DE69533556T2

DE69533556T2 - N-terminal modifizierte Polypeptide, und Herstellungsprozess

Info

Publication number: DE69533556T2
Application number: DE69533556T
Authority: DE
Inventors: Olaf B. Kinstler; Nancy E. Gabriel; Christine E. Farrar; Randolph B. Deprince
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1994-10-12
Filing date: 1995-02-08
Publication date: 2005-10-20
Anticipated expiration: 2015-02-09
Also published as: JP5350330B2; KR100248111B1; HK1008787A1; DE69509628D1; GR3030526T3; JPH11310600A; US8258262B2; PT822199E; DE10299044I1; US20100310510A1; JP2006045243A; CA2307142C; AU1841995A; DE69533556D1; LU91006I2; US20120296072A1; JP3177251B2; WO1996011953A1; ATE277078T1; CN101381409B

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft im weiteren Sinne das Feld der Proteinmodifizierung und insbesondere die Verknüpfung von wasserlöslichen Polymeren an Proteine oder Analoga davon (der hier verwendete Ausdruck „Protein" ist, wenn nichts anderes gesagt wird, synonym mit „Polypeptid" oder „Peptid"). Die vorliegende Erfindung betrifft auch neue Verfahren zum Modifizieren des N-Terminus von Proteinen und Analoga davon und die daraus resultierenden Zusammensetzungen. In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung neue N-terminal monopegylierte G-CSF-Zusammensetzungen und Verfahren zu ihrer Herstellung. Die vorliegende Erfindung betrifft auch chemisch modifiziertes Konsensus-Interferon.
HINTERGRUND
Proteine für eine therapeutische Verwendung sind gegenwärtig in geeigneten Formen und ausreichenden Mengen erhältlich, größtenteils aufgrund der Fortschritte rekombinanter DNA-Technologien. Die Verfügbarkeit von rekombinanten Proteinen erzeugte Fortschritte in der Formulierung und chemischen Modifizierung der Proteine. Ein Ziel einer derartigen Modifizierung ist der Schutz des Proteins. Eine chemische Anbindung kann effizient den physikalischen Kontakt eines protolytischen Enzyms mit dem Protein-Rückgrat selbst verhindern und so den Abbau verhindern. Zusätzliche Vorteile sind unter bestimmten Bedingungen eine Erhöhung der Stabilität und der Zirkulationsdauer des therapeutischen Proteins und eine Erniedrigung der immunisierenden Wirkung. Francis, Focus on Growth Factors 3, 4–10 (Mai 1992) (veröffentlicht von Mediscript, Mountview Court, Friern Barnet Lane, London, N20, OLD, UK) ist ein Übersichtsartikel, der Proteinmodifizierung und Fusionsproteine beschreibt.
Polyethylenglykol ("PEG") ist eine derartige chemische Substanz, die zur Zubereitung von therapeutischen Proteinprodukten verwendet wurde (das Verb "pegylieren" meint das Anheften von wenigstens einem PEG-Molekül). Zum Beispiel ist Adagen eine pegylierte Form von Adenosin-Deaminase, die für die Behandlung ernsthafter kombinierter Immunodefizienz zugelassen ist; pegylierte Superoxid-Dismutase wurde in klinischen Studien zur Behandlung von Kopfverletzungen eingesetzt; pegyliertes alpha-Interferon wurde in klinischen Studien der Phase I zur Hepatitisbehandlung getestet; pegylierte Glucocerebrosidase und pegyliertes Hämoglobin waren in vorklinischen Versuchen. Es wurde gezeigt, dass die Anheftung von Polyethylenglykol vor proteolytischen Abbau schützt, Sada et al., J. Fermentation Bioengineering 71, 137–139 (1991), und Verfahren zur Anheftung von bestimmten Polyethylenglykolverbindungen sind verfügbar. Siehe US-Patent Nr. 4,179,337, Davis et al., "Non-Immunogenic Polypeptides", veröffentlicht am 18. Dezember 1979; und US-Patent Nr. 4,002,531, Royer, "Modifying enzymes with Polyethylene Glycol and Product Produced Thereby", veröffentlicht am 11. Januar 1977. Zum Überblick wird verwiesen auf Abuchowski et al., in Enzymes as Drugs, J. S. Holcerberg und J. Roberts, Herausgeber, Seiten 367–383 (1981).
Andere wasserlösliche Polymere wurden verwendet, wie Copolymere von Ethylenglykol/Propylenglykol, Carboxymethylcellulose, Dextran, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Poly-1,3-Dioxolan, Poly-1,3,6-trioxan, Ethylen/Maleinsäureanhydrid-Copolymere, Polyaminosäuren (entweder Homopolymere oder statistische Copolymere).
Für Polyethylenglykol wurden eine Reihe von Verfahren verwendet, um die Polyethylenglykolmoleküle an das Protein anzuheften. Im Allgemeinen werden Polyethylenglykolmoleküle mit dem Protein über eine reaktive Gruppe auf dem Protein verbunden. Aminogruppen, wie die der Lysinreste oder des N-Terminus sind für eine derartige Anbindung geeignet. Zum Beispiel beschreibt Royer ( US-PS 4,002,531 , supra) eine reduktive Alkylierung für die Anbindung von Polyethylenglykolmolekülen an ein Enzym. EP 0 539 167 , veröffentlicht am 28. April 1993, Wright, "Peg Imidates and Protein Derivates Thereof" beschreibt, dass Peptide und organische Verbindungen mit (einer) freien Aminogruppe(n) durch ein unmittelbares Derivat von PEG oder verwandten wasserlöslichen organischen Polymeren modifiziert werden können. US-PS 4,904,584 , Shaw, veröffentlicht am 27. Februar 1990, betrifft die Modifizierung von Lysinresten in Proteinen zur Anbindung von Polyethylenglykolmolekülen über reaktive Aminogruppen.
Ein spezielles Beispiel für ein therapeutisches Protein, das chemisch modifiziert wurde, ist der Granulozyten-Kolonie-stimulierende Faktor, "G-CSF". G-CSF induziert die rasche Vermehrung und Freisetzung von neutrophilen Granulozyten in das Blut und sorgt so für eine therapeutische Wirkung zur Bekämpfung einer Infektion.
Die EP-A-0 401 384, publiziert am 12. Dezember 1990, mit dem Titel "Chemically Modified Granulocyte Colony Stimulating Factor" beschreibt die Materialien und Verfahren zur Herstellung von G-CSF mit angebundenen Polyethylenglykolmolekülen.
Modifiziertes G-CSF und Analoga davon werden ebenfalls in EP 0 473 268 , publiziert am 4. März 1992, mit dem Titel "Continuous Release Pharmaceutical Compositions Comprising a Polypeptide Covalently Conjugated to a Water Soluble Polymer" beschrieben. Hier ist die Verwendung von verschiedenen G-CSF und kovalent an ein wasserlösliches Polymerpartikel, wie Polyethylenglykol, gebundenen Derivaten beschrieben.
Ein modifiziertes Polypeptid mit der Aktivität des menschlichen Granulozyten-Kolonie-stimulierenden Faktors wird in EP 0 335 423 , publiziert am 4. Oktober 1989, beschrieben.
Ein weiteres Beispiel ist pegyliertes IL-6. In EP-A-0 442 724 mit dem Titel "Modified hIL-6" ist mit Polyethylenglykolmolekülen pegyliertes IL-6 beschrieben (siehe co-anhängige U.S.S.N. 07/632,070).
EP 0 154 316 , veröffentlicht am 11. September 1985, beschreibt eine Reaktion eines Lymphokins mit einem Aldehyd von Polyethylenglykol.
Viele Verfahren zur Anbindung eines Polymers an ein Protein verwenden eine als Verbindungsgruppe fungierende Verbindung. Derartige Verbindungen können jedoch antigene Wirkung besitzen. Eine Tresylchlorid-Methode, die keine Verbindungsgruppe verwendet, ist verfügbar, jedoch kann dieses Verfahren schwierig zur Herstellung von therapeutischen Produkten sein, z. B. kann die Verwendung von Tresylchlorid giftige Nebenprodukte freisetzen. Siehe Francis et al., in: Stability of protein pharmaceuticals: in vivo pathways of degradation and strategies for protein stabilization (Herausgeber Ahern., T. und Manning, M. C.), Plenum, New York, 1991. Siehe auch Degado et al., "Coupling of PEG to Protein By Activation With Tresyl Chloride, Applications In Immunoaffinity Cell Preparation", in: Fisher et al., Herausgeber, Separations Using Aqueous Phase Systems, Applications In Cell Biology and Biotechnology, Plenum Press, N.Y.N.Y., 1989, Seiten 211–213.
Chamow et al., Bioconjugate Chem. 5, 133–140 (1994) beschreiben die Modifizierung von CD4 Immunoadhäsin mit Monomethoxypoly(ethylenglykol)-aldehyd durch reduktive Alkylierung. Die Autoren beschreiben, dass 50% des CD4-Ig unter Bedingungen, die eine Steuerung des Ausmaßes der Pegylierung erlauben, mit MePEG modifiziert wurde. Id. auf Seite 137. Die Autoren beschreiben auch, dass die in vitro-Bindefähigkeit des modifizierten CD4-Ig (an das Protein gp 120) in Übereinstimmung mit der Stärke der MePEGylierung abnahm. Siehe auch Rose et al., Bioconjugate Chemistry 2, 154–159 (1991), was die selektive Anbindung der Linkergruppe Carbohydrazid an die C-terminale Carboxylgruppe eines Proteinsubstrats (Insulin) beschreibt.
Keines der allgemeinen oder Protein-spezifischen Verfahren erlaubt jedoch die selektive Anbindung eines wasserlöslichen Polymers an den N-Terminus eines Proteins, wie G-CSF. Die momentan verwendeten Verfahren erlauben vielmehr eine nicht selektive Anbindung an jeder reaktiven Gruppe, entweder im Protein gelegen, wie eine Lysin-Seitengruppe oder am N-Terminus. Dies führt zu einer heterogenen Population. Zum Beispiel haben manche pegylierte G-CSF-Moleküle eine andere Zahl an Polyethylenglykolresten als andere. Zum Beispiel können die nach vorstehender Methode umgesetzten Proteinmoleküle mit 5 Lysinresten zu einer heterogenen Mischung führen, in der manche 6 Polyethylenglykolreste besitzen, manche 5, manche 4, manche 3, manche 2, manche 1 und manche keinen. Unter den Molekülen mit mehreren Resten könnten die Polyethylenglykolreste an verschiedenen Stellen auf den verschiedenen Molekülen angebunden werden.
Das ist für die Entwicklung eines therapeutischen pegylierten Proteinprodukts nachteilig. In einer derartigen Entwicklung ist die Vorhersagbarkeit einer biologischen Aktivität entscheidend. Zum Beispiel wurde für die nicht-selektive Anbindung von Polyethylenglykol an Superoxidmutase gezeigt, dass einige Fraktionen des modifizierten Enzyms vollkommen inaktiv waren (P. McGoff et al., Chem. Pharm., Bull. 36, 3079–3091 (1988)). Eine derartige Voraussage ist unmöglich, falls das therapeutische Protein in seiner Zusammensetzung von Ansatz zu Ansatz verschieden ist. Einige der Polyethylenglykolreste könnten an manchen Orten nicht so stabil gebunden werden wie an anderen und dies könnte zu einer Ablösung dieser Reste vom Protein führen. Natürlich können die Pharmakokinetiken des therapeutischen Proteins nicht genau vorhersagbar sein, falls derartige Reste zufällig angebunden werden und daher sich zufälligerweise ablösen. Aus dem Blick des Verbrauchers könnte die Zirkulationsdauer von Ansatz zu Ansatz verschieden sein und somit wäre die Dosierung ungenau. Aus Sicht des Produzenten wäre eine vorschriftsmäßige Genehmigung zum Verkauf des therapeutischen Proteins komplexer. Zusätzlich ermöglicht keines der vorstehenden Verfahren eine selektive N-terminale Pegylierung chemische Modifikation ohne einen Linker-Rest (zwischen dem Protein und dem Polymer). Falls ein Linker-Rest verwendet wird, könnte es aufgrund der möglichen antigenen Wirkung nachteilig sein.
