EA003789B1 - КОНЪЮГАТЫ ПОЛИОЛ-β-ИНТЕРФЕРОН - Google Patents

КОНЪЮГАТЫ ПОЛИОЛ-β-ИНТЕРФЕРОН Download PDF

Info

Publication number
EA003789B1
EA003789B1 EA200001111A EA200001111A EA003789B1 EA 003789 B1 EA003789 B1 EA 003789B1 EA 200001111 A EA200001111 A EA 200001111A EA 200001111 A EA200001111 A EA 200001111A EA 003789 B1 EA003789 B1 EA 003789B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
polyol
interferon
peg
beta
ifn
Prior art date
Application number
EA200001111A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200001111A1 (ru
Inventor
Набиль Эль Таяр
Майкл Дж. Робертс
Милтон Харрис
Вэйн Соливич
Original Assignee
Апплайд Резеч Системз Арс Холдинг Н.В.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Апплайд Резеч Системз Арс Холдинг Н.В. filed Critical Апплайд Резеч Системз Арс Холдинг Н.В.
Publication of EA200001111A1 publication Critical patent/EA200001111A1/ru
Publication of EA003789B1 publication Critical patent/EA003789B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

В настоящем изобретении представлены конъюгаты ПЭГ-β-интерферон, где ПЭГ-часть ковалентно связана с Cysчеловеческого β-интерферона, которые получают способом сайт-специфического присоединения ПЭГ с помощью агента для введения ПЭГ, имеющего реакционноспособную тиольную группу. Представлены также фармацевтическая композиция и метод лечения инфекционных заболеваний, опухолей и аутоиммунных и воспалительных заболеваний. Изобретение, кроме того, относится к способу поэтапного присоединения ПЭГ-частей последовательно к полипептиду и особенно к β-интерферону.

