DE69529787T2

DE69529787T2 - Testsatz und Methode für eine Bestimmung durch kompetitive spezifische Bindung

Info

Publication number: DE69529787T2
Application number: DE69529787T
Authority: DE
Inventors: Paul B. Contestable; Brian A. Snyder
Original assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc
Current assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc
Priority date: 1994-06-15
Filing date: 1995-06-14
Publication date: 2004-02-12
Anticipated expiration: 2015-06-15
Also published as: ES2194043T3; JP3808527B2; JPH0854393A; AU2059395A; CA2151690A1; DK0687910T3; SI0687910T1; EP0687910A1; DE69529787D1; US5589344A; PT687910E; CA2151690C; EP0687910B1

Description

Bereich der Erfindung
Diese Erfindung betrifft einen schnellen spezifischen Bindungsassay für einen Yielliganden unter Verwendung eines kompetitiven Bindungsassay-Formats. Eine Verwendung der Erfindung ist in der Diagnostik, um verschiedene spezifisch-bindende Liganden nachzuweisen, die Indikatoren einer Krankheit sein können.
Hintergrund der Erfindung
Es besteht in der medizinischen Praxis und Forschung und in analytischen und diagnostischen ein Bedürfnis für schnelle und genaue Bestimmungen chemischer und biologischer Substanzen, die in verschiedenen Flüssigkeiten, wie biologischen Flüssigkeiten, vorhanden sind. Beispielsweise muß die Gegenwart von Drogen, Narkotika, Hormonen, Proteinen, Toxinen, Mikroorganismen, Viren, Steroiden oder Nukleinsäuren für effiziente Forschung Diagnose oder Behandlung verschiedener Erkankungen oder Zuständen schnell und genau nachgewiesen werden.
Prostaglandin E₂(PGE₂) ist im Körper ein wirksamer biochemischer Entzündungsver-mittler. Für erhöhte Mengen von PGE₂ in crevicularer Flüssigkeit ist es gezeigt worden, daß sie ein Hinweis auf peridontale Erkankungen sind Aufgrund der zyklischen Natur peridontaler Erkankungen würde eine exakte Messung der Krankheitsaktivität nützlich sein, um die Phasen der Krankheitsverschlechterung zu bestimmen und bei einer vorteilhaften Krankheitsbehandlung zu helfen. Wenn PGE₂ in sehr niedrigen Konzentrationen (100 nmolar oder weniger) nachgewiesen werden kann, ist die klinische Nützlichkeit von PGE₂ als Indikator peridontaler Erkrankung optimiert.
Eine Vielzahl analytischer Verfahren sind in den letzen Jahrzehnten entwickelt wurden, um verschiedene chemische oder biologische Substanzen nachzuweisen Die meisten solcher Verfahreen beruhen auf dem, was im Stand der Technik als „spezifische Bindungs"-Reaktionen bekannt ist, in dem eine nachzuweisende unbekannte Substanz (als „spezifisch-bindender Ligand" bekannt) spezifisch und bevorzugt mit einem korrespondierenden "Rezeptor-Molekül reagiert Die am besten bekannten spezifischen Bindungsreaktionen finden zwischen Im munreaktanten, wie Antikörpern und Antigenen (frernde Substanzen, die eine immunologische Antwort hervorrufen) statt, aber andere spezifische Bindungsreaktionen (so wie die von Avidin mit Biotin oder die eines Zuckers mit einem Lektin) sind auch bekannt.
Viele dieser im Stand der Technik bekannten Assay-Formate erfordern, daß eine oder mehrere der Reaktanten auf einem festen Substrat immobilisiert ist, so daß nicht immobilisierte Reaktanten von immobilisierten Reaktanten abgetrennt werden können „Sandwich" und "Direktbindungsassays" sind einige der Assay-Formate, die im Stand der Technik verwendet worden sind, die Abtrennungsschritte erfordem.
Die immunologischen Standardtechniken sind jedoch schwieriger erfolgreich in dem Nachweis von niedermolkularen zielspezifisch-bindenden Liganden, wie PGE₂ zu verwenden. Es ist besonders wünschenswert niedrige Konzentrationen (1 nmolar oder weniger) solchen Liganden nachzuweisen, aber die immunologischen Standardtechniken sind nicht immer für diesen Zweck verläßlich
B. Orsini et al., Clin. Chim. Acta, 1988, 178 (3) 305–312 offenbart einen Zweitantikörper-Festphasenenzymimmunassay für Protaglandin E₂. EP 0 336 647 A2 offenbart ein Verfahren für die Bestimmung eines Analyten in einer Probe. Das Verfahren kombiniert eine Reinigungsvorbehandlung, basierend auf einer Affinitätschromatography mit einem Enzymimmunassay.
Die Quantifizierung niedermolekularer zielspezifish-bindender Liganden beinhaltet im allgemeinen eine Kompetition zwischen unmarkierten Liganden (m einer Probe) und markierten Liganden um die Bindungsstelle des Rezeptors für den Liganden. Dies ist ein typischer kompetitiver spezifischer Bindungsassay. Der Ligand in der Probe verdrängt den markierten Ligand vom Rezeptor und die Menge der Verdrängung wird durch verschiedene Verfahren quantifiziert. Die Messung des gebundenen Liganden führt zu einer inversen Korrelation zwischen der Menge des Liganden in der Probe und dem erzeugten Signal. Die Messung des ungebundenen markierten Liganden wird zu einer positiven Korrelation führen.
Im allgemeinen ist das Signal des gebundenen Liganden einfacher zu messen, aber das Signal ist schwerer durch den Arzt zu interpretieren, wenn ein Mangel an anspruchsvoller diagnostischer Ausbildung und Material (beispielsweise in Arztpraxen) besteht.
Ein weiteres Problem mit üblichen kompetitiven spezifischen Bindungsassay ist, daß die Messung des freien oder gebundenen markierten Liganden durch die Effizienz der Trennung der freien und gebundenen Moleküle limitiert ist. Wenn der freie markierte Ligand nicht erfolgreich von dem gebundenen markierten Liganden abgetrennt wird, wird die Sensitivität und Spezifität des Assays negativ beeinflußt.
Daher besteht ein Bedürfnis für einen sensitiven kompetitiven Bindungsassay, in dem eine effiziente Abtrennung und Messung des freien markierten Liganden erreicht wird, um schnell und einfach geringe Mengen verschiedener zielspezifisch-bindender Liganden (insbesondere von den niedrigen Molekulargewichts) nachzuweisen.
Assays von denen bekannt ist, daß sie die erkannten Probleme lösen, erfordem die Verwendung einiger komplizierter Antikörper, die für das zur Signalerzeugung verwendete Reporterenzym spezifisch sind. Diese Antikörper haben andere kritische Eigenschaften, die den Assay vorteilhaft machen. Es kann schwierig sein solch Reagenzien für bestimmte Assays zu eniwickeln oder konsistent allen und es wäre daher wünschenswert ihre Verwendung zu vermeiden, wenn möglich, bei Beibehaltung der bemerkenswerten Vorteile, die durch dieses Assay-Format im allgemeinen zur Verfügung gestellt werden Daher ist ein alternativer Assay, der weniger anspruchsvolle Reagenzien verwendet und der einfacher herzustellen und zu verwenden, erwünscht.
US-A-4,859,583 (Heller et al.) beschreibt einen Immunoassay für Antigene niederen Molekulargewichts, unter Verwendung einer Vorrichtung die mehrere Kammern besitzt. In dem beschriebenen Assay verdrängt ein Probenantigen ein an ein Antikörper gebundenes markiertes Antigen. Das markierte Antigen diffundiert in eine zweite Kammer, wo ein Lichtsignal wird. Mit diesem Ansatz sind mehrere Probleme verbunden, aber das Hauptproblem ist, daß der Assay notwendigerweise langsam ist, da die Diffusion durh eine Membran erfolgen muß. Darüber hinaus ist die Vorrichtung kompliziert und erfordert für den jeweiligen Analyten (Antigen) eine geeignete Membran. Es wäre wünschenswert, einen einfacheren und schnelleren Assay für Analyten niederen Molkularhewichts zu haben.
Zusammenfassung der Erfindung
Die oben aufgeführten Probleme werden durch eine spezifischen Bindungsmethode für den Nachweis eines zielspezifisch-bildenden Liganden gelöst, umfassend die Schritte:

A) Zusammenbringen in beliebiger Reihenfolge:
1) eine Flüssigprobe, von der vermutet wird, daß sie einen zielspezifisch-bindenden Liganden enthält,
2) einen ersten Rezeptor für den zielspezifisch-bindenden Liganden und
3) ein wasserlösliches Konjugat des zielspezifisch-bindenden Liganden und eines Reporterenzyms um ein Gemisch zu bilden, daß einen Komplex zwischen dem ersten Rezeptor und entweder dem zielspezifisch-bindenden Liganden oder dem wasserlöslichen Konjugat entält,
B) Zusammenbringen einer Probe des Gemisches, enthaltend ein beliebiges nicht-komplexiertes wasserlösliches Konjugat und einen immobiblisierten zweiten Rezeptor, wobei der zweite Rezeptor entweder spezifisch für das Reporterenzym oder den zielspezifisch-bindenden Liganden ist, um ein wasserunlösliches Reaktionsprodukt des zweiten immobilisierten Rezeptors und jedes unkomplexierten wasserlöslichen Konjugats zu bilden,
vorausgesetzt, daß, wenn der erste Rezeptor wasserlöslich ist, der immobilisierte zweite Rezeptor spezifisch für den zielspezifisch-bindenden Liganden ist und vorausgesetzt, daß, wem der erste Rezeptor immobilisiert ist das unkomplexierte wasserrunlösliche Konjugat von dem Komplex des wasserlöslichen Konjugats und des immobilisierten ersten Rezeptors in einem Zwischenschritt zwischen Schritt A) und Schritt B) abgetrennt wird,
C) Abtrennen des wasserlöslichen Reaktionsprodukt, das in Schritt B) gebildet wird von jedem nicht reagierten wasserlöslichen Konjugat und
D) Nachweisen jedes Signals, das von dem wasserunlöslichen Reaktionsprodukt wird, als Bestimmung des zielspezifisch-bindenden Ligandes in der Flüssigprobe.

