JP5341756B2 - 神経障害に基づく機能不全の改善剤およびRhoキナーゼ活性化抑制剤 - Google Patents
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Description
また、神経損傷により脊髄後角の脊髄ミクログリアが活性化し、そこに強度に発現したP2X4受容体の刺激が、神経因性疼痛を引き起こすことが明らかとなり、これら活性化のカスケードの一つの経路として、Rhoキナーゼシグナル伝達系の関与が提唱されている(非特許文献2)。
そこで本発明は、神経障害に基づく機能不全の改善の有効成分となり得る物質を提供することを目的とする。
そして、本発明者らは、ケラタン硫酸糖鎖骨格中のN−アセチルグルコサミニド結合を加水分解するエンド−β−N−アセチルグルコサミニダーゼ型酵素(以下、「エンド−β−N−アセチルグルコサミニダーゼ型ケラタン硫酸分解酵素」ということもある。)を、神経障害、例えば脊髄損傷の直後から、持続的に個体の損傷部位に投与し、ケラタン硫酸プロテオグリカンのケラタン硫酸鎖を除去することが、プロテオグリカンによる神経細胞やグリア細胞等の非神経細胞の持続的な異常活性化を解除し、これがプロテオグリカンによる神経軸索ガイダンス機能の解除につながり、ひいては神経因性疼痛の治療効果につながるとの発想を得た。該発想に基づき、本発明者らは、ラット脊髄損傷モデル髄腔内の損傷部位に、エンド−β−N−アセチルグルコサミニダーゼ型ケラタン硫酸分解酵素を持続投与することにより、運動神経機能及び知覚神経機能の改善を促し、特に後者の改善により、神経因性疼痛、特にアロデニアを改善しうることを初めて見出した。
また、請求項2記載の改善剤は、請求項1記載の改善剤において、前記疼痛が脊髄損傷に伴う神経障害に基づくことを特徴とする。
また、請求項3記載の改善剤は、請求項1記載の改善剤において、前記疼痛が筋萎縮性側索硬化症に基づくことを特徴とする。
また、請求項4記載の改善剤は、請求項1乃至3のいずれかに記載の改善剤において、前記エンド−β−N−アセチルグルコサミニダーゼ型酵素を、ヒト成人、一日当たり、0.3ミリユニット(mU)〜15000mUの用量で、神経障害部位に持続投与するためのものであることを特徴とする。
また、請求項5記載の改善剤は、請求項1乃至4のいずれかに記載の改善剤において、前記エンド−β−N−アセチルグルコサミニダーゼ型酵素が、至適反応温度が50〜60℃の耐熱性ケラタナーゼIIであることを特徴とする。
Ks36ケラタナーゼIIと、BcケラタナーゼIIは、ともにエンド−β−N−アセチルグルコサミニダーゼ型酵素ではあるが、高濃度のケラタンポリ硫酸(硫酸化度の高いケラタン硫酸)に対する反応性、至適pH、pH安定性、至適温度、温度安定性、および薬剤による阻害の影響等が異なることから、本質的には異なった酵素であると言える(必要であれば特許第3734504号、米国特許第5,840,546号、ヨーロッパ特許第0798376 B1等の公報を参照のこと)。本発明における神経障害に基づく機能不全の改善剤の有効成分となる酵素としては、この2種類の酵素が好適に挙げられるが、BcケラタナーゼIIが好ましく、rBCケラタナーゼIIがより好ましい。
なお、本発明において使用されるケラタナーゼIIは、ケラタン硫酸糖鎖骨格中のN−アセチルグルコサミニド結合を加水分解するエンド−β−N−アセチルグルコサミニダーゼ型酵素である限り、上記例示酵素に限定されるものではなく、その由来、酵素学的性質も限定されない。
脊髄損傷のモデルにおいて、ラット(体重:0.3キログラム/脳脊髄液量:0.3 mL)における本発明改善剤の一日当たりの髄腔内投与量は、ケラタナーゼIIの酵素単位として約1.5マイクロユニット(μU)(0.000025 U/200 μL)〜30ミリユニット(mU)、好ましくは約0.3 mU(0.005 U/200 μL)〜10 mU、最も好ましくは約3.0 mU(0.05 U/200 μL)である。ここで、カッコ内のU/200 μLは濃度を表し、各濃度の酵素液剤を1日あたり、12 μL投与する。
これを、ラットの体重を0.3キログラムとし、脳脊髄液量を0.3 mLとして、ヒト成人(体重:60キログラム/脳脊髄液量:150 mL)に換算すると、体重換算で約200倍、硬膜内へ直接投与することを考慮して、脳脊髄液量で換算すると約500倍となる。したがって、ヒト成人(平均的な体重60キログラム/平均的な脳脊髄液量150 mL)への投与量は、以下の通りとなる。