Description

По настоящей заявке испрошен приоритет в соответствии со ст. 35 и. 8. С. § 119(е), по дате подачи первоначальной временной заявки США № 60/083339, полное содержание которой включено сюда в качестве ссылки.
Область изобретения
Изобретение относится к конъюгатам полиол - β-интерферон (полиол - β-ИФН), в которых полиольная часть ковалентно связана с 17
Другими объектами настоящего изобретения являются способ их сайт-специфического получения, а также их использование в терапии, прогнозе или диагностике бактериальных инфекций, вирусных инфекций, аутоиммунных заболеваний и воспалительных заболеваний. Настоящее изобретение далее относится к способу поэтапного присоединения двух или более частей полиэтиленгликоля (ПЭГ) к полипептиду.
Предпосылки к созданию изобретения
Интерферон фибробластов человека (βИФН) обладает противовирусной активностью и может также стимулировать природные клеткикиллеры против опухолевых клеток. Это полипептид с массой около 20.000 Да, индуцируемый вирусами и двухнитевыми РНК. Из нуклеотидной последовательности гена фибробластного интерферона, клонированного с помощью технологии с использованием рекомбинантной ДНК, Оегуик и др. (ХаИие. 285:542-547, 1980) установили полную аминокислотную последовательность протеина. Она имеет длину в 166 аминокислот.
8йератб е1 а1. (ХаИие. 294:563-565, 1981) описали мутацию при основании 842 (Сук - Туг в положении 141), которая уничтожала противовирусную активность интерферона, и вариантный клон с делецией нуклеотидов 1119-1121.
Магк и др. (Ргос. №111. Асаб. 8с1. и. 8. А., 81(18):5662-5666, 1984) осуществили искусственную мутацию путем замены основания 469 (Т) на (А), вызвав замену аминокислоты Сук 8ег в положении 17. Сообщалось, что полученный в результате β-ИФН был так же активен, как нативный β-ИФН, и устойчив при длительном хранении (-70°С).
Ковалентное присоединение к молекулам гидрофильного полимерного полиэтиленгликоля (ПЭГ), также известного как полиэтиленоксид (ПЭО), имеет важное применение в биотехнологии и медицине. В своей наиболее общей форме ПЭГ является линейным полимером с гидроксильными группами на каждом конце: НО - СН2 - СН2О (СН2СН2О)ПСН2СН2 - ОН
Эта формула может быть кратко представлена как НО-ПЭГ-ОН, где имеется в виду, что -ПЭГ- представляет основную цепь полимера без концевых групп:
-ПЭГ- означает -СНСНОССНСНО^СН СН2-.
ПЭГ обычно используется в виде метоксиПЭГ-ОН (м-ПЭГ), в котором один конец явля ется относительно инертной метоксигруппой, в то время как другой конец представляет гидроксильную группу, которая является объектом химической модификации.
СН3О - (СН2СН2О)П - СН2СН2 - ОН
Также обычно используются разветвленные ПЭГ. Разветвленные ПЭГ могут быть обозначены как К.(-ПЭГ-ОН)т, где К. представляет центральное ядро, такое как, например, пентаэритрит или глицерин, и т означает число ответвлений. Число ответвлений (т) может варьироваться от трех до ста или более. Гидроксильные группы являются объектом химических модификаций.
Другая разветвленная форма, такая как описана в публикации международной патентной заявки XVО 96/21469, имеет единственный конец, который является объектом химической модификации. Этот тип ПЭГ может быть представлен как (СН3О-ПЭГ -)РК-Х, где р равно 2 или 3, К представляет центральное ядро, такое как, например, лизин или глицерин, и Х означает функциональную группу, такую как, например, карбоксильную, которая является объектом химической активации. Ещё одна разветвленная форма, ПЭГ с боковыми цепями, имеет реакционноспособные группы, такие как, например, карбоксильная, вдоль основной цепи ПЭГ, а не на конце цепей ПЭГ.
В дополнение к этим формам ПЭГ полимер может быть также получен со слабыми или способными к расщеплению связями в основной цепи. Например, Натк в заявке на патент США 06/026716 показал, что ПЭГ может быть получен со сложноэфирными связями в полимерной основной цепи, которые являются объектом гидролиза. Этот гидролиз приводит к расщеплению полимера на фрагменты с более низкой молекулярной массой согласно схеме реакции: -ПЭГ-СО2-ПЭГ- + Н2О -ПЭГ-СО2Н + НО-ПЭГ- .
Согласно настоящему изобретению термин полиэтиленгликоль или ПЭГ включает все описанные выше производные.
Сополимеры этиленоксида и пропиленоксида близки ПЭГ по своим химическим свойствам, и они могут быть использованы вместо ПЭГ во многих случаях его применения. Они имеют следующую общую формулу:
НО-СН2СНКО(СН2СНКО)ПСН2СНК-ОН , где К обозначает Н или СН3.
ПЭГ является полезным полимером, обладающим высокой растворимостью в воде, а также высокой растворимостью во многих органических растворителях. ПЭГ также нетоксичен и не является иммуногенным. Когда ПЭГ присоединяют химически (присоединение ПЭГ) к нерастворимым в воде соединениям, полученный в результате конъюгат обычно растворим в воде, а также растворим во многих органических растворителях.
Конъюгаты ПЭГ - белок в настоящее время используются в белок-заместительной терапии и для других терапевтических целей. Например, связанная с ПЭГ аденозиндезаминаза (ΑΌΑΟΕΝ) используется для лечения серьезных комплексных иммунодефицитных заболеваний, связанная с ПЭГ Ь-аспарагиназа (ΟΝΟΛΡδΡΛΚ) применяется для лечения острого лимфобластного лейкоза и связанный с ПЭГ а-интерферон (ΙΝΤΚΟΝ(Κ) А) находится на III стадии испытаний по лечению гепатита С.
Общий обзор конъюгатов ПЭГ - белок, обладающих клинической эффективностью, дан в Ν.Η ВигпНат, Ат. I. Нокр. РНагт., 15:210-218,
1994.
Был разработан ряд способов присоединения ПЭГ к белкам. Обычно проводят присоединение ПЭГ к реакционноспособным группам белка, используя производные ПЭГ с повышенной электрофильностью. Присоединение ПЭГ к а- и ε-аминогруппам, имеющимся в остатках лизина, и к Ν-концу дает конъюгат, состоящий из смеси продуктов.
Обычно такие конъюгаты включают ряд нескольких молекул ПЭГ, присоединенных к молекуле белка (ПЭГ-меры) в количестве в пределах от нуля до числа, соответствующего числу аминогрупп в белке. Для молекулы белка, которая была однократно модифицирована, единица ПЭГ может быть присоединена к ряду различных аминных сайтов.
Такой тип неспецифического присоединения ПЭГ приводил к ряду конъюгатов, которые становились почти неактивными. Понижение активности обычно вызывается экранированием активного связывающего домена белка, как в случае многих цитокинов и антител. Например, Ка!те и др. в патенте США №4766106 и патенте США №4917888 описывают присоединение ПЭГ к β-ИФН и интерлейкину 2 (ИЛ-2) с использованием большого избытка метоксиполиэтиленгликолилового эфира Ν-сукцинимидилглутаровой кислоты и метоксиполиэтиленгликолилового эфира Ν-сукцинимидилянтарной кислоты. Оба белка продуцировались в микробных клетках-хозяевах, что делало возможной сайт-специфическую мутацию свободного цистеина в серии. Мутация была необходима при микробной экспрессии β-ИФН для облегчения складывания белка. В частности, β-ИФН, используемый в этих экспериментах, является товарным продуктом Ве1акетоп®, в котором остаток Сук17 заменен серином. Кроме того, отсутствие гликозилирования уменьшало растворимость продукта в водном растворе. Неспецифическое присоединение ПЭГ приводило в результате к повышенной растворимости, но главной проблемой являлся пониженный уровень активности и выход.
Заявка на европейский патент ЕР 593 868, названная Конъюгаты ПЭГ - интерферон, описывает получение конъюгатов ПЭГ-а-ИФН. Однако реакция присоединения ПЭГ не являет ся сайт-специфической, и поэтому получается смесь изомеров положения конъюгатов ПЭГ-аИФН (см. также Мопкагкй и др., АС8 8утр.8ет., 680:207-216, 1997).
КшкДет и др. в заявке на европейский патент ЕР 675201 продемонстрировали селективную модификацию Ν-концевого остатка фактора роста и развития мегакариоцитов м-ПЭГпропионовым альдегидом. Это позволило осуществить воспроизводимые присоединения ПЭГ и фармакокинетику от серии к серии. СПЬеИ и др. в патенте США № 5711944 показали, что присоединение ПЭГ к α-ИФН может быть проведено с оптимальным уровнем активности. В этом случае требовалась трудоёмкая стадия очистки для получения оптимального конъюгата.
Большинство цитокинов, как и другие белки, не обладают специфическим сайтом для присоединения ПЭГ и, кроме упомянутых выше примеров, очень возможно, что некоторые из изомеров, получаемые при реакции присоединения ПЭГ, являются частично или полностью неактивными, вызывая таким образом потерю активности конечной смеси.
Сайт-специфическая реакция присоединения одной единицы ПЭГ является, таким образом, желаемой целью при получении таких белковых конъюгатов.
^одЫтеп и др., Вюеопщда1е СНет.. 4 (5): 314-318, 1993, синтезировали селективное к тиольной группе производное ПЭГ для такого сайт-специфического присоединения ПЭГ. Было показано, что устойчивое производное ПЭГ, защищенное по тиольной группе парапиридилдисульфидной (о-П-88-) реакционноспособной группой специфически конъюгируется со свободным цистеином в белке, папаине. Вновь образованная дисульфидная связь между папаином и ПЭГ могла быть расщеплена в мягких восстановительных условиях для регенерации нативного белка.
Цитирование здесь любого документа не предполагает признания, что такой документ является ранним прототипом или может быть рассмотрен как материал в отношении патентоспособности любого пункта настоящей заявки.
Любое заявление, касающееся содержания или даты какого-либо документа, основывается на доступной заявителям информации на момент представления документа и не является признанием правильности такого заявления.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение относится к конъюгатам полиол - β-ИФН и, в частности к конъюгатам ПЭГ - β-ИФН, где единица полиола ковалентно связана с Сук17. Специфическая конъюгация получается при взаимодействии реакционноспособного в отношении тиола полиольного агента с остатком Сук17 в β-ИФН. Такие конъюгаты, как ожидают, показывают повы шенную эффективность ίη νίνο. Целью изобретения является достижение повышенной растворимости при нейтральных значениях рН, повышенной стабильности (пониженная агрегация), пониженной иммуногенности и отсутствия потери активности по отношению к нативному β-ИФН. Результаты такой конъюгации могут уменьшить число доз, необходимых для ожидаемого действия, упростят и сделают стабильной препаративную форму фармацевтической композиции и увеличат продолжительность действия.
Настоящее изобретение далее относится к способу поэтапного присоединения ПЭГ -частей последовательно к полипептиду.
Краткое описание рисунков
На фиг. 1 показана кривая капиллярного электрофореза (КЭ) конъюгата ПЭГ - β-ИФН до очистки.
Фиг. 2А - 2С показывают очистку конъюгата ПЭГ - β-ИФН, проведенную с помощью эксклюзионной по размерам хроматографии (супероза 12): фиг. 2 А - первое прохождение; фиг. 2В - второе прохождение; фиг. 2С - третье прохождение.
Фиг. 3 представляет хроматографию с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (8Ό8-ΡΑ6Ε) конъюгата ПЭГ - β-ИФН, очищенного после третьего прохождения хроматографии. Полосы 1 и 4 представляют стандарты белков определенной молекулярной массы, полоса 2 означает нативный β-ИФН и полоса 3 представляет конъюгат ПЭГ - β-ИФН.
Фиг. 4 представляет кривую капиллярного электрофореза (КЭ) очищенного конъюгата ПЭГ - β-ИФН, в котором β-ИФН присоединен к ПЭГ использованием м-ПЭГ-о-П-885к.
Фиг. 5 представляет масс-спектр лазерной десорбции и ионизации из матрицы (ΜΑΕΌΙΜ8) очищенного конъюгата ПЭГ - β-ИФН.
Фиг. 6 показывает сравнение антивирусной активности нативного β-ИФН и конъюгата ПЭГ - β-ИФН. Клетки \У18Н инкубировали с указанными концентрациями образцов β-ИФН в течение 24 ч до контрольного заражения цитопатической дозой вируса везикулярного стоматита. Цитопатический эффект определяли после дополнительных 48 ч при превращении с применением МТТ 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5дифенилтетразолийбромид, тиазолиловый синий).
Фиг. 7 представляет кривую связывания βИФН и ПЭГ -ИФН в клетках Эанбг
Фиг. 8 демонстрирует фармокинетическую кривую β-ИФН и ПЭГ-ИФН у мышей после внутривенного введения. Пунктирные линии указывают предел количественного определения (БОО) для каждой стандартной кривой.
Фиг. 9 демонстрирует фармакокинетическую кривую β-ИФН и ПЭГ -ИФН у мышей по сле подкожного введения. Пунктирные линии означают БОО для каждой стандартной кривой.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение основывается на открытии, что присоединение полиольной части, более конкретно ПЭГ-части, к остатку Суз17 человеческого β-ИФН неожиданно повышало (или, по меньшей мере, сохраняло и не приводило к понижению) биологическую активность β-ИФН по отношению к активности нативного β-интерферона человека. Таким образом, βИФН с полиольной частью, присоединенной к остатку Суз17, не только проявляет такую же или большую биологическую активность βИФН, но этот конъюгат полиол - β-ИФН также обеспечивает желаемые свойства, приданные полиольной частью, такие как, например, увеличенная растворимость.
Термин β-ИФН, используемый здесь, означает интерферон фибробластов человека, полученный путем выделения из биологических жидкостей или полученный с помощью методик с рекомбинантной ДНК из прокариотических или эукариотических клеток-хозяев, а также его соли, функциональные производные, предшественники и активные фракции при условии, что они содержат остаток цистеина, находящийся в положении 17 во встречающейся в природе форме.
Полиольная часть в конъюгате полиол - βИФН согласно настоящему изобретению может быть любым водорастворимым моно- или бифункциональным поли(алкиленоксидом) с линейной или разветвленной цепью. Обычно полиол является поли(алкиленгликолем), как например, поли(этиленгликоль) (ПЭГ). Однако специалисты в этой области поймут, что другие полиолы, такие как, например, поли(пропиленгликоль) и сополимеры полиэтиленгликоля и полипропиленгликоля, также пригодны для применения.
Используемый здесь термин ПЭГ-часть включает, но не ограничивается, линейный и разветвленный ПЭГ, метокси-ПЭГ, гидролитически или ферментативно разлагаемый ПЭГ, ПЭГ с боковыми целями, дендримерный ПЭГ, сополимеры ПЭГ и одного или нескольких полиолов и сополимеры ПЭГ и ПМГК (поли(молочная/гликолевая кислота)).
Понятие соли, используемое здесь, относится как к солям карбоксильных групп, так и к солям аминогрупп, полученным известными способами. Соли карбоксильных групп включают неорганические соли, такие как, например, натриевые, калиевые, кальциевые соли и соли с органическими основаниями, такие как образованные с амином, таким как, например, триэтаноламин, аргинин или лизин. Соли аминогрупп включают, например, соли с неорганическими кислотами, такими как соляная кислота, и с ор003789 ганическими кислотами, такими как уксусная кислота.
