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Hintergrund der Erfindung
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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Mikrokügelchen aus einem vernetzten
porösen
Polymermaterial und betrifft Verfahren zur Herstellung solcher Mikrokügelchen.
Diese Erfindung betrifft insbesondere ein Polymer-Mikrokügelchen
mit außergewöhnlich großer Porosität.
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Beschreibung des Stands der
Technik
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Vernetzte,
homogene, poröse
Polymermaterialien sind im
US-Patent
Nr. 4 522 953 offenbart (Barby et al., erteilt am 01.06.1985).
Die offenbarten Polymermaterialien werden durch Polymerisation von
Wasser-in-Öl-Emulsionen
mit einem relativ hohen Verhältnis
von Wasser zu Öl
erzeugt. Diese Emulsionen werden als „Emulsionen mit einer großen inneren
Phase" bzw. als „high internal
Phase emulsions" bezeichnet
und sind in der Technik als „HIPEs" bekannt. HIPEs umfassen
eine kontinuierliche Öl-Phase,
die ein Monomer und ein Vernetzungsmittel einschließt und umfasst
eine wäßrige diskontinuierliche
Phase. Solche Emulsionen werden durch Unterwerfen bzw. Unterziehen
der kombinierten Öl-
und Wasser-Phasen gegenüber
einem Rühren
in Gegenwart eines Emulgators hergestellt. Polymere werden aus der
sich ergebenden Emulsion durch Erhitzen erzeugt. Die Polymere werden
dann gewaschen, um jegliches unpolymerisiertes Monomer/Vernetzer
zu entfernen.
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Die
offenbarten porösen
Polymere weisen starre Strukturen auf, die durch Poren in den Hohlraumwänden verbundene
Hohlräume
enthalten. Durch Auswählen
geeigneter Bestandteile und Verfahrensbedingungen können HIPE-Polymere
mit Leervolumina von 80% oder mehr erreicht werden. Diese Materialien
weisen somit eine sehr hohe Kapazität zum Absorbieren und Zurückhalten
von Flüssigkeiten
auf.
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Verschiedene
Modifikationen von HIPE-Polymeren wurden beschrieben. Beispielsweise
offenbart
US-Patent Nr. 4,536,521 (Haq,
erteilt am 20.08.1985), dass HIPE-Polymere zur Er zeugung von sulfoniertem Polymermaterial
sulfoniert werden können,
das eine hohe Kapazität
zur Absorption ionischer Lösungen
zeigt. Weitere funktionalisierte HIPE-Polymere, die durch ein ähnliches
Verfahren hergestellt werden, wurden im
US-Patent Nr. 4,611,014 (Jomes et
al., erteilt am 09.09.1986) und
4,612,334 (Jones
et al., 16.09.1986) offenbart.
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Obwohl
die Existenz polymerisierbarer HIPEs bekannt ist, ist die Herstellung
nützlicher
HIPE-Polymere nicht ohne Schwierigkeiten. Weil die zur Herstellung
dieser Polymere verwendeten Emulsionen ein hohes Verhältnis von
Wasser zu Öl
aufweisen, neigen die Emulsionen dazu, instabil zu sein. Eine Auswahl
der geeigneten Monomer/Vernetzer-Konzentration, Emulgators und Emulgator-Konzentration,
Temperatur, Rührbedingungen
sind alle zur Bildung einer stabilen Emulsion von Bedeutung. Leichte
Veränderungen
bei jeder dieser Variablen kann verursachen, dass die Emulsion „bricht" oder sich in eine
getrennte Öl-
und Wasserphase auftrennt. Darüber
hinaus können
Emulsionsbestandteile unter Verfahrensbedingungen, die eine stabile
Emulsion erzeugen, nicht immer HIPE-Polymere ergeben, die für ihren
beabsichtigten Verwendungszweck nützlich sind.
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Zusätzlich zu
diesen Problemen haben die mit der Maßstabsvergrößerung der Herstellung von
HIPE-Polymeren verbundenen Kosten eine kommerzielle Entwicklung
von Produkten auf HIPE-Polymerbasis verhindert. Verfahren zur Herstellung
von HIPE-Polymeren im großen
Maßstab
sind bekannt. Beispielsweise offenbart
US-Patent Nr. 5,149,720 (DesMarais
et al., erteilt am 22.09.1992) eine kontinuierliche Phase zur Herstellung
von HIPEs, die zur Polymerisierung zu absorbierenden Polymeren geeignet
sind. Zusätzlich
ist ein Verfahren, das solche kontinuierliche Verfahren durch Reduzieren
der Aushärtezeit
von Monomeren in einem HIPE erleichtert, im
US-Patent Nr. 5,252,619 offenbart
(Brownscombe et al., erteilt am 12.10.1993). Die Herstellung von
HIPE-Polymeren in großem
Maßstab
durch solche bekannten Verfahren wurde jedoch durch das Fehlen kosteneffizienter
Mittel zur Entfernung der nicht polymerisierten Emulsions-Bestandteile
aus den Polymeren erschwert.
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Alle
Verfahren nach dem Stand der Technik zur Herstellung von HIPE-Polymeren
erzeugen einen Block aus Polymermaterial mit der Größe und Form
des zur Polymerisierung verwendeten Gefäßes. Das Problem bei der Herstellung
von HIPE-Polymeren in Blockform besteht darin, dass es sehr schwierig
ist, nicht polymerisierte Emulsions-Bestandteile aus einem Block
aus einem Material mit niedriger Dichte, das stark absorbierend
ist, auszuwaschen. Die versuchte Lösung dieses Problems bestand
darin, die Blöcke
zu Teilchen zu vermahlen, jedoch ist dieser Ansatz deswegen nicht
zufriedenstellend, weil sowohl das Trocknen als auch die Vermahlverfahren
kostenintensiv sind und eine Begrenzung der Größe der durch das Vermahlen
erzeugten Teilchen besteht. Für
viele Anwendungen ist die Entfernung übriger Emulsionsbestandteile
essentiell. Bis heute jedoch wurde kein kosteneffizientes Verfahren
zur Durchführung
dieses Waschschrittes entwickelt.
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Ein
zusätzliches
Problem bei HIPE-Polymerblöcken
gemäß des Stands
der Technik besteht darin, dass die Blöcke eine Haut aufweisen, die
die Grenzfläche
zwischen dem HIPE und dem zur Polymerisierung verwendeten Behälter bildet.
(
US-Patent Nr. 4,522,953 ,
Barby et al., erteilt am 11.06.1985, Spalte 4, Zeilen 1–6). Um
einen permeablen Block zu bilden und daher ein nützliches Produkt zu erzeugen,
muß die
Haut entfernt werden. Idealerweise wäre man dazu in der Lage, ein
Polymermaterial herzustellen, das die erwünschten Eigenschaften von HIPE-Polymeren
aufweist, dem jedoch eine Haut fehlt.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung schließt
ein wie in Anspruch 1 definiertes Material ein. Optionale bzw. wahlweise
Merkmale der beanspruchten Produkte sind in den abhängigen Ansprüchen 2 und
3 offenbart.
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Diese
Mikrokügelchen
bzw. Microbeads weisen eine poröse,
vernetzte Polymerstruktur auf, die durch Hohlräume charakterisiert ist, die
durch miteinander verbundene Poren verbunden sind. Zumindest einige
der Hohlräume
bzw. Kavitäten
im Inneren jedes Mikrokügelchens
steht mit der Oberfläche
des Mikrokügelchens
in Verbindung.
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Die
vorliegende Erfindung schließt
ebenfalls ein wie in Anspruch 3 beschriebenes Verfahren ein. Wahlweise
Merkmale des beanspruchten Verfahrens sind in den abhängigen Ansprüchen 4 bis
45 und 49 offenbart. Der erste Schritt dieses Verfahrens besteht
darin, eine kontinuierliche Öl-Phase
(hierin nachstehend als „Öl-Phase" bezeichnet) mit
einer diskontinuierlichen wäßrigen Phase
zur Bildung einer Emulsion zu vereinigen bzw. zu verbinden. Die Öl-Phase der
Emulsion schließt
ein im wesentlichen wasserunlösliches,
multifunktionelles Monomer, ein im wesentlichen wasserunlösliches,
polyfunktionelles vernetztes Mittel und einen Emulgator ein, der
zur Ausbildung einer stabilen Wasser-in-Öl-Emulsion geeignet ist. Der
zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die Emulsion einem
wäßrigen Suspensionsmedium
zur Bildung einer Öl-in-Wasser-Suspension
dispergierter Emulsions-Tröpfchen
zuzusetzen. Der Endschritt dieses Verfahrens besteht im Polymerisieren
der Emulsions-Tröpfchen
zur Bildung von Mikrokügelchen.
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In
einer Ausführungsform
liegt der Polymerisationsstarter bzw. -initiator sowohl in der wäßrigen diskontinuierlichen
Phase des HIPE als auch im wäßrigen Suspensionsmedium
vor. Ein Polymerisationsstarter kann wahlweise ebenso in die Öl-Phase
eingeschlossen werden. Bei einer Variation dieser Ausführungsform schließt die Öl-Phase
Styrol als das Monomer, Divinylbenzol als Vernetzungsmittel und
Sorbitanmonooleat als Emulgator ein. Zusätzlich enthält die Öl-Phase den Öl-löslichen
Polymerisationsstarter Azoisobisbutyronitril ebenso wie Dodecan,
das die Bildung von miteinander in Verbindung stehenden Poren fördert. Die
wäßrige diskontinuierliche
Phase schließt
den wasserlöslichen
Polymerisationsstarter Kaliumpersulfat ein. Das wäßrige Suspensionsmedium
schließt
ein Suspensionsmittel ein, das modifiziertes Siliziumdioxid und
Gelatine ebenso wie Kaliumpersulfat umfasst. Bei einer weiteren
Ausführungsform
liegt der Polymerisationsstarter lediglich in der Öl-Phase
vor.
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Die
vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls Mikrokügelchen, die zur Verwendung
in speziellen Anwendungen modifiziert wurden. Die vorliegende Erfindung
schließt
insbesondere Mikrokügelchen,
die zur Absorption von Flüssigkeiten
funktionalisiert wurden; Kohlenstoffhaltige Strukturen, die aus
den Mikrokügelchen hergestellt
wurden und ein Verfahren, solche Strukturen herzustellen; und Mikrokügelchen,
die ein Gel oder Prä-Gel
bzw. Vorgel innerhalb der Mikrokügelchen-Hohlräume aufweisen,
ebenso wie ein Verfahren ein, solche Mikrokügelchen herzustellen.
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Zusätzlich beschreibt
die vorliegende Erfindung die Verwendung von Mikrokügelchen
in einer Vielzahl von Anwendungen, einschließlich der Verwendung von Mikrokügelchen
als Substrat bei Trenn- und Syntheseverfahren; der Verwendung von
Mikrokügelchen
als Substrat zum Immobilisieren eines Moleküls wie beispielsweise eines
Polypeptids oder eines Oli gonukleotids; und der Verwendung von Mikrokügelchen
in Zellkultur-Verfahren, wie in Anspruch 48 beschrieben ist.
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Ausführliche Beschreibung der Erfindung
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Die Mikrokügelchen
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Die
vorliegende Erfindung schließt
ein vernetztes poröses
Polymermaterial ein, das als „Mikrokügelchen" bezeichnet wird,
wobei zumindest ungefähr
10% der Mikrokügelchen
im wesentlichen sphärisch
bzw. kugelförmig
und/oder im wesentlichen ellipsoid sind. Die vorliegende Erfindung
schließt
ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Materials
ein. Ein Mikrokügelchen
wird typischerweise durch Suspensionspolymerisierung einer Emulsion
mit großer
inneren Phase, als „HIPE" bezeichnet, erzeugt.
Das Mikrokügelchen
der vorliegenden Erfindung weist somit die erwünschten physikalischen Eigenschaften
der HIPE-Polymere
des Stands der Technik auf (wie beispielsweise solche, die im
US-Patent Nr. 4 522 953 ,
Barby et al., erteilt am 01.06.1985, offenbart wurden). Insbesondere
weist das Mikrokügelchen
aufgrund des Vorhandenseins von Hohlräumen, die durch miteinander
in Verbindung stehenden Poren verbunden sind, eine sehr geringe Dichte
auf. Die Schüttdichte
einer Charge von Mikrokügelchen
gemäß der vorliegenden
Erfindung beträgt
weniger als 0,2 g/ml. Das Leervolumen des Mikrokügelchens ist hoch, zumindest
70% und vorzugsweise zumindest 90%. Diese hohe Porosität verleiht
dem Mikrokügelchen
ein außergewöhnliches
Absorptionsvermögen. Darüber hinaus
stellt das Mikrokügelchen,
weil die zwischen den Hohlräumen
bestehende Verbindung im Mikrokügelchen
es Flüssigkeiten
ermöglicht,
durch das Mikrokügelchen
zu strömen,
ein ausgezeichnetes Substrat zur Verwendung in Biotechnologie-Anwendungen bereit,
wie beispielsweise in der chromatographischen Auftrennung von Proteinen
und in der Peptid-Synthese.
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Der
durchschnittliche Durchmesser des Mikrokügelchens bewegt sich typischerweise
von 5 μm
bis 5 mm. Bevorzugte Durchschnittsdurchmesser bewegen sich von 50 μm bis 500 μm. Die kleine
Größe erleichtert ein
effizientes Waschen des Mikrokügelchens
zur Entfernung restlicher nicht polymerisierter Emulsions-Bestandteile.
Weiterhin kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Herstellung
von Mikrokügelchen
einer relativ gleichförmigen Größe und Form
verwendet werden, was es ermöglicht,
die Waschbedingungen so zu optimalisieren, dass sichergestellt wird,
dass jedes Mikrokügelchen
in einer Charge sorgfältig
gewaschen wurde. Somit kann das Mikrokügelchen anders als die HIPE-Blöcke des
Stands der Technik relativ einfach gewaschen werden. Dieses Merkmal
der vorliegenden Erfindung erleichtert eine kosteneffiziente Vergrößerung der HIPE-Polymererzeugung.
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Ein
zusätzliches
Merkmal des Mikrokügelchens
besteht darin, dass das Mikrokügelchen „hautlos" ist, so dass einige
Innen-Hohlräume
und Poren mit der Oberfläche
des Mikrokügelchens
in Verbindung stehen. Somit bietet das Mikrokügelchen gegenüber HIPE-Polymeren
des Stands der Technik den Vorteil, dass ein poröses Polymermaterial direkt
nach Polymerisierung erzeugt werden kann, und der Bedarf nach einem Haut-Entfernungsschritt
vermieden wird.
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Die
hohe Porosität
des Mikrokügelchens
macht es als Absorptionsmaterial nützlich und ebenfalls als festen
Träger
in einer Vielzahl von Biotechnologie-Anwendungen, einschließlich von
chromatographischen Auftrennungen, Festphasensynthesen, Immobilisierung
von Antikörper
oder Enzymen, und Zellkultur. Darüber hinaus sind viele der physikalischen
bzw. physischen Eigenschaften des Mikrokügelchens wie beispielsweise Leervolumen
und Hohlraumgröße kontrollier-
bzw. steuerbar. Deswegen können
unterschiedliche Typen von Mikrokügelchen, die für unterschiedliche
Verwendungen spezialisiert sind, erzeugt werden. Eine Beschreibung des
allgemeinen Verfahrens zur Herstellung des Mikrokügelchens
ist nachstehend präsentiert,
gefolgt von einer Diskussion von Modifikationen zur Herstellung
spezialisierter Mikrokügelchen.