体重換算の場合、一日当たりの髄腔内投与量として、約0.3 mU〜6000 mU、好ましくは約60 mU〜2000 mU、最も好ましくは約600 mUである。
また、脳脊髄液量換算の場合、一日当たりの髄腔内投与量は、約0.75 mU〜15000 mU、好ましくは約150 mU〜5000 mU、最も好ましくは約1500 mUである。
したがって、上記の換算法を総合的に考慮すると、一日当たりの髄腔内投与量は、約0.3 mU〜15000 mU、好ましくは約60 mU〜5000 mU、最も好ましくは約600 mU〜1500 mUである。
投与期間は、損傷部位におけるケラタン硫酸プロテオグリカンの発現量、有害事象の発生等の可能性を考慮し、症状に応じて医師等の医療専門家が決定すべきことではあるが、その目安としては、持続投与においては受傷後約8週間まで、好ましくは約4週間まで、より好ましくは約2週間までである。投与開始時期は、受傷直後乃至受傷後3日から一週間経過後程度であることが好ましい。
なお、有効成分であるケラタナーゼIIの好ましい比活性は、約2 U/mgタンパク質以上なので、上記の一日当たりの髄腔内投与量は、酵素タンパク質重量としては、約0.3 mUは約0.15マイクログラム(μg)以下、15000 mUは約7500 μg以下、60 mUは約30 μg以下、5000 mUは約2500 μg以下、600 mUは約300 μg以下、1500 mUは約750 μg以下に相当する。なお、酵素量1ユニット(1 U)は、サメ軟骨由来のケラタンポリ硫酸を基質とし、37℃で10分間反応させたときに、1分間に1 μmolのガラクトースに相当する還元末端を生成する酵素量として定義される(必要であれば特開2004−24189号公報を参照のこと)。
例えば、このような薬剤としてはコンドロイチン硫酸プロテオグリカンを分解する作用を有する、コンドロイチナーゼを有効成分とする薬剤が挙げられる。
コンドロイチナーゼは、コンドロイチン硫酸を脱離的に不飽和二糖に分解する脱離酵素である。現在入手可能な酵素を以下に列記する。
・コンドロイチナーゼABC(Proteus vulgaris由来/生化学バイオビジネス(株)販売)
・コンドロイチナーゼAC I(Flavobacterium heparinum由来/生化学バイオビジネス(株)販売))
・コンドロイチナーゼAC II(Arthrobacter aurescens由来/生化学バイオビジネス(株)販売))
・コンドロイチナーゼAC II(Flavobacterium sp. Hp 102由来)
・コンドロイチナーゼB(Flavobacterium heparinum由来/生化学バイオビジネス(株)販売))
・コンドロイチナーゼC(Flavobacterium sp. Hp 102由来)
・コンドロイチナーゼAC(組み換え体、Flavobacterium heparinum由来/IBEX Technologies Inc.販売)
・コンドロイチナーゼB(組み換え体、Flavobacterium heparinum由来/IBEX Technologies Inc.販売)
コンドロイチナーゼABC(Chondroitinase ABC)〔EC 4.2.2.20又はEC 4.2.2.4〕は、コンドロイチン硫酸を含むグリコサミノグリカンのN−アセチルヘキソサミニド結合を脱離反応的に切断して、非還元末端にΔ4−ヘキスロン酸残基を持つ不飽和二糖を主に生成する酵素で、哺乳動物軟骨由来のコンドロイチン硫酸A(コンドロイチン−4−硫酸を多く含む)、鮫軟骨由来のコンドロイチン硫酸C(コンドロイチン−6−硫酸を多く含む)および哺乳動物皮膚由来のコンドロイチン硫酸B(デルマタン硫酸)の分解を強力に触媒し、ヒアルロン酸の分解に対しては弱く触媒する酵素であり、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコンドロイチン硫酸側鎖中のコンドロイチン硫酸A、デルマタン硫酸、及びコンドロイチン硫酸Cも分解する(Yamagata, T. et al., J.Biol. Chem., 243: 1523-1535(1968)、Hamai A. et al., J. Biol. Chem. 272:9123-9130(1997))。