DE68922932T2 - Hohe Expression von Proteinen in Hefe. - Google Patents

Hohe Expression von Proteinen in Hefe.

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Description

    Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Materialien, die für die Herstellung heterologer Proteine in Hefe durch DNA-Rekombinationsverfahren nützlich sind. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren und Materialien, die die Ausbeute der in Hefe hergestellten heterologen Proteine verbessert, wenn die genannte Hefe unter der Kontrolle eines Hefe-Alkohol-Dehydrogenase-Isoenzym II-(ADH II)- Genpromotors oder seiner stromaufwärtigen Aktivierungssequenz (upstream activation sequence, UAS) exprimiert.
    • Hintergrund
  • Die Expression von Fremdgenen in Hefe, die durch das System, das die Expression von ADH II bewirkt, reguliert wird, hat sich als recht nützlich erwiesen. Bei einer solchen Expression wird normalerweise die Sequenz, die das heterologe Protein codiert, unter die Kontrolle des Promotors aus dem ADH2-Gen oder unter die Kontrolle von Hybridpromotoren, bei denen der stromaufwärtige Regulatorbereich des ADH2-Promotors in Kombination mit einem starken Hefepromotor, wie dem Glyceraldehyd-3- phosphat-(GAP)-Promotor, eingesetzt wird, gestellt. Siehe z.B. EPO-Publikation Nr. 164 556, EPO-Publikation Nr. 196 056, die gemeinsame US-Patentanmeldung Aktenzeichen 868639,eingereicht am 29. Mai 1986. Expressionskassetten für das heterologe Protein, bei denen die ADH2-Regulatorbereiche eingesetzt werden, sind normalerweise in dem Hefeexpressionswirt in hohen Kopienzahlen vorhanden. Obwohl mit solchen Expressionssystemen gute Ergebnisse erhalten werden, besteht weiterhin ein Bedürfnis, die Ausbeute an heterologem Protein zu erhöhen.
  • Eine Reihe von Untersuchungen bezüglich der Regulation des ADH2- Gens durch das ADR1-Gen von Hefe, sind veröffentlicht worden. Siehe beispielsweise Shuster et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6: 1894-1902; Denis et al. (1983) Mol. Cell. Biol. 3: 360-370. Mehrere Untersuchungen wurden veröffentlicht, bei denen die Beziehung zwischen dem Maß der Expression bei ADR1 und dem Maß der Expression bei nativen ADH2-Genen untersucht wurde. Siehe Irani et al. (1987) Mol. Cell. Biol. 7: 1233-1241; Denis (1987) Mol. Gen. Genet. 208: 101-106. Diese Untersuchungen zeigten jedoch nicht, ob die erhöhte ADR1-Expression letzten Endes die Ausbeute eines heterologen Proteins, das unter der Kontrolle der ADH2-Regulationssequenzen exprimiert wird, verbessern würde. Beispielsweise wurde von Irani et al. (1987) beobachtet, daß über 100 Kopien von ADR1 die 3- bis 4-fache Inhibierung der ADH2-Transkription, verursacht durch mehrere ADH2-Promotoren, nicht ausglichen. Es wurde vorgeschlagen, daß dieses Ergebnis ein Modell der ADH II-Regulation stützt, nachdem es andere positive, begrenzende Faktoren für die ADH2-Expression gibt als ADR1. Denis (1987) beschrieb ebenfalls, daß eine Erhöhung der ADR1-Gendosierung offensichtlich für den Hefewirt toxisch war, was zu einer signifikanten Erhöhung der Zellverdopplungszeit führte.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Es wurde überraschenderweise gefunden, daß die Ausbeute an heterologem Protein von einem Hefewirt, der durch eine Expressionskassette für das heterologe Protein unter Einsatz des ADH2-Regulationssystems transformiert wurde, signifikant erhöht werden kann, indem man die Expression des durch das ADR1-Gen codierten Proteins in dem Hefewirt erhöht. Dieses Ergebnis ist im Hinblick auf die beschriebene Toxizität der erhöhten Dosierung des ADR1-Gens und den minimalen Effekt von 100+ Kopien des ADR1- Gens auf die ADH II-Aktivität in einem Hefewirt, transformiert mit mehreren ADH2-Promotoren, überraschend.
  • Gemäß einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Expression eines heterologen Proteins in Hefe, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Hefewirt bereitstellt, der transformiert wurde durch (i) eine Expressionskassette für das Nicht-Hefeprotein, umfassend eine DNA-Sequenz, die das Nicht-Hefeprotein unter der Kontrolle der in dem Hefewirt funktionellen, von der Hefe erkannten Transkriptionsinitiations- und -terminationssequenzen codiert, wobei die Transkriptionsinitiationssequenz weiterhin eine stromaufwärtige Hefe-ADH2-Aktivierungsstelle und einen für die stromaufwärtige ADH2-Aktivierungsstelle heterologen Hefepromotor umfaßt, und (ii) eine für den Hefewirt heterologe Expressionskassette für Hefe-ADR I, umfassend eine DNA-Sequenz, die ADR I unter der Kontrolle von in dem Hefewirt funktionellen, von der Hefe erkannten Transkriptionsinitiations- und -terminationssequenzen codiert; (b) eine clonale Population des transformierten Hefewirts unter Bedingungen, unter denen das Nicht-Hefeprotein und ADR I exprimiert werden, züchtet; und (c) daß man das Nicht-Hefeprotein aus der clonalen Population isoliert.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine Hefezelle, die transformiert wurde durch: (a) eine Expressionskassette, umfassend eine DNA-Sequenz, die ein Nicht-Hefeprotein unter der Kontrolle von in dem Hefewirt funktionellen, von der Hefe erkannten Transkriptionsinitiations- und -terminationssequenzen codiert, wobei die Transkriptionsinitiationssequenz eine stromaufwärtige Hefe-ADH2-Aktivierungsstelle und einen für die stromaufwärtige ADH2-Aktivierungsstelle heterologen Hefepromotor umfaßt; und (b) eine für den Hefewirt heterologe Expressionskassette für ADR I, umfassend eine DNA-Sequenz, die ADR I unter der Kontrolle von in dem Hefewirt funktionellen, von der Hefe erkannten Transkriptionsinitiations- und -terminationssequenzen codiert.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfaßt die vorliegende Erfindung eine transformierte Hefe, die, integriert in das Genom, eine Expressionskassette umfaßt, enthaltend eine Sequenz, die ADR I unter der Kontrolle von von der Hefe erkannten Transkriptionsinitiations- und -terminationssequenzen codiert, wobei die Transkriptions initiationssequenz nicht der ADR1-Promotor ist.