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Definitionen
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Der
Begriff „Mikrokügelchen" betrifft ein vernetztes
Polymermaterial, bei dem zumindest 10% dieses Materials aus im wesentlichen
kugelförmigen
und/oder im wesentlichen ellipsoiden Kügelchen besteht. Vorzugsweise
besteht zumindest 20% und besonders bevorzugt zumindest 50% dieses
Materials aus im wesentlichen kugelförmigen und/oder im wesentlichen
elipsoiden Kügelchen.
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Wie
auf die Bestandteile einer HIPE angewendet zeigt der Satz „im wesentlichen
wasserunlöslich" an, dass jeder in
der wäßrigen Phase
vorliegende Bestandteil in einer solch niedrigen Konzentration vorliegt,
dass die Polymerisation des wäßrigen Monomers
weniger als 5 Gew.-%
des polymerisierbaren Monomers beträgt.
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Wie
hierin verwendet bedeutet der Begriff „Schüttdichte" den Wert, der durch Teilen des Gewichtes
eines bekannten Volumens von Mikrokügelchen durch dessen Volumen
erzielt wird.
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Wie
hierin verwendet betrifft der Begriff „Leervolumen" das Volumen eines
Mikrokügelchens,
das kein Polymermaterial umfasst. Mit anderen Worten umfasst das
Leervolumen eines Mikrokügelchens
das Gesamtvolumen der Hohlräume.
Leervolumen wird entweder als Prozentsatz des gesamten Mikrokügelchen-Volumens
oder als Volumen pro Gramm Mikrokügelchen-Material (ccm/g) ausgedrückt.
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Wie
hierin verwendet betrifft der Begriff „Hohlraumgröße" den durchschnittlichen
Durchmesser der in einem Mikrokügelchen
vorliegenden Hohlräume.
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Wie
hierin verwendet betrifft der Begriff „Porogen" eine organische Verbindung, die, wenn
sie in die Öl-Phase
einer HIPE eingeschlossen ist, die Bildung von Poren fördert, die
die Hohlräume
in einem Mikrokügelchen
verbinden.
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Die
Abkürzung „DVB" betrifft „Divinylbenzol"; wobei die Abkürzung „AIBN" „Azoisobisbutyronitril" betrifft; und die
Abkürzung „PVA" „Poly(vinylalkohol)" betrifft, der durch
Hydrolyse von Poly(vinylacetat) erzeugt wird.
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Herstellung von Mikrokügelchen
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Die
Mikrokügelchen
der vorliegenden Erfindung werden bequemerweise aus einem HIPE hergestellt, das
eine Emulsion aus einer diskontinuierlichen wäßrigen Phase in einer Öl-Phase
umfasst. Einmal gebildet wird die HIPE einem wäßrigen Suspensionsmedium zur
Bildung einer Suspension aus HIPE-Mikrotröpfchen im Suspensionsmedium
zugesetzt. Die Polymerisierung wandelt dann die flüssigen HIPE-Mikrotröpfchen zu festen
Mikrokügelchen
um.
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Bei
einer Ausführungsform
liegt der Polymerisationsstarter sowohl in der wäßrigen diskontinuierlichen Phase
der HIPE als auch im wäßrigen Suspensionsmedium
vor. Ein Polymerisationsstarter kann wahlweise ebenso in die Öl-Phase
eingeschlossen werden. In einer weiteren Ausführungsform liegt der Polymerisationsstarter
lediglich in der Öl-Phase
vor.
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Mikrokügelchen-Produktion
unter Verwendung eines Polymerisationsstarters in der wäßrigen Phase.
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Bestandteile der Emulsion
mit großer
innerer Phase
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Die
relativen Mengen der beiden HIPE-Phasen sind, neben anderen Parameter,
bedeutende Determinanten der physikalischen Eigenschaften des Mikrokügelchens.
Insbesondere beeinflußt
der Prozentsatz der wäßrigen diskontinuierlichen
Phase Leervolumen, Dichte, Hohlraumgröße und Oberfläche. Für die Emulsionen,
die zur Herstellung bevorzugter Mikrokügelchen verwendet werden, ist
der Prozentsatz der wäßrigen diskontinuierlichen
Phase im allgemeinen im Bereich von 70% bis 98% besonders bevorzugt
75% bis 95% und am meisten bevorzugt 80% bis 90%.
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Die Öl-Phase
der Emulsion umfasst ein Monomer, ein Vernetzungsmittel und einen
Emulgator, der zur Bildung einer stabilen Wasser-in-Öl-Emulsion
geeignet ist. Der Monomerbestandteil unterscheidet sich von demjenigen
von HIPE-Polymeren des Stands der Technik nicht und kann irgendein
im wesentlichen wasserunlösliches,
monofunktionelles Monomer sein. In einer Ausführungsform ist der Monomertyp
ein Styrol-basiertes Monomer, wie beispielsweise Styrol, 4-Methylstyrol,
4-Ethylstyrol, Chlormethylstyrol, 4-t-BOC-hydroxystyrol. Der Monomer-Bestandteil
kann ein einzelner Monomer-Typ oder ein Gemisch von Typen sein.
Der Monomerbestandteil liegt typischerweise in einer Konzentration
von 5 bis 90 Gew.-% der Öl- Phase vor. Die Konzentration
des Monomer-Bestandteils ist vorzugsweise 15% bis 50% der Öl-Phase
besonders bevorzugt 16% bis 38%.
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Das
Vernetzungsmittel kann aus einer breiten Vielzahl im wesentlichen
wasserunlöslicher,
polyfunktioneller Monomere ausgewählt sein. Vorzugsweise ist
das Vernetzungsmittel bifunktionell. Geeignete Vernetzungsmittel
unterscheiden sich von denjenigen des Stands der Technik nicht und
schließen
aromatische Divinyl-Verbindungen, wie beispielsweise Divinylbenzol
(DVB) ein. Andere Arten von Vernetzungsmitteln, wie beispielsweise
Di- oder Triacryl-Verbindungen und Triallylisocyanurat können ebenfalls
verwendet werden. Das Vernetzungsmittel kann ein einziger Typ eines
Vernetzungsmittels oder ein Gemisch von Typen sein. Das Vernetzungsmittel
liegt im allgemeinen in einer Konzentration von 1 bis 90 Gew.-%
der Öl-Phase
vor. Vorzugsweise ist die Konzentration des Vernetzungsmittel 15%
bis 50% der Öl-Phase.
Besonders bevorzugt ist die Konzentration 16% bis 38%.
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Zusätzlich zu
einem Monomer- und Vernetzungsmittel umfasst die Öl-Phase
einen Emulgator, der die Bildung einer stabilen Emulsion fördert. Der
Emulgator kann irgendeiner von nicht ionischen, kationischen, anionischen
oder amphoteren Emulgatoren oder einer Kombination von Emulgatoren
sein, die die Bildung einer stabilen Emulsion fördern. Geeignete Emulgatoren
unterscheiden sich von denjenigen des Stands der Technik nicht und
schließen
Sorbitanfettsäureester,
Polyglycerolfettsäureester
und Polyoxyethylenfettsäuren
und -ester ein. In einer Ausführungsform
ist der Emulgator Sorbitanmonooleat (vertrieben als SPAN 80). Der
Emulgator liegt im allgemeinen in einer Konzentration von 4 bis
50 Gew.-% der Öl-Phase vor. Vorzugsweise
ist die Konzentration des Emulgators 10% bis 25% der Öl-Phase.
Besonders bevorzugt ist die Konzentration 15% bis 20%.
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In
einer Variation der ersten Ausführungsform
enthält
die Öl-Phase
ebenfalls einen Öllöslichen
Polymerisationsstarter und ein Porogen. Der Starter kann irgendein Öl-löslicher
Starter sein, der die Bildung einer stabilen Emulsion ermöglicht,
wie beispielsweise ein Azo-Starter.
Ein bevorzugter Starter ist Azoisobisbutyronitril (AIBN). Der Initiator
kann in einer Konzentration von bis zu ungefähr 5 Gew.-% des gesamten polymerisierbaren
Monomers (Monomerbestandteil plus Vernetzungsmittel) in der Öl-Phase
vorliegen. Die Konzentration des Starters ist vorzugsweise 0,5 bis
1,5 Gew.-% des gesamten polymerisierbaren Monomers, besonders bevorzugt
1,2 Gew.-%.
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Das
Porogen der vorliegenden Erfindung kann irgendeine nicht polymerisierende
organische Verbindung oder Kombination von Verbindungen sein, die
die Bildung einer stabilen Emulsion ermöglicht, vorausgesetzt, dass
die Verbindung ein für
die verwendeten Monomere gutes Lösungsmittel
ist, jedoch für
das erzeugte Polymer ein schlechtes Lösungsmittel ist. Geeignete
Porogene schließen
Dodecan, Toluol, Cyclohexanol, n-Heptan, Isooctan und Petroleumether
ein. Ein bevorzugtes Porogen ist Dodecan. Das Porogen liegt im allgemeinen
in einer Konzentration von 10 bis 60 Gew.-% der Öl-Phase vor. Die Porogen-Konzentration
beeinflußt
die Größe und Anzahl
der Poren, die die Hohlräume
in dem Mikrokügelchen
miteinander verbinden. Insbesondere erhöht eine Zunahme der Porogen-Konzentration
die Größe und Anzahl
der diese verbindenden Poren; während
eine Abnahme der Porogen-Konzentration
die Größe und Anzahl
der Poren senkt. Die Porogen-Konzentration ist vorzugsweise 25 bis
40 Gew.-% der Öl-Phase.
Die Konzentration ist besonders bevorzugt 30 bis 35 Gew.-%.
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In
der ersten Ausführungsform
umfasst die wäßrige diskontinuierliche
Phase einer HIPE im allgemeinen einen wasserlöslichen Polymerisationsstarter.
Der Starter kann irgendein geeigneter Wasser-löslicher Starter sein. Solche
Initiatoren bzw. Starter sind wohl bekannt und schließen Peroxid-Verbindungen
wie beispielsweise Natrium-, Kalium- und Ammoniumpersulfate; Natriumperacetat;
Natriumperkarbonat und dergleichen ein. Ein bevorzugter Starter
ist Kaliumpersulfat. Der Starter kann in einer Konzentration von
bis zu 5 Gew.-% der wäßrigen diskontinuierlichen
Phase betragen. Vorzugsweise ist die Konzentration des Starters
0,5 bis 2 Gew.-% der wäßrigen diskontinuierlichen
Phase.
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Bestandteile des wäßrigen Suspensionsmediums
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Nach
Bildung einer HIPE durch das ausführlich unten beschriebene Verfahren
wird die HIPE einem wäßrigen Suspensionsmedium
zur Bildung einer Öl-in-Wasser-Suspension
zugesetzt. Das wäßrige Suspensionsmedium
umfasst ein Suspensionsmittel und in der ersten Ausführungsform
einen wasserlöslichen
Polymerisationsstarter. Das Suspensionsmittel kann irgend ein Mittel
oder eine Kombination von Mitteln sein, die die Bildung einer stabilen
Suspension von HIPE-Mikrotröpfchen
fördert.
Typische Tröpfchenstabilisatoren
für Öl-in-Wasser-Suspensionen schließen Wasser-lösliche Polymere
wie beispielsweise Gelatine, natürliche Gummis,
Zellulose und Zellulosederivate (beispielsweise Hydroxyethylzellulose),
Polyvinylpyrrolidon und Poly(vinylalkohol) (PVA) ein. PVA, das zur
Verwendung als Suspensionsmittel geeignet ist, wird durch Teil-(85% bis
92%)hydrolyse von Polyvinylacetat erzeugt. Ebenfalls verwendet werden
fein verteilte, wasserunlösliche anorganische
Feststoffe wie beispielsweise Tonerde, Siliziumdioxid, Aluminiumoxid
und Zirkoniumdioxid. Zwei oder mehr unterschiedliche Suspensionsmittel
können
kombiniert werden. In einer Ausführungsform
ist das Suspensionsmittel tatsächlich
eine Kombination aus Gelatine oder PVA (88% Hydrolyse) und modifizierter Tonerde
und Siliziumdioxid-Teilchen.
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Modifizierte
anorganische Feststoff-Teilchen werden durch Behandlung der Teilchen
mit einem Mittel erzeugt, das die Hydrophobie der Teilchen erhöht, und
dadurch das Vermögen
der Teilchen, die Suspension zu stabilisieren, verbessert. Bei einer
Ausführungsform
sind die anorganischen Feststoff-Teilchen durch Behandlung mit einem
oberflächenaktiven
Stoff bzw. Tensid modifiziert, wie beispielsweise Asphalten, in
Gegenwart eines geeigneten organischen Lösungsmittels. Geeignete organische
Lösungsmittel
schließen
Toluol, Heptan und ein Gemisch der beiden ein. Die relativen Konzentrationen
des anorganischen Feststoffs und von Asphalten können zur Erzeugung modifizierter
anorganischer Feststoffe variierender Hydrophobien variiert werden.
Ein Maß der
Teilchenhydrophobie ist der „Kontaktwinkel", der widerspiegelt,
wie weit ein Teilchen in eine Wasserphase an einer Öl-Wasser-Grenzfläche eindringt.
Ein Kontaktwinkel von 90° zeigt,
dass das Teilchen zur Hälfte
in der Öl-Phase
und zur Hälfte
in der Wasser-Phase vorliegt. Ein Kontaktwinkel von weniger als
90° zeigt,
dass das Teilchen weiter in die Wasser-Phase penetriert, d. h. hydrophiler
ist. In der vorliegenden Erfindung wird die Hydrophobie der anorganischen
festen Teilchen so eingestellt, dass die Teilchen die Bildung einer
stabilen Suspension fördern.
In einer geeigneten Variation dieser Ausführungsform ist der Kontaktwinkel der
modifizierten anorganischen festen Teilchen ungefähr 65°. Das Suspensionsmittel
kann im wäßrigen Suspensionsmittel
in irgendeiner Konzentration vorliegen, die die Bildung einer stabilen
Suspension fördert,
typischerweise ungefähr
0,1 bis ungefähr
10 Gew.-% des wäßrigen Suspensionsmediums.
Für eine
bevorzugte Kombination aus Suspensionsmitteln wird eine stabile
Suspension mit einer PVA-Konzentration von 0,5% bis 5% und einer
anorganischen Feststoff-Konzentration von 0,05 bis 0,3 Gew.-% des
wäßrigen Suspensionsmediums
gewonnen.
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Zusätzlich zum
Suspensionsmittel enthält
das wäßrige Suspensionsmedium
einen wasserlöslichen Polymerisationsstarter
in der ersten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung. Das Vorliegen eines Starters im Suspensionsmedium,
ebenso wie in den HIPE-Mikrotröpfchen
beschleunigt die Polymerisationsreaktion. Es ist im allgemeinen
eine rasche Polymerisation wegen der Neigung der Suspension, über die
Zeit hinweg zu brechen, wünschenswert.
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Der
Starter kann irgendein geeigneter Wasser-löslicher Starter sein, wie beispielsweise
solche, die oben für
die wäßrige diskontinuierliche
Phase der HIPE beschrieben sind. In einer bevorzugten Variation
dieser Ausführungsform
ist der Starter Kaliumpersulfat, vorliegend im Suspensionsmedium
in einer Konzentration von bis zu 5 Gew.-%. Besonders bevorzugt
ist die Konzentration des Starters 0,5 bis 2 Gew.-% des wäßrigen Suspensionsmediums.
