이하, 본 발명의 인간 과립구콜로니자극인자 변이체 및 이의 접합체를 상세히 설명한다.
본 발명에 있어서, 천연형 G-CSF는 서열번호 1로 표현되고, 재조합 G-CSF(rG-CSF)는 서열번호 2로 표현된다. G-CSF는 특별한 언급이 없는 한, 본 발명에서 천연형 G-CSF 및 재조합 G-CSF를 모두 포함하여 사용될 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 인간 과립구콜로니자극인자(G-CSF)의 133번 위치의 트레오닌(Thr)잔기가 시스테인(Cys)잔기로 치환되어 있는 서열번호 3의 인간 과립구콜로니자극인자 변이체를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 인간 과립구콜로니자극인자(G-CSF)의 133번 위치의 트레오닌(Thr)잔기가 시스테인(Cys)잔기로 치환되어 있고, 상기 치환된 시스테인(Cys)잔기에 비 단백질 화학물이 수식된 인간 과립구콜로니자극인자 변이체의 접합체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 133번 위치의 트레오닐(Thr)잔기가 시스테인(Cys)잔기로 치환되고, 17번 시스테인(Cys)잔기가 세린(Ser)잔기로 치환된 서열번호 4의 단백질에, 상기 치환된 133번 시스테인(Cys)잔기에 비 단백질 화학물이 수식된 인간 과립구콜로니자극인자(G-CSF) 변이체의 접합체를 제공한다.
상기 비 단백질 화학물은 133번 시스테인의 티올기에 화학적으로 접합하기 위한 활성화된 생체적합성 고분자 물질로서, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리카르복실산 및 폴리비닐피롤리돈으로 이루어진 군에서 선택된 1종과 말레이미드(maleimide), 비닐설폰(vinyl sulfone), 이오도아세트아미드(iodacetamide) 및 오르토피리딜 디설파이드(orthopyridyl disulfide)로 이루어진 군에서 선택된 1종이 결합된 것이 바람직하고, 폴리에틸렌글리콜과 말레이미드가 결합된 생체적합성 고분자인 것이 더욱 바람직하다.
또한, 상기 비 단백질 화학물은 2 내지 100 kDa의 분자량을 가지는 것이 바람직하고, 5 내지 100 kDa의 분자량의 폴리에틸렌글리콜인 것이 더욱 바람직하다.
한편, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 인간 과립구콜로니자극인자(G-CSF)의 135번 위치의 글리신(Gly)잔기와 136번 위치의 알라신(Ala)잔기 사이에 시스테인(Cys)잔기가 삽입된 서열번호 5의 인간 과립구콜로니자극인자 변이체를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 인간 과립구콜로니자극인자(G-CSF)의 135번 위치의 글리신(Gly)잔기와 136번 위치의 알라신(Ala)잔기 사이에 시스테인(Cys)잔기가 삽입되어 있고, 상기 삽입된 시스테인(Cys)잔기에 비 단백질 화학물이 수식된 인간 과립구콜로니자극인자 변이체의 접합체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 인간 과립구콜로니자극인자(G-CSF)의 135번 위치의 글리신(Gly)잔기와 136번 위치의 알라신(Ala)잔기 사이에 시스테인(Cys)잔기가 삽입되고, 17번 시스테인(Cys)잔기가 세린(Ser)잔기로 치환된 서열번호 6의 단백질에, 상기 삽입된 136번 시스테인(Cys)잔기에 비 단백질 화학물이 수식된 인간 과립구콜로니자극인자(G-CSF) 변이체의 접합체를 제공한다.
상기 비 단백질 화학물은 135번 위치의 글리신(Gly)잔기와 136번 위치의 알라닌(Ala)잔기 사이에 삽입된 시스테인(Cys)잔기의 티올기에 화학적으로 접합하기 위한 활성화된 생체적합성 고분자 물질로서, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리카르복실산 및 폴리비닐피롤리돈으로 이루어진 군에서 선택된 1종과 말레이미드(maleimide), 비닐설폰(vinyl sulfone), 이오도아세트아미드(iodacetamide) 및 오르토피리딜 디설파이드(orthopyridyl disulfide)로 이루어진 군에서 선택된 1종이 결합된 것이 바람직하고, 폴리에틸렌글리콜과 말레이미드가 결합된 생체적합성 고분자인 것이 더욱 바람직하다.
또한, 상기 비 단백질 화학물은 2 내지 100 kDa의 분자량을 가지는 것이 바람직하고, 5 내지 60 kDa의 분자량의 폴리에틸렌글리콜인 것이 더욱 바람직하다.
본 발명에서 이용되거나, 제조되는 인간 G-CSF 변이체는 화학적으로 합성하거나, 게놈 또는 cDNA 클로닝에 의해 수득한 외인성 DNA 서열을 원핵 또는 진핵 숙 주세포에서 유전공학적 방법으로 발현시켜 제조할 수 있다. 숙주로서는 대장균(예를 들어, E. coli) 또는 효모(예를 들어, S. cerevisias) 및 포유동물 세포(예를 들어, 중국 햄스터 난소세포, 원숭이 세포)를 포함한다. 사용한 숙주에 따라, G-CSF 변이체는 글리코실화될 수 있거나, 비-글리코실화될 수 있으며 초기 메티오닌 잔기를 포함할 수 있다. G-CSF 변이체는 형질전환된 포유동물 유기체로부터 생산될 수 있으며 이때 G-CSF 변이체는 소, 양, 돼지, 토끼, 염소의 유(milk), 혈액 및 뇨(urine)에서 채취될 수 있다.
