perfusionsstadien entfernt
werden.
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Es
ist vorteilhaft, auch die Perfusionsflüssigkeit aus dem ersten Perfusionsstadium
hinsichtlich der gleichen Marker zu analysieren, wie diejenigen, die
in der letzten Perfusionsflüssigkeit
analysiert werden und die erhaltenen Werte zu vergleichen, wenn diese
beiden Ausführungsarten
angewendet werden. Ein erhöhter
Wert bei dem späteren
Perfusionsstadium weist auf eine Allergie gegen das betreffende
Allergen hin.
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Perfusionsflüssigkeiten/Lösungen sind
normalerweise gepuffert, z. B. mit einem physiologisch akzeptablen
Puffer, wie PBS. Die Lösungen
können auch
Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Mannit, Glucose, Polyethylenglykol
oder andere bekannte Substanzen enthalten, die die Lösungen gut
verträglich
für die rektale/Colon-Schleimhaut
machen. In Verbindung mit der Erfindung haben wir ein neues Instrument, definiert
gemäß Anspruch
1, entwickelt, das die rektalen Provokations- und Probenentnahme-Vorgänge vereinfacht.
Dieses Instrument wird in den 4 bis 5 gezeigt und beinhaltet einen ausdehnbaren
Teil/eine ausdehnbare Vorrichtung (10), die einen ersten Kanal
(2) umgibt, der sich auf jeder Seite des ausdehnbaren Teils öffnet, und
einen zweiten Kanal (11), durch den die Ausdehnung des
ausdehnbaren Teils (10) kontrolliert werden kann, so dass,
wenn das Instrument rektal in das Rektum eingeführt wird (mit dem ausdehnbaren
Teil ausgedehnt) sich die Außenwand
des ausdehnbaren Teiles in direktem Kontakt mit der rektalen Schleimhaut
befinden wird und bei dem die äußere definierende
Oberfläche
des ausdehnbaren Teiles ein diffusionsfähiges Allergen und auch einen
Rezeptor für
einen Entzündungsmarker trägt. Die
ausdehnbare Vorrichtung kann auf einem Einführungsstab (12) plaziert
sein, um die Handhabung des Instrumentes zu erleichtern. Der sich
auf beiden Seiten der ausdehnbaren Vorrichtung öffnende Kanal (2)
dient dem Ausgleich des Druckes zwischen der Umgebung und den inneren
Teilen des Darmes. Der ausdehnbare Teil (10) wird in einem nicht
ausgedehnten Zustand in 4a und
in einem ausgedehnten Zustand in 4c gezeigt.
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Das
diffusionsfähige
Allergen wird normalerweise adsorptiv oder absorptiv entweder an
die gesamte Oberfläche
der äußeren definierenden
Oberfläche
der ausdehnbaren Vorrichtung oder an Unterbereiche (13a)
davon gebunden, wie in den 4b und 4c gezeigt.
Wenn die ausdehnbare Vorrichtung auch gebundene Rezeptoren, die
spezifisch für das
Fangen eines Entzündungsmarkers
gedacht sind, aufweist, liegen Rezeptor und Allergen entweder gemeinsam
auf den gleichen Unterbereichen (13a und 13b)
oder auf verschiedenen Unterbereichen (13b) vor. Der Rezeptor
soll an seinen Unterbereich mit Bindungen gebunden sein, die in
der Lage sind, den in dem Rektum vorherrschenden Bedingungen zu
widerstehen, normalerweise kovalenten Bindungen. Beispiele für Rezeptoren
sind Antikörper, die
spezifisch für
den Marker, der gefangen/bestimmt (untersucht) werden soll, sind.
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Gemäß einer
alternativen Ausführungsart trägt die äußere definierende
Oberfläche
Rezeptoren für
einen Entzündungsmarker.
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Das
Material, aus dem die ausdehnbare Vorrichtung des Instrumentes der
Erfindung gemacht ist, kann von der gleichen Art sein, wie das,
aus dem die ausdehnbaren Vorrichtungen in den 1 bis 2 gemacht sind (siehe Krog, et al, WO-A-9108013).
Die ausdehnbare Vorrichtung wird so die Form eines aufblasbaren
Ballons aufweisen, der z. B. aus Latexgummi hergestellt ist. Ein
elastischer Gummiball (14) kann verwendet werden, um eine
ausdehnbare, ballonähnliche
Vorrichtung auszudehnen und zu entleeren.