本酵素は、動物組織からムコ多糖類を除去したり、組織中のムコ多糖を同定したりするための研究用試薬として、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)等の細菌の産生する酵素商品が、コード番号:100330(Chondroitinase ABC(Proteus vulgaris))及びコード番号:100332(Chondroitinase ABC Protease Free(Proteus vulgaris))として生化学バイオビジネス(株)から試薬として市販されているほか、より高純度(単一タンパク質で、エンドトキシン、核酸、夾雑タンパク質等を含まない)に精製され、比活性が極めて高い酵素が椎間板ヘルニア治療剤として臨床試験が行われ、生体に対する作用が十分に解明されているため、より好ましい。特に日本特許第3980657号、米国特許第6,184,023号、米国特許第5,773,277号、米国特許第5,763,205号等に記載の高純度かつ比活性の高いコンドロイチナーゼABCが最も好ましい。なお、上記コンドロイチナーゼABCは、下記の別称の酵素と同一酵素である。
・コンドロイチナーゼABC Type1
・Chondroitin ABC endolyase 1
・Chondroitin ABC lyase I
・Chondroitin sulfate endolyase
・Chondroitin ABC eliminase
また、上記コンドロイチナーゼABC活性を持つ物質の遺伝子はクローニングされており、そのタンパク質のアミノ酸配列及びそれをコードするDNAの塩基配列も同定されている(米国特許第5,578,480号、特表2007−520447(WO2004/103299))。代表的なアミノ酸配列としては、米国特許第5,578,480号に記載されているものが挙げられる。このアミノ酸配列は、1021個のアミノ酸残基からなるが、アミノ酸:1−24はシグナル配列を構成し、成熟タンパク質は997個のアミノ酸残基からなる(アミノ酸:25−1021)。また、他の代表的なアミノ酸配列としては、アミノ酸配列データベース(UniProtKB/Swiss-Prot:Entry name CABC_PROVU、Primary accession number P59807、Protein name Chondroitin ABC endolyase 1 [Precursor])に記載されているものが挙げられる。このアミノ酸配列も、1021個のアミノ酸残基からなるが、米国特許第5,578,480号に記載されているアミノ酸配列とは2個のアミノ酸が相違する(694番:Q→E、738番:D→N)。さらに、米国特許出願公開第2006/0233782号のSEQ ID NO: 1に記載されたアミノ酸配列は、成熟タンパク質のものであるため、997個のアミノ酸残基からなるが、米国特許第5,578,480号に記載されているアミノ酸配列のアミノ酸:25−1021の範囲では、4個のアミノ酸が相違する(154番:A→T、295番:I→T、694番:Q→E、738番:D→N)。すなわち、米国特許第5,578,480号に記載されているアミノ酸配列を基準として、少なくとも4個のアミノ酸(例えば、154番、295番、694番、738番)を他のアミノ酸に置換したものであっても、同等のコンドロイチナーゼABC活性を持つ酵素と見なすことができる。
さらに、本発明改善剤を製剤化した薬剤を、神経因性疼痛における改善効果が知られている他の薬剤と併用して治療を行うことも可能である。例えば、このような薬剤としては、下記例示のような、NSAIDsやオピオイド、鎮痛補助薬が挙げられる。オピオイド鎮痛薬としては、モルヒネ、フェンタニル、オキシコドン、リン酸コデイン、ペチジン、ブプレノルフィン、トラマドール、ペンタゾジン、ブトルファノールなどが挙げられる。また、鎮痛補助薬としては、抗うつ剤である三環系(アミトリプチン、ノルトリプチン等)、四環系(テトラミド)、SSRI(パロキセチン、フルボキサチン)、SNRI(ミルナシプラン)、抗痙攣薬としては、カルバマゼピン、ラモトリジン、ゾニサミド、バルブロ酸、クロナゼパム等、抗攣縮薬としてバクロフェン等、抗不整脈薬として、リドカイン、メキシレチン等、NMDA受容体拮抗薬として、ケタミン、デキストロメトルファン、アマンタジン、イフェンプロジル等、ワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出液含有製剤としてノイロトロピンが挙げられる。また、最近注目されている、Caチャンネルブロッカー(α2δサブユニットに結合する)であるガバペンチン(抗痙攣剤)とプレガバリンが挙げられる。また、抗炎症作用を有する薬剤、例えばコハク酸メチルプレドニゾロンナトリウム、デキサメタゾン、ベタメサゾン等のステロイド剤やRhoキナーゼ阻害剤であるファスジルと併用してもよい。
