DE69530647T2 - Für biosynthetische Insulinvorstufen kodierende DNA-Sequenzen und Verfahren zur Herstellung von Insulin - Google Patents
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Description
- Diese Erfindung betrifft für neue biosynthetische Insulinvorsufen kodierende DNA-Sequenzen und die Herstellung von Insulin durch Züchtung von transformierten Zellen, die solche DNA-Sequenzen enthalten.
- Insulin ist ein Hormon, dessen primäre Rolle es ist, den Transport von Glukose aus dem Blutkreislauf in die Zellen, wo es metaboliert wird, zu kontrollieren.
- Insulin besteht aus zwei Ketten von Aminosäuren: einer A-Kette, die aus 21 Aminosäuren besteht, und einer B-Kette, die aus 30 Aminosäuren besteht, wobei die Ketten durch zwei Disulfidbrücken miteinander verbunden sind. Eine dritte Disulfidbrücke befindet sich in der A-Kette.
- Die primäre Form des Insulinmoleküls wird als eine naszierende Polypeptidkette synthetisiert, die Präproinsulin genannt wird, das aus einem Signalpeptid und Proinsulin besteht. Das Signalpeptid lenkt die naszierende Kette über das endoplasmatische Reticulum. Proinsulin wird aus Präproinsulin im Lumenbereich des endoplasmatischen Reticulums erzeugt, sobald die Polypeptidkette die Membrane durchtritt. Proinsulin besteht aus einer eine Kette von 35 Aminosäuren umfassenden Polypeptidkette, die nicht in Insulin vorhanden ist. Dieses Verbindungspeptid (connecting Peptide) oder C-Peptid verbindet das C-Ende der B-Kette mit dem N-Ende der A-Kette des künftigen Insulinmoleküls. Aus dem Lumen des endoplasmatischen Reticulums wandert das Proinsulin zu dem Golgi-Apparatus ab, worin die Proteolyse des Verbindungspeptids beginnt. Das Verbindungs- oder C-Peptid wird durch ein dem Trypsin/Carboxypeptidase-B-System ähnliches enzymatisches System, das an zwei hintereinanderliegende basische Aminosäuren- Sequenzen wirkt, herausgeschnitten und das Insulin wird hergestellt (Steiner et al., J. Cell. Biol. 24, (1984) 121–130).
- Die Bedeutung des C-Peptids liegt darin, dass es die B- und A-Ketten derart verbindet, dass eine richtige Bildung von Disulfidbrücken im Insulinmolekül ermöglicht wird (Bell et al., Nature 284 (1980) 26–32) oder dass es das dem Trypsin ähnliche Konvertierungsenzym anweist, Proinsulin an der Stelle mit zwei basischen Aminosäuren herzustellen (Thim et al., PNAS, 83 (1986) 6766–6770).
- Die Herstellung des biosynthetischen humanen Insulins wurde hauptsächlich in der Bakterie Escherichia coli und im Hefepilz Saccharomyces cerevisiae berichtet. Es ist allen geimeinsam, das die DNA-Sequenz entweder für das ganze Proinsulin, einen modifizierten Teil von Proinsulin oder getrennt für die A- und B-Kette kodiert.
- Das Insulin wird in der Bakterie E. coli. enweder über getrennte A- und B-Ketten (Chance et al., Diabetes Care 4 (1982) 147–154) oder als Proinsulin,
EP 55945 - Im Hefepilz S. cerevisiae wird Insulin über Proinsulin hergestellt, doch nur mit einem sehr niedrigem Ertrag, EP-A-121 884. Verschiedene Modifikationen des C-Peptids verbessern den Ertrag und die richtige Bildung des Insulinmoleküls im Hefepilz.
- In DK-A-5284/87 sind Insulinvorstufen der Formel B-X-A, worin B und A die B- und A-Ketten bedeuten und X das Peptid, das von 2 bis 35 Aminosäuren umfasst, beschrieben.
- In EP-A-195-691 sind Insulinvorstufen der Formel B-X-Y-A, worin B und A die B- und A-Ketten darstellen und X und Y je Lysin oder Arginin darstellen, beschrieben.
- In EP-A-163 529 sind Insulinvorstufen beschrieben, die die Peptidkette B(1-29)-A-(1-21), die mit einem kurzen Peptid mit 2 bis 8 Aminosäuren verbunden ist. Modifikationen von des-B(30)-Insulinvorstufen der Formel B(1-29)-X1-X2-Y2-Y1-A(1-21) sind in EP-A-347 845 beschrieben.