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Das
Instrument kann einfach so durch den Anus eingeführt werden, dass die ausdehnbaren
Vorrichtungen bis hinter den inneren Sphinkter pas sieren. Aus praktischen Überlegungen
sollte das Instrument nicht weiter eingeführt werden als zu der Stelle, an
der das Rektum in einer Rechtskurve in das Colon übergeht.
Wenn in einem nicht ausgedehnten Zustand, wird der Durchmesser der
ausdehnbaren Vorrichtung vorzugsweise kleiner sein als der Durchmesser
des Anus, sprich kleiner als 15 bis 20 mm, mit 5 mm als einem optimalen
minimalen Messwert. Die definierende Oberfläche der Vorrichtung soll die Schleimhaut
des Rektums erreichen, wenn sie sich in einem ausgedehnten Zustand
befindet, was bedeutet, dass die Vorrichtung in der Lage sein soll,
sich auf einen Durchmesser von 20 bis 70 mm auszudehnen. Wie zuvor
erwähnt,
kann die ausdehnbare Vorrichtung ein aufblasbarer Ballon sein. Das
Instrument wird oft einen Einführungsstab
(12) beinhalten, wobei die ausdehnbare Vorrichtung an dem
vorderen Ende des Stabes positioniert ist. Der Stab kann eine variable
Länge aufweisen,
obwohl der Stab, um vollständig
in das Rektum hineinzureichen, vorzugsweise eine minimale Länge von
180 mm mit der Zugabe von weiteren 50 bis 100 mm, die nicht in das
Rektum eindringen müssen,
aufweisen wird. Der Einführungsstab
wird den früher
erwähnten
Druck ausgleichenden Kanal (2) und den Kontrollkanal (11),
der für die
Kontrolle der Ausdehnung der ausdehnbaren Vorrichtung gedacht ist,
beinhalten. Der Stab kann aus PVC-Kunststoff oder ähnlichem
Material hergestellt sein.
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Das
Instrument wird zu einer geeigneten Position in das Rektum eines
Patienten eingeführt,
wobei die ausdehnbare Vorrichtung sich in einem nicht ausgedehnten
Zustand befindet. Das Allergen diffundiert zu der rektalen Schleimhaut
und, wenn die betreffende Person allergisch gegen das Allergen ist, wird
es die Freisetzung von Entzündungsmarkern hervorrufen,
die wiederum zu dem Lumen diffundieren, wo sie durch den Rezeptor
gefangen (gebunden) werden. Nachdem der Marker freigesetzt und an
die ausdehnbare Vorrichtung gebunden worden ist, wird die Vorrichtung
entfernt und im Hinblick auf den gebundenen Marker analysiert. Ein
Wert, der in Bezug auf einen Normalwert erhöht ist, zeigt an, dass der Patient
allergisch gegen das auf der ausdehnbaren Vorrichtung vorliegende
Allergen ist. Der Normalwert kann ein Wert sein, den man mit einem ähnlichen
Instrument erhalten hat, aber mit dem Unterschied, dass kein diffusionsfähiges Allergen
verwendet wurde. Ein Normalwert kann auch ein Wert sein, der auf die
gesunde und normale Population anwendbar ist.
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Bestes Verfahren für die Durchführung der
Erfindung
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Das
beste Verfahren zur Durchführung
der Erfindung an dem Prioritätsdatum
des Instrumentes der Erfindung wird in 4 gezeigt.
Die Ausführungsart,
die den besten Beweis, dass das diagnostische Verfahren effektiv
funktioniert, bereitgestellt hat, wird in dem experimentellen Teil
dieser Anmeldung veranschaulicht. Der Erfinder hält diejenigen für die praktischsten
Verfahren, bei denen die Provokation und Sammlung der an das Lumen
freigesetzten Marker mit ein und demselben Instrument erreicht wird.
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Experimenteller Teil
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Patienten
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Die
Studie schloss neun Patienten, die an Zöliakie litten, mit ein. Die
diagnostischen Kriterien waren wie folgt:
- a)
Dünndarm-Biopsie,
die subtotale oder partielle Zottenatrophie zum Zeitpunkt der Diagnose
zeigte.
- b) Histopathologische Wiederherstellung nach Gluten-freier Diät.
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Alle
Biopsien wurden durch ein und denselben Pathologen getestet, ohne
dass der Pathologe irgendein vorheriges Wissen hatte.