(実験方法)
動物として、S.D.ラット(日本SLC社、雌、9週齢)を用い、エーテルとケタミンカクテル麻酔下に、第9胸椎と第12胸椎を椎弓切除し、IH−0400 Impactorを用い、第9胸椎に圧座による脊髄損傷を作製した。損傷後、顕微鏡下で第12胸椎の硬膜に小切開を加え、マイクロチューブをクモ膜下に挿入した。マイクロチューブには、予め被験サンプルを充填した浸透圧ポンプ(Alzet Osmotic pump)を接続した。チューブならびにポンプは棘間靱帯および筋肉に固定し、筋層ならびに皮膚を閉創した。術後、抗生物質の経口投与を2週間行い、排尿反射が回復するまで、徒手排尿を1日1回施行した。被験サンプルは、損傷直後から、14日間髄腔内に持続投与した(投与速度:12 μL/24 hr,総投与量:168 μL/14日間)。被験サンプルは、次の5種類とした。
(1)BcケラタナーゼII(特許第3734504号公報に記載のバチルス・サーキュランスKsT202株菌体から抽出した耐熱性ケラタナーゼII)(0.000005 U/200 μL、0.000025 U/200 μL、0.05 U/200 μL)
(2)Ks36ケラタナーゼII(特許第2726274号公報に記載のバチルス属細菌Ks36株が産生するケラタナーゼII)(0.000025 U/200 μL、0.0005 U/200 μL、0.05 U/200 μL)
(3)不活性化BcケラタナーゼII(BcケラタナーゼII(0.05 U/200 μL)の酵素活性を100℃(10分間)で不活化した酵素)
(4)Psケラタナーゼ(ケラタン硫酸分解酵素であっても、ケラタン硫酸の硫酸化されていないガラクトースのβ−ガラクトシド結合を加水分解するPseudomonas sp株由来のエンド−β−ガラクトシダーゼ型酵素:以下、Psケラタナーゼと称す。必要であれば参考文献:Kiyoshi Nakazawa and Sakaru Suzuki, J.Biol. Chem., 250: (3) 912-917(1975), Purification of Keratan sulfate-endogalactosidase and Its Action on Keratan Sulfate of Different Originを参照のこと)(0.05 U/200 μL)
(5)生理食塩液(200 μL:コントロール)
損傷1日後および損傷1週後から10週後まで1週間に1回、Bassoらの方法(Basso, D.M., Beattie, M.S. & Bresnahan, J.C., Graded histological and locomotor outcomes after spinal cord contusion using the NYU weight-drop device versus transection. Exp. Neurol., 139, 244-256(1996))に準じ、Basso−Beattie−Bresnahan(BBB)スケールを用いて後肢運動神経機能を評価した。検査はブラインド下で実施し、検査者2人の結果を平均した値で表した。結果を図1〜図5に示す。
図1から明らかなように、BcケラタナーゼIIの0.05 U/200 μL投与群、0.000025 U/200 μL投与群において、生理食塩液投与群に比して顕著な後肢運動神経機能の回復が認められた。中でも0.05 U/200 μL投与群の効力が優れていた。
図2から明らかなように、Ks36ケラタナーゼIIの0.05 U/200 μL投与群、0.0005 U/200 μL投与群において、生理食塩液投与群に比して顕著な後肢運動神経機能の回復が認められた。中でも0.05 U/200 μL投与群の効力が優れていた。
図3から明らかなように、BcケラタナーゼIIとKs36ケラタナーゼIIの後肢運動神経機能の回復に対する効力は、投与濃度が0.05 U/200 μLの場合には同等であった。
図4から明らかなように、投与濃度が0.000025 U/200 μLのような低濃度の場合、後肢運動神経機能の回復に対する効力は、熱安定性に優れたBcケラタナーゼIIでは認められたが、Ks36ケラタナーゼIIでは認められなかった。この結果から、BcケラタナーゼIIは、その優れた安定性から、Ks36ケラタナーゼIIよりも、より低用量で有効性を示し、より優れた治療薬となることが明らかとなった。
図5から明らかなように、BcケラタナーゼII、不活性化BcケラタナーゼII、Psケラタナーゼを0.05 U/200 μLの投与濃度で投与した場合、後肢運動神経機能の回復に対する効力は、BcケラタナーゼIIにおいてのみ認められた。この結果から、後肢運動神経機能の回復治療に対する有効成分となり得るのは、ケラタン硫酸を分解するケラタナーゼと称する酵素の中でもケラタナーゼIIであること、不活性化BcケラタナーゼIIには効力がないことから、BcケラタナーゼIIの効力は、そのエンド−β−N−アセチルグルコサミニダーゼ活性に起因することが明らかとなった。
損傷1週後から10週後まで1週間に1回、ラットを2cm×2cmの網(グリッド)の上に置き、3分間歩行させ、グリッドを下肢でグリップできた回数ならびに全歩数を計測した。全歩数のうち、グリップできた割合を%グリップ値とし、左右それぞれの値を平均して表した。BcケラタナーゼIIとKs36ケラタナーゼIIを0.05 U/200 μLの投与濃度で投与した場合の結果を図6に、0.000025 U/200 μLの投与濃度で投与した場合の結果を図7にそれぞれ示す。
図6から明らかなように、BcケラタナーゼII投与群とKs36ケラタナーゼII投与群の%グリップ値は、投与濃度が0.05 U/200 μLの場合には同等であり、いずれも生理食塩液投与群の%グリップ値に比して高値を示した。
図7から明らかなように、投与濃度が0.000025 U/200 μLのような低濃度の場合、後肢運動神経機能の回復に対する効力は、熱安定性に優れたBcケラタナーゼIIでは認められたが、Ks36ケラタナーゼIIでは認められなかった。この結果から、BcケラタナーゼIIは、その優れた安定性から、Ks36ケラタナーゼIIよりも、より低用量で有効性を示し、より優れた治療薬となることが明らかとなった。
損傷1日後および損傷1週後から10週後まで1週間に1回、ラットの後肢にインクを塗布し、50cmの紙の上を歩行させることで、後肢の足跡を得た。紙の上に記された後肢の足跡の歩幅を左右それぞれ計測し、平均して表した(単位;mm)。BcケラタナーゼIIとKs36ケラタナーゼIIを0.05 U/200 μLの投与濃度で投与した場合の結果を図8に示す。
図8から明らかなように、BcケラタナーゼII投与群とKs36ケラタナーゼII投与群の歩幅は、生理食塩液投与群の歩幅に比して広く、これらの投与群において後肢運動神経機能の回復が認められた。
損傷前および損傷1週後から10週後まで1週間に1回、ラットの尻尾を55℃の湯浴に浸し、尻尾を揺らすまでの時間(反応時間)を計測した(単位;秒)。測定は15分間隔で3回実施し、平均値で表した。BcケラタナーゼIIとKs36ケラタナーゼIIを0.05 U/200 μLの投与濃度で投与した場合の結果を図9に示す。
図9から明らかなように、生理食塩液投与群では、損傷前に比して、損傷後、経日的に反応時間が短縮していき、熱刺激に対して過敏反応を示した。一方、BcケラタナーゼII投与群とKs36ケラタナーゼII投与群では、損傷早期には生理食塩液投与群と同様の傾向を示したが、損傷5週後以降からは、熱刺激に対する過敏反応は改善し、損傷8週後には、損傷前とほぼ同程度の安定した反応時間となり、これらの投与群において知覚神経機能の正常値に至る顕著な回復(サーマル・アロデニア治療/改善効果)が認められた。
損傷前および損傷1週後から10週後まで1週間に1回、ラットを小箱に入れ、15分間静置させた。ラットが落ち着いたところで、下からvon frey filament(刺激強度の異なる数種のフィラメント)で後肢の足底を刺激した。強い刺激、弱い刺激を繰り返し、正確な刺激閾値を決定する方法であるUp−down method(Chaplan, S.R., Bach, F.W., Pogrel, J.W., Chung, J.M., Yaksh, T.L., Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw., J. Neurosci. Methods 53, 55-63(1994))を用い、ラットが痛みを感じて後肢を動かすfilamentの圧刺激を左右それぞれ計測し、平均値で表した(単位;グラム)。BcケラタナーゼIIとKs36ケラタナーゼIIを0.05 U/200 μLの投与濃度で投与した場合の結果を図10に示す。
図10から明らかなように、生理食塩液投与群では、損傷前に比して、損傷1週後から2週後にfilamentの圧刺激が高値を示し、後肢への刺激に対して鈍感反応を示した。しかし、損傷4週後以降には、損傷前に比してfilamentの圧刺激が低値を示し、さらに、損傷6週後では後肢への僅かな刺激でも反応してしまう、知覚過敏症状を示した。一方、BcケラタナーゼII投与群とKs36ケラタナーゼII投与群では、損傷6週後までは生理食塩液投与群と同様の傾向を示したが、損傷7週後以降は徐々に知覚過敏反応は改善した。損傷10週後には、損傷前と同程度のfilamentの圧刺激となり、これらの投与群において知覚神経機能の正常値に至る顕著な回復(メカニカル・アロデニア治療/改善効果)が認められた。
実験その1:神経軸索伸長阻害の解除
(実験方法)
生後1日目(P1)のマウス脳より、プライマリー皮質神経組織を採取後、皮質を小片に細切し、カルシウムおよびマグネシウム・フリー・ハンクス緩衝液(HBSS)中に浮遊させ、0.25%トリプシン、0.1%デオキシリボヌクレアーゼ(DNase)で37℃にて15分間処理した。単離した神経細胞は、2%の神経細胞培養用添加物B−27添加剤(B27 Supplement for Neuronal Cells)を添加したNeurobasal培地(Basal Medium for Neuronal Cells;Invitrogen社)にて、1×105cells/mLになるように細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液を、被験サンプルを塗布した8ウェルチャンバーに播種した後、一晩インキュベートした。神経細胞培養開始から24時間後にチャンバースライドを4%パラホルムアルデヒドにて固定処理し、神経細胞をNeuronal Class IIIβ tubulin(TUJ1)抗体(COVANCE社)を用いた免疫組織化学的手法によって同定した。1回の実験あたり80個から90個の神経細胞の軸索長を計測し、平均値を算出しグラフで示した。被験サンプルは、次の3種類とした。
(1)25 μg/mLのポリ−L−リジン(シグマ社、以下同じ)を塗布したもの
(2)25 μg/mLのポリ−L−リジンを塗布してからさらにExtracellular proteoglycan mixture solution(PG)(0.5 μg/mL:Chemicon社、Neurocan, Phosphacan, Versican, Aggrecanの混合物、以下同じ)を塗付したもの
(3)25μg/mLのポリ−L−リジンを塗布してからさらにPG(0.5μg/mL)とKs36ケラタナーゼII(0.01 U/mL:生化学工業(株))を塗付したもの
結果を図11に示す。図11から明らかなように、ケラタン硫酸を含むPG存在下では、神経軸索の伸長が約70%阻害されたが、Ks36ケラタナーゼIIの共存下では、PGによって誘導された神経軸索の伸長阻害作用が、ほぼ100%解除された。以上の結果から、ケラタナーゼIIには、神経軸索の伸長阻害作用に対する解除効果があることが明らかとなった。
(実験方法)
次に、ケラタナーゼIIの上記実験その1の作用メカニズムを調べるために、Rhoキナーゼの関与を検討した。被験サンプルを塗布した8ウェルチャンバーを作製し、実験その1の方法と同様にして神経細胞を播種した。神経細胞培養開始から24時間後、15μMのY27632(Rhoキナーゼ阻害剤、シグマ社)を添加し、さらに24時間培養した。その後、チャンバーを4%パラホルムアルデヒドにて固定処理し、神経細胞をNeuronal Class IIIβ tubulin(TUJ1)抗体(COVANCE社)を用いた免疫組織化学的手法によって同定した。1回の実験あたり80個から90個の神経細胞の軸索長を計測し、平均値を算出しグラフで示した。被験サンプルは、次の4種類とした。