Понятие функциональные производные, используемое здесь, относится к производным, которые могут быть получены благодаря функциональным группам, присутствующим в боковых цепочках аминокислотных участков или в концевых Ν- или С-группах, в соответствии с известными способами и включаются в настоящее изобретение, когда они являются фармацевтически приемлемыми, т.е. когда они не подавляют активность белка или не придают токсичность содержащим их фармацевтическим композициям. Такие производные включают, например, сложные эфиры или алифатические амиды карбоксильных групп и Ν-ацилпроизводные свободных аминогрупп или Оацилпроизводные свободных гидроксильных групп и образуются с ацильными группами, такими как, например, алканоильная или ароильная группы.
Предшественники представляют собой соединения, которые превращаются в β-ИФН в организме человека или животного.
В качестве активных фракций белка настоящее изобретение подразумевает любой фрагмент или предшественник полипептидной цепи самого соединения, одного или в комбинации с родственными молекулами или со связанными с ним остатками, например остатки сахаров или фосфатов, или агрегаты полипептидной молекулы, когда такие фрагменты или предшественники проявляют такую же активность, как β-ИФН, в качестве лекарственного средства.
Конъюгаты по настоящему изобретению могут быть получены любым из известных в данной области способов. В соответствии с вариантом осуществления изобретения β-ИФН реагирует с осуществляющим присоединение ПЭГ агентом в подходящем растворителе и желаемый конъюгат выделяют и очищают, например, используя один или несколько хроматографических методов.
Хроматографический метод подразумевает любую методику, используемую для разделения компонентов смеси при их нанесении на носитель (стационарная фаза), через который пропускают растворитель (подвижная фаза). Принципы разделения при хроматографии основываются на различных физических свойствах стационарной и подвижной фазы.
Некоторые особые виды хроматографических методов, которые хорошо известны в литературе, включают жидкостную хроматографию, жидкостную хроматографию высокого давления (высокоэффективную), ионообменную хроматографию, абсорбционную хроматографию, аффинную хроматографию, распределительную хроматографию, хроматографию с гидрофобным взаимодействием, обращенно-фазовую хроматографию, гель-фильтрацию, ультра фильтрацию или тонкослойную хроматографию.
Обеспечивающий присоединение ПЭГ агент, имеющий группу, реакционноспособную по отношению к тиольной группе, как упоминается в настоящей заявке, означает любое производное ПЭГ, способное реагировать с тиольной группой остатка цистеина. Это может быть, например, ПЭГ, содержащий функциональную группу, такую как орто-пиридилдисульфидная, винилсульфоновая, имидмалеиновой кислоты иодацетамид и другие. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, обеспечивающим присоединение ПЭГ агентом, имеющим группу реакционноспособную по отношению к тиольной группе, является орто-пиридилдисульфидное (оП-88) производное ПЭГ.
Агент, обеспечивающий присоединение ПЭГ, применяется в моно-метоксилированной форме, где только один конец доступен для конъюгации, или в бифункциональной форме, где оба конца доступны для конъюгации, как, например, при образовании конъюгата с двумя β-ИФН, ковалентно присоединенными к одной ПЭГ-части. Он имеет предпочтительно молекулярную массу между 500 и 100 000.
Типичная схема реакции получения конъюгатов по изобретению представлена ниже:
Ν=\ н<7 белок—ЗН + м-ПЭГ—8—8—ά ► м-ПЭГ—8—8—белок ^^/^р-меркаптоэтанол белок—8—Н + м-ПЭГ—8—Н + НОСН^—8—8—СНгСНоОН
Вторая строчка приведенной выше схемы показывает способ расщепления связи ПЭГбелок. Производное м-ПЭГ-88-П-о является высоко селективным для свободных сульфгидрильных групп и быстро реагирует при кислотных значениях рН, при которых β-ИФН устойчив. Высокая селективность может быть продемонстрирована на примере восстановления конъюгата в нативную форму β-ИФН и ПЭГ.
Показано, что дисульфидная связь, которая образуется между белком и ПЭГ-частями, устойчива при циркуляции, но она может быть восстановлена при вхождении в клеточную среду. Поэтому ожидается, что конъюгат, который не вошел в клетку, будет устойчив при циркуляции до его выведения.
Следует отметить, что вышеупомянутая реакция является сайт-специфической, поскольку два других остатка Сук, находящиеся в положениях 31 и 141 во встречающейся в природе форме человеческого β-ИФН, не реагируют с агентом, осуществляющим присоединение ПЭГ, к имеющим группу, реакционноспособную по отношению к тиольной группе, поскольку они образуют дисульфидный мостик.
Настоящее изобретение также относится к способу поэтапного присоединения двух или более ПЭГ-частей к полипептиду. Этот способ основывается на обнаружении того, что активированный ПЭГ с низкой молекулярной массой реагирует более полно со стерически затрудненным реакционным сайтом на белке, чем активированный ПЭГ с высокой молекулярной массой. ПЭГ-модификация дорогих терапевтических белков должна быть эффективной по стоимости, чтобы приготовление конъюгатов ПЭГ было целесообразным. Кроме того, чтобы уменьшить фильтрацию от конгломератов и оптимизировать фармакологические свойства конъюгатов ПЭГ-белок, конъюгаты должны иметь эффективный размер, эквивалентный таковому для белка с молекулярной массой в 70 кДа. Это означает, что для сайт-специфической модификации, когда присоединяется один остаток ПЭГ, предпочтительно присоединяется производное ПЭГ с молекулярной массой более чем 20 кДа. Если сайт модификации стерически нагружен, реакционноспособная группа на большой ПЭГ-части может испытывать трудность в достижении сайта модификации, и это приведет к низким выходам. Предпочтительный способ присоединения ПЭГ к полипептиду согласно настоящему изобретению повышает выход сайтспецифического присоединения ПЭГ путем того, что сначала присоединяется небольшая гетеро- или гомобифункциональная ПЭГ-часть, которая, благодаря своему относительно меньшему размеру, может реагировать со стерически нагруженными сайтами. Последующее присоединение производного ПЭГ с большой молекулярной массой к небольшому ПЭГ приводит к высокому выходу желаемого белка с присоединенным ПЭГ.
Способ поэтапного присоединения двух или нескольких ПЭГ-частей последовательно к полипептиду согласно настоящему изобретению включает присоединение гетеробифункциональной или гомобифункциональной ПЭГ-части с низкой молекулярной массой сначала к полипептиду и затем присоединение монофункциональной или бифункциональной ПЭГ-части к свободному концу ПЭГ-части с низкой молекулярной массой, которая присоединена к полипептиду. После поэтапного присоединения двух или более ПЭГ-частей последовательно к полипептиду, который предпочтительно является βИФН и в котором Су5|7. расположенный в стерически нагруженном сайте, является предпочтительным сайтом присоединения ПЭГ, конъюгат ПЭГ-полипептид может быть очищен с использованием одной или более методик очистки, таких как, например, ионообменная хроматография, вытеснительная по размерам хроматография, хроматография с гидрофобным взаимодействием, аффинная хроматография и обращённо-фазовая хроматография.
ПЭГ-часть с низкой молекулярной массой имеет формулу:
\-СН2СН2О (СН2СН2О)тСН2СН2-Х, где \ и X являются группами, которые независимо реагируют с амином, сульфгидрильной, карбоксильной или гидроксильной функциональной группой для присоединения ПЭГ-части с низкой молекулярной массой к полипептиду. \ и X выбираются независимо предпочтительно из орто-пиридилдисульфида, имидов малеиновой кислоты, винилсульфонов, иодацетамидов, аминов, тиолов, карбоксилов, активных сложных эфиров, бензотриазолкарбонатов, пнитрофенолкарбонатов, изоцианатов и биотина. ПЭГ-часть с низкой молекулярной массой предпочтительно имеет молекулярную массу в диапазоне от 100 до 5000 дальтон.
Монофункциональная или бифункциональная ПЭГ-часть для присоединения к свободному концу ПЭГ с низкой молекулярной массой, который связан с полипептидом, имеет предпочтительно молекулярную массу в диапазоне примерно от 100 дальтон до 200 кДа и представляет предпочтительно метокси-ПЭГ, разветвленный ПЭГ, гидролитически или ферментативно разлагаемый ПЭГ, дополненный ПЭГ или дендримерный ПЭГ. Монофункциональный или бифункциональный ПЭГ имеет, кроме того, формулу:
У-СН2СН2О(СН2СН2О)мСН2СН2-2, где Υ является реакционноспособным остатком по отношению к концевой группе на свободном конце ПЭГ-части с низкой молекулярной массой, которая присоединена к полипептиду, и Ζ является метоксигруппой или реакционноспособной группой для образования бифункционального конъюгата.
Конъюгат ПЭГ - полипептид, полученный вышеупомянутым способом поэтапного присоединения двух или более ПЭГ-частей, может быть применен в качестве активного ингредиента для получения лекарственного средства или фармацевтической композиции для лечения заболеваний или нарушений, по отношению к которым полипептиды эффективны.
Другим объектом настоящего изобретения является получение конъюгатов, по существу, в очищенной форме, для того, чтобы они были пригодны для использования в фармацевтических композициях в качестве активных ингредиентов для лечения диагностики или прогнозирования бактериальных или вирусных инфекций, а также аутоиммунных, воспалительных заболеваний и опухолей. Такие фармацевтические композиции представляют другой объект настоящего изобретения.
Нелимитирующие примеры вышеуказанных заболеваний включают септический шок, СПИД, ревматоидный артрит, красную волчанку и рассеянный склероз.
Дальнейшие варианты осуществления изобретения и преимущества изобретения будут очевидны из следующего описания.
Вариантом осуществления изобретения является введение фармакологически активного количества конъюгатов по изобретению субъектам с риском развития одного из вышеупомянутых заболеваний или субъектам, уже имеющим такие патологии.
Может быть использован любой способ введения, совместимый с действующим началом. Парентеральное введение, как, например, подкожное, внутримышечная или внутривенная инъекции предпочтительно. Доза активного ингредиента, которую следует ввести, зависит от медицинского предписания в соответствии с возрастом, весом и индивидуальной реакцией больного.
Доза может быть в интервале от 10 мкг до 1 мг в день для среднего веса тела 75 кг, предпочтительная дневная доза находится в интервале от 20 до 200 мкг.
Фармацевтические композиции для парентерального введения могут быть получены в виде инъецируемой формы, состоящей из активного начала и подходящего носителя. Носители для парентерального введения хорошо известны в этой области и включают, например, воду, физиологический раствор, раствор Рингера и/или декстрозу. Носитель может содержать небольшие количества наполнителей для поддержания стабильности и изотоничности фармацевтического препарата. Получение растворов может быть осуществлено согласно обычным методикам.
Настоящее изобретение описано с ссылкой на конкретные варианты осуществления изобретения, но содержание описания включает все модификации и замены, которые могут быть сделаны специалистом в данной области без расширения объема и цели, определенных формулой изобретения.
Изобретение далее будет описано с помощью следующих примеров, которые не должны быть рассмотрены как каким-либо образом ограничивающие настоящее изобретение.
Пример 1. Получение конъюгата ПЭГ-βИФН. Модификация β-ИФН с помощью мПЭГ5к-88-П-о.
Рекомбинантный β-ИФН человека, устойчивый при концентрации 0,37 мг/мл в 50 мМ буфере с ацетатом натрия, рН 3,6, использовали для получения конъюгата ПЭГ-в-ИФН. Примерно 1,0 мл 6М мочевины прибавляли к 2 мл β-ИФН в концентрации 0,37 мг/мл (0,74 мг, 3,7х10-8 моль). Прибавляли м-ПЭГ5к-88-П-о с молярным избытком 50 моль на один моль βИФН и оба компонента реагировали в полипропиленовой пробирке либо в течение 2 ч при 37°С, либо в течение 1 ч при 50°С. Реакционную смесь перед какой-либо очисткой анализировали с использованием кривой капиллярного электрофореза (КЭ) для определения степени образования конъюгата ПЭГ-в-ИФН при реакции присоединения ПЭГ (фиг. 1). Типичный выход ПЭГ-в-ИФН для этой реакции составляет 50%.
Продукты реакции отфильтровывали от реакционной смеси с применением шприцевого фильтра диаметром 0,22 мм и отфильтрованный раствор затем загружали в колонку для эксклюзионной по размерам хроматографии (либо супероза 12, либо супердекс 75, Рйатшас1а) и элюировали буфером с рН 7,0, содержащим 50 мМ фосфат натрия, 150 мМ №1СТ На фиг. 2А представлена кривая элюирования после очистки конъюгата ПЭГ-β-ИФН на колонке с суперозой 12 для вытеснительной по размерам хроматографии. Пики собирали и анализировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (фиг.3). Фракции, содержащие конъюгат ПЭГ-βИФН, объединяли и концентрат затем повторно загружали в такую же колонку для вытеснительной по размерам хроматографии с целью дальнейшей очистки конъюгата ПЭГ-β-ИФН изза близости пика нативного β-ИФН (фиг. 2В). Эту процедуру повторяли (третье прохождение), чтобы гарантировать чистоту (фиг. 2С). Фиг. 4 и фиг. 5 представляют соответственно кривую капиллярного электрофореза и масс-спектр лазерной десорбции и ионизации из матрицы очищенного конъюгата ПЭГ-β-ИФН.
Модификация β-ИФН с помощью м-ПЭГ30к-88-П-о.
Предоставленный рекомбинантный человеческий β-ИФН устойчив в растворе в концентрации 0,36 мг/мл в 50 мМ натрийацетатном буфере, рН 3,6. Приблизительно 36 мг м-ПЭГ30к88-П-о в 3 мл деионизованной воды прибавляли к 3 мл β-ИФН в концентрации 0,36 мг/мл (1,08 мг, 4,9 х 10-8 моль) и оба продукта реагировали в полипропиленовой пробирке в течение 2 ч при 50°С. Реакционную смесь анализировали для определения степени модификации с помощью капиллярного электрофореза. Обычные выходы для этой реакции составляют <30%. Раствор затем помещают в колонку для вытеснительной по размерам хроматографии (супероза 12, фирма Рйатшааа) и элюируют с помощью буфера с рН 7,0, содержащего 50 мМ фосфата натрия, 150 мМ №1С1. Фракции собирают и анализируют на содержание с применением электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия.
Пример 2. Биологическая активность конъюгатов ПЭГ-β-ИФН.
Чтобы оценить влияние присоединения ПЭГ на противовирусную активность рекомбинантного человеческого β-ИФН, амниотические клетки XVI8Н человека предварительно инкубировали либо со свежеприготовленным β-ИФН (такая же серия, как использованная для присоединения ПЭГ), либо с конъюгатом ПЭГ-βИФН. Опосредствованную β-ИФН противовирусную активность, как измеренную с помощью анализа заболеваемости клеток XVI8Н при воздействии вируса везикулярного стоматита (У8У), определяли согласно разработанному биотесту для \У18Н, основанному на протоколе Хомск и др., 1. 1ттипо1, 129:2244-2247(1982). Материалы, использованные в этом анализе \У18Н, приведены ниже:
клетки \У18Н (АТСС/Американская коллекция типовых культур/ССБ 25), штаммы вируса везикулярного стоматита (АТСС У-520-001-522), хранящиеся при -70°С, β-ИФН, человеческий рекомбинантный, 1п1етРйатт БаЬогаЮпех ЙТЭ (тип 32,075, партия № 205035), 82х106 МЕд./мл, удельная активность: 222х106 МЕд./мг, конъюгат ПЭГ-в-ИФН, полученный в примере 1 и сохраняемый в забуференном фосфатом физиологическом растворе (ЗФР), рН 7,4, среда для роста \У18Н (минимальная поддерживающая среда (МЕМ)) с высоким содержанием глюкозы, с солями Еаг1е + 5% фетальной бычьей сыворотки + 1,0% й-глутамина + пенициллин/стрептомицин (100 Ед./мл, 100 мкг/мл), среда для анализа \У18Н (МЕМ) с высоким содержанием глюкозы, с солями Еаг1е + 5% фетальной бычьей сыворотки + 1,0% й-глутамина + пенициллин/стрептомицин (100 Ед./мл, 100 мкг/мл),
МТТ в концентрации 5 мг/мл в ЗФР, хранящийся при -70°С.
Протокол испытания \У18Н следует далее.
Делают двукратное разведение образцов βИФН относительно начальной концентрации в среде для анализа \У18Н.
Делают трехкратные разведения образцов βИФН в среде для анализа \У18Н в 96-ячеечном плоскодонном планшете так, чтобы в каждой ячейке содержалось 50 мкл разведенного образца β-ИФН (в некоторые контрольные ячейки помещают только 50 мкл среды для анализа \У18Н).
Собирают клетки XVI8Н фазы логарифмического роста с помощью раствора трипсин/ этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТК), промывают средой для анализа ХУ18Н и доводят до конечной концентрации 0,8 х 106 клеток/мл.
Прибавляют 50 мкл суспензии клеток Χνΐ8Η (4х104 клеток/в ячейке) в каждую ячейку. Теперь конечная концентрация β-ИФН, представленного клеткам, составляет 1.
После инкубирования в течение 24 ч в инкубаторе в атмосфере 5% СО2 добавляют 50 мкл, разбавленной 1:10 (в среде для анализа Χνΐ8Η) исходной культуры У8У (доза, предварительно определенная для лизирования 100% клеток Χνΐ8Η в течение 48 ч) во все ячейки, кроме контрольных ячеек (в такие ячейки помещают только равный объем среды для анализа).
Еще через 48 ч во все ячейки добавляют 25 мкл раствора МТТ, после чего планшеты инкубируют ещё в течение 2 ч в инкубаторе.
Содержимое ячеек удаляют путем перевертывания планшета и в ячейки добавляют 200 мкл 100% этилового спирта.
Через 1 ч снимают показания с планшетов при 595 нм с использованием программного обеспечения 8ой тах Рго и спектрофотометрической системы 8рее1татах (фирмы Мо1еси1аг Пеу1се8).
Таблица 1. Противовирусная активность образцов β-ИФН с присоединенным ПЭГ и с псевдоприсоединенным ПЭГ
Образец β-ИФН* ЕС50**
Конъюгат ПЭГ-β-ИФН 3,9 + /- 0,7пг/мл
β-ИФН 16,4 +/- 1,0пг/мл
* Исходные концентрации β-ИФН в образцах, определенные с помощью аминокислотного анализа.
** ЕС50 (эффективная концентрация, приводящая к 50%-ному эффекту) (+/- стандартное отклонение /С.О./) определяли с помощью программного обеспечения М1сгоса1 Οτί§ίη 4.1
Как показано на фиг. 6 и в табл. 1, конъюгаты ПЭГ^-ИФН поддерживали уровень противовирусной активности выше уровня активности свежеприготовленной партии родительского β-ИФН. Наблюдение, что конъюгат ПЭГ β-ИФН имеет приблизительно в 4 раза более высокую биоактивность, чем активность свежеприготовленного β-ИФН, может также быть следствием увеличенной стабильности конъюгата ПЭГ-[(-ИФН по отношению к нативному β-ИФН после прибавления среды для анализа клеток ХУ18Н.
Пример 3. Ιη Уйто анализы относительной активности образцов ПЭГ - ИФН.
Определяли относительную биоактивность ПЭГ [30 кДа] - β-ИФН и ПЭГ[2 х 20 кДа] - βИФН путем анализа ^18Н, используя стандартный протокол, описанный в примере 2 (табл. 2). Было проведено три независимых анализа тремя разными исполнителями в разное время.
Таблица 2. Относительная противовирусная активность ПЭГ^-ИФН
Относительная активность интерферона * (из трех исследований)
Образец Анализ 1 Анализ 2 Ана- лиз 3 Среднее значение (С.О.)
ПЭГ[30 кДа]^ИФН В 3,2 раза выше В 3,1 раза выше В 1,8 раза выше В 3,0 раза (0,78) выше
ПЭГ [2x20 кДа]^ИФН В 4,2 раза выше В 1,3 раза выше В 0,85 раза выше В 2,1 раза (1,8) выше
* Дозы с ЕС50 в сравнении со стандартом β-ИФН, включенным в каждый анализ.
Сравнение базируется на концентрации βИФН в 330 мкг/мл. Исходные концентрации ПЭГ [30 кДа] -β-ИФН (5,41 мкг/мл) и ПЭГ [2 х 20 кДа] - β-ИФН (6,86 мкг/мл) были определены с помощью аминокислотного анализа.
Связывание ПЭГ-в-ИФН с его рецептором на клетках оценивалось в присутствии фиксированного количества 1251-ИФН-а2а. ИФН-а2а радиоактивно метили с помощью 1251, используя метод с хлорамином Т. Связанный с 1251 ИФНа2а отделяли от свободного иода при пропускании реагентов через колонку с Сефадексом 625 и объединении содержащих белок фракций (фирма Рйаттааа). 1251-ИФН-а2а количественно оценивали с помощью ферментного иммуносорбентного анализа (ЕЫ8А) (фирма Вюкоигее, США) и определяли удельную активность. Собирали клетки Οαιιάί. выросшие в экспоненциальной фазе роста, и 2 х 106 клеток инкубировали с 0,5 нМ 1251-ИФН-а2а в течение 3 ч при комнатной температуре в присутствии различных концентраций ПЭГ-в-ИФН или ИФН-а2а, разведенных в буфере для анализа, который является средой РРМ1 1640, содержащей 2% фетальной бычьей сыворотки и 0,1% азида натрия. По окончании инкубирования клетки пропускали через слой фталата в виде масла и связанную с клеткой радиоактивность считали с помощью счетчика гамма-квантов. Следует добавить, что связывание ПЭГ [30 кДаЩ-ИФН и ПЭГ [2 х 20 кДа]-в-ИФН с рецептором было очень похожим или близким связывающей активности β-ИФН, как показано на фиг. 7.
Также относительная активность была определена при анализе антипролиферационного эффекта в отношении клеток ОаиПт (В-клетки лимфомы человека) (фиг. 3). Все интерфероны были приготовлены в концентрации 2 х от 200 нг/мл. Образцы разводили в три раза вдоль по длине планшета при конечном объеме 100 мкл. Прибавляли в каждую ячейку 1х105 клеток/ ячейка (100 мкл) и инкубировали в общей сложности в течение 72 ч при 37°С в увлажненном СО2 инкубаторе. Через 48 ч прибавляли насыщенный тритием (3Н) тимидин в 20 мкл по 1 мкКю/в ячейке. В конце 72-часового инкубирования все содержимое планшета собирали с помощью устройства для сбора с планшета Тош1ек. Представленные в табл. 3 результаты показывают, что после присоединения ПЭГ не наблюдали какой-либо определяемой потери активности интерферона. На самом деле, активность была несколько выше, чем для свободного β-ИФН. Это может быть объяснено образованием неактивных агрегатов в свободном интерфероне или различиями в способах количественной оценки (аминокислотный анализ для образцов ПЭГ - ИФН и обращённо-фазовая ВЭЖХ для β-ИФН) .
Таблица 3. Анализ антипролиферационной активности на клетках Иаиб!
Доза 1С50 Кратность увеличения по отношению к ИФН
β-ИФН (планшет 1) 1153,1 -
ПЭГ [30 кДа]- ИФН (71А) 695,6 В 1,6 раза
β-ИФН (план- шет 2) 1005,8 -
ПЭГ[40кДа]- ИФН (71В) 629,4 В 1,7 раза
Пример 4. Фармакокинетические исследования на мышах. Внутривенное введение.
Мышей инъецировали 100 нг Р-ИФН, ПЭГ[30кДа] - β-ИФН или ПЭГ [2 х 20 кДа] - βИФН и кровь отбирали после этого в указанные моменты времени. Концентрации β-ИФН в сыворотке определяли с помощью специфичного к β-ИФН ЕЫ8А (Тогау 1п6и81пе8), результаты приведены на фиг. 8. Двадцать восемь самок мышей штамма Β6Ό2Ε1 (6-8 недель) (каждая весом примерно 20 г) делили на четыре группы следующим образом: группа 1 состояла из девяти мышей, однократно инъецированных 200 мкл болюса человеческого β-ИФН в концентрации 500 нг/ мл (конечная доза 100 нг/ мышь); группа 2 (девять мышей) получала 200 мкл эквивалентного по массе ПЭГ [30 кДа] - β-ИФН; группа 3 получала 200 мкл эквивалентного по массе ПЭГ [2 х 20 кДа] - β-ИФН и группа 4 является группой из трех неинъецированных мышей, служивших в качестве отрицательного контроля.
Образцы крови (примерно 200 мкл/образец) собирали в девять указанных моментов времени путем введения в ретро-глазничное венозное сплетение капиллярной трубки. Образцам крови давали возможность свернуться в течение 1 ч при комнатной температуре, сгустки, перемешивая круговыми движениями, отводили от стенок и подвергали микроцентрифугированию. Выделенные при этом сыворотки хранили при -70°С до тех пор, пока были собраны все образцы. Сыворотки исследовались на присутствие биоактивного человеческого β-ИФН с использованием Тогау-анализа. Результаты показывают, что площадь под кривой (ППК) заметно возрастает в случае образцов ПЭГ - ИФН по отношению к свободному β-ИФН и что ПЭГ [2 х 20 кДа^-ПФН превосходит ПЭГ [30 кДа] - β-ИФН.
Подкожное введение
Мышам инъецировали подкожно β-ИФН и ПЭГ - ИФН (100 нг/ мышь). Фиг. 9 показывает, что общая площадь под кривой (ППК) резко увеличена в случае образцов ПЭГ - ИФН по сравнению со свободным β-ИФН. Фармакокинетические исследования согласуются с тем, что образцы ПЭГ - ИФН имеют больший период полувыведения и увеличенную ППК.
Пример 5. Присоединение ПЭГ-части с низкой молекулярной массой к полипептиду.
Связывание β-интерферона с о-П-88ПЭГ 2к-гидразидом
Рекомбинантный человеческий β-интерферон был использован в растворе в концентрации 0,33 мг/мл в 50 мМ натрийацетатного буфера, рН 3,8. Приблизительно 3,6 мг (40-мольный избыток по отношению к молям белка) гетеробифункционального, включающего ПЭГ реагента, о-П-88-ПЭГ2к-гидразид, в 2 мл деионизованной воды добавляли к 3 мл β-ИФН в концентрации 0,33 мг/мл (0,99 мг) и оба компонента реагировали в полипропиленовой пробирке в течение 1 ч при 45°С. Реакционную смесь затем анализировали с использованием капиллярного электрофореза для определения степени модификации. Типичные выходы находились в пределах 90-97%, что зависело от чистоты βинтерферона и ПЭГ реагента. Затем раствор вносили в колонку для вытеснительной по размерам хроматографии (супердекс 75, Рйаттас1а) и элюировали содержащим 5 мМ фосфат натрия и 150 мМ ЫаС1 буфером с рН 7,0. Фракции собирали и анализировали при электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Фракции, содержащие β-интерферон с одной присоединенной ПЭГчастью, объединяли, используя затем для дальнейшего этапа модификации с применением ПЭГ с высокой молекулярной массой.
Связывание β-интерферона с (о-П-88)2 ПЭГ3400
Рекомбинантный человеческий βинтерферон использовали в растворе в 50 мМ натрийацетатном буфере, рН 3,8, в концентрации 0,33 мг/мл. Приблизительно 6,1 мг (40мольный избыток по отношению к молям белка) гомобифункционального ПЭГ -реагента, (о-П88)2-ПЭГ3400, в 2 мл деионизованной воды прибавляли к 3 мл β-интерферона в концентрации 0,33 мг/мл (0,99 мг) и проводили реакцию в полипропиленовой пробирке 2 ч при 50°С. За ходом реакции следили с помощью невосстановительного электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия и конечную реакционную смесь анализировали с помощью капиллярного электрофореза для определения степени модификации.
Типичные модификации для этой реакции с β-интерфероном составляли >95%. Раствор затем вводили в колонку для вытеснительной по размерам хроматографии (супердекс 75, Рйагтас1а) и элюировали содержащим 50 мМ фосфат натрия и 150 мМ №1С1 буфером с рН 7,0.
Фракции собирали и анализировали их содержание с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Фракции, содержащие β-интерферон с одним присоединенным остатком ПЭГ, объединяли.
Пример 6. Присоединение второй ПЭГчасти к ПЭГ с низкой молекулярной массой, присоединенному к полипептиду.
Модификация ИФН -8-8-ПЭГ2к-гидразида с помощью м-ПЭГ30к альдегида белок—8—8— ПЭГ^Ц—ΝΗ-ΝΗ2 О + θ - > белок—8—8—ПЭГг,—С—ΝΗ—Ы=СН—м-ПЭГю, м-пэг,Л—сцснЛн
К объединенным фракциям ИФН - 8-8ПЭГ2к-гидразида примера 5 прибавляли мПЭГ30к-альдегид в 20-мольном избытке по отношению к белку. Реакцию проводили при комнатной температуре (25°С) в течение 4 ч и образец помещали в колонку для вытеснительной по размерам хроматографии (супероза 6, Рйагтааа) для определения выхода модификации. Выход модификации обычно составлял >80% в зависимости от чистоты ПЭГ реагента и условий реакции.
После полного описания этого изобретения специалистам в данной области понятно, что то же самое может быть осуществлено в большом диапазоне эквивалентных параметров, концентраций и условий без отступления от объема и сути изобретения и без чрезмерного экспериментирования.
Хотя это изобретение было описано в связи с конкретным вариантом его осуществления, понятно, что оно допускает дальнейшие модификации. Эта заявка предполагает распространение на любые варианты использования или адаптации изобретений, следующих в большинстве случаев принципам изобретения и включающих и такие отклонения от настоящего раскрытия, как встречающиеся в рамках известной или привычной практики в области, к которой относится изобретение, и которые могут быть применены к основным существенным признакам, указанным выше в заявленных пунктах формулы изобретения.
Все указанные здесь ссылочные материалы, включая статьи в журналах и рефераты, опубликованные или неопубликованные заявки на патенты США или заявки на иностранные патенты, опубликованные патенты США или иностранные патенты или любые другие ссылки, полностью включены сюда в качестве ссылок, включая все данные, таблицы, рисунки и текст цитированных ссылок. Кроме этого, полное содержание ссылочных материалов в приведенных здесь ссылках также полностью включено в качестве ссылок.
Ссылка на известные стадии методов, стадии обычных методов, известные методы или обычные методы ни в какой мере не является допущением того, что любой аспект, описание или осуществление настоящего изобретения раскрывается, изучается или предлагается в уровне техники.
Приведенное выше описание конкретных вариантов осуществления изобретения настолько полно раскрывает общую природу изобретения, что другие могут, используя знания в пределах необходимой в данной области квалификации (включая содержание процитированных ссылок), легко модифицировать и/или адаптировать для различных применений такие специальные варианты осуществления изобретения без чрезмерного экспериментирования, без отклонения от общей концепции настоящего изобретения. Поэтому, основываясь на обучении и следовании представленным здесь указаниям, предполагается, что такие адаптации и модификации находятся в пределах объема и существа эквивалентов раскрываемых вариантов осуществления изобретения. Следует также понять, что приведенная здесь фразеология или терминология используется с целью описания, а не ограничения, так что терминология или фразеология настоящего технического описания должна интерпретироваться квалифицированным специалистом в свете представленного здесь обучения и следования представленным указаниям в комбинации со знаниями квалифицированного специалиста в данной области.