- In
EP 249 350 - Viele Polypeptide zu therapeutischer und diagnostischer Verwendung z. B. Erythropoietin, tPA und Faktor VIII wurden N-glykosyliert (Parekh et al., TIBTECH 7 (1989) 117–121).
- Beschrieben wurde auch ein dreifach erhöhter Ertrag des Rinder-Chymosins (Glykochymosin) im Pilz A. niger var. awamori, was durch die Einführung einer N-Glykosylierungskonsensustelle in die kodierende Sequenz erreicht wurde. Durch eine Fusion des Prochymosin- und Glukoamylasegens wurde sogar ein höherer Ertrag erreicht, während durch eine Fusion von Glykochymosin zu Glukoamylase keine weitere Ertragserhöhung erreicht wurde (Berka et al., Biochem. Soc. Trans. 19 (1991) 681–685).
- Im Fall von Asparaginproteinase (Renin), die mikrobieller Abstammung ist und als Chymosinersatz dient, wurde beobachtet, dass eine Hyperglykosylierung die Enzymaktivität verringern kann, wenn sie an einer kritischen Stelle im Molekül geschieht (Berka et al., Biochem. Soc. Trans. 19 (1991) 681–685; Aikawa et al., J. Biol. Chem. 265 (1990) 13955–13959).
- Eine Mutation des glykosyliertem Asparagins in der kodierenden Region von Renin hatte eine bedeutende Verringerung von Sekretion in Hefepilzzellen zur Folge (Aikawa et al., J. Biol. Chem. 265 (1990) 13955–13959).
- Der Gegenstand der Erfindung sind für neue biosynthetische Insulinvorstufen kodierende DNA-Sequenzen und die Verwendung von eukaryotischen Zellen, insbesondere von Pilzzellen, zur Herstellung von Insulin.
- Das wurde mittels einer DNA-Sequenz erreicht, die eine für Insulinvorstufen kodierende Sequenz der Formel B-Pg-A umfasst, worin B und A die B- bzw. A-Ketten darstellen und Pg ein modifiziertes C-Peptid oder irgendeine Zahl von Aminosäuren, die wenigstens eine N-Glykosylierungskonsenusstelle umfassen, darstellt. Pg verbindet die B- und A-Ketten durch proteolytische Prozessierungssignale oder spezifische chemische Spaltungsstellen.
- Die Modifikation des Proinsulingens findet bevorzugt durch die Bildung der N-Glykosylierungsstelle AsnXSer statt. Die kann in einer C-Peptidsequenz erreicht werden, z. B. durch den Wechsel des Kodons GCC für Ala-C-20 Aminosäure zum Kodon AAC für Asn.
- Das gleiche Prinzip kann auch für des-B(30)-Proinsulin verwendet werden.
- Die Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass der mit RIA-Methode gemessene Ertrag des immunoreaktiven Insulins viel höher ist bei Transformanten, die die DNA-Sequenz der Formel B-Pg-A mit Schutzprotein fusiert umfassen, als bei Transformanten, die die nicht-modifizierte DNA-Sequenz des Proinsulins mit Schutzprotein fusiert umfassen. Die mit einem Vektor, der die DNA-Sequenz des nicht-fusierten Proinsulins oder des nicht-fusierten modifizierten Proinsulins mit einer N-Glykosylierungskonsensusstelle umfasst, transformierten Zellen ergaben einen sehr niedrigen oder sogar keinen Ertrag des immunoreaktiven Insulins, mit RIA-Methode gemessen.
- Deshalb erhöht die Einführung einer N-Glykosylierungskonsensusstelle in eine Linkenegion, die kein Teil des reifen Insulinmoleküls ist, merklich die Expression in Pilzzellen, die mit der für solche fusierten Insulinvorstufen kodierenden DNA-Sequenz transformiert sind. Fusiertes Protein und Proinsulin können entweder im Wirtsorganismus selbst verarbeitet oder durch eine spätere enzymatische oder chemische Abspaltung entfernt werden.
- Die für die erwähnte modifizierte Insulinvorstufe kodierende DNA-Sequenz kann mittels einer Oligonukleotidsynthese der ganzen DNA-Sequenz in Kombination mit PCR oder mittels in vitro Mutagenese hergestellt werden. Die DNA-Sequenz kann auch für die Expression in einem geeigneten Organismus, vorzugsweise in einem Pilzstamm, kodon-optimiert werden.
- Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von Insulin durch Kultivierung von geeigneten Zellen, vorzugsweise Pilzzellen, die mit einem Vektor, der eine für die Insulinvorstufe kodierende DNA-Sequenz der Formel B-Pg-A umfasst, transformiert werden, in einem geeigneten Nährmedium.
- Die Expression und Sekretion des Peptids der erwähnten Formel kann durch die Verwendung eines Vektors erreicht werden, in dem die Kodierungssequenz durch einen Promotor, eine Signalsequenz und einen Terminator, die in einem geeignetem Organismus funktionell sind, reguliert wird. So kann es z. B. pglaA und eine Signalsequenz von glaA-Gen oder ein Teil davon, der für die Expression in Aspergillus sp. geeignet ist, sein (Cullen et al., Biotechnology, 5 (1987) 369–376). Die Expression und Sekretion des Peptids können auch durch die Verwendung eines Expressionsvektors, in dem die für die Insulinvorstufe kodierende DNA-Sequenz der oben erwähnten Formel mit dem Gen des Schutzproteins über ein Prozessierungssignal (Ward et al., Botechnology 8 (1990) 435–440; Broekhuijsen et al., J. Biotech. 31 (1993) 135–145) oder eine chemische Spaltungsstelle fusiert wird, erreicht werden.
-
1 zeigt eine Nukleotidsequenz von beiden, dem natürlichen und dem Kodonoptimierten Proinsulingen, und eine entsprechende Aminosäurensequenz, wobei die üblichen Abkürzungen für Nukleotide und Aminosäuren verwendet werden. -
2 beschreibt zwei Typen von Expressionskassetten des humanen Proinsulingens und zeigt schematisch das humane Proinsulingen und das Mutantgen, das eine N-Glykosylierungskonsenusstelle umfasst. -
3 erklärt die Konstruktionsstrategie des menschlichem Proinsulingens und des eine N-Glykosylierungskonsensusstelle umfassenden Mutantgens für zwei Typen von Expressionskassetten über Fragmente, die getrennt durch Überlappungs-Oligonukleotide ("overlapping oligonucleotids") in Kombination mit PCR synthetisiert werden. -
4 zeigt 14 Oligonukleotide, die für die Synthese des menschlichem Proinsulingens und des eine N-Glykosylierungskonsensusstelle umfassenden Mutantgens modelliert werden. -
5 erklärt auf dem Beispiel der Synthese des Fragments I den neuen Ansatz, der für die Synthese des humanen Proinsulingens durch Verwendung von überlappenden komplementären Oligonukleotiden in Kombination mit PCR verwendet wurde. -
6 zeigt schematisch die Synthese des Fragments IV (Oligonukleotide sind nur durch Pfeile angezeigt). -
7 zeigt schematisch die Synthese des Fragments II, Fragments III und Fragments V (Oligonukleotide sind nur durch Pfeile angezeigt). -
8 zeigt die Konstruktion der Plasmide pPZG301, pPZG302, pPZG303, pPZG304, pPZG305. -
9 zeigt die Konstruktion der Plasmide pPZG311, pPZG312. -
10 zeigt die Konstruktion der Expressionsvektoren in Fadenpilzen für Expressionskassetten Typ I. -
11 zeigt die Konstruktion der Expressionsvektoren in Fadenpilzen für Expressionskassetten Typ II. -
12 zeigt die Sequenz an der GlaG2-Bindung des glaA-Gens. - Beispiele
- Beispiel 1
- Die Synthese des menschlichen Proinsulingens und des eine N-Glykosylierungskonsensusstelle umfassenden Mutantgens durch überlappende ("overlapping") Oligonukleotide in Kombination mit Polymerasekettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR)
- a) Methodologie
- Alle DNA-Manipulierungsexperimente wurden mittels üblicher Molekulärbiologiemethoden, wie in Maniatis, T., et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, U.S.A. (1982) beschrieben, durchgeführt.
- Alle Chemikalien, Enzyme und Plasmide sind, falls nicht anders angegeben, aus verschieden Handelsquellen erhältlich. Die Puffer und Reaktionsbedingungen für Digestionen mit Restriktionsendonuklease wurden, falls nicht anders angegeben, wie vom Hersteller empfohlen verwendet.