  • Diese und andere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind für den Durchschnittsfachmann aus der folgenden Beschreibung offensichtlich.
    • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Fig. 1 ist ein Flußdiagramm, das die Konstruktion der Plasmide pJS119 und pDM15 zeigt.
  • Fig. 2 ist eine Restriktionskarte des Plasmids pJS119. Nicht alle Restriktionsschnittstellen sind gezeigt. Die folgenden Abkürzungen werden in der Figur verwendet: URA3, Hefe-URA3-Gen; LEU2-d, Hefe-LEU2-d-Gen; GAP-t, Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase- mRNA-Terminationssequenzen; ADR1, Hefe-ADR1-Gen; p-GAP, Startsequenzen des Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase-mRNA-Promotors ; p8R322, Sequenzen des E. coli-Plasmids; 2 um, Sequenzen des Hefe-2-Mikron-Plasmids.
  • Fig. 3 ist eine Restriktionskarte des Plasmids pDM15. Nicht alle Restriktionsschnittstellen sind gezeigt. Die Abkürzungen sind dieselben wie in Fig. 2, mit den folgenden zusätzlichen Angaben: G418, Gen, das Resistenz gegen G418 (Geneticin) überträgt; (Sma/Pst), Fusionsstelle der Restriktionsschnittstellen SmaI und PstI.
    • Detaillierte Beschreibung
  • Bei der praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung werden, sofern nicht anders angegeben, herkömmliche, auf dem Fachgebiet bekannte Techniken der Molekularbiologie, Mikrobiologie und der DNA-Rekombination eingesetzt. Diese Techniken sind in der Literatur vollständig erklärt. Siehe beispielsweise Maniatis, Fritsch & Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning, Bd. I & II (D.N. Glover, Hrsg. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, Hrsg. 1984); Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins, Hrsg. 1984); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984).
  • Bei der Beschreibung der vorliegenden Erfindung wird die folgende Terminologie gemäß den nachfolgend angegebenen Definitionen verwendet.
  • "ADH II" betrifft die durch Glucose reprimierbare Alkohol-Dehydrogenase II aus Hefe, insbesondere Saccharomyces und insbesondere S. cerevisiae. "ADH2" betrifft das Hefegen, das ADH II codiert sowie seine zugehörigen Regulationssequenzen. Siehe z.B. Russell et al. (1983), J. Biol. Chem. 258: 2674-2682.
  • "UAS" ist ein auf dem Fachgebiet bekannter Ausdruck für stromaufwärtige Aktivierungssequenzen oder Enhancer-Bereiche, bei denen es sich üblicherweise um kurze repetitive DNA-Sequenzen handelt, die stromaufwärts von der TATA-Box eines Promotors angeordnet sind. In der vorliegenden Erfindung ist die ADH2-UAS von besonderem Interesse; es handelt sich dabei um eine perfekte invertierte Sequenzwiederholung mit 22 bp, die stromaufwärts von der ADH2-TATA-Box angeordnet ist. Siehe Shuster et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6: 1894-1902.
  • ''ADR1" bezeichnet ein positives Regulationsgen aus Hefe, das für die Expression von ADH II erforderlich ist. Siehe z.B. Denis et al. (1983) Mol. Cell. Biol. 3: 360-370. Das von dem ADR1-Gen codierte Protein wird hier als "ADR I" bezeichnet.
  • Ein "Replikon" ist ein beliebiges genetisches Element (z.B. ein Plasmid, Cosmid, Chromosom, Virus), das bei der DNA-Replikation in vivo als autonome Einheit funktioniert, d.h. es ist zur Replikation unter seiner eigenen Kontrolle fähig.
  • Ein "Vektor" ist ein Replikon, wie ein Plasmid, ein Phage oder ein Cosmid, an das ein weiteres DNA-Segment angeknüpft werden kann, um die Replikation des angeknüpften Segments zu bewirken.
  • Ein "doppelsträngiges DNA-Molekül" bezeichnet die polymere Form von Desoxyribonucleotiden (Adenin, Guanin, Thymidin oder Cytosin) als normale doppelsträngige Helix. Dieser Ausdruck betrifft nur die Primär- und Sekundärstruktur des Moleküls und begrenzt die Struktur nicht auf irgendeine besondere tertiäre Form. Dieser Ausdruck umfaßt somit doppelsträngige DNA, die u.a. in linearen DNA-Molekülen (z.B. Restriktionsfragmenten), Viren, Plasmiden und Chromosomen gefunden wird. Bei der Diskussion der Struktur eines bestimmten doppelsträngigen DNA-Moleküls werden die Sequenzen hier nach der normalen Konvention beschrieben: es wird nur die Sequenz in der Richtung von 5' nach 3' des nicht-transkribierten DNA- Strangs angegeben, d.h. des Strangs, der eine homologe Sequenz zu der mRNA hat, die von einer bestimmten Codierungssequenz produziert wird.
