JPH09261A - 糖蛋白質の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 天然型ピキア属酵母株に比して糖鎖伸長能が
抑制されてなる修飾ピキア属酵母株を培養し、培養物か
ら糖蛋白質を採取することを特徴とする糖蛋白質の製造
方法。修飾ピキア酵母株は、ピキア属酵母に由来する、
糖蛋白質の糖鎖伸長に携わるタンパクをコードする塩基
配列を有するＤＮＡの塩基配列の一部が、該ＤＮＡによ
ってコードされる機能産物の産生が少なくとも抑制され
るように修飾されてなるＤＮＡを有する。 【効果】 本発明によれば、遺伝子レベルで該酵母が本
来もつ糖鎖伸長能を抑制し、医薬上有用な生理活性蛋白
質と同一もしくは類似の構造の糖鎖を有する糖蛋白質を
ピキア属酵母を産生株または宿主として産生させること
ができる。本発明によれば、酵母と哺乳類細胞とで共通
するＥＲコア糖鎖と同一もしくは類似の糖鎖構造を有す
る糖蛋白質が調製可能。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ピキア属酵母に由来す
る、糖蛋白質の糖鎖伸長に携わるタンパクをコードする
遺伝子を修飾してなるＤＮＡを有する修飾ピキア属酵母
株を産生株または宿主として用いる糖蛋白質の製造方法
に関する。このタンパクは、ピキア属酵母を宿主とする
糖蛋白質発現系において産生される糖蛋白質における糖
鎖の伸長、好ましくはα−１，６結合マンノースの伸長
に関与するものである。医薬上重要な生理活性蛋白質の
ほとんどは糖蛋白質であるが、本発明の糖蛋白質の製造
方法によれば、酵母と哺乳類細胞とで共通するＥＲコア
糖鎖と同一構造のＭａｎ₈ ＧｌｃＮＡｃ₂ 糖鎖のみを有
する糖蛋白質を調製し得る。

【０００２】

【従来の技術・発明が解決しようとする課題】生体内で
機能する蛋白質の殆どは、糖鎖による修飾を受けた糖蛋
白質である。近年、糖鎖の構造については、レクチンを
用いた解析等の従来の方法に加え、ＨＰＬＣやＮＭＲ、
ＦＡＢ−ＭＡＳを用いた新しい分析法等が開発され、次
々と新しい糖蛋白質の糖鎖構造が解明されてきている。
一方、多くの研究者によって糖鎖の機能解析の研究も盛
んとなり、糖鎖は細胞間認識、分子識別、蛋白質の構造
維持や活性への寄与、生体内でのクリアランス、分泌、
局在化など多くの生体内機構に重要な役割を担っている
ことがわかってきた。

【０００３】例えば、糖鎖構造とその機能がよく研究さ
れているヒト・エリスロポエチン〔竹内、蛋白質・核酸
・酵素、増刊「複合糖質」37, 1713 (1992) 参照〕にお
いては、エリスロポエチンに付加されているアスパラギ
ン結合型糖鎖は（図１にその機能分担モデルを示す）、
その先端部分のＮｅｕ５Ａｃ（シアル酸）が血中クリア
ランス、分岐部分のＧａｌ／ＧａｌＮＡｃ基（ガラクト
ース／Ｎ−アセチルガラクトサミン）は受容体との結合
に関する立体的な寄与、そしてコア部分はペプチドの活
性発現維持の関与と多岐にわたる機能に関与しているこ
とが報告されている。このように糖蛋白質の糖鎖は、そ
の構造が複雑であるだけでなく機能も多岐に渡っている
ことから、特に医薬品として糖蛋白質を開発する場合に
はその構造および機能解析が重要である。

【０００４】ところで、微生物を用いた物質生産は、そ
の生産コストの低さや、これまで醗酵工学として培って
きた培養技術など、動物細胞を用いた物質生産に比べる
と、いくつかの点で有利である。しかしながら、微生物
においてはヒト糖蛋白質と同一構造の糖鎖（例えば上述
したエリスロポエチンにおいて機能している上記糖鎖）
を付加することができないという問題がある。つまり、
ヒトを含め動物細胞由来の糖蛋白質は、図１で示したよ
うな複合型、さらに混成型およびハイマンノース型の３
種類のアスパラギン結合型糖鎖に加え、多種多様のムチ
ン型糖鎖を有しているが、大腸菌等の原核微生物では糖
鎖付加自体が起こらず、また真核微生物であるパン酵母
（ Saccharomyces cerevisiae ）でも付加されるアスパ
ラギン結合型糖鎖はハイマンノース型のみで、ムチン型
はマンノースのみを主成分とする糖鎖しか付加されな
い。従って、上述したエリスロポエチン等のように糖鎖
が重要な機能を持っている糖蛋白質の遺伝子組換え生産
には、微生物は適しておらず、実際にエリスロポエチン
の生産にはチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ
細胞）が用いられている。

【０００５】これに対しパン酵母等の真核微生物の遺伝
子工学的な分子育種を行い、パン酵母細胞内で動物細胞
と同一あるいは類似の構造の糖鎖を付加させようとする
研究も行われ始めている。1994年、Schwientekらはパン
酵母でヒト由来β-1,4-galactosyltransferase遺伝子の
活性発現の成功を報告している〔Schwientek,T. andErn
st, J.F., Gene, 145, 299 (1994)〕。また、Krezdrn
らも同様の研究を進めており、同じくパン酵母でヒト由
来β-1,4-galactosyltransferase及びα-2,6-sialyltra
nsferaseの活性発現を行っている〔Krezdrn,C.H., et a
l., Eur.J.Biochem.220, 809 (1994) 〕。

【０００６】また、一方でパン酵母由来の糖蛋白質の糖
鎖自体の改変を目的とする試みが行われている。パン酵
母由来の糖蛋白質に付加されるハイマンノース型糖鎖は
動物細胞のハイマンノース型糖鎖よりもさらにマンノー
スを多量に含む、いわゆるHyper mannosylation された
糖鎖が多数を占めており、この過剰に付加されたマンノ
ースのうち、β結合したマンノースにα-1,3結合したマ
ンノース残基を出発点として伸長するα-1,6結合マンノ
ースや外糖鎖に付加されるα-1,3結合マンノース等はパ
ン酵母特有の構造である（図２）。

【０００７】1992年、地神らはこのα-1,6結合マンノー
スの伸長の鍵酵素であると考えられているパン酵母のＯ
ＣＨ１遺伝子（α-1,6-mannosyltransferaseを発現す
る) のクローニングに成功した(Nakayama, K., EMBO J.
11, 2511 (1992)、図２参照〕。このＯＣＨ１遺伝子の
破壊株（△ｏｃｈ１）の糖蛋白質には、Ｍａｎ₈ Ｇｌｃ
ＮＡｃ₂ 、Ｍａｎ₉ ＧｌｃＮＡｃ₂ 、Ｍａｎ₁₀ＧｌｃＮ
Ａｃ₂ の３種の糖鎖が付加されており、このうちＭａｎ
₈ ＧｌｃＮＡｃ₂ 糖鎖は、パン酵母と哺乳類細胞とで共
通するＥＲコア糖鎖と同一の構造（図２中、「Ｍａ」 で
記載した構造）で、Ｍａｎ₉ ＧｌｃＮＡｃ₂ 、Ｍａｎ₁₀
ＧｌｃＮＡｃ₂ の糖鎖は、このＥＲコア糖鎖にα-1,3結
合マンノースが付加された構造〔Nakanishi-Shindo,Y.,
Nakayama,K.,Tanaka,A.,Toda,Y. and Jigami,Y., (199
4), J.Biol.Chem.〕であった。さらに、△ｏｃｈ１，ｍ
ｎｎ１二重変異株（図２参照）を作製して末端のα-1,3
結合マンノース転移を阻害することにより、パン酵母と
哺乳類細胞で共通するＥＲコア糖鎖と同一構造のＭａｎ
₈ ＧｌｃＮＡｃ₂ 糖鎖のみを付加するパン酵母宿主を作
製できた。この△ｏｃｈ１，ｍｎｎ１二重変異株は、ハ
イマンノース型糖鎖を有する哺乳類由来の糖蛋白質を遺
伝子組換え技術により生産する際に有用な宿主となると
考えられている〔地神芳文(1994)蛋白質・核酸・酵素,
39,657〕。