Daher besteht ein Bedarf für Verfahren welche es ermöglichen, selektiv N-terminal chemisch modifizierte Proteine oder Analoga davon, einschließlich G-CSF und Konsensus-Interferon (zwei chemisch modifizierte Proteine sind unten als Beispiel aufgeführt) herzustellen. Die vorliegende Erfindung kommt diesem Bedürfnis in einer Reihe von Aspekten nach.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft im Wesentlichen homogene Zubereitungen von N-terminal chemisch modifizierten Proteinen und Verfahren dafür. Unerwarteterweise zeigte eine chemische Modifizierung am N-Terminus von G-CSF Vorteile in der Stabilität, die nicht in anderen G-CSF-Spezies mit einer chemischen Modifikation an anderen Orten im Molekül erkennbar ist. Ebenso unerwartet wurde durch das vorliegende Verfahren zur Herstellung von N-terminal chemisch modifiziertem G-CSF festgestellt, dass man durch die Verwendung von reduktiver Alkylierung Bedingungen für eine selektive Modifizierung des N-Terminus bereitstellen kann und dass dieses Verfahren breit für andere Proteine anwendbar ist (oder Analoga davon), genauso wie für G-CSF. Ebenso stellte sich unerwarteterweise heraus, dass mittels reduktiver Alkylierung das Endprodukt, Protein mit einer Aminbindung an das wasserlösliche Polymer, viel stabiler war als ein identisches Polymer/Protein-Konjugat mit einer Amidbindung. Ein weiteres so modifiziertes Protein (wie in einem Arbeitsbeispiel unten beschrieben) ist Konsensus-Interferon. Somit weist, wie unten genauer gezeigt, die vorliegende Erfindung eine Zahl von Aspekten auf, welche sich auf eine chemische Modifikation von Proteinen (oder Analoga davon) als auch auf spezifische Modifikationen von spezifischen Proteinen beziehen.
In einem Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine im Wesentlichen homogene Zubereitung von N-terminal chemisch modifiziertem G-CSF (oder Analoga hiervon) und darauf bezogene Verfahren. Ein nachstehendes Arbeitsbeispiel zeigt, dass N-terminal monopegyliertes G-CSF stabiler als andere Formen von monopegyliertem G-CSF ist. Zusätzlich ist ein größerer Teil der N-Termini pegyliert, da der N-Terminus des G-CSF-Moleküls besser für eine Reaktion mit Polyethylenglykol zur Verfügung steht. Daher bietet diese Spezies Verarbeitungsvorteile.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Art reduktiver Alkylierung, die selektiv die α-Aminogruppe des N-terminalen Restes eines Proteins oder einem Analogon hiervon aktiviert und daher für eine selektive Anbindung eines wasserlöslichen Polymer-Restes an den N-Terminus-Rest sorgt. Das ermöglicht eine im Wesentlichen homogene Zubereitung von Polymer/Protein-Konjugaten (wenn Polyethylenglykol verwendet wird), genauso wie eine Präparation von pegylierten Protein-Molekülen mit direkt an den Proteinteil gekoppeltem Polyethylenglykol. Das Verfahren wird nachstehend für G-CSF und für Konsensus-Interferon beschrieben und diese ermöglichen zusätzliche Aspekte der vorliegenden Erfindung.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1A ist eine Nachbildung des Chromatogramms der Ionenaustauschchromatographie von pegyliertem G-CSF.
1B ist ein SDS-PAGE verschiedener Spezies von monopegyliertem G-CSF.
2 ist ein SEC-HPLC-Profil von (Spur A) rekombinantem menschlichen Methionyl G-CSF-Standard; (Spur B) SCM-PEG-G-CSF-Reaktionsmix; (Spur C) N-terminal pegyliertem G-CSF; (Spur D) an Lysin 35 monopegyliertem G-CSF; (Spur E) an Lysin 41 monopegyliertem G-CSF.
3A, 3B und 3C sind HPLC-Endoproteinase SV8-Peptid-Mapping-Aufzeichnungen von N-terminal pegyliertem G-CSF (3A); an Lysin 35 monopegyliertem G-CSF (3B); an Lysin 41 monopegyliertem G-CSF (3C).
4 ist ein Säulendiagramm, das einen Vergleich einer in vitro-Bioaktivität von monopegylierten G-CSF-Spezies im Vergleich zu einem unpegylierten Standard veranschaulicht.
5A und 5B sind Diagramme, die die Resultate der in vivo-Bioaktivitätstests von monopegylierten G-CSF-Derivaten veranschaulichen, wobei 5A die durchschnittliche Zahl an weißen Blutkörperchen eines Hamsters nach einer einzigen subkutanen Injektion von N-terminal pegyliertem G-CSF, an Lysin 35 monopegyliertem G-CSF oder an Lysin 41 monopegyliertem G-CSF zeigt und 5B den Nettodurchschnitt der Fläche der Zahl an weißen Blutkörperchen unter der Kurve nach einer einzigen subkutanen Injektion der verschiedenen vorstehend erwähnten monopegylierten G-CSF-Derivate zeigt.
6A, 6B und 6C sind SEC-HPLC-Profile für Stabilitätsuntersuchungen von N-terminal pegyliertem G-CSF oder an Lysin 35 monopegyliertem G-CSF. 6A und 6B sind die Profile für Stabilitätsuntersuchungen, die bei pH 6,0 und 4°C für N-terminal monopegyliertes G-CSF (6A) oder an Lysin 35 monopegyliertes G-CSF (6B) durchgeführt wurden. 6C zeigt die Profile für weitere Stabilitätsuntersuchungen bei pH 6,0 und 4°C für an Lysin 35 monopegyliertes G-CSF. Zeit ("T") bedeutet Tage.
7 zeigt eine Größenausschluß-HPLC-Analyse der Reaktionsmischung in dem Verfahren einer reduktiven Alkylierung von rh-G-CSF mit Methoxypolyethylenglykolaldehyd (MW 6 kDa).
8 zeigt eine Größenausschluß-HPLC-Analyse der Reaktionsmischung unter Verwendung von N-Hydroxysuccinimidylester des MPEG, ebenso bei MW = 6 kDa.
9 zeigt die Reaktion der gesamten weißen Blutkörperchen nach einer einzigen subkutanen Dosis von Mono-N-terminal MPEG-G-CSF-Konjugaten, hergestellt durch reduktive Alkylierung von rh-G-CSF mit MPEG-Aldehyden verschiedenen Molekulargewichts (6 kDa, 12 kDa und 20 kDa).
DETAILIERTE BESCHREIBUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft im Wesentlichen homogene Zubereitungen von N-terminal chemisch modifizierten Proteinen und Verfahren dafür.
In einem Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung N-terminal chemisch modifzierte G-CSF-Zusammensetzungen und Verfahren dafür.
Die vorliegenden Verfahren (für sowohl N-terminal modifiziertes G-CSF als auch die vorliegenden Verfahren der reduktiven Alkylierung) ermöglichen eine im wesentlichen homogene Mischung eines Monopolymer/Protein-Konjugats. "Im Wesentlichen homogen", wie hier verwendet, bedeutet, dass alle Polymer/Protein-Konjugate nur einen Polymerteil besitzen. Die Zubereitung kann nicht reagiertes Protein enthalten (d. h. ohne einen Polymerteil). Wie durch Peptid-Mapping und N-terminale Sequenzierung überprüft, stellt ein nachstehendes Beispiel eine Präparation bereit, die wenigstens 90% Monopolymer/Protein-Konjugat enthält und maximal 10% nicht reagiertes Protein. Bevorzugt beträgt das N-terminal monopegylierte Material wenigstens 95% der Zubereitung (wie in dem nachstehenden Beispiel) und insbesondere beträgt das N-terminal monopegylierte Material 99% der Zubereitung oder mehr. Das Monopolymer/Protein-Konjugat besitzt biologische Aktivität. Die vorliegenden "im Wesentlichen homogenen" N-terminal pegylierten G-CSF-Zubereitungen, die hier bereitgestellt werden, sind ausreichend homogen, um die Vorteile einer homogenen Zubereitung zu zeigen, wie Eignung für eine klinische Anwendung durch die Vorhersagbarkeit der Pharmakokinetiken von Probe zu Probe.
Man könnte eine Mischung von Polymer/Protein-Konjugaten herstellen und der Vorteil der hier ermöglicht wird ist, dass man den Anteil des Monopolymer/Protein-Konjugats in der Mischung wählen kann. So kann man, falls gewünscht, eine Mischung von verschiedenen Proteinen mit einer verschiedenen Zahl an gebundenen Polymergruppen (d. h. Di-, Tri-, Tetra-, usw.) herstellen und diese Mischung mit dem unter Verwendung der vorliegenden Verfahren hergestellten Monopolymer/Protein-Konjugat vereinigen und so eine Mischung mit einem vorgegebenen Anteil an Monopolymer/Protein-Konjugat erhalten.
Nachstehend ist ein Beispiel mit G-CSF als ein therapeutisches Protein zur Behandlung hämatopoetischer Krankheiten gegeben. Im Allgemeinen kann das G-CSF, das zur Durchführung dieser Erfindung verwendet wird, aus einem Säugerorganismus isoliert werden oder kann alternativ dazu ein Produkt von chemischen Syntheseverfahren oder prokaryotischer oder eukaryotischer Wirtsexpression von exogenen DNA-Sequenzen, erhalten durch die Klonierung von genomischer oder cDNA oder durch DNA-Synthese, sein. Geeignete prokaryotische Wirte beinhalten verschiedene Bakterien (z. B. E. coli); geeignete eukaryotische Wirte beinhalten Hefe (z. B. S. cerevisiae) und Säugerzellen (z. B. Chinese hamster ovary cells, Affenzellen). In Abhängigkeit von dem verwendeten Wirt kann das G-CSF-Expressionsprodukt mit Säuger- oder anderen eukaryotischen Kohlenhydraten glykosyliert sein oder es kann nicht glykosyliert sein. Das G-CSF-Expressionsprodukt kann auch einen Methioninrest am Anfang tragen (an der Position-1). Die vorliegende Erfindung umfasst die Verwendung von jedem und allen diesen G-CSF-Molekülen, obwohl rekombinantes G-CSF, vor allem aus E. coli, aufgrund unter anderem der größten kommerziellen Praktikabilität bevorzugt ist.
