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Gebiet der Erfindung
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Die
Erfindung betrifft eine neue ppGpp-Synthetase und Expressionssysteme
für die
verbesserte Produktion von interessierenden Proteinen in Gram-positiven
Bakterien, bei denen die Verwendung der neuen ppGpp-Synthetase beteiligt
ist.
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Hintergrund der Erfindung
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In
Gram-positiven Bakterien werden sekretierte Proteine durch eine
Zellmembran und eine Zellwand exportiert, und sie werden dann nachfolgend
in das externe Medium freigesetzt.
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Gram-positive
Bakterien, wie B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. licheniformis,
besitzen eine hohe Kapazität
für die
sekretierende Proteine, und in der Tat werden viele bazilläre extrazelluläre Enzyme
industriell verwendet.
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Eine
Anzahl von Proteinen ist im Sekretionsapparat in gram-positiven
Zellen beteiligt.
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WO 94/19471 beschreibt
ein PrsA-Protein, das beim Sekretionsapparat von Bacilllus beteiligt
ist, und sie beschreibt weiter ein Expressionssystem für die Erhöhung der
Sekretion von interessierenden Exoproteinen, die die Überexpression
des PrsA-Proteins involviert.
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Dedhia
et al. (Biotechnology and Bioengeneering 53: 379–386 (1997) beschreibt Gram-negative E. coli-Stämme, die
weniger als die Wildtypmenge der ppGpp-Synthetase (relA) exprimieren.
Solche Gram-negativen E. coli-Stämme
ergeben eine verbesserte Produktion eines Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT)-Proteins.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Das
Problem, das durch die vorliegende Erfindung gelöst werden soll, ist die Bereitstellung
eines Expressionssystems für
die verbesserte Produktion eines interessierenden Proteins in einem
Gram-positiven Bakterium, z. B. in einem Bacillus-Stamm.
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Die
Lösung
basiert auf klonierten neuen DNA-Sequenzen aus der Bacillus-Spezies
B. subtilis (SEQ ID Nr: 1) und B. amyloliquefaciens (SEQ ID: Nr
3), die beide ein Polypeptid kodieren, das eine ppGpp-Synthetase-Aktivität aufweist.
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Die
neue hier offenbarte Sequenzinformation kann verwendet werden, um ähnliche
DNA-Sequenzen aus
Gram-positiven Bakterien zu klonen, z. B. durch Standard-PCR-Technologie,
vgl. die Arbeitsbeispiele hier (vide infra).
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Diese
DNA-Information stellt die Möglichkeit
bereit, eine Expressionssystem für
die verbesserte Produktion mindestens eines interessierenden Proteins
in einem Gram-positiven Bakterium zu konstruieren, wobei das Gram-positive
Bakterium eine geringere als die Wildtyp-Menge eines Polypeptides
mit ppGpp-Synthetase-Aktivität
exprimiert.
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Demgemäß stellt
die Erfindung in einem ersten Aspekt ein isoliertes Polynucleotid-Molekül bereit,
ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus (a) Polynucleotid-Moleküle, die
ein Polypeptidmolekül
mit einer ppGpp-Synthetase-Aktivität kodieren und eine Nucleotidsequenz
umfassen, wie sie in der SEQ ID Nr 1 von Nucleotid 21 bis Nucleotid
2222 dargestellt ist, (b) Spezieshomologe von (a); (c) Polynucleotid-Moleküle, die
ein Polypeptid kodieren, das eine ppGpp-Synthetase-Aktivität aufweist,
das zu mindestens 70% identisch mit der Aminosäure-Sequenz der SEQ ID Nr: 2 vom Aminosäurerest
1 bis zum Aminosäurerest
734 ist, (d) Moleküle, die
komplementär
zu (a), (b) oder (c) sind, und (e) degenerierte Nucleotid-Sequenzen von (a),
(b), (c) oder (d).
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In
einem zweiten Aspekt wird ein Expressionsvektor bereitgestellt,
der die folgenden operativ verbundenen Elemente aufweist: Tranksriptionspromotor,
DNA-Segment, ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus (a) Polynucleotid-Moleküle, die
ein Polypeptid kodieren, das eine ppGpp-Synthetase-Aktivität aufweist
und eine Nucleotidsequenz umfasst, wie sie in SEQ ID Nr 1 von Nucleotid
21 bis Nucleotid 2222 dargestellt ist, (b) Spezieshomologe von (a);
(c) Polynucleotid-Moleküle,
die ein Polypeptid kodieren, das eine ppGpp-Synthetase-Aktivität aufweist,
das zu mindestens 70% identisch mit der Aminosäure-Sequenz der SEQ ID Nr:
2 vom Aminosäurerest
1 bis zum Aminosäurerest
734 ist, (d) degenerierte Nucleotid-Sequenzen von (a), (b), (c) oder (d),
und ein Transkriptionsterminator.
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In
einem dritten Aspekt wird eine kultivierte Zelle bereitgestellt,
in die ein Expressionsvektor, wie er vorstehend beschrieben wurde,
eingeführt
wurde, wobei die Zelle das Polypeptid exprimiert, das durch das DNA-Segment
kodiert wird.
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Ein
vierter Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein isoliertes
Polypeptid mit einer ppGpp-Synthetase-Aktivität bereit, ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus (a) Polypeptid-Molekülen, die die Sequenz der Aminosure-Reste
umfasst, wie sie in der SEQ ID Nr 2 von dem Aminosäurerest
1 bis zu Aminosäurerest
734 dargestellt sind, (b) Spezieshomologe von (a).
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In
einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Zusammensetzung
bereitgestellt, die ein gereinigtes Polypeptid gemäß der vorliegenden
Erfindung in Verbindung mit einem anderen Polypeptid umfasst.
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In
einem noch anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren
zur Produktion eines Polypeptides nach der vorliegenden Erfindung
bereitgestellt, das das Kultivieren einer Zelle, in die ein Expressionsvektor
eingeführt
wurde, wie er vorstehend beschrieben wurde, wobei die Zelle eine
Polypeptid kodiert, das durch das DNA-Segment kodiert wird, und
Gewinnen des Polypeptides.
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Weiterhin
wird ein Expressionssystem für
die verbesserte Produktion mindestens eines rekombinant exprimierten
interessierenden Proteins in einem Gram-positiven Bakterium bereitgestellt,
wobei das Expressionssystem ein Gram-positives Bakterium umfasst,
das eine geringere als die Wildtyp-Menge eines Polypeptides der
Erfindung exprimiert.
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In
einem letzten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren
zur verbesserten Produktion mindestens eines interessierenden Proteins
in einem Gram-positiven Bakterium, wobei das Verfahren umfasst:
- (i) Kultivieren eines Expressionssystems gemäß der Erfindung
und
- (ii) Reinigen des interessierenden Proteins aus der resultierenden
Kulturbrühe
oder dem Expressionssystem.
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Definitionen
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Bevor
die Erfindung im Detail diskutiert wird, werden zuerst die folgenden
Ausdrücke
definiert.
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Der
Ausdruck „Spezieshomolog" ist dazu gedacht, „Ortholog" und/oder „Paralog" zu umfassen.
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Der
Ausdruck „Ortholog" bezeichnet ein Polypeptid
oder ein Protein, das aus einer Spezies erhalten wird, die Homologie
zu einem analogen Polypeptid oder Protein aus einer anderen Spezies
aufweist.
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Der
Ausdruck „Paralog" bezeichnet ein Polypeptid
oder ein Protein, das aus einer gegebenen Spezies erhalten wird,
die Homologie zu einem distinktem Polypeptid oder Protein aus der
gleichen Spezies aufweist.
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Der
Ausdruck „Expressionsvektor" bezeichnet ein DNA-Molekül, das linear
oder zirkulär
ist, das ein Segment umfasst, das ein interessierendes Protein kodiert,
das operativ mit zusätzlichen
Elementen verbunden ist, die die Transkription ergeben. Solch zusätzlichen
Segmente können
Promotor- und Terminator-Sequenzen umfassen, und sie können optional
einen oder mehrere Replikationsursprünge, einen oder mehrere selektierbare
Marker, einen Enhancer, ein Polyadenylationssignal und dergleichen
umfassen. Expressionsvektor werden im Allgemeinen von Plasmid- oder
Virus-DNA abgeleitet, oder sie können
Elemente von beiden enthalten. Der Expressionsvektor der Erfindung
kann jeder Expressionsvektor sein, der üblicherweise rekombinanten
DNA-Verfahren unterzogen wird, und die Wahl des Vektors wird oft
von der Wirtszelle abhängen,
in die der Vektor eingeführt
werden soll. Somit kann der Vektor ein autonom replizierender Vektor
sein, d. h. ein Vektor, der als extrachromosomale Einheit existiert,
deren Replikation unabhängig
von der chromosomalen Replikation ist, z. B. ein Plasmid. Alternativ
kann der Vektor einer sein, der, wenn er in eine Wirtszelle eingeführt wurde,
in das Wirtszellgenom integriert wird und zusammen mit dem/den Chromosom/en
repliziert wird, in das/die es integriert wurde.