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Fünf Patienten
wurden neu als an Zöliakie leidend
diagnostiziert und aßen
eine normale Diät. Die übrigen vier
Patienten aßen
eine Glutenfreie Diät. Gesunde
Freiwillige, vier Männer
und eine Frau, die keine Vorgeschichte mit gastrointestinaler Erkrankung
hatten, wurden als Kontrollpersonen verwendet. Die Kontrollpersonen
hatten ein durchschnittliches Alter von 37 Jahren (einen Altersbereich
von 28 bis 52 Jahren abdeckend).
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Rektale Perfusion
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Die
angewendete Perfusionstechnik war die Technik, die von Raab, et
al (Am. J. Med. 87 (1992) 1453–59)
gelehrt wurde, mit bestimmten Modifikationen, die angenommen wurden,
um das Instrument an die rektale Verwendung zu adaptieren. Kurz
gefasst wurde ein 6-kanaliger PVC-Schlauch mit einem inneren Durchmesser
von 10 mm, einem äußeren Durchmesser
von 16 mm und einer Gesamtlänge
von 38 cm verwendet. Es wurden drei aufblasbare Ballons an dem Schlauch
befestigt, um ein rektales Perfusionssegment von 8 cm Länge zu erhalten.
Die Kanäle wurden
entweder verwendet, um die Ballons aufzublasen oder das Segment
zu perfundieren oder einen Farbmarker an die Schlauchspitze zu verabreichen. Es
wurden zwei rektale Perfusionen bei jeder Person an ein und demselben
Tag durchgeführt:
eine basale Per fusion und eine Perfusion 3 Stunden nach Einführung von
Gluten (siehe unten). Die Teilnehmer wurden untersucht, nachdem
sie 17 Stunden lang gefastet hatten, und 4 l einer oralen laxativen
Lösung
(Laxabon®,
Lund, Schweden) wurden als Einlauf verwendet. Mepiridene®,
25 mg und Diazepam®, 2,5 mg wurden intravenös als Prämedikation
verabreicht. Der Darm wurde mit Hilfe von Endoskopie des Rektums
und des Colons sigmoideum mit dem über dem Endoskop plazierten
Schlauch untersucht (Olympus Gastroskop P2). Das Endoskop wurde
in Position gebracht und dann verwendet, um den Schlauch in das Rektum
zu leiten. Als der Schlauch an die erwünschte Position eingeführt worden
war, wurde das Endoskop zurückgezogen
und die Ballons mit Luft gefüllt. Das
verwendete Luftvolumen wurde zum Teil durch die Reaktion der Teilnehmer
bestimmt. Die Luftzufuhr wurde unterbrochen, wenn die Teilnehmer
einen leichten Druck in dem Darm fühlten. Schließlich wurde
die Position des Schlauches mit Hilfe eines Fluoroskopes überprüft.
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Perfusion
wurde mit einer Geschwindigkeit von 3 ml/min mit der Hilfe einer
Spritzenpumpe (Modell 355, Sage Instruments, Orion Research, Inc., Cambridge,
MA, U.S.A.) aufgenommen. Der Perfusionspuffer enthielt NaCl 120
mM, KCl 5,4 nM, Na2HPO4 2
nM, Glucose 10 mM, Mannit 35 mM und Polyethylenglykol (PEG; MG 4
kD) 1 g/l. Die Pufferlösung
wies einen endgültigen
pH von 7,20 bis 7,25 und eine Osmolalität von 290 mosm/l auf. Die Lösung wurde
bei einer Temperatur von 37°C
während
des Perfusionsstadiums erhalten. Die Sammlung von Proben wurde direkt,
nachdem die Flüssigkeit
aufklarte, aufgenommen. Die Proben wurden in 20minütigen Abständen über einen
Zeitraum von 80 Minuten entnommen. 14C-markiertes
PEG (MG 4 kD, Amersham Lab., Buckinghamshire, England), endgültige Konzentration
2,3 mCi/l wurde als ein Marker zur Erholungsbestimmung zu dem Perfusat
zugegeben. 10 ml Aprotilin (10.000 KIU/ml) wurden pro Liter Perfusionspuffer
zugegeben, um proteolytische Aktivität zu verhindern. Um das Auftreten
von Verlust aus dem Colon in das Perfusionssegment auszuschließen, wurde
Phenol-Rot-Lösung
(50 mg/l in gewöhnlicher
physiologischer Kochsalzlösung)
proximal zu dem Segment mit einer konstanten Geschwindigkeit (0,5
ml/min) infundiert.