Bestimmte G-CSF-Analoga wurden als biologisch funktionell beschrieben und diese können ebenfalls in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung chemisch modifiziert sein, zum Beispiel der Zusatz eines oder mehrerer Polyethylenglykol-Moleküle. G-CSF-Analoga werden in US-PS 4,810,643 beschrieben. Beispiele von anderen G-CSF-Analoga, von denen eine biologische Aktivität beschrieben wurde, sind in AU-A-786380/91, EP 0 459 630 , EP 0 272 703 , EP 0 473 268 und EP 0 335 423 beschrieben, obwohl nicht die Aktivität von jedem beschriebenen Analoga dargestellt wird. Vgl. auch AU-A-10948/92, PCT/US94/00913 und EP 0 243 153 .
Im Allgemeinen können die für die vorliegende Erfindung geeigneten G-CSFs und Analoga davon mittels Durchführung der chemischen Modifizierungsverfahren bestimmt werden, und, um wie hier beschrieben, selektiv die N-terminale alpha-Aminogruppe chemisch zu modifizieren und das resultierende Produkt auf die gewünschten biologischen Charakteristika zu testen, wie durch die hier beschriebenen biologischen Aktivitätstests. Natürlich kann man, falls man dies bei einer Behandlung von nicht menschlichen Säugern wünscht, rekombinante, nicht menschliche G-CSFs verwenden, wie rekombinantes G-CSF aus Maus, Rind, Hund, usw.; vgl. z. B. PCT WO 91 05798 und PCT WO 89 10932.
So beinhaltet ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt Zusammensetzungen mit N-terminal chemisch modifizierten G-CSF-Analoga. Wie vorstehend beschrieben, können G-CSF-Analoga Proteine mit zusätzlichen Aminosäuren, mit Deletionen und/oder Substitutionen beinhalten (im Vergleich zu der in nachstehendem Beispiel 1 beschriebenen Aminosäuresequenz von G-CSF). Die G-CSF-Analoga, die erwartungsgemäß in einem N-terminal pegylierten Zustand selektiv die Produktion von Neutrophilen stimulieren sind die mit einem N-Terminus, der nicht für die Bindung an einen G-CSF-Rezeptor erforderlich ist. Vgl. Hill et al., PNAS-USA 90, 5167–5171 (1993); vgl. auch PCT/US94/00913.
Die verwendeten Polymer-Moleküle können aus wasserlöslichen Polymeren ausgewählt werden. Für das hier beschriebene Verfahren zur reduktiven Alkylierung sollten die Polymere ein einzelnes reaktives Aldehyd aufweisen. Das ausgewählte Polymer sollte wasserlöslich sein, so dass das Protein, an das es angebunden wird, nicht in einer wässrigen Umgebung ausfällt, wie z. B. einer physiologischen Umgebung. Für eine reduktive Alkylierung sollte das gewählte Polymer ein einziges reaktives Aldehyd besitzen, so dass der Grad der Polymerisation wie durch die vorliegenden Verfahren ermöglicht gesteuert werden kann. Das Polymer kann verzweigt oder unverzweigt sein. Bevorzugt soll für eine therapeutische Verwendung des Endprodukts das Polymer pharmazeutisch verträglich sein. Ein Fachmann wird aufgrund von Überlegungen fähig sein, das gewünschte Polymer auszuwählen, wie z. B., ob das Polymer/Protein-Konjugat therapeutisch verwendet werden soll, und falls dies der Fall ist, aufgrund der gewünschten Dosierung, Zirkulationsdauer, Proteolyseresistenz und anderen Überlegungen. Für G-CSF könnten diese Punkte unter Verwendung der hier beschriebenen Tests ermittelt werden und ein Fachmann sollte die geeigneten Tests für andere therapeutische Proteine auswerten. Das wasserlösliche Polymer kann zum Beispiel aus der oben aufgelisteten Gruppe (in dem Abschnitt „Hintergrund") und Dextran oder Poly(n-vinylpyrrolidon)polyethylenglykol, Propropylenglykol-Homopolymere, Prolypropylenoxid/ethylenoxid-Copolymere, polyoxethylierte Polyole und Polyvinylalkohol ausgewählt sein.
In den Überlegungen zur Optimierung, wie nachstehend ausgeführt, kann das Polymer irgendeinem Molekulargewicht entsprechen und kann verzweigt oder unverzweigt sein. Für Polyethylenglykol beträgt das bevorzugte Molekulargewicht zwischen etwa 2 kDa und etwa 100 kDa (die Bezeichnung "etwa" weist darauf hin, dass einige Moleküle in den Polyethylenglykol-Präparationen mehr wiegen werden und manche weniger als das festgelegte Molekulargewicht). Nachstehende Beispiele 1 und 2 beinhalten die Verwendung von PEG 6000, das zur Erleichterung der Reinigung und zur Bereitstellung eines geeigneten Modellsystems gewählt wurde. Es können andere Größen verwendet werden, abhängig von den gewünschten therapeutischen Merkmalen (z. B. die Dauer der gewünschten verzögerten Freisetzung, die Wirkungen hinsichtlich biologischer Aktivität, die Handhabung, das Ausmaß oder das Fehlen einer antigenen Wirkung und weitere bekannte Wirkungen des Polyethylenglykols auf ein therapeutisches Protein oder ein Analogon).
Ein spezifischer erfindungsgemäßer Aspekt ist N-terminal monopegyliertes G-CSF, umfassend einen Polyethylenglykolteil und einen G-CSF-Teil. Für die beschriebenen Zusammensetzungen kann man aus einer Reihe von Polyethylenglykolmolekülen auswählen (aufgrund des Molekulargewichts, der Verzweigung, usw.), der Menge an Polytethylenglykolmolekülen im Vergleich zu G-CSF-Proteinmolekülen in der Reaktionsmischung, die Art der durchzuführenden Pegylierungsreaktion, das Verfahren zum Erhalt des gewünschten N-terminal pegylierten G-CSF und die Art des zu verwendenden G-CSF. Weiterhin beinhalten die vorliegenden Zusammensetzungen und Verfahren eine Formulierung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, Verfahren zur Behandlung und Herstellung von Medikamenten.
Das Verhältnis von Polyethylenglykolmolekülen zu Proteinmolekülen wird variieren, genauso wie deren Konzentrationen in der Reaktionsmischung. Im Allgemeinen wird das optimale Verhältnis (in Bezug auf die Reaktionseffizienz, damit kein Überschuss an unreagiertem Protein oder Polymer besteht) durch das Molekulargewicht des gewählten Polyethylenglykols bestimmt. Zusätzlich kann das Verhältnis von der Zahl der möglichen reaktiven Gruppen (typischerweise alpha- oder epsilon-Aminogruppen) abhängen, da ein Beispiel der vorliegenden Verfahren nicht spezifische Pegylierung und spätere Reinigung von N-terminal monopegylierten Spezies verwendet. Ein Ausführungsbeispiel verwendete ein ziemlich niedriges Verhältnis von Protein : PEG-Molekülen in der Reaktion zur Herstellung von im Allgemeinen monopegyliertem Material (1,5 PEG-Moleküle pro Proteinmolekül).
Zur Herstellung von N-terminal pegyliertem G-CSF kann das Pegylierungsverfahren aus verschiedenen Verfahren gewählt werden, wie vorstehend beschrieben, oder das Verfahren kann die vorliegende reduktive Alkylierung, wie in nachstehendem Beispiel 2 beschrieben, verwenden. Ein Verfahren, das keine Linker-Gruppe zwischen dem Polyethylenglykolteil und dem Proteinteil verwendet, wird in Francis et al., in: Stability of protein pharmaceuticals: in vivo pathways of degradation and strategies for protein stabilization (Herausgeber Ahern, T. und Manning, M. C.), Plenum, New York, 1991) beschrieben. Delgado et al., "Coupling of PEG to Protein by Activation With Tresyl Chloride, Applications in Immunoaffinity Cell Preparation", in: Fisher et al., Herausgeber, Separations Using Aqueous Phase Systems, Applications in Cell Biology and Biotechnology, Plenum Press, N.Y.N.Y., 1989, Seiten 211–213, beinhaltet ebenfalls die Verwendung von Tresylchlorid, was zu keiner Linker-Gruppe zwischen dem Polyethylenglykolteil und dem Proteinteil führt. Dieses Verfahren kann für die Herstellung von therapeutischen Produkten schwierig sein, da die Verwendung von Tresylchlorid giftige Nebenprodukte produzieren kann. Eines der vorliegenden Beispiele beinhaltet die Verwendung von N-Hydroxysuccinimidylestern von Carboxymethylmethoxypolyethylenglykol. Wie nachstehend genauer ausgeführt, beinhaltet ein zweites Beispiel die Verwendung des vorliegenden Verfahrens der reduktiven Alkylierung.
Das Verfahren zum Erhalt der N-terminal pegylierten G-CSF-Zubereitung (d. h. Abtrennung dieses Restes von anderen monopegylierten Resten, falls nötig) kann mittels Reinigung des N-terminal pegylierten Materials aus einer Gruppe von pegylierten G-CSF-Molekülen erfolgen. Zum Beispiel wird nachstehend ein Beispiel gezeigt, wo pegyliertes G-CSF zuerst durch Ionenaustauschchromatographie aufgetrennt wird, um Material mit einer für monopegyliertes Material charakteristischen Ladung zu erhalten (weiteres multi-pegyliertes Material mit scheinbar derselben Ladung kann vorhanden sein) und die monopegylierten Materialien werden dann mittels Größenausschlusschromatographie aufgetrennt. So wurde N-terminal monopegyliertes G-CSF von anderen monopegylierten Spezies abgetrennt, genauso wie von anderen multi-pegylierten Spezies. Weitere Verfahren sind beschrieben. Zum Beispiel beschreibt PCT WO90/04606, veröffentlicht am 3. Mai 1990, ein Verfahren zur Fraktionierung einer Mischung von PEG-Proteinen, umfassend Auftrennung der PEG/Protein-Addukte in einem PEG-enthaltenden, wässrigen biphasischen System.
In einem anderen Aspekt ermöglicht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur selektiven Gewinnung eines N-terminal chemisch modifizierten Proteins (oder Analogon). Nachstehend ist ein Verfahren zur Proteinmodifikation durch reduktive Alkylierung beschrieben, was die verschiedene Reaktivität von verschiedenen primären Aminogruppen nutzt (Lysin gegenüber dem N-Terminus), die für eine Derivatisierung in einem bestimmten Protein verfügbar sind. Unter geeigneten Reaktionsbedingungen wird eine im Wesentlichen selektive Derivatisierung des Proteins am N-Terminus mit einem Carbonylgruppen enthaltenden Polymer erreicht. Die Reaktion wird bei einem pH durchgeführt, der die Nutzung eines Vorteils aufgrund des pK_a-Unterschieds zwischen den epsilon-Aminogruppen der Lysinreste und der alpha-Aminogruppe des N-terminalen Restes des Proteins erlaubt. Durch eine derartige selektive Derivatisierung wird die Anheftung eines wasserlöslichen Polymers an ein Protein gesteuert: die Anbindung des Polymers findet vor allem am N-Terminus des Proteins statt und es findet keine merkliche Modifikation von anderen reaktiven Gruppen, wie den Aminogruppen der Lysin-Seitenkette, statt.
Überraschenderweise bietet die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer im Wesentlichen homogenen Zubereitung von Molekülen eines Monopolymer/Protein-Konjugats ohne weitere extensive Reinigung, im Gegensatz zur Anwendung anderer chemischer Modifikationen. Zusätzlich ist das Produkt mit einer Aminbindung unerwartet stabiler als ein Produkt mit einer Amidbindung, und dies wird in den nachstehenden Aggregationsstudien gezeigt. Insbesondere bietet die vorliegende Erfindung auch N-terminal pegyliertes Protein, falls Polyethylenglykol verwendet wird, denen möglicherweise antigene Verbindungsgruppen fehlen und bei denen der Polyethylenglykolteil direkt an den Proteinteil ohne Bildung giftiger Nebenprodukte gekoppelt wird.