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Der
Ausdruck „rekombinante
Expression" oder „rekombinant
exprimiert", wie
er hier in Verbindung mit der Expression eines Polypeptides oder
Proteins verwendet wird, ist gemäß der Standarddefinition
auf diesem Gebiet definiert. Die rekombinante Expression eines Proteins
wird im Allgemeinen unter Verwendung eines Expressionsvektors, wie
er unmittelbar vorstehend beschrieben wurde, durchgeführt.
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Der
Ausdruck „isoliert", wenn er auf ein
Polynucleotidmolekül
angewendet wird, bezeichnet, dass das Polypeptid aus seiner natürlichen
genetischen Umgebung entfernt wurde und somit frei von anderen fremden oder
unerwünschten
kodierenden Sequenzen ist, und in einer Form vorliegt, die für die Verwendung
in einem gentechnischem Proteinproduktionssystem geeignet ist. Solche
isolierten Moleküle
sind diejenigen, die aus ihrer natürlichen Umgebung getrennt wurden
und sie umfassen cDNA und genomische Klone. Isolierte DNA-Moleküle der vorliegenden
Erfindung sind frei von anderen Genen, mit denen sie üblicherweise
assoziiert sind, aber sie können
natürlich
vorkommende 5'-
und 3'-untranlatierte
Bereiche umfassen, wie Promotoren und Terminatoren. Die Identifikation
einer assoziierten Region wird für
einen Fachmann auf diesem Gebiet evident werden (siehe z. B. Dynan
und Tijan, Nature 316: 774–78,
1985). Der Ausdruck „ein
isoliertes Polynucleotid" kann
alternativ als „kloniertes
Polynucleotid" bezeichnet
werden.
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Wenn
er sich auf ein Protein bezieht, weist der Ausdruck „isoliert" darauf hin, dass
das Protein in einem Zustand gefunden wird, der ein anderer als
die native Umgebung ist. In einer bevorzugten Form ist das isolierte Protein
im Wesentlichen frei von anderen Proteinen, insbesondere anderen
homologen Proteinen (d. h. „homologe
Verunreinigungen",
siehe nachstehend). Es ist bevorzugt, das Protein in einer hoch
gereinigten Form bereit zu stellen, d. h. mehr als 80% rein, bevorzugter
mehr als 95% rein und am bevorzugtesten mehr als 99% rein, bestimmt
mit SDS-PAGE.
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Der
Ausdruck „homologe
Verunreinigungen" bedeutet
jede Verunreinigung (z. B. ein anderes Polypeptid als das Polypeptid
der Erfindung), das aus der homologen Zelle stammt, wo das Polypeptid
der Erfindung ursprünglich
erhalten wird.
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Der
Ausdruck „erhalten
aus", wie er hier
in Verbindung mit einer speziellen mikrobiellen Quelle verwendet
wird, bedeutet, dass das Polynucleotid und/oder Polypeptid von der
speziellen Quelle oder von eine Zelle hergestellt wird, in die ein
Gen aus der Quelle eingeführt
wurde.
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Der
Ausdruck „operativ
verbunden" bezeichnet,
wenn er sich auf ein DNA-Segment bezieht, dass die Segmente so angeordnet
sind, dass sie im Einvernehmen mit ihren beabsichtigten Zwecken
funktionieren, z. B. die Transkription im Promotor initiiert und
durch das kodierende Segment zu Terminator voranschreitet.
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Der
Ausdruck „Polynucleotid" bezeichnet ein einzel-
oder doppelsträngiges
Polymer aus Deoxyribonucleotid- oder Ribonucleotid-Basen, die vom
5'- zum 3'-Ende gelesen werden.
Polynucleotide umfassen RNA und DNA und können aus natürlichen
Quellen isoliert, in vitro synthetisiert oder aus einer Kombination
von natürlichen
oder synthetischen Molekülen
hergestellt werden.
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Der
Ausdruck „Komplemente
der Polynucleotidmoleküle" bezeichnet Polynucleotid-Moleküle, die
eine komplementäre
Basensequenz und eine reverse Anordnung verglichen mit einer Bezugssequenz
aufweisen. Beispielsweise ist die Sequenz 5' ATGCACGGG 3' mit 5' CCCGTGCAT 3' komplementär.
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Der
Ausdruck „degenerierte
Nucleotidsequenz" bezeichnet
eine Sequenz von Nucleotiden, die ein oder mehrere degenerierte
Codons enthält
(verglichen mit einem Referenzpolynucleotidmolekül, das ein Polypeptid kodiert).
Degenerierte Codons enthalten verschiedene Triplets an Nucleotiden,
aber sie kodieren den gleichen Aminosäure-Rest (d. h. GAU- und GAC-Triplets
kodieren jeweils Asp).
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Der
Ausdruck „Promotor" bezeichnet einen
Teil eines Gens, der DNA-Sequenzen enthält, die das Binden der RNA-Polymerase
und die Initiation der Transkription bewirkt. Promotor-Sequenzen werden üblicherweise
aber nicht immer in den 5'-nicht-kodierenden
Regionen des Gens gefunden.
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Der
Ausdruck „Sekretionssignalsequenz" bezeichnet eine
DNA-Sequenz, die ein Polypeptid kodiert (ein „Sekretionspeptid"), das als Komponente
eines größeren Polypeptides
das größere Polypeptid
durch einen Sekretionsweg einer Zelle leitet, in der es synthetisiert
wurde. Das größere Peptid
wird üblicherweise
gespalten, um das Sekretionspeptid während des Durchganges durch
den Sekretionsweg zu entfernen.
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Der
Ausdruck „Expressionssystem" für die verbesserte
Herstellung eines interessierenden Proteins in Gram-positiven Bakterien
bezeichnet ein Gram-positives Bakterium, das weniger als die Wildtyp-Menge
eines Polypeptides exprimiert, das eine ppGpp-Synthestaseaktivität gemäß der Erfindung
hat. Das interessierende Protein kann z. B. ein rekombinant exprimiertes
Protein sein.
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Der
Ausdruck „Wildtyp-Mengen", wie er hier in
Verbindung mit einem unmittelbar vorstehend beschriebenen Expressionssystem
verwendet wird, bezeichnet die Wildtyp(native)-Mengen des Expressionslevels
des Polypeptides der vorliegenden Erfindung, d. h. die Menge der
Expressionsmenge, bevor der Gram-positive Stamm modifiziert wurde,
um geringere Mengen des Polypeptides zu exprimieren.
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Der
Ausdruck „Exoprotein" bezeichnet ein Protein,
das aus einer interessierenden Zelle exkretiert wird. Ein Exoprotein
umfasst im Allgemeinen eine Sekretionssignalsequenz, wie sie vorstehend
beschrieben wurde.
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Der
Ausdruck „ppGpp-Synthetase" bezeichnet ein ppGpp-Synthetase-Enzym,
wie es auf diesem Gebiet definiert ist.
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Die
Synthese von ppGpp wird in E. coli auf mindestens zwei Wegen gesteuert
(Dedhia et al. (Biotechnology and Bioengeneering 53: 379–386 (1997)).
Das Enzym ppGpp-Synthetase I (PSI) (EC 2.7.6.5), die durch das relA-Gen
in E. coli kodiert wird, ist für
die ppGpp-Synthese während
der stringenten Antwort auf die Aminosäure-Deprivation verantwortlich
(Block, R., Haseltine, W. A. 1974. In vitro synthesis of ppGpp and
ppGppp, Seiten 747–761.