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Nach
Beendigung des basalen Perfusionsvorganges wurden die Ballons entleert,
der Schlauch zurückgezogen
und man ließ die
Teilnehmer die Toilette besuchen, bevor man einen Gluteneinlauf
verabreichte. 135 bis 150 Minuten nach Einbringen des Glutens wurde
das Rektum-Sigmoid mit 500 ml Perfusionspuffer mit der Absicht,
das Rektum von Gluten und Detritus zu reinigen, gespült, wonach
der Perfusionsschlauch wieder eingeführt wurde. Die zweite rektale
Perfusion wurde 180 Minuten nach der Glutenprovokation begonnen
und für
180 Minuten fortgeführt.
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Provokation
mit Gluten
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Weizen-Gluten
(6,2 bis 6,5 g, ungereinigtes Weizen-Gluten, Sigma Chemical Co.,
St. Louis, Missouri, U.S.A.) wurde in 25 ml Perfusionspuffer suspendiert.
Die Suspension wurde in das Rektum mit der Hilfe einer 60 ml-Spritze
injiziert, wobei der Teilnehmer auf seiner/ihrer linken Seite lag.
Man ließ den Teilnehmer
dann so gut er/sie konnte, herumlaufen, und er wurde instruiert,
den Einlauf für
60 Minuten zu behalten.
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Chemische Analyse
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Alle
Proben wurden auf Eis gesammelt und 1 ml Aprotilin (10.000 KIU/ml)
wurde zu jeder Probe (60 ml) Perfusat zugegeben, um die proteolytische
Aktivität
zu inhibieren. Diejenigen Proben, die nicht direkt analysiert wurden,
wurden auf –70°C eingefroren. 14C wurde durch Flüssig-Szintillation und Zählung (10 min)
der Proben (1 ml) bestimmt. Phenol-Rot wurde spektrophotometrisch
bei 520 nm nach Alkalisierung auf pH 11 gemessen, als die Proben
bei visueller Bestimmung rot waren. ECP, Histamin, MPO und Albumin
wurden doppelt durch Radio-Immunoassay (Pharmacia Diagnostics, Uppsala,
Schweden) gemessen. Prostaglandin E2 wurde
doppelt durch Radio-Immunassay (DuPont, Dreieich, Deutschland) gemessen,
IL-6 und IL-8 wurden durch Enzym-Immunoassay (Medgenix, Brüssel, Belgien)
gemessen.
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Statistische
Analyse
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Die
Ergebnisse wurden als Mittelwerte ± Standardabweichung und 95%
Konfidenzintervall bestimmt. Die statistischen Berechnungen wurden
mit einem Mann-Whitney U-Test durchgeführt. Wenn die Konzentration
von MPO, ECP, Histamin, PGE2, IL-6 oder
IL-8 in der rektalen Flüssigkeit
unter dem Nachweisniveau für
die jeweiligen Verfahren lag, wurde die Konzentration sofort über das
Nachweisniveau bei den Berechnungen plaziert (MPO = 7,9 μg/l; ECP =
1,9 μg/l;
Histamin = 0,9 μg/l;
PGE2 = 1 μg/l;
IL-6 = 1 μg/l;
und IL-8 = 1 μg/l).
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Ergebnisse
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Alle
Teilnehmer bei der Studie waren in der Lage, mit der rektalen Perfusion
umzugehen und keiner der Teilnehmer entwickelte Symptome aufgrund der
Glutenprovokation. Die Provokation induzierte eine Zunahme bei der
Freisetzung von Entzündungsmarkern,
diese Zunahme betrug das 25fache für Marker von neutrophilen Granulozyten
(z. B. Myeloperoxidase), das durchschnittlich 3fache für eosinophiles basisches
Protein (aus Eosinophilen) und für
PGE2, das durchschnittlich 7fache für Cytokine
(z. B. IL-6 und IL-8) und in dem Fall einiger Teilnehmer bis zu
einer 20fachen Zunahme für
Histamin (Marker für Mastzellen/Basophile).
In dem Fall derjenigen Teilnehmer/Patienten, die an Zöliakie litten,
resultierte die Glutenprovokation im Rektum in einer mehr als 4fachen
Zunahme der Schleimhautdurchlässigkeit, definiert
als die Freisetzung von Plasmaprotein (Albumin) an das rektale Lumen.