  • Eine DNA-"Codierungssequenz" ist eine DNA-Sequenz, die in vivo transkribiert und zu einem Polypeptid translatiert werden kann, wenn sie unter die Kontrolle von geeigneten Regulationssequenzen gestellt wird. Die Grenzen der Codierungssequenz werden von dem Startcodon am 5'- (Amino)-Ende und einem Stoppcodon für die Translation am 3'-(Carboxy)- Ende bestimmt und schließen diese ein. Eine Codierungssequenz kann prokaryotische DNA-Sequenzen, Virus-DNA-Sequenzen, cDNA- oder Genom-DNA-Sequenzen aus eukaryotischen Quellen (z.B. Säugetiere) und sogar synthetische DNA-Sequenzen enthalten; sie ist jedoch nicht darauf beschränkt.
  • "Von der Hefe erkannte Transkriptionsinitiations- und -terminationssequenzen" bezeichnen DNA-Regulationsbereiche, die eine Codierungssequenz flankieren und die in der Hefe für die Transkription einer zu der Codierungssequenz homologen mRNA verantwortich sind, die dann in das Polypeptid translatiert werden kann, das von der Codierungssequenz codiert wird. Transkriptionsinitiationssequenzen schließen Hefepromotorsequenzen ein, bei denen es sich um DNA-Regulationssequenzen handelt, die in einer Zelle Hefe-RNA-Polymerase binden und die Transkription einer Codierungssequenz stromabwärts (3'-Richtung) initiieren können. Für die Definition der vorliegenden Erfindung ist die Promotorsequenz an ihrem 3'- Ende mit dem Translationsstartcodon einer Codierungssequenz verknüpft (und schließt diese aus), und sie erstreckt sich stromaufwärts (5'-Richtung), wobei sie die minimale Anzahl Nucleotide oder Elemente umfaßt, die notwendig sind, um die Transkription in Konzentrationen zu initiieren, die gegenüber dem Hintergrund nachweisbar sind. Innerhalb der Promotorsequenz befindet sich eine Transkriptionsinitiationsstelle (geeigneterweise durch das Kartieren mit der Nuclease S1 definiert) sowie die Protein-bindenden Domänen (Consensus-Sequenzen), die für das Binden der Hefe-RNA-Polymerase verantwortlich sind (z.B. die TATA-Box). Transkriptionsinitiationssequenzen können auch andere Regulationsbereiche enthalten, die für die Promotorregulation oder dessen Verstärkung verantwortlich sind, wie UAS.
  • Für die vorliegende Erfindung nützliche Promotoren schließen den Wildtyp-ADR1-Promotor sowie andere Hefepromotoren ein. Besonders bevorzugt sind Promotoren, die die Enzyme des Glycolysestoffwechselwegs betreffen, z.B. Phosphoglucoisomerase, Phosphofructokinase, Phosphotrioseisomerase, Phosphoglucomutase, Enolase, Pyruvatkinase, Glyceraldehyd-3- phosphat-Dehydrogenase (GAPD), ADH I, ADH II sowie Hybride dieser Promotoren. Ein besonders bevorzugter Hybridpromotor ist das Hybrid, gebildet aus den 5'-Regulationssequenzen des ADH2-Gens (einschließlich UAS) und der Transkriptionsinitiationsstelle sowie den Consensus-Sequenzen des GAPD-Promotors; dies wird als "ADH2/GAPD-Hydridpromotor" bezeichnet. Siehe z.B. EPO-Publikationen Nrn. 120 551 und 164 556 und Nr. 196 056. In gleicher Weise kann eine Transkriptionsterminationssequenz, die auf der 3'-Seite des Translationsstoppcodons angeordnet ist, entweder die ADR1-, ADH2- oder GAPD-Transkriptionsterminationssequenz des Wildtyps sein, oder es kann sich um eine andere von Hefe erkannte Terminationssequenz handeln, wie diejenigen aus den Genen für andere glycolytische Enzyme.
  • Eine Codierungssequenz steht "unter der Kontrolle" von Transkriptionsinitiations- und -terminationssequenzen, wenn RNA-Polymerase an die Transkriptionsinitiationssequenz bindet und die Codierungssequenz in mRNA transkribiert, die an der Transkriptionsterminationssequenz endet, und die mRNA anschließend zu dem Polypeptid translatiert wird, das von der Codierungssequenz codiert wird (d.h. "Expression").
  • Eine "Expressionskassette" ist eine DNA-Konstruktion, die eine Codierungssequenz unter der Kontrolle von Transkriptionsinitiations- und -terminationssequenzen umfaßt. Bei der praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung sind an solchen Konstruktionen von Hefe erkannte Transkriptionsinitiations- und -terminationssequenzen beteiligt, und die Expressionskassetten enthalten beispielsweise eine Codierungssequenz für das ADR1-Protein oder ein Nicht-Hefeprotein oder beides. Es ist besonders bevorzugt, die Expressionskassetten mit Restriktionsschnittstellen zu flankieren, welche bewirken, daß die Kassetten bequem in einen geeigneten Vektor cloniert werden können.
  • Eine Zelle ist durch exogene DNA "transformiert", wenn diese exogene DNA in die Zelle eingeführt worden ist. Die Nachkommen solcher Zellen, die die exogene DNA beibehalten, werden hier ebenfalls als "tranformierte" Zellen bezeichnet. Die exogene DNA kann in die chromosomale DNA, aus der das Zellgenom besteht, integriert (kovalent verknüpft) sein oder nicht. Die exogene DNA kann in der transformierten Zelle extrachromosomal auf einem Replikon, wie einem Plasmid, beibehalten werden. Wenn die exogene DNA in das Chromosom integriert worden ist, wird sie durch die Replikation des Chromosoms auf die Tochterzellen vererbt. Eine Zelle, die durch exogene DNA transformiert wurde, die in das Chromosom integriert worden ist, wird als eine "stabil" transformierte Zelle bezeichnet.
  • Ein "Clon" oder eine "clonale Population" ist eine Zellpopulation, die sich von einer einzelnen Zelle oder einem gemeinsamen Vorfahren durch Mitose ableitet.
  • Zwei DNA-Sequenzen sind "im wesentlichen homolog", wenn mindestens etwa 60 % (vorzugsweise mindestens etwa 75 % und am meisten bevorzugt mindestens etwa 90 %) der Nucleotide über eine definierte Länge (z.B. 100 bp, 200 bp, 500 bp, 1 kb, 2 kb oder mehr) der Moleküle einander entsprechen. Sequenzen, die im wesentlichen homolog sind, können in einem Southern-Hybridisierungsexperiment unter den Bedingungen einer ausgewählten Stringenz, wie sie für das spezielle System definiert ist, identifiziert werden. Das Festlegen geeigneter Hybridisierungsbedingungen gehört zum Fachwissen. Siehe beispielsweise Maniatis et al., supra; DNA Cloning, supra; Nucleic Acid Hydridization, supra.
  • Ein "heterologer" Bereich eines DNA-Moleküls ist ein identifizierbares DNA-Segment innerhalb eines größeren DNA-Moleküls, das in der Natur nicht zusammen mit dem größeren Molekül gefunden wird. Ein identifizierbares Segment ist eine Sequenz mit einer ausreichenden Länge, um festzustellen, daß die Sequenz eine Quelle, die zu dem größeren Molekül oder seinem Herkunftsorganismus exogen ist, besitzt. Wenn daher der heterologe Bereich ein Säugetierprotein codiert, wird der heterologe Bereich üblicherweise von DNA flankiert, welche die Säugetier-DNA-Sequenz in dem Genom des Herkunftsorganismus nicht flankiert. Ein weiteres Beispiel einer heterologen Codierungssequenz ist eine Konstruktion, bei der die Codierungssequenz selbst nicht in der Natur gefunden wird (z.B. eine cDNA, deren genomische Codierungssequenz Introns oder synthetische Sequenzen mit Codons aus anderen Organismen, die das gleiche oder ein ähnliches Protein codieren, enthält. Allele Variationen, Punktmutationen oder natürlich vorkommende Mutationsereignisse führen nicht zu einem "heterologen" DNA-Bereich, wie hier verwendet. Ein zu einem Organismus "heterologes" Protein ist ein Protein, das in der Natur nicht von dem Genom des Organismus codiert wird. Ein "Nicht-Hefe"-Protein ist zu der fraglichen Hefe heterolog.
  • Wie hier verwendet, umfaßt "Hefe" ascosporogene Hefen (Endomycetales), basidiosporogene Hefen und Hefen, die zu den Fungi imperfecti gehören (Blastomycetes). Die ascosporogenen Hefen werden in zwei Familien unterteilt, Spermophthoraceae und Saccharomycetaceae. Letztere besteht aus vier Unterfamilien, Schizosaccharomycoideae (z.B. die Gattung Schizosaccharomyces), Nadsonioideae, Lipomycoideae und Saccharomycoideae (z.B. die Gattungen Pichia, Kluyveromyces und Saccharomyces). Die basidiosporogenen Hefen umfassen die Gattungen Leucosporidium, Rhodosporidium, Sporidiobolus, Filobasidium und Filobasidiella. Hefen, die zu den Fungi Imperfecti gehören, werden in zwei Familien, Sporobolomycetaceae (z.B. die Gattungen Sporobolomyces, Bullera) und Cryptococcaceae (z.B. Gattung Candida) unterteilt. Von besonderem Interesse für die vorliegende Erfindung sind die Arten innerhalb der Gattungen Pichia, Kluyveromyces, Saccharomyces, Schizosaccharomyces und Candida. Von besonderem Interesse sind die Saccharomyces-Arten S. cerevisiae, S. carlsbergensis, S. diastaticus, S. douglasii, S. kluvveri, S. norbensis und S. oviformis. Spezies, die in der Gattung Kluyveromyces von besonderem Interesse sind, schließen K. lactis ein. Da die Klassifizierung der Hefen sich in der Zukunft verändern kann, wird für die Zwecke dieser Erfindung Hefe definiert, wie in Biology and Activities of Yeast (F.A. Skinner, S.M. Passmore & R.R. Davenport Hrsg. 1980) (Soc. App. Bacteriol. Symp. Series Nr. 9) beschrieben. Zusätzlich zu dem vorstehend Erwähnten, sind die Durchschnittsfachleute vermutlich mit der Biologie der Hefe und der Manipulation der Hefegenetik vertraut. Siehe z.B. Biochemistry and Genetics of Yeast (M. Bacila, B.L. Horecker & A.O.M. Stoppani Hrsg. 1978); The Yeasts (A.H. Rose & J.S. Harrison, Hrsg., 2. Aufl., 1987); The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces (Strathern et al., Hrsg. 1981).
  • Als Beispiel wird die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf die Hefe der Gattung Saccharomyces, insbesondere S. cerevisiae, beschrieben. Die Erfindung ist jedoch nicht auf diese Hefen beschränkt.