도입된 자유 시스테인(cysteine)에 PEG를 부가하기 위해서는 PEG 부가 후에도 생물학적 활성이 유지되며 또한 용이하게 PEG접합이 가능한 위치에 자유 시스테인이 도입된 G-CSF 변이체 제작이 필요하다. 이에 본 발명자들은 상기 목적을 달성하기 위해 구조적으로 유연한 CD-loof 부분에 치환 또는 삽입으로 자유 시스테인을 도입한 후, 도입된 자유 시스테인에 PEG를 접합하여 이들 변이체 들 중 PEG 접합 과정에서 G-CSF 변이체 및 G-CSF 변이체-PEG 접합물의 안정성이 유지되고 G-CSF 변이체-PEG 접합물의 생물학적 활성이 유지되는 G-CSF 변이체를 선별하였다.
G-CSF의 X-ray 회절구조(PDB ID, 1bgc )에서 G-CSF의 CD loop은 상당히 유연하며 G-CSF 전체 구조에 큰 영향을 미치지 않는 부위로 판단되어 CD loop (rG-CSF(서열번호 2)의 Gly126 -Ser143)부위에 시스테인이 도입된 변이체들을 제작하였다. CD loop부위는 몇몇 X ray 결정 구조 (PDB ID, 1bgc)에서 볼 수 있듯이 그 구조가 불분명한 영역으로 구조적으로 유연한 부분으로 예측되며, PEG 접합에 의한 구조적 변화를 충분히 완충화할 수 있는 부위로 예상하였다. 또한 충분히 외부에 노출되어 있어 고분자 물질의 접근이 용이하고 receptor 결합 구조에 있어서도 receptor와 overlap되는 부위가 없어 화학적 접합에 유리한 위치라 예측되었다.
이에 본 발명자들은 G-CSF의 CD loop부위(서열번호 2의 126-Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser-143)에 시스테인이 도입된 변이체를 제작하고 도입된 시스테인을 PEG 접합시키는 과정의 screening과정을 수행하였고, 그 결과 각각의 시스테인 도입 변이체들은 그 위치에 따라 안정성 및 PEG 접합에서 큰 차이를 보였다. 몇몇 변이체는 안정하여 발현 및 정제 과정이 용이하였으나 PEG 접합이 용이하지 않았는 데, 이는 변이가 위치한 주위의 microenvironment가 steric hinderance나 근접 잔기의 영향으로 PEG접합이 용이하지 않음을 의미한다. 또한 몇몇 변이체들은 불안정하여 발현 및 정제가 용이하지 않아 대부분 정제 과정 중 침전을 형성하였다.
시스테인이 도입된 G-CSF 변이체의 PEG 접합에서 기대되는 장점은 첫째, PEG 접합 반응의 정확성에 있다. 단백질의 Lysine 또는 N-terminal amine에 (a)PEG dichlorotriazine, (b)PEG tresylate, (c)PEG succinimidyl carbonate, (d)PEG benzotriazole carbonate, (e)PEG p-nitrophenyl carbonate (f)PEG trichlorophenyl carbonate, (g)PEG carbonylimidazole 및 (h)PEG succinimidyl succinate 등을 매개로 일어나는 PEG 접합은 비 특이적이며 주로 이당량 또는 그 이상의 PEG가 접합되거나, 동일한 당량의 PEG가 접합되더라도 다른 위치에 접합된 위치 이성체(isomer)가 생성된다. 그리고 이를 제거하는데 시간과 비용이 많이 소 요된다(M.J. Roberts et al., Chemistry for peptide and protein PEGylation., Advanced Drug Delivery Reviews 54 (2002), 459-476). 그리고 둘째, PEG 접합위치를 선정할 수 있는 장점이 있다. 대부분의 PEG 접합 위치는 Lysine, Aspatate, Glutamate, Alpha-amine, carboxyl과 같이 포괄적이어서 접합 위치가 구조적으로 활성에 중요한 부분에 위치할 경우, PEG접합은 활성을 크게 저하시킨다. 이러한 관점에서 시스테인-도입에 의한 선택적 PEG 접합은 활성을 유지하는 PEG 접합체의 개발에 유용할 것이다.
자유 티올기는 반응성이 높아 산화 (Rigo A et al., Interaction of copper with cysteine: stability of cuprous complexes and catalytic role of cupric ions in anaerobic thiol oxidation, J Inorg Biochem. 2004, 98(9), 1495-501)뿐 아니라 disulfide bond (이황화 결합)를 쉽게 생성하여, 화학적 수식을 위하여 단백질 표면에 도입할 경우 분자간 디설파이드(disuldise) 결합을 생성하여 부차적인 침전을 유발하거나 산화되어 수식(modification)이 불가능하게 되기 쉽다(Crow MK, et.al., Protein aggregation mediated by cysteine oxidation during the stacking phase of discontinuous buffer SDS-PAGE, Biotechniques 2001, 30(2), 311-6). 그리고 이러한 현상은 도입-시스테인(cysteine)의 위치가 외부에 노출될수록 정도가 심해지는 것은 당연하다. 따라서, 선택적 화학 수식 (specific chemical modification)을 위한 시스테인-도입 위치를 선정 시, 구조적인 정보 (structural information)에만 의존하여 시스테인 도입 위치를 선정할 경우, 대부분 상당한 오류, 즉 자유 시스테인에 의한 단백질 불안정성에 봉착하게 된다( Grzegorz Bulaj, Formation of disulfide bonds in proteins and peptides, Biotechnology Advances 23 (2005) 87-92).