In: M. Nomura, A. Tissieres und P. Lengyel (Hrsg.), Ribosomes. Cold
Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor N. Y.). Wenn das Wachstum
des Bakteriums durch die Depletion der primären Kohlenstoffquelle verlangsamt
wird, wird die stringente Antwort durch einen Weg aktiviert, der
vom relA-Gen unabhängig
ist (Hernandez, V. J. Bremer, H. 1991. E. coli ppGpp-Synthetase II-Aktivität requires
spoT. J. Biol. Chem. 266: 5991 5999). Ein zweites Enzym, ppGpp-Synthetase
II (PSII), das durch das spoT-Gen kodiert wird, ist für das katalysieren
der ppGpp-Synthetase verantwortlich (Hernandez, V. J., Bremer, H.
1991. E. coli-ppGpp-Synthetase-Aktivität erfordert
spoT. J. Biol. Chem. 266: 5991–5999).
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In
dem vorliegenden Kontext ist „pppGpp-Synthetase" dazu gedacht, sowohl
ein Enzym mit ppGpp-Synthetase-I-Aktivität (EC 2.7.6.5) und/oder ein
Enzym mit einer ppGpp-Synthetase-II-Aktivität, wie sie
vorstehend beschrieben wurde, abzudecken.
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Alternativ
kann der Ausdruck „ppGpp-Synthetase" als „(p)ppGpp-Synthetase" bezeichnet werden.
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Der
Ausdruck „ppGppSynthetasegen" ist dazu gedacht,
eine DNA-Sequenz abzudecken, die ein Polypeptid mit einer ppGpp-Synthetase-Aktivität kodiert.
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Genaue Beschreibung der Erfindung
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WIE EINE SEQUENZ DER ERFINDUNG VERWENDET
WIRD, UM ANDERRE DARAUF BEZOGENE SEQUENZEN ZU ERHALTEN
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Die
hier offenbarte Sequenzinformation, die sich auf eine Polynucleotidsequenz
bezieht, die eine ppGpp-Synthetase der Erfindung kodiert, kann als
Hilfsmittel verwendet werden, andere homologe ppGpp-Synthetasen
zu identifizieren. Beispielsweise kann die Polymerasekettenreaktion
verwendet werden, um Sequenzen zu amplifizieren, die andere homologe
ppGpp-Synthetasen aus einer Vielzahl von mikrobiellen Quellen kodiert, insbesondere
verschiedene Bacillus-Spezien.
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Für weitere
Details wird hier auf ein Arbeitsbeispiel (vide infra) Bezug genommen.
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ASSAY FÜR AKTIVITÄTSTEST
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Ein
Polypeptid der Erfindung mit einer ppGpp-Synthetase-Aktivität kann hinsichtlich
der ppGpp-Synthetase-Aktivität
nach Standardtestverfahren, die auf diesem Gebiet bekannt sind,
getestet werden, wie durch die Verwendung der UV-Absorption bei
254 nm nach der Nucleotidtrennung durch Ionenpaar-Umkehrphasen – Hochleistungsflüssigkeitschromatografie.
Für weitere
Details wird auf Baracchini er al (Mol Gen Genet (1988) 213: 379–387) Bezug
genommen.
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Ein
interessierendes Protein, das durch Verwendung eines Expressionssystems
der Erfindung hergestellt wurde, kann hinsichtlich der Aktivität nach Standardaktivitätsassays,
die das interessierende Protein betreffen, getestet werden. Insbesondere
wenn das interessierende Protein ein Enzym ist, ist eine Vielzahl
von relevanten Enzymaktivitätstests
auf dem Gebiet beschrieben. Für
einen Fachmann auf dem Gebiet ist es Routinearbeit, insbesondere
hinsichtlich Enzyme, ein geeignetes Assay zu identifizieren, der
sich auf das interessierende Protein bezieht.
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POLYNUCLEOTIDE
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Innerhalb
bevorzugter Ausführungsformen
der Erfindung wird ein isoliertes Polynucleotid der Erfindung an
Regionen ähnlicher
Größe der SEQ
ID Nr: 1 oder einer dazu komplementären Sequenz unter mindestens
mittleren Stringenzbedingungen hybridisieren.
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Insbesondere
werden Polynucleotide der Erfindung an eine doppelsträngige DNA-Sonde
unter mindestens mittleren Stringenzbedingungen, aber vorzugsweise
hohen Stringenzbedingungen, wie sie im Detail nachstehend beschrieben
sind, hybridisieren, die die in den Positionen 21–2222 in
SEQ ID Nr: 1 gezeigte Sequenz umfasst.
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Geeignete
experimentelle Bedingungen zur Bestimmung der Hybridisierung bei
mittleren oder hohen Stringenzbedingungen zwischen einer Nucleotidsonde
und einer homologen DNA- oder RNA-Sequenz umfasst das Voreinweichen
des Filters, der die DNA-Fragmente oder RNA enthält, um in 5 × SSC (Natriumchlorid/Natriumcitrat,
Sambrook et al. 1989) während
10 Minuten zu hybridisieren, und das Prähybridisieren des Filters in
einer Lösung
von 5 × SSC,
5 × Denhardt's Lösung (Sambrook
et al. 1989), 0,5% SDS und 100 μg/ml denaturierter
beschallter Lachsspermien-DNA (Sambrook et al. 1989), gefolgt von
der Hybridisierung in der gleichen Lösung, die eine Konzentration
von 10 ng/ml einer zufällig
geprimten (Feinberg, A. P. und Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem.
132: 6–13), 32P-dCTP-markierten
(spezifische Aktivität > 1 × 109 cpm/μg) Sonde
während
12 Stunden bei ca. 45°C.
Der Filter wird dann zweimal während
30 Minuten in 2 × SSC,
0,5% SDS bei mindestens 60°C
(mittlere Stringenz), bevorzugter mindestens 65°C (mittlere/hohe Stringenz),
noch bevorzugter mindestens 70°C
(hohe Stringenz) und am bevorzugtesten mindestens 75°C (sehr hohe
Stringenz) gewaschen.
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Moleküle, an die
die Oligonucleotidsonde unter diesen Bedingungen hybridisieren,
werden unter Verwendung eines Röntgenfilms
nachgewiesen.
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Wie
früher
bemerkt wurde, umfassen die isolierten Polynucleotide der Erfindung
DNA und RNA. Verfahren zur Isolierung von DNA und RNA sind auf dem
Gebiet gut bekannt.
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Gesamt-RNA
kann unter Verwendung der Guanidin-HCl-Extraktion, gefolgt von der
Isolierung durch Zentrifugation in einem CsCl-Gradienten erfolgen
(Chirgwin et al., Biochemistry 18: 52–94 1979). Poly (A)+-RNA wird aus der Gesamt-RNA unter Verwendung
des Verfahrnes von Aviv und Leder (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:
1408–1412)
hergestellt. Komplementäre
DNA (cDNA) wird aus Poly (A)+-RNA unter
Verwendung bekannter Verfahren hergestellt. Polynucleotide, die
Polypeptide kodieren, die eine ppGpp-Synthetase-Aktivität der Erfindung aufweisen,
werden dann identifiziert und isoliert, z. B. durch Hybridisierung
und PCR.
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Die
vorliegende Erfindung stellt weiterhin Gegenstück-Polypeptide oder -Polynucleotide
aus verschiedenen bakteriellen Stämmen (Orthologe und Paraloge)
bereit. Von besonderem Interesse sind die ppGpp-Synthetase-Polypeptide
aus Gram-positiven Stämmen,
einschließlich
Spezien aus Bacillus, wie Bacillus subtilis, Bacillus lentus, Bacillus
brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus
amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus
lautus, Bacillus thuringiensis, Bacillus clausii oder insbesondere Bacillus
licheniformis.
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Das
Polynucleotid der Erfindung, das in SEQ ID Nr: 1 gezeigt ist, wird
aus dem Bacillus subtilis Stamm 168 (NCIB 10106) erhalten.
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Spezieshomologe
eines Polypeptides mit einer ppGpp-Synthetase-Aktivität der Erfindung
können
unter Verwendung der Information und der Zusammensetzungen kloniert
werden, die durch die vorliegende Erfindung in Verbindung mit konventionelle
Klonierungstechniken bereitgestellt werden. Beispielsweise kann eine
cDNA unter Verwendung von mRNA kloniert werden, die aus einem Zelltyp
gewonnen wurde, der das Protein exprimiert. Geeignete Quellen an
mRNA können
durch Testen mit Northern-Blots mit Sonden identifiziert werden,
die aus den hier offenbarten Sequenzen konstruiert wurden. Eine
Bibliothek wir dann aus der mRNA einer positiven Zelle gewonnen.