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Herstellung einer Emulsion
mit großer
innerer Phase
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Der
erste Schritt bei der Herstellung eines HIPE-basierten Mikrokügelchens
ist die Bildung einer Emulsion mit großer innerer Phase. Eine HIPE
kann durch irgendeines der Verfahren des Stands der Technik hergestellt
werden, wie beispielsweise diejenigen, die im
US-Patent Nr. 4,522,953 offenbart
sind (Barby et al., erteilt am 11.06.1985). Kurz gesagt wird eine
HIPE durch Vereinigen der Öl-
und wäßrigen diskontinuierlichen Phasen
gebildet, während
die Kombination einer Scher-Bewegung unterworfen werden. Im allgemeinen
wird eine Misch- oder
Rühr- bzw.
Bewegungsvorrichtung wie beispielsweise eine Stiftschneidmühle verwendet.
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Der
Umfang und die Dauer der Scher-Bewegung muss so ausreichend sein,
um eine stabile Emulsion zu bilden. Weil die Scher-Bewegung zur
Hohlraumgröße umgekehrt
in Beziehung steht, kann die Bewegung erhöht oder gesenkt werden, um
jeweils ein Mikrokügelchen
mit kleineren oder größeren Hohlräumen zu
gewinnen. In einer Ausführungsform
wird eine HIPE unter Verwendung eines Gifford-Wood Homogenizer-Mixers (Model
1-LV), eingestellt auf 1.400 UpM, hergestellt. Bei dieser Mischgeschwindigkeit
wird die HIPE in ungefähr
5 Minu ten erzeugt. Bei einer anderen Ausführungsform wird eine HIPE unter
Verwendung einer Luft-betriebenen Version des obigen Mixers (Modell
1-LAV) hergestellt, wobei der Luftdruck für ungefähr 5–10 Minuten bei 5–10 psi
eingestellt wird. Die HIPE kann in einem chargenweisen oder in einem
kontinuierlichen Verfahren gebildet werden, beispielsweise das,
das im
US-Patent Nr. 5,149,720 offenbart
ist (DesMarais et al., erteilt am 22.09.1992).
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Herstellung einer HIPE-Mikrotröpfchen-Suspension
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Wenn
sie einmal gebildet wird, wird die HIPE dem wäßrigen Suspensionsmedium zugesetzt.
Die HIPE muss dem Suspensionsmedium in einer Menge und in einer
Geschwindigkeit zugesetzt werden, die zur Bildung einer Suspension
aus HIPE-Mikrotröpfchen
geeignet ist.
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Wenn
die HIPE zugesetzt wird, wird die Suspension einer ausreichenden
Scher-Bewegung unterworfen, um eine stabile Suspension zu bilden.
Um sicherzustellen, dass die erzeugten Mikrokügelchen eine relativ gleichförmige Größe aufweisen,
sollte die Mischvorrichtung die verwendet wird, eine relativ gleichförmige Verteilung
an Bewegungs- bzw. Rührkraft
durch die ganze Suspension hindurch bereitstellen. Weil die Scher-Bewegung
zur Mikrotröpfchen-Größe umgekehrt
in Beziehung steht, kann die Bewegung zur Erzielung kleinerer oder
größerer HIPE-Mikrotröpfchen jeweils
erhöht
oder gesenkt werden. Auf diese Weise kann man die Größe des nach
Polymerisation erzeugten Mikrokügelchens
steuern.
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Um
eine stabile Mikrotröpfchen-Suspension
in einem kugelförmigen
221-Reaktor mit Scheide- bzw. Trennwänden oder Vertiefungen herzustellen
wird beispielsweise die HIPE dem Suspensionsmedium tropfenweise
in einer Strömungsgeschwindigkeit
von bis zu ungefähr
500 ml/min zugesetzt, bis die Suspension bis zu ungefähr 50% HIPE
umfasst. Das Rühren
kann sich von ungefähr
50 bis ungefähr
500 UpM bewegen, wenn ein propeller- oder schaufelartiges Flügelrad mit
einem Durchmesser von ungefähr
1,5 bis 3 Inch bzw. Zoll verwendet wird. In einer Ausführungsform
wird die HIPE dem Suspensionsmedium im 22 Liter-Reaktor in einer Durchflußgeschwindigkeit
von 20 ml/min zugesetzt, bis die Suspension ungefähr 10% HIPE
umfasst.
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Das
Rühren
dieses Gemisches bei ungefähr
250 UpM gefolgt von Polymerisation ergibt Mikrokügelchen mit einem durchschnittlichen
Durchmesser im Bereich von 100 bis 160 μm.
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Polymerisation von HIPE-Mikrotröpfchen
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Wenn
einmal eine stabile Suspension von HIPE-Mikrotröpfchen erzielt wird, wird die
Temperatur des wäßrigen Suspensionsmediums
auf über
Umgebungstemperatur angehoben und die Polymerisation wird gestartet.
Die Polymerisationsbedingungen variieren abhängig von der Zusammensetzung
der HIPE. Beispielsweise sind das Monomer- oder Monomergemisch und
der Polymerisationsstarter (die Polymerisationsstarter) besonders
bedeutende Determinanten der Polymerisationstemperatur. Darüber hinaus
müssen
die Bedingungen so gewählt
werden, dass eine stabile Suspension für eine Zeitspanne aufrecht
erhalten werden kann, die für
die Polymerisation von Nutzen ist. Die Bestimmung einer geeigneten
Polymerisationstemperatur für
eine gegebene HIPE liegt innerhalb des Fachwissens auf dem Gebiet.
Im allgemeinen sollte die Temperatur der HIPE-Suspension nicht über 85°C angehoben
werden, weil hohe Temperaturen ein Brechen der Suspension verursachen
können.
Vorzugsweise werden, wenn AIBN der Öl-lösliche Starter und Kaliumpersulfat
der Wasser-lösliche
Starter ist, Styrolmonomere durch Halten der Suspension bei 60°C über Nacht
polymerisiert (ungefähr
18 Stunden).
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Waschen der Mikrokügelchen
-
Der
Polymerisationsschritt wandelt ein HIPE-Mikrotröpfchen zu einem festen Mikrokügelchen
um. Wie oben diskutiert wird dieses Mikrokügelchen im allgemeinen zur
Entfernung irgendwelcher restlichen nicht polymerisierten Bestandteile
der HIPE oder des Suspensionsmediums gewaschen. Das Mikrokügelchen
kann mit irgendeiner Flüssigkeit
gewaschen werden, die die übrigen
Bestandteile solubilisiert bzw. löslich macht, ohne die Stabilität des Mikrokügelchens
zu beeinflussen. Mehr als ein Waschzyklus kann erforderlich sein.
Vorzugsweise wird das Mikrokügelchen
fünf Mal
mit Wasser gefolgt von einer Aceton-Extraktion für ungefähr einen Tag in einem Soxhlet-Extraktor,
gewaschen. Das Mikrokügelchen
kann dann in konventioneller Weise getrocknet werden. Vorzugsweise
wird das Mikrokügelchen
für zwei
Tage luftgetrocknet oder wird unter Vakuum bei 50°C über Nacht
getrocknet. Die sich ergebenden Mikrokügelchen weisen typischerweise
eine Schüttdichte
von weniger als 0,1 g/ml auf.
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Mikrokügelchen-Herstellung
unter Verwendung eines Öl-Phasen-Starters
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Mikrokügelchen-Bestandteile
-
In
einer zweiten Ausführungsform
kann ein Polymer-Mikrokügelchen
durch ein Verfahren hergestellt werden, bei dem der Polymerisationsstarter
in der Öl-Phase
anstelle der wäßrigen Phase
vorliegt. Geeignete Starter für
diese Ausführungsform
schließen Öl-lösliche Starter
beispielsweise AIBN, Benzoylperoxid, Lauroylperoxid, VAZO-Typ Initiatoren
bzw. Starter (wie beispielsweise 1,1'-Azobis(cyclohexancarbonitril), das
als VAZO-Katalysator 88 von Aldrich, Milwaukee, WI, vertrieben wird)
und dergleichen ein.
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In
dieser Ausführungsform
wird ein ausreichender Starter der Öl-Phase zugesetzt, um eine
freie Radikalreaktion zu starten. Geeignete Starter-Konzentrationen
für eine
gegebene Mikrokügelchen-Präparation können in
einfacher Weise durch den Fachmann auf dem Gebiet bestimmt werden.
Typischerweise liegt der Starter in einer Konzentration von bis
zu 5 Gew.-% am gesamten polymerisierbaren Monomer (Monomer-Bestandteil
plus Vernetzungsmittel) in der Öl-Phase
vor. Die Konzentration des Starters ist vorzugsweise 0,5 bis 3,0
Gew.-% am gesamten polymerisierbaren Monomer, besonders bevorzugt
ungefähr
2,2 Gew.-%.
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Zusätzlich macht
die zweite Ausführungsform
die Verwendung eines Stabilisators erforderlich, der dazu in der
Lage ist, eine Grenzfläche
zwischen der wäßrigen diskontinuierlichen
Phase der HIPE und dem wäßrigen Suspensionsmedium
zu bilden, wobei diese beiden wäßrigen Medien
in der Mikrotröpfchen-Suspension
aneinander grenzen. Dieses Phänomen
ist der Situation in Seifenblasen analog, in denen eine Grenzfläche, die
durch Detergenz-Moleküle
gebildet wird, Luft auf der Innenseite der Blase von Luft auf der
Außenseite abtrennt.
Der Stabilisator reduziert einen Wasserverlust aus den HIPE-Mikrotröpfchen und
hilft dabei, eine Koaleszenz der Mikrotröpfchen zu vermeiden.
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Im
allgemeinen sollte der Stabilisator eine filmbildende Verbindung
sein, die in organischen Lösungsmitteln
löslich
ist und die ausreichend hydrophil ist, um die Grenzfläche zwischen
der wäßrigen diskontinuierlichen
Phase der HIPE und des wäßrigen Suspensionsmediums
zu stabilisieren. Diese Eigenschaften sind in einer Vielzahl natürlicher
und synthetischer Polymere zu finden, die als Stabilisatoren in
dieser Ausführungsform
dienen können,
einschließlich
von Zellulosederivaten, wie beispielsweise Methylzellulose und Ethylzellulose,
und PVA (weniger als 70% Hydrolyse). Weitere geeignete Stabilisatoren
können
empirisch durch den Fachmann auf dem Gebiet gemäß der hierin offenbarten Lehren
bestimmt werden. Vorzugsweise umfasst der Stabilisator Ethylzellulose.
-
Die
Stabilisatorkonzentration muss ausreichend sein, um den Wasserverlust
aus den HIPE-Mikrotröpfchen zu
reduzieren und um eine Mikrotröpfchen-Koaleszenz
zu reduzieren. Optimale Konzentrationen variieren mit der HIPE-Zusammensetzung
und werden empirisch bestimmt. Geeignete Stabilisator-Konzentrationen bewegen
sich typischerweise von 0,01 bis ungefähr 15 Gew.-% der Öl-Phase.
Höhere
Stabilisator-Konzentrationen können
verwendet werden; jedoch ist es bei Konzentrationen oberhalb 15%
schwierig, den Stabilisator aus den polymerisierten Mikrokügelchen
auszuwaschen. Vorzugsweise ist die Stabilisator-Konzentration 0,1% bis 1% der Öl-Phase,
besonders bevorzugt 0,2% bis 0,6%.
-
Wenn
der Stabilisator in der Öl-Phase
nicht löslich
ist, wird der Stabilisator typischerweise in einem inerten Lösungsmittel
gelöst
und die sich ergebende Lösung
der Öl-Phase
der HIPE zugesetzt. Zusätzlich
zum Solubilisieren des Stabilisators dient das inerte Lösungsmittel
als ein Porogen. Das inerte Lösungsmittel
kann irgendein Lösungsmittel
sein, das dazu in der Lage ist, den Stabilisator zu solubilisieren
und das in der Öl-Phase
der HIPE mischbar ist. Beispiele für inerte Lösungsmittel, die in der zweiten
Ausführungsform
von Nutzen sind, schließen
Trichlorethan, Toluol, Chloroform und andere halogenierte Lösungsmittel
und dergleichen ein.
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Ausreichend
inertes Lösungsmittel
wird dem Stabilisator zugesetzt, um die Löslichkeit des Stabilisators
zu erhöhen,
um ein Mischen des Stabilisators mit der Öl-Phase zu ermöglichen.
Die inerte Lösungsmittel-Konzentration
variiert mit der verwendeten Stabilisator- und Öl-Phase und die Bestimmung des geeigneten Typs
und der Konzentration eines inerten Lö sungsmittels zur Erleichterung
des Mischens eines speziellen Stabilisators mit einer vorgegebenen Öl-Phase
liegt innerhalb der Fähigkeiten
des Fachmanns. Typischerweise bewegt sich die Konzentration des
inerten Lösungsmittels
von 3 bis 60 Gew.-% der Öl-Phase
und insbesondere von 10 bis 40%.
-
Geeignete
Konzentrationen an Monomer, Vernetzungsmittel und Emulgator sind
im wesentlichen wie oben beschrieben, außer dass die Konzentrationen
irgendeiner dieser Verbindungen so reduziert werden können, dass
sie den Einschluß des Öl-löslichen
Polymerisations-Starters, Stabilisators und des inerten Lösungsmittels
in der Öl-Phase
in Einklang bringen. Somit sind typische Konzentrationsbereiche
für diese
Bestandteile in der zweiten Ausführungsform
wie folgt:
Bestandteil | Konzentration
(Gew.-% HIPE) |
Monomer | 4–90 |
Vernetzer | 1–89 |
Emulgator | 3–50 |
-
Bevorzugte
Konzentrationen für
jeden dieser Bestandteile sind dieselben wie oben für die erste
Ausführungsform
diskutiert. Zusätzlich
kann ein Porogen wahlweise in die Öl-Phase mit eingeschlossen
werden, wie oben für
die erste Ausführungsform
beschrieben. Wenn ein Porogen eingeschlossen wird, können die
Konzentrationen an Monomer, Vernetzungsmittel und/oder Emulgator
reduziert werden.
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Die
wäßrige diskontinuierliche
Phase und das wäßrige Suspensionsmedium
der zweiten Ausführungsform
unterscheiden sich von solchen der ersten Ausführungsform dahingehend, dass
die wäßrige diskontinuierliche
Phase und das wäßrige Suspensionsmedium
der zweiten Ausführungsform
keinen Polymerisationsstarter einschließen. Bei einer Variation der
zweiten Ausführungsform
besteht die wäßrige diskontinuierliche Phase
im wesentlichen aus Wasser. Das wäßrige Suspensionsmedium dieser
Ausführungsform
umfasst ein Suspendierungsmittel, das jedes Mittel oder Kombination
von Mitteln sein kann, die die Bildung einer stabilen Suspension
von HIPE-Mikrotröpfchen
fördert.
Beispiele für
geeignete Suspensionsmittel werden oben diskutiert. Natürliche Gummis,
wie beispielsweise Akazien-Gummi (im Handel erhältlich von Aldrich Chemical
Co., Milwaukee, WI) werden bevorzugt. Das Suspendierungsmittel kann
in jeder Konzentration vorliegen, das die Bildung einer stabilen
Suspension fördert,
typischerweise 1 bis 30 Gew.-% des wäßrigen Suspensionsmediums.