- Mit der chemischen Synthese der Oligonukleotide wurde "ISOGEN Bioscience", Amsterdam, Niederlande beauftragt. Die DNA-Proben wurden in einer gefriergetrockneten Form als Natriumsalze mit freien Hydroxylgruppen an 5' und 3' Enden geliefert. Solche DNA wurde in sterilem MQ H2O gelöst. Die Konzentration von einzelkettigen DNA-Oligonukleotiden wurde durch Absoranzmessung bei A260 bestimmt. Die Proben der gelösten DNA-Oligonukleotide wurden bei –20°C gelagert.
- Die Polymerasekettenreaktion, weiter als PCR bezeichnet, wurde mit Perkin Elmer Cetus (761 Main Ave., Norwalk CT 06859) Apparatur und GeneAmpTM DNA Amplification Reagent Kit with AmpliTaqTM Recombinant Taq DNA Polymerase durchgeführt. Konzentrierte Lösungen und Reaktionsmischungen wurden gemäß "Perkin Elmer Cetus Protocol for DNA Amplification" wie von Hersteller empfohlen hergestellt mit der Ausnahme, dass sich in der Reaktionsmischung keine DNA-Matrize, sondern nur Oligonukleotide in einer Konzentration von 100 pMol per Reaktion (100 μl) befanden. Das Profil der Temperaturzyklen für jede PCR war: Schmelztemperatur 94°C/l Min, Annealing-Temperatur 40°C/l Min. (für Fragmente I und IV) oder 50°C/l Min. (für Fragmente II, III und V), Polymerisationstemperatur 72°C/l Min. Es gab 25 Zyklen. Nach dem letzen Zyklus wurde die Polymerisationszeit für 7 Minuten verlängert, um die Polymerisation von allen Ketten zu beenden. Danach wurde die Probe auf 4°C gekühlt. Die PCR-Produkte wurden aus die Reaktionsmischung durch Chloroformextraktion in zwei Stufen isoliert, danach wurde die DNA mit Isopropanol ausgefällt, im Vakuum getrocknet und in 50 μl von TE Puffer gelöst.
- In Experimenten der Transformation und Amplifikation von Plasmiden wurde die Bakterie E. coli K12, JM109 (Yanisch-Perron et al., Gene 33 (1985) 103–119) verwendet. Die Transformation und Elektroporation von E. coli wurden gemäß früher beschriebenen Methoden (Hanahan, D. J. Mol. Biol. 166 (1983) 557–580; Biorad Genepulser) durchgeführt.
- Modellierung von Oligonukleotiden
- Das synthetische menschliche Proinsulingen wurde aus der veröffentlichten Sequenz des menschlichen Insulingens (Bell et al., Nature 284 (1980) 26–32) abgeleitet. Es soll betont werden, dass bei der Synthetisierung des Gens manche Modifikationen gemacht werden können: es ist möglich, verschiedene, in meisten Fällen bevorzugte Kodone zu verwenden, man kann zusätzliche fuktionelle DNA-Sequenzen und Restriktionsstellen einführen, um eine Ligation zu Expressionsvektoren zu ermöglichen, man kann ein oder mehrere Kodone der Kodierungsregion ändern, um ein strukturell modifiziertes Polypeptid, jedoch mit einer im Wesentlichen gleichen Aktivität oder Nützlichkeit herzustellen.