본 발명에서 시도된 대부분의 시스테인-도입 G-CSF 변이체는 발현 및 정제 효율이 낮았다. 이와 같은 자유 시스테인을 갖는 단백질의 불안정성 문제를 해결하고자 COX G. N. 등은 시스테인-도입 변이체의 생산에 이들 변이체들의 불안정성을 보완하기 위해 특별히 고안된 방법들을 사용하였다(국제공개 제WO 00/42175호). 그러나 이러한 노력은 자유 시스테인 도입 변이체가 근본적으로 갖는 불안정성을 완화시킬 뿐 생산 공정에 적용하기에는 어려운 면이 많다. 예를 들어 제WO 00/42175호에 설명된 것처럼 단백질의 세포내 발현은 시스테인 도입 변이체의 안정성에 유리하나 이를 정제하기 위해서는 세포 밖으로 유리해야한다. 이때 redox couple등을 이용하여 산화/환원적인 외부환경(redox potential)을 일정하게 유지하여 세포 밖에서의 안정성을 유지한다는 것이 WO 00/42175호의 원리이나 세포 밖에서 장시간에 걸쳐 산화/환원 환경을 일정하게 유지하기 어려우며 특히 정제 과정에서 이를 유지시키기는 더 어렵다. 그러나 본 발명에서는 일반적인 폴딩(folding)과정과 정제 과정이 적용될 수 있는 시스테인-도입 변이체를 선택하였으며 이는 본 발명에서 선택된 시스테인-도입 변이체가 자유 시스테인을 갖고 있음에도 불구하고 구조적으로 지속적인 안정성을 유지함을 입증하는 것이라 하겠다. 본 발명에서 선정한 시스테인-도입 G-CSF 변이체는 E. coli .에서 봉입체(inclusion body)로 발현되며 일반적인 리폴딩(refolding)방법으로 활성형 G-CSF 변이체로 전환되었다. 일반적인 리폴딩(refolding)방법이란 봉입체(inclusion body)를 urea나 guanidium 염 등으로 용 해 후 urea나 guanidium을 dilution과 같은 방법으로 제거하거나 농도를 낮추어 생물학적으로 활성을 갖는 구조를 이루게 하는 과정으로 단백질 내 disulfide 결합의 유무에 따라 redox-couple (산화, 환원 형태의 glutatione 또는 cysteine)을 첨가시키기도 한다 (Ronald W et al., Disulphide bond formation in food protein aggregation and gelation, Biotechnology Advances 23 (2005) 75-80). 바람직하게 본 발명은 6-8 M urea urea에 시스테인 도입 변이형 G-CSF의 inclusionbody를 용해 시키고 2-4 M urea에 glutathione 존재 하에 dilution하여 refolding을 수행하였다.
접합될 PEG 중합체의 분자량은 제한되지 않으나, 2 내지 100 kDa이 바람직하고, 10 내지 60 kDa이 더 바람직하다. 본 발명에서는 생체적합성 고분자인 PEG-말레이미드를 시스테인-도입 G-CSF의 도입된 시스테인-티올(thiol)기에 결합시키는 방법을 사용하였는데 G-CSF를 PEG (20kDa 또는 30kDa)-maleimide와 반응시킴으로써, PEG (20kDa 또는 30kDa)-G-CSF 접합체를 제조하였다.
본 발명에서 G-CSF에 도입된 시스테인의 티올기를 통해 생체적합성 고분자 PEG를 결합시키는 반응에 있어서, PEG와 G-CSF의 반응 몰-비율이 2:1 내지 200:1, 반응 온도는 0 내지 60℃, 반응 pH는 5.0 내지 7.7, 반응시간은 5분 내지 24시간 범위의 조건이 바람직하였다.
본 발명에서 설명된 방법으로 PEG접합 반응을 수행한 후 SDS-PAGE를 통해 PEG와 G-CSF 변이체의 결합 여부를 확인하였다. 접합반응물로부터 모노-PEG-G-CSF 접합체를 얻기 위해, 먼저 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 모노-PEG-G-CSF 유도체를 분리해 낸다. 상기의 양이온 교환 크로마토그래피를 통해 분리된 것을 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 반응에 참여하지 않고 존재하는 미량의 G-CSF를 제거한 모노-PEG-G-CSF 접합체만을 분리하였다.
본 발명에서 기술한 모노-PEG-G-CSF 유도체의 생물학적 활성을 측정하기 위해 여러 문헌 (Baldwin et al., Acta Endocrinologica., 119:326, 1988; Clark et al., J. Biol. Chem., 271(36):21969, 1996; 및 Bozzola et al., J. endocrinol. Invest., 21:768, 1998)에 공지된 방법을 수행하였다. 그 결과, 본 발명에 따라 제조된 인간 과립구콜로니자극인자 변이체의 PEG 접합체는 생체 내에서 잔류 시간의 증가와 동시에 생물학적 활성을 높은 수준으로 유지할 수 있음을 확인하였다.