Vorzugsweise ist die Suspendierungsmittelkonzentration zwischen
2% bis 15%.
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Herstellung der Mikrokügelchen
-
Um
Mikrokügelchen
gemäß der zweiten
Ausführungsform
herzustellen wird eine Öl-Phase
hergestellt, indem der Öl-lösliche Polymerisationsstarter,
der Stabilisator und ein inertes Lösungsmittel mit einem Monomer,
einem Vernetzungsmittel und einem Emulgator vereinigt wird. Eine
HIPE wird durch Kombinieren der Öl- und
wäßrigen diskontinuierlichen
Phasen gebildet, während
die Kombination einer ausreichenden Scher-Bewegung unterzogen wird,
um eine stabile Emulsion wie oben beschrieben zu bilden. Wenn sie
einmal geformt ist wird die HIPE in einer Menge und in einer Geschwindigkeit
dem wäßrigen Suspensionsmedium
zugesetzt, die zur Ausbildung einer Suspension aus HIPE-Mikrotröpfchen geeignet
ist. Wenn das HIPE zugesetzt wird, wird die Suspension wie oben
beschrieben einem Scher-Rühren
bzw. einer Scher-Bewegung unterworfen.
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Nach
Gewinnung einer stabilen Suspension wird die Polymerisation durch
Erhöhen
der Temperatur gestartet. Wie oben beschrieben variieren die Polymerisationsbedingungen
abhängig
von der Zusammensetzung der HIPE und die Bestimmung geeigneter Bedingungen
für eine
gegebene HIPE liegt innerhalb des Wissens des Fachmanns auf dem
Gebiet. Wenn Lauroylperoxid der Starter ist, wird die Polymerisation üblicherweise
für 20
Stunden bei 50°C
durchgeführt.
-
Modifikationen der Mikrokügelchen
-
Das
Mikrokügelchen
ist für
eine Vielzahl von Anwendungen von Nutzen, und bemerkenswerter Weise als
Absorptionsmaterial und ebenfalls als fester Träger in Biotechnologie-Anwendungen. Ein
Mikrokügelchen-basiertes
Absorbenz kann beispielsweise zum Transport von Lösungsmitteln,
zum Absorbieren von Körperflüssigkeiten
und als adhäsiver
Mikroträger verwendet
werden. Biotechnologie-Anwendungen schließen chromatographische Auftrennungen,
Festphasensynthese, Immobilisierung von Antikörpern oder Enzymen und mikrobielle
oder Säugetierzellkultur
ein. Das basische bzw. grundlegende Mikrokügelchen kann auf einer Vielzahl
von Wegen modifiziert werden, um Mikrokügelchen zu erzeugen, die für spezielle
Anwendungen spezialisiert sind.
-
Funktionalisierung des Mikrokügelchens
zur Absorption von Säuren
-
Eine
breite Vielzahl ionischer und polarer funktioneller Gruppen kann
dem Mikrokügelchen
zugesetzt werden, um ein polymeres Mikrokügelchen zu erzeugen, das große Mengen
an sauren Flüssigkeiten
absorbieren kann. Solche Mikrokügelchen
weisen im allgemeinen eine größere Kapazität zum Absorbieren
wäßriger und/organischer
Säuren
auf im Vergleich zu deren Kapazität für das Neutralöl Methyloleat.
Insbesondere ist das Verhältnis
von wäßriger und/oder
organischer Säure-
zur Methyloleat Absorption im allgemeinen größer als 1,2. Ein bevorzugtes
Ausgangsmaterial zur Herstellung eines solchen Mikrokügelchens
ist ein Mikrokügelchen,
das von 1% bis 50% vernetzt ist und ein Leervolumen von mehr als
70% in seinem durch Lösungsmittel aufgequollenen
Zustand aufweist.
-
Das
funktionalisierte Mikrokügelchen
umfasst die folgende strukturelle Einheit:
wobei A eine vernetzte Kohlenstoff-Kette
repräsentiert,
wobei Y eine optionale Spacer-Gruppe
ist und Z eine ionische oder polare funktionelle Gruppe ist. Z ist
aus einer Amino- oder
substituierten Amino-Gruppe und einer kationischen Alkyl-Ammoniumgruppe
mit 8 oder mehr Kohlenstoffatomen ausgewählt (hierin nachstehend „ein höheres Alkyl") oder aus einer
kationischen quartären
Alkylammonium-Gruppe von 8 Kohlenstoffatomen oder weniger in Gegenwart
eines organischen Gegenions mit 8 oder mehr Kohlenstoffatomen. Das
funktionalisierte Mikrokügelchen
kann einen einzigen Typ einer solchen strukturellen Einheit oder
eine Kombination unterschiedlicher Typen umfassen.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist Z aus ionischen oder polaren funktionellen Gruppen der Strukturen
1–3 ausgewählt:
wobei R
2,
R
3, R
4, R
5 und R
6 gleich oder
unterschiedlich sein können
und aus Alkyl, Cycloalkyl, Aryl und Hydroxyalkyl ausgewählt sein
können.
Alternativ können
R
2 und R
3 den Teil
eines Ringsystems bilden. Wenn Z eine kationische quartäre Ammonium-Gruppe
(3) ist, sind R
4, R
5,
R
6 vorzugsweise so ausgewählt, dass
die Anzahl von Kohlenstoffatomen, die in R
4 +
R
5 + R
6 vorliegen,
10 oder mehr ist. Wenn Z eine Amino-Salzgruppe (2) ist, sind R
4 und R
5 vorzugsweise
so ausgewählt,
dass die Anzahl von Kohlenstoffatomen, die in R
4 +
R
5 vorliegen, 8 oder mehr beträgt.
-
Das
Gegenion X– für die kationische
quartäre
Ammonium-Gruppe (3) oder die Amino-Salzgruppe (2) ist ein organisches oder
anorganisches Ion. Das Gegenion für die höhere kationische Alkyl-Gruppe
ist eine anorganische Spezies wie beispielsweise Chlorid, Sulfat
oder Nitrat. Alternativ ist das Gegenion eine lang- oder kurzkettige
organische Spezies wie beispielsweise Acetat oder Oleat.
-
In
einer weiteren Ausführungsform
sind R4, R5 und
R6 niedere Alkyl-Gruppen, so dass die Anzahl
von Kohlenstoffatomen, die in R4 + R5 + R6 vorliegt,
weniger als 10 für
eine kationische quartäre
Ammonium-Gruppe (3) beträgt
und die Anzahl von Kohlenstoffatomen in R4 +
R5 für
ein Aminosalz (2) weniger als 8 beträgt. In dieser Ausführungsform
ist das Gegenion X– vorzugsweise eine organische
Gruppe mit 8 oder mehr Kohlenstoffatomen, wie beispielsweise Oleat.
Für eine
kationische quartäre
Ammonium-Gruppe (3) kann X– ebenfalls OH– sein.
-
Die
Menge an Lösungsmittel,
die von dem funktionalisierten Mikrokügelchen absorbiert wird, nimmt mit
der Anzahl ionischer oder polarer funktioneller Gruppen, die vorliegen,
zu, vorausgesetzt, das Niveau des Vernetzens überschreitet nicht ungefähr 15–20%. Oberhalb
dieses Niveaus der Vernetzung ist die Menge der Flüssigkeit,
die absorbiert wird, viel weniger gegenüber dem Ausmaß der Substitution
empfindlich, weil die Flüssigkeitsaufnahme
dann von der Mobilität
solvatisierter Polymer-Ketten abhängig ist. Das Niveau des Vernetzens
wird durch Verändern
der relativen Konzentrationen von Monomer und Vernetzer kontrolliert.
Vorzugsweise ist das Niveau der Vernetzung im Bereich von 2–10%. Der
Umfang der Funktionalisierung ist im allgemeinen größer als
30%, vorzugsweise größer als
50% und am meisten bevorzugt größer als
70%.
-
Funktionalisierte
Mikrokügelchen
werden durch dieselben Verfahren erzeugt, die auch zur Herstellung funktionalisierter
HIPE-Polymere verwendet werden. Geeignete Verfahren sind wohl bekannt
und sind beispielsweise im
US-Patent
Nr. 4,611,014 offenbart (Jomes et al., erteilt am 09.09.1986).
Kurz gesagt wird das funktionalisierte Mikrokügelchen im allgemeinen indirekt
durch chemische Modifikation eines vorgeformten Mikrokügelchens
hergestellt, das eine reaktive Gruppe wie beispielsweise Brom oder
Chlormethyl trägt.
-
Ein
für eine
anschließende
chemische Modifikation geeignetes Mikrokügelchen kann durch Polymerisation
von Monomeren wie beispielsweise Chlormethylstyrol oder 4-t-BOC-hydroxystyrol hergestellt
werden. Weitere geeignete Monomere sind Styrol, α-Methylstyrol oder ein anderes
substituiertes Styrol oder aromatische Vinylmonomere, die nach Polymerisation,
zur Erzeugung eines reaktiven Mikrokügelchen-Zwischenproduktes,
das anschließend
zu einem funktionalisierten Mikrokügelchen umgewandelt werden
kann, chlormethyliert werden kann.
-
Monomere,
die keine reaktiven Gruppen tragen (einschließlich des Vernetzungsmittels)
können
in das Mikrokügelchen
in Konzentrationen von bis zu 20% oder mehr eingebaut werden. Um
HIPE-basierte Mikrokügelchen
zu erzeugen müssen
jedoch solche Monomere die Bildung einer stabilen HIPE erlauben.
Die Konzentration des reaktiven Monomers sollte im allgemeinen ausreichend
hoch sein, um sicherzustellen, dass das funktionalisierte Mikrokügel chen,
das nach chemischer Modifikation erzeugt wird, ionische oder polare
funktionelle Gruppen auf minimal 30% der Monomer-Reste trägt.
-
Eine
chemische Modifikation des reaktiven Mikrokügelchen-Zwischenproduktes wird
durch eine Vielzahl herkömmlicher
Verfahren durchgeführt.
Bevorzugte beispielhafte Verfahren zur Herstellung von durch Amino-,
Aminosalz- und kationischen quartären Ammoniumfunktionalisierten
Mikrokügelchen
sind ausführlich in
den Beispielen 2 bzw. 4 dargestellt.
-
In
einer weiteren Ausführungsform
können
Mikrokügelchen,
die ionische oder polare Gruppen tragen, direkt durch Emulgieren
und Polymerisation eines geeigneten im wesentlichen Wasser-unlöslichen
Monomers hergestellt werden.
-
Funktionalisierung des Mikrokügelchens
zur Absorption wäßriger Lösungen
-
Durch
Auswählen
unterschiedlicher polarer oder ionischer funktioneller Gruppen kann
das Mikrokügelchen
so funktionalisiert werden, dass ein Mikrokügelchen produziert wird, das
große
Mengen wäßriger Lösungen absorbiert,
und das ebenfalls als Ionenaustauscherharz dient. Die Kapazität dieser
Mikrokügelchen
zum Absorbieren einer 10% Natriumchloridlösung ist derartig, dass das
Verhältnis
von 10% Natriumchlorid zu Wasser-Absorption im allgemeinen größer als
0,1, vorzugsweise größer als
0,5 und am meisten bevorzugt größer als
0,7 ist.
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Das
für die
wäßrige Absorption
funktionalisierte Mikrokügelchen
umfasst die folgende strukturelle Einheit:
bei der A eine vernetzte
Kohlenstoff-Kette ist, bei der Y eine optionale Spacer-Gruppe ist
und Z eine ionische oder polare funktionelle Gruppe ist. Z ist aus
einer kationischen Alkyl-Ammoniumgruppe
mit 10 Kohlenstoffatomen oder weniger, einem Alkyl-Amino-Salz mit
8 Kohlenstoffatomen oder weniger, einem Alkoxylat, einem Metall-
oder Ammonium- oder substituiertem Ammonium-Salz einer Schwefelsäure-, Karbonsäure-, Phosphorsäure-, oder
Sulfonsäure-Gruppe
ausgewählt,
vorausgesetzt, dass, wenn Z eine Sulfonsäure ist, Y nicht die folgende
Struktur aufweist:
wenn m = 0
-
Das
funktionalisierte Mikrokügelchen
kann einen einzigen Typ einer von solchen strukturellen Einheiten
oder eine Kombination unterschiedlicher Typen umfassen.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist Z aus ionischen oder polaren funktionellen Gruppen der Strukturen
1–2 ausgewählt:
wobei R
2,
R
3 und R
4 gleich
oder unterschiedlich sein können
und aus einem Alkyl, Cycloalkyl, Aryl und Hydroxyaryl ausgewählt sind.
Alternativ bilden R
2 und R
3 Teil
eines Ringsystems. Wenn Z eine kationische quartäre Ammonium-Gruppe (1) ist,
sind R
2, R
3, R
4 vorzugsweise so ausgewählt, dass die Anzahl der Kohlenstoffatome, die
in R
2 + R
3 + R
4 vorliegt, weniger als 10 beträgt. Wenn
Z eine Amino-Salzgruppe (2) ist, sind R
2 und
R
3 vorzugsweise derart ausgewählt, dass
die Anzahl von Kohlenstoffatomen, die in R
2 +
R
3 vorliegen, weniger als 8 beträgt.
-
Das
Gegenion X– für die kationische
quartäre
Ammonium-Gruppe (1) oder die Amino-Salzgruppe (2) ist eine anorganische
Spezies wie beispielsweise Chlorid, Sulfat oder Nitrat.
-
Alternativ
kann das Gegenion eine Carboxylat-Spezies mit weniger als 8 Kohlenstoffatomen
sein, beispielsweise Acetat oder Lactat. Für eine kationische quartäre Ammonium-Gruppe
(1) kann X– ebenfalls
OH– sein.
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In
einer Ausführungsform
ist Z eine alkoxylierte Kette des folgenden Typs:
wobei p 1 bis 680 ist und
und wobei R
5 eine
Wasserstoff- oder eine Alkyl-Gruppe ist und M ein Metall-, ein Ammonium-,
oder ein substituiertes Ammoniumkation ist. Besonders bevorzugt
ist R
5=Wasserstoff, B=CH
2OH
und p < 20.
-
Verfahren
zum Zusetzen der oben beschriebenen funktionellen Gruppen zu HIPE-Polymeren
sind im
US-Patent Nr. 4,612,334 offenbart
(Jones et al., 16.09.1986). Mikrokügelchen, die zur wäßrigen Absorption funktionalisiert
werden, werden durch dieselben Verfahren hergestellt, die zur Herstellung
der entsprechenden funktionalisierten HIPE-Polymere verwendet werden.
Geeignete Verfahren sind dieselben wie die oben beschriebenen Verfahren
zur Herstellung von Mikrokügelchen,
die zur Säureabsorption
für funktionelle
Gruppen desselben basischen Typs funktionalisiert wurden (beispielsweise
Aminosalze).