(1)25 μg/mLのポリ−L−リジン(シグマ社、以下同じ)を塗布してからさらに10 μg/mLラミニン(BD Biosciences社、以下同じ)を塗布したもの
(2)25 μg/mLのポリ−L−リジンを塗布してからさらに10 μg/mLのラミニンと20 μg/mLのケラタン硫酸(生化学工業(株)、以下同じ)を塗布したもの
(3)25 μg/mLのポリ−L−リジンを塗布してからさらに10 μg/mLのラミニンと40 μg/mLのケラタン硫酸を塗布したもの
(4)25 μg/mLのポリ−L−リジンを塗布してからさらに10 μg/mLのラミニンと20 μg/mLのケラタン硫酸とKs36ケラタナーゼII(0.01 U/mL、生化学工業(株))を塗布したもの
図12に、被験サンプル(2)についてY27632を添加しなかった場合(a)と添加した場合(b)の神経軸索の伸長程度の蛍光顕微鏡写真を示す。また、図13に、それぞれの被験サンプルについてY27632を添加しなかった場合と添加した場合の神経細胞の軸索長の計測結果を示す。図12と図13から明らかなように、ケラタン硫酸によって誘導された神経軸索の伸長阻害作用は、Y27632の添加によって解除された。この結果から、ケラタン硫酸は、Rhoキナーゼ活性化を介して神経軸索の伸長阻害を誘導していることがわかった。また、ケラタン硫酸によるRhoキナーゼ活性化を介した神経軸索の伸長阻害作用が、Y27632を添加しなくても、Ks36ケラタナーゼIIの共存によって解除されたことから、ケラタナーゼIIは、Rhoキナーゼ活性化を抑制することでケラタン硫酸による神経軸索の伸長阻害作用の解除効果を発揮していることが明らかとなった。
ALSモデルマウスであるSOD1−G93AマウスはJackson Laboratory社より購入した。ALSモデルマウス2匹より脊髄を摘出し、蛋白質を抽出後、ウェスタンブロッティングを実施した。ケラタン硫酸量は、抗ケラタン硫酸抗体5D4(生化学工業(株))にて検出した。その結果、ALSモデルマウスでは、野生型マウス(WT)に比してケラタン硫酸の発現増強が検出された(図14)。
次に、ALSモデルマウスの脊髄でのケラタン硫酸発現細胞を免疫組織化学的手法により調べた。ALSモデルマウスの脊髄を摘出し、組織切片を作製後、抗ケラタン硫酸抗体5D4とミクログリア細胞の特異マーカーを認識するIba1で2重染色を行ったところ、ケラタン硫酸のミクログリアでの発現が確認された(図15)。
ALSは、グリオーシスが起こることで知られているが、以上の結果から、ケラタン硫酸は、グリオーシスの主体であるアストロサイトではなく、しかし、病気の成り立ちに深く関わっているといわれているミクログリアに特異的に発現することがわかった。この現象は、脊髄損傷や脳刺傷の際に、ケラタン硫酸が、ミクログリアのみならず、オリゴデンドロサイトにも発現することを考えると、ALSに特異的な発現様式であるといえる。
rBcケラタナーゼII(遺伝子組換え型耐熱性ケラタナーゼII)を生理食塩液に溶解して濃度が0.000025 U/μL〜0.05 U/200μLの溶液製剤を調製した。
Claims (5)
- ケラタン硫酸糖鎖骨格中のN−アセチルグルコサミニド結合を加水分解するエンド−β−N−アセチルグルコサミニダーゼ型酵素を有効成分とすることを特徴とするアロデニア又は痛覚過敏反応に基づく疼痛の改善剤。
- 前記疼痛が脊髄損傷に伴う神経障害に基づくことを特徴とする請求項1記載の改善剤。
- 前記疼痛が筋萎縮性側索硬化症に基づくことを特徴とする請求項1記載の改善剤。
- 前記エンド−β−N−アセチルグルコサミニダーゼ型酵素を、ヒト成人、一日当たり、0.3ミリユニット(mU)〜15000mUの用量で、神経障害部位に持続投与するためのものであることを特徴とする請求項1乃至3のいずれかに記載の改善剤。
- 前記エンド−β−N−アセチルグルコサミニダーゼ型酵素が、至適反応温度が50〜60℃の耐熱性ケラタナーゼIIであることを特徴とする請求項1乃至4のいずれかに記載の改善剤。
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