N-말단에 PEG가 접합된 Filgrastim의 in vitro 생물학적 활성은 Filgrastim의 68 %라 보고되었다(미국특허 제5,824,784호). 그러나 본 발명에서 제조되는 G-CSF 변이체의 PEG 접합물들은 in vitro 생물학적 활성이 Filgrastim의 2.1 ~ 3.5 배(250~300%) 정도이다. 또한, 체내 반감기는 Filgrastim의 약 5 배 이상이며, Filgrastim보다 호중구 활성화 능력이 우월하다. 이는 선택한 시스테인-도입 위치가 G-CSF의 활성 및 안정성에 큰 영향을 미치지 않는 위치이며 또한 유연하여 PEG접합에 의한 구조적 변화를 완충할 수 있었기 때문인 것으로 생각된다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하는 것은 결코 아니다.
[
실시예
1 ~ 11] G-
CSF
의 CD loop(서열번호 2의
Gly
126
-
Ser
143
) 내 각 아미노산의 시스테인 치환을 통한 G-
CSF
변이체의
접합체 제조
A. 재조합 인간
과립구콜로니자극인자(rG-CSF)의
준비
본 발명에서 사용된 재조합 인간 과립구콜로니자극인자(G-CSF)는 본 출원인의 대한민국 특허등록 제230579호에 기재된 균주(KFCC-10961)를 사용하여 발현되었다. 이 발현 방법으로 준비된 재조합 G-CSF는 대장균에서 유래된 것으로 Filgrastim 과 동일하며 서열번호 2의 아미노산 서열을 가진다.
본 실시예들에서 G-CSF는 재조합 G-CSF를 이용하는 것에 기인하여, 서열번호 2의 아미노산 서열을 기준으로 번호를 부여하기로 한다.
B. 재조합 인간
과립구콜로니자극인자의
시스테인-도입
변이체
제작
시스테인-도입 G-CSF 변이체들은 대한민국 특허등록 제230579호에 기재된 G-CSF 발현 균주(KFCC-10961)로부터 제작되었다. G-CSF 발현 균주를 LB 배지에 12 시간 진탕 배양 후 Quiagene사의 plasmid preparation kit을 사용하여 G-CSF 발현 벡터(pGW2)를 분리하였다. 분리된 G-CSF 발현 벡터(pGW2)를 template 로 하여 하기 표 1에 표시된 바와 같이 시스테인-도입 유전자가 포함된 상보성의 mutation primer (30-40 base pair 길이의 상보성 polynucleotide 2 가닥)를 사용하여 분리된 G-CSF 발현 벡터를 template로 PCR을 수행하였다. PCR로 복제된 G-CSF 발현 벡 터는 DPN 1효소로 처리하여 template를 제거한 후 rubidium 처리한 MC 1061 E. coli 에 transformation 하였다. Transformation된 host는 Ampicilin 배지에 배양하여 형질 전환 균주를 선별하였다. 변이(Mutation)을 위한 PCR과 template제거를 위한 효소처리는 site-directed mutagenesis kit (Stratagene사의 QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit) 의 pfuTurbo DNA polymerase와 Dpn 1 효소를 각각 사용하여 사용자 지침서를 기초로 수행하였다. Mutation 확인은 primer (5'-GCGGATCCTGCCTGA-3')를 사용한 sequencing PCR을 통한 염기서열 분석으로 확인하였다.
C. 시스테인-도입 G-
CSF
변이체의
발현
Ampicilin 이 5 μg/ml로 첨가된 5 ml LB 배지에 시스테인-도입 G-CSF 변이체들을 12시간 배양 후, 500 ml의 LB 배지(Ampicilin 5 μg/ml 첨가)에 옮겨 진탕 배양하였다. 균체 OD가 0.5 에 도달 했을 때, arabinose를 최종 1 %(w/v) 되게 배지에 첨가 후 7 시간 진탕배양하여 시스테인-도입 G-CSF 변이체를 과다 발현 시켰다.
D. 시스테인-도입 G-
CSF
변이체의
리폴딩
(
refolding
).
시스테인-도입 G-CSF 변이체가 과다 발현된 균체를 원심분리하여 Tris 20 mM , 150 mM NaCl 에 현탁 후, sonicator로 균체를 파쇄하였다. 세포 파쇄물을 원심분리 후 2%(w/v) sodium deoxycholate로 세척하여 봉입체(inclusionbody)를 회수하였 다. 시스테인-도입 변이체의 봉입체(inclusion body)를 7 M urea, 20 mM Tris, 100 mM NaCl, pH8.8에 녹인 후, 3.3 M urea, 5 mM Tris, 2 mM reduced glutathione, 0.2 M oxidized glutathione, pH 8.8에 10배 희석하여 18 시간 동안 4 ℃에서 교반하면서 리폴딩(refolding)과정을 수행하였다.
E-1. 시스테인-도입 G-
CSF
변이체의
PEG의
접합물
제조.
시스테인-도입 G-CSF 변이체의 리폴딩(refolding) 시료를 pH 4.5 되게 HCl로 적정한 후, 원심분리하여 침전물을 제거하였다. 활성을 갖는 시스테인-도입 G-CSF 변이체를 정제하기 위하여 20 mM sodium phosphate pH 4.0로 평형된 SP-sepharos fast flow column에 주입 후, 평형버퍼로 세척하는 과정을 거친 후, 100~5000 mM NaCl 염농도 구배 용출로 분리하였다. SP-sepharos로부터 용출된 시스테인-도입 G-CSF 변이체 시료의 pH를 6.8로 조정 후, 평균 분자량이 각각 20kDa 또는 30 kDa인 메톡시-PEG-말레이미드(Shearwater사, 미국)를 시스테인-도입 G-CSF 변이체: 메톡시-PEG-말레이미드의 몰비가 1:2가 되도록 상기 용액에 각각 첨가하고 4℃에서 18시간 동안 서서히 교반시키면서 반응시켰다.