  • Die vorliegende Erfindung, verstärkte Expression eines heterologen Proteins in Hefe, wird erreicht, indem man die Codierungssequenz für das heterologe Protein im Hefewirt unter die Kontrolle von ADH2-Regulationssequenzen stellt und indem man weiterhin in dem Hefewirt eine verstärkte Expression von ADR I bereitstellt. Die Konstruktion der Expressionskassetten für Nicht-Hefeproteine unter Verwendung von ADH2-Promotoren einschließlich der ADH2-Hybridpromotoren, wie dem ADH2/GAPD-Hybridpromotor, ist vollständig in den EPO-Publikationen Nrn. 120 551 und 164 556 beschrieben. Bei der vorliegenden Erfindung werden Hefewirte eingesetzt, die im Vergleich zu Hefestämmen des Wildtyps eine verstärkte ADR I-Expression aufweisen. Wenn solche Hefewirte in Verbindung mit den obigen Expressionskassetten auf ADH2-Basis verwendet werden, wird die Produktion des heterologen Proteins, das durch die ADH2-Kassetten produziert wird, wesentlich erhöht. Hefewirte, die eine verstärkte ADR I-Expression aufweisen, können auf mehreren Wegen bereitgestellt werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die verstärkte ADR I-Expression bereitgestellt, indem man den Hefewirt mit einer Expressionskassette transformiert, die eine Codierungssequenz für ADR I (üblicherweise aus dem ADR1-Gen) enthält, wobei die Kassette zu einem höheren Maß an ADR I-Expression in dem Wirt führt. Die Expressionskassette kann die Codierungssequenz unter der Kontrolle von ADR1-Transkriptionsinitiations-und -terminationssequenzen umfassen, oder heterologe Transkriptioninitiations- und -terminationssequenzen können verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die ADR I-Kassette unter Verwendung eines starken Hefepromotors anstelle des ADR1-Promotors konstruiert worden; d.h. eines Promotors, der mindestens eine 5-fache Erhöhung der Transkription einer Codierungssequenz, bezogen auf den ADR1-Promotor, bereitstellt. Ein Beispiel für einen solchen Promotor ist der GAPD-Promotor.
  • Die ADR I-Kassetten können bei der Transformation von Hefewirten verwendet werden, indem man entweder die Kassette auf einem extra-chromosomalen Vektor, wie einem Vektor mit hoher Kopienzahl, hält oder indem man sie in das Genom des Hefewirts über einen sich integrierenden Vektor integriert. Die ADR I-Kassette und die Nicht-Hefeproteinkassette können in dem Hefewirt entweder auf demselben oder auf verschiedenen Vektoren beibehalten werden, oder sie können mit demselben oder verschiedenen sich integrierenden Vektoren in das Wirtsgenom eingebaut werden.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird der Hefewirt durch einen integrierenden Vektor transformiert, der die ADR I-Kassette, bei der ein starker Hefepromotor verwendet wird, trägt, und die Kassette für das heterologe Protein wird auf einem extra-chromosomalen Vektor mit hoher Kopienzahl gehalten. Beispielsweise kann bei der integrierten ADR I-Kassette der GAPD-Promotor verwendet werden, und bei der extrachromosomalen Nicht-Hefeproteinkassette kann der ADH2-Promotor oder der ADH2/GAPD-Hybridpromotor verwendet werden.
  • Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Replikons, normalerweise Plasmide, enthalten ein oder mehrere Replikationssysteme, wünschenswerterweise zwei Replikationssysteme, die das Aufrechterhalten des Replikons sowohl in einem Hefewirt für die Expression als auch in einem Bakterienwirt (z.B. E. coli) für die Clonierung erlaubt. Beispiele für solche Hefe-Bakterien-Shuttle-Vektoren sind YEP24 [Botstein et al. (1979) Gene 8: 17-24], pCl/l [Brake et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 4642-4646] und YRp17 [Stinchomb et al. (1982) J. Mol. Biol. 158: 157]. Weiterhin kann es sich bei einem extra-chromosomalen Vektor entweder um einen Vektor mit hoher oder niedriger Kopienzahl handeln, wobei die Kopienzahl generell im Bereich von etwa 1 bis etwa 500 liegt. Bei Hefevektoren mit hoher Kopienzahl gibt es im allgemeinen mindestens 10, bevorzugt mindestens 20 und normalerweise nicht mehr als etwa 150 bis 500 Kopien in einem einzelnen Wirt. Je nach ausgewähltem Nicht-Hefeprotein kann entweder ein Vektor mit hoher oder niedriger Kopienzahl angestrebt sein; dies hängt von der Wirkung des Vektors und des Fremdproteins auf den Wirt ab. Vgl. z.B. Brake et al., supra. Erfindungsgemäße DNA-Konstruktionen können auch durch einen integrierenden Vektor in das Hefegenom integriert werden. Beispiele für solche Vektoren sind auf dem Fachgebiet bekannt. Siehe z.B. Botstein et al., supra. Bevorzugt werden weniger als 50 Kopien der Kassette in das Genom integriert, mehr bevorzugt weniger als etwa 10 und normalerweise weniger als etwa 5 (zusätzlich zu einem beliebigen Wildtyp-Gen). Typischerweise werden nur 1 oder 2 Kopien integriert.
  • Die Auswahl der geeigneten Hefe und anderer Wirtsmikroorganismen (z.B. Diploid, Haploid, Auxotrophe etc.) für die praktische Durchführung der vorliegenden Erfindung ist für den Fachmann Routine. Bei der Auswahl von Hefewirten für die Expression können geeignete Wirte solche sein, die u.a. eine gute Sekretionskapazität, eine geringe proteolytische Aktivität und insgesamt Widerstandsfähigkeit besitzen. Hefe und andere Mikroorganismen sind generell über eine Vielzahl von Quellen erhältlich, u.a. vom Yeast Genetic Stock Center, Department of Biophysics and Medical Physics, University of California, Berkeley, Californien und von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland.
  • Verfahren zur Einführung von exogener DNA in Hefewirte sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Es gibt eine große Auswahl von Wegen für die Transformation der Hefe. Beispielsweise wird die Sphäroplasten-Transformation beispielsweise von Hinnen et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1919-1933 und Stinchcomb et al., EPO-Publikation Nr. 45 573 gelehrt. Die Transformanten werden in einem geeigneten Nährmedium gezüchtet und ggf. unter Selektionsdruck gehalten, um die Retention der endogenen DNA sicherzustellen. Wenn die Expression induzierbar ist, kann das Wachstum des Hefewirts zugelassen werden, um eine hohe Zelldichte zu erhalten, dann wird die Expression induziert. Das Nicht-Hefeprotein kann nach einem beliebigen herkömmlichen Verfahren gewonnen werden und durch Chromatographie, Elektrophorese, Dialyse, Flüssig-Flüssig-Extraktion und dgl. gewonnen werden.
    • Beispiele
  • Die folgenden Beispiele sind nur zur Verdeutlichung angegeben, sie sollen den Bereich der vorliegenden Erfindung nicht einschränken. Es wird angenommen, daß die Hinterlegung der biologischen Ausgangsmaterialien für die Durchführung der vorliegenden Erfindung nicht notwendig ist, da entweder die gleichen oder äquivalente Materialien allgemein zugänglich sind. Die Offenbarungen aller in der Beschreibung zitierten Literaturstellen sind vermutlich dem Durchschnittsfachmann geläufig; auf sie wird hier ausdrücklich Bezug genommen.
    • I.
  • Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion einer Expressionskassette zur verstärkten Expression von ADR 1, ihre Insertion in einen autonom replizierenden Hefevektor und die Transformation von Hefestämmen damit. Fig. 1 zeigt ein Flußdiagramm der Konstruktion des Vektors, Fig. 2 zeigt eine partielle Restriktionskarte des resultierenden Vektors.
  • Das Plasmid YPp7-ADR1-411 [Denis et al. (1983) Mol. Cell. Biol. 3: 360-370] enthält das Hefe-ADR1-Gen. Dieses Plasmid wurde mit dem Restriktionsenzym HincII gespalten, und es wurde ein Fragment isoliert, das das ADR1-Gen enthielt, wobei die Codons für die ersten 16 Aminosäuren am 5'- Ende fehlten. Ein Oligonucleotid wurde nach herkömmlichen Verfahren synthesisiert, um die N-terminalen Codons zu ersetzen und um eine 5'-Verlängerung bereitzustellen, die eine BglII-Restriktionsspaltstelle enthält. Die Sequenz des Oligonucleotid-Adapters, der unter Verwendung von bei Hefe bevorzugten Codons anstelle der normalerweise in dem ADR1-Gen vorhandenen Codons hergestellt wurde, ist nachfolgend angegeben.
  • Der Adapter wurde mit dem HincII-Fragment von YPp7-ADR1-411 unter Standardbedingungen ligiert. Nach dem Inaktivieren der Ligase wurde das Gemisch mit BglII gespalten, um ein 1,9 kb BglII-Fragment herzustellen, das codierende Sequenzen für die ersten 641 Aminosäuren von ADR I enthielt. Dieses BglII-Fragment wurde dann gereinigt, erneut cloniert und in eine BglII-Spaltstelle zwischen einen GAPD-Promotor und einem GAPD-Terminator im Plasmid pA827 ligiert, so daß der Promotor die korrekte Transkription der ADR I-Codierungssequenz steuert. Das resultierende Plasmid wurde mit pJS118 bezeichnet.
  • Das Plasmid pA827 ist ein Hefe-Shuttle-Expressionsvektor, umfassend Sequenzen aus dem Hefe-2-Mikron-Plasmid, dem E. coli pBR322-Plasmid, den Hefemarkergenen URA3 und LEU-2d und eine "leere" GAPD-Expressionskassette mit einer BglII-Insertionsstelle, die zwischen der GAPD-Promotor- und der GAPD-Terminatorsequenz angeordnet ist.
  • Plasmid pJS118 ist ein Zwischenprodukt, da es nur die ersten 641 Aminosäuren von ADR I codiert. Der Rest der Codierungssequenz des ADR1- Gens wurde diesem Vektor anschließend hinzugefügt, wodurch pJS119 erhalten wurde. Zunächst wurde YRp7-ADR1-411 mit SacI gespalten, und ein 4 kb Fragment wurde isoliert, das die restliche Codierungssequenz von ADR1 und seine 3'-flankierenden Sequenzen enthält. Dieses 4 kb Fragment wurde dann in mit SacI gespaltenes und mit alkalischer Phosphatase behandeltes pJS118 ligiert, um das Plasmid pJS119 herzustellen. Die Vollständigkeit der ADR1-Codierungssequenz wurde durch Restriktionsenzymanalyse untersucht, um sicherzustellen, daß das Fragment in der korrekten Orientierung insertiert worden war. Das Plasmid pJS119 wurde in zwei verschiedene Hefewirtsstämme, AB110 und JC482, transformiert, wobei Standardverfahrensweisen eingesetzt wurden. Siehe beispielsweise Hinnen et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929.
  • Der Hefestamm AB110 wurde durch Kreuzen von S. cerevisiae 2150-2-3 (erhältlich von Lee Hartwell, University of Washington) mit der Transformante AB103.1 von S. cerevisiae, die das pCl/1-Derivat enthält, erhalten. Die Diploiden wurden zur Sporulation veranlaßt, und die Tetraden wurden getrennt. Die Stämme wurden auf Leucin-selektiven Platten gehalten, um das Beibehalten des Plasmids sicherzustellen, da die Eltern auxotroph sind. Eine Reihe von Kolonien wurden nach ihrem Genotyp im Hinblick auf eine Anzahl von Markern (Mat α, ura3, leu2, pep4-3) abgesucht. Der Stamm AB110 wurde erhalten, indem man den resultierenden Hybridstamm von seinem innewohnenden Plasmid durch Züchten in Gegenwart von Leucin (d.h. fehlender Selektionsdruck) befreite und anschließend durch Replikaplattieren leu&supmin;-Kolonien selektierte. AB110 hat den folgenden Genotyp: Mat α, ura3-52, leu2-04 oder sowohl leu2-3 als auch leu2-112, pep4-3, his4-580, cirº. Eine Probe dieses Stammes, die ein unterschiedliches heterologes Plasmid enthält, wurde am 9. Mai 1984 bei der ATCC unter der Hinterlegungsnr. 20709 hinterlegt. Siehe EPO-Publikation Nr. 164 556
  • Der Stamm JC482 wurde von Dr. John Cannon von der University of Pennsylvania, Philadelphia, Pennsylvania, erhalten. Der Stamm wurde von seinem innewohnenden 2-Mikron-Plasmid befreit.