- In der vorliegenden Erfindung wurde synthetisches menschliches Proinsulingen für die Expression in Pilzen modifiziert. Es wurden die am häufigsten verwendeten Kodone des Glukoamylase-Gl-Gens des Fadenpilzes A. niger, das in hohen Mengen expressiert wird (Boel et al., EMBO J., 3 (1984) 1097–1102; Nunberg et al., Mol. Cell. Biol., 4 (1984) 2306–2315) verwendet und sie waren in meisten Fällen die gleichen wie die menschlichen Kodonen, mit Ausnahme von manchen Regionen, worin durch die Wahl von bevorzugtem Kodon die Oligonukleotide sehr reich an CG Nukleotiden werden würden, was zu Problemen in der Sequentierung und möglicherweise auch in PCR führen würde. Somit wurden manche, meistens Gly-Kodone von GGC zu GGT, das das zweite bevorzugte Gly-Kodon im Glukoamylasegen von Fadenpilz A. niger (
1 ) ist, geändert. - An 5'-Ende des synthetischen Proinsulingens wurden zusätzliche DNA-Sequenzen eingeführt, die entweder für 18 Aminosäuren von Signalpeptid des Glucoamylasegens (glaA) oder für 6 Aminosäuren von Propeptid des glaA-Gens, das Lys-Arg proteolytische Spaltungsstelle enthält, um die Konstruktion von zwei Typen von Expressionskassetten zu ermöglichen, kodieren. Im ersten Fall (I) wurde das synthetische menschliche Proinsulingen durch den Glukoamylasepromotor (pglaA) und die Signalsequenz (ssglaA) des Glukoamylasegens reguliert, während im zweiten Fall (II) das Proinsulingen mit dem ganzen glaA-Gen des Fadenpilzes A. niger über ein ein KEX-2-ähnliches Proteinprozessierungssignal enthaltendes Abstandhalterpeptid unter der Kontrolle von pglaA fusiert wurde (
1 und12 ). - Es wurde auch ein Mutant des synthetischen menschlichen Proinsulingens hergestellt der eine N-Glykosylierungskonsensusstelle trug, um den Einfluss auf den Expressions- und Sekretionsspiegel zu studieren. Da das C-Peptid für die Insulinfunktion nicht wesentlich ist, weil es in Sekretionsprozess abgespalten wird, wurde eine Mutation in die Kodierungsregion des C-Peptids des menschlichen Proinsulingens (BCA) eingeführt. Es wurde ein Mutant (BPgA), der eine N-Glykosylierungkonsensusstelle AsnXSer trug, mittels Wechsel des Kodons GCC für Ala-C20 Aminosäaure ins Kodon AAC für Asn Aminosäure hergestellt (
2 ). - Für die Synthese des menschlichem Proinsulingens wurde ein neuer Ansatz eingeführt, worin überlappende, komplementäre Oligonukleotide in Kombination mit PCR verwendet wurden. Das Prinzip der Methode war, während PCR zwei mittlere, überlappende, komplementäre Oligonukleotide gleichzeitig als Matrize und als Primer zu verwenden, wodurch es ermöglicht wurde, dass TaqDNA-Polymerase sie "vergrößert", d. h. sie während des ersten Zyklus verlängert. Im zweiten Zyklus überlappen solche "vergrößerten" Oligonukleotide mit dem nachbarlichen 3'- oder 5'-Oligonukleotid, womit es ermöglicht wird, dass TaqDNA-Polymerase bereits "vergrößerte" mittlere Oligonukleotide "zusätzlich vergrößert". Auf diese Weise füllt TaqDNA-Polymerase tatsächlich die Leerstellen zwischen chemisch synthetisierten, überlappenden Oligonukleotiden aus und bildet eine DNA-Doppelwendel. Die Synthese des menschlichen Proinsulingens und seines eine N-Glykosylierungskonsensusstelle umfassenden Mutanten wurde in Fragmenten, die getrennt mit PCR synthetisiert wurden, durchgeführt. Die Spaltung von Genen in Fragmente wurde durch die Anwesenheit von zwei Spaltungsstellen für das Restriktionsenzym PstI in der Kodierungsregion von C-Peptid ermöglicht (
