JPH10500863A - バチルス・リチェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＰＷＤ−１のケラチナーゼをコードしているＤＮＡ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ケラチナーゼをコードしている単離DNAが開示されている。単離DNAは、（a）図１のバチルス・リチェニフォルミス（Bacillus Licheniformis）PWD-1のケラチナーゼ酵素をコードしている単離DNAと、（b）上記（a）のDNAとハイブリッド形成し、バチルス・リチェニフォルミス（Bacillus Licheniformis）NCIB 6816のズブチリシンカールスベルグセリンプロテアーゼとハイブリッド形成しないオリゴヌクレオチドプローブとハイブリッド形成する単離DNAと、および（c）遺伝子コードの縮重によりヌクレオチド配列が上記（a）および（b）の単離DNAと異なり、かつケラチナーゼ酵素をコードしている単離DNAとのうちのいずれかである。

Description

【発明の詳細な説明】 バチルス・リチェニフォルミス（Bacillus Licheniformis）PWD-1の ケラチナーゼをコードしているDNA 本発明は、USDA（米国農務省）からの補助金による政府援助を受けた。政府は 本発明に対し特定の権利を有する。 技術分野 本発明は、バチルス・リチェニフォルミス（Bacillus Licheniformis）PWD-1 のケラチナーゼをコードしているDNAに関し、羽毛等のケラチンを分解し、それ からアミノ酸を生成するのに有効なケラチナーゼの製造に役立つものである。 発明の背景 羽毛は、家禽産業によって大量に生産される。これらの羽毛は、利用範囲の広 い原材料の安価な供給源である。数ある中で、動物飼料のアミノ酸と消化性タン パク質の安価な供給源として利用できるように、羽毛の分解方法の開発に大きな 関心が寄せられてきた。現在までに開発されている羽毛を動物飼料に変換する方 法には、蒸気による加水分解処理法と蒸気による加水分解処理と酵素処理を組み 合わせた方法がある。Papadopoulos，M.C.，Animal Feed Science and Technolo gy 16:151（1986）、Papadopoulos，M.C.，Poultry Science 64:1729（1985）、 Alderibigde，A.O．et al.，J．Animal Science 1198（1983）、Thomas and Bee son，J.Animal Science 45:819（1977）、Morris et al.，Poultry Science 52: 858（1973）、Moran et al.，Poultry Science 46:456（1967）、Davis et al. ，Processing of poultry by-products and their utilization in feeds，Part I，USDA Util．Res．Rep．no.3，Washington，D.C.（1961）参照のこと。これ らの方法には、蒸気処理により熱に弱いアミノ酸が分解されたり、生成物の 消化性が比較的低い等の欠点があったことから、過酷な蒸気処理を必要としない 経済的で新しい羽毛分解法に対する関心は薄れなかった。従って、本発明の目的 は、蒸気加水分解に依存しないケラチンに富む材料の加水分解法を提供すること である。 更なる目的は、ケラチンに富む材料を高いアミノ酸収率でアミノ酸に変換する 方法を提供することである。 本発明の更なる目的は、消化性が高く、食物タンパク質およびアミノ酸の良質 な供給源となる飼料成分として有用な羽毛の加水分解生成物を提供することであ る。 本発明の更なる目的は、飼料中のケラチンとその他のタンパク質の消化性を改 善するための飼料添加物として利用可能なケラチナーゼ酵素を提供することであ る。 本発明の更なる目的は、食物アミノ酸源として羽毛の加水分解生成物を利用し た経済的な動物飼料を提供することである。本発明の前記およびその他の目的と 本発明の点は下記の概要、詳細な説明、例に詳細に説明されている。 発明の概要 本発明の第一の点は、 （a）図１（配列番号１）のバチルス・リチェニフォルミス（Bacillus Lichen iformis）PWD-1（ATCC Accession No．53757）のケラチナーゼをコードしている 単離DNAと、 （b）60℃で0.3MのNaCl、0.03Mのクエン酸ナトリウム、0.1％のSDSの洗浄の厳 密さによって表される条件で、上記（a）の単離DNAとハイブリッド形成し、上記 （a）の単離DNAと少なくとも65％が相同であり、かつケラチナーゼ酵素をコード している単離DNAと、 （c）上記（a）のDNAと同じハイブリッド形成条件でハイブリッド形成するが 、 バチルス・リチェニフォルミス（Bacillus Licheniformis）NCIB 6816のズブチ リシンカールスベルグセリンプロテアーゼ（バチルス・リチェニフォルミス（Ba cillus Licheniformis）PWD-1の前記プロテアーゼはその変異型に思われる）を コードするDNAと同じハイブリッド形成条件でハイブリッド形成しないオリゴヌ クレオチドプローブとハイブリッド形成する単離DNAと、 （d）遺伝子コードの縮重によりヌクレオチド配列が上記（a）および（b）の 単離DNAと異なり、かつケラチナーゼ酵素をコードしている単離DNAと から成るグループから選択されるケラチナーゼをコードしている単離DNAである 。 本発明の第二の点は、ベクターDNAとケラチナーゼ酵素をコードしている上記 に示すDNAを含む組換えDNA分子である。 本発明の第三の点は、上記の組換えDNA配列を含み、コードされたケラチナー ゼ酵素を発現できる宿主細胞である。 本発明の第四の点は、コードされたケラチナーゼを発現できる条件で上記宿主 細胞を培養し、発現されたケラチナーゼを収集することによるケラチナーゼ酵素 製造方法である。 本発明の前記およびその他の点は、下記の図、具体例、詳細な説明に詳しく説 明されている。 図面の簡単な説明 図１は、バチルス・リチェニフォルミス（Bacillus Licheniformis）PWD-1の ケラチナーゼをコードしている単離DNAの配列とコードされているアミノ酸配列 を示す図である。更に、図１は、バチルス・リチェニフォルミス（Bacillus Lic heniformis）PWD-1とバチルス・リチェニフォルミス（Bacillus Licheniformis ）NCIB 6816のズブチリシンカールスベルグ遺伝子をコードしているアミノ酸の 違いも示している。 発明の詳細な説明 本明細書に開示されているアミノ酸配列は左から右に、アミノ末端からカルボ キシル末端の方向に表示されている。アミノ基とカルボキシル基は配列に表示さ れていない。ヌクレオチド配列は左から右に5'から3'の方向に一本鎖のみによっ て本明細書に表示されている。ヌクレオチドとアミノ酸は、37CFR1.822と確立さ れた利用法に準じて、IUPAC-IUB生化学命名委員会によって推奨される方法で、 あるいは（アミノ酸に関しては）３文字コードにより表されている。例えば、Pa tentIn User Manual，99-102（1990年11月）（米国特許商標庁、Office of the Assistant Commissioner for Patents，Washington，D.C．20231）；Hudson et al.の米国特許第4,871,670号、３欄の20〜43行目を参照すること（本明細書に引 用されたこれらの文献は、引用することによって本明細書中に組み込むことを出 願人は意図している）。 Ａ． ケラチナーゼ酵素をコードしているDNA DNAは、羽毛のようなケラチン供給源を分解するケラチナーゼ酵素をコードし ている。この定義は、このDNAの天然の対立遺伝子の変異を含むことを意図して いる。ケラチナーゼの発現をコードしているその他のDNA配列と上記DNA配列との ハイブリッド形成が可能なハイブリッド形成条件は、一般に高度に厳密な（stri ngency）条件である。例えば、このような配列は、60℃または70℃で0.3MのNaCl 、0.03Mのクエン酸ナトリウム、0.1％のSDSの洗浄の厳密さによって表される条 件で、標準的なin situハイブリッド形成分析において本明細書に開示されてい るDNAとハイブリッド形成することができる。J．Sambrook et al.，Molecular C loning，A Laboratory Manual（第二版、1989年）（Cold Spring Harbor Labora tory）を参照。一般に、ケラチナーゼをコードしており、かつ本明細書に開示さ れているバチルス・リチェニフォルミス（Bacillus Licheniformis）PWD-1のケ ラチナーゼをコードしているDNA配列とハイブリッド形成するDNA配列は、本明細 書に開示されているケラチナーゼの配列と少なくとも65％、70％、75％、80％、 85％、90％あるい は95％以上相同である。 更に、前記配列によりコードされているものと同じケラチナーゼをコードして いるが、遺伝子コードの縮重によりこれらとはコドン配列が異なるDNA配列（ま たはオリゴヌクレオチド）も本発明の一面をなす。遺伝子コードの縮重は、異な る核酸配列により同じタンパク質またはペプチドをコードするものであるが、文 献にて公知である。例えば、Toole et al．の米国特許第4,757,006号、２欄、表 １を参照。 前記配列によりコードされているものと同じケラチナーゼをコードしているが 、部位指定変異誘起法によりこれらとはコドン配列が異なるDNA配列（またはオ リゴヌクレオチド）も本発明の更なる一面をなす。ケラチナーゼ酵素の特性の改 善に有用な部位指定突然変異誘起法は、下記に説明されているように公知である 。Kunkelの米国特許第4,873,192号を参照。 Ｂ． 遺伝子工学技術 遺伝子工学によるクローン化遺伝子、組換えDNA、ベクター、形質転換宿主細 胞、タンパク質およびタンパク質断片の作製法は公知である。Bell et al．の米 国特許第4,761,371号の６欄３行目から９欄65行目、Clark et al．の米国特許第 4,877,729号の４欄38行目から７欄６行目、Schilling et al．の米国特許第4,91 2,038号の３欄26行目から14欄12行目、Wallner et al．の米国特許第4,879,224 号の６欄８行目から８欄59行目を参照。 ケラチナーゼをコードしているDNAは公知の技術のいずれによっても作製でき る。例えば、このDNAは、BIO-RAD社のMUTA-GENE TM Phagemid in vitro突然変異 誘発キットを使用して構成することができる。このキットは、米国特許第4,873, 192号においてKunkelにより報告されている方法に基づいている。（T．Kunkel， Proc Natl．Acad．Sci．USA 82:488（1985）、T．Kunkel et al.，Methods in E nzymol．154:367（1987）も参照）。米国特許第4,873,192号は、二本鎖DNAの非 突然 変異鎖に対する非常に強い選択法を提供する。DNAがdut^-ung^-二重突然変異細菌 の中で合成されると、新生DNAはdut突然変異の結果、チミンの位置に多くのウラ シルを持ち、それによって酵素dUTPaseを不活化し、細胞内dUTP濃度が高くなる 。ung突然変異はウラシルＮ-グリコシラーゼを不活化し、取り込まれたウラシル はDNAの中に残存できる。次に、このウラシルを含む鎖を、所望の突然変異を含 むオリゴヌクレオチドによってプライム（開始）される相補鎖のin vitro合成の 鋳型として利用する。得られた二本鎖DNAは能率的なウラシルＮ-グリコシラーゼ を有する細胞内に形質転換され、ウラシルを含む鎖は高い効率で不活化され、ウ ラシルを含まない残存物質が残り、複製される（一般的な情報はBIO-RADカタロ グ番号170-3576使用マニュアルを参照）。 ケラチナーゼと調節要素をコードしているDNAを含むケラチナーゼ遺伝子は、 選択された、あるいは標的となる核酸配列の増幅により構成される。増幅は適切 な手段のいずれによっても実施できる。一般的には、D．Kwoh and T．Kwoh，Am ．Biotechnol．Lab．8:14（1990）を参照。適切な増幅技術の例としては、ポリ メラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅（一般的には、G．Walker et al.，Proc．Natl．Acad.Sci.USA 89:392（1992）、G．Walker et al.，Nucleic Acids Res．20:1691（1992）参照）、転写に基づく増幅（D．Kwoh et al.，Pro c Natl．Acad．Sci．USA 86:1173（1989）を参照）、自己保持配列複製（または 「3SR」）（J.Guatelli et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:1874（1990） 参照）、Qβレプリカーゼ系（P.Lizardi et al.，Biotechnology 6:1197（1988 ）参照）、核酸配列に基づく増幅（または「NASBA」）（R．Lewis，Genetic Eng ineering News 12 9:1（1992）参照）、修復連鎖反応（すなわち「RCR」）（上 記R．Lewis参照）、およびブーメランDNA増幅（すなわち「BDA」）（上記R．Lew is参照）が含まれるが、これらに限定されない。 前記のようなDNA増幅技術には、目的の標的タンパク質をコードしているDNAに 特異的に結合するプローブ、１対のプローブまたは２対のプローブが含まれる場 合がある。 ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、公知の技術によって実施できる。例えば、 米国特許第4,683,195号、第4,683,202号、第4,800,159号および第4,965,188号を 参照。一般に、PCRは、まずハイブリッド形成条件下に、検出すべき特異的配列 の各鎖に対するあるオリゴヌクレオチドプライマーを用いて（例えば熱に安定な DNAポリメラーゼの存在下に）核酸試料を処理すると、各核酸鎖に相補的な各プ ライマーの伸長生成物が合成される。プライマーはハイブリッド形成する特異的 配列に十分に相補的であり、各プライマーから合成される伸長生成物は、その相 補体から単離された場合には、もう一方のプライマーの伸長生成物合成の鋳型と して利用できる。次に、検出すべき配列が存在する場合には、変性条件で試料を 処理し、プライマー伸長生成物をそれらの鋳型から単離する。これらの段階は、 目的の増幅量が得られるまで、周期的に反復される。増幅配列の検出は、反応生 成物とハイブリッド形成できるオリゴヌクレオチドプローブ（例えば、本発明の オリゴヌクレオチドプローブ）を反応生成物に加えることによって実施でき、そ のプローブとしては、検出可能な標識を付けたプローブを用いる。次に公知の技 術によって、あるいはゲル上で直接視認により標識を検出する。 リガーゼ連鎖反応（LCR）も、公知の技術に従って実施される。例えば、R．We iss，Science 254:1292（1991）を参照。一般に、反応は２対のオリゴヌクレオ チドプローブを用いて実施され、１対は検出されるべき配列の１本の鎖に結合し 、もう１対は検出されるべき配列のもう１本の鎖に結合する。各対は共にその対 応する鎖に完全に重なる。反応は、まず検出されるべき配列の鎖を変性させ（例 えば単離し）、次に熱に安定なリガーゼの存在下に鎖を２対のオリゴヌクレオチ ドプローブと反応させ、オリゴヌクレオチドプローブの各対を共に結合させる。 次に反応生成物を単離し、目的の量まで配列が増幅されるまでこの工程を周期的 に 反復する。次に、PCRに関して記述されている方法により検出することができる 。 ベクターは、複製可能なDNA構成物である。ベクターは、本明細書に示される ケラチナーゼをコードしているDNAを増幅するか、および／または本明細書に示 されるケラチナーゼをコードしているDNAを発現するために使用される。発現ベ クターは、複製可能なDNA構成物であり、ケラチナーゼをコードしているDNA配列 が適切な宿主内でケラチナーゼを発現する適切な調節配列に操作可能なように結 合されている。このような調節配列の必要性は、選択される宿主および選択され る形質転換法によって異なる。一般に、調節配列には、転写プロモーター、転写 を調節する選択されたオペレーター配列、適切なmRNAリボソーム結合部位をコー ドしている配列、転写および翻訳の終結を調節する配列が含まれる。 増幅ベクターは発現調節領域を必要としない。必要とされるのは、通常は複製 起点によって賦与される宿主内複製能と、形質転換細胞の確認を促進する選択遺 伝子だけである。 ベクターには、プラスミド、ウイルス（例えばアデノウイルス、サイトメガロ ウイルス）、ファージ、組み込み可能なDNA断片（すなわち、組換えにより宿主 ゲノムの中に組み込むことができる断片）が含まれる。ベクターは、宿主ゲノム とは独立に複製され、機能する。あるいは場合によってはゲノムそのものに組み 込まれる。発現ベクターは、発現されるべき遺伝子に操作可能なように結合し、 宿主生物内で操作可能なRNA結合部位とプロモーターとを含まなくてはならない 。 DNA領域は、機能的に互いに関係がある場合には、操作可能なように結合され るか、あるいは操作可能なように連結される。例えば、プロモーターは、それが 配列の転写を調節している場合には、コーディング配列に操作可能なように結合 されたり、あるいは、リボソーム結合部位は、それが翻訳できるように配置され ている場合には、コーディング配列に操作可能なように結合される。 形質転換宿主細胞は、組換えDNA技術を用いて作製された本明細書に開示され て いるDNA配列を含むベクターにより形質転換またはトランスフェションされた細 胞である。形質転換宿主細胞は、普通はケラチナーゼを発現するが、ケラチナー ゼDNAをクローニングまたは増幅する目的で形質転換された宿主細胞は、ケラチ ナーゼを発現する必要はない。適切な宿主細胞には、本技術に精通する者にとっ て公知の原核生物宿主細胞のような宿主細胞が含まれる。 原核生物宿主細胞には、大腸菌（E.coli）またはバチルス等のグラム陰性また はグラム陽性菌が含まれる。より高等な真核細胞には、下記の哺乳動物由来の確 立された細胞系が含まれる。宿主細胞の例は、E.coli W3110（ATCC 27,325）、E .coli B、E.coli X1776（ATCC 31,537）、E.coli 294（ATCC 31,446）等である 。広範にわたる適切な原核細胞と微生物のベクターが利用可能である。E.coliは 典型的にpBR322を利用して形質転換される。組換え微生物発現ベクターにおいて 最も多く利用されるプロモーターには、β-ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）お よびラクトースプロモーター系（Chang et al.，Nature 275:615（1978）；およ びGoeddel et al.，Nature 281:544（1979））、トリプトファン（trp）プロモ ーター系（Goeddel et al.，Nucleic Acids Res．8:4057（1980）およびヨーロ ッパ特許公報第36,776号）およびtacプロモーター（H.De Boer et al.，Proc．N atl．Acad．Sci．USA 80:21（1983））含まれる。（原核宿主の発現に関する） プロモーターとシャイン-ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列は、ケラチナーゼを コードしているDNAに操作可能なように結合される。すなわち、これらは、DNAか らのケラチナーゼメッセンジャーRNAの転写を促進するように配置されている。 培養酵母等の真核微生物も、本明細書に開示されている単離DNAを持つベクタ ーにより形質転換できる。例えば、米国特許第4,745,057号を参照。パン酵母（S accharomyces cerevisiae）は、より下等な真核宿主微生物の中では最も多く利 用されるが、多くの他の菌株も一般的に利用可能である。酵母ベクターには、２ ミクロンの酵母プラスミドからの複製起点または自律複製配列（ARS）、プロモ ーター、 本明細書に記載されているケラチナーゼをコードしているDNA、ポリアデニル化 のための配列、および転写終結のための配列、および選択遺伝子を含む。プラス ミドの例としてYRp7がある（Stinchcomb et al.，Nature 282:39（1979）；King sman et al.，Gene 7:141（1979）、Tschemper et al.，Gene 10:157（1980）） 。 酵母ベクター内の適切なプロモーター配列には、メタロチオネインのプロモー ター、3-ホスホグリセレートキナーゼ（Hitzemen et al.，J．Biol．Chem．255: 2073（1980）またはその他の解糖酵素（Hess et al.，J．Adv．Enzyme Reg．7:1 49（1968）およびHolland et al.，Biochemistry 17:4900（1978））が含まれる 。酵母での発現に利用される適切なベクターとプロモーターは、R．Hitzeman et al.，ヨーロッパ特許公報第73,657号に詳細に記述されている。 Ｃ． ケラチナーゼ酵素の調製および利用法 上記のように、ケラチナーゼ酵素は、コードされているケラチナーゼを発現さ せることが可能な条件で上記のように宿主細胞を培養し、発現されたケラチナー ゼを収集することによって、作製できる。宿主細胞は、細胞が増殖する条件で培 養され、次いでコードされたケラチナーゼの発現を誘発する条件で培養できる。 あるいは、細胞はコードされたケラチナーゼの発現と増殖とを同時に誘発できる 。ケラチナーゼは適切な分泌リーダー配列に融合できる。あるいは培養培地内で 発現させ、培地から収集できる。あるいはケラチナーゼを細胞内で発現させ、次 いで細胞を溶解し、細胞溶解物からケラチナーゼを収集できる。一般に、培養し てトランスジェニックしたタンパク質を発現させる適切な技術は全て利用でき、 これは本技術に精通する者にとって公知である。 調製されたケラチナーゼ酵素は、ケラチンに富む材料の分解処理工程に有用で ある。具体的な加水分解処理工程は、Shih et al．の米国特許第5,063,161号お よび第4,959,311号に記載されており、これらは引用することによってすべて本 明細書に組み込まれるものとする。前記のShih et al．の特許は、ケラチナーゼ 酵素 を含む発酵培地を開示している。従って、本発明のケラチナーゼ酵素は発酵培地 の調製に有用である。 調製されたケラチナーゼ酵素は、羽毛の加水分解生成物の生産にも利用できる 。羽毛の加水分解生成物には幾つか利用法がある。例えば、加水分解された羽毛 は、動物飼料の成分として利用できる。同様に、調製されたケラチナーゼ酵素そ のものを動物飼料調製品に組み込むことができる。Shih et al．の米国特許第5, 186,961号には、ケラチナーゼ酵素を含む動物試料の適切な調製法が開示されて いる。Shih et al．の米国特許第5,186,961号は、引用することによってすべて 本明細書に組み込まれる。 調製されたケラチナーゼ酵素は、背景技術において上述されているように、羽 毛生成物からのアミノ酸生成にも有用である。 本発明は、以下の限定することを意図したものではない具体例に詳細に説明さ れている。具体例は説明だけを目的としており、発明の範囲を限定するものでは ない。 例１PCR- ウォーキングによるバチルス・リチェニフォルミス（Bacillus Licheniform is）PWD-1からのケラチナーゼ遺伝子の単離と配列決定 本技術に精通する者にとって公知の技術に従って、臭化シアンを用いてケラチ ナーゼ酵素を切断する。その後、個々に対を成す一連のランダムプライマーと共 に、Ｎ末端アミノ酸配列に対応する5'DNA（N10）配列を固定プライマーとして使 用し、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行う。N10の下流に位置する25-merオリゴ ヌクレオチドプローブとのハイブリッド形成により、N10とランダムプライマー の１つによって増幅された683bpのPCR生成物が得られ、これはケラチナーゼ遺伝 子を含む部分として同定される。遺伝子の3'末端部分も、＋548の位置に設定さ れ、ランダムプライマーと対をなす第二の固定プライマー（I10）を用いて、同 じ方法 で増幅、配列決定される。上流の配列分析も同様の方法で実施した。575bpの上 流領域は、ランダムプライマーと対を成すアンチセンス10-mer固定プライマー（ R10）を用いて、PCRにより増幅される。バチルス・リチェニフォルミス（Bacill us Licheniformis）のケラチナーゼ遺伝子と調節要素を含む完全な1,457bpの配 列は、PCR産物の組み合わせにより決定される。 図１に示すように、同定された遺伝子は、バチルス・リチェニフォルミス（Ba cillus Licheniformis）NCIB 6816のズブチリシンカールスベルグ遺伝子との類 似性が高い。変更部分は、同定されたバチルス・リチェニフォルミス（Bacillus Licheniformis）のケラチン分解プロテアーゼの対応するアミノ酸配列の上に太 字でアミノ酸のカールスベルグ遺伝子の違いとして明らかにされている。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９６年５月２０日 【補正内容】 請求の範囲（補正） １．配列番号１のDNA配列を持ち、ケラチナーゼをコードしている単離DNA分子 。 ２．ベクターDNAと、配列番号２のアミノ酸配列を持つケラチナーゼ酵素をコ ードしている上記請求項１記載の単離DNAとを含む組換えDNA分子。 ３．請求項２記載の組換えDNAを含み、配列番号２のアミノ酸配列を持つケラ チナーゼ酵素を発現できる宿主細胞。 ４．コードされているケラチナーゼを発現させることが可能な条件下で請求項 ３記載の宿主細胞を培養して細胞培養物を得る工程と、上記細胞培養物から上記 ケラチナーゼ酵素を収集する工程とを含むケラチナーゼ酵素の製造方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 リン，シャン アメリカ合衆国、27607 ノース・キャロ ライナ、ローリー、イースト・サウス・キ ング・ヴィレッジ ジー18 (72)発明者 ミラー，エリック・エス アメリカ合衆国、27606 ノース・キャロ ライナ、ローリー、ディアヴュー・ドライ ヴ 6512 【要約の続き】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（a）図１のバチルス・リチェニフォルミス（Bacillus Licheniformis）P WD-1のケラチナーゼ酵素をコードしている単離DNAと、 （b）上記（a）のDNAと同じハイブリッド形成条件でハイブリッド形成す るが、バチルス・リチェニフォルミス（Bacillus Licheniformis）NCIB 6816の ズブチリシンカールスベルグセリンプロテアーゼをコードするDNAと同じハイブ リッド形成条件でハイブリッド形成しないオリゴヌクレオチドプローブとハイブ リッド形成する単離DNAと、 （c）遺伝子コードの縮重によりヌクレオチド配列が上記（a）および（b ）の単離DNAと異なり、かつケラチナーゼ酵素をコードしている単離DNAと から成るグループから選択されるケラチナーゼをコードしている単離DNA。 ２．図１のバチルス・リチェニフォルミス（Bacillus Licheniformis）PWD-1 のケラチナーゼ酵素をコードしている請求項１記載の単離DNA。 ３．図１のDNA配列を持つ請求項１記載の単離DNA。 ４．ベクターDNAと、ケラチナーゼ酵素をコードしている上記請求項１の単離D NAとを含む組換えDNA分子。 ５．請求項４記載の組換えDNAを含み、コードされているタンパク質を発現で きる宿主細胞。 ６．コードされているケラチナーゼを発現させることが可能な条件下で請求項 ５記載の宿主細胞を培養して細胞培養物を得る工程と、上記細胞培養物から上記 ケラチナーゼ酵素を収集する工程とを含むケラチナーゼ酵素の製造方法。 ７．（a）図１のバチルス・リチェニフォルミス（Bacillus Licheniformis）P WD-1のケラチナーゼをコードしている単離DNAと、 （b）60℃で0.3MのNaCl、0.03Mのクエン酸ナトリウム、0.1％のSDSの洗浄 の厳密さによって表される条件で、上記（a）の単離DNAとハイブリッド形成し、 上記（a）の単離DNAと少なくとも65％が相同であり、かつケラチナーゼ酵素をコ ードしている単離DNAと、 （c）遺伝子コードの縮重によりヌクレオチド配列が上記（a）および（b ）の単離DNAと異なり、かつケラチナーゼ酵素をコード化ている単離DNAと から成るグループから選択されるケラチナーゼをコードしている単離DNA。 ８．ベクターDNAと、ケラチナーゼ酵素をコードしている上記請求項７記載の 単離DNAを含む組換えDNA分子。 ９．請求項８記載の組換えDNAを含み、コードされているタンパク質を発現で きる宿主細胞。 １０．コードされているケラチナーゼを発現させることが可能な条件下で請求 項９記載の宿主細胞を培養して細胞培養物を得る工程と、上記細胞培養物から上 記ケラチナーゼ酵素を収集する工程とを含むケラチナーゼ酵素の製造方法。