【０００８】ところで、近年、メタノール資化性酵母で
あるピキア属酵母（Pichia pastoris 等）が異種蛋白発
現系の有効な宿主として注目を浴びている。ピキア属酵
母は、特にその分泌発現量がパン酵母を大きく上回って
おり、また培養技術が確立しているので工業生産に用い
られる酵母として大変好適に用いられる。しかしなが
ら、ピキア属酵母が有する糖蛋白質の糖鎖伸長機構やピ
キア属酵母によって産生される糖蛋白質の糖鎖構造等に
ついての研究はほとんど行われていないのが現状であ
る。

【０００９】本発明は、遺伝子組換え技術により、ピキ
ア属酵母を用いて、哺乳類由来の糖蛋白質と同一もしく
は類似の糖鎖構造を有する糖蛋白質を製造する糖蛋白質
製造方法を提供することを目的とする。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ピキア属
酵母を宿主として種々の生理活性蛋白質の産生を行って
いるが、上述のように生理活性蛋白質の殆どは糖蛋白質
であることから、ピキア属酵母を組換え生産の宿主とす
る場合、糖蛋白質の糖鎖の問題は避けられない問題であ
る。そこで、かかる問題を解決すべく種々研究を重ねた
ところ、ピキア属酵母に由来する糖鎖伸長に携わるタン
パクをコードする遺伝子のクローニングに成功し、当該
タンパクがピキア属酵母を宿主とする発現系において、
糖蛋白質の糖鎖の伸長に関与していることを確認して本
発明を完成した。

【００１１】すなわち本発明は、糖蛋白質の糖鎖伸長に
携わるタンパクをコードする塩基配列を有するＤＮＡの
一部が、該ＤＮＡによってコードされる機能産物の産生
が少なくとも抑制されるように修飾されてなるＤＮＡを
有することによって、天然型ピキア属酵母株に比して糖
蛋白質の糖鎖伸長能が抑制されてなる修飾ピキア属酵母
株を培養し、培養物から糖蛋白質を採取することを特徴
とする糖蛋白質の製造方法に関する。

【００１２】以下、本発明について詳細に説明する。 （１）糖蛋白質の糖鎖伸長に携わるタンパク このタンパクは、原始的にはピキア属酵母によって産生
されるタンパクであり、糖蛋白質の糖鎖の伸長の最初の
段階をつかさどっており、糖鎖の伸長を制御する機能を
有することを特徴とする。なお、以下説明を簡便にする
ため、前記タンパクを糖鎖伸長タンパクともいう。

【００１３】この糖鎖伸長タンパクの由来となるピキア
属酵母としては、特に制限はないが、具体的には Pichi
a pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophil
a, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichi
a opuntiae, Pichia thermotolerans, Pishia salictar
ia, Pichia guercuum Pichia pijperi等が例示され
る。好ましくは Pichia pastoris( 以下、P.pastorisと
いう) である。

【００１４】この糖鎖伸長タンパクは原始的にピキア属
酵母に由来するものであり、かつ上記機能を有するもの
であれば特に制限されないが、好ましくはＮ末端領域に
式Ｉで示されるアミノ酸配列を有するタンパクであり、
より好ましくは実質的に式IIで示されるアミノ酸配列を
有するタンパクである。

【００１５】

【化４】

【００１６】

【化５】

【００１７】なお、かかるアミノ酸配列は、上述の特性
を変更しない範囲で、一部が修飾（例えば、アミノ酸残
基またはペプチド鎖の置換、欠失、挿入または付加等）
されていてもよい。

【００１８】この糖鎖伸長タンパクは、その一次構造と
して例示される式II記載のアミノ酸配列が、パン酵母に
由来するα-1,6結合マンノース伸長の鍵酵素、α-1,6-m
annosyltransferaseのアミノ酸配列と高い相同性（約４
０％）を有し、また後述するようにそのＤＮＡもパン酵
母に由来する該酵素をコードするＯＣＨ１遺伝子と高い
相同性（約５５％）を有すること等から、ピキア属酵母
に由来するα-1,6結合マンノース伸長の鍵酵素である可
能性が高い。

【００１９】この糖鎖伸長タンパクは、ピキア属酵母を
常法に従って、好ましくは該酵母の増殖に適した条件下
で培養し、培養菌体から常法により抽出、精製すること
により製造することができる。また、本発明で例示する
アミノ酸配列に基づいてポリペプチド合成したり、また
本発明で例示する塩基配列に基づいて慣用の組換えＤＮ
Ａ技術によっても製造することができる。

【００２０】（２）糖鎖伸長タンパクをコードする塩基
配列を有するＤＮＡ このＤＮＡは、前述の糖鎖伸長タンパクをコードする塩
基配列を有することを特徴とするものである。以下、こ
のＤＮＡを糖鎖伸長ＤＮＡ、もしくは後述の修飾糖鎖伸
長ＤＮＡと区別するため天然型糖鎖伸長ＤＮＡともい
う。かかる塩基配列は、糖鎖伸長タンパクをコードし得
る塩基配列であれば特に制限されないが、好適には式Ｉ
で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列、より好
ましくは実質的に下記式III で示される塩基配列が例示
される。

【００２１】

【化６】

【００２２】当該ＤＮＡは、従来公知の手法により製造
することができる。例えば、本発明で例示する塩基配列
をもとにＤＮＡ合成機を用いてその一部または全てのＤ
ＮＡを合成したり、ピキア属酵母（例えばP.pastoris）
の染色体ＤＮＡを用いてＰＣＲ法で増幅させることによ
り製造することも可能である。

【００２３】前記糖鎖伸長ＤＮＡは、ピキア属酵母によ
って産生される、糖蛋白質の糖鎖伸長に携わるタンパク
をコードする遺伝子として提供されるものであって、ピ
キア属酵母を宿主とする糖蛋白質発現系における糖蛋白
質の糖鎖の構造・機能等の機序を解明する上で極めて有
用である。

【００２４】前記糖鎖伸長タンパクは、ピキア属酵母を
宿主として産生される蛋白質のコア糖鎖にさらにα−
１，６結合マンノースを転移する働きを有し、動物細胞
由来の糖蛋白質に比べて過剰にマンノースを付加させて
しまう。よって、糖鎖伸長タンパクが本来的に有する糖
鎖伸長活性の減弱または除去は、糖鎖伸長タンパクをコ
ードする塩基配列を有するＤＮＡを、該ＤＮＡによって
コードされる機能産物の産生を少なくとも抑制するよう
に修飾することによって達成することができる。

【００２５】（３）天然型糖鎖伸長ＤＮＡが修飾されて
なるＤＮＡ 本発明に用いられる修飾ピキア属酵母株が有する糖鎖伸
長タンパクをコードするＤＮＡ（天然型糖鎖伸長ＤＮ
Ａ）の修飾物は、ピキア属酵母に由来する、糖蛋白質の
糖鎖伸長に携わるタンパクをコードするＤＮＡの塩基配
列の一部が、該ＤＮＡによってコードされる機能産物の
産生を少なくとも抑制されるように修飾されてなるＤＮ
Ａである。

【００２６】ここで「ＤＮＡによってコードされる機能
産物」とは、ピキア属酵母に由来する天然型糖鎖伸長Ｄ
ＮＡによってコードされるタンパク、すなわち糖蛋白質
の糖鎖伸長に携わるタンパクをいうが、前述する当該タ
ンパクと同一の機能を有している限り、ここでいう機能
産物に包含される。ここで「機能」とは、糖鎖伸長タン
パクが有する糖鎖合成・伸長に関する機能（活性）、具
体的には、「少なくともコア糖鎖にα−１，６結合マン
ノースを転移する」活性（本明細書において、「糖鎖伸
長活性」という。）を意味する。また「機能産物の産生
が少なくとも抑制」とは、発現せず本発明の天然型糖鎖
伸長ＤＮＡがコードするタンパクを全く産生しない場合
のみならず、発現しても得られる産物が天然型糖鎖伸長
ＤＮＡによってコードされる機能産物と同一でなくその
機能が減弱される場合（即ち、産物が、天然型糖鎖伸長
ＤＮＡによってコードされる機能産物が有する糖鎖伸長
活性を全く有しない場合および天然型糖鎖伸長ＤＮＡに
よってコードされる機能産物が有する糖鎖伸長活性に比
して低い活性を有する場合）をも含めて意味するもので
ある。

【００２７】従って、ＤＮＡの修飾の態様は、遺伝子の
発現を不能ならしめるもの、または修飾された糖鎖伸長
ＤＮＡの発現・生成物が、天然型糖鎖伸長ＤＮＡの生成
物が本来有する糖鎖伸長活性を全く有しないか、有して
いても天然型糖鎖伸長ＤＮＡの生成物の糖鎖伸長活性に
比して減弱せしめてなるようなものであれば、特に制限
されない。具体的には、天然型糖鎖伸長ＤＮＡの塩基配
列中の少なくとも一つのヌクレオチドが欠失されている
かもしくは配列中に少なくとも一つのヌクレオチドが挿
入される態様の修飾や、天然型糖鎖伸長ＤＮＡの塩基配
列中の少なくとも一つのヌクレオチドが置換される態様
の修飾が例示される。さらに、天然型糖鎖伸長ＤＮＡの
塩基配列に少なくとも一つのヌクレオチドが付加される
ことも修飾の態様に含まれる。かかる修飾により、読み
枠がずれ、あるいは塩基配列が改変されるため、発現さ
れないか、発現されても得られる生成物の機能が、天然
型ＤＮＡ由来の生成物の機能と異なるものとなる。

【００２８】好適な修飾方法としては、天然型糖鎖伸長
ＤＮＡのコード領域内に形質転換のマーカー遺伝子を挿
入する方法が挙げられる。これによると、天然型糖鎖伸
長ＤＮＡを破壊することができるとともに、導入された
形質転換のマーカー遺伝子を指標として、該修飾型糖鎖
伸長ＤＮＡを有する変異体を容易にスクリーニングする
ことができるという利点がある。また、形質転換マーカ
ー遺伝子に加えて、産生しようとする糖蛋白質の遺伝子
を挿入することもできる。これによると、該糖鎖伸長Ｄ
ＮＡの修飾と産生しようとする糖蛋白質の発現が同時に
一度の操作で行うことができる。

【００２９】用いられる形質転換マーカー遺伝子として
は、P.pastorisまたはパン酵母のＨＩＳ４遺伝子、ＡＲ
Ｇ４遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子、ＳＵＣ２遺伝子、Ｇ４１
８耐性遺伝子等が例示される。好ましくは、ＨＩＳ４遺
伝子である。また、糖蛋白質の遺伝子としては、製造し
ようとする所望の糖蛋白質のＤＮＡであれば特に制限さ
れないが、具体的には可溶性高親和性ＩｇＥ受容体α鎖
（ｓＦｃεＲＩα、特開平６−１６９７７６号公報）、
インターフェロンα（特開昭６１−１８５１８９号公
報）、ウロキナーゼ（特開昭６０−１８０５９１号公
報）、キマーゼ〔Caughey,G.H., et al.，J.Biol.Chem.
266，12956(1991) 〕、尿性トリプシンインヒビター
〔Kaumeyer,J.F., et al. ，Nucleic Acids Res. 14,78
39(1986) 〕、ＩＧＦ結合蛋白質（ＩＧＦ１ＢＰ３、特
表平３−５０５３９７号公報）などが例示される。

【００３０】（４）修飾ピキア属酵母株 本発明に用いられる修飾ピキア属酵母株は、前述の修飾
糖鎖伸長ＤＮＡを有することに基づいて、天然型ピキア
属酵母株に比して糖鎖伸長能が抑制されてなるピキア属
酵母株である。すなわち、天然型糖鎖伸長ＤＮＡの代わ
りに上述の修飾型糖鎖伸長ＤＮＡを有するピキア属酵母
であり、天然型糖鎖伸長ＤＮＡによってコードされる機
能産物の活性が減弱されるか、または活性が発現されな
い。

【００３１】このような修飾ピキア属酵母株は、種々の
方法により調製することができる。例えば、天然型ピキ
ア属酵母中の天然型糖鎖伸長ＤＮＡの修飾、または天然
型ピキア属酵母株に無作為的な変異を起こさせ、天然型
ピキア属酵母株に比して糖鎖伸長活性が抑制されてなる
突然変異体を選択する方法が挙げられる。天然型ピキア
属酵母中の天然型糖鎖伸長ＤＮＡの修飾による方法が好
ましく用いられる。天然型糖鎖伸長ＤＮＡの修飾によ
り、修飾ピキア属酵母株を作成する方法は、具体的には
天然型糖鎖伸長ＤＮＡの特定座位において形質導入する
ＤＮＡを部位特異的組み込み法により導入することによ
り実施される。形質導入したＤＮＡは、宿主の内在性の
天然型ＤＮＡに置き換わることにより組み込まれる。酵
母宿主の標的座位内への形質導入ＤＮＡの導入に都合の
よい方法は、標的遺伝子ＤＮＡ断片の内部を欠落、ある
いは選択マーカー遺伝子ＤＮＡや異種遺伝子発現ＤＮＡ
断片を挿入した直鎖状ＤＮＡ断片を作製することであ
る。これにより形質転換によって、その発現生成物が糖
鎖伸長活性に影響を与えるＤＮＡの特定部位での相同的
組換えを起こすように方向付けられる。

【００３２】天然型ピキア属酵母を形質転換する方法な
らびに当該酵母細胞の培養方法は、当該分野で採用され
る通常の方法を用いることができる。例えば、形質転換
方法としては、スフェロプラスト方法〔Creggh et al.,
Mol.Cell.Biol.,5,3376 (1985) 、米国特許第4,879,23
1 号〕、塩化リチウム法〔Ito et al., Agric.Biol.Che
m.,48,341 (1984)、欧州特許出願第312,934 号、米国特
許第4,929,535 号〕等が用いられる。

【００３３】形質転換に用いられる天然型ピキア属酵母
由来の宿主細胞は、特に制限されないが、好ましくは唯
一の炭素源およびエネルギー源としてメタノールを効率
よく利用できるメタノール資化性酵母（methylotrophi
c）酵母である。適切なメタノール資化性酵母として
は、具体的には栄養要求性P.pastoris ＧＴＳ１１５株
（ＮＲＲＬ Ｙ−１５８５１），P.pastoris ＧＳ１９
０株（ＮＲＲＬ Ｙ−１８０１４），P.pastoris ＰＰ
Ｆ１株（ＮＲＲＬ Ｙ−１８０１７）、野生型P.pastor
is株（ＮＲＲＬ Ｙ−１１４３０、ＮＲＲＬ Ｙ−１１
４３１）等が例示される。

【００３４】また、さらに好ましくは、少なくとも一つ
の独立栄養性マーカー遺伝子が欠失した株であり、例え
ばＨＩＳ４欠失P.pastoris ＧＳ１１５株（ＡＴＣＣ２
０８６４）、ＡＲＧ４欠失P.pastoris ＧＳ１９０株，
ＨＩＳ４／ＵＲＡ３欠失P.pastoris ＧＳ４−２株，Ｈ
ＩＳ４／ＵＲＡ４欠失P.pastoris ＰＰＦ１株（ＮＲＲ
Ｌ Ｙ−１８０１７：米国特許第4,812,405 号参照）等
が挙げられる。このように宿主細胞が少なくとも一つの
独立栄養性マーカー遺伝子が欠失した株である場合は、
形質導入するＤＮＡとして、宿主細胞に欠失している独
立栄養性マーカー遺伝子を有するものを用いることが好
ましい。かかる方法によると、形質導入するＤＮＡが取
り込まれて糖鎖伸長ＤＮＡが修飾された形質転換体（修
飾ピキア属酵母株）を迅速かつ簡便に同定、選択するこ
とができる点で有用である。

【００３５】当該修飾ピキア属酵母株は、さらに天然培
地〔例えば、ＹＰＤ培地（１％イーストエキストラク
ト，２％ペプトン，２％グルコース），ＹＰＭ培地（１
％イーストエキストラクト，２％ペプトン，２％メタノ
ール）等〕などの栄養条件下で天然型ピキア属酵母株と
同等の増殖能力を保持しているという特徴を有する。こ
のことは、糖鎖伸長ＤＮＡの修飾の有無は、栄養条件下
ではピキア属酵母の生育に影響を与えないことを意味す
る。従って、本発明に用いられる修飾ピキア属酵母株
は、医薬上有用な糖蛋白質を産生する優れた産生株また
はそのような産生株を作成するための宿主となる。すな
わち、当該酵母は天然型ピキア属酵母株に比して宿主細
胞に由来する糖鎖伸長能が減弱もしくは消失しているた
め、哺乳動物細胞、なかんずくはヒトに由来する細胞が
産生する糖蛋白質と同一または類似の糖鎖構造を有する
糖蛋白質を産生することができる。

【００３６】上述の哺乳動物細胞、なかんずくはヒトに
由来する細胞が産生する糖蛋白質と同一または類似の糖
鎖構造を有する糖蛋白質としては、蛋白質分子上に糖鎖
構造を有する糖蛋白質であれば特に制限されないが、好
ましくは医薬上有用な生理活性蛋白質、具体的には、可
溶性高親和性ＩｇＥ受容体α鎖（ｓＦｃεＲＩα）、表
皮増殖因子（ＥＧＦ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲ
Ｆ）、ＩＧＦ１結合蛋白質３（ＩＧＦ１ＢＰ３）、プロ
ウロキナーゼ・アネキシンＶ融合蛋白質、キマーゼ、尿
性トリプシンインヒビターなどが例示される。

【００３７】糖蛋白質産生のために有用な発現系は、種
々の方法により作製することができる。例えば、上述し
た修飾ピキア属酵母株に糖蛋白質をコードするＤＮＡを
導入する方法、天然型糖鎖伸長ＤＮＡの塩基配列に形質
転換マーカー遺伝子とともに糖蛋白質をコードするＤＮ
Ａを挿入したＤＮＡを用いて天然型ピキア属酵母を形質
転換する方法、糖蛋白質をコードするＤＮＡを有する組
換えピキア属酵母株が有する天然型糖鎖伸長ＤＮＡを後
発的に、前記修飾糖鎖伸長ＤＮＡの態様に変異せしめる
方法、または、天然型ピキア属酵母株を上記の修飾糖鎖
伸長ＤＮＡおよび糖蛋白質をコードするＤＮＡで同時に
形質転換する方法等が挙げられる。

【００３８】組換え糖蛋白質発現系のピキア属酵母は、
転写の読み枠の方向に、少なくとも、プロモーター領
域、実質的に所望の糖蛋白質をコードするＤＮＡ及び
転写ターミネーター領域を有するものである。これら
のＤＮＡは、所望の糖蛋白質をコードするＤＮＡがＲＮ
Ａに転写されるように、お互いに機能するように関連し
て配列される。

【００３９】プロモーターとしては、P.pastorisのＡＯ
Ｘ１プロモーター（プライマリーアルコールオキシダー
ゼ遺伝子のためのプロモーター）、P.pastorisのＡＯＸ
２プロモーター（セカンダリー アルコールオキシダー
ゼ遺伝子のためのプロモーター）、P.pastorisのＤＡＳ
プロモーター（ジヒドロキシアセトン シンターゼ遺伝
子のためのプロモーター）、P.pastorisのＰ４０プロモ
ーター（Ｐ４０遺伝子のためのプロモーター）、P.past
orisのアルデヒド デヒドロゲナーゼ遺伝子のためのプ
ロモーターまたはP.pastorisの葉酸デヒドロゲナーゼ遺
伝子のためのプロモーターなどが挙げられる。好ましく
は、P.pastorisのＡＯＸ１プロモーター（Ellis et a
l., Mol.Cell.Biol.,5,111(1985)、米国特許第4,855,23
1 号など) であり、より好ましくは、発現効率が向上す
るように修飾された変異型ＡＯＸ２プロモーター（Ohi,
H et al., Mol.Gen.Genet., 243, 489-499, 1994年、特
開平４−２９９９８４号公報）である。

【００４０】なお、実質的に所望の糖蛋白質をコードす
るＤＮＡの前に分泌シグナル配列をコードするＤＮＡを
有していてよい。かかるＤＮＡを有する組換え糖蛋白質
発現系によれば、糖蛋白質が宿主細胞外に分泌産生され
るため、所望の糖蛋白質を容易に単離精製することがで
きる。分泌シグナル配列をコードしているＤＮＡとして
は、糖蛋白質に関連した天然の分泌シグナル配列をコー
ドするＤＮＡ、パン酵母α−接合因子（αＭＦ）シグナ
ル配列をコードしているＤＮＡ（プロセッシング部位を
コードしているＤＮＡ配列を含む、Ｌｙｓ−Ａｒｇ）、
ウシリゾチームＣシグナル配列のようなメタノール資化
性酵母細胞で機能するシグナル配列をコードするＤＮＡ
等が挙げられる。

【００４１】前記転写ターミネーターは、プロモーター
からの転写に対して転写終結信号を提供するサブセグメ
ントを有するものであればよく、プロモーター源の遺伝
子と同じもしくは異なるものであってもよく、また糖蛋
白質をコードする遺伝子から取得されるものであっても
よい。

【００４２】本発明に用いられる発現系は、上記のＤＮ
Ａ配列に加えてさらに選択マーカー遺伝子を含んでいて
もよい。用いられる選択マーカー遺伝子としては、ＨＩ
Ｓ４，ＡＲＧ４，ＵＲＡ３，パン酵母ＳＵＣ２，Ｇ４１
８耐性遺伝子等が挙げられる。

【００４３】所望の表現型に形質転換された修飾ピキア
属酵母株は、当該分野で通常用いられる方法で培養する
ことにより、糖蛋白質を産生することができる。用いら
れる培地には特に制限はなく、通常の天然培地（ＹＰＤ
培地，ＹＰＭ培地）等が挙げられる。培養温度は、ピキ
ア属酵母宿主細胞の増殖および所望の糖蛋白質の産生に
適した温度であることが好ましく、約２０〜３０℃、好
ましくは約２３〜２５℃である。培地のｐＨも、宿主細
胞の増殖および所望の糖蛋白質の産生に適したｐＨを適
宜採用することができる。さらに、必要により通気や攪
拌を加えることができる。培養後、培養上清を回収し、
当該上清から自体公知の方法、例えば分画法、イオン交
換，ゲル濾過，疎水相互作用クロマトグラフィーまたは
アフィニティカラムクロマトグラフィー等により所望の
異種蛋白質を精製取得することできる。

【００４４】

【発明の効果】本発明によれば、天然型ピキア酵母株と
同等の増殖能力を有し、かつ天然型ピキア酵母株に比し
て糖鎖伸長能が減弱もしくは消失してなる修飾ピキア酵
母株を産生株または宿主として用いることにより、酵母
と哺乳類細胞とで共通するＥＲコア糖鎖と同一もしくは
類似の糖鎖構造を有する医薬上有用な糖蛋白質を調製す
ることができる。本発明によれば、パン酵母より分泌発
現量が多いピキア属酵母を用いて該糖蛋白質を生産する
ため、酵母を用いた該糖蛋白質の製造において生産量の
向上を計ることができる。

【００４５】

【実施例】以下、実施例および参考例に基づいて本発明
をより詳細に説明する。しかし、本発明はこれによって
なんら限定されるものではない。本発明の実施例で用い
るプラスミド，制限酵素等の酵素，Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
及び他の物質は市販のものであり、常法に従って使用す
ることできる。ＤＮＡのクローニング，塩基配列の決
定，宿主細胞の形質転換，形質転換細胞の培養，得られ
る培養物からの酵素の採取，精製等に用いられた操作に
ついても当業者によく知られているものであるか、文献
により知ることのできるものである。

【００４６】実施例 （ａ） ピキア属酵母由来の糖鎖伸長タンパクの遺伝子
の取得 パン酵母（Saccharomyces cerevisiae）由来糖鎖伸長遺
伝子ＯＣＨ１をＰＣＲ法で増幅してプローブとなし、ピ
キア属酵母の染色体遺伝子をサザン解析して、ピキア属
酵母由来の糖鎖伸長に関わるタンパクをコードするＤＮ
Ａを探索した。

【００４７】（１）ＰＣＲ法によるパン酵母のＯＣＨ１
遺伝子の増幅、取得 パン酵母由来糖鎖伸長遺伝子ＯＣＨ１をクローニングす
るため、文献〔The EMBO Journal vol.11 no.7 p2511-2
519 (1992): p2513, Fig.2〕に開示のＤＮＡ配列を基
に、その蛋白翻訳領域の両末端ＤＮＡに相補的な配列に
ＨｉｎｄＩＩＩ認識部位を付与したＮ末端プライマー：
５’−ＣＧＡＡＧＣＴＴＡＴＧＴＣＴＡＧＧＡＡＧＴＴ
ＧＴＣＣＣＡＣＣＴＧ−３’、及びＣ末側プライマー：
５’−ＣＧＡＡＧＣＴＴＡＴＴＴＡＴＧＡＣＣＴＧＣＡ
ＴＴＴＴＴＡＴＣＡＧ−３’（ＰＣＲ増幅用プライマ
ー）をＤＮＡ合成装置（ＡＢＩ社製、モデル３９２ＤＮ
Ａ／ＲＮＡシンセサイザー）を用いて化学合成した。当
該プライマーを用いて、常法（Sherman, F., Fink,G.R.
and Hicks, J.B. (1986) Laboratory course manual f
or methods in yeast genetics, Cold Spring Harbor L
aboratory, Cold Spring Harbor, New York)に従って調
製したパン酵母 AH22株 (a, len2, his4, can1)（Hinn
en, A. et al(1978) Proc. Natl. SciUSA 75, p.1929
）由来染色体ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ反応（９４
℃で１分間、５０℃で２分間、７２℃で２分間／２５サ
イクル）〔DNA Thermal Cycler Model PJ2000 、Perkin
-Elmer社〕を行った。増幅されたＤＮＡ断片についてア
ガロースゲル電気泳動した結果、ゲル上で明瞭な単一バ
ンドが観察された。また、増幅されたＤＮＡ断片は設定
したプライマーから予想される大きさ（1458 bp)を示し
た。

【００４８】（２）パン酵母由来ＯＣＨ１遺伝子のサブ
クローニング （１）で得られたＰＣＲ増幅断片をＨｉｎｄIII で消化
後、ｐＵＣ１９のＨｉｎｄIII 部位にサブクローニング
した。作製されたプラスミド（ｐＫＭ０４９、図３）を
数種類の制限酵素（ＢａｍＨＩ，ＥｃｏＲＩ，Ｋｐｎ
Ｉ）で消化し、その切断パターンを発表されているＯＣ
Ｈ１遺伝子の切断部位〔EMBO J. 11, 7 p2511-2519 (19
92): p2512, Fig.1 及び p2513, Fig.2 〕と比較したと
ころ、完全に一致していた。

【００４９】（３）ＯＣＨ１遺伝子をプローブとするピ
キア属酵母の染色体遺伝子のサザンハイブリダイゼーシ
ョン ピキア属酵母（Pichia pastoris ＧＴＳ１１５株）をＹ
ＰＤ培地（1% イーストエキストラクト, 2% ペプト
ン，2% グルコース) で、３０℃、３日間培養し、Sher
man らの方法（Sherman, F., Fink,G.R. and Hicks, J.
B. (1986) Laboratory course manual for methods in
yeast genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Col
d Spring Harbor, New York)に従って染色体ＤＮＡを調
製した。得られた染色体ＤＮＡを様々な態様の制限酵素
処理を行った後アガロースゲル電気泳動し、ＤＮＡ断片
をナイロンメンブレン（Hybond-N、アマシャム社製) に
トランスファーした。（１）で得られたパン酵母由来Ｏ
ＣＨ１遺伝子ＨｉｎｄIII 断片を「ＤＩＧ−ＥＬＩＳＡ
標識キット」（ベーリンガーマンハイム社製）を用いて
標識してプローブとし、常法によりサザンハイブリダイ
ゼーションを行い（Sambrook, J., Fritsh, e.f. and M
aniatis, T. (1989) Molecular cloning: A laboratory
manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Sprin
g Harbor, NewYork) 、パン酵母由来ＯＣＨ１遺伝子と
相同性のある遺伝子が存在するかどうかの検討を行っ
た。

【００５０】パン酵母由来ＯＣＨ１遺伝子とピキア属酵
母の染色体ＤＮＡとの相同性については不明であるた
め、ハイブリダイゼーションの温度（６５℃，５５℃，
４５℃）及び洗浄条件（塩濃度：０．２〜０．５×ＳＳ
Ｃ、温度：室温〜４２℃）について様々検討した。その
結果、ハイブリダイゼーションを５５℃で一夜行い、２
×ＳＳＣ，室温，３０分，２回洗浄後、さらに０．５×
ＳＳＣ，４２℃，３０分，２回洗浄した場合に、EcoRI
消化物に対し約5kb の明瞭なバンドが観察された。ハイ
ブリダイゼーションの温度及び洗浄条件を上記の如く緩
やかにすることにより、パン酵母由来のＯＣＨ１遺伝子
と相同性のある遺伝子がピキア属酵母の染色体上に存在
することが示唆された。

【００５１】（４）λｇｔ１０ライブラリーの作製 （３）の結果に基づいて、ピキア属酵母の染色体ＤＮＡ
のＥｃｏＲＩ断片（約５ｋｂ）のクローニングを行っ
た。まず、約１５０μｇのP.pastoris ＧＴＳ１１５株
由来染色体ＤＮＡ（ＮＲＲＬ寄託番号Ｙ−１５８５１）
を２００酵素単位のＥｃｏＲＩで一夜消化した後、０．
８％のアガロースゲル電気泳動により約４．５〜６ｋｂ
のＤＮＡを分離回収した。回収したＤＮＡの一部を１μ
ｇのλｇｔ１０ａｒｍ（「lambda gt10 vector digeste
d with EcoRI and dephosphorylated 」、ストラタジー
ン社製）とリゲーションし、GigapackＩＩ Gold Packag
ing Extract （ストラタジーン社製）を用いてパッケー
ジングを行った。その結果、スクリーニングに必要な数
のプラークが得られた。

【００５２】（５）プラークハイブリダイゼーション （４）で作製した組換λファージライブラリーを80mm径
の１プレートあたり200 〜300 プラークになるようにタ
イトレーションを行い、ナイロンメンブレンフィルター
（Hybond-N、アマシャム社製) にトランスファーした。
これらのフィルターを10枚作製し（全スクリーニング
数；約3000プラーク）、前記のパン酵母由来ＯＣＨ１遺
伝子断片をプローブにしてハイブリダイゼーションを行
った。その結果、鮮明な１４個のポジティブプラークが
検出された。

【００５３】（６）λＤＮＡの精製 （５）で検出されたポジティブプラークのうち、任意に
１０プラークを選び、single plaque isolation の後、
Sephaglas ^TM PhagePrep Kit（ファルマシア社製）を用
いてλＤＮＡを抽出、精製した。精製した各ＤＮＡを数
種の制限酵素（ＥｃｏＲＩ，ＢｇｌII，ＨｉｎｄIII,
ＸｈｏＩ）の消化パターンをアガロースゲル電気泳動で
比較したところ、１０クローン中８クローンまでが同一
の挿入ＤＮＡ（約５ｋｂ）を有していることが分かっ
た。

【００５４】（７）サブクローニング そのうちの１クローンについて、挿入されたＥｃｏＲＩ
断片をｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ部位にサブクローニング
して、ｐＫＭ５０（図4 ）を作製した。

【００５５】（８）ｐＫＭ５０に挿入されたＤＮＡ断片
の塩基配列およびアミノ酸配列の決定 ｐＫＭ５０に挿入されているピキア属酵母由来のＥｃｏ
ＲＩ断片の塩基配列を決定した。ｐＫＭ５０を用いてク
ローニングした染色体ＤＮＡ断片の制限酵素地図を作製
し、さらにいくつかの制限酵素を用いてより詳細にサザ
ーン解析した結果、約2.5kb のＢｇｌII断片中にパン酵
母ＯＣＨ１遺伝子との相同領域が存在することが示され
た。そこで、この約２．５ｋｂのＢｇｌII断片のＤＮＡ
塩基配列を決定した。具体的には、挿入断片を数種の制
限酵素を用いて部分断片にしてｐＵＣ１９にサブクロー
ニングし、それらのＤＮＡ塩基配列をＭ１３〜４０プラ
イマーおよび Reverse primer(ファルマシアＬＫＢバイ
テクノロジー）を用いて、ＤＮＡシークエンサー（Ａ．
Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシークエンサー、ファルマシアＬＫＢバ
イテクノロジー）により決定した。

【００５６】ｐＫＭ５０に挿入されたパン酵母ＯＣＨ１
遺伝子と相同性を示す領域を含む遺伝子断片〔ＢｇｌII
〜ＳａｌＩ断片（約３．０ｋｂ）〕の塩基配列を決定し
たところ、４０４アミノ酸からなる Open Reading Fram
e (ORF) （図４、斜線領域）が存在していた。ＢｇｌII
〜ＳａｌＩ部位までの塩基配列（２８５８ｂｐ）及びOp
en Reading Frame 領域をアミノ酸に翻訳した配列を配
列表配列番号１に示す。なお、かかる領域にはアスパラ
ギン結合型糖鎖付加が生じる可能性部位（Ａｓｎ−Ｘａ
ａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）が２ヶ所存在していた。

【００５７】次いで、ピキア属酵母由来の上記ＯＲＦ領
域のアミノ酸配列とパン酵母由来ＯＣＨ１遺伝子由来の
タンパクのアミノ酸配列とを比較した。その結果、上記
で決定したピキア属酵母由来のＥｃｏＲＩ断片（約５ｋ
ｂ）によってコードされるアミノ酸配列はパン酵母由来
ＯＣＨ１遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と約
４０％の相同性を有していた（図５）。また、該アミノ
酸配列をコードするＤＮＡレベルでの相同性は、約５５
％であった。図５中□で囲んで示したアスパラギン結合
型糖鎖付加部位については、１ヶ所のみ相同的な領域で
一致が見られた（本発明のピキア属酵母由来の糖鎖伸長
タンパクのＡｓｎ¹⁹⁹ 及びパン酵母ＯＣＨ１蛋白のＡｓ
ｎ²⁰³ ）。アミノ酸配列から予想される分子量は、パン
酵母ＯＣＨ１蛋白が５５ｋＤａであるのに対し、ピキア
属酵母由来の糖鎖伸長タンパクは４６ｋＤａであった。

【００５８】次に、両タンパクの Hydrophobicity を比
較した。その結果、図６に示すように両者は非常によく
似たパターンを示した。このことから、ピキア属酵母か
ら得られたＥｃｏＲＩ断片は、ピキア属酵母由来のＯＣ
Ｈ１遺伝子であることが示唆された。また、パン酵母Ｏ
ＣＨ１蛋白は、Ｎ末端付近に膜貫通領域（membrane spa
nning domain) と思われる疎水性領域が存在しているが
（Ｔｈｒ¹⁶〜Ｐｈｅ³⁰）、ピキア属酵母由来の糖鎖伸長
タンパクではさらに長い疎水性領域が存在していた。

【００５９】（ｂ）糖鎖伸長ＤＮＡ破壊株の作製 （１）ピキア属酵母由来の糖鎖伸長ＤＮＡの Genomic S
outhern Hybridization解析 上記（ａ）でクローニングしたピキア属酵母由来の糖鎖
伸長ＤＮＡを破壊した菌株を作製する目的で、まず該Ｄ
ＮＡが染色体上で単一遺伝子であることを確認するため
の Genomic Southern Hybridization 解析を行った。宿
主として用いたP.pastoris ＧＴＳ１１５株の染色体を
ＢｇｌII, ＥｃｏＲＩ，ＳｐｈＩ，ＸｂａＩの各制限酵
素で切断、アガロースゲル電気泳動後、ナイロンメンブ
ランにブロットした。次にピキア属酵母由来の糖鎖伸長
ＤＮＡの蛋白翻訳領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤ
ＮＡ断片（図４，ｐＫ５０のＨｎｉｄIII −ＨｉｎｃII
断片約９００ｂｐ，塩基配列表配列番号１記載の塩基番
号1488〜塩基番号2385の領域）をプローブとして、ハイ
ブリダイゼーションを行った。結果を図７に示す。これ
から分かるように、ピキア属酵母由来の糖鎖伸長ＤＮＡ
プローブはいずれの制限酵素を用いた場合でも単一のバ
ンドにしかハイブリダイズしなかった。以上の結果か
ら、ピキア属酵母由来の糖鎖伸長ＤＮＡは単一遺伝子で
あることがわかった。

【００６０】（２）ＨＩＳ４を選択マーカーとしたピキ
ア属酵母由来の糖鎖伸長ＤＮＡ破壊株の作製 ピキア属酵母由来の糖鎖伸長ＤＮＡとその周辺の染色体
断片を含むプラスミドｐＫＭ５０（図４参照）のＡｓｕ
ＩＩおよびＢａｌＩ部位を消化して平滑末端にし、その
間にＨＩＳ４遺伝子および可溶性高親和性ＩｇＥ受容体
α鎖遺伝子（ｓＦｃεＲＩα）発現ユニットを挿入し
て、プラスミドｐＫＭ７４（図８）を作成した。可溶性
高親和性ＩｇＥ受容体α鎖遺伝子（ｓＦｃεＲＩα）発
現ユニットは、パン酵母ＳＵＣ２遺伝子のシグナル配列
をｓＦｃεＲＩα遺伝子〔Nucleic Acids Research, Vo
lume 16 Number 8, 3584 (1988) 参照〕の成熟型Ｎ末端
に付加し、P.pastoris ＡＯＸ２遺伝子のプロモーター
領域およびP.pastoris ＡＯＸ１遺伝子ターミネーター
領域を連結したＤＮＡ断片で、P.pastorisでヒト由来高
親和性ＩｇＥ受容体の細胞外領域（１７２アミノ酸）を
分泌発現することができるものである。

【００６１】該ｐＫＭ７４をＳｐｈＩ及びＰｓｔＩで消
化し、P.pastoris ＧＴＳ１１５株（his4) （ＮＲＲＬ
寄託番号Ｙ−１５８５１）を形質転換したところ、４５
株の形質転換体（ＨＩＳ４）が取得できた。そこで、こ
れらの形質転換株のうちいくつかを選び、以下の解析を
行った。

【００６２】（３）ＧＴＳ１１５／ｐＫＭ７４形質転換
株の解析 パン酵母ＯＣＨ１遺伝子破壊株について、該株は高温耐
性を失っており、３７℃で成育できないことが報告され
ている〔Nakayama,K., et al. EMBO J. 11, 2511 (199
2) 〕。そこで、（２）で得られた形質転換体について
温度感受性を調べた。ＹＰＤプレートを用いて４５株に
ついて、２５℃、３０℃及び３７℃での成育をそれぞれ
観察したところ、うち１０株が３７℃で成育できなかっ
た。一方で、形質転換株のうち任意に１０株を選び、Ge
nomic Southern Hybridization解析を行ったところ、こ
のうちの２株（ＫＭ７４−２及びＫＭ７４−５株）の糖
鎖伸長ＤＮＡが破壊されていた。この２株はいずれも３
７℃で成育ができず、温度感受性とGenomic Southern H
ybridization解析は一致していることが示された。

【００６３】さらに形質転換株（ＫＭ７４−２株）につ
いて、より詳細なGenomic SouthernHybridization解析
を行った（図９）。図９に示すＫＭ４５株は、ｐＫＭ７
４のＨＩＳ４遺伝子および可溶性高親和性ＩｇＥ受容体
α鎖遺伝子（ｓＦｃεＲＩα）発現ユニットＤＮＡ断片
を、P.pastoris ＧＴＳ１１５his4株のhis4遺伝子座に
組み込ませた形質転換株で、ｓＦｃεＲＩα鎖蛋白を分
泌発現できるものである。ＧＴＳ１１５株、ＯＣＨ１遺
伝子野生株ＫＭ４５株、ＯＣＨ１遺伝子破壊株ＫＭ７４
−２株について、染色体ＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＢｇｌ
ＩＩで消化後、糖鎖伸長ＤＮＡの上流域（図９中、プロ
ーブ１：図４に示すｐＫＭ５０ ＢｇｌII−ＡｓｕII断
片 １２５６ｂｐ，塩基配列表配列番号１記載の塩基番
号２〜塩基番号1258）及び糖鎖伸長ＤＮＡの領域（図９
中、プローブ２：図４に示すｐＫＭ５０，ＨｉｎｄIII
−ＥｃｏＴ１４I 断片 ４６８ｂｐ，塩基配列表配列番
号１記載の塩基番号1488〜塩基番号1948）をプローブと
してGenomic Southern Hybridization解析を行い、ＫＭ
７４−２株の糖鎖伸長ＤＮＡが、導入したｐＫＭ７４遺
伝子断片により破壊されていることを確認した（図１
０、図１１参照）。

【００６４】（ｃ）ピキア属酵母の糖鎖伸長ＤＮＡ破壊
株の産生するｓＦｃεＲＩα鎖蛋白の解析 ピキア属酵母糖鎖伸長ＤＮＡ破壊株の糖鎖付加を調べる
ため、糖鎖伸長ＤＮＡ破壊株ＫＭ７４−２およびＫＭ７
４−５株と野生型株としてＫＭ４５株を３×ＹＰ＋２％
のメタノール培地（3% イーストエキストラクト，6%
バクトペプトン，2% メタノール) で、２５℃、４日間
培養後、培養上清よりＩｇＥアフィニティーカラムによ
り、ｓＦｃεＲＩα鎖蛋白を精製した。精製した各ｓＦ
ｃεＲＩα鎖蛋白およびＰＮＧａｓｅＦ（Genzyme 社
製）でアスパラギン結合型糖鎖を除去したサンプルをＳ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で解析した（図
１２）。この結果、糖鎖伸長ＤＮＡが破壊されていない
ＫＭ４５株では高分子量のｓＦｃεＲＩα鎖蛋白が観察
される（図１２、レーン１）のに対し、糖鎖伸長ＤＮＡ
破壊株であるＫＭ７４−２及びＫＭ７４−５株由来のｓ
ＦｃεＲＩα鎖蛋白では、糖鎖の伸長が抑制されたた
め、高分子量を示す蛋白分子種が消失していた（図１
２、レーン２，３）。さらに、これらの蛋白の糖をＰＮ
ＧａｓｅＦ（Genzyme 社製）で除去したところ、同じ分
子量を示すことから（図１２、レーン４，５，６）、こ
の分子量分布の差は、糖鎖に起因することが確認され
た。以上の結果から、P.pastoris糖鎖伸長ＤＮＡ破壊株
では糖鎖の伸長が抑制されていることが示唆された。

【００６５】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：２８５８ 配列の型：核酸 鎖の数：２ トポロジ─：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 起源 生物名：P.pastoris 株名：GTS115 配列の特徴： 特徴を表す記号：CDS 存在位置：1027−2238 特徴を決定した方法：S,P 配列 AGATCTGCCT GACAGCCTTA AAGAGCCCGC TAAAAGACCC GGAAAACCGA GAGAACTCTG 60 GATTAGCAGT CTGAAAAAGA ATCTTCACTC TGTCTAGTGG AGCAATTAAT GTCTTAGCGG 120 CACTTCCTGC TACTCCGCCA GCTACTCCTG AATAGATCAC ATACTGCAAA GACTGCTTGT 180 CGATGACCTT GGGGTTATTT AGCTTCAAGG GCAATTTTTG GGACATTTTG GACACAGGAG 240 ACTCAGAAAC AGACACAGAG CGTTCTGAGT CCTGGTGCTC CTGACGTAGG CCTAGAACAG 300 GAATTATTGG CTTTATTTGT TTGTCCATTT CATAGGCTTG GGGTAATAGA TAGATGACAG 360 AGAAATAGAG AAGACCTAAT ATTTTTTGTT CATGGCAAAT CGCGGGTTCG CGGTCGGGTC 420 ACACACGGAG AAGTAATGAG AAGAGCTGGT AATCTGGGGT AAAAGGGTTC AAAAGAAGGT 480 CGCCTGGTAG GGATGCAATA CAAGGTTGTC TTGGAGTTTA CATTGACCAG ATGATTTGGC 540 TTTTTCTCTG TTCAATTCAC ATTTTTCAGC GAGAATCGGA TTGACGGAGA AATGGCGGGG 600 TGTGGGGTGG ATAGATGGCA GAAATGCTCG CAATCACCGC GAAAGAAAGA CTTTATGGAA 660 TAGAACTACT GGGTGGTGTA AGGATTACAT AGCTAGTCCA ATGGAGTCCG TTGGAAAGGT 720 AAGAAGAAGC TAAAACCGGC TAAGTAACTA GGGAAGAATG ATCAGACTTT GATTTGATGA 780 GGTCTGAAAA TACTCTGCTG CTTTTTCAGT TGCTTTTTCC CTGCAACCTA TCATTTTCCT 840 TTTCATAAGC CTGCCTTTTC TGTTTTCACT TATATGAGTT CCGCCGAGAC TTCCCCAAAT 900 TCTCTCCTGG AACATTCTCT ATCGCTCTCC TTCCAAGTTG CGCCCCCTGG CACTGCCTAG 960 TAATATTACC ACGCGACTTA TATTCAGTTC CACAATTTCC AGTGTTCGTA GCAAATATCA 1020 TCAGCC ATG GCG AAG GCA GAT GGC AGT TTG CTC TAC TAT AAT CCT CAC AAT 1071 Met Ala Lys Ala Asp Gly Ser Leu Leu Tyr Tyr Asn Pro His Asn 1 5 10 15 CCA CCC AGA AGG TAT TAC TTC TAC ATG GCT ATA TTC GCC GTT TCT GTC 1119 Pro Pro Arg Arg Tyr Tyr Phe Tyr Met Ala Ile Phe Ala Val Ser Val 20 25 30 ATT TGC GTT TTG TAC GGA CCC TCA CAA CAA TTA TCA TCT CCA AAA ATA 1167 Ile Cys Val Leu Tyr Gly Pro Ser Gln Gln Leu Ser Ser Pro Lys Ile 35 40 45 GAC TAT GAT CCA TTG ACG CTC CGA TCA CTT GAT TTG AAG ACT TTG GAA 1215 Asp Tyr Asp Pro Leu Thr Leu Arg Ser Leu Asp Leu Lys Thr Leu Glu 50 55 60 GCT CCT TCA CAG TTG AGT CCA GGC ACC GTA GAA GAT AAT CTT CGA AGA 1263 Ala Pro Ser Gln Leu Ser Pro Gly Thr Val Glu Asp Asn Leu Arg Arg 65 70 75 CAA TTG GAG TTT CAT TTT CCT TAC CGC AGT TAC GAA CCT TTT CCC CAA 1311 Gln Leu Glu Phe His Phe Pro Tyr Arg Ser Tyr Glu Pro Phe Pro Gln 80 85 90 95 CAT ATT TGG CAA ACG TGG AAA GTT TCT CCC TCT GAT AGT TCC TTT CCG 1359 His Ile Trp Gln Thr Trp Lys Val Ser Pro Ser Asp Ser Ser Phe Pro 100 105 110 AAA AAC TTC AAA GAC TTA GGT GAA AGT TGG CTG CAA AGG TCC CCA AAT 1407 Lys Asn Phe Lys Asp Leu Gly Glu Ser Trp Leu Gln Arg Ser Pro Asn 115 120 125 TAT GAT CAT TTT GTG ATA CCC GAT GAT GCA GCA TGG GAA CTT ATT CAC 1455 Tyr Asp His Phe Val Ile Pro Asp Asp Ala Ala Trp Glu Leu Ile His 130 135 140 CAT GAA TAC GAA CGT GTA CCA GAA GTC TTG GAA GCT TTC CAC CTG CTA 1503 His Glu Tyr Glu Arg Val Pro Glu Val Leu Glu Ala Phe His Leu Leu 145 150 155 CCA GAG CCC ATT CTA AAG GCC GAT TTT TTC AGG TAT TTG ATT CTT TTT 1551 Pro Glu Pro Ile Leu Lys Ala Asp Phe Phe Arg Tyr Leu Ile Leu Phe 160 165 170 175 GCC CGT GGA GGA CTG TAT GCT GAC ATG GAC ACT ATG TTA TTA AAA CCA 1599 Ala Arg Gly Gly Leu Tyr Ala Asp Met Asp Thr Met Leu Leu Lys Pro 180 185 190 ATA GAA TCG TGG CTG ACT TTC AAT GAA ACT ATT GGT GGA GTA AAA AAC 1647 Ile Glu Ser Trp Leu Thr Phe Asn Glu Thr Ile Gly Gly Val Lys Asn 195 200 205 AAT GCT GGG TTG GTC ATT GGT ATT GAG GCT GAT CCT GAT AGA CCT GAT 1695 Asn Ala Gly Leu Val Ile Gly Ile Glu Ala Asp Pro Asp Arg Pro Asp 210 215 220 TGG CAC GAC TGG TAT GCT AGA AGG ATA CAA TTT TGC CAA TGG GCA ATT 1743 Trp His Asp Trp Tyr Ala Arg Arg Ile Gln Phe Cys Gln Trp Ala Ile 225 230 235 CAG TCC AAA CGA GGA CAC CCA GCA CTG CGT GAA CTG ATT GTA AGA GTT 1791 Gln Ser Lys Arg Gly His Pro Ala Leu Arg Glu Leu Ile Val Arg Val 240 245 250 255 GTC AGC ACG ACT TTA CGG AAA GAG AAA AGC GGT TAC TTG AAC ATG GTG 1839 Val Ser Thr Thr Leu Arg Lys Glu Lys Ser Gly Tyr Leu Asn Met Val 260 265 270 GAA GGA AAG GAT CGT GGA AGT GAT GTG ATG GAC TGG ACG GGT CCA GGA 1887 Glu Gly Lys Asp Arg Gly Ser Asp Val Met Asp Trp Thr Gly Pro Gly 275 280 285 ATA TTT ACA GAC ACT CTA TTT GAT TAT ATG ACT AAT GTC AAT ACA ACA 1935 Ile Phe Thr Asp Thr Leu Phe Asp Tyr Met Thr Asn Val Asn Thr Thr 290 295 300 GGC CAC TCA GGC CAA GGA ATT GGA GCT GGC TCA GCG TAT TAC AAT GCC 1983 Gly His Ser Gly Gln Gly Ile Gly Ala Gly Ser Ala Tyr Tyr Asn Ala 305 310 315 TTA TCG TTG GAA GAA CGT GAT GCC CTC TCT GCC CGC CCG AAC GGA GAG 2031 Leu Ser Leu Glu Glu Arg Asp Ala Leu Ser Ala Arg Pro Asn Gly Glu 320 325 330 335 ATG TTA AAA GAG AAA GTC CCA GGT AAA TAT GCA CAG CAG GTT GTT TTA 2079 Met Leu Lys Glu Lys Val Pro Gly Lys Tyr Ala Gln Gln Val Val Leu 340 345 350 TGG GAA CAA TTT ACC AAC CTG CGC TCC CCC AAA TTA ATC GAC GAT ATT 2127 Trp Glu Gln Phe Thr Asn Leu Arg Ser Pro Lys Leu Ile Asp Asp Ile 355 360 365 CTT ATT CTT CCG ATC ACC AGC TTC AGT CCA GGG ATT GGC CAC AGT GGA 2175 Leu Ile Leu Pro Ile Thr Ser Phe Ser Pro Gly Ile Gly His Ser Gly 370 375 380 GCT GGA GAT TTG AAC CAT CAC CTT GCA TAT ATT AGG CAT ACA TTT GAA 2223 Ala Gly Asp Leu Asn His His Leu Ala Tyr Ile Arg His Thr Phe Glu 385 390 395 GGA AGT TGG AAG GAC TAA AGAAAGCTAG AGTAAAATAG ATATAGCGAG 2271 Gly Ser Trp Lys Asp *** 400 ATTAGAGAAT GAATACCTTC TTCTAAGCGA TCGTCCGTCA TCATAGAATA TCATGGACTG 2331 TATAGTTTTT TTTTTGTACA TATAATGATT AAACGGTCAT CCAACATCTC GTTGACAGAT 2391 CTCTCAGTAC GCGAAATCCC TGACTATCAA AGCAAGAACC GATGAAGAAA AAAACAACAG 2451 TAACCCAAAC ACCACAACAA ACACTTTATC TTCTCCCCCC CAACACCAAT CATCAAAGAG 2511 ATGTCGGAAC ACAAACACCA AGAAGCAAAA ACTAACCCCA TATAAAAACA TCCTGGTAGA 2571 TAATGCTGGT AACCCGCTCT CCTTCCATAT TCTGGGCTAC TTCACGAAGT CTGACCGGTC 2631 TCAGTTGATC AACATGATCC TCGAAATGGG TGGCAAGCAT CGTTCCAGAC CTGCCTCCTC 2691 TGGTAGATGG AGTGTTGTTT TTGACAGGGG ATTACAAGTC TATTGATGAA GATACCCTAA 2751 AGCAACTGGG GGACGTTCCA ATATACAGAG ACTCCTTCAT CTACCAGTGT TTTGTGCACA 2811 AGACATCTCT TCCCATTGAC ACTTTCCGAA TTGACAAGAA CGTCGAC 2858