Die Reaktion kann wie folgt dargestellt werden, (wobei Natriumcyanoborhydrid als beispielhaftes Reduktionsmittel verwendet wird):
So ist ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Polymer/Protein-Konjugats, umfassend (a) Umsetzung eines Proteinrestes mit mehr als einer Aminogruppe mit einem wasserlöslichen Polymerrest unter Bedingungen einer reduzierenden Alkylierung und bei einem pH, der zur selektiven Aktivierung der α-Aminogruppe am Amino-Terminus des Proteinteils geeignet ist, so dass das wasserlösliche Polymer selektiv an die α-Aminogruppe bindet; und (b) Gewinnung des Reaktionsprodukts. Man kann gegebenenfalls, und bevorzugt für ein therapeutisches Produkt, die Reaktionsprodukte von nicht umgesetzten Resten abtrennen.
Ein Aspekt der Erfindung ist, dass eine reduktive Alkylierung eine selektive Verknüpfung des Polymers an ein beliebiges Protein mit einer alpha-Aminogruppe an dem Amino-Terminus bereitstellt und eine im Wesentlichen homogone Zusammensetzung eines Monopolymer/Protein-Konjugats ergibt. Der Ausdruck „Monopolymer/Protein-Konjugat" wird hier verwendet, um eine Zusammensetzung zu bezeichnen, die einen einzelnen Polymerrest umfasst, der an ein Proteinrest verbunden ist (auch umfasst sind solche Konjugate, welche die hier beschriebenen Proteinanaloga verwenden). Das Monopolymer/Protein-Konjugat hat einen Polymerrest, der an dem N-Terminus lokalisiert ist, nicht aber an Amino-Seitengruppen, wie solche von Lysin. Die Zusammensetzung hat vorzugsweise mehr als 80% Monopolymer/Protein-Konjugat und am meisten bevorzugt mehr als 95% Monopolymer/Protein-Konjugat.
Für eine im Wesentlichen homogene Population an Monopolymer/Protein-Molekül-Konjugaten sind die Reaktionsbedingungen derart, dass sie die selektive Anbindung des wasserlöslichen Polymerrestes an den N-Terminus des gewünschten Proteins erlauben. Derartige Reaktionsbedingungen werden im All- gemeinen durch pK_a-Unterschiede zwischen den Lysin-Aminogruppen und der α-Aminogruppe am N-Terminus ermöglicht (wobei der pK der pH ist, an dem 50% der Aminogruppen protoniert sind und 50% nicht protoniert sind). im Allgemeinen können für verschiedene Proteine verschiedene pH verwendet werden um die alpha-Aminogruppen des N-Terminus optimal zu modifizieren.
Der pH beeinflusst auch das zu verwendende Verhältnis an Polymer zu Protein. Im Allgemeinen, sofern der pH niedriger als der pK ist, wird ein größerer Überschuss des Polymers im Vergleich zum Protein erwünscht sein (d. h. je weniger reaktiv die N-terminale α-Aminogruppe ist, desto mehr Polymermoleküle sind nötig, um optimale Bedingungen zu erreichen). Falls der pH höher als der pK ist, muss das Polymer : Protein-Verhältnis nicht so hoch sein (d. h. mehr reaktive Gruppen sind verfügbar und somit sind weniger Polymermoleküle erforderlich).
Eine weitere wichtige Überlegung ist das Molekulargewicht des Polymers. Je höher im Allgemeinen das Molekulargewicht des Polymers, desto weniger Polymermoleküle können an das Protein angebunden werden. Ähnlich sollte eine Verzweigung des Polymers in Betracht gezogen werden, falls diese Parameter optimiert werden. Je höher im Allgemeinen das Molekulargewicht (oder je mehr Verzweigungen), desto höher das Polymer : Protein-Verhältnis.
Für die vorliegende reduktive Alkylierung sollte das reduzierende Agens in wässriger Lösung stabil sein und sollte bevorzugt nur zur Reduktion der am Anfang der reduktiven Alkylierung gebildeten Schiffschen Base fähig sein. Bevorzugte reduzierende Agenzien können aus der Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus Natriumborhydrid, Natriumcyanoborhydrid, Dimethylaminborat, Trimethylaminborat und Pyridinborat. Natriumcyanoborhydrid wurde in den nachfolgenden Beispielen verwendet.
Das wasserlösliche Polymer kann dem vorstehend beschriebenen entsprechen und sollte eine einzige reaktive Aldehydgruppe zur Kopplung an das Protein besitzen. Für Polyethylenglykol wird nachstehend die Verwendung von PEG 6000 zur Kopplung an G-CSF und PEG 12000 an Konsensus-Interferon beschrieben. Es soll bemerkt werden, dass PEG 12000, 20000 und 25000 ebenfalls für G-CSF erfolgreich in dem vorliegenden Verfahren verwendet wurden. Polyethylenglykolpropionaldehyd (vgl. z. B. US-PS 5,252,714 ) ist aufgrund seiner Stabilität in Wasser von Vorteil.
Wie oben angedeutet, sind die vorliegenden Verfahren auf jedes beliebige Protein, das eine N-terminale alpha-Aminogruppe besitzt, oder einem Analog davon im breiten Umfang anwendbar. Zum Beispiel können Proteine, die das Produkt einer in Bakterien exprimierten exogenen DNA-Sequenz sind, einen N-terminalen Methionylrest mit einer alpha-Aminogruppe als Ergebnis der bakteriellen Expression besitzen. Wie oben angedeutet, sind Peptide eingeschlossen, als auch Peptidomimetika und andere modifizierte Proteine. Proteinanaloga, wie die oben beschriebenen G-CSF Analoga und das nicht natürlich vorkommende Konsensus-Interferon sind auch für die vorliegenden Verfahren geeignet.
So können für das vorliegende N-terminal chemisch modifizierte G-CSF alle G-CSFs oder hier beschriebenen Analoga verwendet werden (z. B. die vorstehend beschriebenen). Die nachstehenden Beispiele verwenden in Bakterien produziertes rekombinantes G-CSF mit 174 Aminosäuren und einem weiteren N-terminalen Methionylrest. Wie hier beschrieben, kann die chemische Modifikation mit beliebigen hier beschriebenen wasserlöslichen Polymeren durchgeführt werden und die vorliegenden Beispiele beschreiben die Verwendung von Polyethylenglykol.
Konsensus-Interferon ist ein weiteres Protein, das in den vorliegenden Beispielen verwendet wird. Unten wird die Herstellung von chemisch modifiziertem Konsensus-Interferon bei Verwendung der vorliegenden Verfahren zur reduktiven Alkylierung für eine N-terminale Monopegylierung gezeigt. Somit betreffen andere Aspekte der vorliegenden Erfindung diese Zubereitungen. Wie hier verwendet, bezeichnet humanes Konsensus-Leukozyteninterferon „Konsensus-Interferon" oder „IFN-con", was ein nicht natürlich vorkommendes Polypeptid bezeichnet, das vorwiegend solche Aminosäurenreste einschließt, die in allen natürlich vorkommenden humanen Leukozyteninterferon-Subtypsequenzen vorkommen und welche an einer oder mehreren dieser Positionen, an denen es keine in allen Subtypen übliche Aminosäure gibt, eine Aminosäure einschließt, die vorwiegend an dieser Position vorkommt und keinesfalls einen Aminosäurerest einschließt, der nicht an dieser Position in mindestens einem natürlich vorkommenden Subtyp vorhanden ist. IFN-con umfasst die Aminosäuresequenzen, die als IFN-con1, IFN-con2 und IFN-con3 bezeichnet werden und welche in den Patenten U.S. 4,695,623 und 4,897,471 beschrieben sind, wobei deren gesamter Inhalt unter Bezugnahme eingeschlossen ist (U.S. Patentnr. 4,897,471 und 4,695,623 verwenden die Bezeichnung „α", welche nicht hier verwendet wird). DNA-Sequenzen, die für IFN-con kodieren können wie in den oben beschriebenen Patenten oder durch andere Standardverfahren synthetisiert werden. IFN-con Polypeptide sind vorzugsweise die Expressionsprodukte von hergestellten DNA-Sequenzen, die in bakterielle Wirte transformiert oder transfiziert wurden, speziell in E. coli. Somit stellt IFN-con rekombinantes IFN-con dar. IFN-con wird vorzugsweise in E. coli hergestellt und kann durch für den Fachmann auf dem Gebiet und im Allgemeinen von Klein et al., J. Chromatog. 454: 205–215 (1988) für IFN-con1 beschriebene Verfahren aufgereinigt werden. Gereinigtes IFN-con kann ein Gemisch von Isoformen umfassen, z. B. umfasst gereinigtes IFN-con1 ein Gemisch von Methionyl-IFN-con1, Des-Methionyl-IFN-con1 und Des-Methionyl-IFN-con1 mit einem blockierten N-Terminus (Klein et al., Arc. Biochem. Biophys. 276: 531–537 (1990)). Alternativ, kann IFN-con eine spezifische, isolierte Isoform umfassen. Isoformen von IFN-con werden voneinander durch für den Fachmann bekannte Techniken wie isoelektrische Fokussierung getrennt.
Somit ist ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ein chemisch modifziertes Konsensus-Interferon, wobei der Konsensus-Interferon-Rest ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus IFN-con1, IFN-con2 und IFN-con3. Die chemische Modifikation ist die Verwendung eines hier beschriebenen wasserlöslichen Polymers wie PEG. Die vorliegenden Verfahren zur reduktiven Alkylierung können zur selektiven N-terminalen chemischen Modifikation verwendet werden. Das hier beschriebene Beispiel 3 zeigt ein chemisch modifziertes IFN-con1, das einen IFN-con1-Rest umfasst, der an den N-Terminus eines Polyethylenglykolrestes (PEG 12000) verknüpft ist.
In einem weiteren Aspekt, bringen die vorliegenden Verfahren pegylierte Proteine hervor, wobei der Polyethylenglykolrest direkt an ein Proteinrest verknüpft ist und bei der eine getrennte Verknüpfungsgruppe fehlt und keine toxischen Übergangsprodukte vorhanden sind. Die Beispiele umfassen G-CSF und das hier beschriebene Konsensus-Interferon. Bei einer Population von pegylierten G-CSF-Molekülen, bei denen jeder Polyethylenglykolrest direkt an den G-CSF-Proteinrest verknüpft ist (nicht notwendigerweise eine Population von N-terminalen pegylierten G-CSF-Molekülen) kann man die oben beschriebene reduktive Alkylierung mit oder ohne saurem pH durchführen.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden pharmazeutische Zusammensetzungen des vorstehend erwähnten bereitgestellt. Derartige pharmazeutische Zusammensetzungen können für eine Verabreichung mittels Injektion oder für eine orale, pulmonale, nasale oder andere Verabreichung verwendet werden. Im Allgemeinen fallen pharmazeutische Zusammensetzungen unter die Erfindung, umfassend effektive Mengen des Monopolymer/Protein-Konjugats der Erfindung zusammen mit pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmitteln, Konservierungsmitteln, Lösungsmitteln, Emulgatoren, Hilfsmitteln und/oder Trägerstoffen. Solche Zusammensetzungen beinhalten Verdünnungsmittel mit verschiedenem Puffergehalt (z. B. Tris-HCl, Acetat, Phosphat), pH und Ionenstärke; Zusätze wie Detergenzien und solubilisierende Stoffe (z. B. Tween 80, Polysorbat 80), Antioxidantien (z. B. Ascorbinsäure, Natriummetabisulfit), Konservierungsmittel (z. B. Thimersol, Benzylalkohol) und Füllstoffe (z. B. Lactose, Mannit); Einbau des Materials in Partikel polymerer Verbindungen, wie Polylacetat, Polyglykolsäure, usw. oder in Liposomen. Derartige Zusammensetzungen können den physikalischen Zustand beeinflussen, die Stabilität, die Rate der in vivo-Freisetzung und die Rate der in vivo-Ausscheidung des vorliegenden N-terminal chemisch modifizierten Proteins. Vgl. z. B. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Ausgabe (1990), Mack Publishing Co., Easton, PA 18042), Seiten 1435–1712.
In einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt werden Verfahren zur Behandlung und Herstellung eines Medikaments bereitgestellt. Zustände, die durch eine Verabreichung der vorliegenden Polymer/G-CSF-Konjugate oder Analoga mit den hämatopoetischen biologischen Eigenschaften des natürlichen G-CSF gemildert oder moduliert wurden, sind typischerweise durch eine reduzierte Funktion des hämatopoetischen oder Immunsystems charakterisiert und insbesondere durch eine erniedrigte Zahl an Neutrophilen. Derartige Zustände können im Verlauf einer Therapie zu einem anderen Zweck auftreten, wie Chemotherapie oder Strahlentherapie. Solche Zustände können das Resultat einer Infektionskrankheit sein, wie einer bakteriellen, viralen, Pilz- oder anderen Infektion.
Zum Beispiel entsteht Sepsis aus einer bakteriellen Infektion. Oder ein derartiger Zustand kann erblich sein oder durch die Umweltbedingungen hervorgerufen werden, wie schwere chronische Neutropenie oder Leukämien. Das Alter kann auch eine Rolle spielen. Zum Beispiel können Patienten in der Geriatrie eine verminderte Zahl an Neutrophilen oder verringerte Mobilisierung von Neutrophilen besitzen. Einige dieser Zustände werden zusammengefaßt in Filgrastim (r-met Hu G-CSF) in Clinical Practice, Morstyn, G. und T. M. Dexter, Herausgeber, Marcel Dekker, Inc., N.Y., N.Y. (1993). Andere weniger gut untersuchte Zustände, die durch Verabreichung der vorliegenden Polymer/G-CSF-Konjugate gemildert oder moduliert werden können, können die Verminderung von Lipiden oder Cholesterin im Blut und bestimmte kardiovaskuläre Zustände beinhalten, da G-CSF die Produktion von Plasminogen-Aktivatoren induzieren kann. Die Wirkweise von G-CSF oder Analoga davon bei diesen Behandlungen ist momentan wenig verstanden. Die Zugabe eines wasserlöslichen Polymers, wie Polyethylenglykol, kann dem Patienten praktische Vorteile ermöglichen, dadurch dass eine anhaltende biologische Aktivität die Verabreichung von weniger G-CSF-Injektionen pro Krankheitsverlauf oder Behandlung erlaubt.
Im Allgemeinen sind Bedingungen, welche durch Verabreichung des vorliegenden Polymer/Konsensus-Interferons erleichtert oder moduliert werden können solche, bei denen Konsensus-Interferon einsetzbar ist und umfassen Zellproliferationserkrankungen, virale Infektionen und Autoimunnerkrankungen, wie multiple Sklerose. Siehe McManus Balmer, DICP, The Annals of Pharmacotherapy 24: 761–767 (1990) (Clinical use of biologic response modifiers in cancer treatment: an overview. Part I. The Interferons). Verfahren und Zusammensetzungen zur Behandlung von Zellproliferationserkrankungen bei Verwendung von Konsensus-Interferon sind in PCT WO 92/06707, veröffentlicht am 30. April 1992, welche hier unter Bezugnahme eingeschlossen ist, beschrieben. Zum Beispiel kann Hepatitis (A, B, C, D, E) bei Verwendung der vorliegenden pegylierten Konsensus-Interferon-Moleküle behandelbar sein. Die nachstehenden Beispiele zeigen, dass, in vitro, chemisch modifziertes Konsensus-Interferon die biologische Aktivität von 20% des nicht chemisch modifzierten Konsensus-Interferons besitzt.
Für alle vorstehenden Moleküle wird sich die Information in Hinblick auf geeignete Dosierungsmengen zur Behandlung von verschiedenen Zuständen in verschiedenen Patienten erweitern, sobald weitere Untersuchungen durchgeführt werden und ein Fachmann wird unter Berücksichtigung des therapeutischen Zusammenhangs, des Alters und des allgemeinen Gesundheitszustands des Empfängers fähig sein, eine geeignete Dosierung festzustellen. Im Allgemeinen wird die Dosis für eine Injektion oder Infusion zwischen 0,01 μg/kg und 100 μg/kg Körpergewicht (das Gewicht des Proteins ohne chemische Modifikation) betragen.
Die nachstehenden Beispiele erläutern die verschiedenen vorstehend diskutierten Aspekte. In Beispiel 1 werden die Vorteile von N-terminal pegyliertem G-CSF im Vergleich zu an Lysin 35 oder Lysin 41 monopegyliertem G-CSF (der G-CSF met + 174 Aminosäuren-Version) verdeutlicht. Beispiel 2 erläutert die erfindungsgemäße reduktive Alkylierung bei N-terminal pegyliertem G-CSF. Das Verfahren liefert eine im wesentlichen homogene Zubereitung von N-terminal pegyliertem G-CSF. Beispiel 3 erläutert die vorliegende reduktive Alkylierung in N-terminal pegyliertem Konsensus-Interferon.
BEISPIEL 1
A. Herstellung von rekombinantem menschlichen met-G-CSF
Rekombinantes menschliches met-G-CSF (als "rhG-CSF" oder "r-met-hu-G-CSF" hier bezeichnet) wurde nach dem in der US-PS 4,810,643 , Souza, beschriebenen Verfahren hergestellt. Das verwendete rhG-CSF war ein rekombinantes Expressionsprodukt aus E. coli mit der durch die nachfolgend gezeigte DNA-Sequenz kodierten Aminosäuresequenz (SEQ ID NOs: 1 und 2):
(Dies war auch die nicht pegylierte Zusammensetzung, die für die Kontrolltiere verwendet wurde.) Alternativ kann man gekauftes Neupogen^® für die nachstehenden Pegylierungsverfahren verwenden. Der Inhalt der Packungsbeilage davon ist hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen.
B. Herstellung von pegyliertem G-CSF
Eine Lösung mit 10 mg/ml des vorstehenden rhG-CSF in 100 mM Bicine, pH 8,0, wurde zu festem SCM-MPEG (N-Hydroxysuccinimidylester von Carboxymethylmethoxypolyethylenglykol) (Union Carbide) mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 6000 Dalton gegeben. Dies ergab einen 1,5 molaren Überschuss an SCM-MPEG zu rhG-CSF. Nach einstündigem vorsichtigen Rühren wurde die Mischung mit sterilem Wasser auf 2 mg/ml verdünnt und der pH wurde auf 4,0 mit verdünnter HCl eingestellt. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur durchgeführt. In diesem Stadium bestand die Reaktionsmischung hauptsächlich aus drei Formen an monopegyliertem rhG-CSF, etwas dipegyliertem rhG-CSF, nicht modifiziertem rhG-CSF und Reaktionsnebenprodukt (N-Hydroxysuccinimid).
C. Herstellung von N-terminal pegyliertem rhG-CSF
Die drei Formen an monopegyliertem rhG-CSF wurden voneinander mittels Ionenaustauschchromatographie getrennt. Die Reaktionsmischung wurde auf eine mit Puffer A (20 mM Natriumacetat, pH 4,0) equilibrierte Pharmacia S Sepharose FF-Säule (Pharmacia XK50/30-Behälter mit einem Bettvolumen von 440 ml) (1 mg Protein/ml Säulenmaterial) geladen. Die Säule wurde mit 3 Säulenvolumina Puffer A gewaschen. Das Protein wurde mit einem linearen Gradienten von 0–23% Puffer B (20 mM Natriumacetat, pH 4,0, 1 M NaCl) in 15 Säulenvolumina eluiert. Die Säule wurde dann mit 1 Säulenvolumen an 100% Puffer B gewaschen und mit 3 Säulenvolumina Puffer A rückequilibriert. Die Flussrate für den gesamten Lauf wurde bei 8 ml/min gehalten. Das Eluat wurde bei 280 nm überwacht und 5 ml Fraktionen wurden gesammelt. Die einzelnen monopegylierten Spezies enthaltenden Fraktionen wurden gemäß 1A vereinigt. Die Proben wurden mit einer gerührten 350 ml Amicon-Säule mit einer YM10 76 mm-Membran einkonzentriert.
Vereinigte Fraktionen der Ionenaustauschchromatographie wurden einer Größenausschlusschromatographie unterzogen, um dipegylierte Spezies von monopegylierten Spezies abzutrennen. Typischerweise wurden 5–10 mg in 2–5 ml Lösung auf eine 120 ml Pharmacia Superdex 75 HR 16/60-Säule geladen, die mit 20 mM Natriumacetat, pH 4,0, equilibriert worden war. Die Säule wurde 100 Minuten bei 1,5 ml/min gefahren. 2 ml-Fraktionen wurden gesammelt. Der Proteingehalt des Eluats wurde bei 280 nm überwacht. Fraktionen von getrennten Ausschlägen wurden vereinigt und einer Analyse unterzogen. Die nachstehende Tabelle vergleicht die verhältnismäßigen Ausbeuten für jeden Ausschlag.
TABELLE 1 Relative Ausbeuten und Ort der Modifikation
Unter diesen Bedingungen waren die Lysine an den Positionen 17 und 24 wahrscheinlich nicht signifikant pegyliert.
D. Charakterisierung
Fünf Analysen wurden durchgeführt, um jede Probe zu charakterisieren: (1) SDS-PAGE (1B), (2) Größenausschlusschromatographie mittels HPLC ("SEC-HPLC") (2), (3) Peptid-Mapping-Analyse (3A, 3B und 3C), (4) in vitro-G-CSF-Biotest (4) und (5) in vivo-Test in Hamster (5A und 5B).