  • Die obigen Stämme zeigen verstärkte ADH II-Aktivität und sind für die Transformation mit einer Expressionskassette für ein heterologes Protein unter der Kontrolle einer ADH2-Regulationssequenz geeignet, insbesondere mit Expressionskassetten auf einem integrierenden Vektor. Als Alternative könnten solche Expressionskassetten in eine beliebige geeignete Restriktionsspaltstelle von pJS119 insertiert werden und der resultierende Vektor für die Transformation eines geeigneten Hefestammes verwendet werden.
    • II.
  • Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion eines integrierenden Vektors, der eine Expressionskassette für ADR I enthält, und die Transformation von Hefestämmen damit. Das integrierende Plasmid pDM15 ist in Fig. 3 dargestellt, und die Konstruktion ist in dem Flußdiagramm in Fig. 1 gezeigt.
  • Das Plasmid pJS132 ist ein Plasmid, das pBR322-Sequenzen enthält, sowie ein Gen, das die G418-Resistenz in Hefe codiert unter der Kontrolle der ADH1-Promotor- und Terminatorsequenzen von Kluvveromyces lactis. Dieses Plasmid wird mit SmaI und SalI gespalten, und das große lineare Fragment wird gereinigt.
  • Das Plasmid pJS119 wurde mit PstI gespalten, und zwar findet die Spaltung an einer stromabwärts vom 3'-Ende der ADR I-Codierungssequenz statt. Das gespaltene Plasmid wurde dann mit einzelstrangspezifischer S1- Nuclease behandelt, um stumpfe Enden zu erzeugen, dann wurde es mit Sall gespalten, um ein 6,2 kb Fragment herzustellen, das die ADR I-Expressionskassette enthält. Zwischen jeder der aufeinanderfolgenden Stufen wurde mit Phenol extrahiert und mit Ethanol gefällt. Das SalI-Fragment mit stumpfen Enden wurde dann mit dem großen pJS132-Fragment ligiert, um das Plasmid pDM15 herzustellen.
  • Das Plasmid pDM15 wurde dann verwendet, um ADR I-überproduzierende Saccharomyces-Stämme zu erzeugen, indem man die Hefe unter Einsatz von Standardverfahren transformierte. Beispielsweise wurde der Stamm AB110 zur G418-Resistenz transformiert, und ein Stamm, der Überproduktion von ADR I aufwies, wurde isoliert. Dieser Stamm wurde mit JSC300 bezeichnet. Ein weiterer ADR I-überproduzierender Stamm JS302 wurde auf gleiche Weise aus dem Stamm BJ2168 (Yeast Genetic Center, supra), der von seinem innewohnenden Plasmid befreit worden war, hergestellt. Noch ein weiterer ADR I-überproduzierender Stamm ist JSC308.
    • III.
  • Das folgende Beispiel zeigt die Nützlichkeit der Hefestämme mit verstärkter ADR I-Produktion als Expressionswirte für heterologe Proteine.
  • Der Hefestamm JC300 wurde mit Expressionsvektoren für ein Superoxiddismutase (SOD)/insulinartiger Wachstumsfaktor II (IGF II)-Fusionsprotein und für den menschlichen basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (basic human fibroblast growth factor, hFGF) transformiert.
  • Der SOD/IGF II-Expressionsvektor pYLUIGF2-14 wird in der EPO-Publikation Nr. 196 056 beschrieben. Er ist ebenfalls unter der ATCC-Hinterlegungsnummer 20745 (27. Februar 1985) hinterlegt.
  • Der Expressionsvektor für den basischen hFGF, pa/G-hFGF, wurde folgendermaßen hergestellt. Zunächst wurde ein synthetisches hFGF-Gen nach Standardmethoden hergestellt, das die folgende Sequenz besitzt:
  • Das Plasmid pBS100 [EPO-Publikation Nr. 181 150] enthält die ADH2/GAPD-Hybridpromotorkassette. Die synthetische hFGF-Sequenz wurde gelgereinigt und in mit Ncol/Sall gespaltenes pBS100 cloniert, um die hFGF-Sequenz in die Kassette einzufügen. Die Kassette wurden aus dem pBS100/FGF-Plasmid mit BamHI ausgeschnitten und dann in die BamHI- Schnittstelle des Hefe-Shuttle-Vektors pAB24 cloniert. Siehe EPO-Anmeldung Nr. 88312306.9 und japanische Anmeldung Nr. 63-335685. Der resultierende Vektor wurde mit pA/G-hFGF bezeichnet.
  • Die obigen Expressionskassetten enthielten eine UAS aus dem ADH2- Gen. Die Stämme wurden nach der Transformation gezüchtet, und das heterologe Protein wurde mittels Standardverfahren gewonnen. Das isolierte Protein wurde durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert. Die Expression der SOD/IGF II-Fusion und von hFGF in den Stämmen AB110 (Kontrolle) und JCS300 zeigte, daß eine Erhöhung der Ausbeute des Nicht-Hefeproteins auftrat, wenn JCS300 als Wirt verwendet wurde.
  • Weitere Beispiele für die Expression in hoher Ausbeute schließen Polypeptide aus dem menschlichen Immunodefizienz-Virus (HIV) vom Typ 1 ein. Beispielsweise kann ein Polypeptid, das der Carboxy-terminalen Hälfte des HIV-gp120env entspricht, in hohen Konzentrationen exprimiert werden. Beispiele für geeignete Expressionsvektoren können in der EPO-Publikation Nr. 181 150 und der japanischen Patentanmeldung Nr. 60-246102 gefunden werden. Ein darin beschriebener, besonders bevorzugter Vektor ist pBS24/SOD-SF2env4.