Eine cDNA, die ein Polypeptid mit einer ppGpp-Synthetase-Aktivität der Erfindung
kodiert, kann dann durch eine Vielzahl von Verfahren isoliert werden,
wie das Sondieren mit einer vollständigen oder partiellen cDNA
oder mit einer oder mehrer Sets einer degenerierten Sonde, basierend
auf den offenbarten Sequenzen. Eine cDNA kann auch unter Verwendung
der Polymerasekettenrekaion oder PCR (Mullie,
US-Patent 4,683,202 ) kloniert werden,
wobei Primer verwendet werden, die von den hier offenbarten Sequenzen
konstruiert werden. In einem zusätzlichen
Verfahren kann die cDNA-Bibliothek verwendet werden, um Wirtszellen
zu transformieren oder transfizieren, und die Expressionder interessierenden
cDNA kann mit einem Antikörper
gegen relA-bac oder durch einen Aktivitätstest, der sich auf ein Polypeptid
mit einer ppGpp-Synthetase-Aktivität bezieht, detektiert werden. Ähnliche
Techniken können
auch für
die Isolierung genomischer Klone angewendet werden.
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POLYPEPTIDE
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch isolierte ppGpp-Synthetase-Polypetide
bereit, die im Wesentliche homolog zu den Polypeptiden der SEQ ID
Nr: 2 und ihren Spezieshomologen (Paraloge und Orthologe) sind.
Der Ausdruck „im
wesentlichen homolog" wird
hier verwendet, um Polypeptide zu bezeichnen, die mehr als 70%,
bevorzugt mindestens 80% Sequenzidentität zu den in SEQ ID Nr: 2 gezeigten
Sequenz oder ihren Orthologen oder Paralogen aufweist. Solche Polypeptide
werden vorzugsweise zu mindestens 90% identisch und am bevorzugtesten
95% oder mehr mit der SEQ ID Nr: 2 oder seinen Orthologen oder Paralogen
identisch sein. Die prozentuale Sequenzidentität wird durch herkömmliche
Verfahren bestimmt, mittels auf dem Gebiet bekannter Computerprogramme,
wie GAP, das in dem GCG-Programmpacket bereitgestellt wird (Programmmanual
für das
Wisconsin-Packet, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group,
575 Science Drive, Madision, Wisconsin, USA 53711) (Needleman, S.
B. und Wunsch C. D. (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443–453). GAP
wird mit den folgenden Einstellungen für den Polypeptidvergleich verwendet:
GAP-Creationpenalty von 3,0 und GAP-Extensionspenalty von 0,1.
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Die
Sequenzidentität
von Polynucleotidmolekülen
wird durch ein ähnliches
Verfahren bestimmt, wobei GAP mit den folgenden Einstellungen für den DNA-Sequenzvergleich
verwendet wird: GAP-Creationpenalty von 5,0 und GAP-Extensionpenalty
von 0,3.
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Im
Wesentlichen homologe Proteine und Polypeptide sind dadurch charakterisiert,
dass sie eine oder mehrer Aminosäure-Subtitutionen,
-Deletionen oder -Additionen aufweisen. Diese Änderungen sind vorzugsweise
von geringer Natur, d. h. konservative Aminosäuresubstitutionen (siehe Tabelle
2) und andere Substitutionen, die die Faltung oder Aktivität des Proteins
oder Polypeptides nicht signifikant beeinflussen, kleine Deletionen
typischerweise von einer bis etwa 30 Aminosäuren, und kleine Amino- oder
Carboxyl-terminale
Extensionen, wie einen terminalen Methionin-Rest, ein kleines Linkerpeptid
von bis zu 20 bis 25 Resten, oder eine kleine Extension, die die
Reinigung erleichtert (ein Affinitätstag), wie einen Polyhistidinteil,
Protein A (Nilsson et al., EMBO J. 4: 1075, 1985, Nilsson et al.,
Methods Enzymol. 198: 3, 1991, siehe im Allgemeinen Ford et al.,
Protein Expression and Purification 2: 95–107, 1991. DNA-kodierende
Affinitätstags
sind von kommerziellen Lieferanten erhältlich, (z. B. Pharmacia Biotech,
Piscataway, NJ, New England Biolabs, Beverly, MA). Tabelle
2 Konservative
Aminosäuresubstitutionen
| Basisch: | Arginin |
| | Lysin |
| | Histidin |
| Sauer: | Glutaminsäure |
| | Aspartinsäure |
| Polar: | Glutamin |
| | Asparagin |
| Hydrophob: | Leucin |
| | Isoleucin |
| | Valin |
| Aromatisch: | Phenylalanin |
| | Tryptophan |
| | Tyrosin |
| Klein: | Glycin |
| | Alanin |
| | Serin |
| | Threonin |
| | Methionin |
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Zusätzlich zu
den 20 Standardaminosäuren,
können
nicht-Standardaminosäuren
(wie 4-Hydroxyprolin,
6-N-Methyllysin, 2-Aminoisobuttersäure, Isovalin und a-Methylserin)
für Aminosäurereste
eines Polypeptides der Erfindung substituiert sein. Eine beschränkte Anzahl
nicht-konservativer Aminosäuren,
Aminosäuren, die
nicht durch den genetischen Code kodiert werden, und unnatürliche Aminosäuren können für die Aminosäurereste
substituiert sein. „Unnatürliche Aminosäuren" wurden nach der
Proteinsynthese modifiziert und/oder besitzen eine chemische Struktur
in ihrer/ihren Seitenkette/n, die von denen der Standardaminosäuren verschieden
sind. Unnatürliche
Aminosäuren
können
chemisch synthetisiert werden oder sind vorzugsweise kommerziell
erhältlich,
und umfassen Pipecolinsäure
(„pipecolic
acid"), Thiazolidincarbonsäure, Dehydroprohn
3- und 4-Methylprolin
und 3,3-Dimethylprolin.
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Essentielle
Aminosäuren
in dem ppGpp-Synthetase-Polypeptid der vorliegenden Erfindung können mit
Standardverfahren auf dem Gebiet identifiziert werden, wie die ortsspezifische
Mutagenese oder die Alaninscanninmutagenese (Cunningham und Wells,
Science 244: 1081–1085,
1989). In letzterer Technik werden einzelne Alaninmutationen in
jedem Rest in dem Molekül
eingeführt,
und die resultierenden Moleküle
werden hinsichtlich der biologischen Aktivität (d. h. ppGpp-Synthetase-Aktivität) getestet,
um Aminosäurereste
zu identifizieren, die für
die Aktivität
des Moleküls
kritisch sind, siehe Nilton et al, J. Biol. Chem. 271: 4699–4708, 1996.
Stellen für
Liganden-Rezeptor- oder andere biologische Interaktionen könne auch
durch die physikalische Analyse der Struktur bestimmt werden, wie
sie durch solche Technike wie Kernspinresonanz, Kristallographie,
Elektronendiffraktion oder Photoaffinitätsmarkierung in Verbindung
mit der Mutation der putativen Kontaktstellenaminosäuren bestimmt
werden, siehe z. B. de Vos et al., science 255: 306–312 1992,
Smith et al., J. Mol. Biol. 224: 899–904, 1992, Wlodaver et al.,
FEBS Lett. 309: 59–64,
1992. Die Identitäten
essentieller Aminosäuren
kann auch aus der Analyse der Homologie mit Polypeptiden abgeleitet
werden, die mit einem Peptid der Erfindung verwandt sind.
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Multiple
Aminosäuresubstitutionen
können
erzeugt und getestet werden, wobei bekannte Verfahren der Mutagenese,
der Rekombination und/oder des Shuffling („shuffling"), gefolgt von relevanten Screeningverfahren
eingesetzt werden, wie die bei Reidhaar-Oolson und Sauer (Science
241: 5357, 1988), Bowie und Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:
2152–2156,
1989),
WO95/17413 oder
WO 95/22625 offenbart sind.
Kurz dargestellt beschreiben die Autoren Verfahren für die simultane
Randomisierung von zwei oder mehr Positionen in einem Polypeptid
oder die Rekobination/das Shuffling von verschiedenen Mutationen
(
WO95/17413 ,
WO 95/22625 ), gefolgt von
der Selektion hinsichtlich der Funktionalität eines Polypeptides, und dann
dem Sequenzieren des mutagenisierten Polypeptides, um das Spektrum
der erlaubbaren Substitutionen an jeder Pposition zu bestimmen.