Claims (13)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Конъюгат полиол-в-интерферон, полиольная часть которого ковалентно связана с Сук17 человеческого β-интерферона.
  2. 2. Конъюгат полиол-в-интерферон по п.1, в котором указанная полиольная часть является полиалкиленгликольной частью.
  3. 3. Конъюгат полиол-в-интерферон по п.2, где указанная полиалкиленгликольная часть является полиэтиленгликольной (ПЭГ) частью.
  4. 4. Конъюгат полиол-в-интерферон по любому из пп.1-3, где конъюгат полиол-в-интерферон обладает такой же или большей активностью в-интерферона, как нативный человеческий в-интерферон.
  5. 5. Способ получения конъюгата полиол-винтерферон по п.1, включающий стадии взаимодействия в-интерферона с полиольным агентом, имеющим группу, реакционно способную по отношению к тиольной группе для сайт-специфического и ковалентного присоединения полиольной части к Сук17 человеческого в-интерферона с получением конъюгата полиол-в-интерферон, и выделения полученного конъюгата полиолв-интерферон.
  6. 6. Способ по п.5, в котором полиольным агентом, имеющим группу, реакционноспособную по отношению к тиольной группе, является агент для присоединения ПЭГ, имеющий группу, реакционноспособную по отношению к тиольной группе.
  7. 7. Способ по п.5 или 6, где полиольный агент, имеющий группу, реакционноспособную по отношению к тиольной группе, монометоксилирован.
  8. 8. Способ по п.5 или 6, где полиольный агент, имеющий группу, реакционноспособную по отношению к тиольной группе, является бифункциональным.
  9. 9. Способ по п.5 или 6, где полиольным агентом, имеющим группу, реакционноспособную по отношению к тиольной группе, является производное полиола с функциональной группой, выбранной из группы, включающей ортопиридилдисульфид, винилсульфон, имид малеиновой кислоты и иодацетамид.
  10. 10. Способ по п.5 или 6, где полиольным агентом, имеющим группу, реакционноспособную по отношению к тиольной группе, является орто-пиридилдисульфидное производное монометоксилированного полиола.
  11. 11. Способ по п.5, где стадию взаимодействия проводят при кислотных значениях рН, при которых в-интерферон устойчив.
  12. 12. Фармацевтическая композиция, включающая в качестве активного ингредиента конъюгат полиол-в-интерферон по любому из пп.1-3 и фармацевтически приемлемый носитель, наполнитель или вспомогательный агент.
  13. 13. Способ лечения инфекционных болезней, опухолей и аутоиммунных и воспалительных заболеваний, включающий введение субъекту в случае необходимости эффективного количества фармацевтической композиции по п.12.
EA200001111A 1998-04-28 1999-04-28 КОНЪЮГАТЫ ПОЛИОЛ-β-ИНТЕРФЕРОН EA003789B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US8333998P 1998-04-28 1998-04-28
PCT/US1999/009161 WO1999055377A2 (en) 1998-04-28 1999-04-28 Polyol-ifn-beta conjugates