    • Hinterlegung der biologischen Materialien
  • Proben der folgenden Stämme und Plasmide wurden bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USA, hinterlegt und werden gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags aufbewahrt. Die Hinterlegungsnummern und die Hinterlegungsdaten sind nachfolgend aufgeführt. Hinterlegtes Material ATCC-Hinterlegungs-Nr. Hinterlegungsdatum S. cerevisiae
  • Diese Hinterlegungen werden als Entgegenkommen für die Fachleute zur Verfügung gestellt. Mit diesen Hinterlegungen wird weder zugegeben, daß solche Hinterlegungen für die Durchführung der vorliegenden Erfindung notwendig sind, noch, daß äquivalente Ausführungsformen im Hinblick auf die vorliegende Offenbarung nicht innerhalb des Fachwissens liegen. Die allgemeine Zugänglichkeit dieser Hinterlegungen stellt nicht die Gewährung einer Lizenz zur Herstellung, Verwendung oder zum Verkauf der hinterlegten Materialien unter diesem oder irgendeinem anderen Patent dar. Auf die Nucleinsäuresequenzen der hinterlegten Materialien wird hier ausdrücklich Bezug genommen, und sie sind maßgeblich, wenn Widersprüche mit irgendeiner hier beschriebenen Sequenz bestehen.
  • Obwohl die vorliegende Erfindung der Klarheit und des Verständnisses wegen detailliert anhand von Erläuterungen und Beispielen beschrieben worden ist, ist es selbstverständlich, daß Veränderungen und Modifizierungen innerhalb des Bereichs der beigefügten Ansprüche durchgeführt werden können.

Claims (14)

1. Verfahren zur Expression eines nicht-Hefeproteins in einem Hefewirt, dadurch gekennzeichnet, daß man
(a) einen Hefewirt bereitstellt, der transformiert wurde durch
(i) eine Expressionskassette für das nicht-Hefeprotein, umfassend eine DNA-Sequenz, die das nicht-Hefeprotein unter der Kontrolle der in dem Hefewirt funktionellen, von der Hefe erkannten Transkriptionsintitiations- und -terminationssequenzen codiert, wobei die Transkriptionsinitiationssequenz weiterhin eine stromaufwärtige Hefe-ADH2-Aktivierungsstelle und einen für die stromaufwärtige ADH2-Aktivierungsstelle heterologen Hefepromotor umfaßt, und
(ii) eine für den Hefewirt heterologe Expressionskassette für ADR1, umfassend eine DNA-Sequenz, die ADR1 unter der Kontrolle von in dem Hefewirt funktionellen, von der Hefe erkannten Transkriptionsinitiations- und -terminationssequenzen codiert,
(b) eine clonale Population des transformierten Hefewirts unter Bedingungen, unter denen das nicht-Hefeprotein und ADR1 exprimiert werden, züchtet, und
(c) das nicht-Hefeprotein aus der clonalen Population isoliert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Hefepromotor ein GAPD-Promotor ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die ADR1-Expressionskassette einen nicht-ADR1-Promotor umfaßt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der nicht-ADR1-Promotor der GAPD-Promotor ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die ADR1-Expressionskassette auf einem extra-chromosomalen Vektor gehalten wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der extra-chromosomale Vektor ein Plasmid mit hoher Kopienzahl ist.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die ADR1-Expressionskassette in das Genom des Hefewirts integriert wird.
8. Transformierter Hefewirt, umfassend:
(a) eine Expressionskassette, umfassend eine DNA- Sequenz, die ein nicht-Hefeprotein unter der Kontrolle von in dem Hefewirt funktionellen, von der Hefe erkannten Transkriptionsinitiations- und -terminationssequenzen codiert, wobei die Transkriptionsinitiationssequenz eine stromaufwärtige Hefe-ADH2-Aktivierungsstelle und einen für die stromaufwärtige ADH2-Aktivierungsstelle heterologen Hefepromotor umfaßt, und (b) eine für den Hefewirt heterologe Expressionskassette für ADR1, umfassend eine DNA-Sequenz, die ADR1 unter der Kontrolle der von in dem Hefewirt funktionellen, von der Hefe erkannten Transkriptionsinitiations- und -terminationssequenzen codiert.
9. Hefe nach Anspruch 8, wobei der für die stromaufwärtige ADH2-Aktivierungsstelle heterologe Hefepromotor einen Hefe-GAPD-Promotor umfaßt.
10. Hefe nach Anspruch 8 oder 9, wobei die nicht-Hefeprotein-Expressionskassette in der Hefe auf einem extra-chromosomalen Vektor gehalten wird.
11. Hefe nach einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei die ADR1-Expressionskassette in das Genom der Hefe integriert ist.
12. Hefe nach Anspruch 11, wobei die ADR1-Expressionskassette einen GAPD-Promotor umfaßt.
13. Hefe nach Anspruch 8, wobei die ADR1-Expressionskassette in das Genom der Hefe integriert ist und die darin enthaltene Transkriptionsinitiationssequenz ein starker nicht- ADR1-Hefepromotor ist und die nicht-Hefeprotein-Expressionskassette auf einem extra-chromosomalen Vektor gehalten wird.
14. Verwendung einer transformierten Hefe, unmfassend eine in das Genom integrierte Expressionskassette, enthaltend eine codierende Sequenz für ADR1 unter der Kontrolle von von der Hefe erkannten Transkriptionsinitiations- und -terminationssequenzen, wobei die Transkriptionsinitiationssequenz eine andere als der ADR1-Promotor ist, zur Produktion eines transformierten Hefewirts, wie in einem der Ansprüche 8 bis 13 definiert.
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