Im Hinblick auf die Zusammensetzung jeder Probe zeigen die Resultate, dass im Falle des N-terminal monopegylierten G-CSF die Proben eine mehr als 95% N-terminal pegylierte Zusammensetzung aufwiesen, wobei der Rest wahrscheinlich unpegyliertes Material ist (obwohl der Rest der Proben niedriger als die Detektionsgrenze des Tests ist). Im Hinblick auf die prozentuelle Ausbeute an monopegylierter Substanz für jede der drei Formen des monopegylierten Materials (N-terminal, pegyliert an Lysin 35 und pegyliert an Lysin 41), zeigte die N-terminale und Lysin 41-Fraktion mehr als 97% monopegyliertes, und die Lysin 35-Fraktion etwas weniger pegyliertes Material, möglicherweise aufgrund der Instabilität des Moleküls unter den Testbedingungen. Zusammenfassend wurden die nachstehenden Resultate erhalten:
TABELLE 2 Prozentuale Zusammensetzung des N-terminal pegylierten G-CSF
TABELLE 3 Prozent monopegyliertes Material der drei Spezies
METHODEN

1. SDS-PAGE. SDS-PAGE wurde in einem nicht reduzierenden 4–20% ISS Daiichi Pure Chemicals, Co., Tokyo, Japan, Minigel durchgeführt, unter Verwendung von Coomassie Brillant Blue R-250 als Färbemittel. Das Gel wurde mittels eines Molekular Dynamics Densitometer mit Image Quant eingelesen. Resultate: Resultate sind in 1B gezeigt. Spur Nr. 1 (von links) beinhaltete Molekulargewichts-Proteinstandards (Novex Mark 12 Molecular Weight Standards). Spur 2 enthält 3 μg rhG-CSF Standard. Spur 3 enthält die SCM-PEG-G-CSF-Reaktionsmischung, wobei 10 μg geladen wurden. Spur 4 enthält N-terminal monopegyliertes G-CSF, wobei 10 μg geladen wurden. Spur 5 enthält 10 μg monopegyliertes G-CSF, wobei sich die Pegylierungsstelle am Lysin des 35. Restes ausgehend vom N-terminalen Methionin befindet. Spur 6 enthält 10 μg monopegyliertes G-CSF, wobei sich die Pegylierungsstelle am Lysin des 41. Restes ausgehend vom N-terminalen Methionin befindet. Man erkennt in Spur 3, die das N-terminal monopegylierte Material enthält, eine einzige Bande.
2. Größenausschlusschromatographie, hochauflösende Flüssigkeitschromatographie. SEC-HPLC wurde mit einem Waters HPLC-System mit einer Biosep SEC 3000-Säule unter Verwendung von 100 mM Natriumphosphat, pH 6,9, und einer Flussrate von 1 ml/min 20 Minuten durchgeführt. Das Signal wurde bei 280 nm überwacht. Resultate: Wie aus 2 erkennbar, enthält Spur "C" mit dem N-terminal monopegylierten rhG-CSF einen einzigen Ausschlag, genauso wie "D" (Lys-35 monopegyliertes Material) und "E" (Lys-41 monopegyliertes Material). Dies zeigt eine wesentliche Reinheit der aufgetrennten Fraktionen an monopegyliertem G-CSF.
3. Peptid-Mapping. Die nachstehenden Verfahren wurden verwendet. Drei Proben, bezeichnet als "Mono-PEG-1", "Mono-PEG-2" und "Mono-PEG-3" wurden analysiert. (a) Reduktive Alkylierung. 500 μg-Mengen des Mono-PEG-G-CSF wurden mit einer Speed Vac getrocknet und in einer Konzentration von 1 mg in 950 μl in 0,3 M Tris-HCl mit 6 M Guanidinium HCl und 1 mM EDTA, pH 8,4, gelöst. Proben wurden dann durch Zugabe von Jodessigsäure S-carboxymethyliert und 20 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Proben wurden dann mittels Sephadex G-25 Quick Spin Protein Columns entsalzt und der Puffer ausgetauscht. Nach der Entsalzung und dem Puffertausch wurde die Probenkonzentration auf 0,5 mg/ml mittels zusätzlichen Puffer eingestellt. (b) Endoproteinase SV8-Verdau. Proben wurden mit SV8 (Enzym zu Substrat-Verhältnis von 1 : 25) 26 Stunden bei 25°C verdaut. (c) HPLC-Peptid-Mapping. Protein-Verdaus wurden auf eine Vydak C4-Säule (4,6 × 250 mm, 5 μ Teilchengröße, 300 Å Porengröße) injiziert und die Peptide wurden mittels HPLC unter Verwendung eines linearen Gradienten an Acetonitril in 0,1% TFA ausgewertet. Peptide wurden manuell gesammelt und in einer Speed Vac zur Sequenzanalyse getrocknet. Resultate: Im Vergleich zu einem Referenzstandard (i) (3A) verschwand für "Mono-PEG-1" (das N-terminal monopegylierte Material) ein Ausschlag bei 57,3 Minuten und ein neuer Ausschlag bei 77,5 Minuten erschien; (ii) (3B) für "Mono-PEG-2" (das an Lysin 35 pegylierte Material) nahm die Ausschlagshöhe für ein Peptid mit einer Verzögerungszeit von 30,3 Minuten ab und ein neuer Ausschlag erschien bei 66,3 Minuten: (iii) (3C) für "Mono-PEG-3" (das an Lysin 41 pegylierte Material) war kein Ausschlag bei der Verzögerungszeit von 30,3 Minuten vorhanden und ein neuer Ausschlag erschien bei 66,4 Minuten. Diese Peptide waren die einzigen signifikanten Unterschiede in den Erfassungen der Proben. Es traten einige kleinere unvollständige Spaltungen auf, die auf beiden Seiten des Peptids bei 86,1 Minuten aufgrund der kleineren Verdauunterschiede erkennbar sind. (d) N-terminale Sequenzanalyse. Jedes der "neuen" Peptide der vorstehenden Erfassungen wurde zur Identifikation N-terminal sequenziert. Die getrockneten Peptide wurden in 0,1% TFA gelöst und auf einem ABI-Protein-Sequenzierer sequenziert. Für "Mono-PEG-1" (das N-terminal monopegylierte Material) wurden 60% des "neuen" Ausschlags (bei 77,5 Minuten) für 10 Zyklen sequenziert. Die anfängliche Ausbeute betrug weniger als 5%, was darauf hinweist, dass der N-terminale Methionylrest durch ein Polyethylenglykolmolekül blockiert ist. Es wird darauf hingewiesen, dass dieses anfängliche Peptid in überhaupt keiner anfänglichen Ausbeute resultieren sollte und die beobachtete < 5%-Ausbeute kann aus der Entfernung des Polyethylenglykols von dem N-terminalen Methionyl während der Sequenzanalyse stammen. Die bestimmte Sequenz war die des N-terminalen Peptids, M-T-P-L-G-P-A-S-S. Für "Mono-PEG-2" (das an Lysin 35 pegylierte Material) wurde 80% des gesamten Ausschlagvolumens für den Ausschlag bei 66,3 Minuten gesammelt und wurde für 9 Zyklen sequenziert. Die Ausbeute an Lysin 35 war signifikant niedrig und gibt einen Hinweis auf eine Pegylierung an Position 35. Die Ausbeute von Lysin 41 war mit dem anderen Rest in Übereinstimmung und weist auf keine Modifizierung an dieser Position hin. Die Ausschlaghöhe des Peptids bei 30,3 Minuten vermindert sich in der Ausschlaghöhe im Vergleich zu dem entsprechenden Ausschlag der Standardreferenz. Das Peptid bei 30,3 Minuten macht nur 57,5% der Ausschlagfläche des entsprechenden Peptids aus. Die für diese Spezies ermittelte Sequenz war K-L-C-A-T-Y-K-L. Für "Mono-PEG-3", das Lysin 41-Material, wurde 80% des gesamten Ausschlagvolumens des bei 66,4 Minuten eluierenden gesammelten Peptids für 9 Zyklen sequenziert. Die ermittelte Sequenz war K-L-C-A-T-Y-K-L und enthielt die Lysinreste 35 und 41. Die Ausbeute an Lysin 35 war in Übereinstimmung mit den Ausbeuten von anderen Resten. Die Ausbeute an Lysin 41 war signifikant niedriger und weist auf eine Pegylierung an Position 41 hin. Resultate: "Mono-PEG-1" ist ein N-terminal monopegyliertes Material; "Mono-PEG-2" ist ein Lysin 35 partiell pegyliertes Material; und "Mono-PEG-3" ist ein an Lysin 41 pegyliertes Material. Durch einen Vergleich des Referenzstandards (nicht-pegyliertes G-CSF) und den Erfassungen der Peptide 1, 2 und 3 des monopegylierten G-CSF wurde herausgefunden, dass sowohl die Erfassungen von "Mono-PEG-2" (Lysin 35) und "Mono-PEG-3" (Lysin 41) leicht erniedrigte Ausschlaghöhen für die N-terminalen Peptide zeigen. Dies weist darauf hin, dass das an Lysin 35 und Lysin 41 Material einen kleinen Anteil an N-terminal pegyliertem Material enthält oder dass die N-terminale Methioningruppe zu einem kleinen Prozentsatz pegyliert ist.
4. In vitro-Aktivität. Das Material war aktiv. 4 zeigt die Resultate der in vitro-Tests. Wie man erkennen kann, besaß das N-terminal monopegylierte Material 68% der Aktivität von nicht modifiziertem rhG-CSF. Methoden: Der G-CSF-in vitro-Biotest ist ein mitogener Test, der einen G-CSF-abhängigen Klon von 32D-Zellen der Maus verwendet. Zellen wurden in Iscoves-Medium mit 5% FBS und 20 ng/ml fhG-CSF gehalten. Vor der Zugabe der Probe wurden die Zellen durch zweimaliges Spülen mit Wachstumsmedium ohne rhG-CSF vorbereitet. Eine erweiterte Zwölf-Punkt-rhG-CSF-Standardkurve wurde angefertigt, die sich von 48 bis 0,5 ng/ml (entsprechend mit 4800 bis 50 IU/ml) erstreckt. Vier Verdünnungen, die schätzungsweise in den linearen Bereich der Standardkurve fallen (1000 bis 3000 IU/ml) wurden für jede Probe angefertigt und dreimal getestet. Wegen ihrer erkennbar niedrigeren Aktivität in vitro wurden die pegylierten rhG-CSF-Proben etwa 4–10-mal weniger verdünnt. Ein Volumen von 40 μl einer jeden Verdünnung der Probe oder des Standards wird zu den jeweiligen Vertiefungen auf einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen, enthaltend 10.000 Zellen/Vertiefung, gegeben. Nach 48 Stunden bei 37°C und 5,5% CO₂ wurden 0,5 μm Ci Methyl-³H-Thymidin zu jeder Vertiefung hinzugefügt. 18 Stunden später wurden die Platten geerntet und ausgezählt. Eine Dosis Reaktionskurve (log rhG-CSF-Konzentration gegen CPM-Hintergrund) wurde erstellt und eine lineare Regression der Punkte, die in den linearen Bereich der Standardkurve fallen, wurde durchgeführt. Konzentrationen von unbekannten Testgruppen wurden bestimmt unter Verwendung der resultierenden linearen Gleichung und der Korrektur für die Verdünnung. Resultate: Resultate sind in 4 gezeigt. Wie ersichtlich, zeigt N-terminal monopegyliertes G-CSF die höchste in vitro-biologische Aktivität der 3 monopegylierten Spezies.
5. In vivo-Aktivität. In vivo-Tests bestätigten die Aktivität des N-terminal pegylierten Materials. Die in vivo-Tests wurden durch Verabreichung von 0,1 mg/kg der Probe an männliche Goldhamster mittels einer einzigen subkutanen Injektion durchgeführt. Vier Tiere pro Gruppe und Zeitpunkt wurden ausgeblutet. Serumproben wurden durch eine vollständige Blutauszählung am gleichen Tag, an dem die Proben gesammelt wurden, ausgewertet. Die durchschnittliche Zahl an weißen Blutkörperchen wurde berechnet. Die Reaktion auf jedes Material an dem der einzigen subkutanen Injektion von 0,1 mg/kg darauffolgenden Tag wird in 5A und 5B gezeigt. Zwei der monopegylierten Materialien (N-terminal und Lys-35) zeigten eine verlängerte Reaktion, während die Reaktion auf das an Lysin 41 pegylierte Material keine Erhöhung der in vivo-Aktivität im Vergleich zu nicht modifziertem rhG-CSF zeigte (tatsächlich zeigte es weniger, 5B). Diese Resultate verdeutlichen, dass die Anbindung eines einzigen Polyethylenglykolmoleküls grundlegend das therapeutische Verhalten eines Proteins verändern kann und dass die Vorteile einer Protein-Pegylierung von der modifizierten Stelle abhängen können. Die durchschnittliche Netto-WBC-Fläche unter der Kurve nach der einzigen subkutanen Injektion (berechnet gemäß CRC-Standard Mathematical Tables, 26. Auflage (Beyer, W. H., Herausgeber), CRC-Press Inc., Boca Raton, FL, 1981, Seite 125) war ähnlich für Lys-35 und N-terminal monopegyliertes Formen.

E. Stabilitätsstudien
Zusätzlich wurden Stabilitätsstudien mit den wie oben beschriebenen präparierten N-terminalem und Lys-35 monopegyliertem Formen durchgeführt. Das Lys-41-Material wurde nicht verwendet, da es keine zusätzliche Aktivität gegenüber nicht modifiziertem G-CSF zeigte. Diese Studien zeigen, dass das N-terminal pegylierte G-CSF unerwartet stabiler bei Lagerung ist als das an Lysin 35 monope- gylierte G-CSF. Stabilität wurde in Bezug auf den Abbau des Produkts ermittelt, wie mittels SEC-HPLC dargestellt.
Methoden: N-terminal pegyliertes G-CSF und an Lysin 35 monopegyliertes G-CSF wurden bei zwei pH-Werten untersucht, pH 4,0 und pH 6,0 bei 4°C, jeweils bei bis zu 16 Tagen. Eine Erhöhung des pHs auf 6,0 ermöglicht die Bedingungen für beschleunigte Stabilitätstests. Für die pH 6,0-Proben wurde wie vorstehend beschrieben hergestelltes N-terminal monopegyliertes G-CSF und an Lysin 35 monopegyliertes G-CSF in einen Puffer mit 20 mM Natriumphosphat, 5 mM Natriumacetat, 2,5% Mannit, 0,005% Tween 80, pH 6,0, bei einer Endproteinkonzentration von 0,25 mg/ml gegeben. Mengen von 1 ml wurden in sterilen 3 ml-Injektionsgefäßen aufbewahrt. Jedes dieser Gefäße wurde bei 4°C und 29°C bis zu 16 Tage aufbewahrt. Stabilität wurde durch SEC-HPLC-Analyse bewertet. Falls spätere Messungen die gleichen Ergebnisse brachten (wie durch eine visuelle Untersuchung bestätigt) wie die anfänglichen Messungen (Zeit = 0), wurde die Probe über diese Zeit als stabil betrachtet.
Resultate: Resultate sind in 6A–6C gezeigt.

(a) Vergleich bei pH 6,0 und 4°C. 6A zeigt die 4°C SEC-HPLC-Profile für N-terminal monopegyliertes G-CSF bei pH 6 in Relation zur Zeit und 6B zeigt die 4°C SEC-HPLC-Profile für an Lysin 35 monopegyliertes G-CSF bei pH 6 in Relation zur Zeit. Ein Resultat ist, dass das Lys-35-Material zu einem Material mit einem Molekulargewicht ähnlich zu dem von nicht modifiziertem G-CSF abgebaut wird.
(b) Erweiterte Dauer bei pH 4,0 und 4°C. pH 4,0 und 4°C ermöglicht gleichsam eine Kontrolle, die ziemlich stabile Voraussetzungen verdeutlicht, dadurch dass die N-terminale Form keinen Abbau zeigt. Der Abbau findet für die Lys-35-Form immer noch statt, jedoch bei einer langsameren Rate.
(c) Vergleich bei pH 6,0 und 4°C. 6C zeigt die SEC-HPLC-Profile für die monopegylierten G-CSFs unter diesen Bedingungen und unter einer erweiterten Zeitdauer. Wie erkennbar, zeigt das Lysin-35-Material bei pH 6,0 und 4°C keine Erhöhung der Depegylierung am Tag 16 oder Tag 35 gegenüber der am Tag 6 (6B). Dies weist darauf hin, dass sich die Depegylierung (Instabilität) unter diesen Bedingungen nach Tag 6 nicht ändert.

BEISPIEL 2
Dieses Beispiel zeigt ein Verfahren zur Herstellung einer im Wesentlichen homogenen Population an monopegyliertem G-CSF mittels reduktiver Alkylierung und Charakterisierung dieser Population. Rekombinantes G-CSF wie in dem Beispiel oben beschrieben wurde verwendet. Wie erkennbar, bieten die vorliegenden Verfahren nicht nur Vorteile im Hinblick auf die Ausbeute von N-terminal chemisch modifiziertem Material, sondern die Aminbindungen des Verfahrens der vorliegenden reduktiven Alkylierung produzieren wesentlich mehr stabile Produkte, wie durch einen großen Unterschied in dem Grad der Aggregation während der Aufbewahrung gezeigt.
A. Herstellung des Mono-methoxypolyethylenglykol-G-CSF-Konjugats, wobei sich die Anbindungsstelle am N-terminalen α-Aminorest befindet
Zu einer kalten (4°C) gerührten Lösung von rhG-CSF (1 ml, 5 mg/ml, wie in dem Beispiel oben beschrieben) in 100 mM Natriumphosphat, pH 5, mit 20 mM NaCNBH₃ wurde ein 5facher molarer Überschuss an Methoxypolyethylenglykolaldehyd (MPEG) (durchschnittliches Molekulargewicht, 6 kDa) gegeben. Das Rühren der Reaktionsmischung wurde bei der gleichen Temperatur fortgesetzt.
Das Ausmaß der Proteinmodifikation im Verlauf der Reaktion wurde durch SEC-HPLC überwacht, unter Verwendung einer Bio-Sil SEC 250-5-Säule (Bio-Rad), die mit 0,05 M NaH₂PO₄, 0,05 M Na₂HPO₄, 0,15 M NaCl, 0,01 M NaN₃, pH 6,8, mit 1 ml/min eluiert wurde.
Nach 10 Stunden deutete die SEC-HPLC-Analyse an, dass 92% des Proteins zum Mono-MPEG-G-CSF-Derivat umgesetzt worden waren. Das ist aus 7 ersichtlich, die die Proteinkonzentration wiedergibt (wie durch die Absorption bei A₂₈₀ bestimmt) und die den Ausschlag bei 8,72 Minuten des monopegylierten G-CSF und einen kleineren Ausschlag von nicht reagiertem G-CSF bei 9,78 Minuten zeigt.
Im Vergleich zeigt 8 die Ausschläge bei der Verwendung von N-Hydroxysuccinimidylester von MPEG. Das Molekulargewicht betrug ebenfalls 6 kDa. Wie erkennbar, war die aus dieser Reaktion erhaltene Mischung: Tri-MPEG-G-CSF-Konjugat (Schulter bei etwa 7,25 Minuten), Di-MPEG-G-CSF-Konjugat (Ausschlag bei 7,62 Minuten), Mono-MPEG-G-CSF-Konjugat (Ausschlag bei 8,43 Minuten) und nicht reagiertes G-CSF (Ausschlag bei 9,87 Minuten).
Bei diesem 10 Stunden Zeitpunkt, wo 92% des Proteins zu monopegyliertem Material umgewandelt worden waren, wurde der pH der Reaktionsmischung auf pH 4 mit 100 mM HCl eingestellt und die Reaktionsmischung wurde 5fach mit 1 mM HCl verdünnt.
Das Mono-MPEG-G-CSF-Derivat wurde mittels Ionenaustauschchromatographie mit einer HiLoad 16/10 S Sepharose HP-Säule (Pharmacia), equilibriert mit 20 mM Natriumacetatpuffer, pH 4, gereinigt. Die Reaktionsmischung wurde auf die Säule bei einer Flussrate von 1 ml/min geladen und der nicht reagierte MPEG-Aldehyd eluierte mit 3 Säulenvolumina desselben Puffers. Dann wurde ein linearer Gradient von 0% bis 45% 20 mM Natriumacetat, pH 4, mit 1 M NaCl über einen Zeitraum von 400 Minuten verwendet, um das Protein/Polymer-Konjugat bei 4°C zu eluieren.
Fraktionen mit dem Mono-MPEG-G-CSF-Derivat wurden vereinigt, einkonzentriert und steril filtriert.
Verschiedene Mono-MPEG-G-CSF-Konjugate, erhalten durch Modifikation von rhG-CSF mit MPEG-Aldehyden mit unterschiedlichem durchschnittlichen Molekulargewicht (12, 20 und 25 kDa) wurden in einer ähnlichen Weise hergestellt.
B. Analyse von monopegyliertem G-CSF
1. Molekulargewicht
Das Molekulargewicht der monopegylierten Konjugate wurde mittels SDS-PAGE, Gelfiltration, Matrix-unterstützter Laser-Desorptionsmassenspektrometrie und Gleichgewichtszentrifugation bestimmt. Diese Resultate sind in Tabelle 4, nachstehend, gezeigt. TABELLE 4 Molekulargewicht von N-terminal alkylierten Mono-MPEG-G-CSF-Konjugaten

ND: nicht bestimmt

Die Strukturen der hergestellten N-terminalen Mono-MPEG-G-CSF-Konjugate wurden mittels der Verfahren der N-terminalen Proteinsequenzierung und Peptid-Mapping bestätigt. Bromcyanspaltung des N-terminalen Methionylrestes führte zur Abspaltung des Polyethylenglykols.
2. Biologische Aktivität
Die in vitro-biologische Aktivität der pegylierten MPEG-G-CSF-Konjugate wurde durch Messung der stimulierten Aufnahme von ³H-Thymidin in Knochenmarkszellen von Mäusen bestimmt.
Die in vivo-biologische Aktivität wurde an Hamstern durch subkutane Injektion von MPEG-G-CSF-Konjugaten oder rhG-CSF (zu 100 mg/kg) und Messung der Gesamtzahl an weißen Blutkörperchen bestimmt. Bioaktivität im Vergleich zu nicht derivatisiertem G-CSF wurde als die Fläche unter der WBC/Zeitkurve nach Abzug der Kontrollkurve des Trägers berechnet. Relative Bioaktivität der MPEG-G-CSF-Derivate wurde als Prozent Bioaktivität im Vergleich zu nicht modifiziertem G-CSF ausgedrückt.
Dies ist in 9 gezeigt, deren Kurve eine Reaktion der Gesamtzahl an weißen. Blutkörperchen auf Mono-N-terminale MPEG-G-CSF-Konjugate zeigt, die durch reduktive Alkylierung von rhG-CSF mit MPEG-Aldehyden verschiedenen Molekulargewichts (6 kDa, 12 kDa und 20 kDa) hergestellt wurden. Wie erkennbar, zeigten alle monopegylierten Moleküle eine Reaktion. Je höher das Molekulargewicht des verwendeten Polyethylenglykolrestes, desto höher die erreichte Zahl an weißen Blutkörperchen, mit der Ausnahme, dass die 12 kDa-Probe eine etwas höhere Zahl als die 20 kDa-Version am Tag 2 erreichte.