Diese Erfindung stellt auch ein Test-Kit zur Verfügung, das für den Nachweis eines zielspezifisch-bildenden Liganden nützlich ist, welches einzeln verpackt:
ein warserlösliches Konjugat eines zielspezifisch-bindenden Liganden eines Reporterenzyms,
einen ersten Rezeptor für den zielspezifisch-bindenden Liganden und
einen immobilisierten zweiten Rezeptor umfaßt, wobei der zweite Rezeptor entweder für das Reporterenzym oder den zielspezifisch-bindenden Liganden spezifisch ist,
vorausgesetzt, daß, wenn der erste Rezeptor wasserlöslich ist, der immobilisierte zweite Rezeptor spezifisch für den zielspezifisch-bindenden Liganden ist.
Die vorliegende Erfindung ist ein spezifischer Bindungsassay, in dem das Signal der Aktivität des Reporterenzyms direkt proportional zu der Menge des zielspezifisch-bindenden Ligandens in dem Assay-System ist. Es stellt die schnelle und einfache Bestimmung geringer Konzentration zielspezifisch-bindender Liganden zur Verfügung insbesondere von Liganden niederen Molekulargewichts, wie PGE₂. Daher kann der Assay vorteilhaft in der Diagnose oder Behandlung von peridontalen Erkrankungen verwendet werden.
In einer Ausführungsform verwendet der erfindungsgemäße. Assay eine schnelle kompetitive Trennung von freien und gebundenen Reporterenzym-markierten Liganden unter Verwendung eines ersten Rezeptors. Der freie markierte Ligand wird dann mit immobilisierten zweiten Rezeptormolekülen komplexiert, die entweder für den Liganden oder das Reporterenzym spezifisch sind und das sich ergebende Reaktionsprodukt wird typischerweise in einer Wegwerftestvorrichtung zur einfachen Signalerzeugung und Detektion gefangen. In einer bevorzugten Ausführungsform erlaubt die Verwendung unterschiedlicher immobilisierter Rezeptoren und wasserlöslicher Konjugaten für jeden Zielliganden die Detektion und Differenzierung verschiedener Zielliganden in einer einzigen Testvorrichtung.
In einer weiterem Ausführungsform ist der erste Rezeptor wasserlöslich (nicht-immobilisiert) und der immobilisierte zweite Rezeptor wird mit einem Ligand reagiert, der an ein Reporterenzym konjugiert ist, um die Gegen wart des Liganden in der Probe nachzuweisen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine graphische Auftragung des Farbsignalfarbwerts gegen die log PGE₂-Konzentration und wird detaillierter in Beispiel 1 unten beschrieben.
2 ist eine graphische Auftragung der Farbsignaldichtetransmission gegen die log PGE₂-Konzentration und wird detallierter in Beispiel 1 unten beschrieben
3 ist eine graphische Auftragung des Farbsignalabwerts gegen die log Diphenylhydantoin-Konzentration und wird delaillierter in Beispiel 2 unten beschrieben.
4 ist eine graphische Auftragung des Farbsignaldichtetransmission gegen die log Diphenylhydantoi-Konzentration und wird detaillierter in Beispiel 2 unten beschrieben
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Definitionen:
Die vorliegende Erfindung kann verwendet werden, um qualitativ, quantitativ oder semi-quantitativ einen oder mehrere einer Vielzahl von zielspezifisch-bindenden Liganden (im folgenden als Liganden bezeichnet) für die Rezeptormoleküle erhältlich oder herstellbar sind, nachzuweisen. Beispiele von Ligand-Rezeptorkomplexen (das bedeutet ein Reaktionsprodukt eines Liganden und eines korrespondierenden Rezeptors) umfassen, sind aber nicht limitiert auf Antikörper-Antigen, Antikörper-Hapten, Avidin-Biotin-, Zucker-Lectin, Gelatin-Fibronectin- und Protein A-IgG-Komplexe. Für den Zweck dieser Erfindung werden komplementäre Nukleinsäuren (das bedeutet hybridisierte Produkte komplementärer Stränge) auch als Ligand-Rezeptorkomplexe angesehen. Solche komplementären Nukleinsäuren müssen nicht an jeden Besenpaar komplementär sein Ein Strang kann länger als der andere sein oder ein Strang kann eine Vielzahl komplementärer Stränge besitzen.
Liganden umfassen, sind aber nicht limitiert auf Peptide, Polypeptide, Proteine (umfassend Enyzme, Antikörper, Antigene, Proteine, Glycoproteine, Lipoproteine und Avidin), Hormone (so wie Thyroxin, Triiodothyronin, humanes Choriongonadotropin, Ostrogen, ACTH und Substanz P) Immunsystemmodulatoren (wie Interleukin-1, Interleukin-6 und Tumornekrosefaktor α), Vitamine, Steroide, Kohlenhydrate (wie Polysaccharide), Glycolipide, Arzneimittel (wie Digoxin, Phentoin, Phenobarbital, Morphin, Carbamazepin und Theophyllin), Antibiotika (wie Gentamicin), Bestandteile von Zellen und Viren (wie Streptokokken Species, Herpesviren, Gonokokken Species, Chlamydia Species, Retroviren, Influenzaviren, Prevotella Species, Porphyromona Species, Actinobacillus Species und Mycobacterium Species), Nukleinsäuren (umfassend einzel- und doppelsträngige Oligonukleotide), Pharmazeutika, Haptene, Lecitine, Biotin und andere Materialien, die dem Fachmann ohne weiteres offensichtlich sind. In bevorzugten Ausführungsformen sind die Liganden antigene Substanzen (so wie die oben erwähnten Arzneistoffe) oder Antikörper (umfassend anti-Antikörper).
Diese Erfindung ist insbesondere für den Nachweis von zielspezifisch-bindenden Liganden niederen Molekulargewichts nützlich. Mit „zielspezifisch-bindenden Liganden niederen Molekulargewichts" sind Verbindungen gemeint, die ein Molekulargewicht von weniger als 500 Dalton besitzen und die nur in der Lage sind mit einem einzigen korrespondierendem Rezeptormolekül zu komplexieren (entweder da sie nur eine epitopische Bindungsstelle besitzen oder aufgrund von sterischen Behinderungen). Solche Liganden umfassen, sind aber nicht limitiert auf PGE₂ und andere Arachidonsäurenmetaboliter, Digoxin, Diphenylhydantoin, Carbamazepin, Phenobarbital und andere Materialien, die aus dem Stand der Technik ohne weiteres ersichtlich sind In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform ist diese Erfindung für den effiyienten und schnellen Nachweis von PGE₂ nützlich.
Wie hierin verwendet (wenn nicht anders bemerkt) umfaßt der Begriff "Antikörper" ganze Immunglobulinmoleküle, die eine einzige Spezifität wie es im Stand der Technik üblich ist. Zusätzlich ist beabsichtigt, daß dieser Begriff chemisch herstellte Fragmente (wie Fab, F(ab)', F(ab)₂-Fragmente) solcher Moleküle und genetisch hergestellte Äquivalente davon (wie "Einzelkettenantikörperfragmente" oder ScFv- Fragmente) umfaßt, Jeder Antikörpertyp, der hierin beschrieben wird, kann monoklonal oder polyklonal sein. Monoklonale Antikörper umfassen die Moleküle, die im allgemeinen durch konventionelle Hybridomtechnologie hergestellt werden, aber sie könen auch durch Elektrofusion, virale Transformation und andere im Stand der Technik bekannte Verfahren hergestellt werden.
Im allgemeinen werden die monoklonalen Antikörper, die in der vorliegenden Erfindung verwenden werden, durch die Immunisierung geeigneten Säugetiers (wie eine Maus oder eine Ratte) mit dem entsprecheden Antigen, wie einem Reporterenzym (oder dem an ein Trägerprotein konjugierten Antigen) immunisiert, gefolgt von den üblichen Velfahren, die durch Kohler et al., Nature 256, 495 (1975) beschrieben wurden.
Eine Milzzellpopulation aus dem immunisiertem Tieren kann mit einer geeigneten Hybridomzellinie in der Gegenwart von Polyethylenglycol(PEG1450) oder eines anderen Fusogens der Lehre von Lane (J. Immunol. Methods 81, Seiten 223-228 (1985) folgend, fusioniert werden. Die sich ergebenden hybridisierten Zellen werden in selektivem Medium verdünnt, auf Mikrotitelplatten verteilt und vor dem Screening für 7 bis 21 Tage kultiviert, um zu sehen, welche Eigenschaften die Antikörper besitzen. Ein spezifisches Verfahren für die Herstellung der besonderen nülzlichen Antikörper wird unten dargestellt
Eine Vielzahl von Myelomzellinien für die Hybridisierung mit den Säugetiermilzellen sind kommerziell erhältlich Quellen solcher Zellinien umfassen die American Type Culture Collection (ATCC) in Rockville, Maryland. Besonders nützliche Myelomzellinien umfassen SP2/0-Ag14 und P3×63Ag8 Myelomzellen die beide von ATCC erhältlich sind. Die erste Zellinie ist bevorzugt.
Bei der Herstellung monoklonaler Antikörper für die Verwendung in dieser Erfindung werden ausgewählte Hybridome im weichen Agar kloniert und individuelle Klone wurden entnommen unter Verwendung üblicher Mittel kultiviert und unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren gescreent. Die monoklonalen Antikörper wurden in Schüttelkolben wachsen gelassen und die Aritikörper wurden gesammelt und unter Verwendung üblicher Affinitätschromatographie über entweder immobilisiertes Protein A oder Protein G gereinigt Wenn gewünscht, können andere übliche Reinigungsveifahren verwendet werden
Assayprotokoll:
Im allgemeinen umfaßt das Assayprotokoll dieser Erfindung das Zuasammenbringen der folgenden Reagenzien in beliebiger Reihenfolge:

1) des Liganden (wie eine antigene Substanz) in einer Flüssigprobe eines Typs,
2) eines elsten Rezeptors (wie ein Antikörper), der spezifisch für und reaktiv mit dein Liganden (der mit einem Reporterenzym konjugiert oder in freier Form sein kann) in der Flüssigprobe ist und
3) eines wasserlöslichen Konjugats des Zielliganden und eines Reporterenzyms.

Sowie diese Reagenzien zusammengebracht werden, finden die entsprechenden Reaktionen statt Spezieller. Es konkurrieren die Zielliganden und das wasserlösliche Konjugat um die verfügbaren Stellen des ersen Rezeptors, wodurch spezifisch bindende Komplexe gebildet werden.
Wenn der erste Rezeptor in einer bestimmten Weise immobilisert ist, wird der wasserunlösliche spezifische Bindungskomplex, der so gebildet wird, dann von dem unkomplexierten wasserlöslichen Konjugat im sich ergebenden werden im großeren Detail unten beschrieben.
Sowie die Abtrennung erreicht ist, wird eine Probe des Überstands, der alles unkomplexierte wasserlösliche Konjugat enthält, mit einem immobilisierten zweiten Rezeptor zusammengebracht. Dieser zweite Rezeptor ist entweder für das Reporterenzym des Konjugats oder den Ligandenteil des Konjugats spezifisch.
Das Ergebnis dieses Kontakts ist die Bildung eines wasserunlöslichen Reaktiv des Konjugats mit dem immobilisierten zweiten Rezeptor. Dieses Reaktionsprodukt wird dann von allen verbleibenden nicht reagierten wasselöslichem Konjugat abgetrennt. Das Signal wird durch die Gegenwart des aktiven Reporterenzyms in dem immobilisierten Reaktionsprodukt in Proportion zur Menge des in der Flüssigprobe enthaltenen Liganden unter Verwendung geeigneter Signal-erzeugender Reagenzien (unten beschrieben) erzeugt.
Deshalb wird, wenn in der ursprünglichen Flüssigprobe kein Lignd vorhanden war, nach dem ersten Abtrennungsschritt kein wasserlösliches Konjugat im Überstand vorhanden sein. Wenn kein wasserlösliches Konjugat im Überstand vorhanden ist, reagiert kein Konjugat mit dem immobilisierten zweiten Rezeptor und es wird kein Signal erzeugt. Wenn in der Flüssigprobe Ligand vorhanden ist, wird wasserlösliches Konjugat im Überstand vorhanden sein Dieses Konjugat wird mit dem immobilisierten zweiten Rezeptor komplexieren, wodurch im direkten Verhaltnis zu der Menge des in der Flüssigprobe enthaltenen Liganden nachweisbares immobilisiertes Reaktionsprodukt zur Verfügung gestellt wird.
Wenn der erste Rezeptor wasserlöslich ist (nicht immobilisiert), wird die Reaktionslösung die ein Gemisch aus komplexierten und unkoplexierten Materialien enthält, direkt mit dem immobilisierten zweiten Rezeptor, der nur für den zielspezifisch bindenden Liganden spezifisch ist, in Kontakt gebracht. Alle Komplexe des ersten Rezeptors mit dem Konjugat des Liganden und Reporterenzyms werden weggewaschen, da sie nicht mit dem immobilisierten zweiten Rezeptor reagieren können. Daher ist keine vorherige Trennung von komplexierten und unkomplexierten Material unter Verwendung des ersten Rezeptors erforderlich. Die Signalerzeugung und der Nachweis wird in einer ähnlichen Weise wie oben beschrieben erreicht.
In den verschiedenen oben beschriebenen Schritten können die oben erwähnten bei einer geeigneten Temperatur im allgemeinen im Bereich von etwa 10 bis etwa 35°C und voryugsweise bei Raumtemperatur zusammengebracht werden. Die Zeit für das Mischen kann zwischen wenigen Sekunden bis 120 Minuten variieren, obwohl typischerweise der Mischungsschritt weniger als etwa fünf Minuten erfordert. Es ist auch bevorzugt, daß das gesamte Verfahren innerhalb von etwa 20 Minuten ausgeführt werden kann.
Der wende Ligand kann in jeder einer Velzahl von Flüssigproben (oder wäßrigen Lösungen) aus tierischen oder menslichen Körperflüsigkeiten, Geweben oder Abfallprodukten umfassend, aber nicht eingeschränkt auf Vollblut, Serum, Plasma, Lymphflüssigkeit Galle, Urin, Rückenmarksflüssigkeit, Tränenflüssigkeit Wischproben, Stuhlproben, Sperma, Vaginalsekretion, Speichel, crevikulärer Flüssigkeit, und anderen, die dem Fachmann ohne weiteres offensichtlich sind, riachgewiesen werden Die Menge der Flüssigprobe kann, wie es im Stand der Technik bekannt ist, im großen Umfang variieren, ist aber typischerweise mindestens etwa 1–10 μl.
Erste und zweite Rezeptormleküle werden für die Reaktion mit dem Liganden oder der Reporterenzymmarkierung die an dem Liganden befestigt ist, zugänglich gemacht. Im allgemeinen sind solche Rezeptoren Antikörper, die für den Liganden oder für das Reporterenyzm (unten beschrieben) spezifisch sind.
In einer Ausführungsform werden sowohl der erste und der zweite Rezeptor in immobilisierter Form auf dem selben oder einem anderen wasserunlöslichen Träger yur Verfügung gestellt. Geeignete Träger umfassen, sind aber nicht limitiert auf Polymer, magnetische oder Glaspartikel, Polymer- oder Gasfiltrationsmembranen, Zellulosefilterpapiere, Polymerfilme, Glasobjektträger, Testhöchren, magnetische Ferrofluide, Testvertiefungen oder Testvorrichtungen oder Mikrotiterplatten oder andere Materialien, die dem Fachmann ohne weiteres ersichtlich sind. Vorzugsweise werden die Rezeptoren auf demselben oder verschiedenen Polzmerpartikeln, die für diesen Zweck gestaltet worden sind, wobei die Partikel im Stand der Technik gut bekannt sind, immobilisiert. Die reaktiven Gruppen auf der Oberfläche der Partikel umfassen, sind aber nicht limitiert auf Carboxy, 2-subsititiertes Ethylsulfonyl, Vinylsulfonyl, Epoxy, Aldehyd, aktive Halogenatome, Amin, Hydrazin und aktive Ester wie Succinimidoxycarbonyl.
Besonders nützliche teilchenförmige Träger sind beispielsweise in EP-A 0 323 692 (am 12. Juli 1989 publiziert) und US-A,997,772 (Sutton et al.)beschrieben, die aus einem oder mehreren ethylenisch ungesättigen polymerisierbaren Monomeren hergestellt weiden, die aktive Halogenatome, aktivierte 2-subsituierte Ethylsulfonyloder Vinylsulfonylgruppen besitzen. Nützliche Carboxy-enthaltende Polymerpartikel sind in US-A-5,262,297 (Sutton et al.) beschrieben Andere Carboxy-enthaltende Polymerpartikel sind im Stand der Technik beschrieben und viele sind kommierziell erhältlich.
Die Befestigung der Rezeptoren am Träger kann unter Verwendung einer Vielzahl üblicher Verfahren erreicht werden wie dem Beschichten, um die Rezeptormoleküle zu absorbierten oder dem Inkubieren, um eine kovalente Reaktion mit den reaktiven Gruppen des Trägers zu erlauben. Solche Verfahren sind beispielsweise in US-A-5,252,457 (Snodgrass et al.) und US-A 5,262,297 (Sutton et al.) beschrieben. Alternativ kann der Rezeptor mit Trägem wie Polymerpartikeln, an denen Verknüpfungsgruppen befestigt sind, verknüpft werden und solche Verknüpfungsgruppen können chemische Gruppen sein, die sich vom Träger aus erstrecken oder biologische Verknüpfungsgruppen wie Peptide oder Antikörper, mit denen der Rezeptor komplexiert werden kann.
Die Menge des ersten Rezeptors, der in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, ist im allgemeinen von etwa 10^–11 bis etwa 10^–7 Molar, wobei von etwa 10^–9 bis etwa 10^–8 bevorzugt wird Das wasserlösliche Konjugat des Liganden und des Reporterenzyms, das in der Anwendung dieser Erfindung verwendet wird, kann unter Verwendung jedes üblichen Verfachrens des Stands der Technik für die kovalente Bindung von Proteinen, Hormonen, Arzneistoffen oder anderer chemischer oder biologischer Verbindungen, die die erforderlichen reaktiven Gruppen besitzen, hergestellt werden. Deshalb können verschiedene reaktive Gruppen des Liganden und des Reporterenyzms bei der Wahl der Mittel für die Herstellung des Konjugats erwogen werden, wie Gruppen umfassend, aber nicht limitiert Carboxy-, Amino-, Hydroxy-, Thiol- und Imidazolgruppen. Nützliche Verfahren der Bindung umfassen, sind aber nicht limitiert auf Bindung von Peptiden, Periodatoxidadion, Verwendung von Glutaraldehyd, Dikationether, Carbamoylonsalze, Carbodiimide oder N-Hydroxysuccinid und andere, die dem Fachmann ohne weiteres ersichtlich sind. Details für jede dieser und anderer Methoden werden in der umfangreichen Literatur, die Williams et al. Method in Immunology and Immunochemistry, Academic Press, New York, 1976 und Yoshitake et al., Eur. J. Biochem 101, 395 (1979) umfaßt, gefunden.
Die Menge des wasserlöslichen Konjugats, das in dem ersten Schritt des Verfahrens verwendet wird, ist im allgemeinen ausreichend, um mindestens etwa 10^–11 Molar Reproterenzym zur Verfügung zu stellen, so daß der Hintergrund vernachlässigbar ist und die Kinetik der Komplexbildung akzeptabel ist Zusätzlich ist im allgemeinen die Menge weniger als oder gleich zu etwa 3 × 10^–8 Molar, so daß die Enzymsubstrate zur Erzeugung eines Signals nicht zu schnell reagieren.
Die Reporterenzyme, die in dieser Erfindung als Teil des wasserlöslichem Konjugats nützlich sind, sind Enzyme, die typischerweise als Markierung in diagnostischen Verfahren verwendet werden. Sie umfassen, sind aber nicht limitiert auf Peroxidase, Glucoseoxidase, β-Galactosidase, Urease, alkalische Phoshotase, Kreatinkinase, Uricase, Glucose-6-Phosphatdehydrogenase und andere die dem Fachmann ohne weiteres erkenband sind. Eine Peroxidase (von einer Vielzahl von Quellen) ist bevorzugt und Meerrettichperoxidase ist am meisten bevorzugt
Der zweite in der Ausführung dieser Erfindung im Schritt B) verwendete Rezeptor kann derselbe oder ein anderer sein, als der im ersten Schritt A) des Verfahrens verwendete Rezeptor. Das bedeutet, es kann ein Rezeptor wie ein Antikörper für den Liganden sein Antikörper für verschiedene Liganden sind im allgemeinen im Stand der Technik gut bekannt und sind entweder durch Kauf von kommerziellen Quellen erhältlich oder können unter Verwendung bekannter Verfahren zur Herstellung polyklonaler oder monoklonaler Antikörper hergestellt werden. In den unten beschriebenen Ausführungsformen, bei denen mehrere Liganden gleichzeitig nachgewiesen werden, werden zweite Rezeptoren verwendet, die spezifisch für die wenden Liganden sind Alternatiz kann der zweite Rezeptor ein Antikörper sein, der speyifisch für das Reporterenzym des wasserlöslichen Konjugats ist, vorbei der Antikörper nicht signifikant die enzymatische Aktivität behindert. Das bedeutet, der Antikörper behindert die enzymatische Aktivität nicht mehr als 20% oder weniger (und vorzugsweise 6% oder weniger). Solche Antikörper können unter Verwendung üblicher oben beschriebener Verfahren hergestellt werden, gefolgt von einem Screeningverfahren, um Antikörper zu finden, die die gewünschten Eigenschaften besitzen. Sie weiden hierin als „Bindungsantikörper" bezeichnet Beispielsweise wird das Screening für „Bindungsantikörper", die für Meerrettichperoxidase spezifisch sind, unten zur Illustration dessen beschrieben, wie ein solches Screening für ein gegebenes Reporterenzym durchgeführt werden kann, aber diese Erfindung soll nicht so intepretiert werden, als daß sie nur auf dieses Reporterenzym beschränkt ist. Es wird angenommen, daß Antikörper gegen andere Reporterenzyme gleichermaßen hergestellt und unter Verwendung der hierin zur Verfügung gestellten Lehre identifiziert werden können. Das Screening auf Spezifität für das Reporterenzym kann ohne weiteres durch Verwendung üblicher Enzym Linked Immunosorbent Assays (ELISA) in Polystyrenmikrotiteplatten enthaltend absorbierte Meerrettichperoxidasekonjugate eireicht werden
Spezifität für Meerrettichperoxidase
Eine Probe (50 μl-Plattenvertiefung) jedes Hybridomkulturüberstands wird in eine Mikrotitervertiefung eingebracht, die mit einem Konjugat aus Meerreichperoxidase und einem irrelevanten Antikörper (einem in dem System nicht reaktiven Antikörper) der beispielsweise von Jackson Immunoresearch erhältlich ist, beschichtet ist Nach 30–60 Minuten Inkubation werden die Platten mit einer geeigneten Pufferlösung einer nicht ionischen oberflächenaktiven Substanz gewaschen und die Gegenwart von Maus- oder Meerrettichperoxidasespezifischen monoklonalen Anitikörpern wird mit einem Konjugat aus anti-Maus IgG oder anti-Ratten IgG und alkalischer Phosphatase (konjugiert mit anti-Maus Fc, beispielsweise von Jackson Immunoresearch erhältlich) nachgewiesen Ein Farbsignal kann durch das Hinzufügen des Substrats o-Nitrophenylphosphatdinatriumsalz (4 mg-ml) in Tris-(Hydroxymethyl)-aminomethanpuffer (1,5 Molar, pH 8) erzeugt weder. Andere Signal-erzeugende Reagenzien oder Enzymmarkierungen können gleichermaßen verwendet werden. Die Antikörper, die nach etwa 30 Minuten ein Farbsignal zur Vefügung stellen, das mindestens zweimal so stark wie das Hintegrundsignal ist, werden als für Meerrettichperoxidase spezifisch angesehen. Das Farbsignal kann unter Verwendung eines üblichen Spektrophotometers gemessen werden.
Die Bindungsantikörper, die für Meerrettichperoxidase spezifisch sind, können auf ihre inhibitorische Funktion in der folgenden Weise gescreentt werden. Wie oben bemerkt, ist es erwünscht daß die Bindungsantikörper eine geringere oder keine Inhibition der enzymatischen Aktivität aufweisen.
Assay für Enzyminhibition:
Eine Probe (50 μl) jedes Kulturüberstands wird in eine Mikrotiterplattenvertiefung eingebracht, gefolgt von dem Hinzufügen einer Lösung (50 μl) von Meerrettichperoxidase (0,2 nMolar), Gelantine (0,8%) in Phosphat gepufferter Salzlösung und dem sich ergebenden Gemisch wird es erlaubt, für 10 Minuten bei Raumtemperatur zu stehen Die residuale Enyzmaktivität wird dann durch das Hinzufügen von 100 μl des Meerrettichperoxidasesubstrats o-Phenylendiamin (1 mg/ml) in Citrat/Phosphat-Puffer (50 mMolar, pH 5,5, 1 : 1 Mischungsverhältnis) und dem Messen der Farbsinalmenge bei 450 nm unter Verwendung eines üblichen Spektrophotometers (mit einer Geschwindigkeit von 100 mOD/Minute) bestimmt Andere Substrate oder farbgebende Reagenzien können gleichenmaßen verwendet werden.
Die Kulturüberstände, die die Meerrettichperoxidaseaktivität weniger als 20% (im Vergleich zu einer Kontrolle ohne Gegenwart eins monoklonalen Antikörpers) inhibieren, werden als Bindungsantikörper angesehen. Vorzugsweise verringern die Antikörper die Aktivität des Reporterenzyms (wie Meerrettichperoxidase) um nicht mehr als 6%.
Die Dissoziationskonstanten (K_d) der Bindungsantikörper sind im allgemeinen geringer oder gleich 50 nMolar, vorzugsweise geringer oder gleich 25 nMolar und noch bevorzugter geringer oder gleich 5 nMolar. Es sollte verstanden werden, daß die K_d-Werte, die hierin bemerkt werden, relative Meßwerte für die Antikörper sind und daß verschiedene übliche Verfahren zur Messung dieses Parameters leicht höhere oder niedrigere Werte ergeben können. Die meisten der uniten in Tabelle 1 wiedergegebenden K_d-Werte (mit Ausnahme von "5–10") wurden durch die Messung der Konzentration des Bindungsantikörpers bestimmt, der erforderlich war, um eine 50% Inhibition von 0,1 nMolar des Rezeptorenzyms (wie Meerrettichperoxidase) durch 10 nMolar des monoklonalen Antikörpers, der als „4-22.2" bezeichnet wird, für den in den oben angegebenen Screeningtest bestimmt wurde, daß er 99% der enzymatischen Aktivität inhibiert, zu verhindem. Der monoklonale Antikörper 4-22.2 wurde unter Verwendung der Hybridomzellinie HB 11603, welche bei ATCC hinterlegt worden ist, herstellt.
Der K_d des Bindungsantikörpers, B5–10 wurde üblichen kompetitiven Assay durch die Messung der Menge des gebudenen und ungebundenen Antikörpers in Gegenwart von Meerrettichperoxidase gemessen.
Die folgende Tabelle I führt nützliche monoklonale Bindungsantikörper, die spezifisch für Meerrettichperoxidase sind, die nütylich in der Ausführung dieser Erfindung sind nach Spezies, Isotyp, K_d und maximaler Meerrettichperoxidaseinhibition auf:
Tabelle I
Die 6–89.1 und 7–32.2 monoklonalen Antikörper sind representative Bindungsantikörper für Meerretichperoxidase. Sie wuden unter Verwendung der neuen Hybridomzellinien, die hier als HB 11635 bzw. HB 1160 bezeichet wenden, welche beim ATCC hinterlegt worden sind, hergestellt.
Das im Verlauf des erfindungsgemäßen Assays durch das Reporterenzym erzeugte Signal kann ein chemmilumineszentes, elektrochemisches oder colorimetrisches Signal sein, abhängig von dem jeweiligen Reporterenzym und den korrespondierenden Reagenzien (wie Substrate) die verwendet werden, um das Signal zu erzeugen. Chemilumineszente Signale können in einer Vielzahl verschiedener Wege in Antwort auf ein Reporterenyzm erzeugt werden. In den meisten Systemen ist das Reporterenzym Peroxidase und ein Oxi dant wie Wasserstoffperoxid ist vorhanden oder wird in irgendeiner Weise hergestellt (beispielsweise durch die Reaktion von Oxidase mit seinem Substrat). Nützliche chemilumineszente Signale werden beispielsweise unter Verwendung von Acridinsalzen, Dioxetanen, Tetrakis-(Dimethylamino)-ethylen, Luciferin, Lucigenin, Oxalylchlorid, bestimmten Oxidasen (beispielsweise Xanthinoxidase) und 2,3-Dihydro-1,4- phtalazinedionen (wie Luminol und Isoluminol) erzeugt Viele Beispiele solcher Verbindungen und ihre Verwendung sind im Stand der Technik beispielsweise aus US-A-4,383,031 (Boguslaski et al.) US-A-4,598,044 (Kricka et al.), US-A-4,729,950 (Kricka et al.), US-A-5,108,893 (Baret) und Chemililumineszenz in Organic Chemistry (Gundermann et al., Springer-Verlag, Berlin 1987, Seiten 204–207) bekannt. Wenn ein chemilumineszentes Signal erzeugt wird, wird vorzugsweise Peroxidase als Reporterenzym verwendet und Luminol oder eine ähnliche Verbindung wird als Signal-erzeugendes Reagenz verwendet.
Vorzugsweise wird ein colorimetrisches Signal in dem erfindungsgemäßen Verfahren erzeugt Solche Signale können, wie es im Stand der Technik gut bekann ist unter Verwendung einer Vielzahl verschiedener Reporterenzyme und Reagenzien erhalten werden. Wenn das Reporterenyzm eine Peroxidase ist, wie es bevorzugt ist, umfassen nützliche Reagenzien, die eine Farbe bereitstellen, sind aber nicht limitiert auf Tetramethylbenzin und Derivate davon, o-Phenzlendiamin, Triarylmethane und Imidazolleucofarben, wie Triarylimidayolleucofarben, die in US-A-4,087,747 (Bruschi) und US-Aß5,024,935 (McClune) beschrieben werden. Substratlösungen für die verschiedenen Reporterenzyme werden in einer Waschlösung oder am Ende des Assays bereitgestellt. Eine nützliche Substratlösung für die Triarylimidayolleucofarben umfaßt Wasserstoffperoxid und ein Elektronentransfermittel, wie 4'-Hydxyacetonilid oder 3'-Chlor-4'-hydroxyacetanilid in einem geeigneten Puffer.
Die Menge der verschiedenen Reagenzien, die für die Erzeuagung des gewünschten Signals benötigt werden, würden für den Fachman unter Heranziehung der umfangreichen für die verschiedenen Signal-erzeugenden Systeme erhältlichen Literatur ohne weiteres offensichtlich sein. Die spezifische Ausführbarkeit für ein bevorzugtes colorimetrisches System ist unten in den Beispielen gezeigt.
Auch die für den Nachweis des gewünschten in dem Assay erzeugten Signals benötigte Ausrüstung würde ohne weiteres für den Fachmann erkennbar sein. Einige colorimetrische Signale können ohne weiteres unter der visuellen Beobachtung des Nutzers bewertet werden, aber im allgemeinen werden die Signale unter Verwendung geeigneter Vorrichtungen für den Empfang und die Evaluierung colorimetrischer, fluorimetrischer oder chemilumineszenter Signale evaluiert.
Wenn der erste Rezeptor immoobilisiert ist, wird zwischen den Schritten A) und B) ein Abtrennungszwischenschritt ausgeführt Der wasserunlösliche Komplex, der zwischen dem immobilisierten ersten Rezeptor und entweder dem Liganden oder dem wasserlöslichen Konjugat gebildet wird, wird von dem unkomplexierten Material (umfassend unkomplexiertes wasserlösliches Konjugat) unter Verwendung jedes Apparats und Verfahrens abgetrennt. Beispielsweise kann das Reaktionsgemisch aus Schritt A) durh eine Vielzahl von Filtermaterialien filtriert werden, die den (enthaltend wasserlösliche Materialien) hindurchlassen, während sie den wasserunlöslichen Komplex zurückhalten. Alternativ kann der von dem wasserulöslichen Komplex, der an einer Mikrotitellatte, einem Teströhrchen oder einer anderen Behältervorrichtung befestigt ist dekantiert werden. Vom wird der wasserunlösliche Komplex an Partikeln eines geeigneten (wie Polymerparticel, wie oben beschrieben) befestigt und solche Partikel werden ohne weiteres filtriert oder zentrifugiert.
Nützliche Filtrationsvorrichtungen würden für den Fachman ohne weiteres ersichtlich sein. Bevorzugte Filtrationsvorrichtungen sind in US-A,948,561 (Hinckley et al., 1) beschrieben.
Die am meisten bevorzugte Filtrationsvorrichtung enthält eine mikroporöse Filtrationsmembran, die eine durchschnittliche Porengröße von etwa 0,5 bis etwa 10 μm besitzt. Solche Membranen sind kommerziell von der Pall Corp. als LOPRODYNE^TM Membranen erhältlich.
Der Schritt B) und die folgenden Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens können in einem geeigneten Behälter ausgeführt werden, wobei der immobilisierte zweite Rezeptor und die anfängliche Reaktionslösung geeigneterweise gemischt werden können. Beispielsweise kann das Mischen in Mikrotiterplatten, Teströhrchen, Mikroyentrifugenröchren und anderen Vorrichtungen ausgeführt werden, die für den Fachmann ohne weiteres offensichtlich sind. Vorzugsweise wird das Verfahren in Wegwerftestvorrichtungen durchgeführt, in denen der zweite Rezeptor in einer geeigneten Weise immobilisiert ist. Solche Testvorrichtungen würden für den Fachmann ohne weiteres erkennbar sein und würden solche Vorrichtungen, wie die, die in US-A 3,825,410 (Bagshawe), US-A-3,888,629 (Bagshawe), US-Aß3,970,429 (Updike), US-A-4,446,232 (Liotto), US-A-4,833,087 (Hinckley), US-A-4,877,586 (Devaney, Jr. et al), US-A-4,921,677 (Hinckley et al.), US-A-4,923,680 (Nelson), US-A-4,948,561 (Hinckley et al.), US-A-4,988627 (Smith-Lewis) und US-A-5,132,085 (Pelanek) beschrieben sind, umfassen. Die am meisten bevorzugten Testvorrichtungen enthalten eine Mehrzahl von Testvertiefungen, die mikroporöse Filtrationsmembranen (wie LOPRODYNE^TM oder BIODYNE^TM-Membran der Pall Corp.) enthalten. Solche Vorrichtungen sind von der Eastman Kodak Company in SURECELL^TM oder EVALUSITE^TM-Test-Kits erhältlich. Der immobilisierte zweite Rezeptor kann, wenn gewünscht, in dem efindungsgemäßen Verfahren vor der Verwendung auf der Membran angeordnet werden.
Der Abtrennungschritt C) des beanspruchten Verfahrens kann in jeder gewiünschten Weise ausgeführt werden. Das Verfahren und der oben beschriebene Apparat für den Zwischenabtrennungschritt kann in Schritt C) verwendet werden. Vorzugsweise wird das wasserlösliche Reaktionsprodukt vom unreagierten wasserunlöslichen Konjugat in derselben wegwerfbaren Testvorrichtung wie oben beschrieben, abgetrennt. Jedes von dem abgetrennten Reaktionsprodukt erzeugte Signal kann auch in diesen Fällen in der wegwerfbaren Testvorrichtung nachgewiesen werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform können zwei oder mehr verschiedene Liganden gleichzeitig unter Verwendung derselben Filtrations- und Testvorrichtungen nachgewiesen werden. Eine solche speyifische Bindungsimethode für den Nachweis von zwei oder mehr zielspezifisch-bindenden Liganden umfaßt die Schritte:

A) Zusammenbringen in beliebiger Reihenfolge:
1) eine Flüssigprobe, von der vermutet wird, daß sie zwei oder mehr zielspezifisch-bindende Li-ganden enthält,
2) einen immobilisierten ersten Rezeptor für jeden der zielspezifisch-bindenden Liganden und
3) zwei oder mehr wasserlösliche Kanjugate, wobei ein Koonjugat von jedem zielspezifischbindenden Liganden und demselben Reporterenzym gebildet wird, um zwei oder mehr unterschiedliche, wasserlösliche Komplexe zwischen dem immobilisierten ersten Rezeptoren und entweder dem entsprechenden zielspezifisch-bindenden Liganden oder den wasserlöslichen Konjugaten zu bilden,
B) Abtrennen er wasserunlöslichen Komplexe, die in Schritt A) gebildet wurden, von dem Überstand, der alle unikomplexierten wasserunlöslichien Konjugate enthält,
C) Zusammenbringer einer Probe des Überstands, der alle unkomplexierten wasserlöslichen Konjugate enthält, und eines immobilisierten zweien Rezeptors für jeden der zielspezifisch-bindenden Liganden, wobei die immobilisierten zweiten Rezeptoren in unterschiedlichen Bereichen eines wasserunlöslichen Trägers angeordnet sind, um ein wasserunlösliches Reaktionsprodukt des immobiliserten zweiten Rezeptors und aller unkomplexierten wasserunlöslichen Konjugate in den jeweiligen unterschiedlichen Regionen des wasserunlöslichen Trägers zu bilden.
D) Abtrennen des in Schritt C) gebildeten Reaktionsprodukts von allen unreagierten wasserlöslichen Konjugaten und
E) Nachweisen jedes Signals, das in den löslichen Reaktionsprodukten in unterschiedlichen Regionen des wasserunlöslichen Trägers erzeugt wird, als Bestimmung der zwei oder mehr zielspezifisch-bindenden Liganden in der Flüssigprobe.

Nützliche wasserunlösliche Träger zum Nachweis mehrerer Liganden in dem angeführten Verfahren können Filme, Papiere, Membranen oder jedes andere wasserunlösliche Material sein, daß gegenüber den Reagenzien des Assays inert ist und auf dem unterschiedliche Ablagerungen immobilisierter zweiter Rezeptoren angeordnet werden können Solche Ablagerungen können in jeder gewünschten Konfiguration angeordet werden, umfasssend Punkte, Streifen und Symbole (siehe beispielsweise US-A-5,132,085 und EP A-0 439 210). Vorzugsweise werden die Abscheidungen der immobilisierten zweiten Rezeptoren als verschiedene Teilchenpunkte auf einer mikroporösen Membran in einer Einyeltestvorrichtung angeordnet.
Die hierin beschrieben Reagenzien und Vorrichtungen und die in der Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet werden, können als individiuell verpackte Komponenten eines Test Kits geliefert wenden. Solche Kits enthalten ein wasserlösliches Konjugat eines zielspezifisch-bindenden Liganden und ein Reporterenzyms, einen ersten Rezeptor (immobilisert oder nicht), wie oben beschrieben und einen immobiliserten zweiten Rezeptor, wie oben beschrieben. Das Test-Kit kann alle diese Reagenzien sowie geeignete Reagenzien zur Bereitstellung eines colorimetrischen, fluorimetrischen oder chemilumineszenten Signals in Antwort auf das Reporterenzym, Waschlösungen, wegwerfbare Testvorrichtungen, Filtrationsvorrichtungen und Anleitungen zur Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens enthalten. Die Kits können auch individuelle Komponenten enthalten, die benötigt werden, um mehr als einen zielspezifisch-bindenden Liganden nachzuweisen, das be deutet mehrere erste Rezeptoren, zweite Rezeptoren und andere Reagenzien, wie es ein Fachmann verstehen würde.
Die folgenden Beispiele sind beschreibend für die Erfindung und sind nicht beschränkend gemeint. Alle Prozentangaben sind in Gewichtsprozent, wenn nichts anders angegeben ist.
Materialien und Methoden für die Beispiele:
Herstellung des monoklonalen Rezeptorantikörpers, der für Meerrettichperoxidase spezifisch ist:
Ein reprasentätiver monoklonaler Bindungsantikörper, der in der Tabelle I als 6-89.1 bezeichnet wurde, wurde wie folgt hergestellt:
Sprague-Dawley-Raaten wurden mit einer Lösung aus Meerrettichperoxidase (400 μg) in dem kommerziell erhältlichen Emmulsionsadjuvant TDM/MPL (RIBI Corporation) viermal in vierwöchigen Tntervallen injiziert. Eine fünfte Injektion wurde mit Meerrettichperoxidase (400 μg) in Phosphat-gepufferter Salzlösung durchgeführt. Drei Tage später wurden Milzzellen aus den immunisierten Ratten mit Zellen von der SP2/0-Ag14 Myelomzellinie unter Verwendung üblicher Verfahren fusioniert.
Das Screening der sich ergebenden Antikörper auf ihre Spezifität gegen Meerrettichperoxidase wurde wie beschrieben durch Hinzufügen von 50 μl des Kulturüberstands zu den Vertiefungen einer Mikrotitelplatte, die mit einem Konjugat von Meerrettichperoxidase und anti-Mausantikörper beschichtet war, durchgeführt Der gebundene Antikörper wurde durch Hinzufügen eines Konjugats alkaliner Phosphatase mit Ziegen-anti-Maus-IgG Fc (Jackson Immunoresearch) nachgewiesen, gefolgt von einer Signalerzeugung unter Verwendung von 4 mg/ml o-Nitriophenylphosphatdinatriumsalz (Sigma Chemical) als Substrat für die alkalische Phosphatase in Tris(hydroxymethyl)aminomethanpuffer (1,5 Molar, pH 8). Das Farbsignal wurde nach 30 Minuten unter Verwendung eines üblichen Spektrophotometers ausgewertet.
Das Screenen nach Meerrettichperoxidase inhibitorischer Funktion wurde durch das Hinzufügen einer Probe (50 μl) jedes Kulturübeistanandes zur Mikrotiterplattenvertiefung ausgeführt, gefolgt von der Zugabe von Meerrettich peroxidase (0,2 nmolar) und Gelatine (0,8%) in Phosphat-gepufferter Salzlösung und es wurden den sich ergebenden Gemischen erlaubt, bei Raumtemperatur für 10 Minuten zu inkubieren.
Die verbleibende Meerrettichperoxidase-Aktivit winde durch Hinzufügen einer Lösung (100 μl) von o-Pherryldiamin (1 mg/ml) in Citrat/Phosphatpuffer (50 μl, 50 nMolar, pH 5,5) und dem Messen der Städte des Farbsignals bei 450 nm unter Verwendung eines üblichen Spektrophotometers (100 mOD/Minute) nachgewiesen. Für den sich ergebenden Antikörper 6-89.1 wurde gemessen, daß er die Enzymaktivitäten nur um 6% verringerte.
Der monklonale Bindungsantikörper, der oben als „B5-10" bezeichnet wurde, wurde in einer ähnlichen Weise hergestellt. Der jeweilige Bindungsantikörper, den in den folgenden Beispielen verwendet wird, ist nicht kritisch für die Erfindung. Jeder geeignete Bindungsantikörper, wie oben beschrieben, kann gleichermaßen verwendet werden.
Die Bindungsantikörper wurden vor der Verwendung in den Assays bei 4°C als getrennte Stammlösungen, die etwa 1 mg Antikörper pro ml Phosphat-gepufferter Salzlösung und 0,02% Mrthiolat als Konservierungsmittel enthielten, aufbewahrt.
Herstellung und Verwendung des Konjugats von Diphenylhydantoin und Meerrettichperoxidase:
Ein wasserlösliches Konjugat von Diphenylhydantoinhapten und Amin-angereicherter Merrettichperoxidase wurde wie folgt hergestellt. Diese Zubereitung ist nur beispielhaft und nicht für die Herstellung der in der vorliegenden Erfindung nützlichen Konjugate entscheidend. Es existieren auch alternative Herstellungsverfahren.
Das Hapten 5,5-Diphenyl-3-{4-[4-{3-succinimidoxycarbonylpropionyl)-1-piperazinylcar-bonyl]-butyl}-2,4imidawlidindion, wurde durch die in EP A-0 517 327 Beschriebenen Verfahren (am 5. Mai 1993 publiziert) hergestellt. Es wird in dieser Publikation als „HD-2" bezeichnet. Amin-angereicherte Meerrettichperoxidase wurde unter Verwendung des allgemeinen Verfahrens des Beispiels 1 von US-A-5,162,219, das hierin durch Verweis aufgenommen wird, hergestellt.
Das Hapten wurde mit der Amin-angereicherten Meerrettichperoxidase durch Auflösen vor „HD-2" (15,5 mg) in trocknem N,N-Dimethylformamid (1,031 ml) enthaltend 4'-Hydroxyacetanilid (10 mMolar) konjugiert Eine Lösung der Amin-angereicherten Meerrettichperoxidase (1 ml, 10 mg/ml) in N(2-Hydroxyethyl)piperazin-N'(3-propanssulfonsäure)-Puffer (pH 8, 0,1 Molar) wurde mit N,N'-Dimethylformamid (500 μl) enthaltend 4'-Hydroxyacetanilid (10 mMolar) unter Vortex-Mischung vereint und dann in ein 42°C Wasserbad gestellt Die „HD-2"-Lösung (500 μl) wurde tropfenweisen zu der Enzymlösung unter Vortex-Mischung zugefiigt, so daß das molare Verhältnis 50 : 1 war. Das Reaktionsgemisch wurde für eine Stunde bei 42°C unter vorsichtiger Bewegung gemischt.
Das Reaktionsprodukt wurde wie folgt dialysiert:

a) Gegen ein Gemisch aus N,N'-Dimethylformamid (1 Liter) enthaltend 4'-Hydroxyacetanilid (10 mMolar) und den oben angegeben Puffer (pH 8, 0,1 Molar) in einem Verhältnis von 1 : 1 bei 42°C für eine Stunde.
b) Die Dialysebedingung a) wurde wiederholt.
c) Gegen den beschriebenen Puffer (1,5 Liter, 0,1 Molar, pH 8) enthaltend Rinderserumalbumin (0,1%) bei 8°C für 1,5 Stunden
d) Gegen den beschriebenen Puffer (1,5 Liter, 0,1 Molar, pH 8) bei 8°C für 18 Stunden.
e) Gegen Tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochloridpuffer (1,5 L Liter, 0,04 Molar, pH 7,5) enthaltend Natriumchlorid (0,15 Molar) bei 8°C für 2 Stunden.
f) Die Dialysebedingung e) wurde für 4 Stundew wiederholt.

Die Produktlösung enthielt 1,48 mg/ml des Diphenylhydantoin-Meerrettichperoxidasekonjugats wie durch Spektrophotometrie bestimmt wurde.
Herstellung des Konjugats aus PGE₂ und Meerrettichperoxidase:
Ein wasserlösliches Konjugat aus PGE₂ und Meerrettichperoxidase wurde durch das folgende Verfahren hergestellt. Dieses Verfahren ist jedoch nur beispielhaft, da andere nützliche Verfahren auch bekannt sind.
Eine Lösung (0,6 ml) von PGE₂ (5 mg) in wäßrigen N,N'-Dimethylformamid/Di-methylsulfoxid (13% beziehugsweise 26%) wurden mit einer äquimolaren Menge Tributylamin (2,63 μl) behandelt, in einem Eisbad gekühlt und dann mit einer äquimolaren Menge Isobutylchlorfomiat (1,94 μl einer 1 : 100 Lösung in N,N-Dimethylformamid) gemischt. Das sich ergebende Gemisch wurde in einem Eisbad für 20 Minuten gerührt. Die Amin-angereicherte Meerrettichperoxidase wurde unter Verwendung des Verfahrens des Beispiels 1 aus US-A 5,162,219 (oben wiedergeben) hergestellt mit der Ausnahme, daß es in einem größeren Rahmen hergestellt wurde, L-Lysine wude für Ethylendiamin substituiert und 1-Ethyl-3(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid wurde für 1-(4-Morpholinocarbonyl)-4-(2-sulfoethyl)pyridinhydroxid, inneres Salz, substituiert Ein Teil der sich ergebenden Lösung des angereicherten Enzyms (19,33 mg/ml) wurde mit 3-(Nmorpholino)propansulfonsäurepuffer (0,02 Molar) auf 1 mg/ml verdünnt. Der pH wurde mit Natriumhydroxid (0,05 Molar) auf 9 erhöht, darin tropfenweise mit der vorher hergestellten PGE₂-Lösung (1,493 ml) behandelt. Das Gemisch wurde für 90 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und der pH mit verdünnter Salzsäure auf 7 verringert Ammoniumhydroxid (0,578 ml, 0,2 Molar, pH 7) wurde zu einer Endkonzentration von 0,02 Molar hinzugesetzt und das sich ergebende Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 2 Stunden inkubiert. Die sich ergebende Konjugatlösung wurde in Gelfiltrationsäulen entsalzen, konzentiert und zuerst gegen Wasser, dann gegen Phosphat-gepufferte Salzlösung dialysiert. Die Produktlösung ethielt 1,3 mg/ml (58% Ausbeute) des PGE₂-Meerrettichperoxidasekonjugats, wie durch Spektophotometrie bestimmt wurde.
Das oben beschriebene Diphenylhydantoin-Meerrettichperoxidasekonjugat (3,29 × 10^–10 Molar) und das PGE₂-Meerrettichperoxidasekonjugats (1 × 10^–9 Molar) wurden getrennt in 3-(N Morpholino)propansulfonsäurepuffer (0,2 Molar, pH 7) enthaltend Rinderserumalbumin (1%) und Merthiolat (0,02%) aufbewahnt.
Die in den Assays der Beispiele verwendeten monoklonalen, die spezifisch für Diphenylhydantoin sind und monklonale und polyklonale Antikörper, die spezifisch für PGE₂ sind, wurden entweder von kommerziellen Quellen erhalten oder unter Verwendung üblicher Verfahren hergestellt. Diese Aritikörper wurden wie folgt getrennt auf Partikeln aus Poly[styren-co-p-(2-chlorethyl-sulfonylmethyl)styren](Monomer-Gewichtsverhältnis von 92 : 8, 1 μm durchschnittliche Größe)immobilisiert. Die monoklonalen Bindungsantikörper, wie B 5– 10 wurden gleicheimaßen immobilisiert.
Eine Lösung (3% Feststoffe) der Partikel wurde mit den jeweiligen Antikörpen (0,829 mg/ml) für 24 Stunden bei Raumtemperatur in Borpuffer (0,1 Molar, pH 8,5) gemischt. Die sich ergebende befestigte Bedeckung war etwa 0,025 g/g Antikörper pro Gramm Partikel für anti-PGE₂-Antikörper, 0,025 g/g für anti-Diphenylhydantoin Antikörper und 0,013 g/g für anti-Meerrettichperoxidase-Antikörper. Die sich ergebenden immobilisierten Antikörper, die als immobiliserte erste oder zweite Rezeptoren verwendet wurden, wurden gewaschen und in N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethansulfonsäurepuffer (0,1 Molar, pH 7) resuspendiert
Meerrettichperoxidase, die Isoenzym C enthielt, wurde von Servac Inc. (Südafrika) erhalten.
Die Enzymsubstratlösung wurde durch Hinzufügen einer Lösung (5 ml) aus 4,5-bis(4-Dimethylaminophenyl)- 2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)imidazol-Leucofarbstoff (1 g) in N,N-Dimethylformamid zu einer Lösung (500 ml) aus Polyvinylpyrrolidon (125 g) hinzugegeben und für eine Stunde gerührt Diethylentriamindepentaessigsäure (1 ml, 0,1 Molar) wurde zu einer Lösung 9500 ml eines einbasigen Natriumphosphatmonohydrats (13,8 g) unter Rühren hinzugefügt, gefolgt durch das Hinzufügen von 3'-Chlor-4'- hydroxyacetanilid (9,4 g). Das sich ergebende Gemisch wurde gerührt, um die Bestandteile zu lösen und der pH wurde mit 50% Natriumhydroxid auf 6,8 angeglichen. Unter heftigem Rühren wurde es dann mit der Leucofarblösung gemischt. Wasserstoffperoxid (10 ml, 30%) wurde hinzugefügt und die Endlösung wurde für weitere 15 Minuten gerührt.
Eine Farbsignalstoplösung enthielt Benzohydroxansäure (0,1%) und Merthiolat (0,01%) in Phosphat-gepufferter Salzlösung (0,05 Molar, pH 7,3).
Eine Waschlösung enthielt TERGITOL^TM 4 anionisches Detergenz (1,35%), Casein (0,5%) und Merthiolat (0,01%) in Glycinpuffer (pH 10).
Die Lösung des Zieldiphenylhydrantoin oder des PGE₂ wurde in 3-(N-Morpholino)propansulfonsäurepuffer (0,2 Molar, pH 7), der Rindserumalbumin enthielt (1%), hergestellt.
In der Ausführungsform dieser Erfindung in der ein immobilisierter erster Rezeptor verwendet wird (Beispiele 1 und 2, Schritt A) wurde die folgende Abtrennung unter Verwendung einer Extraktionsvorrichtung, enthaltend ein Röhrchen (6 ml Volumen) an das eine Filterkappe angepaßt war, die eine LOPRODYNE^TM mikroporose Membran (1,2 μm durchschnittliche Porengröße) enthielt, wie in US-A-4,948,561 (wie oben bemerkt) beschrieben, durchgeführt. In der Ausführungdform, in der der erste Rezeptor wasserlöslich ist, wurde Schritt A) in einem Teströhrchen ausgeführt
Die Sekante der vorliegenden Erfindung wurde in einer wegwerfarben Testvorrichtung aus einem EVALUSITE^TM-Test-Kit [wie das in US-A 5,132,085 (Pelanek)beschriebene] ausgeführt, die 3 Testvertiefungen enthielten, wobei jede eine LOPRODYNE^TM mikroporöse Membran (1,2 μm durchschnittliche Porengröße) besitzt. Auf die Membran jeder Vertiefung wurde eine Suspension (1,8 μl, 0,3% Feststoffe) des oben beschriebenen immobiliserten zweiten Antikörpers gegeben und getrocknet.
Beispiel 1 Assay für Prostaglandin PGE₂
Der Ligand PGE₂ wurde gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wie folgt bestimmt. Zu einem Mikrozentrifugenröhrchen wurde in folgender Reihenfolge hinzugefügt:
N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-2-aminoethansulfonsäurepuffer (0,107 ml, 0,1 Molar, pH 7), immobilisierte anti-PGE₂-Antikörperreagenz (0,028 ml, 0,6% Feststoffe, Endkonzentration) und unmarkierte PGE₂-Lösung (0,03 ml, verschiede Ligandenkonzentration), gefolgt von einer Inkubation bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Dann wurde wasserlösliches PGE₂-Meerrettichperoxidasekonjugat (0,03 ml) hnzugefügt, gefolgt von einer Inkubation für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Der Inhalt wurde in den Röhrchen für 8 Minuten zetrifugiert. Der Überstand des Röhrchens wurde in die Testvertiefugen der wegwerfbaren Testvorrichtung die immobiliserte anti-Meerrettichperoxidas Antikörper enthalten, dekantiert. Wo genügend Ziel-PGE₂ in der Testlösung vorhanden war, enthielt der Überstand ungebundenes wasserlösliches Konjugat aus PGE₂ und Meerrettichperoxidase. Nach Inkubation in 5 Minuten bei Raumtemperatur wurde die Waschlösung (etwa 350 μl) zu den Testvertiefungen hinzugefügt, entleert und von einer zweiten Waschung gefolgt. 3 Tropfen der Enzymsubstratlösung wurden hinzugefügt. Nach Inkubation für 2 Minuten bei Raumtemperatur wurde die Farbsignalstoplösung (3 Tropfen) hinzugefügt und das sich ergebene Farbsignal wurde bewertet Positive Kontroll-Assays wuden gleichmaßen in Abwesenheit des Ziel-PGE₂ und immobilisierten anti-PGE₂-Antikörpers in dem Mikrozentrifugenröhren ausgeführt. In solchen Situationen war das gesamte wasserlösli che Konjugat frei, um mit dem immobilisierten zweiten Rezeptor (Antikörper) in der Testvorrichtug zu komplexieren, wodurch das maximale Farbsignal zur Verfügung gestellt wurde.
Negative Kontroll-Assays wurden gleichermaßen in Abwesenheit des Ziel-PGE₂ ausgeführt, aber in Gegenwart von immobiliserten anti-PGE₂-Antikörpern in dem Mkrozentrifugenröhrchen. Das sich ergebende Fairbsignal war nur vom Hintergrund.
Eine Titration des Farbsgnals über den Hintergrund hinaus wurde als Funktion der PGE₂-Konzentration mit einer Nachweisgrenze zwischen 1 × 10^–9 und 3 × 10–9 Molar PGE² beobachtet. Die 1 und 2 zeigen die Ergebnisse dieser Assays in Form von Dosis-Antwort-Kurven, umfassend die Positiv- und Negativ-Kontrollen Kurven 1 bzw. 3) und den erfindungsgemäßen Assay (Kurve 2). In 1 ist das Farbsignal (beobachteter Farbwert aus einem Farb-Dichten-Diagramm) auf der y-Achse aufgetragen und die PGE₂-Konzentration [log(PGE₂)] auf der x-Achse aufgetragen. 2 ist eine ähnliche Zeichnung, aber mit dem Farbsignal (Dichte-Transmission) auf der x-Achse aufgetragen. Dieser Assay zeigt den empfindlichen Nachweis von PGE₂, das ein Marker für bestimmte peridontale Erkankungen ist.
Beispiel 2 Assay für Diphenylhydantoin
Der Ligand Diphenylhydantoin (Phenytoin) wurde gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wie folgt wie folgt bestimmt zu einer Extraktionsvorrichtung wurde in folgender Reihenfolge hinzugefügt: N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-2-aminoethansulfonsäurepuffer (0,211 ml, 0,1 Molar, pH 7), immobilisierte anti-Diphenylhydration-Antkörperreagenz (0,059 ml, 0,2% Feststoffe, Endkonzentration, ind unmarkierte Diphenylhydantoinlösung (0,03 ml, verschiedene Ligandenkonzentration) gefolgt von Inkubation für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Wasserlösliches Diphenylhydantoin-Meerrettichperoxidaskonjugat (0,03 ml) wurde gefolgt von Inkubation für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Dann wurde die Filterkappe auf das Röhrchen gesetzt.
Der Überstand aus den Extraktionsröhrchen wurde durch die Filterkappe gepreßt und auf die Testvertiefungen der wegwerfbaren Testvorrichtung, die immobiliserte anti-Diphenylhydantoin-Antikörper als zweiten Rezeptor enthielten, gegeben. Wo ausreichend Zieldiphenylhydantoin vorhanden war, enthielt der Überstand ungebunde nes wassrelösliches Konjugat Diphenylhydrantoin und Meerrettichperoxidase. Nach Inkubation für 5 Minuten bei Raumtemperatur wurde die Waschlösung (350 μl) zu den Testvertiefungen hinzugefügt, entleert und von einer zweiten Waschung gefolgt 3 Tropfen der Enzymsubstratlösung wurde hinzugefügt Nach Inkubation für 2 Minuten bei Raumtemperatur wurde die Farbsignalstoplösung (3 Tropfen) hinzugefügt und das sich ergebende Farbsignal wurde bewertet.
Positive und negative Kontroll-Assays wurden gleichermaßen, wie in Beispiel 1 beschrieben, aiusgeführt.
Eine Titration des Farbsignals über den Hintergrund hinaus wurde als Funktion der Diphenylhydantoin-Konzentration mit einer Nachweisgrenye zwischen 1 × 10^–8 und 3 × 10^–8 Diphenylhydantoin beobachtet 3 und 4 zeigen die Ergebnisse dieser Assays in Form von Dosis-Antwort-Kurven, umfassend die positiven und negativen Kontrollen (Kurven 1 bzw. 3) und den erfindungsgemäßen Assay (Kurve 2). In 3 ist das Farbsignal (der beobachtete Farbwert aus einem Farb-Dichte-Diagiamm) auf der y-Achse aufgetragen und die Diphenylhydantoin-Konstellation [log(Diphenylhydantoin)] auf der x-Achse aufgetragen 4 ist eine ähnliche Auftragung, wobei das Farbsignal (Dichte- Transmission) auf dery-Achse aufgetragen ist
Beispiel 3 Alternativer Assay für Prostaglandin PGE₂
Der Ligand PGE₂ wurde gemäß einer alternativen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung unter Verwendung eines wasserlöslichen (nicht-immobiliserten) ersten Rezeptors wie folgt bestimmt Zu einem Teströhrchen wurde folgender Reihenfolge hinzugefügt:
anti-PGE₂-Antikörper (0,270 ml, 0,00316 mg/ml) in N-[Tris(hydroxymethyl]-2-aminoethansulfonsäurepuffer (0,1 Molar, pH 7) und unmarkierte PGE₂-Lösung (0,03 ml, verschiedene Ligandenkonzentrationen, wie in Beispiel 1) gefolgt von Inkubation für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Dann wurde wasserlösliches PGE₂-Meerrettichperoxidase-konjugat (0,03 ml) hinzugefügt, gefolgt von Inkubation für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Der Inhalt wurde in die Testvertiefungen der wegwerfbaren Testvorrichtug, die immobilisierte monoklonale anti-PGE₂-Antikörper enthielten, dekantiert. Wo ausreichend Ziel-PGE₂ in der Testlösung den war, enthielt der Überstand ungebundenes wasserlösliches Konjugat aus PGE₂ und Meerrettichperoxidase.
Nach Inkubation für 5 Minuten bei Raumtemperatur wurde die Waschlösung (etwa 350 μl) zu den Testvertiefungen hinzugefügt, entleert und von einer zweiten Waschung gefolgt 3 Tropfen der Enzymsubsratlösung wurden hinzugefügt Nach Inkubation für 2 Minuten bei Raumtemperatur wurde die Farbsignalstoplösung (3 Troffen) hinzugefügt und das sich ergebende Farbsignal winde bewertet.
Positive Kontroll-Assays wurden gleichermaßen in Abwesenheit des Ziel-PGE₂ und der anti-PGE₂-Antikörper in den Teströhrchen ausgeführt In solchen Situationen waren alle wasserlöslichen Konjugate frei mit immobilisierten zweiten Rezeptor (Antikörpern) in der Testvorrichtung zu komplexieren, wodurch das maximale Farbsignal zur Verfügung gestellt wurde.
Negative Kontroll-Assays wurden gleichermaßen in Abwesenheit des Ziel-PGE₂, aber mit in dem Röhrhen vorhandenen PGE₂-Antikörpern ausgeführt. Das sich ergebende Farbsignal war nur vom Hintergrund.
Eine Titration des Farbsignals über den Hintergrund wurde als Funktion der PGE₂-Konzentration mit einer Nachweisgrenze zwischen 1 × 10^–8 und 3 × 10^–8 Molar PGE₂ beobachtet. Dieser Assay zeigt einen Nachweis von PGE₂, das ein Marker für bestimmte peridontale Erkankungen ist. Die Erfindung ist im Detail mit besonderem Verweis auf bevorzugte Ausführungsformen davon beschrieben worden, aber es wird verstanden werden, daß Variation und Veränderug innerhalb des Umfangs der Erindung erzielt werden können.

Claims

Spezifisches Bindungsverfahren für den Nachweis von zielspezifisch bindenden Liganden, umfassend die Schritte: A) Zusammenbringen in beliebiger Reihenfolge: 1) eine Flüssigprobe, von der vermutet wird, daß sie ein zielspezifisch bindenden Liganden enthält 2) einen ersten Rezeptor für den zielspezifisch bindenden Liganden und 3) ein wasserlösliches Konjugat des zielspezifisch bindenden Liganden und eines Reporterenzyms um ein Gemisch zu bilden, das einen Komplex zwischen dem ersten Rezeptor und entweder dem zielspezifisch bindenden Liganden oder dem wasserlöslichen Konjugat enthält, B) Zusammenbringen einer Probe des Gemisches, enthaltend ein beliebiges nichtkomplexiertes wasserlösliches Konjugat und einen immobilisierten zweiten Rezeptor, wobei der zweite Rezeptor entweder spezifisch für das Reporterenzym oder den zielspezifisch bindenden Liganden ist, um ein wasserunlösliches Reaktionsprodukt des zweiten immobilisierten Rezeptors und eines beliebigen unkomplexierten wasserlöslichen Konjugats zu bilden, vorausgesetzt, daß, wenn der erste Rezeptor wasserlöslich ist, der zweite Rezeptor spezifisch für den zielspezifisch bindenden Liganden ist und vorausgesetzt, daß, wenn der erste Rezeptor immobilisiert ist, das unkomplexierte wasserlösliche Konjugat von dem Komplex des wasserlöslichen Konjugats und des immobilisierten ersten Rezeptors in einem Zwischenschritt, zwischen Schritt A) und Schritt B) abgetrennt wird, C) Abtrennen des wasserlöslichen Reaktionsprodukts, das in Schritt B) gebildet wird, von jedem nicht reagiertem wasserlöslichen Konjugat und D) Nachweisen jedes Signals, das von dem abgetrennten wasserunlöslichen Reaktionsprodukt erzeugt wird, als Bestimmung des zielspezifisch bindenden Ligandens in der Flüssigprobe.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die ersten und zweiten Rezeptoren Antikörper gegen den zielspezifisch bindenden Liganden sind.
Verfahre nach Anspruch 1, wobei das Reporterenzym eine Peroxidase, alkalische Phosphatase, Creatinkinase, Glucoseoxidase, Urease, β-Galactosidase oder Glucose-6-Phosphatdehydrogenase ist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Reporterenzym eine Meerrettichperoxidase ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Nachweisschritt D) durch die Bewertung eines kolorimetrischen Signals durchgeführt wird, das vom Reporterenzym in der Gegenwart eines geeigneten Substrats erzeugt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, für den Nachweis eines niedermolekularen zielspezifisch bindenden Ligandens, wobei der erste Rezeptor ein gegen den niedermolekularen zielspezifisch bindenden Ligaeden spezifischer Antikörper ist und der zweite Rezeptor ein entweder gegen den niedermolekularen zielspezifischen Ligaeden oder gegen das Reporterenzym spezifischer Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 6 für den Nachweis von Prostaglandin E₂ (PGE₂), wobei das Reporterenzym Meerrettichperoxidase ist, der erste Rezeptor ein gegen PGE₂ spezifischer Antikörper ist und der immobilisierte zweite Antikörper ein gegen entweder PGE₂ oder Meerrettichperoxidase spezifischer Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die ersten und zweiten Rezeptoren auf Polymerteilchen immobilisiert sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der immobilisierte erste Rezeptor ein Antikörper gegen den zielspezifisch bindenden Liganden ist und der immobilisierte zweite Rezeptor ein Antikörper gegen das Reporterenzym ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Flüssigprobe und der immobilisierte erste Rezeptor vor dem Kontakt mit dem wasserlöslichen Konjugat zusammengebracht werden, der wasserunlösliche Komplex, der in Schritt A) gebildet wird, von dem nichtkomplexierten wasserlöslichen Konjugat im Überstand durch Filtration abgetrennt wird und der immobilisierte zweite Rezeptor auf einer Filtrationsmembran, durch die der Überstand in Schritt C) entwässert wird, angeordnet ist.
Spezifisches Bindungsverfahren für den Nachweis von zwei oder mehr zielspezifisch bindenden Liganden, umfassend die Schritte: A) Zusammenbringen in beliebiger Reihenfolge: 1) eine Flüssigprobe, von der vermutet wird, daß sie zwei oder mehr zielspezifisch bindende Ligaeden enthält, 2) ein immobilisierter erster Rezeptor, für jeden der zielspezifisch bindenden Ligaeden und 3) zwei oder mehr wasserlösliche Konjugate, wobei ein Konjugat mit beliebigen zielspezifisch bindenden Ligaeden und demselben Reporterenzym gebildet wird, um zwei oder mehr unterschiedliche wasserunlösliche Komplexe zwischen dem immobilisierten ersten Rezeptor und entweder dem korrespondierenden zielspezifisch bindenden Ligaeden oder dem wasserlöslichen Konjugaten zu bilden, B) Abtrennen der wasserunlöslichen Komplexe, die in Schritt A) gebildet werden von einem Überstand, der beliebige nicht-komplexierte wasserlösliche Konjugate enthält, C) Zusammenbringen einer Probe des Überstands, enthaltend beliebige nichtkomplexierte wasserlösliche Konjugate und einen immobilisierten zweiten Rezeptor für jeden der zielspezifsch bindenden Ligaeden, wobei die zweiten im mobilisierten Rezeptoren an unterschiedlichen Regionen des wasserunlöslichen Trägers angeordnet sind, um wasserunlösliche Reaktionsprodukte der immobilisierten zweiten Rezeptoren und beliebiger nicht-komplexierter wasserlöslicher Konjugate an den jeweiligen unterschiedlichen Regionen des wasserunlöslichen Trägers zu bilden, D) Abtrennen der wasserunlöslichen Reaktionsprodukte, die in Schritt C) gebildet wurden von beliebigen nicht-reagierten wasserlöslichen Konjugaten und E) Nachweisen jedes Signals, daß von den wasserunlöslichen Reaktionsprodukten an den unterschiedlichen Regionen des wasserunlöslichen Trägers erzeugt wird, als Bestimmung der zwei oder mehr zielspezifisch bindenden Liganden in der Flüssigprobe.