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200001111A1 EA200001111A1 (ru) 2001-04-23
EA003789B1 true EA003789B1 (ru) 2003-10-30

Family

ID=22177687

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200001111A EA003789B1 (ru) 1998-04-28 1999-04-28 КОНЪЮГАТЫ ПОЛИОЛ-β-ИНТЕРФЕРОН
EA200300382A EA005495B1 (ru) 1998-04-28 1999-04-28 Способ поэтапного присоединения частей полиэтиленгликоля к полипептиду

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200300382A EA005495B1 (ru) 1998-04-28 1999-04-28 Способ поэтапного присоединения частей полиэтиленгликоля к полипептиду

Country Status (31)

Country Link
US (3) US6638500B1 (ru)
EP (2) EP1075281B1 (ru)
JP (2) JP4574007B2 (ru)
KR (1) KR100622796B1 (ru)
CN (2) CN1187094C (ru)
AR (1) AR020070A1 (ru)
AT (2) ATE365563T1 (ru)
AU (1) AU762621B2 (ru)
BG (2) BG64694B1 (ru)
BR (1) BR9910023A (ru)
CA (2) CA2565375A1 (ru)
CY (1) CY1108022T1 (ru)
CZ (2) CZ298579B6 (ru)
DE (2) DE69920002T2 (ru)
DK (2) DK1075281T3 (ru)
EA (2) EA003789B1 (ru)
EE (1) EE05214B1 (ru)
ES (2) ES2224649T3 (ru)
HK (2) HK1038194A1 (ru)
HU (1) HUP0300548A3 (ru)
IL (1) IL139286A (ru)
NO (2) NO329749B1 (ru)
NZ (1) NZ507456A (ru)
PL (2) PL193352B1 (ru)
PT (2) PT1421956E (ru)
SI (2) SI1075281T1 (ru)
SK (2) SK286217B6 (ru)
TR (2) TR200003161T2 (ru)
TW (2) TWI232882B (ru)
UA (2) UA79430C2 (ru)
WO (1) WO1999055377A2 (ru)