3. Stabilitätsuntersuchungen
N-terminal pegylierte G-CSFs, hergestellt durch die zwei verschiedenen chemischen Verfahren (Amid vs. Amin der reduktiven Alkylierung hier) wurden im Hinblick auf den Grad der Aggregation verglichen. Unerwarteterweise fand man, dass N-terminal pegyliertes G-CSF, erhalten durch das Amin-Verfahren, wesentlich stabiler ist als N-terminal pegyliertes G-CSF mit einer Amidbindung (chemisches NHS-Verfahren, wie in Beispiel 1 beschrieben).
Methoden: Beide N-terminal pegylierten G-CSF-Proben fanden sich in 10 mM NaOac, pH 4,0, mit 5% Sorbit bei einer Konzentration von 1 mg Protein/ml. Die G-CSFs wurden beide mit PEG 6000 pegyliert. Das Amid-gebundene Konjugat wurde wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt und das Amin-gebundene Konjugat wurde wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt. Jeweils 6 Proben wurden 8 Wochen bei 45°C aufbewahrt. Nach dem Ende der 8 Wochen wurde der Grad an Aggregation mittels Größenausschlusschromatographie und Ionenaustauschchromatographie bestimmt.
Resultate: Die Resultate zeigen, dass das vorliegende Verfahren der reduktiven Alkylierung gegenüber einer Acylierung vorteilhaft ist, da es überraschenderweise ein Material mit bei weitem weniger Aggregaten nach 8 Wochen bei erhöhten Temperaturen bildet. Die nachstehende Tabelle zeigt den prozentualen Teil an nicht aggregiertem Material (Material des "Hauptausschlags") für beide Materialien mittels Größenausschlusschromatographie (SEC) oder Ionenaustauschchromatographie (IE):
TABELLE 5
BEISPIEL 3
Dieses Beispiel erläutert klinisch modifiziertes Konsensus-Interferon. Insbesondere zeigt dieses Beispiel ein Verfahren zur Herstellung einer im Wesentlichen homogenen Population von monopegyliertem IFN-con₁ und die Charakterisierung dieser Population.
Es ist anzumerken, dass jedes der oben aufgeführten Konsensus-Interferone chemisch modifiziert sein können, während in dem vorliegenden Beispiel IFN-con₁ verwendet wird. Eine solche chemische Modifikation kann mit einem beliebigen der oben aufgeführten wasserlöslichen Polymere stattfinden, obwohl hier PEG verwendet wird. Für eine Pegylierung wird hier PEG 12000 verwendet, obwohl eine beliebige lösliche PEG-Form verwendet werden kann (PEG 12000 wurde ausgewählt aufgrund der einfachen Handhabung und Einsetzbarkeit). Es sind wiederum eine Reihe von Mittel zur chemischen Modifikation (wie Acetylierung) erhältlich, aber für eine selektive N-terminale chemische Modifikation, wie eine N-terminale Pegylierung, wird das in diesem Beispiel beschriebene vorliegende reduktive Alkylierungsverfahren bevorzugt.
A. Herstellung von Konsensus-Interferon
IFN-?con₁ (hier als IFN-con₁ bezeichnet) wie es in der 2 von U.S. Patent Nr. 4,695,623 beschrieben wird und hier unter Bezugnahme vollständig eingeschlossen ist, wurde zur Herstellung von monopegyliertem Konsensus-Interferon verwendet. Das IFN-con₁ wurde hergestellt durch Expression einer exogenen DNA in Bakterien und enthielt einen Methionyl-Rest an dem N-Terminus.
B. Pegylierung von Konsensus-Interferon
Es wurde zu einer gekühlten (4°C) gerührten Lösung von IFN-con₁ (3,45 mg/ml, enthaltend 35,25% der N-terminalen blockierten Form) in 100 mM Natriumphosphat, pH 4,0, enthaltend 20 mM NaCNBH₃ wurde ein 8facher molarer Überschuss von Methoxypolyethylenglykolaldehyd (MPEG) (durchschnittliches Molekulargewicht 12 kDa) zugeführt.
Der Grad der Proteinmodifikation während des Reaktionsverlaufs wurde durch eine Umkehrphasen-HPLC überwacht bei Verwendung einer Polymer-basierenden Poly(styrol/divinylbenzol)säule wie PLRP-S (PL Separation Sciences Polymer Laboratories).
Nach 10 Stunden zeigte die Umkehrphasen-HPLC-Analyse, dass 80% des Proteins mit einer nicht blockierten ?-Aminogruppe an dem N-Terminus zu einem MPEG-IFN-con₁-Derivat umgewandelt worden ist.
Nach dem 10-Stunden-Zeitpunkt wurde das Reaktionsgemisch 5-mal mit Wasser verdünnt und das Mono-MPEG-IFN-con₁-Derivat wurde durch Ionenaustauschchromatographie aufgereinigt unter Verwendung einer HiLoad 16/10 S-Sepharose-HP-Säule (Pharmacia), welche mit 20 mM Natriumacetatpuffer, pH 4,0 equilibriert wurde. Das Reaktionsgemisch wurde auf der Säule bei einer Durchflussrate von 1 ml/min geladen und das nicht reagierte MPEG-Aldehyd wurde mit drei Säulenvolumen desselben Puffers eluiert. Dann wurde ein linearer 420-Minuten-Gradient von 0 bis 75% des 20 mM Natriumacetats, pH 4,0, enthaltend 1 mol NaCl verwendet, um das Protein-Polymer-Konjugat bei 4°C zu eluieren.
Die Fraktionen, welche Mono-MPEG-IFN-con₁-Derivat enthielten, wurden vermengt, konzentriert und steril filtriert.
C. Analyse von monopegyliertem Konsensus-Interferon
1. Homogenität
Die Homogenität der gereinigten Mono-MPEG-IFN-con₁-Konjugate wurde durch SDS-PAGE unter Verwendung von 10 bis 20% oder 4 bis 20% vorgefertigten Gradientengelen (Integrated Separation Systems) bestimmt. Die Gele zeigten eine Hauptbande bei MW 35 kDa.
Um die wirksame Größe jeder Mono-MPEG-IFN-con₁-Form zu bestimmen (hydrodynamischer Radius) wurde eine Superose-6-HR 10/30 (Pharmacia)-Gelfiltrationssäule verwendet. Die Proteine wurden durch UV-Absorption bei 280 nm nachgewiesen. Die BIO-RAD Gelfiltrationsstandards dienten als globuläre Protein/Molekulargewichtsmarker.
Die Struktur der gereinigten N-terminalen Mono-MPEG-IFN-con₁-Konjugate wurden bestätigt unter Verwendung von Verfahren zur N-terminalen Proteinsequenzierung und Peptidkartierung.
Es ist anzumerken, dass diese IFN-con₁-Zubereitung einiges N-terminal blockiertes Material enthielt, und dieses Material war nicht pegyliert. Das Material, das pegyliert war, war jedoch an dem N-Terminus monopegyliert. Somit wünscht man sich in dieser Situation andere Mittel zu verwenden, um das blockierte von dem nicht blockiertem Material abzutrennen, wie Ionenaustausch- oder Größenausschlusschromatographie.
2. Biologische Aktivität
Die biologische Aktivität der Mono-MPEG-IFN-con₁-Konjugate in vitro wurde durch Messung deren antiviralen Bioaktivität bestimmt. Die biologische Aktivität der Mono-MPEG-IFN-con₁-Konjugate in vitro wurde durch Messung deren antiviralen Bioaktivität in menschlichen (HeLa)-Zellen bestimmt.
Es wurde festgestellt, dass das Mono-MPEG (12 kDa)-IFN-con₁-Konjugat eine in vitro-Bioaktivität von 20% aufweist (in E/mg Protein) im Vergleich zu der nicht modifizierten Form. Wie oben für pegyliertes G-CSF beschrieben, können die in vitro-Assays einen ziemlich niedrigen Spiegel der Aktivität von klinisch modifizierten Proteinen aufgrund ihrer charakteristischen fortlaufenden Freisetzung aufweisen, während sie zum Bestimmen der biologischen Aktivität nützlich sind. Die in vivo biologische Aktivität kann höher sein als die in vitro biologische Aktivität.
D. Chemisch modifiziertes Konsensus-Interferon mit entfernten N-terminal blockierten Molekülen
Die vorliegende reduktive Alkylierung wurde auch auf dem oben genannten IFN-con₁ durchgeführt, bei dem der Teil der N-terminal blockierten Moleküle vorher entfernt wurde. Es wurden sowohl PEG 12000 und PEG 20000 in dem oben beschriebenen reduktiven Alkylierungsverfahren verwendet. Die apparenten Molekulargewichte waren wie folgt:
Die Analyse des IFN-con₁ ergab bei der FPLC-Ionenaustauschchromatographie drei Spitzen: Mono-MPEG-IFN-con₁: 66% der Gesamtfläche (eluiert bei 265,93 ml)
Proteinaggregat und Oligo-MPEG-IFN-con₁-Konjugat: 24% der Gesamtfläche (eluiert bei 238,42 ml) und
nicht reagiertes IFN-con₁: 10% der Gesamtfläche (eluiert bei 328,77 ml).
Die Bedingungen wurden nicht weiter optimiert. Man kann das monopegylierte Material mit chromatographischen oder anderen Verfahren weiter auftrennen.
Während die vorliegende Erfindung anhand bevorzugter Ausführungsformen beschrieben wurde, sollen Variationen und Modifikationen davon für den Fachmann auf dem Gebiet ersichtlich sein. Daher ist es beabsichtigt, dass die anhängenden Ansprüche alle äquivalenten Variationen, die innerhalb des beanspruchten Schutzumfangs der Erfindung fallen, eingeschlossen sind.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Herstellung eines N-terminal monopegylierten Polypeptids umfassend die Schritte: (a) Reagieren eines Polypeptids, das eine Alpha-Aminogruppe an dessen N-Terminus hat, mit einem wasserlöslichen Polyethylenglycol, das eine einzelne Aldehydgruppe hat, in wässriger Lösung, unter Bedingungen einer reduktiven Alkylierung und bei einem pH, der genügend sauer ist, um die Alpha-Aminogruppe selektiv zu aktivieren und (b) Auftrennen des N-terminal monopegylierten Polypeptids von dem Reaktionsgemisch.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das verwendete Polyethylenglycol ein Molekulargewicht zwischen ungefähr 2 kDa und 100 kDa hat.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das verwendete Polyethylenglycol ein Molekulargewicht zwischen ungefähr 6 kDa und 25 kDa hat.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das verwendete Polyethylenglycol ein Methoxy-polyethylenglycolaldehyd ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das bei der reduktiven Alkylierung verwendete reduzierende Agens Natriumborhydrid oder Natriumcyanborhydrid ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das verwendete Polypeptid Konsensus-Alpha-Interferon ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das verwendete Konsensus-Alpha-Interferon einen Methionin-Rest an dessen N-Terminus an Position-1 aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der Auftrennungsschritt (b) eine Aufreinigung umfasst.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Aufreinigung eine Ionenaustauschchromatographie des Reaktionsgemisches und eine Größenausschlusschromatographie umfasst.
N-terminal monopegyliertes Konsensus-Alpha-Interferon, erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein N-terminal monopegyliertes Konsensus-Alpha-Interferon nach Anspruch 10.