E-2. 시스테인-도입 G-
CSF
변이체의
vinyl
sulfone
-PEG의
접합물
제조.
E-1 방법으로 분리된 시스테인 도입 G-CSF 변이체의 SP-sepharos용출액 시료의 pH를 7.5로 조정 후, 평균 분자량이 20 kDa인 메톡시-PEG-vinylsulfone을 시스테인-도입 G-CSF 변이체:메톡시-PEG-vinylsulfone의 몰비가 1:5 가 되도록 상기 용 액에 각각 첨가하고 4℃에서 18시간 동안 서서히 교반시키면서 반응시켰다.
E-3. 시스테인-도입 G-
CSF
변이체의
iodoacetimide
-PEG의
접합물
제조.
E-1 방법으로 분리된 시스테인 도입 G-CSF 변이체의 SP-sepharose 용출액 시료의 pH를 7.0로 조정 후, 평균 분자량이 20 kDa인 메톡시-PEG-iodoacetimide를 시스테인-도입 G-CSF 변이체:메톡시-PEG-iodoacetimide의 몰비가 1:2 가 되도록 상기 용액에 각각 첨가하고 4℃ 조건하에 48 시간 동안 암실에서 서서히 교반시키면서 반응시켰다.
F. 모노-
PEG
-인간 과립구
콜로니
자극인자
유도체의
융합체
분리
생성된 시스테인-도입 G-CSF 변이체의 PEG 접합 반응물의 pH를 4,0 으로 조정 후, 20 mM Na2HPO4 mono basic, pH 4.8 완충용액으로 3배 희석하여 동일한 버퍼 (20 mM Na2HPO4 mono basic, pH 4.8 완충용액)로 평형화된 SP-sepharose column 에 주입하였다. 20 mM Na2HPO4 mono basic, 50 mM NaCl, pH 4.8 완충액으로 washing후 50~500 mM NaCl 염농도 구배로 용출하였다. SP-sepharose column으로부터 용출된 시스테인-도입 G-CSF 변이체의 PEG 접합체는 PEG가 반응하지 않은 시스테인-도입 G-CSF 변이체로부터 제거하기 위하여 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)를 수행하였다. 20mM Na2HPO4 mono basic, 100mM NaCl(pH4.0)완충용액으로 평형화시킨 슈퍼덱스 200(Superdex 200 (2.5 X 50 cm), Pharmacia사)에 상 기 SP-sepharose 용출액을 농축하여 주입하고 동일한 완충 용액으로 1 ㎖/분으로 용출시켰다. 분리된 시스테인-도입 G-CSF 변이체의 PEG 접합물의 순도는 SDS-PAGE 분석으로 측정하였다.
하기 표 1은 실시예 1 ~ 11 에서 제조된 시스테인-도입 변이체들의 회수율과 PEG 접합율을 나타낸다.
변이체 |
실시예 |
변이위치 |
변이체 회수율(%) |
maleimide-PEG 접합율(%) |
1 |
Ala 128 Cys |
0.01 |
0 |
2 |
Ala 130 Cys |
8 |
3 |
3 |
Leu 131 Cys |
30 |
3 |
4 |
Gln 132 Cys |
50 |
35 |
5 |
Thr 134 Cys |
50 |
70 |
6 |
Gln 135 Cys |
40 |
70 |
7 |
Gly 136 Cys |
18 |
0.01 |
8 |
Ala 137 Cys |
62 |
30 |
9 |
Met 138 Cys |
34 |
0.01 |
10 |
Ala 140 Cys |
0.01 |
0 |
11 |
Ala 142 Cys |
0.01 |
0 |
[본 발명의 표들에 있어서, 변이위치 란의 "아미노산(Ala) 번호(128) 아미노산(Cys)"는 128번 Ala 를 Cys 로 치환하는 것을 의미하고, 동일 방식으로 적용된다.]
[변이체 회수율은 상기 변이체에 PEG 접합을 위하여 상기 리폴딩 방법과 정제 방법으로 변이체를 얻는 과정의 수율을 의미한다. 즉 inclusionbody에 발현된 총 G-CSF변이체로부터 정제 과정을 통하여 얻게 되는 G-CSF 변이체의 비율을 의미한다.]
[PEG 접합율은 PEG 접합 반응에 투여한 총 G-CSF 변이체 중에서 PEG에 접합된 G-CSF의 비율을 의미한다]
[
실시예
12 ~ 22] G-
CSF
의
CD
loop
(
Gly
126
-
Ser
143
) 내 각 아미노산의 시스테인 치환 및 18번 시스테인의 세린 치환을 통한 G-
CSF
변이체의
접합체 제조
상기 실시예 1 ~ 11 과 동일한 방법으로 실시하되, CD loop(Gly126 -Ser143) 내 시스테인(Cys) 치환 과 Cys 18 Ser 치환 모두를 포함하는 변이체를 제작하기 위하여 미리 제작된 Cys 18 Ser 치환 변이 균주로부터 시스테인-도입 변이를 수행하여 하였으며 Cys 18 Ser 치환 균주의 시스테인-도입 변이는 상기 방법과 동일한 과정으로 진행하였다.