-
Insbesondere
schließen
geeignete Monomere zur Herstellung eines reaktiven Mikrokügelchen-Zwischenproduktes,
das zur Absorption wäßriger Lösungen funktionalisiert
werden kann, Chlormethylstyrol, n-Butylmethacrylat, t-Butylacrylat,
2-Ethylhexylacrylat oder andere geeignete Acrylat- oder Methacrylat-Ester
ein. Zusätzlich
können
Monomere wie beispielsweise Styrol, α-Methylstyrol oder andere substituierte
Styrole oder aromatische Vinylmonomere polymerisiert und darauf
zur Herstellung eines reaktiven Mikrokügelchen-Zwischenproduktes chlormethyliert, sulfoniert,
nitriert oder in anderer Weise aktiviert werden, das anschließend zu
einem funktionalisierten Mikrokügelchen
umgewandelt werden kann. Bevorzugte beispielhafte Verfahren zur
Herstellung von Aminosalz-, kationischem quartärem Ammonium-, Alkoxylat- und
Sulfonat-Salz funktionalisierten Mikrokügelchen sind ausführlich in
den Beispielen 5 bzw. 8 beschrieben.
-
Herstellung einer stabilen
Kohlenstoff-Struktur aus dem Mikrokügelchen
-
Ein
Mikrokügelchen
kann in ein poröses
kohlenstoffhaltiges Material umgewandelt werden, das die Orginalstruktur
von Mikrokügelchen-Hohlräumen und
diese verbindenden Poren beibehält.
Dieses Material ist beispielsweise als Sorptions- oder Filtrationsmedium
und als fester Träger
in einer Vielzahl biotechnologischer Anwendungen von Nutzen (weiter
im nächsten
Abschnitt beschrieben). Zusätzlich
kann das kohlenstoffhaltige Mikrokügelchen als Elektroden-Material
in Batterien und Super-Kondensatoren verwendet werden. Batterieelektrodenmaterialien
weisen vorzugsweise einen großen
Gitterabstand auf, wie beispielsweise derjenige des Mikrokügelchens.
Ein großer
Gitterabstand reduziert oder eliminiert eine Gitterausdehnung und
Kontraktion während
des Batteriebetriebs und verlängert
dadurch die Batteriezykluslebenszeiten. Superkondensatoren erfordern
hochleitende Elektroden. Das Mikrokügelchen ist ideal für diese
Anwendung geeignet, weil die miteinander-Verbundenheit des Mikrokügelchens
dieses hochleitend macht.
-
Um
ein kohlenstoffhaltiges Mikrokügelchen
zu erzeugen wird ein stabiles Mikrokügelchen in einer Inertatmosphäre wie für die HIPE-Polymere
im
US-Patent Nr. 4,775,655 beschrieben
(Edwards et al., erteilt am 04.10.1988) erhitzt. Die Fähigkeit
des Mikrokügelchens,
dieser Hitzebehandlung zu widerstehen variiert abhängig vom
verwendeten Monomer oder den Monomeren. Einige Monomere, wie beispielsweise
Styrol-basierte Monomere ergeben Mikrokügelchen, die gegen eine Depolymerisierung
während
des Erhitzens stabilisiert werden müssen.
-
Die
zur Stabilisierung solcher Mikrokügelchen erforderliche Modifikation
kann viele Formen annehmen. Mikrokügelchen-Bestandteile und Verfahrensbedingungen
können
so ausgewählt
werden, dass ein hoher Vernetzungsgrad erreicht wird oder um chemische
Einheiten einzuschließen,
die eine Depolymerisierung unter den verwendeten Erhitzungsbedingungen
reduzieren oder diesen vorbeugen. Geeignete stabilisierende chemische
Einheiten schließen
die Halogene; Sulfonate und Chlormethyl, Methoxy, Nitro- und Cyano-Gruppen ein.
Zur maximalen thermischen Stabilität ist der Grad des Vernetzens
vorzugsweise größer als
20% und der Grad irgendeiner anderen chemischen Modifikation ist
zumindest 50%. Die stabilisierenden Einheiten können in das Mikrokügelchen
nach dessen Bildung oder durch Selektion von in geeigneter Weise
modifizierten Monomeren eingebracht werden.
-
Wenn
es einmal stabilisiert ist, wird das Mikrokügelchen in einer Inertatmosphäre auf eine
Temperatur von zumindest 500°C
erhitzt. Um den Stabilisator-Gehalt der endgültigen Kohlenstoff enthaltenden
Struktur zu reduzieren, sollte die Temperatur im allgemeinen auf
zumindest ungefähr
1.200°C
erhöht
werden. Ein bevorzugtes beispielhaftes Verfahren zur Herstellung
einer stabilen Kohlenstoffstruktur aus dem Mikrokügelchen
ist ausführlich
in Beispiel 9 beschrieben.
-
Herstellung eines Mikrokügelchens
zur Verwendung als Substrat
-
Viele
Chromatographie- und chemischen Synthesetechniken verwenden ein
Substrat. Bei chromatographischen Auftrennungen werden Bestandteile
einer Lösung
auf Grundlage des Vermögens
solcher Bestandteile aufgetrennt, mit chemischen Gruppen, die an
die Substratoberfläche
gebunden sind, wechselzuwirken. Bei einer Festphasensynthese dient
das Substrat als Plattform, an die ein wachsendes Molekül wie beispielsweise
ein Polypeptid, verankert wird.
-
Beide
Verfahren können
in einer chargenweise oder kontinuierlichen Weise durchgeführt werden.
In einem chargenweisen Verfahren ist das Substrat in einem Gefäß enthalten
und Lösungen,
die die zu trennenden Bestandteile oder die Recktanten enthalten,
werden aufeinanderfolgend zugesetzt und durch Filtration und Waschen
entfernt. Alternativ ist in kontinu ierlichen oder halbkontinuierlichen
Verfahren das Substrat in einer Säule enthalten und Lösungen werden
anschließend
durch die Säule
hindurch geleitet.
-
Das
Mikrokügelchen
ist in einzigartiger Weise zur Anwendung in solchen Systemen geeignet,
weil das Mikrokügelchen
ein starres Gerüst
bereitstellt, das offene Kanäle
für die
Flüssigkeitsströmung sicherstellt
und ermöglicht,
dass Lösungs-Bestandteile
oder Recktanten in oder aus dem Mikrokügelchen diffundieren. Wenn dies
für eine
spezielle Anwendung erwünscht
ist, kann das Mikrokügelchen
durch Bereitstellen chemischer Gruppen an der Mikro-Kugel-Oberfläche funktionalisiert
werden, direkt mit den Bestandteilen oder Recktanten in einer Lösung interagieren.
Alternativ können
die chemischen Gruppen an der Mikrokügelchen-Oberfläche als Anker für andere
reaktive Spezies dienen, wie beispielsweise für Katalysatoren, Enzyme oder
Antikörper.
-
Die
anschließenden
Abschnitte beschreiben die Verwendung des Mikrokügelchens in der Chromatographie
und Festphasensynthese und diskutieren als Beispiel die Funktionalisierung
des Mikrokügelchens
zur Verwendung in einer Ionenaustauscher-Chromatographie und in
der Peptidsynthese. Die Diskussionen dieser beiden Anwendungen sollen
lediglich veranschaulichend sein und die Erfindung keinesfalls einschränken. Variationen
dieser Anwendung werden für
den Fachmann auf dem Gebiet offensichtlich sein und sind in den
Umfang der Erfindung mit eingeschlossen.
-
Funktionalisierung des Mikrokügelchens
zur Verwendung in der Chromatographie
-
Das
Mikrokügelchen
ist als Substrat in einer Vielzahl von chromatographischen Techniken
von Nutzen, einschließlich
der Ionen-Austausch-, Gelfiltrations-, Adsorptions- und Affinitätschromatographie.
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In
der Ionenaustausch-Chromatographie werden die Bestandteile eines
Gemisches auf Grundlage von Unterschieden der Netto-Ladung aufgetrennt.
Substrate, die Kationen auftrennen, werden als „Kationenaustauscherharze" bezeichnet und sind
durch das Vorliegen negativ geladener Gruppen charakterisiert. Umgekehrt
sind Substrate, die Anionen auftrennen „Anionenaustauscherharze" durch das Vorhandensein
von positiv geladenen Gruppen charakteri siert. Ein Bestandteil,
der an ein Anionenaustauscherharz bindet, wird typischerweise aus
dem Harz durch Erhöhen
des pH des Säulenpuffers
oder durch Zusetzen von Anionen, die mit dem Bestandteil um die
Bindung an die Säule
konkurrieren, freigesetzt. Ein solcher Bestandteil eluiert aus der Säule vor
den Bestandteilen, die eine höhere
negative Netto-Ladung aufweisen und hinter den Bestandteilen, die
eine niedrigere Netto-Ladung aufweisen.
-
Kationenaustauscherharze
können
aus Mikrokügelchen
durch Bereitstellen von sauren Gruppen auf den Mikrokügelchen-Oberflächen erzeugt
werden. Geeignete Gruppen schließen die stark sauren Sulfonat-Gruppen
ebenso wie die schwach sauren Carboxylat-, Carboxymethyl-, Phosphat-,
Sulfomethyl-, Sulfoethyl- und Sulfopropylgruppen ein. Anionenaustauscherharze
können
aus Mikrokügelchen
durch Funktionalisieren der Mikrokügelchen mit basischen Gruppen
hergestellt werden, die sich von den stark basischem quartären Ammonium-Gruppen
bis zu den schwach basischen Gruppen wie beispielsweise Aminoethyl-,
Diethylaminoethyl-, Guanidoethyl- und Epichlorhydrin-triethanolamin-Gruppen
bewegen.
-
Saure
und basische Gruppen können
einem vorgeformten Mikrokügelchen
wie oben zur Funktionalisierung des Mikrokügelchens zur Absorption saurer
und wäßriger Lösungen beschrieben
oder durch irgendein anderes herkömmliches Verfahren zugesetzt
werden. Alternativ kann ein Mikrokügelchen, das solche Gruppen trägt, direkt
durch Polymerisation eines geeigneten Monomers hergestellt werden.
-
Unabhängig vom
Herstellungsverfahren weist das zur Chromatographie funktionalisierte
Mikrokügelchen
im allgemeinen ein Leervolumen von zumindest 70% und eine Hohlraumgröße von bis
zu 50 μm
auf. Vorzugsweise weist ein Mikrokügelchen ein Leervolumen von
70% bis 80% auf. Diese Kombination an Merkmalen stellt eine rasche
Aufnahme von Flüssigkeiten
mit einer relativ unbeeinträchtigten
Strömung
durch das Mikrokügelchen
sicher.
-
Die
Kapazität
des Mikrokügelchen-Substrats
kann durch Zusetzen eines Gels zum Mikrokügelchen gemäß der im
US-Patent Nr. 4,965,289 offenbarten
Verfahren (Sherrington, erteilt am 23.10.1990) erhöht werden.
Wie weiterhin im nächsten
Abschnitt diskutiert wird, wird das Gel in den Mikrokügelchen-Hohlräumen gebildet
oder diesen zugesetzt und wird an die Mikrokügelchen-Oberfläche gebunden.
Das Gel trägt
entweder saure oder basische Gruppen, ab hängig davon, ob das Mikrokügelchen-Substrat
als Anionenaustauscherharz oder Kationenaustauscherharz dienen soll.
-
Funktionalisierung des Mikrokügelchens
zur Verwendung in der Festphasensynthese
-
Das
Mikrokügelchen
wird zur Verwendung in der Festphasensynthese funktionalisiert,
indem chemische Gruppen bereitgestellt werden, die an die Mikrokügelchen-Oberflächen gebunden
werden. Die chemischen Gruppen werden so ausgewählt, dass sie mit einem der
in die Synthese involvierten Recktanten bzw. Reaktionspartner interagieren.
Auf Grundlage der ausgewählten
chemischen Gruppe können
Mikrokügelchen-Substrate
für chemische
Synthesen von so unterschiedlichen Spezies wie Peptiden, Oligonukleotiden und
Oligosacchariden spezialisiert sein. Verfahren zum Zusetzen geeigneter
chemischer Gruppen zum Funktionalisieren des Mikrokügelchens
zur Verwendung in solchen Synthesen unterscheiden sich nicht von
den früher
für HIPEs
nach dem Stand der Technik und für
andere Polymere beschriebenen Verfahren.
-
Ein
Mikrokügelchen
kann für
die Peptidsynthese beispielsweise wie im
US-Patent Nr. 4,965,289 (Sherrington,
erteilt am 23.10.1990) funktionalisiert werden. Kurz gesagt wird
ein Mikrokügelchen
derart hergestellt, dass das Hohlvolumen zumindest 70% beträgt und die
Hohlraumgröße bis zu
50 μm beträgt. Das
Mikrokügelchen
ist vorzugsweise so ausreichend vernetzt, dass das Mikrokügelchen
auf nicht mehr als das zweifache seines Trockenvolumens während der
Anwendung aufquillt.
-
Die
chemische Gruppe, die an die Mikrokügelchen-Oberfläche gebunden
ist, kann irgendeine Gruppe sein, die an den ersten Reaktionspartner
in der Synthese bindet. In der Peptidsynthese ist die chemische
Gruppe beispielsweise irgendeine Gruppe, die an die erste Aminosäure des
Peptids, das hergestellt werden soll, bindet. Die chemische Gruppe
sollte so gewählt
werden, dass die chemische Gruppe an einer Position an die Aminosäure bindet,
die von der Amino-Gruppe
verschieden ist. Typischerweise umfasst die chemische Gruppe ein
Amin, das mit der Carboxyl-Gruppe der ersten Aminosäure reagiert.
-
Chemische
Gruppen können
einem vorgeformten Mikrokügelchen
zugesetzt werden oder alternativ kann ein Mikrokügelchen, das chemische Gruppen
trägt,
direkt durch Emulsifikation bzw. Emulsionsbildung und Polymerisation
eines geeigneten im wesentlichen Wasserunlöslichen Monomers hergestellt
werden. Falls es erwünscht
ist, können
die chemischen Gruppen weiter modifiziert werden, um Spacer-Gruppen
bereitzustellen, die mit der ersten Aminosäure des Peptids interagieren.
-
Die
Peptidsynthese wird durch Binden der ersten Aminosäure an geeignete
chemische Gruppen auf der Mikroperlen-Oberfläche begonnen. Die Amino-Gruppen
der Aminosäure-Reaktionspartner
sind im allgemeinen geschützt
und somit tritt eine Kettenverlängerung
durch alternierende Runden der Entschützung und Bindung von Aminosäuren auf.
Das Verfahren wird durch Abspaltung des Peptids vom Substrat beendet,
wonach das Peptid typischerweise gereinigt wird.
-
Die
Kapazität
des Mikrokügelchen-Substrats
kann durch Zusetzen eines Gels zum Mikrokügelchen gemäß der im
US-Patent Nr. 4,965,289 offenbarten
Verfahren erhöht
werden (Sherrington, erteilt am 23.10.1990). Kurz gesagt wird ein
geeignetes Mikrokügelchen
wie oben beschrieben hergestellt und ein Gel oder ein Vor-Gel wird
in den Hohlräumen
des Mikrokügelchens
abgelagert und in diesen gehalten. Das Gel ist im allgemeinen in
einem hohen Maße
durch Lösungsmittel
gequollenes, vernetztes Gel und kann beispielsweise ein weiches
deformierbares bzw. verformbares Polyamidgel sein. Für Syntheseanwendungen
wird das Gel im allgemeinen so angepaßt, dass es mit einem Reaktionspartner
in der Synthese wechselwirkt. Das Verhältnis von gequollenem Gel zu
porösem
Material kann sich von 60:40 bis 95:5 (Gewicht:Gewicht) bewegen
und ist besonders bevorzugt von 75:25 bis 95:5. Das am meisten bevorzugte
Verhältnis
ist ungefähr
80:20.
-
Das
Gel kann in dem vorgeformten Mikrokügelchen durch irgendeines der
Verfahren des Stands der Technik zur Herstellung von Gel-befüllter HIPE-Polymere
wie beispielsweise solche, die im
US-Patent
Nr. 4,965,289 offenbart sind (Sherrington, erteilt am 23.10.1990),
abgelagert und in diesem gehalten werden. In einer Ausführungsform
wird das Gel aus Vor-Gelmaterialien
innerhalb der Mikrokügelchen-Hohlräume gebildet.
Am meisten bevorzugt wird das Gel in den Mikrokügelchen-Hohlräumen während der
Gelbildung gehalten oder ver ankert. Das Gel kann durch die Kettenverlängerung
und/oder Interpenetration zwischen dem Gel und den Mikrokügelchen-Oberflächen gehalten
werden. Zusätzlich
kann das Gel durch ein Verfahren zurückgehalten werden, von dem
angenommen wird, dass es die chemische Bindung zwischen dem Gel
und den Oberflächen
des Mikrokügelchens
mit einschließt.
Kombinationen der obigen Mechanismen sind ebenfalls möglich.
-
In
einer Ausführungsform
wird das Mikrokügelchen
mit einer Lösung
in Berührung
gebracht, die Vor-Gel-Bestandteile und ein quellendes Lösungsmittel
für das
Mikrokügelchen
umfaßt.
Wenn die Prä-
bzw. Vor-Gel-Bestandteile in das Mikrokügelchen eindringen und beginnen,
ein Gel zu bilden, quillt das Mikrokügelchen auf und fängt Anteile
des sich bildenden Gels durch Polymer-Ketteninterpenetration zwischen
dem gequollenen Polymermaterial des Mikrokügelchens und dem sich bildenden
Gel ein. Geeignete quellende Lösungsmittel
hängen
von der Natur des Mikrokügelchen-Polymers
ab und können
in einfacher Weise durch den Fachmann auf dem Gebiet bestimmt werden.
Die Details eines bevorzugten beispielhaften Verfahrens zur Herstellung
eines Gel-befüllten
Mikrokügelchens
für die
Polymer-Kettenverlängerung
ist in Beispiel 10 dargelegt.
-
In
einer weiteren Ausführungsform
kann die Zurückhaltung
durch chemische Bindung durch Umsetzen der Gel- oder Prä-Gel-Bestandteile
mit Ankergruppen auf dem Mikrokügelchen
erreicht werden. Geeignete Gel-Ankergruppen unterscheiden sich von
solchen, die in der Technik bekannt sind nicht, einschließlich Gruppen,
die Doppelbindungen aufweisen, die für eine Interaktion mit Gel
oder Prä-Gel-Bestandteilen
verfügbar sind.
Solche Ankergruppen können
in das Mikrokügelchen
durch Modifikation nach Mikrokügelchen-Bildung oder
durch Selektion von in geeigneter Weise modifizierten Monomeren
eingebracht werden.
-
Beispielsweise
kann ein Gel-befülltes
Mikrokügelchen
durch Umsetzen eines Aminomethylfunktionalisierten Mikrokügelchens
mit Acryloylchlorid hergestellt werden, um ein acryliertes Mikrokügelchen
herzustellen. Nach Erhitzen in Gegenwart von Prä-Gel-Bestandteilen zum Starten
der Gel-Polymerisation wird angenommen, dass die Doppelbindungen
der Acrylat-Gruppe
mit dem sich bildenden Gel Wechselwirken, was eine kovalente Bindung
des Gels an das Mikrokügelchen
zur Folge hat. Wenn ein acryliertes Mikrokügelchen verwendet wird, schließen geeignete
Prä-Gel-Monomere
beispielsweise Acryloyltyramin-Acetat und Acryloyl sarcosin-Methylester
ein. Wie oben diskutiert können
Ankergruppen in das Mikrokügelchen
durch Modifikation nach Mikrokügelchen-Bildung
oder durch Selektion von geeignet modifizierten Monomeren eingebracht
werden.
-
Verwendung des Mikrokügelchens
zur Immobilisierung von Molekülen
-
Das
Mikrokügelchen
kann als Substrat für
eine breite Vielzahl von Molekülen
verwendet werden, einschließlich
von Polypeptiden und Oligonukleotiden. Das Mikrokügelchen
ist insbesondere zum Immobilisieren von Antikörpern, Lectinen, Enzymen und
Haptenen von Nutzen. Verfahren zur Bindung solcher Moleküle an Polymersubstraten
sind wohl bekannt (siehe beispielsweise Tijssen, P. Laboratory Techniques
in Biochemistry and Molecular Biology: Practice and Theories of
Enzyme Immunoassays New York: Elsevier (1985) auf den Seiten 298–314). Mehrere
solcher Verfahren werden unten kurz beschrieben. Die Verfahren sind
als Beispiele beschrieben und sollen nicht als einschränkend aufgefaßt werden,
weil der Fachmann auf dem Gebiet in einfacher Weise bestimmen kann,
wie diese Verfahren nach dem Stand der Technik zu verwenden oder
zu modifizieren sind, um ein interessierendes Molekül an das
Mikrokügelchen
zu binden.
-
Ein
Polypeptid kann an das Mikrokügelchen über eine
nicht-kovalente Adsorption oder durch kovalente Bindung befestigt
werden. Eine nicht-kovalente Adsorption wird im allgemeinen nicht
spezifischen hydrophoben Wechselwirkungen zugeschrieben und ist
von der Netto-Ladung
des Polypeptids unabhängig.
Ein Polypeptid wird an das Mikrokügelchen durch Behandlung des
Mikrokügelchens
mit einer Pufferlösung,
die das Polypeptid enthält,
befestigt. Geeignete Puffer schließen 50 mM Karbonat, pH 9,6;
10 mM Tris-HCl, pH 8,5, das 100 mM Natriumchlorid enthält; und
Phosphat-gepufferte Salzlösung
ein. Die Polypeptidkonzentration ist im allgemeinen zwischen 1 und
10 μg/ml.
Das Mikrokügelchen
wird typischerweise in dieser Lösung über Nacht
bei 4°C
in einer Feuchtkammer inkubiert. Die Polypeptidadsorptionsniveaus
können
durch teilweise Denaturierung des Polypeptids beispielsweise durch
Exponieren des Polypeptids gegenüber
einer hohen Temperatur, niedrigem pH (beispielsweise 2,5) oder denaturierenden
Mitteln (beispielsweise Urea) erhöht werden.
-
Mehrere
unterschiedliche Verfahren sind für die kovalente Bindung von
Polypeptiden an das Mikrokügelchen
verfügbar.
Bequemerweise kann ein Polypeptid mit einer freien Amino-Gruppe an ein Mikrokügelchen auf
Styrol-Basis beispielsweise durch Behandlung des Mikrokügelchens
mit Glutaraldehyd bei einem niedrigen pH gebunden werden. Das Polypeptid
wird dann zugesetzt und der pH der Lösung wird auf zwischen 8,0
und 9,5 mit 100 mM Karbonat erhöht.
Die Erhöhung
des pHs erhöht
die Reaktivität
des Glutaraldehyds, das das Polypeptid an die Mikrokügelchen-Oberfläche bindet.
Ethylchlorformiat kann für
Glutaraldehyd substituiert werden oder in Kombination mit diesem
im obigen Verfahren verwendet werden.
-
Alternativ
können
die Mikrokügelchen
für eine
kovalente Bindung der Polypeptide funktionalisiert werden. Ein solches
Mikrokügelchen
stellt Ankergruppen bereit, die an das interessierende Polypeptid
binden. Geeignete Anker-Gruppen zur Bindung von Polypeptiden an
Polymere sind wohl bekannt und schließen Hydrazid-Gruppen, Alkylamin-Gruppen
und Sanger's Reagenz
ein. Anker-Gruppen können
in das Mikrokügelchen durch
Modifikation nach Mikrokügelchen-Bildung
oder durch Selektion von in geeigneter Weise modifizierten Monomeren
eingebracht werden.
-
Zusätzlich kann
ein Polypeptid an das Mikrokügelchen über ein
Brückenmolekül gebunden
werden. Dieses Verfahren der Bindung ist für Polypeptide von Nutzen, die
schlecht an das Mikrokügelchen
binden. Solche Polypeptide werden an ein Brückenmolekül gebunden, das eine hohe Affinität für Kunststoff
aufweist, wie beispielsweise Rinderserumalbumin (BSA). Um ein Polypeptid
an ein Mikrokügelchen über eine
BSA-Brücke zu
binden, wird BSA dem Mikrokügelchen
zugesetzt und darauf wird das Polypeptid an das immobilisierte BSA unter
Verwendung eines herkömmlichen
Vernetzers wie beispielsweise Carbodiimid gebunden.
-
In
einer weiteren Ausführungsform
dient das Mikrokügelchen
als Substrat für
ein Oligonukleotid. Das Oligonukleotid kann bequemerweise an ein
Mikrokügelchen
durch Behandlung des Mikrokügelchens
mit einer polykationischen Substanz wie beispielsweise methyliertem
BAS, poly-L-Lysin oder Protaminsulfat adsorbiert werden. Wenn das
Letztere verwendet wird, wird das Mikrokügelchen typischerweise für ungefähr 90 Minuten mit
einer 1% wäßrigen Lösung von
Protaminsulfat gefolgt von mehreren Waschungen mit destilliertem
Wasser behandelt. Das Mikrokügelchen
wird dann trocknen gelassen. Ein Oligonukleotid wird an das behandelte
Mikrokügelchen
durch Zusetzen des Oligonukleotids zum Mikrokügelchen in einer Konzentration
von ungefähr 10 μg/ml in einem
Puffer wie beispielsweise 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, adsorbiert, der 10 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)
und 10 mM Ethylenglykol-bis(β-aminoethylether)N,N,N',N'-tetraessigsäure (EGTA)
enthält.
Im allgemeinen ergibt eine Behandlungszeit von 60 Minuten geeignete
Ergebnisse.
-
Verwendung des Mikrokügelchens
in einer hochdichten Zellkultur
-
Zusätzlich zu
den obigen Anwendungen ist das Mikrokügelchen ebenfalls in einer
Zellkultur von Nutzen. Eine hochdichte Zellkultur erfordert im allgemeinen,
dass Zellen durch kontinuierliche Perfusion mit Wachstumsmedium
genährt
werden. Suspensionskulturen erfüllen
diese Anforderung, jedoch begrenzen Scher-Effekte die Belüftung bei
einer hohen Zellkonzentration. Das Mikrokügelchen schützt die Zellen vor diesen Scher-Wirkungen
und kann in konventionellen Rühr-
oder Airlift-Bioreaktoren verwendet werden.
-
Um
ein Mikrokügelchen
zur Verwendung beim Kultivieren eukaryontischer oder prokaryontischer
Zellen herzustellen wird das Mikrokügelchen im allgemeinen durch
irgendeines der vielen wohl bekannten Sterilisationsverfahren sterilisiert.
Geeignete Verfahren schließen
Bestrahlung, Ethylenoxid-Behandlung und vorzugsweise Autoklavieren
ein. Sterile Mikrokügelchen
werden dann in einem Kulturgefäß mit dem
für die
zu kultivierenden Zellen geeigneten Wachstumsmedium angeordnet.
Geeignete Wachstumsmedien sind wohl bekannt und unterscheiden sich
von den Wachstumsmedien des Stands der Technik für Suspensionskulturen nicht.
Ein Inoculum der Zellen wird zugesetzt und die Kultur wird unter
Bedingungen gehalten, die für
die Zellanlagerung an die Mikrokügelchen
geeignet sind. Das Kulturvolumen wird dann im allgemeinen erhöht und die Kultur
wird in derselben Weise wie in Suspensionskulturen nach dem Stand
der Technik aufrecht erhalten.
-
Mikrokügelchen
können
in einer Zellkultur ohne Modifikation verwendet werden, jedoch können die
Mikrokügelchen
ebenfalls zur Verbesserung der Zell-Bindung bzw. Anlagerung, Wachstum
und der Herstellung spezifischer Proteine modifiziert werden. Beispielsweise
kann eine Vielzahl von Brückenmolekülen verwendet werden,
um die Zellen an die Mikrokügelchen
anzulagern. Geeignete Brücken-Moleküle schließen Antikörper, Lectine,
Glutaraldehyd und Poly-L-lysin ein. Zusätzlich erhöht die Sulfonierung von Mikrokügelchen
wie oben beschrieben die Zell-Anlagerungsraten. Beispiel 11 veranschaulicht
die Verwendung sulfonierter Mikrokügelchen in einer beispielhaften
Säugetierzellkultur.
-
Diese
Erfindung wird weiter durch die nachfolgenden speziellen, jedoch
nicht einschränkenden
Beispiele, veranschaulicht. Verfahren, die konstruktiv auf die Praxis
reduziert sind werden in der Gegenwartsform beschrieben und Verfahren,
die im Labor durchgeführt
wurden, werden in der Vergangenheitsform dargelegt.
-
Beispiel 1
-
A. Mikrokügelchen-Produktion unter Verwendung
wäßriger und Öl-Phasen-Starter
-
Beispielhafte
bevorzugte Mikrokügelchen
werden gemäß der folgenden
Vorschrift hergestellt. Die Endkonzentration jedes Bestandteils
der HIPE und des wäßrigen Suspensionsmediums
ist in Tabelle 1, Studie 4 dargestellt. Tabelle 1 zeigt weiterhin
Studien, bei denen die vorliegende Vorschrift wie gezeigt variiert
wurde. Die Ergebnisse dieser Studien sind in Tabelle 2 dargelegt.
- 1. Herstellen einer Öl-Phase durch Vereinigen von
11,37 g Styrol-basiertem Monomer, 11,25 g DVB, 8,00 g Span 80, 0,27
g AIBN; und 15,00 g Dodecan unter Rühren bei Raumtemperatur.
- 2. Herstellen einer wäßrigen diskontinuierlichen
Phase durch Zusetzen von 0,78 g Kaliumpersulfat zu 94,3 ml destilliertem
Wasser.
- 3. Rühren
der Öl-Phase
bei ungefähr
1.400 UpM und darauf Zusetzen der wäßrigen diskontinuierlichen Phase
zur Öl-Phase
in einer Strömungsgeschwindigkeit
von 20 ml/Minute. Rühren
der vereinigen Phasen bei 1.400 UpM für ungefähr 5–10 Minuten zur Bildung einer
stabilen HIPE.
- 4. Herstellen eines wäßrigen Suspensionsmediums
durch Kombinieren von 2 g Kaliumpersulfat und 3 g Kaolinit-Tonerde
(Georgia Kaolin Co., Inc.) mit 1 Liter destilliertem Wasser. Rühren des
Gemisches bei 700 UpM für
ungefähr
15 Minuten und darauf Einstellen der Rührgeschwindigkeit auf 250 UpM.
- 5. Zusetzen der HIPE tropfenweise zum wäßrigen Suspensionsmedium in
einer Strömungsgeschwindigkeit von
15 ml/Minute in einen 221 Lurexreaktor (Modell Nr. LX6214-1008), bis die Suspension
ungefähr
20% HIPE erreicht.
- 6. Zur Bildung von Mikrokügelchen
Polymerisieren der Suspension durch Erhöhen der Temperatur auf 60°C über Nacht
(ungefähr
18 Stunden) unter Rühren
bei 250 UpM.