【図面の簡単な説明】

【図１】エリスロポエチンにおけるＡｓｎ結合型糖鎖の
機能分担モデルを示す図である。図中、Ｍａｎはマンノ
ース、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンおよび
Ｆｕｃはフコースを意味する。

【図２】パン酵母における糖蛋白質の糖鎖構造モデルを
示す図である。図中、Ｍはマンノース、２はα−１，２
結合、３はα−１，３結合、６はα−１，６結合および
４はβ−１，４結合を意味する。また、Ｎ−ｌｉｎｋｅ
ｄ糖鎖中の「Ｍａ」は小胞体（ＥＲ）で合成されるマン
ノース糖を意味する。

【図３】パン酵母由来ＯＣＨ１遺伝子がサブクローニン
グされたプラスミドｐＫＭ０４９を示す図である。

【図４】ｐＫＭ５０に挿入された遺伝子断片（パン酵母
ＯＣＨ１遺伝子と相同性を有するP.pastoris染色体ＤＮ
Ａ断片）の制限酵素地図を示す。斜線領域は、決定した
塩基配列より予想されるＯＣＨ１遺伝子翻訳領域を示
す。

【図５】パン酵母ＯＣＨ１遺伝子がコードするアミノ酸
配列（上段）とP.pastoris糖鎖伸長ＤＮＡがコードする
アミノ酸配列（下段）のホモロジーを示す図である。□
は、アスパラギン糖鎖付加部位を示す。

【図６】パン酵母由来のＯＣＨ１タンパク（Ａ）とP.pa
storis由来の糖鎖伸長タンパク（Ｂ）の Hydrophobicit
y プロファイルを比較した図である。

【図７】ピキア属酵母の糖鎖伸長ＤＮＡをプローブとし
たGenomic Southern Hybridization解析を行った結果を
示す図面に代わる写真である。

【図８】P.pastoris糖鎖伸長ＤＮＡ破壊プラスミド（ｐ
ＫＭ７４）の制限酵素地図を示す図である。

【図９】糖鎖伸長ＤＮＡ破壊株ＫＭ７４−２および野生
株ＧＴＳ１１５，ＫＭ４５の染色体ＤＮＡの糖鎖伸長遺
伝子座近傍の構造を示した図で、図中の下線はGenomicS
outhern Hybridization解析に用いたプローブの位置を
示した図である。なお、図中、ＥはＥｃｏＲＩを、Ｂｇ
はＢｇｌＩＩを意味する。

【図１０】糖鎖伸長ＤＮＡ破壊株ＫＭ７４−２および野
生株ＧＴＳ１１５，ＫＭ４５について図９で示したプロ
ーブ１を用いてGenomic Southern Hybridization解析を
行った結果を示す図面に代わる写真である。

【図１１】糖鎖伸長ＤＮＡ破壊株ＫＭ７４−２および野
生株ＧＴＳ１１５，ＫＭ４５について図９で示したプロ
ーブ２を用いてGenomic Southern Hybridization解析を
行った結果を示す図面に代わる写真である。

【図１２】P.pastoris糖鎖伸長ＤＮＡ破壊株が産生する
ｓＦｃεＲＩα鎖蛋白についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を
行った電気泳動像を示す図面に代わる写真である。１：
ｓＦｃεＲＩα（ＫＭ４５）、２：ｓＦｃεＲＩα（Ｋ
Ｍ７４−２）、３：ｓＦｃεＲＩα（ＫＭ７４−５）、
４：ＰＮＧａｓｅＦ処理ＫＭ４５−ｓＦｃεＲＩα、
５：ＰＮＧａｓｅＦ処理ＫＭ７４−２−ｓＦｃεＲＩ
α、６：ＰＮＧａｓｅＦ処理ＫＭ７４−５−ｓＦｃεＲ
Ｉα

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 9/99 Ｃ１２Ｎ 9/99 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:84）

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記（Ａ）の糖蛋白質の糖鎖伸長に携わ
   るタンパクをコードする塩基配列を有するＤＮＡの一部
   が、該ＤＮＡによってコードされる機能産物の産生が少
   なくとも抑制されるように修飾されてなるＤＮＡを有す
   ることによって、天然型ピキア属酵母株に比して糖蛋白
   質の糖鎖伸長能が抑制されてなる修飾ピキア属酵母株を
   培養し、培養物から糖蛋白質を採取することを特徴とす
   る糖蛋白質の製造方法。 （Ａ）実質的に下記に示されるアミノ酸配列をＮ末端領
   域に有し、ピキア属酵母に由来するタンパク。 【化１】
2. 【請求項２】 糖蛋白質の糖鎖伸長に携わるタンパク
   が、実質的に下記に示されるアミノ酸配列を有すること
   を特徴とする請求項１記載の糖蛋白質の製造方法。 【化２】
3. 【請求項３】 糖蛋白質の糖鎖伸長に携わるタンパクを
   コードする塩基配列を有するＤＮＡが、下記に示される
   塩基配列を有することを特徴とする請求項１または２記
   載の糖蛋白質の製造方法。 【化３】
4. 【請求項４】 機能産物の産生が少なくとも抑制される
   ように修飾されてなるＤＮＡの修飾の態様が、糖鎖伸長
   に携わるタンパクをコードするＤＮＡの塩基配列への形
   質転換マーカー遺伝子の挿入である請求項１〜３のいず
   れかに記載の糖蛋白質の製造方法。
5. 【請求項５】 形質転換マーカー遺伝子が、パン酵母由
   来ＳＵＣ２遺伝子、ピキア属酵母由来のＨＩＳ４遺伝
   子、ＡＲＧ４遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子およびＧ４１８耐
   性遺伝子からなる群から選択されるものであることを特
   徴とする請求項４記載の糖蛋白質の製造方法。
6. 【請求項６】 糖蛋白質が可溶性高親和性ＩｇＥ受容体
   α鎖（ｓＦｃεＲＩα）、キマーゼ、プロウロキナーゼ
   −アネキシンＶ融合タンパク、尿性トリプシンインヒビ
   ター、ＩＧＦ１結合蛋白質３（ＩＧＦ１ＢＰ３）からな
   る群から選択されるいずれかであることを特徴とする請
   求項１〜５のいずれかに記載の糖蛋白質の製造方法。