Andere Verfahren, die verwendet werden können umfassen das Phagendisplay
(z. B. Lowman et al., Biochem. 30: 108832–10837, 1991; Ladner et al.,
US-Patent Nr. 5,223,409 ,
Huse WIPO-Veröffentlichung
WO 92/06204 ) und regionspezifische
Mutagenese (derbyshire et al., Gene 46: 145, 1986; Ner et al., DNA
7: 127. 1988).
-
Mutagenese/Shuffling-Verfahren,
wie sie vorstehend offenbart sind, können mit automatisierten Hochdurchsatz-Screening-Verfahren
kombiniert werden, um die Aktivität von klonierten, mutagenisierten
Polypeptiden in Wirtszellen nach zu weisen. Mutagenisierte DNA-Moleküle, die
aktive Polypeptide kodieren, können aus
den Wirtszellen gewonnen werden und schnell unter Verwendung von
modernem Equipment sequenziert werden. Diese Verfahren ermöglichen
die schnelle Bestimmung der Wichtigkeit von individuellen Aminosäureresten
in einem interessierenden Polypeptid, und kann auf Polypeptide mit
unbekannter Struktur angewendet werden.
-
Unter
Verwendung der vorstehend diskutierten Verfahren kann ein normaler
Fachmann eine Vielzahl von Polypeptiden identifizieren und/oder
herstellen, die im Wesentlichen homolog zu den Resten 1 bis 734
der SEQ ID Nr: 2 sind und die ppGpp-Synthetase-Aktivität des Wildtyp-Proteins
erhalten.
-
PROTEINHERSTELLUNG
-
Die
Polypeptide der vorliegenden Erfindung, einschließlich der
Proteine in voller Länge,
Fragmente davon und Fusionsproteine, können in gentechnisch veränderten
Wirstzellen nach konventionellen Techniken hergestellt werden. Geeignete
Wirtszellen sind solche Zelltypen, die mit einer exogenen DNA transformiert oder
transfiziert werden können
und in Kultur wachsen, und sie umfassen Bakterien- und Pilzzellen
und kultivierte höhere
eukaryotische Zellen. Bakterienzellen, insbesondere kultivierte
Zellen Gram-positiver Organismen, sind bevorzugt. Gram-positive
Zellen aus der Gattung Bacillus sind besonders bevorzugt, wie Bacillus subtilis,
Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus
alkalophilus, Bacillus amyloloquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus
circulans, Bacillus lautus, Bacillus thuringiensis, Bacillus clusii
oder insbesondere Bacillus licheniformis.
-
Techniken
für die
Manipulation klonierter DNA-Moleküle und die Einführung exogener
DNA in eine Vielzahl von Wirtszellen sind in Sambrook et al., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Ausubel et al., (Hrsg.) Current
Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987,
und (Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria, Sonensheim
et al., 1993, American Society for Microbiology, Washington D. C)
beschrieben.
-
Im
Allgemeinen wird eine DNA-Sequenz, die ein ppGpp-Synthetase-Polypeptid
der vorliegenden Erfindung kodiert, operativ mit anderen genetischen
Elementen verbunden, die für
seine Expression erforderlich sind, die im Allgemeinen einen Transkritpitonspromotor
und einen Terminator in einem Expressionsvektor umfassen. Der Vektor
wird üblicherweise
einen oder mehrere selektierbare Marker und einen oder mehrere Replikationsursprünge enthalten,
obwohl der Fachmann erkennen wird, dass in bestimmten Systemen selektierbare
Marker auf einem separatem Vektor bereitgestellt werden können, und
die Replikation der exogenen DNA kann durch die Intergration in
das Wirtszellgenom bewirkt werden. Die Auswahl von Promotoren, Terminatoren,
selektierbaren Marker, Vektoren und anderen Elementen ist für den Fachmann
auf diesem Gebiet eine Routineangelegenheit. Viele solcher Elemente
sind in der Literatur beschrieben und sind von kommerziellen Lieferanten
erhältlich.
-
Um
ein Polypeptid in den Sekretionsweg der Wirtszelle zu leiten, wird
eine Sekretionssignalsequenz (auch bekannt als Leadersequenz, Preprosequenz
oder Presequenz) in dem Expressionsvektor bereitgestellt. Die Sekretionssignalsequenz
kann die des Polypeptides sein, oder sie kann von einem anderen
sekretierten Protein stammen oder de novo synthetisiert werden.
Die Sekretionssignalsequenz ist mit der DNA-Sequenz in korrektem
Leseraster verbunden. Die Sekretionssignalsequenzen werden üblicherweise
5' zu der DNA-Sequenz,
die das interessierende Polypeptid kodiert, positioniert, obwohl
bestimmte Signalsequenzen irgendwo in der interessierenden DNA-Sequenz
positioniert sein können
(siehe z. B. welch et al.,
US-Patent
Nr. 5,037,743 , Holland et al.,
US Patent Nr. 5,143,830 ).
-
Transformierte
oder transfizierte Wirtszellen werden gemäß üblichen Verfahren in einem
Kulturmedium kultiviert, das Nährstoffe
und andere Komponenten enthält,
die für
das Wachstum der ausgewählten
Wirtszellen erforderlich ist. Eine Vielzahl von geeigneten Medien,
einschließlich
definierter Medien und komplexer Medien, sind auf dem Gebiet bekannt,
und im Allgemeinen umfassen sie eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle,
essentielle Aminosäuren,
Vitamine und Mineralien. Die Medien enthalten auch solche Komponenten
wie Wachstumsfaktoren oder Serum, wie es erforderlich ist. Das Wachstumsmedium
wird im Allgemeinen hinsichtlich Zellen selektieren, die die exogen
zugegebene DNA enthalten, z. B. durch Arzneimittelselektion oder
Defizienz in einem essentiellen Nährstoff, der durch den selektierbaren
Marker, der auf dem Expressionsvektor getragen wird oder in die
Wirtszelle co-transfiziert ist, komplementär ist.
-
PROTEINISOLIERUNG
-
Expremierte
rekombinante Polypeptide (oder chimäre Polypeptide) können unter
Verwendung von Fraktionierungs- und/oder konventionellen Reinigungsverfahren
und Medien gereinigt werden. Die Ammoniumsulfatpräzipitation
und die saure oder chaotrope Extraktion können für die Fraktionierung von Proben
verwendet werden. Beispielhafte Reinigungsschritte können Hydoxyapatit-,
Größenausschluss-,
FPLC- und Umkehrphasen-Hochleistungsflüssig-Chromatographie
umfassen. Geeignete Anionenaustauschermedien umfassen derivatisierte
Dextrane, Agarose, Cellulose, Polyacrylamid, spezielle Silica und
der gleichen. PEI-, DEAE-, QAE- und Q-Derivate sind bevorzugt, wobei
die DEAE-Fast-Flow-Sepharose
(Pharmacia, Piscataway, NJ) besonders bevorzugt ist. Beispielhafte
Chromatographiemedien umfassen die Medien, die mit Phenyl-, Butyl-
oder Octyl-Gruppen derivatisiert sind, Wie Phenyl-Sepharose FF (Pharmacia),
Toyopearl-Butyl 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), Octyl-Sepharose
(Pharmacia) und dergleichen, oder Polyacrylharze, wie Amberchrome
CG 71 (Toso Haas) und dergleichen. Geeignete feste Träger umfassen
Glasskügelchen,
auf Silica basierende Harze, Celluloseharze, Agarosekügelchen,
vernetzte Agarosekügelchen,
Polystyrolkügelchen, vernetzte
Poylacrylamidharze un der geleichen, die unter den Bedingungen,
bei denen sie verwendet werden sollen, unlöslich sind. Diese Träger können mit
reaktiven Gruppen modifiziert sein, die das Anbinden des Proteins
durch Amino-Gruppen,
Carboxyl-Gruppen, Sulfhydryl-Gruppen, Hydroxyl-Gruppen und/oder
Kohlenhydrat-Resten ermöglicht.
Beispiele der Kopplungschemie umfassen die Cyanobromid-Aktivierung,
die N-Hydroxysuccinimid-Aktivierung, die Epoxid-Aktivierung, die
Sulfhydryl-Aktivierung, die Hydrazin-Aktivierung und die Carboxyl-
und Amino-Derivate
für die
Carbodiimid-Kopplungschemie. Diese und andere feste Materialien
sind gut bekannt und werden weit verbreitet auf diesem Gebiet benutzt,
und sie sind von kommerziellen Lieferanten erhältlich.