3 ). Vierzehn Oligonukleotide wurden modelliert: zehn Oligonukleotide (B3, B4, B5, B6, C1, C2, C3, A1, A2 und A3) wurden aus der für menschliches Proinsulin DNA kodiernden Sequenz mit bevorzugten Kodonen für Expression im Fadenpilz A. niger, abgeleitet, zwei Oligonukleotide (B1 und B2) wurden für die Einführung der Signalsequenz des glaA-Gens und zusätzliche Restriktionsstellen, um die Ligation in den Expressionsvektor Typ I zu ermöglichen, modelliert, ein Oligonukleotid (B7) wurde für die Einführung der Abstandshalterregion von glaA (G2) Gen und zusätzliche Restriktionsstellen, um die Ligation mit dem Expressionsvektor Typ II zu ermöglichen, modelliert und ein Oligonukleotid (C4) wurde für die Einführung einer eine N-Glykosylierungskonsensusstelle tragenden Mutation modelliert (4 ). - b) PCR-Synthese von Fragmenten I–V
- Fragmente I und IV
- Die Fragmente I und IV wurden schrittweise synthetisiert. Im ersten Schritt von PCR wurde eine Reaktion mit Oligonukleotiden B3 und B4 durchgeführt, was das Produkt B3/B4 ergab. Im nächsten Schritt wurde 1 μl des Produktes B3/B4 in PCR-Reaktionsmischung mit: a) B2 und B5 Oligonukleotiden für Fragment I und b) B7 und B5 Oligonukleotiden für Fragment IV vermischt. Erhalten wurden die Produkte B2B3/B4/B5 und B7B3/B4/B5. Im dritten Schritt wurde 1 μl des Produktes B2/B3/B4/B5 für PCR mit Oligonukleotiden B1 und B6 für das Fragment I verwendet, und 1 μl des Produktes B7/B3/B4/B5 wurde in PCR-Reaktionsmischung mit Oligonukleotiden B7 und B6 für das Fragment IV vermischt. Es wurden PCR-Produkte B1/B2/B3/B4/B5/B6 und B7/B3/B4/B5/B6 erhalten. Ihre Größe entsprach der erwarteten Größe und die Produkte wurden mit entsprechenden Restriktionsenzymen digerirert, was Fragment I und Fragment IV (
5 und6 ) ergab. - Fragmente II, III und V
- Die Fragmente II, III und V wurden in einem Schritt synthetisiert. PCR wurde mit Oligonukleotiden: a) C1, C2, C3; b) A1, A2, A3; und c) C2, C4, C5 durchgeführt. PCR Produkte C1/C2/C3, A1/A2/A3 und C1/C4/C3 hatten die erwartete Größe und wurden mit ensprechenden Restriktionsenzymen digeriert, was Fragment II, Fragment III und Fragment V ergab (
7 ). - Klonierung von PCR-synthetisierten Fragmenten zum pUC19 Vektor und DNA-Sequenzanalyse
- Das Plasmid pUC19 wurde mit: a) PstI, b) PstI/EcoRI und c) PCTI/salI Restriktionsenzymen digeriert und mit entsprechenden Fragmenten I–V ligiert, was die Plasmide pPZG301, pPZG302, pPZG303, pPZG304 und pPZG305 ergab (
8 ). Mit diesen Plasmiden wurde die Bakterie E. coli JM109 transformiert. Aus den erhaltenen Transformanten wurde pDNA mittels einer "Minipräparation" isoliert und mit Restriktionsenzymen analysiert. Richtige Plasmide enthaltende E. coli-Transformanten wurden kultiviert, ihre pDNA wurde mittels einer "QIAGEN Typ 20" Kolonne isoliert und mittels "SEQUENASE® Version 2.0. kit" sequenziert. Die eine richtig synthetisierte und eingeführte Sequenz tragenden Vektoren wurden für weitere Konstruktionen verwendet. - pPZG311 und pPZG312
- Die Vektoren mit dem kompletten menschlichen Proinsulingen und dem Mutantgen mit einer N-Glykosylierungskonsensusstelle mit Signalsequenz des glaA-Gens wurden wie folgt konstruiert: pPZG311 wurde mittels Ligierung des 173 bp EcoRI-PstI Fragments, das aus pPZG301 isoliert wurde, des 75 bp PstI-PstI Fragments, das aus pPZG302 isoliert wurde, und des 74 bp PstI-SalI Fragments, das aus pPZG303 isoliert wurde, zum EcoRI/SalI digerierten pUC 19 Vektor konstruiert. pPZG312 wurde mittels Ligierung des 173 bp EcoRI-PstI Fragments, das aus pPZG301 isoliert wurde, des 75 bp Pst-PstI Fragments, das aus pPZG305 isoliert wurde, und des 74 bp PstI-SalI Fragments, das aus pPZG303 isoliert wurde, zum EcoRI/SalI digerierten pUC Vektor konstruiert (
9 ). - Beispiel 2
- Konstruktion des Fadenpilz-Expressionsvektors
- I. Expressionskassette Typ I
- pAN52-7NotBCA und pAN52-7NotBPgA