- 7. Waschen der sich ergebenden Mikrokügelchen fünf Mal mit Wasser und darauf
Durchführen
einer Aceton-Extraktion in einem Soxhlet-Extraktor für ungefähr einen
Tag. Lufttrocknen lassen der Mikrokügelchen über Nacht. Die Schüttdichte
des sich ergebenden Materials beträgt 0,055 g/ml getrockneter
Mikrokügelchen.
-
B. Mikrokügelchen-Produktion unter Verwendung
eines Öl-Phasen-Starters
-
Beispielhafte
bevorzugte Mikrokügelchen
werden gemäß der folgenden
alternativen Vorschrift hergestellt. Die Endkonzentration jedes
Bestandteils der HIPE und des wäßrigen Suspensionsmediums
ist in Tabelle 3, Studie 7 dargestellt. Tabelle 3 zeigt ebenfalls
Studien, bei denen die anschließende
Vorschrift wie angezeigt variiert wurde. Die Ergebnisse dieser Studien
sind in Tabelle 4 dargelegt.
- 1. In einem 1
Liter Becherglas Herstellen einer Öl-Phase durch Lösen von
0,4 g Ethylzellulose in 30 g Trichlorethan und Zusetzen von 20 g
Styrol-basiertem Monomer, 19,5 g DVB, 22 g Span 80 und 0,9 g Lauroylperoxid.
Vermischen der Bestandteile durch Rühren bei Raumtemperatur.
- 2. Anordnen des Becherglases unter einen Gifford-Wood-Homogenisiermischer
(Modell 1-LV, im Handel erhältlich
von Greerco, Hudson, NH) und Rühren
bei 1.800 bis 4.800 UpM unter langsamem Zusetzen von 850 g entionisiertem
Wasser zur Bildung einer HIPE.
- 3. In einem 2 Liter Glas Zylinderreaktor (von Ace Glass, Vineland,
NJ) Herstellen eines wäßrigen Suspensionsmediums
durch Kombinieren von 120 g Akazien-Gummi mit 800 g entionisiertem
Wasser. Unter Rühren
bei 100 UpM Erhitzen des Gemischs auf 60–70°C für ungefähr 15 Minuten und darauf Abkühlen des Gemisches
auf ungefähr
40°C.
- 4. Zusetzen der HIPE zum wäßrigen Suspensionsmedium
tropfenweise in einer Strömungsgeschwindigkeit von
ungefähr
200 ml/Minute.
- 5. Einstellen der Mischgeschwindigkeit auf zwischen 10 UpM und
300 UpM, abhängig
von der erwünschten Kügelchen-Größe.
- 6. Zur Bildung von Mikrokügelchen
Polymerisieren der Suspension durch Anheben der Temperatur auf 45°C für ungefähr 20 Stunden
unter konstantem Rühren.
- 7. Waschen der sich ergebenden Mikrokügelchen fünf Mal mit Wasser und darauf
Durchführen
einer Aceton-Extraktion gefolgt von einer Methanol-Extraktion in
einem Soxhlet-Extraktor für
jeweils ungefähr
18 Stunden. An der Luft trocknen lassen der Mikrokügelchen über Nacht.
![Figure 00380001](https://patentimages.storage.***apis.com/1d/33/71/3efc255b5a9cec/00380001.png)
![Figure 00390001](https://patentimages.storage.***apis.com/3b/09/2f/932d5b50a06fcd/00390001.png)
![Figure 00400001](https://patentimages.storage.***apis.com/c4/48/d4/51eea09f9b5060/00400001.png)
![Figure 00410001](https://patentimages.storage.***apis.com/53/e9/b7/2ff48ffa28148a/00410001.png)
![Figure 00420001](https://patentimages.storage.***apis.com/72/22/5a/8707aee161b84d/00420001.png)
![Figure 00430001](https://patentimages.storage.***apis.com/53/60/79/db2516e425aa78/00430001.png)
![Figure 00440001](https://patentimages.storage.***apis.com/a8/7e/6c/c4e5850c44055b/00440001.png)
Tabelle 4 Eigenschaften
von Mikrokügelchen
aus den Studien von Tabelle 3 |
Nr. | Ungefähre Schüttdichte
(g/ml) | Mikrokügelchen-Größe* Bereich (μm) |
1 | 0,15 | 100–200 |
2 | 0,12 | 80–200 |
3 | 0,14 | 150–400 |
4 | 0,13 | 50–150 |
5 | 0,15 | 50–150 |
6 | 0,09 | 100–300 |
7 | 0,10 | 30–150 |
- *Die Mikrokügelchen-Ausbeute für jedes
Experiment betrug ungefähr
85–95%.
-
Beispiel 2
-
Funktionalisierung von Mikrokügelchen
zur Absorption von Säuren
unter Verwendung von Amino-Gruppen
-
Diethylamin-funktionalisierte
Mikrokügelchen
werden aus Clormethylstyrol-Mikrokügelchen hergestellt, wie in
Beispiel 1 beschrieben. Die Mikrokügelchen werden über Nacht
luftgetrocknet und im Soxhlet für 15
Stunden mit 200 ml Hexan extrahiert, um übrige nicht polymerisierte
Bestandteile zu entfernen. 5 g Mikrokügelchen werden dann unter Rückflußkühlung mit
150 ml wäßrigem Diethylamin
für 20
Stunden erhitzt. Die sich ergebenden Diethy lamin-funktionalisierten
Mikrokügelchen
sind zu 85% substituiert und weisen eine Kapazität von 1,5 mM/g auf. Ein g dieses
Materials absorbiert 20 ml 1 N Schwefelsäure.
-
Beispiel 3
-
Funktionalisierung von Mikrokügelchen
zur Absorption von Säuren
unter Verwendung von Aminosalzen
-
Um
ein Dihexylammoniumsalz herzustellen werden Dihexylamin-funktionalisierte
Mikrokügelchen
wie oben in Beispiel 3 für
Diethylamin-funktionalisierte Mikrokügelchen beschrieben hergestellt.
1 g Dimethylhexamin-funktionalisierte Mikrokügelchen werden darauf zu 100
ml methanolischer HCl zugesetzt und für 30 Minuten gerührt. Das
Gegenion des sich ergebenden Salzes ist Chlorid. Die Dihexylammoniumchlorid-funktionalisierten
Mikrokügelchen
werden durch Filtration gesammelt, 3 mal mit 50 ml Methanol gewaschen
und über Nacht
luftgetrocknet. Die sich ergebenden Mikrokügelchen sind zu 70% substituiert.
-
Beispiel 4
-
Funktionalisierung von Mikrokügelchen
zur Absorption von Säuren
unter Verwendung quartärer
Ammonium-Gruppen
-
Um
ein Dimethyldecylammonium-Salz herzustellen werden Chlormethylstyrol-Mikrokügelchen
wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Die Mikrokügelchen
werden über
Nacht luftgetrocknet und mit Hexan Soxhlet extrahiert um restliche
nicht polymerisierte Bestandteile zu entfernen. 1 g Mikrokügelchen
werden dann unter Vakuum mit einem 10-fach molarem Überschuß an ethanolischem
Amin befüllt
und für
7 Stunden unter Rückflußkühlung erhitzt.
Das Gegenion des sich ergebenden Salzes ist Chlorid. Die Dimethyldecylammoniumchlorid-funktionalisierten
Mikrokügelchen
werden durch Filtration gesammelt, 2 mal mit 50 ml Ethanol und 2 mal
mit 50 ml Methanol gewaschen und darauf über Nacht luftgetrocknet. Die
sich ergebenden Mikrokügelchen sind
zu 70% substituiert.
-
Beispiel 5
-
Funktionalisierung von Mikrokügelchen
zur Absorption wäßriger Lösungen unter
Verwendung von Aminosalzen
-
Um
ein Dimethylammonium-Salz herzustellen werden Diethylamino-funktionalisierte
Mikrokügelchen wie
in Beispiel 3 beschrieben hergestellt. Die Mikrokügelchen
werden über
Nacht luftgetrocknet und mit Hexan Soxhlet extrahiert, um restliche
nicht polymerisierte Bestandteile zu entfernen. 1 g Mikrokügelchen
werden dann zu 100 ml methanolischer HCl zugesetzt und für 30 Minuten
gerührt.
Das Gegenion des sich ergebenden Salzes ist Chlorid. Die Diethylaminchlorid-funktionalisierten
Mikrokügelchen
sind zu 85% substituiert.
-
Beispiel 6
-
Funktionalisierung von Mikrokügelchen
zur Absorption wäßriger Lösungen unter
Verwendung quartärer
Ammonium-Gruppen
-
Um
ein Dimethyldecylammonium-Salz herzustellen werden Chlormethylstyrol-Mikrokügelchen
wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Die Mikrokügelchen
werden über
Nacht luftgetrocknet und mit Hexan Soxhlet extrahiert, um übrige nicht
polymerisierte Bestandteile zu entfernen. 1 g Mikrokügelchen
werden dann mit 100 ml wäßrigem Amin
für 30
Minuten behandelt. Die sich ergebenden Dimethyldecylammoniumchlorid-funktionalisierten
Mikrokügelchen
sind zu 85% substituiert.
-
Beispiel 7
-
Funktionalisierung von Mikrokügelchen
zur Absorption wäßriger Lösungen unter
Verwendung von Alkoxylat-Gruppen
-
Ethoxylierte
Mikrokügelchen
werden aus Chlormethylstyrol-Mikrokügelchen wie in Beispiel 1 beschrieben
hergestellt. Die Mikrokügelchen
werden über
Nacht luftgetrocknet und mit Hexan Soxhlet-extrahiert, um restliche
nicht polymerisierte Bestandteile zu entfernen. 1 g Mikrokügelchen
werden mit 100 ml der anionischen Form eines Polyethylenglykol (PEG)
enthaltenden 8–9
Ethylenglykolmonomers in überschüssigem PEG als
Lösungsmittel
behandelt. Die Reaktionspartner werden für 2 Stunden auf 95°C erhitzt.
Die sich ergebenden ethoxylierten Mikrokügelchen sind zu 90% substituiert.
-
Beispiel 8
-
Funktionalisierung von Mikrokügelchen
zur Absorption wäßriger Lösungen unter
Verwendung von Sulfonat-Gruppen
-
Sulfonat-funktionalisierte
Mikrokügelchen
werden aus Styrol-Mikrokügelchen
hergestellt, die wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt wurden.
Die Mikrokügelchen
werden unter Vakuum bei 50°C
für 2 Tage
getrocknet. 10 g Mikrokügelchen
werden dann einem 500 ml Kolben zugesetzt, der ein Gemisch aus 200
ml Chloroform und 50 ml Chlorsulfonsäure enthält. Der Kolben wird bei Raumtemperatur
für 2 Tage
geschüttelt.
Die Sulfonat-funktionalisierten Mikrokügelchen werden durch Filtration
gesammelt und nacheinander mit 250 ml jeweils von Chloroform, Methylenchlorid,
Aceton und Methanol gewaschen. Die Mikrokügelchen werden in 300 ml 10%
wäßrigem Natriumhydroxid über Nacht
eingeweicht und darauf mit Wasser gewaschen, bis das Eluat einen
neutralen pH erreicht. Die Schüttdichte
des sich ergebenden Materials beträgt 0,067 g/ml getrockneter Mikrokügelchen
und die Kapazität
beträgt
2,5 mM/g. 1 g dieses Materials absorbiert 23,5 g Wasser.
-
Beispiel 9
-
Herstellung stabiler Kohlenstoff-Strukturen
aus Chlormethylstyrol-Mikrokügelchen
-
3-Chlormethylstyrol
Mikrokügelchen
werden wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt, so dass die Konzentration
des Vernetzungsmittels zwischen 20–40% und das Hohlvolumen 90%
beträgt.
1 g Mikrokügelchen
werden dann in einem elektrisch beheizten Rohrofen angeordnet und
die Temperatur wird in einer sauerstofffreien Stickstoffatmosphäre auf 600°C erhitzt.
Die Geschwindigkeit des Erhitzens wird im allgemeinen unter 5°C pro Minute
gehalten und im Bereich von 180–380°C, wobei
die Erhitzungsgeschwindigkeit 2°C
pro Minute nicht über schreitet.
Nach dem Erhitzungsprozeß werden
die Mikrokügelchen
auf Umgebungstemperatur in einer inerten Atmosphäre abgekühlt um eine Oxidation durch
Luft zu vermeiden.
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Beispiel 10
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Herstellung von Gel-befüllten Mikrokügelchen
zur Verwendung als Substrat für
die Proteinsynthese
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Mikrokügelchen
mit einem Leervolumen von 90%, einer Schüttdichte von 0,047 g/ml, einem
durchschnittlichen Hohlraumdurchmesser im Bereich von 1–50 μm und die
zu 10% vernetzt sind, werden wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt.
Das verwendete Gel ist Poly(N-(2-(4-acetoxyphenyl)ethylacrylamid). Um eine Lösung aus
Gel-Vorläufern
herzustellen, werden 2,5 g Monomer, 0,075 g des Vernetzungsmittels
Ethylenbis(acrylamid) und 0,1 g des Starters AIBN zu 10 ml des Quellmittels
Dichlorethan zugesetzt. Die Gel-Vorläuferlösung wird dann durch Durchspülen mit
Stickstoff desoxygeniert.
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0,7
g Mikrokügelchen
werden der Gel-Vorläuferlösung zugesetzt
und die Polymerisation wird durch Erhitzen des Gemisches auf 60°C gestartet,
während
die Probe auf einem Rotationsverdampfer, der für die Rückflußkühlung modifiziert wurde, rotiert
wird. Das Dichlorethan quillt die Mikrokügelchen auf und ermöglicht es den
Gel-Vorläufern,
in das Mikrokügelchen
einzudringen und ein Polyamid zu bilden, das zwischen die Polymer-Ketten
des Mikrokügelchens
eindringt. Nach einer Stunde werden die Gel-befüllten Mikrokügelchen
(hierin nachstehend als „Gemisch") bezeichnet, mit
50 ml Dimethylformamid (DMF) und 50 ml Diethylether gewaschen und
darauf vakuumgetrocknet. Die Ausbeute an Gemisch beträgt 2,7 g.
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Um
chemische Gruppen innerhalb des Gemisches zu erzeugen werden 0,25
g Gemisch mit 50 ml 5% Lösung
Hydrazinhydrat in DMF für
5 Minuten behandelt. Diese Behandlung ergibt freie Phenol-Funktionalitäten innerhalb
der Gel-Matrix, die als chemische Gruppen für die Peptidsynthese dienen
können.
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Beispiel 11
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Verwendung von Mikrokügelchen
in hochdichten Zellkulturen
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Um
Mikrokügelchen
herzustellen, die für
eine Säugetierzellkultur
geeignet sind, werden sulfonierte Mikrokügelchen wie in Beispiel 8 beschrieben
hergestellt und werden in einer 70% Ethanollösung befeuchtet und bei 121°C für 15 Minuten
autoclaviert. Die Mikrokügelchen
werden dann zwei Mal mit steriler Phosphat-gepufferter Salzlösung und
einmal mit vollständigem
Wachstumsmedium gewaschen. 500 mg der sterilen Mikrokügelchen
werden in einer 500 ml Rollflasche angeordnet, die silikonisiert
wurde, um eine Anlagerung der Zellen an der Flasche zu verhindern.