-
Die
Auswahl eines besonderen Verfahrens ist Gegenstand von Routineüberlegungen
und wird zum Teil durch die Eigenschaften des gewählten Trägers bestimmt,
siehe zum Beispiel Affinity Chromatography: Principles & Methods, Pharmacia
LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden, 1988.
-
Es
ist bevorzugt, das Protein zu > 80%
Reinheit, vorzugsweise zu > 90%
Reinheit, besonders bevorzugt zu > 95%
Reinheit zu reinigen, und insbesondere bevorzugt ist ein nahezu
vollständiger
Reinheitszustand, d. h. mehr als 99,9% Reinheit in Bezug auf verunreinigende
Makromoleküle,
insbesondere andere Proteine und Nukleinsäuren, und frei von infektiösen oder
pyrogenen Mitteln. Vorzugsweise ist ein gereinigtes Protein im Wesentlichen
frei von anderen Proteinen, insbesondere anderen Proteinen bakteriellen
Ursprungs und insbesondere Gram-positiven bakteriellem Ursprung.
Der Reinheitsgrad wird durch SDA-PAGE bestimmt.
-
Die
Polypeptide der Erfindung oder Fragmente davon können auch mittels chemischer
Synthese hergestellt werden. Die Polypeptide der Erfindung können Monomere
oder Multimere sein, sie können
glycosyliert oder nicht glycosyliert sein, sie können pegyliert oder nicht pegyliert
sein und sie können
oder können
nicht einen initialen Methionin-Aminosäure-Rest umfassen.
-
VERWENDUNGEN DER POYNUCLEOTIDE/POYLPEPTIDE
-
Die
hier offenbarte Information bezüglich
eines Polypeptides mit einer ppGpp-Synthetase-Aktivität der Erfindung ist essentiell,
um eine Expressionsystem zur verbesserten Herstellung eines interessierenden
Proteins in Gram-positiven Bakterien zu konstruieren, wie es detailliert
nachfolgend beschrieben wird.
-
EXPRESSIONSSYSTEM FÜR DIE ERHÖHUNG DER SEKRETION EINES EXOPROTEINS
IN GRAM-POSITIVEN BAKTERIEN
-
Ein
Aspekt der vorliegenden Beschreibung beschreibt ein Expressionssystem
für die
verbesserte Produktion mindestens eines rekombinant exprimierten
interessierenden Proteins in Gram-positiven Bakterien, wobei das
Expressionssystem ein Gram-positives Bakterium umfasst, das weniger
als die Wildtyp-Mengen eines Polypeptides der Erfindung exprimiert.
-
Vorzugsweise
ist das interessierende Protein ein Exoprotein.
-
Vorzugsweise
bezeichnet der Ausdruck „Expressionssystem
für die
verbesserte Produktion mindestens eines interessierenden Proteins" ein Expressionssystem
mit einer oder mehreren verbesserten Eigenschaften, die unmittelbar
danach beschrieben werden.
-
Verbesserte
Eigenschaften für
ein Expressionssystem der Erfindung umfassen Eigenschaften, wie eine
verbesserte Fähigkeit
zur Benutzung des Wachstumsmediums, eine Fähigkeit, zu einer höheren Zelldichte
zu wachsen, die Fähigkeit,
in einem Minimalmedium zu wachsen, Sporulationsdefizienz des Produktionswirtes,
erhöhte
Expression des interessierenden Proteins, entweder gemessen hinsichtlich
der Menge des interessierenden Proteins, das in der Fermentationsbrühe akkumuliert
wurde, oder als Produktion des interessierenden Proteins pro Zellmasse
pro Zeiteinheit, die verminderte Tendenz der Fermentationsbrühe, Schaum zu
bilden, die verminderte Viskosität
der Fermentationsbrühe,
der verminderte Abbau des Proteinprodukts, das im Produktionswirt
hergestellt wird, die verminderte Tendenz des Produktionsorganismus,
zu lysieren (verminderte Autolyse), ein höherer Anteil hoch produzierender
Zellen in der Produktionskultur, eine verminderte Bildung von Pigmenten
oder gefärbten
Verbindungen während
der Fermentation und verbesserte Fermentationsbrühen, die mehr, leichter und
effizientere Gewinnungsschritte erlauben und somit in einer verbesserten
Gewinnungsausbeute resultieren.
-
Wie
vorstehend beschrieben wurde, ist ein relA-Bac-Polypeptid der Erfindung
ein Polypeptid, das eine ppGpp-Synthetase-Aktivität aufweist.
-
Vorteile,
weniger als die Wildtyp-Mengen von ppGpp im Produktionsorganismus
zu haben: ppGpp ist ein echtes Alarmon („alarmone"), d. h. seine Konzentration ist unter
normalen Wachstumsbedingungen sehr gering (P. Neubauer et al. (J.
of Biotechnology (1995) 43: 195–204))
und die intrazelluläre
Konzentration von ppGpp erhöht
sich schnell, wenn der Organismus Mangelbedingungen oder anderen
Stressfaktoren ausgesetzt wird. Wenn die intrazelluläre ppGpp-Konzentration
erhöht
wird, nimmt die Konzentration der ribosomalen RNA (rRNA) ab, was
wiederum resultieren kann in:
- • Verminderte
Translation und dadurch eine Abnahme der erwünschten Proteinproduktion.
- • Höhere Instabilität einer
gegebenen mRNA, da die Anzahl der Ribosomen, mit der die mRNA beladen
ist, vermindert ist, was in einer weniger geschützten mRNA resultiert, die
zu einer höheren
Nucleaseaktivität führen könnte.
- • Verminderte
Elongationsrate der Messenger-RNA-Ketten (U. Vogel et al., (J. of
Biological Chemistry (1997) 272: 12265–12271).
-
Dementsprechend
ist es vorteilhaft, um ein Expressionssystem für die verbesserte Herstellung
eines interessierenden Proteins zu erhalten, weniger als die Wildtypmenge
von ppGpp-Synthetase
in den Prodiktionszellen zu exprimieren, die verwendet werden, um
das interessierende Protein zu exprimieren.
-
Eine
Vielzahl von Techniken, die es ermöglichen, kleinere Mengen eines
interessierenden Polypeptides in einem Gram-positiven Bakterium
zu exprimieren, sind auf dem Gebiet bekannt, insbesondere für das bevorzugte
Gram-positive Bakterium der Gattung Bacillus (Bacillus subtilis
und andere Gram-positive Bakterien, Sonensheim er al., 1993, American
Society for Microbiology, Washington D. C.).
-
Geeignete
Techniken, um kleinere Mengen eines Polypeptides mit ppGpp-Synthetase-Aktivität der Erfindung
zu exprimieren, umfassen Techniken, wie die Deletion oder Destruktion
in anderer Weise (z. B. durch Zerstören des korrekten Leserasters)
eines ppGpp-Synthetase-Gens
(einige oder alle Kopien davon) der Erfindung (z. B. auf dem Chromosom
des Gram-positiven Bakteriums), Trunkation eines ppGpp-Synthetase-Gens
(z. B. durch Einführen
eines Stopp-Codons), wobei Antisens-mRNA gegen die transkribierte
mRNA aus einem ppGpp-Synthetase-Gen verwendet wird, und/oder Ändern der
regulatorischen Elemente, um die Expression zu erhöhen, z.
B. die Verwendung schwacher Promotoren, u. s. w. Bezüglich weiterer
Details wird Bezug genommen auf (Sambrook et al. (1989) Molecular
Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., cold Spring
Harbor, NY; Ausubel, F. M. et al., (Hrsg.) "Current protocols in Molecular Biology". John Wiley and
Sons, 1995; Harwood, C. R., und Cutting, S. M. (Hrsg.) "Molecular Biology
Methods for Bacillus" John
Wiley and Sons, 1990).
-
Basierend
auf der DNA- und/oder Aminosäure-Sequenzinformation,
die hier bereitgestellt wird, ist die Auswahl einer besonderen Strategie,
um eine kleinere Menge als die Wildtypmengen eines Polypeptides
mit ppGpp-Synthetase-Aktivität
der Erfindung in einem Gram-positiven
Bakterium zu exprimieren, eine Routineangelegenheit für den Fachmann
auf diesem Gebiet.