- pAN52-7NotuidA (Verdoes et al., Gene (1994) im Druck) wurde mit NcoI und mit SalI teilweise digeriert. 7,55 kb SalI-NcoI Fragment tragend glaA Promotor und trpC terminierende Region von trpC Gen wurde isoliert und mit 317 bp Nco-SalI Fragment des Plasmids pPZG311, was Plasmid pAN52-7NotBCA ergab, und mit 317 bp NcoI-salI Fragment des Plasmids pPZG312, was Plasmid pAN52-7NotBPgA ergab, ligiert (
10 ). - pAN52-7BCAamdS und pAN52-7BPgAamdS
- 5,0 kb NotI Fragment tragend Acetamydasegen (amdS) aus A. nidulans wurde in die NotI Stelle der Plasmide pAN52-7NotBCA und pAN52-7NotBPgA ligiert, was Plasmide pAN52-7BCAamdS und pAN52-7BPgAamdS ergab (
10 ). - II. Expressionskassette Typ II
- pAN56-7BCAamdS und pAN56-7BPgAamdS
- Die Vektoren für fusiertes Glucoamylse-Proinsulinprotein und Glukoamylase-Proinsulinmutanten mit N-Glykosylierungskonsensusstelle wurden wie folgt konstruiert: das Plasmid pPZG304 wurde mit EcoRV und AlwNI digeriert. Das Fragment EcoRV-AlwNI von 25 bp, tragend die Sequenz für 6 Aminosäurenabstandhalter, wurde mit 3,07 kb SalI-EcoRV Fragment aus pAn56-7 tragend glaA (G2) Gen ligiert, was das Fragment SalI-AlwNI ergab. Vektor pAN56-7 wurde aus Vektor pAN56-4 (Broekhuijsen et al., J. Biotech., 31 (1993) 135–145), in dem der gpdA Promotor durch 4,2 kb NotI-NcoI Fragment aus pAN52-7 mit glaA Promotor ersetzt wurde und dem das Interleukingen entfernt wurde, wobei die EcoRV Stelle aufwärts von GlaG2 heruntergelassen wurde, gewonnen. Danach wurde das Fragment AlwNI-SalI mit 10,6 kb HidnIII-SalI Fragment aus pAB1-6S (Den Herder et al., Mol. Gen. Genet. 233 (1992) 404–410), das den glaA Promotor und das amdS Gen hat, und mit a) 1,06 kb AlwNI-HindIII Fragment aus pAN52-7BCA, was das Plasmid pAN56-7BCAamdS ergab, und mit b) 1,06 kb AlwNI-HindIII Fragment aus pAN52-7BPgA, was den Vektor pAN56-7BPgAmdS ergab, ligiert (
11 ). Im Abstandshalter befindet sich eine dibasische Prozessierungsstelle Lys-Arg. Die Sequenz um die Fusionsstelle von Glukoamylasegen mit menschlichem Proinsulingen (BCA) und Proinsulinmutanten (BPgA) mittels Abstandshalterregion ist in12 dargestellt. - Beispiel 3
- Transformation des Fadenpilzes Aspergillus niger
- Die Transformation des Fadenpilzes Aspergillus niger wurde gemäß bereits beschriebenen Methoden durchgeführt (Goosen et al., Curr. Genet. 11 (1987) 499-503; Kelly and Hynes, Embo J. 4 (1985) 475–479; Van Hartingsveldt et al., Mol. Gen. Genet. 206 (1987) 71–75).
- Der Fadenpilz A. niger N402 (Bos, C J. et al., Curr. Genet. 14 (1988) 437–443) wurde mit Expressionsvektoren pAN52-7BCAamdS, pAN52-7BPgAamdS, pAN56-7BCAamdS und pAN56-7BPgAamdS transformiert. Die Kolonien wurden an Nährmedien mit Acetamid oder Acrylamid als der einzigen Kohlenstoff- und Stickstoffquelle ausgewählt. Ausgehend aus Einzelsporen wurde eine weitere Analyse von Transformanten durchgeführt.
- Beispiel 4
- Sekretion des menschlichen Insulins ins Nährmedium
- 1. Züchtung von A. niger Transformanten tragend menschliches Proinsulingen und Mutantgen mit N-Glykosylierugskonsensusstelle
- Etwa 108 Sporen von ausgewählten Transformanten wurden in 500 ml Erlenmeyerkolben mit 100 ml eines flüssigen Nährmediums enthaltend 70 mM NaNO3, 7 mM KCl, 11 mM KHP2O4, 2 mM MgSO4, 4% Dextrin, Spurenlemente (1 : 1000; 76 mM ZnSO4, 178 mM HB3O3, 25 mM MnCl2, 18 mM FeSO4, 7,1 mM CoCl2, 6,4 mM CuSO4, 6,2 mM NaMo2O4, 174 mM EDTA) und Vitamine (1 : 1000; 100 mg/l Thiamin, 100 mg/l Riboflavin, 100 mg/l Nicotinamid, 50 mg/l Pyridoxin, 10 mg/l Pantothensäure, 0,2 mg/l Biotin). Die Transformanten wurden 36 Stunden bei 32°C gezüchtet. Die Proben wurden auf die Anwesenheit von Insulin analysiert.