하기 표 2은 실시예 12 ~ 22 에서 제조된 시스테인-도입 변이체들의 회수율과 PEG 접합율을 나타낸다.
변이체 |
실시예 |
변이위치 |
변이체 회수율(%) |
maleimide-PEG 접합율(%) |
12 |
Ala 128 Cys, Cys 18 Ser |
0.5 |
0 |
13 |
Ala 130 Cys, Cys 18 Ser |
10 |
10 |
14 |
Leu 131 Cys, Cys 18 Ser |
30 |
5 |
15 |
Gln 132 Cys, Cys 18 Ser |
45 |
30 |
16 |
Thr 134 Cys, Cys 18 Ser |
55 |
75 |
17 |
Gln 135 Cys, Cys 18 Ser |
43 |
65 |
18 |
Gly 136 Cys, Cys 18 Ser |
15 |
0.01 |
19 |
Ala 137 Cys, Cys 18 Ser |
64 |
35 |
20 |
Met 138 Cys, Cys 18 Ser |
30 |
0.01 |
21 |
Ala 140 Cys, Cys 18 Ser |
0.01 |
0 |
22 |
Ala 142 Cys, Cys 18 Ser |
0.01 |
0 |
[
실시예
23 ~ 28] G-
CSF
의
CD
loop
(
Gly
126
-
Ser
143
) 내 시스테인(
Cys
) 삽입을 통한 G-
CSF
변이체의
접합체 제조
상기 실시예 1 ~ 11 과 동일한 방법으로 실시하되, CD loop(Gly126 -Ser143) 내 시스테인(Cys) 삽입을 위하여, 분리된 G-CSF 발현 벡터(pGW2)의 G-CSF 유전자에 하기 표 3에 표시된 바와 같이 시스테인-도입 유전자가 포함된 상보성의 mutation primer (30-40 base pair 길이의 상보성 polynucleotide 2가닥)를 사용하여 분리된 G-CSF 발현 벡터를 template로 PCR을 수행하였다.
하기 표 3은 실시예 23 ~ 28 에서 제조된 시스테인-도입 변이체들의 회수율과 PEG 접합율을 나타낸다.
변이체 |
실시예 |
변이위치 |
변이체 회수율(%) |
maleimide-PEG 접합율(%) |
23 |
130 Cys 131 |
45 |
45 |
24 |
131 Cys 132 |
40 |
20 |
25 |
134 Cys 135 |
45 |
0.01 |
26 |
135 Cys 136 |
50 |
37 |
27 |
136 Cys 137 |
75 |
85 |
28 |
137 Cys 138 |
25 |
15 |
[본 발명의 표들에 있어서, 변이위치 란의 "번호(130) 아미노산(Cys) 번호(131)"는 130번 과 131번 사이에 Cys이 삽입되는 것을 의미하고, 동일 방식으로 적용된다.]
[
실시예
29 ~ 34] G-
CSF
의
CD
loop
(
Gly
126
-
Ser
143
) 내 시스테인(
Cys
) 삽입 및 18번 시스테인의 세린 치환을 통한 G-
CSF
변이체의
접합체 제조
상기 실시예 23 ~ 28 과 동일한 방법으로 실시하되, CD loop(Gly126 -Ser143) 내 시스테인(Cys) 삽입과 Cys 18 Ser 치환 모두를 포함하는 변이체를 제작하기 위하여 미리 제작된 Cys 18 Ser 치환 변이 균주로부터 시스테인-도입 변이를 수행하여 하였으며 Cys 18 Ser 치환 균주의 시스테인-도입 변이는 상기 방법과 동일한 과정으로 진행하였다.
하기 표 4은 실시예 29 ~ 34 에서 제조된 시스테인-도입 변이체들의 회수율과 PEG 접합율을 나타낸다.
변이체 |
실시예 |
변이위치 |
변이체 회수율(%) |
maleimide-PEG 접합율(%) |
29 |
130 Cys 131, Cys 18 Ser |
50 |
40 |
30 |
131 Cys 132, Cys 18 Ser |
45 |
15 |
31 |
134 Cys 135, Cys 18 Ser |
55 |
0.01 |
32 |
135 Cys 136, Cys 18 Ser |
40 |
43 |
33 |
136 Cys 137, Cys 18 Ser |
85 |
70 |
34 |
137 Cys 138, Cys 18 Ser |
23 |
20 |
도 2는 상기 실시예 33에서 제조된 G-CSF 변이체(M2_S)[18 Cys가 Ser로 치환, 136 Gly 과 137 Ala 사이에 시스테인(Cys)이 삽입]를 20 kDa PEG-maleimide 또는 30 kDa PEG-maleimide와 접합한 후 정제하여, SDS PAGE 로 분석한 결과로 단일 밴드임을 확인할 수 있다.
도 3은 상기 실시예 33에서 제조된 G-CSF 변이체(M2_S)[18 Cys가 Ser로 치환, 136 Gly 과 137 Ala 사이에 시스테인(Cys)이 삽입]의 20 kDa PEG접합 반응물의 SDS PAGE 이다. 도 3에 보이는 바와 같이, 시스테인 도입 G-CSF 변이체의 PEG-maleimide 접합반응은 도입된 시스테인에 특이적이어서 이당체 및 다당체의 생성 없이 단당량의 PEG가 접합된 G-CSF를 얻을 수 있었다.
[실험예 1] 시험관내(in vitro) 활성 측정
실시예 1 ~ 34 에서 제조된 시스테인-도입 G-CSF 변이체 PEG 접합물의 생물학적 활성을 필그라스팀 (대장균 유래 G-CSF)과 비교하였다. 활성측정은 인간 골수의 백혈병 세포주인 NFS-60 (ATCC X65622, murine myeloid leukemic cell line)의 세포증식을 통하여 수행하였다. NFS60 세포를 10%(v/v)의 소 태아 혈청과 WEHI-1640 세포주 배양액 5%를 포함하는 RPMI1640 배지에서 배양한 후, 약 2×105 세포/㎖이 되도록 10%(v/v)의 소 태아 혈청을 포함하는 RPMI 배지에 현탁하였다. 현탁된 세포 배양액을 96 well plate의 각 웰 에 50 ㎕씩 넣어서 웰 당 세포가 약 1×104 개가 되도록 분주하였다. Filgrastim및 상기 실시예에 따라 제조된 시스테인-도입 변이체들의 PEG 접합물을 BCA (Bicinconinic acid) 단백 정량 하여 15 ng/㎖ 되도록 10%(v/v)의 소 태아 혈청을 포함하는 RPMI 1640으로 희석하였고, 이를 다시 10%(v/v)의 소 태아 혈청을 포함하는 RPMI 1640에 3배씩 12 단계 희석하였다. 이렇게 만들어진 시료를 NFS60 배양 중인 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하여, 배양액 내의 최종 시료 농도가 연속적으로 감소하여 10000 ~ 0.05 pg/ml 범위에 들도록 하였다. 37℃ 배양기에서 48시간 배양 후. 프로메가(PROMEGA)사의 CellTiter96 TM (Cat. No. G3580)을 이용하여 세포의 증가를 측정하였다.
하기 표 5는 실시예 1 ~ 34 에서 제조된 시스테인-도입 변이체들의 회수율과 maleimide-PEG 접합율 그리고 PEG 접합물의 생물학적 활성을 종합적으로 도시한 것이다.
변이체 회수율은 발현된 시스테인-도입 변이체가 봉입체(inclusionbody)로부터 PEG접합을 위해 정제된 수율을 나타내며 회수율이 높을수록 시스테인-도입 변이체의 안정성이 높다고 판단된다. PEG접합 비율은 정제된 시스테인 도입 변이체 중 PEG 접합 반응에 의해 PEG접합 된 비율을 나타내며 PEG 접합율이 높을수록 도입된 시스테인에 PEG 접합이 용이함을 의미한다. PEG 접합물의 NFS60 활성화율은 PEG접합물의 in vitro 생물학적 활성을 Filgrastim을 100%로 기준하여 표시한 것이다.
변이체 |
실시예 |
변이위치 |
변이체 회수율(%) |
maleimide-PEG 접합율(%) |
PEG 접합물의 NFS 60 활성화(%)[Filgrastim 100% 기준] |
1 |
Ala 128 Cys |
0.01 |
0 |
- |
2 |
Ala 130 Cys |
8 |
3 |
21 |
3 |
Leu 131 Cys |
30 |
3 |
2 |
4 |
Gln 132 Cys |
50 |
35 |
40 |
5 |
Thr 134 Cys |
50 |
70 |
210 |
6 |
Gln 135 Cys |
40 |
70 |
30 |
7 |
Gly 136 Cys |
18 |
0.01 |
- |
8 |
Ala 137 Cys |
62 |
30 |
40 |
9 |
Met 138 Cys |
34 |
0.01 |
- |
10 |
Ala 140 Cys |
0.01 |
0 |
- |
11 |
Ala 142 Cys |
0.01 |
0 |
- |
12 |
Ala 128 Cys, Cys 18 Ser |
0.5 |
0 |
- |
13 |
Ala 130 Cys, Cys 18 Ser |
10 |
10 |
21 |
14 |
Leu 131 Cys, Cys 18 Ser |
30 |
5 |
5 |
15 |
Gln 132 Cys, Cys 18 Ser |
45 |
30 |
45 |
16 |
Thr 134 Cys, Cys 18 Ser |
55 |
75 |
230 |
17 |
Gln 135 Cys, Cys 18 Ser |
43 |
65 |
45 |
18 |
Gly 136 Cys, Cys 18 Ser |
15 |
0.01 |
- |
19 |
Ala 137 Cys, Cys 18 Ser |
64 |
35 |
55 |
20 |
Met 138 Cys, Cys 18 Ser |
30 |
0.01 |
- |
21 |
Ala 140 Cys, Cys 18 Ser |
0.01 |
0 |
- |
22 |
Ala 142 Cys, Cys 18 Ser |
0.01 |
0 |
- |
23 |
130 Cys 131 |
45 |
45 |
48 |
24 |
131 Cys 132 |
40 |
20 |
60 |
25 |
134 Cys 135 |
45 |
0.01 |
- |
26 |
135 Cys 136 |
50 |
37 |
43 |
27 |
136 Cys 137 |
75 |
85 |
270 |
28 |
137 Cys 138 |
25 |
15 |
65 |
29 |
130 Cys 131, Cys 18 Ser |
50 |
40 |
60 |
30 |
131 Cys 132, Cys 18 Ser |
45 |
15 |
70 |
31 |
134 Cys 135, Cys 18 Ser |
55 |
0.01 |
- |
32 |
135 Cys 136, Cys 18 Ser |
40 |
43 |
50 |
33 |
136 Cys 137, Cys 18 Ser |
85 |
70 |
350 |
34 |
137 Cys 138, Cys 18 Ser |
23 |
20 |
70 |
상기 표 5에서 보는 바와 같이 실시예 1, 10, 11, 12, 21 및 22의 시스테인-도입 변이체는 발현 및 정제가 용이하지 않았다. 발현과 정제가 용이한 시스테인-도입 변이체 중 18 Cys 이 Ser로 치환된 변이체는 18 Cys 을 그대로 유지한 변이체와 비교하여 생물학적 활성에 큰 차이가 없었다. 그러나 18 Cys를 그대로 유지한 시스테인-도입 변이체는 PEG 접합 후 생물학적 활성이 다소 낮아졌다. 이것은 Park 등의 보고 (대한민국 특허출원 제10-2003-0017606호)와 일치하는 결과로 Cys 18에 PEG 접합이 일어났기 때문인 것으로 판단된다.
상기 스크리닝(screening)과정을 거쳐, 본 발명에서는 PEG접합을 위해 G-CSF의 134 Thr 을 시스테인으로 치환한 G-CSF 변이체 (M1)와 136 Gly 과 137 Ala 사이에 시스테인을 삽입한 G-CSF 변이체 (M2) 그리고 부가적으로 18 Cys 가 Ser로 치환된 변이체로서 134 Thr 를 시스테인으로 치환한 G-CSF 변이체 (M1_S) 와 부가적으로 18 Cys가 Ser로 치환된 변이체로서 136 Gly 과 137 Ala 사이에 시스테인을 삽입한 G-CSF 변이체 (M2_S)를 최종 선별하였다. 그리고 선정된 M1, M1_S, M2, M2_S 변이체에 PEG가 접합된 접합물을 각각 20kDa PEG-M1, 20kDa PEG-M1_S, 20kDa PEG-M2, 20kDa PEG-M2_S 라 명명하였다.
[실험예 2] 약물동력학 측정
실험예 1에서 선정한 각각의 시스테인-도입 G-CSF 변이체에 20kDa PEG가 접합된 20kDa PEG-M1, 20kDa PEG-M1_S, 20kDa PEG-M2 및 20kDa PEG-M2_S의 혈청 (serum)내 잔존 시간을 측정하였다. 각 군당 5마리의 SD 랫트 (Male Sprague Dawly Rat, 6주령, 평균 200-250g)에게 필그라스팀 (대조군)과 상기 실시예에서 제조된 20kDa PEG-M1, 20kDa PEG-M1_S, 20kDa PEG-M2, 20kDa PEG-M2_S 및 필그라스팀을 100 ㎍/㎏이 되도록 피하 주사한 후, 0.5, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 96, 120, 144 및 168 시간 후에 채혈하였다. 혈액시료는 1시간 상온에서 응고시킨 후, 마이크로 원심분리기에서 10000 rpm에서 5분간 원심 분리하여 세포를 제거하였다. 혈장 내 G-CSF 양은 단일항체를 이용한 ELISA 방법으로 측정하였다.
그 결과, 각 시험군과 대조군의 혈중 반감기는 하기 표 6과 같았다.
|
대조구 |
실시예 |
실시예 |
실시예 |
실시예 |
|
필그라스팀 |
20kDa PEG-M1 |
20kDa PEG-M1_S |
20kDa PEG-M2 |
20kDa PEG-M2_S |
혈중반감기 (T1 /2, hr) |
1.9 |
7.9 |
8.2 |
8.9 |
9.7 |
도 4는 본 발명에 따라 제조된 인간 과립구콜로니자극인자변이체와 PEG 접합물의 체내 약물동력학 (Pharmacokinetics) 측정 결과이다.
상기 표 6과 도 4의 약물동력학 그래프에 나타난 바와 같이, 본 발명에서 선정된 20kDa는 Filgrastim보다 혈중 안정성이 증가하여 필그라스팀에 비해 4.2 -5.1배 증가된 체내 반감기를 나타내었다. 이러한 결과는 시스테인-도입 G-CSF 변이체의 20kDa PEG 접합체들이 필그라스팀보다 체내에서 활성을 지속적으로 유지하여 치료 효과를 향상시킬 수 있음을 의미한다.
[실험예 3] 약물 약동학 측정
실험예 1에서 선정한 20kDa PEG-M1, 20kDa PEG-M1_S, 20kDa PEG-M2, 20kDa PEG-M2_S의 호중구 활성화 능력을 측정하였다. 각 군당 5마리의 SD 랫트 (Male Sprague Dawly Rat, 6주령, 평균 200-250g)에게 필그라스팀과 20kDa PEG-M1, 20k Da PEG-M1_S, 20kDa PEG-M2, 20kDa PEG-M2_S을 100 ㎍/㎏ 용량으로 피하주사하였으며 시간별로 eye-bleeding 한 후, 혈 중 호중구 수를 측정하였다. 측정은 CELL-DYN 3700기기를 이용하였다.
도 5는 본 발명에 따라 제조된 인간 과립구콜로니자극인자변이체와 PEG 접합물의 체내 호중구 활성화 능력을 비교한 약물약동학 (Pharmacodynamics) 측정 결과이다.
도 5에 보이는 바와 같이, Filgrastim에 비해 20kDa PEG-M1, 20kDa PEG-M1_S, 20kDa PEG-M2, 20kDa PEG-M2_S 의 호중구 활성화 능력이 매우 증가 되었다.