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Ein
Inoculum von 5 × 107 Baby-Hamster-Nierenzellen in 50 ml Wachstumsmedium
(das 10% fötales Kalbsserum
enthält)
wird der Rollflasche zugesetzt. Das Inoculum wird mit den Mikrokügelchen
für 8 Stunden bei
37°C unter
periodischem Schütteln
inkubiert, um eine Anlagerung der Zellen an die Mikrokügelchen
zu ermöglichen.
Das Kulturvolumen wird dann auf 100 ml erhöht und die Rollflasche wird
mit Luft-CO2 (95:5) Gemisch begast und in
einer Rollvorrichtung angeordnet. Das Wachstumsmedium wird ersetzt,
wenn die Glukosekonzentration unter 1 g/l abfällt.
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Die
nachfolgenden bevorzugten Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung sind unten beschrieben:
Poröse vernetzte
Polymer-Mikrokügelchen
werden mit Hohlräumen
ausgestattet, die durch miteinander in Verbindung stehende Poren
verbunden sind, wobei zumindest einige der Hohlräume im Inneren jedes Mikrokügelchens
mit der Oberfläche
des Mikrokügelchens
in Verbindung stehen, und wobei ungefähr 10% der Mikrokügelchen
im wesentlichen kugelförmig
oder im wesentlichen ellipsoidförmig
oder eine Kombination hiervon sind, wobei die Mikrokügelchen
derart funktionalisiert wurden, dass die funktionalisierten Mikrokügelchen
wäßrige und/oder
organische saure Flüssigkeiten
absorbieren, wobei die funktionalisierten Mikrokügelchen die folgende Struktureinheit
umfassen:
bei der
A eine vernetzte
Kohlenstoff-Kette ist;
Y eine wahlweise Spacer-Gruppe ist;
und
Z eine ionische oder polare funktionelle Gruppe ist;
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(Ausführungsform
1).
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In
den funktionalisierten Mikrokügelchen
von Ausführungsform
1 ist das Verhältnis
der wäßrigen und/oder
organischen Säure-Absorption
durch die funktionalisierten Mikrokügelchen zur Methyloleat-Absorption
größer als
ungefähr
1,2.
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In
den funktionalisierten Mikrokügelchen
von Ausführungsform
1 ist Z aus der Gruppe ausgewählt,
die aus einer Amino- oder substituierten Amino-Gruppe, einer kationischen
quartären
Alkyl-Ammonium-Gruppe mit 8 oder mehr Kohlenstoffatomen, und einer
kationischen quartären
Ammonium-Alkylgruppe von 8 Kohlenstoffatomen oder weniger in Gegenwart
eines Gegenions, d. h. einer organischen Gruppe, die 8 oder mehr Kohlenstoffatome
enthält,
besteht.
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In
den funktionalisierten Mikrokügelchen
der Ausführungsform
1 umfaßt
Z eine ionische oder polare funktionelle Gruppe, ausgewählt aus
der Gruppe, die aus den Spezies 1–3 besteht:
wobei R
2,
R
3, R
4, R
5 und R
6 gleich oder
verschieden sein können
und aus der Gruppe ausgewählt
sind, die aus Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Hydroxyalkyl besteht; oder
R
2 und R
3 den Teil
eines Ringsystems bilden; und
die Anzahl von Kohlenstoffatomen,
die in R
4 + R
5 +
R
6 vorliegt 10 oder mehr für ein kationisches
quartäres
Ammonium ist (3);
die Anzahl der Kohlenstoffatome, die in R
4 + R
5 vorliegen
8 oder mehr für
ein Aminosalz (2) ist; und
das Gegenion X
– ein
organisches oder anorganisches Ion ist.
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In
den funktionalisierten Mikrokügelchen
von oben beträgt
die Anzahl der Kohlenstoffatome, die in R4 +
R5 + R6 vorliegt
weniger als 10 für
ein kationisches quartäres
Ammonium (3); die Anzahl der Kohlenstoffatome, die in R4 +
R5 vorliegt weniger als 8 für ein Aminosalz
(2) und ist das Gegenion eine organischen Gruppe mit 8 oder mehr
Kohlenstoffatomen.
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In
den funktionalisierten Mikrokügelchen
von Ausführungsform
1 ist der Vernetzungsgrad von 1 bis 20%.
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In
den funktionalisierten Mikrokügelchen
von Ausführungsform
1 ist der Vernetzungsgrad von 2 bis 10%.
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In
den funktionalisierten Mikrokügelchen
von Ausführungsform
1 ist das Hohlvolumen der Mikrokügelchen
größer als
95%.
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In
den funktionalisierten Mikrokügelchen
von Ausführungsform
1 ist Funktionalisierungsgrad größer als
50%.
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Ausführungsform
2:
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Poröse vernetzte
Polymer-Mikrokügelchen
werden mit Hohlräumen
versehen, die durch miteinander in Verbindungen stehenden Poren
verbunden sind, wobei zumindest einige der Hohlräume im Inneren jedes Mikrokügelchens
mit der Oberfläche
des Mikrokügelchen
in Verbindung stehen, und wobei ungefähr 10% der Mikrokügelchen
im wesentlichen kugelförmig
oder im wesentlichen elipsoidförmig
oder eine Kombination hiervon sind, wobei die Mikrokügelchen
so funktionalisiert wurden, dass die funktionalisierten Mikrokügelchen wäßrige Flüssig keiten
absorbieren, wobei die funktionalisierten Mikrokügelchen die folgende Struktureinheit umfassen:
bei der A eine vernetzte
Kohlenstoff-Kette ist;
Y eine wahlweise Spacer-Gruppe ist;
und
Z eine ionische oder polare funktionelle Gruppe ist;
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In
den funktionalisierten Mikrokügelchen
von Ausführungsform
2 ist das Verhältnis
von 10% Natriumchlorid-Absorption durch die funktionalisierten Mikrokügelchen
zur Wasserabsorption größer als
0,1.
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In
den funktionalisierten Mikrokügelchen
von oben ist das Verhältnis
von 10% Natriumchlorid-Absorption zur Wasserabsorption größer als
0,5.
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In
den funktionalisierten Mikrokügelchen
von oben ist das Verhältnis
von 10% Natriumchlorid-Absorption zur Wasserabsorption größer als
0,7.
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In
den funktionalisierten Mikrokügelchen
von Ausführungsform
2 ist Z aus der Gruppe ausgewählt,
die aus einer kationischen quartären
Alkyl-Ammoniumgruppe mit 10 Kohlenstoffatomen oder weniger, einer
Aminosalz-Alkylgruppe mit 8 Kohlenstoffatomen oder weniger;
einer
Alkoxylat-Gruppe;
einem Metall-, Ammonium- oder substituiertem
Ammonium-Salz einer Schwefelsäure-,
Karbonsäure-,
Phosphorsäure-
oder Sulfonsäure-Gruppe
besteht, außer
dass, wenn Z eine Sulfonsäure
ist, Y nicht die folgende Struktur aufweist:
wenn m = 0.
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In
den funktionalisierten Mikrokügelchen
von Ausführungsform
2 umfasst Z eine ionische oder polare funktionelle Gruppe, ausgewählt aus
der Gruppe, die aus den Strukturen 1–2 besteht:
bei denen R
2,
R
3 und R
4 gleich
oder verschieden sein können
und aus der Gruppe ausgewählt
sind, die aus einem Alkyl, Cycloalkyl, Aryl und Hydroxyalkyl besteht;
oder R
2 und R
3 den
Teil eines Ringsystems bilden; und die Anzahl von Kohlenstoffatomen,
die in R
2 + R
3 +
R
4 vorliegt weniger als 10 für ein kationisches
quartäres Ammonium
(1) beträgt;
die
Anzahl von Kohlenstoffatomen, die in R
2 +
R
3 vorliegt, weniger als 8 für ein Aminosalz
(2) beträgt;
und
das Gegenion X
– ein anorganisches Ion
oder eine Carboxylat-Gruppe mit weniger als 8 Kohlenstoffatomen
ist.
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In
den funktionalisierten Mikrokügelchen
von Ausführungsform
2 ist Z eine Alkoxylat-Gruppe
mit der Struktur
wobei p 1 bis 680 ist, und
und wobei R
5 eine
Wasserstoff- oder eine Alkyl-Gruppe ist und M ein Metall, ein Ammonium-
oder ein substituiertes Ammoniumkation ist.
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In
den funktionalisierten Mikrokügelchen
von Ausführungsform
2 ist der Vernetzungsgrad von 1 bis 20%.
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In
den funktionalisierten Mikrokügelchen
von Ausführungsform
2 ist der Vernetzungsgrad von 2 bis 10%.
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In
den funktionalisierten Mikrokügelchen
von Ausführungsform
2 ist das Leervolumen bzw. Hohlraumvolumen der Mikrokügelchen
größer als
95%.
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In
den funktionalisierten Mikrokügelchen
von Ausführungsform
2 ist der Funktionalisierungsgrad größer als 50%.
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Ausführungsform
3
-
Poröse vernetzte
Polymer-Mikrokügelchen
werden mit Hohlräumen
versehen, die durch miteinander in Verbindung stehenden Poren verbunden
sind, wobei zumindest einige der Hohlräume im Inneren jedes Mikrokügelchens
mit der Oberfläche
des Mikrokügelchens
in Verbindung stehen, und wobei ungefähr 10% der Mikrokügelchen
im wesentlichen kugelförmig
oder im wesentlichen ellipsoid oder eine Kombination hiervon sind,
wobei die Mikrokügelchen
eine Kohlenstoff-haltige Struktur aufweisen.
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In
den Kohlenstoff-haltigen Mikrokügelchen
von Ausführungsform
3 weisen die Mikrokügelchen
ein Hohlraumvolumen von zumindest 90% und eine Trockendichte von
weniger als 0,25 g/ccm auf.
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Ausführungsform
4
-
Ist
ein Trennverfahren, das folgendes umfasst:
- (i)
das Passieren einer Lösung,
die zumindest zwei Bestandteile aufweist, durch poröse, vernetzte
Polymer-Mikrokügelchen
mit Hohlräumen,
die durch miteinander in Verbindung stehenden Poren verbunden sind,
wobei eine chemische Gruppe, die vorzugsweise mit einem der beiden
Bestandteile interagiert, mit der Oberfläche der Mikrokügelchen
verbunden ist; und
- (ii) Trennen der beiden Bestandteile voneinander.
-
Im
Verfahren nach Ausführungsform
4 ist das Trennverfahren eine Ionen-Austauschchromatographie.
-
Im
Verfahren von Ausführungsform
4 ist die chemische Gruppe an die Oberfläche der Mikrokügelchen gebunden.
-
Im
Verfahren nach Ausführungsform
4 ist die chemische Gruppe an ein Gel oder Prä-Gel innerhalb der Hohlräume der
Mikrokügelchen
gebunden.
-
Ausführungsform
5
-
ist
ein Verfahren, das das Durchleiten einer Lösung, die einen Reaktionspartner
einschließt,
durch poröse,
vernetzte Polymer-Mikrokügelchen
mit durch miteinander in Verbindung stehenden Poren verbundenen Hohlräumen umfasst,
wobei eine chemische Gruppe, die mit dem Reaktionspartner interagiert,
an die Oberfläche
der Mikrokügelchen
gebunden ist, und wobei die chemische Gruppe an die Oberfläche der
Mikrokügelchen
gebunden ist.
-
Im
obigen Verfahren ist die chemische Gruppe an ein Gel oder Prä-Gel innerhalb
der Hohlräume
der Mikrokügelchen
gebunden.
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Ausführungsform
6
-
Poröse vernetzte
Polymer-Mikrokügelchen
werden mit Hohlräumen
bereitgestellt, die durch miteinander in Verbindung stehenden Poren
verbunden sind, wobei zumindest einige der Hohlräume im Inneren jedes Mikrokügelchens
mit der Oberfläche
des Mikrokügelchens
in Verbindung stehen und wobei ungefähr 10% der Mikrokügelchen
im wesentlichen kugelförmig
oder im wesentlichen ellipsoid oder eine Kombination hiervon sind,
wobei die Mikrokügelchen
zusätzlich
ein Gel oder Prä-Gel
innerhalb der Hohlräume
der Mikrokügelchen umfassen,
wobei das Gel oder Prä-Gel
eine chemische Gruppe umfasst, die mit einer chemischen Einheit
interagiert, ausgewählt
aus der Gruppe, die aus einem Bestandteil einer Lösung und
einem Reaktionspartner in einer chemischen Synthese besteht.
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Bei
den Mikrokügelchen
von Ausführungsform
6 bewegt sich die Hohlraum-Größe im Bereich
von 1 bis 100 μm
Durchmesser.
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Bei
den Mikrokügelchen
von Ausführungsform
6 sind die Mikrokügelchen
derart vernetzt, dass die Gegenwart einer Flüssigkeit das Aufquellen eines
Mikrokügelchens
das Trockenvolumen des Mikrokügelchens um
nicht mehr als ungefähr
zwei Mal überschreitet.
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Bei
den Mikrokügelchen
von Ausführungsform
6 liegt das Gewichtsverhältnis
von aufgequollenem Gel zum Mikrokügelchen im Bereich von 60:40
bis 95:5.
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Ausführungsform
7
-
ist
ein Verfahren zur Herstellung von Mikrokügelchen, die ein Gel oder Prä-Gel aufweisen,
das folgendes umfasst:
- (a) Herstellen poröser, vernetzter
Polymer-Mikrokügelchen
mit Hohlräumen,
die durch miteinander in Verbindung stehenden Poren verbunden sind
und
- (b) Ablagern und/oder Zurückhalten
eines Gels oder Prä-Gels
in den Mikrokügelchen-Hohlräumen;
wobei
Schritt (b) ein in Berührung
bringen der Mikrokügelchen
mit einer Lösung
umfasst, die Prä-Gel-Bestandteile
und ein Quelllösungsmittel
für die
Mikrokügelchen
umfasst, für
eine Zeitspanne, die ausreicht, um es den Prä-Gel-Bestandteilen zu ermöglichen,
in die aufgequollenen Mikrokügelchen
einzudringen und ein Gel innerhalb der Hohlräume innerhalb des Mikrokügelchens
zu bilden.
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Ausführungsform
8
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Poröse vernetzte
Polymer-Mikrokügelchen
werden mit Hohlräumen
versehen, die durch miteinander in Verbindung stehenden Poren verbunden
sind, wobei zumindest einige der Hohlräume im Inneren jedes Mikrokügelchens
mit der Oberfläche
des Mikrokügelchens
in Verbindung stehen, und wobei ungefähr 10% der Mikrokügelchen
im wesentlichen kugelförmig
oder im wesentlichen ellipsoid oder eine Kombination hiervon sind,
wobei ein Molekül,
ausgewählt
aus der Gruppe, die aus einem Polypeptid und einem Oligonukleotid
besteht, an die Oberfläche
der Mikrokügelchen
gebunden ist.
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In
den Mikrokügelchen
von Ausführungsform
8 ist das Molekül
ein Polypeptid, ausgewählt
aus der Gruppe, die aus einem Antikörper, einem Lectin, einem Enzym
und einem Hapten besteht.
-
In
den Mikrokügelchen
von Ausführungsform
8 ist das Molekül
an die Oberfläche
der Mikrokügelchen durch
eine Art einer Bindung gebunden, ausgewählt aus der Gruppe, die aus
einer nicht kovalenten Absorption, kovalenten Bindung und Bindung über ein
Brückenmolekül besteht.