- 2. Expression von Insulin
- Die Expression von immunoreaktivem menschlichem Insulin wurde mittels "Pharmacia INSULIN RIA 100 " Zubehör, Kabi Pharmacia Diagnostics demonstriert. Die Proben von mittels Fermentation gezüchteten Transformanten wurden filtriert, die Filtrate wurden neutralisiert, falls nötig verdünnt und dann der RIA(Radio Immuno Assay)-Bestimmung (Livessy et al., Clin. Biochem. 13 (1980) 151–55) unterworfen. Der Expressionsspiegel des immunoreaktiven menschlichen Insulins (mU/L) in A. niger ist in der Tabelle 1 dargestellt.
- Tabelle 1 Expressionsspiegel des immunoreaktiven menschlichen Insulins in verschiedenen A. niger Transformanten
- Die Transformanten A. niger 7650, A. niger 7651, A. niger 7649 und A. niger 7638 wurden in "National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, H-1502 Budapest, P.O.B. 53, Ungarn, am B. Juli 1994 unter den Aufnahmenummern NCAIM (p) F 001215, NCAIM (P) F 001216, NCAIM (P) F 001214 und NCAIM (P) F 001213 und gemäß dem Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren, Erklärung bei Ersthinterlegung (Regel 6.1), deponiert.
- Aus der Tabelle ist es ersichtlich, dass in der Expression von Transformanten, die verschiedene Vektoren enthalten, ein augeprägter Unterschied besteht. Das weitgehend beste Ergebnis zeigt ein Transformant, der mittels Transformation mit einem Vektor, der menschliches Proinsulingen tragend eine N-Glykosylierungskonsensusstelle fusiert mit Glukoamylaseprotein hatte, erhalten wurde.
Claims (8)
- DNA-Sequenz enthaltend eine Insulinvorstufe kodierende Sequenz der Formel B-Pg-A, worin B und A B- bzw. A-Ketten des menschlichen Insulins darstellen, Pg ein modifiziertes C-Peptid oder irgendeine Zahl von Aminosäuren, die wenigstens eine N-Glykosylierungskonsensusstelle umfassen, darstellt und Pg die B- und A-Ketten durch proteolytische Prozessierungssignale oder spezifische chemische Spaltungsstellen verbindet.
- DNA-Sequenz enthaltend eine Insulinvorstufe kodierende Sequenz der Formel B(29)-Pg-A, worin B(29) Aminosäuren 1–29 der B-Kette des menschlichen Insulins darstellt, A eine A-Kette des menschlichen Insulins darstellt, Pg ein modifizertes C-Peptid oder irgendeine Zahl von Aminosäuren, die wenigstens eine N-Glykosylierungskonsensusstelle umfassen, darstellt und Pg die B- und A-Ketten durch proteolytische Prozessierungssignale oder spezifische chemische Spaltungsstellen verbindet.
- DNA-Sequenz gemäss Anspruch 1 oder 2 mit bevorzugten Kodonen für die Expression in bestimmten Wirten.
- DNA-Sequenz gemäss irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, fusiert mit einem Schutzproteingen mittels einer Abstandshalterregion, die ein proteolytisches Prozessierungssignal oder eine spezifische chemische Spaltungsstelle trägt.
- Transformierte Zellen eines geeigneten Wirtes, die eine DNA-Sequenz gemäss irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4 umfassen.
- Transformierte Pilzzellen enthaltend eine DNA-Sequenz gemäss irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4.
- Transformierte Aspregillus sp. Pilzzellen enthaltend eine DNA-Sequenz gemäss irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4.
- Verfahren zur Herstellung von Insulin mittels Vermehrung von geeigneten Zellen, vorzugsweise Pilzzellen, transformiert mit einem Vektor, der eine DNA-Sequenz gemäss irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4 umfasst.
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