Families Citing this family (78)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5932462A (en) * 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
US7220717B2 (en) 1997-08-14 2007-05-22 Yeda Research And Development Company Ltd. Interleukin-18 binding proteins, their preparation and use
IL121860A0 (en) 1997-08-14 1998-02-22 Yeda Res & Dev Interleukin-18 binding proteins their preparation and use
US7704944B2 (en) 1997-08-14 2010-04-27 Yeda Research And Development Company Ltd. Interleukin-18 binding proteins, their preparation and use for the treatment of sepsis
LT2599503T (lt) 1998-10-16 2017-06-26 Biogen Ma Inc. Interferono beta-1a polimero konjugatai ir jų panaudojimas
CN100480266C (zh) 1998-10-16 2009-04-22 拜奥根Idec马萨诸塞公司 干扰素-β融合蛋白及用途
AU769425B2 (en) * 1999-04-23 2004-01-29 Alza Corporation Conjugate having a cleavable linkage for use in a liposome
US7238368B2 (en) * 1999-04-23 2007-07-03 Alza Corporation Releasable linkage and compositions containing same
US7303760B2 (en) * 1999-04-23 2007-12-04 Alza Corporation Method for treating multi-drug resistant tumors
US7144574B2 (en) 1999-08-27 2006-12-05 Maxygen Aps Interferon β variants and conjugates
US6531122B1 (en) 1999-08-27 2003-03-11 Maxygen Aps Interferon-β variants and conjugates
US7431921B2 (en) 2000-04-14 2008-10-07 Maxygen Aps Interferon beta-like molecules
TR200101086A3 (ru) * 1999-10-15 2001-08-21
WO2001048052A1 (fr) 1999-12-24 2001-07-05 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Glycols de polyalkylene ramifies
AR027509A1 (es) 2000-01-10 2003-04-02 Maxygen Aps Conjugados g-csf
RU2278123C2 (ru) 2000-02-11 2006-06-20 Максиджен Холдингз Лтд. Молекулы, подобные фактору vii или viia
DE60236796D1 (de) 2001-01-30 2010-08-05 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Verzweigte polyalkylenglykole
EP1234583A1 (en) 2001-02-23 2002-08-28 F. Hoffmann-La Roche Ag PEG-conjugates of HGF-NK4
HUP0303251A2 (hu) 2001-02-27 2003-12-29 Maxygen Aps Béta-interferon-szerű molekulák
DE60236522D1 (de) 2001-07-11 2010-07-08 Maxygen Inc G-csf konjugate
CN101700401B (zh) 2002-01-18 2013-08-14 比奥根艾迪克Ma公司 具有用于共轭生物活性化合物的部分的聚亚烷基二醇
TWI334785B (en) 2002-06-03 2010-12-21 Serono Lab Use of recombinant ifn-β1a and pharmaceutical composition comprising recombinant ifn-β1a for the treatment of hcv infection in patients of asian race
AU2003254641A1 (en) * 2002-08-28 2004-03-19 Maxygen Aps Interferon beta-like molecules for treatment of cancer
US8129330B2 (en) * 2002-09-30 2012-03-06 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
US20040136952A1 (en) * 2002-12-26 2004-07-15 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates of cytokines, chemokines, growth factors, polypeptide hormones and antagonists thereof with preserved receptor-binding activity
KR101238517B1 (ko) * 2002-12-26 2013-02-28 마운틴 뷰 파마슈티컬즈, 인크. 생물학적 효능이 향상된 인터페론-베타의 중합체 접합체
ES2327044T3 (es) 2003-03-20 2009-10-23 Bayer Healthcare Llc Variantes de fvii o fviia.
TWI272948B (en) 2003-05-01 2007-02-11 Ares Trading Sa HSA-free stabilized interferon liquid formulations
GB0316294D0 (en) * 2003-07-11 2003-08-13 Polytherics Ltd Conjugated biological molecules and their preparation
EP2633866A3 (en) 2003-10-17 2013-12-18 Novo Nordisk A/S Combination therapy
AU2008201682B2 (en) * 2004-02-02 2011-02-24 Ambrx, Inc. Modified human interferon polypeptides and their uses
JP4889505B2 (ja) 2004-02-02 2012-03-07 アンブレツクス・インコーポレイテツド 被修飾されたヒト成長ホルモンポリペプチドおよびこれらの使用
EP1586334A1 (en) * 2004-04-15 2005-10-19 TRASTEC scpa G-CSF conjugates with peg
US7879320B2 (en) 2004-05-17 2011-02-01 Ares Trading S.A. Hydrogel interferon formulations
JP2008500995A (ja) 2004-06-01 2008-01-17 アレス トレーディング ソシエテ アノニム タンパク質安定化法
UA92146C2 (ru) 2004-06-01 2010-10-11 Эйрэс Трейдинг С.А. Стабилизированная жидкая композиция, которая содержит интерферон
WO2009100255A2 (en) 2008-02-08 2009-08-13 Ambrx, Inc. Modified leptin polypeptides and their uses
TW200633718A (en) * 2004-12-16 2006-10-01 Applied Research Systems Treatment of hepatitis c in the asian population
JP5243041B2 (ja) 2004-12-21 2013-07-24 ネクター セラピューティックス 安定化ポリマーチオール試薬
KR101224781B1 (ko) 2004-12-22 2013-01-21 암브룩스, 인코포레이티드 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 인간 성장호르몬의 조제물
KR20070090023A (ko) 2004-12-22 2007-09-04 암브룩스, 인코포레이티드 변형 인간 성장 호르몬
JP2008525032A (ja) 2004-12-22 2008-07-17 アンブレツクス・インコーポレイテツド 組換えヒト成長ホルモンを発現及び精製するための方法
EP1893632B1 (en) 2005-06-17 2015-08-12 Novo Nordisk Health Care AG Selective reduction and derivatization of engineered factor vii proteins comprising at least one non-native cysteine
BRPI0614257A2 (pt) * 2005-08-04 2011-03-15 Nektar Therapeutics Al Corp conjugados de uma porção de g-csf e um polìmero
SG155183A1 (en) 2005-08-26 2009-09-30 Ares Trading Sa Process for the preparation of glycosylated interferon beta
KR20080050591A (ko) 2005-09-01 2008-06-09 아레스 트레이딩 에스.에이. 시신경염 치료
US20070238656A1 (en) * 2006-04-10 2007-10-11 Eastman Kodak Company Functionalized poly(ethylene glycol)
WO2007130453A2 (en) * 2006-05-02 2007-11-15 Allozyne, Inc. Non-natural amino acid substituted polypeptides
US20080096819A1 (en) * 2006-05-02 2008-04-24 Allozyne, Inc. Amino acid substituted molecules
JP2009537605A (ja) 2006-05-24 2009-10-29 メルク セローノ ソシエテ アノニム 多発性硬化症を治療するためのクラドリビン・レジメン
KR20090013816A (ko) 2006-05-24 2009-02-05 노보 노르디스크 헬스 케어 악티엔게젤샤프트 연장된 생체내 반감기를 갖는 인자 ⅸ 유사체
EP2076533B1 (en) * 2007-05-02 2014-10-08 Ambrx, Inc. Modified interferon beta polypeptides and their uses
CA2707840A1 (en) * 2007-08-20 2009-02-26 Allozyne, Inc. Amino acid substituted molecules
DK2234645T3 (da) 2007-12-20 2012-07-09 Merck Serono Sa Peg-interferon-beta-formuleringer
CN101525381B (zh) * 2008-03-04 2012-04-18 北京百川飞虹生物科技有限公司 一种重组复合干扰素及其表达载体的构建和表达
WO2009155102A2 (en) * 2008-05-30 2009-12-23 Barofold, Inc. Method for derivatization of proteins using hydrostatic pressure
US20110124614A1 (en) * 2008-10-25 2011-05-26 Halina Offner Methods And Compositions For The Treatment of Autoimmune Disorders
DE102009032179A1 (de) * 2009-07-07 2011-01-13 Biogenerix Ag Verfahren zur Reinigung von Interferon beta
ES2365343B1 (es) 2009-11-19 2012-07-10 Fundación Centro Nacional De Investigaciones Cardiovasculares Carlos Iii Uso de cd98 como marcador de receptividad endometrial.
JP5914363B2 (ja) 2010-02-16 2016-05-11 ノヴォ ノルディスク アー／エス 低減されたｖｗｆ結合を有する因子ｖｉｉｉ分子
AR080993A1 (es) 2010-04-02 2012-05-30 Hanmi Holdings Co Ltd Formulacion de accion prolongada de interferon beta donde se usa un fragmento de inmunoglobulina
US20120135912A1 (en) 2010-05-10 2012-05-31 Perseid Therapeutics Llc Polypeptide inhibitors of vla4
CN102971006A (zh) 2010-07-15 2013-03-13 诺沃—诺迪斯克有限公司 稳定的因子viii变体
WO2012035050A2 (en) 2010-09-15 2012-03-22 Novo Nordisk A/S Factor viii variants having a decreased cellular uptake
CN103228290A (zh) 2011-02-18 2013-07-31 (株)斯坦帝尔 包含沉默信息调节因子1表达诱导物质的败血症或者败血性休克的预防或者治疗用组合物
US9382305B2 (en) 2011-07-01 2016-07-05 Bayer Intellectual Property Gmbh Relaxin fusion polypeptides and uses thereof
MY168902A (en) * 2011-10-01 2018-12-04 Glytech Inc Glycosylated polypeptide and pharmaceutical composition containing same
KR102057356B1 (ko) 2012-02-27 2019-12-18 아뮤닉스 파마슈티컬스, 인크. Ｘｔｅｎ 콘주게이트 조성물 및 그의 제조 방법
US20150030564A1 (en) 2012-02-29 2015-01-29 Toray Industries, Inc. Inhibitory agent for body cavity fluid accumulation
DK2982686T3 (en) 2013-03-29 2018-10-08 Glytech Inc POLYPEPTIDE WITH SIALYLED SUGAR CHAIN CONNECTED
WO2016013697A1 (ko) * 2014-07-24 2016-01-28 에이비온 주식회사 인터페론-베타 변이체의 폴리에틸렌글리콜 배합체
WO2016013911A1 (ko) * 2014-07-24 2016-01-28 에이비온 주식회사 페길화된 인터페론 -베타 변이체
ES2824028T3 (es) 2014-08-19 2021-05-11 Biogen Ma Inc Método de PEGilación
JP7245649B2 (ja) 2015-05-01 2023-03-24 アリスタ ファーマスーティカルス インク． 眼疾患を治療するためのアディポネクチンペプチド模倣薬（関連出願の相互参照）
WO2016205618A1 (en) * 2015-06-19 2016-12-22 Morphotek, Inc. Cys80 conjugated immunoglobulins
EP3612214A4 (en) * 2017-04-17 2021-01-20 The Regents of the University of Colorado, A Body Corporate OPTIMIZATION OF ALTERNATIVE ENZYMOTHERAPY FOR THE TREATMENT OF HOMOCYSTINURIA
US20220118050A1 (en) 2019-01-28 2022-04-21 Toray Industries, Inc. Polyethylene glycol-modified form of hepatocyte growth factor or active fragment thereof
BR112021012472A2 (pt) 2019-01-28 2021-11-30 Toray Industries Forma modificada por polietileno glicol de um fator de crescimento de hepatócito ou um fragmento ativo do mesmo, e, medicamento