-
Um
den Grad der verminderten Expression eines Polypeptides mit einer
ppGpp-Synthetase-Aktivität der Erfindung
zu bestimmen, kann jeder relevante ppGpp-Synthetaseaktivitätsassay/-test verwendet werden (geeignete
Assays sind hier beschrieben (vide supra)). Die Menge eines Polypeptides
der Erfindung mit einer ppGpp-Synthetase-Aktivität, die vor und nach der Modifikation
der Gram-positiven Zelle hergestellt wird, wird gemessen, und der
Grad der Abnahme der Expression kann relativ zu unmodifizierten
Wildtyp(Kontroll)-Zellen gemessen werden.
-
Der
Grad der verminderten Expression eines Polypeptides mit einer ppGpp-Synthetase-Aktivität gemäß der Erfindung
ist vorzugsweise eine zweifach verminderte Expression, bevorzugter
eine vierfache verminderte Expression und noch mehr bevorzugt eine
zehnfach verminderte Expression, und am bevozugtesten ist die Expression
eines Polypeptides gemäß der Erfindung
mit einer ppGpp-Synthetase-Aktivität vollständig gestört.
-
Vorzugsweise
ist ein Polypeptid mit einer ppGpp-Synthetase-Aktivität der Erfindung
ein Polypeptid, das aus einer Bacillus-Spezies erhalten wird, wie
Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus
alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus
circulans, Bacillus lautus, Bacillus thuringiensis, Bacillus licheniformis,
Bacillus clausii oder insbesondere aus Bacillus subtilis.
-
Die
Gram-positiven Bakterien im Expressionssystem der Erfindung können durch
konventionelle Verfahren, wie sie für Wirtszellen im Abschnitt „PROTEINHERSTELLUNG" beschrieben wurden
(vide supra), kultiviert werden.
-
Vorzugsweise
ist das Gram-positive Bakterium eine Spezies von Bacillus, wie Bacillus
subtilis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacilllus stearothermophilus,
Bacillus alkalophilus, Bacilllus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans,
Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacilllus thuringiensis, Bacillus
clausii oder Bacillus licheniformis.
-
Relativ
zum Gram-positiven Bakterium kann das interessierende Protein sowohl
ein homologes Protein oder ein heterologes Protein sein.
-
Vorzugsweise
wird das interessierende Protein rekombinant exprimiert.
-
Das
interessierende Protein kann jedes interessierende Protein sein.
Jedoch ist das interessierende Protein vorzugsweise ein Exoprotein
und insbesondere eine Protease, eine Lipase, eine Amylase, eine
Galactosidas, eine Pullanase, eine Cellulase, eine Glucoseisomerase,
eine Proteindisulfidisomerase, eine CGT'ase (Cyclodextringlucontransferase),
eine Phytase, eine Glucoseoxidase, eine Glucosyltransferase, eine
Laccase, eine Xylanase, ein Bakterienproteintoxin, ein mikrobielles
Oberflächenprotein,
ein virales Protein oder ein pharmazeutischen Protein.
-
Um
der Grad der verbesserten Produktion eines interessierenden Proteins
zu bestimmen, vorzugsweise eines interessierenden Exoproteins, kann
jeder relevante Aktivitätsassay/-test,
der dem interessierenden Protein (z. B. dem Exoprotein) entspricht,
verwendet werden.
-
Der
Grad der verbesserten Produktion eines interessierenden Proteins
kann relativ zur Produktionsmenge des Proteins des Gram-positiven
Stammes bestimmt werden, bevor der Stamm modifiziert wurde, um kleinere
Menge eines Polypeptides gemäß der Erfindung
zu exprimieren.
-
Die
Verwendung des Expressionssystems der Erfindung resultiert in einer
mindestens 2-fach verbesserten Produktion mindestens eines interessierenden
Proteins, bevorzugter mindestens 4-fach verbesserten Produktion
mindestens eines interessierenden Proteins und noch bevorzugter
einer mindestens 10-fach verbesserten Produktion mindestens eines
interessierenden Proteins.
-
Das
interessierende Protein kann nach Standardverfahren isoliert werden,
wie sie z. B. im Abschnitt „PROTEINISOLIERUNG" beschrieben sind
(vide supra).
-
Weiterhin
wird ein Verfahren für
die verbesserte Produktion mindestens eines interessierenden Proteins
in einem Gram-positiven Bakterium bereitgestellt, wobei das Verfahren
umfasst:
- (i) Kultivieren eines Expressionssystem
gemäß der Erfindung
und
- (ii) Reinigen des interessierenden Proteins aus der resultierenden
Kulturbrühe
oder dem Expressionssystem.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
erfolgt das Kultivieren als Fed-Batch-Fermentation.
-
Eine
Fed-Batch-Fermentation ist ein Standardfermentationsverfahren, insbesondere
für die
industrielle Produktion eines interessierenden Proteins in großem Maßstab.
-
Die
Fed-Batch-Fermentation wird allgemein in BASIC Biochemical Engineering
(Bungay, Henry R. BASIC Biochemical Engineering (2. Aufl.) Troy:
BiLine Associates, 1993) als der Systemtyp beschrieben, in dem "der Nährstoff
zugegeben wird, wenn seine Konzentration etwas unter einen eingestellten
Punkte fällt". Üblicherweise
wird die Zugabe der Nährstoffe
wegen der Präzision
mit einem Computer kontrolliert. Ein bevorzugter Weg, um die Zugabe
der Einspeisung zu kontrollieren ist es, die Konzentration des Nährstoffes
selbst in dem Fermenter oder Reaktionsgefäß zu überwachen.
-
Der
Nährstoff
selbst wird in mehreren Dosen zugegeben, um sicherzustellen, dass
nicht zu viel des Nährstoffes
in dem Fermenter zu irgendeiner Zeit vorliegt. Wenn zuviel eines
Nährstoffes
vorliegt, kann er das Wachsen der Zellen inhibieren. Durch Zugabe
des Nährstoffes
in einer kontrollierten Weise, kann die Reaktion in einer hohen
Produktionsrate voranschreiten, ohne dass sie überladen wird.
-
Ein
Beispiel einer geeigneten Fed-Batch-Fermentation wird in Neubauer,
P. et al. (1995, Journal of Biotechnology 43, Seiten 197–198) beschrieben.
-
Die
Theorie hinter dieser bevorzugten Ausführungsform ist, dass der zelluläre Gehalt
vieler direkter Teilnehmer in der Proteinsynthese, wie RNA-Polymerase,
Elongationsfaktoren und Initiationsfaktoren, als Ergebnis eines
Nährstoff-
und Energiemangels und vermittelt durch die (p)ppGpp-Synthetase,
die durch das relA-Gen kodiert wird, abnimmt, Dedhia, N. et al.
(1997) Biotechnology and Bioengineering 53 (4) Seiten 379–386.
-
Durch
Verwendung eines Gram-positiven Bakteriums mit einer verminderten
Expression eines Polypeptides mit einer ppGpp-Synthetase-Aktivität gemäß der Erfindung
wird die Produktion eines interessierenden Proteins in einer solchen
Fed-Batch-Fermentation verbessert.
-
Alternativ
kann das Kultivieren z. B. durch die Verwendung einer der nachfolgend
angegebenen Standardfermentionstechniken erfolgen:
Batch-Fermentation:
In einer Batch-Fermentation werden die Zellen nach der Inokulation
wachsen, bis eine der Substratkomponenten erschöpft oder ein Inhibitor akkumuliert
ist, oder Kontinuierliche Kultivierung mittels einer der nachfolgenden
Standardtechniken:
Chemostatnährstoffe („chemostat nutrient") werden in einer
konstanten Rate zugeführt;
Turbidostat
(„turbidostat") unter Verwendung
einer Feedbackkontrolle einer Pumprate, um eine fixierte Trübung der
Kultur aufrecht zu erhalten. Die Kontroller des Turbidostats verlangsamen
die Einspeisung wenn die Zellkonzentration unter dem eingestellten
Punkt liegt, so dass das Wachstum die Trübung erneuern kann. Wenn der
eingestellte Punkt überschritten
wird, beschleunigt die Pumpe, um die Zellkonzentration zu verdünnen, oder
Nustat(„nustat")-, Nutristat(„nutristat")- oder Auxostat(„auxostat")- (die Namen sind
Synonyme) Einspeisungsmedium, um einen Faktor konstant zu halten.
-
Die
Erfindung wird weiter durch die folgenden nicht beschränkenden
Beispiele veranschaulicht.
-
MATERIAL UND METHODEN
-
Allgemeine molekularbiologische Methoden
-
Wenn
nichts anderes angegeben ist, wurden die DNA-Manipulationen und
-transformationen unter Verwendung von Standardverfahren der Molekularbiologie
durchgeführt
(Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A laboratory manual,
Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY, Ausubel F. M. et
al. (Hrsg.) "Current
protocols in Molecular Biology" John
Wiley and Sons, 1995, Harwood, C. R. und Cutting S. M. (Hrsg.) "Molecular Biological
Methods for Bacillus" John
Wiley and Sons, 1990).
-
Enzyme
für die
DNA-Manipulationen wurden nach den Angaben des Lieferanten verwendet.
-
Enzyme für die DNA-Manipulationen
-
Soweit
nichts anderes angegeben ist, wurden alle Enzyme für die DNA-Manipulationen,
wie z. B. Restriktionsendonucleasen, Ligasen etc. von New England
Biolabs, Inc. erhalten.
-
BEISPIELE
-
BEISPIEL 1:
-
Identifizierung
von anderen ppGpp-Synthetasen, die aus verschiedenen Bacillus erhalten
wurden
-
PCR-Reaktion:
-
Auf Kolonien:
-
Eine
reisolierte Kolonie, die während
18 Stunden auf LB-Agar-Platten mit 10 μg/ml Kanamycin, 10 mm Kaliumphosphat
pH 7,0 und 0,4% Glucose inkubiert wurde, wurde in 10 μl 1 × PCR-Puffer
(Super TagTM DNA-Polymerase) suspendiert,
auf 95°C
während
5 Minuten erwärmt,
bei 20 000 × g
während
2 Minuten zentrifugiert. Von dem Überstand wurden 5 μl als Vorlage
für eine
PCR-Reaktion (30 Zyklen) verwendet, wobei die nachstehenden verschiedenen
Primer und die Super TaqTM DNA-Polymerase
nach den Angaben des Herstellers (Enzym technologies Ltd.) verwendet
wurden.
-
Primer
für die
RCR-Reaktion. DNA-Primer (Primer: #104775 bis #104780) mit einer
Oligonucleotidzusammensetzung mit Identität zur B. subtilis relA-Bac-Sequenz,
die in SEQ ID Nr: 1 (unterstrichen) gezeigt ist, wurden zur Amplifizierung
von DNA-Fragmenten von B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. lentus
und B. licheniformis verwendet.
-
Die
Positionen beziehen sich auf die DNA-Sequenz, die in SEQ ID NO:
1 gezeigt ist. Nicht unterstrichene Primersequenz sind Linkersequenzen
zu Klonierungszwecken, die eine geeignete Stelle für die Restriktionsenzymverdauung
aufweisen.
-
Primer
für das
5'-Ende des relA-Bac-gens
aus B. subtilis (Sensprimer)
-
Primer
für das
3'-Ende des inneren
Teils des relA-Bac-Gens aus B. subtilis (Antisensprimer)
-
Primer
für das
3'-Ende des relA-Bac-Gens
aus B. subtilis (Antisensprimer)
-
Analyse der PCR-Produkte
-
PCR-Produkte
aus B. subtilis, B. amyloliqufaciens, B. licheniformis und B. lentus
wurden an einem 0,7% Agarose-Gel, das Ethidiumbromid enthielt, analysiert,
um zu bestimmen, ob DNA vorlag und, wenn es vorlag, eine Abschätzung der
Größe der DNA
zu geben.
-
Die
erwartete Größe des PCR-Produkts
wurde erhalten.
-
B.
amyloliquefaciens: Größe des PCR-Fragments
etwa 980 Basenpaare mit den Primern 104775, 104777.
-
B.
lentus: Größe des PCR-Fragments
etwa 980 Basenpaare und 680 Basenpaare mit Primern 104775, 104777.
Beide PCR-Fragmente können
weiter verwendet werden, um eine B. lentus-ppGpp-Synthestase zu klonieren.
-
B.
licheniformis: Größe des PCR-Fragments
etwa 800 Basenpaare mit den Primern 104776, 104778, und Größe des PCR-Fragments
etwa 1900 Basenpaare mit den Primern 104776, 104779.
-
Die
PCR-amplifizierten DNA-Fragmente werden sequenziert und diese Sequenzinformation
wird verwendet, um B. amyloliquefaciens-, B. licheniformis-, B.
lentus-ppGpp-Synthetase gemäß der Erfindung
zu klonieren. Das Klonieren erfolgt nach Standardverfahren auf diesem
Gebiet.
-
Klonieren von B. amyloliquefaciens-ppGppSynthetase
in voller Länge
-
Unter
Verwendung des B. amyloloquefaciens-PCR-Fragments in der Größe von etwa
980 Basenpaaren, das mit den Primern 104775, 104777 (siehe vorstehend)
zusammen mit dem PCR(Anitsens)-Primer #113554 amplifiziert wurde,
wurde ein PCR-Fragment aus einem B. amyloliquefaciens-Stamm erhalten
und die DNA mit einem automatischen DNA-Sequenzierer nach den Vorschriften der
Herstellers sequenziert.
-
Diese
DNA-Sequenz und die entsprechende Sequenz des reifen Proteins sind
in SEQ ID Nr: 3 und 4 gezeigt.
-
Beispiel 2:
-
HOMOLOGIE/BASIS FÜR VORHERSAGE
-
Die
vorliegende Erfindung beruht teilweise auf der Entdeckung einer
neuen Polynucleotidsequenz, die aus einem Bacillus subtilis-Stamm
erhalten wurde, der ein Polypeptid kodiert, das eine ppGpp-Synthetase-Aktivität aufweist
und eine Homologie zu anderen mikrobiellen ppGpp-synthetasen besitzt.
Das Polypeptid wurde als relA-Bac bezeichnet.
-
Die
Kriterien, um ein neues Polypeptid mit einer ppGpp-Synthetase-Aktivität der vorliegenden
Erfindung zu definieren, wurden anfänglich durch Abfrage der öffentlich
bekannten Datenbank Genebank (EMBL, Heidelberg) für homologe
Sequenzen zu der neuen relA-Bac-Sequenz der Erfindung identifiziert.
-
Unter
Verwendung eines konventionellen Prozent-Sequenz-Identitäts-Programms,
wie es detaillierter hier beschrieben wird (vide infra), ist die
DNA-Sequenzidentität
von relA-Bac (SEQ ID Nr: 1) zu bekannten ppGpp-Synthetasen in Tabelle
I unten gezeigt, und die korrespondierende Aminosäuresequenzidentität ist in Tabelle
II dargestellt.
-
Tabelle II.
-
Homologie
zwischen DNA-Sequenzen. Die Sequenzen, die für die Ähnlichkeit verwendet wurden,
ist die kodierende DNA-Sequenz (CDS) aus den GeneBank-Einträgen bei
EMBL mit dem Locus, der in dem Schema aufgelistet ist.
- GB_BA:SEDEXB
! X72832 S.equisimilis
- GB_BA:VSU13769 ¡ U13769
Vibrio sp.
- GB_BA:ECOSPOT ¡ M24503
E. coli
- GB_BA:ECORELA ¡ J04039
E. coli
| GB_BA: | Bsrela.orf | ecorela.orf | ecospot.orf | sedexb.orf | vsu13769.orf |
| relA-Bac | 100 | 50 | 51 | 59 | 50 |
| ecorela.orf | 50 | 100 | 48 | 49 | 62 |
| ecospot.orf | 51 | 48 | 100 | 51 | 45 |
| sedexb.orf | 59 | 49 | 51 | 100 | 49 |
| vsu13769.orf | 50 | 62 | 45 | 49 | 100 |
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Homologie
zwischen Peptidsequenzen, die durch die vorstehenden DNA-Sequenzen
kodiert werden.
| | bsrela.pep | ecorela.pep | ecospot.pep | sedexb.pep | vsu13769.pep |
| relA-Bac | 100 | 38 | 41 | 53 | 37 |
| ecorela.pep | 38 | 100 | 32 | 36 | 65 |
| ecospot.pep | 41 | 32 | 100 | 42 | 32 |
| sedexb.pep | 53 | 36 | 42 | 100 | 34 |
| vsu13769.pep | 37 | 65 | 32 | 34 | 100 |
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Von
den vorstehenden Ausführungen
wird erkannt werden, dass, obgleich spezielle Ausführungsformen
der Erfindung zum Zweck der Veranschaulichung beschrieben wurden,
verschiedene Modifikationen gemacht werden können, ohne vom Gegenstand der
Erfindung abzuweichen. Dementsprechend ist die Erfindung nicht beschränkt, ausgenommen
durch die beigefügten
Ansprüche.
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