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5206344A (en) * 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
WO1987000056A1 (en) * 1985-06-26 1987-01-15 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4917888A (en) 1985-06-26 1990-04-17 Cetus Corporation Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US5208344A (en) * 1987-07-31 1993-05-04 American Home Products Corporation Naphthalenepropionic acid derivatives as anti-inflammatory/antiallergic agents
US5166322A (en) * 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
US5595732A (en) * 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
US5382657A (en) * 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
ES2174915T3 (es) 1993-11-10 2002-11-16 Enzon Inc Productos de conjugacion mejorados de un interferon con un polimero.
DK0690127T3 (da) 1994-03-31 1999-05-03 Amgen Inc Sammensætninger og fremgangsmåder til stimulering af megakaryocytvækst og -differentiering
DE69534318T2 (de) * 1994-05-18 2006-04-20 Nektar Therapeutics, San Carlos Methoden und zusammensetzungen für die trockenpuderarznei aus interferonen
US5824784A (en) * 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
SE9503380D0 (sv) * 1995-09-29 1995-09-29 Pharmacia Ab Protein derivatives
TW517067B (en) * 1996-05-31 2003-01-11 Hoffmann La Roche Interferon conjugates
US5851984A (en) * 1996-08-16 1998-12-22 Genentech, Inc. Method of enhancing proliferation or differentiation of hematopoietic stem cells using Wnt polypeptides
KR0176625B1 (ko) 1996-11-05 1999-04-01 삼성전자주식회사 적외선 물체검출장치
WO1998032466A1 (en) * 1997-01-29 1998-07-30 Polymasc Pharmaceuticals Plc Pegylation process
IL133974A0 (en) * 1997-07-14 2001-04-30 Bolder Biotechnology Inc Derivatives of growth hormone and related proteins
US6307024B1 (en) * 1999-03-09 2001-10-23 Zymogenetics, Inc. Cytokine zalpha11 Ligand
US6531122B1 (en) * 1999-08-27 2003-03-11 Maxygen Aps Interferon-β variants and conjugates

Also Published As

Publication number Publication date
EP1075281A2 (en) 2001-02-14
CZ298597B6 (cs) 2007-11-21
TR200101751T2 (tr) 2002-05-21
UA79430C2 (en) 2007-06-25
JP2002512983A (ja) 2002-05-08
CN100335503C (zh) 2007-09-05
TWI232882B (en) 2005-05-21
DK1421956T3 (da) 2007-10-01
ATE365563T1 (de) 2007-07-15
NO20005337L (no) 2000-12-28
ES2285286T3 (es) 2007-11-16
DE69920002T2 (de) 2005-09-22
US7357925B2 (en) 2008-04-15
HUP0300548A3 (en) 2005-07-28
HUP0300548A2 (hu) 2003-06-28
BR9910023A (pt) 2000-12-26
HK1076115A1 (en) 2006-01-06
BG64694B1 (bg) 2005-12-30
NO20005337D0 (no) 2000-10-23
UA66857C2 (ru) 2004-06-15
CN1187094C (zh) 2005-02-02
NZ507456A (en) 2003-10-31
IL139286A (en) 2005-12-18
CY1108022T1 (el) 2013-09-04
EA200300382A1 (ru) 2005-02-24
EP1421956A1 (en) 2004-05-26
AU762621B2 (en) 2003-07-03
CA2330451A1 (en) 1999-11-04
WO1999055377A9 (en) 2000-03-02
EA005495B1 (ru) 2005-02-24
BG104871A (en) 2001-07-31
PL344490A1 (en) 2001-11-05
PT1421956E (pt) 2007-07-13
EA200001111A1 (ru) 2001-04-23
DK1075281T3 (da) 2005-01-03
AR020070A1 (es) 2002-04-10
WO1999055377A3 (en) 1999-12-29
CZ20003995A3 (en) 2001-06-13
JP2010184929A (ja) 2010-08-26
CA2565375A1 (en) 1999-11-04
US6638500B1 (en) 2003-10-28
PL193352B1 (pl) 2007-02-28
SK286654B6 (sk) 2009-03-05
SK16222000A3 (sk) 2001-04-09
AU3767499A (en) 1999-11-16
CN1302209A (zh) 2001-07-04
SI1421956T1 (sl) 2007-10-31
DE69936409T2 (de) 2008-04-17
US7700314B2 (en) 2010-04-20
BG65046B1 (bg) 2007-01-31
JP4574007B2 (ja) 2010-11-04
SI1075281T1 (en) 2005-02-28
NO20100324L (no) 2000-12-28
NO332224B1 (no) 2012-07-30
TR200003161T2 (tr) 2001-01-22
CN1637020A (zh) 2005-07-13
PL196533B1 (pl) 2008-01-31
IL139286A0 (en) 2001-11-25
CZ298579B6 (cs) 2007-11-14
EE05214B1 (et) 2009-10-15
EP1075281B1 (en) 2004-09-08
EP1421956B1 (en) 2007-06-27
ES2224649T3 (es) 2005-03-01
DE69920002D1 (de) 2004-10-14
BG109291A (en) 2006-04-28
ATE275422T1 (de) 2004-09-15
HK1038194A1 (en) 2002-03-08
SK286217B6 (sk) 2008-05-06
KR100622796B1 (ko) 2006-09-13
WO1999055377A2 (en) 1999-11-04
US20070141620A1 (en) 2007-06-21
NO329749B1 (no) 2010-12-13
PT1075281E (pt) 2004-11-30
US20040043002A1 (en) 2004-03-04
TWI266800B (en) 2006-11-21
DE69936409D1 (de) 2007-08-09
KR20010071158A (ko) 2001-07-28
EE200000614A (et) 2002-04-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA003789B1 (ru) КОНЪЮГАТЫ ПОЛИОЛ-β-ИНТЕРФЕРОН
JP2980569B2 (ja) インターフェロン複合体
EA008866B1 (ru) ПОЛИМЕРНЫЙ КОНЪЮГАТ МОДИФИКАЦИЙ ИНТЕРФЕРОНА-β, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ ПРОДУКТЫ НА ЕГО ОСНОВЕ И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ
RU2488598C2 (ru) Гормон роста, модифицированный двухцепочечным полиэтиленгликолем, способ его получения и применение
RU2298560C2 (ru) Конъюгаты белка и производного полиэтиленгликоля, фармацевтическая композиция, способ борьбы с вирусной инфекцией
MXPA00010223A (en) Polyol-ifn-beta conjugates
KR20040086521A (ko) 생물학적 활성물질과 생체적합성 고분자의 1:1 접합체,이의 제조방법과 이를 함유하는 약학 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
PC4A Registration of transfer of a eurasian patent by assignment
PD4A Registration of transfer of a eurasian patent in accordance with the succession in title
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU