DE69503849T2

DE69503849T2 - Zusammensetzungen und Verfahren zur Anregung des Wachstums und der Differenzierung von Megakaryozyten

Info

Publication number: DE69503849T2
Application number: DE69503849T
Authority: DE
Inventors: Timothy D. Thousand Oaks Ca 91362 Bartley; Jakob M. Camarillo Ca 93010 Bogenberger; Robert A. Thousand Oaks Ca 91362 Bosselman; Pamela Thousand Oaks Ca 91362 Hunt; Olaf B. Newbury Park Ca 91320 Kinstler; Babru B. Moorpark Ca 93021 Samal
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1994-03-31
Filing date: 1995-03-30
Publication date: 1999-04-01
Anticipated expiration: 2015-03-31
Also published as: TW496870B; ES2119250T3; PL182567B1; FI960136A; EP0755263A4; CN1229385C; LV12275B; DK0690127T3; NO960111L; HK1041275A1; FI960136A0; MX9600206A; IL113206A0; HK1041275B; NO960111D0; MY113048A; CZ350595A3; LV11783B; EP0690127B1; EP0690127A1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Proteine, die hierin synonym als Mpl-Liganden oder MGDFs bezeichnet werden, die das Wachstum von Megakaryocyten stimulieren und die Differenzierung oder Reifung von Megakaryocyten vermehrt/vergrößert wird, mit dem letztendlichen Effekt, die Anzahl von Plättchen zu erhöhen. Es werden auch Verfahren zum Erhalten der Proteine in homogener Form aus natürlichen Quellen und zum Produzieren derselben durch rekombinante gentechnologische Techniken vorgesehen.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung im breiten Umfang eine neue Klasse von MGDF-Derivaten, worin ein MGDF-Molekül an ein wasserlösliches Polymer angebunden wird, und Verfahren zum Herstellen derartiger Moleküle. In einem noch weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung MGDF-Derivate, worin ein MGDF-Molekül an ein oder mehrere Polyethylenglycol ("PEG")-Gruppen gebunden ist und Verfahren zu ihrer Herstellung.

Hintergrund der Erfindung

Es sind wenigstens zwei große Forschungsbereiche an dieser Erfindung beteiligt. Der erste betrifft die Entwicklung von Megakaryocyten und nochfolgende Produktion von Plättchen und der zweite betrifft ein Polypeptidmitglied einer Wachstumsfaktorrezeptorfamilie, hierin als Mpl-Rezeptor bezeichnet, und Liganden davon. Ein jedes dieser Forschungsgebiete wird im folgenden kurz dargestellt.

A. Plättchenproduktion von Megakaryocyten

Blutplättchen sind zirkulierende Zellen, die wesentlich für das Verhinderung von Blutungen und für die Blutkoagulation sind. Megakaryocyten sind die zelluläre Quelle für Blättchen und entstehen aus einer gemeinsamen Knochenmarksvorläuferzelle, die der Ursprung aller hämatopoietischen Zellinien ist. Diese gemeinsame Vorläuferzelle ist bekannt als die pluripotente Stammzelle oder PPSC.
Eine Hierarchie von Megakaryocytenvorläuferzellen ist definiert worden auf der Grundlage des Zeitpunkts, zu dem sie auftreten und der Größe der Megakaryozyten (MK)-Kolonien, die in in vitro Kultursystem in Antwort auf geeignete Wachstumsfaktoren auftreten. Der Burstbildende Einheitsmegakaryocyt (BFU-MK) ist die primitivste Megakaryocytenvorläuferzelle. Man nimmt an, daß BFU-MK letztendlich viele koloniebildende Einheitsmegakaryocyten (CFU-MK) bilden, die differenziertere MK-Vorläuferzellen darstellen.
Während die MK-Zellen eine nachfolgende Differenzierung durchlaufen, verlieren sie ihre Fähigkeit, Mitose zu durchlaufen, erwerben jedoch eine Fähigkeit, zu endoreduplizieren. Endoreduplizierung (oder Endomitose) ist das Phänomen bei Zellen der Kernteilung in Abwesenheit von Zellteilung. Endoreduplikation führt letztendlich zu einem MK, der polyploid ist. Weitere MK-Reifung führt zum Erwerb von zytoplasmatischen Organellen und Membranbestandteilen, die für Plättchen kennzeichnend sind.
Plättchen werden von reifen MKs durch einen nur wenig definierten Prozeß gebildet, den man als eine Konsequenz von physikalischer MK-Fragmentierung oder andern Mechanismen vorgeschlagen hat. Beobachtungen extensiver Membranstrukturen innerhalb von Megakaryocyten haben zu einem Modell der Plättchenbildung geführt, bei dem ein Demarkationsmembransystem naszierende Plättchen innerhalb des Zellkörpers umreißt. Ein weiteres Modell der Plättchenbildung wurde entwickelt aus Beobachtungen, daß Megakaryocyten lange cytoplasmatische Fortsätze bilden wird, die sich bei Intervallen von Plättchengrößen zusammenschnüren, von denen Plättchen mutmaßlich infolge Blutflußdrücken im Mark und/oder in der Lunge abschnüren. Diese cytoplasmatische Fortsätze wurden von Becker und DeBruyn bezeichnet also Pro-Plättchen, um die mutmaßliche Vorläuferrolle bei der Plättchenbildung widerzuspiegeln. Siehe Becker und DeBuryn, Amer. J. Anat. 145 : 183 (1976).
Fig. 1 stellt einen Überblick der verschiedenen Vorläuferzellen dar, die bei der Megakaryocyten- und Plättchenentwicklung beteiligt sind. Die Zellen ganz links außen bei der Figur stellen ein PPSC dar, und die zusätzlichen Zellen rechts des PPSC in dem Diagramm stellen BFU-MK, gefolgt von CFU-MK. Die Zelle, die Endoreduplikation durchläuft, die unmittelbar rechts der PPSC in dem Diagramm angeordnet ist, ist eine reife Megakaryocytenzelle. Als ein Ergebnis von Endomitose ist diese Zelle polyploid geworden. Die nächste Struktur rechts schließt lange cytoplasmatische Fortsätze ein, die vom polyploiden Nukleus der reifen Mega karyocytenzelle ausgehen. Ganz rechts bei der Darstellung sind eine Anzahl von Plättchen gezeigt, die durch Fragmentierung der cytoplasmatischen Fortsätze hergestellt worden sind.
Das folgende ist eine Zusammenfassung von einigen früheren Publikationen, die die obige Beschreibung der Megakaryocyten-Reifung und der Produktion von Plättchen betreffen:
1. Williams, N. und Levine, R. F., British Journal of Haematology 52 : 173-180 (1982).
2. Levin, J., Molecular Biology and Differentiation of Megakaryocytes, Hrsg. Wiley-Liss, Inc.: 1-10 (1990).
3. Gewirtz, A. M., The Biology of Hematopoiesis, Hrsg. Wiley-Liss, Inc.: 123-132 (1990).
4. Han, Z. C., et al., Int. J. Hematol. 54 : 3-14 (1991).
5. Nieuwenhuis, H. K. und Sixma, J., New Eng. J. of Med. 327 : 1812-1813 (1992).
6. Long, M. Stern Cells 11 : 33-40 (1993).

B. Regulierung der Plättchenbildung

Eine große Vielzahl an Daten, die in vielen Laboratorien erzeugt wurden, zeigt an, daß die Plättchenproduktion durch humorale Faktoren geregelt wird. Die Komplexität dieses biologischen Prozesses wurde ursprünglich nicht erkannt und gegenwärtig scheint es, daß eine Anzahl menschlicher Wachstumsfaktoren diese Fähigkeit besitzt.
Megakaryocytenregulierung erfolgt auf vielen zellulären Ebenen. Eine Anzahl von Cytokinen verstärkt Plättchenbildung, indem der Vorläuferzellpool expandiert wird. Eine zweite Gruppe humoraler Wachstumsfaktoren, dient als Reifungsfaktoren, die auf differenziertere Zellen wirken, um Endoreduplikation zu Fördern. Zusätzlich scheinen zwei unabhängige Biorückkopplungsschleifen zu existieren, die diese Prozesse regeln.
Mehrere Linien- und spezifische hämatopoietische Wachstumsfaktoren üben wichtige Wirkungen auf die MK-Reifung aus. Granulocyten-Makrophagenkolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF), Interleukin-3 (1L-3), 1L-6, 1L-11, Leukämie-inhibitorischer Faktor (LIF) und Erythropoietin (EPO) fördern jeweils einzeln die menschliche MK-Reifung in vitro, wie durch ihre Wirkung auf MK-Größe, -Anzahl oder -Ploidie bestimmt. Die MK- Reifungswirkungen von LIF, 1L-6 und 1L-11 sind entweder teilweise (LIF und 1L-6) oder vollständig (1L-11) additiv zu jenen von 1L-3. Derartige Daten von diesen früheren Publikationen schlagen vor, daß Kombinationen von Cytokinen notwendig sein können, um MK- Reifung in vivo zu fördern.
Das folgende ist eine Zusammenfassung von einigen früheren Publikationen, die die Regulierung der Megakaryocyten- und Plättchenproduktion betreffen:
7. Hoffman, R. et al., Blood Cells 13: 75-86 (1987).
8. Murphy, M. J., Hematology/Oncology Clinics of North America 3 (3): 465-478 (1998).
9. Hoffman, R. Blood 74 (4): 1196-1212 (1989).
10. Mazur, E. M. und Cohen, J. L., Clin. Pharmacol. Ther., 46 (3): 250-256 (1989).
11. Gewirtz, A. M. und Calabretta, B., Int. J. Cell Cloning 8: 267-276 (1990).
12. Williams, N., Progress in Growth Factor Research 2: 81-95 (1990).
13. Gordon, M. S. und Hoffman, R., Blood 80 (2): 302-307 (1992).
14. Hunt, P. et al., Exp. Hematol. 21: 372-281 (1993).
15. Hunt, P. et al., Exp. Hematol. 21: 1295-1304 (1993).
Es ist auch berichtet worden (siehe Literaturstelle 16), daß aplastisches menschliches Serum eine Megakaryocytenkolonie-stimulierende Aktivität aufweist, die verschieden ist von 1L-3, Granulocytenkolonie-stimulierenden Faktor und Faktoren, die in Lymphocytenkonditioniertem Medium vorhanden sind. Das für diese Aktivität verantwortliche Molekül wurde im Stand der Technik jedoch weder isoliert noch charakterisiert.
16. Mazur, E. M., et al., Blood 76 : 290-297 (1990).

C. Der Mpl-Rezeptor

Das myeloproliferative Leukämie-Virus (MPLV) ist ein muriner Replikations-defizienter Retrovirus, der akute Leukämie bei infizierten Säugetieren verursacht. Es ist entdeckt worden, daß ein von MPLV exprimiertes Gen aus einem Teil des Gens besteht, das die retrovirale Hülle (oder externen Proteinmantel) des Virus codiert, das an eine Sequenz fusioniert ist, die verwandt ist mit der cytokinen Rezeptorfamilie, einschließlich der Rezeptoren für GM-CSF, G-CSF und EPO.
Die Expression des MPLV-Gens, das oben beschrieben wurde, weist die interessante biologische Eigenschaft auf, daß es murine Vorläuferzellen verschiedener Typen veranlaßt, unmittelbar Wachstumsfaktorunabhängigkeit für sowohl Proliferation als auch letztendliche Reifung zu erwerben. Darüberhinaus enthielten einige Kulturen von Knochenmarkszellen, die akut durch MPLV transfiziert waren, Megakaryocyten, was eine Verbindung zwischen MPLV-Gen und Megakaryocytenwachstum und Differnzierung nahelegt.
Es ist nun erkannt worden, daß das virale MPLV-Gen (bezeichnet als v-Mpl) ein Homologes in Säugerzellen aufweist, das als ein zelluläres Mpl-Gen (oder c-Mpl) bezeichnet wird. Unter Verwendung von von v-Mpl abgeleiteten Sonden wurde eine zu dem menschlichen c-Mpl- Gen korrespondierende cDNA kloniert. Siehe veröffentlichte internationale Patentanmeldung WO 92/07074 (veröffentlicht am 30. April 1992; unten diskutiert). Die Sequenzanalyse hat gezeigt, daß das durch das c-Mpl-Genprodukt kodierte Protein zu der hochkonservierten Cytokinrezeptorsuperfamilie gehört, gerade wie das homologe v-Mpl-Genprodukt.
Man glaubt, daß dieses zelluläre Gen, c-Mpl, eine funktionelle Rolle bei der Hämatopoese spielt auf der Grundlage der Beobachtung, daß man seine Expression in Knochenmark, Milz und fötaler Leber von normalen Mäusen durch RNAse-Sondenschutz und RT-PCR- Experimente, nicht aber in anderen Geweben fand. Insbesondere wird c-Mpl auf Megakaryocyten exprimiert. Es ist auch gezeigt worden, daß das zelluläre menschliche Gen, menschliches c-Mpl, in CD34-positiven Zellen exprimiert wird, einschließlich gereinigter Megakaryocyten und Plättchen. CD34 ist ein Antigen, das für frühe hämatopoietische Vorläuferzellen indizierend ist. Weiterhin inhibiert die Exponierung von CD34-positiven Zellen gegenüber synthetischen Oligodeoxynukleotiden, die antisense zu der c-Mpl-mRNA oder Botschaft sind, wesentlich die Koloniebildungsfähigkeit von CFU-MK-Megakaryocytenvorläufern, hat aber keine Wirkung auf Erythrocyten- oder Granulomakrophagenvorläufer.
Die obigen Daten und Beobachtungen legen nahe, daß ein c-Mpl ein Zelloberflächenmolekül codiert, das hierin als Mpl-Rezeptor bezeichnet wird, das an einen Liganden bindet, der den Rezeptor aktiviert, was möglicherweise zur Produktion und/oder Entwicklung von Megakaryocyten führt.
PCT-Patentanmeldung WO 92/07074 betrifft die Sequenz des durch das c-Mpl-Gen produzierten Proteins, sowohl aus menschlichen als auch murinen Quellen. Dieses Genprodukt, von dem man annimmt, daß es ein Rezeptor ist, wie oben erklärt, wird gebildet aus wenigstens drei allgemeinen Regionen oder Domänen: eine extrazelluläre Domäne, eine Transmembran- Domäne und eine intrazelluläre (oder cytoplasmatische) Domäne. Aneinandergefügt bilden diese Domäne den intakten Mpl-Rezeptor. Diese PCT-Veröffentlichung bezieht sich auch auf eine lösliche Form des Rezeptors, der im wesentlichen der extrazellulären Domäne des reifen c-Mpl-Proteins entspricht. Die intrazelluläre Domäne enthält eine hydrophobe Region, die, wenn mittels der Transmembranregion an die extrazelluläre Domäne des Proteins angebunden, das Gesamtprotein zum Gegenstand von Aggregation und Unlöslichkeit macht. Andererseits, wenn die extrazelluläre Domäne des c-Mpl-Genproduktes von der Transmembran- Domäne und der intrazellulären Domäne getrennt ist, wird sie löslich, weshalb die extrazelluläre Form des Proteins als eine "lösliche" Form des Rezeptors bezeichnet wird.
Das folgende ist eine Zusammenfassung einiger früherer Publikationen betreffend die obige Beschreibung der v-Mpl- und c-Mpl-Rezeptoren und Gene:
17. Wendling, F., et al., Leukemia 3 (7): 475-480 (1989)
18. Wendling, F. et al., Blood 73 (5): 1161-1167 (1989).
19. Souyri, M., et al., Cell 63: 1137-1147 (1990).
20. Vigon, L, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5640-5644 (1992).
21. Skoda, R. C., et al., The EMBO Journal 12 (7): 2645-2653 (1993).
22. Ogawa, M., Blood 81 (11): 2844-2853 (1993).
23. Methia, N., et al., Blood 82 (5): 1395-1401 (1993).
24. Wendling, F., et al., Blood 80: 246a (1993).

D. Das Erfordernis für ein Mittel, das in der Lage ist Plättchenbildung zu stimulieren.

Es ist kürzlich berichtet worden, daß Plättchentransfusionen mit einer immer größeren Häufigkeit in medizinischen Zentren in Nordamerika, Westeuropa und Japan verabreicht werden. Siehe Gordon, M. S. und Hoffman, R., Blood 80 (2): 302-307 (1992). Dieser Anstieg scheint in großem Maße auf Fortschritten in der medizinischen Technologie und größerem Zugang zu solchen Technologien sowie Herzchirurgie und Knochenmarks-, Herz- und Lebertransplantation zu beruhen. Dosisverstärkung als ein Mittel, Krebspatienten Therapien zu verabreichen und die HIV-1-Epedemie haben auch zu der nachdrücklichen Forderung nach Plättchennachschub beigetragen.
Die Verwendung von Plättchen trägt in sich die Möglichkeit der Übertragung von vielen dem Blut entstammenden Infektionskrankheiten ebenso wie Alloimmunisierung. Darüberhinaus ist die Herstellung gereinigter Plättchen ein teures Unterfangen und somit erhöht die zunehmende Verwendung derartiger Plättchen die gesamten Medizinkosten. Als ein Ergebnis besteht ein akuter Bedarf für neue und verbesserte Verfahren zur Herstellung von Plättchen zur Anwendung beim Menschen.
Beispielhafte frühere Ansätze, um Plättchenproduktion zu erhöhen, sind im folgenden beschrieben:
US-Patent 5,032,396 berichtet, daß Interleukin-7 (1L-7) in der Lage ist, Plättchenproduktion zu stimulieren. Interleukin-7 ist auch bekannt als Lymphopoietin-1 und ist ein lymphopvietischer Wachstumsfaktor, der in der Lage ist, B- und T-Zellvorläufer im Knochenmark zu stimulieren. Die veröffentlichte PCT-Anmeldung mit der Seriennummer 88/03747, eingereicht am 19. Oktober 1988 und die Europäische Patentanmeldung, Nr. 88309977.2, eingereicht am 24. Oktober 1988 offenbaren DNAs, Vektoren und verwandte Prozesse zum Herstellen von Säuger-IL-7-Proteinen durch rekombinante DNA-Technologie. Die in dem US-Patent dargestellten Daten zeigen, daß 1L-7 zirkulierende Plättchen in normalen und sublethal bestrahlten Mäusen erhöhen kann.
US-Patent 5,087,448 offenbart, daß Megakaryocyten und Plättchen stimuliert werden, in Säugetieren zu proliferieren, indem sie mit Interleukin-6 behandelt werden. Rekombinantes menschliches Interleukin-6 ist ein Glycoprotein mit einem Molekulargewicht von 26000 mit multiplen biologischen Aktivitäten. Die in diesem Patent dargestellten Daten zeigen, daß IL-6 in vitro eine Wirkung dahingehend aufweist, daß es Kolonien von Megakaryocyten vergrößert.
Keines der oben angesprochenen Patente erwähnt irgend etwas hinsichtlich der Mpl- Liganden, die an der vorliegenden Erfindung beteiligt sind.
Trotz der obigen Offenbarungen bleibt nach wie vor ein großer Bedarf für neue Stimulatoren für Megakaryocyten und/oder Plättchen in Säugetieren bestehen.

E. Hintergrund betreffend chemisch modifiziertem MGDF

Proteine für die therapeutische Verwendung sind gegenwärtig in geeigneten Formen in angemessenen Mengen erhältlich, weitestgehend als ein Ergebnis der Fortschritte bei rekombinanten DNA-Technologien. Chemische Derivate deraritiger Proteine können wirksam ein proteolytisches Enzym vom physikalischen Kontakt mit dem Proteinrückgrat selbst abhalten und somit Abbau verhindern. Zusätzlich Vorteile können, unter bestimmten Bedingungen, einschließen Erhöhen der Stabilität und Zirkulationszeit des therapeutischen Proteins und verringern der Immunogenität. Es sollte jedoch festgehalten werden, daß die Wirkung der Modifikation eines bestimmten Proteins nicht vorhergesagt werden kann. Ein Übersichtsartikel, der Proteinmodifikation und Fusionsproteine beschreibt ist Francis, Focus on Growth Factors 3: 4-10 (Mai 1992) (publiziert von Mediscript, Mountview Court, Friern Barnet Lane, London N20, OLD, UK).
Polyethylenglycol ("PEG" oder "Peg") ist eine solche chemische Komponente, die bei der Herstellung therapeutischer Proteinprodukte verwendet worden ist. Zum Beispiel ist Adagen®, eine Formulierung von mit PEG versehener Adenosindeaminase, zugelassen für die Behandlung schwerer kombinierter Immundefizienzerkrankung; mit PEG versehene Superoxiddismutase war in klinischen Versuchen für die Behandlung von Kopfverletzungen; mit PEG versehenes alpha-Interferon ist in Phase I von klinischen Versuchen zur Behandlung von Hepatitis getestet worden. Man berichtet, daß mit PEG versehene Glucocerebrosidase und mit PEG versehenes Hämoglobin in präklinischen Tests waren. Für einige Proteine wurde gezeigt, daß die Anbindung von Polyethylenglycol vor Proteolyse schützt; Sada et al., J. Fermentation Bioengineering 71 : 137-139 (1991) und Verfahren zum Anbinden bestimmter Polyethylenglycolkomponenten sind verfügbar. Siehe US-Patent 4,179,337, Davis et al., "Non- Immunogenic Polypeptides," erteilt am 18. Dezember 1979; und US-Patent Nr. 4,002,531, Royer, "Modifying enzymes with Polyethylene Glycol and Product Produced Thereby," erteilt am 11. Januar 1977. Für eine Übersicht siehe Abuchowski et al., in Enzymes as Drugs. (J. S. Holcerberg und J. Roberts, Hrsg. S. 367-383 (1981)).
Weitere wässerlösliche Polymere sind verwendet worden, um Proteine zu modifizieren, so Copolymere von Ethylenglycol/Propylenglycol, Carboxymethylcellulose, Dextran, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Poly-1,3-dioxolan, Poly-1,3,6-trioxan, Ethyl/Maleinsäureanhydrid-Copolymer und Polyaminosäuren (entweder Homopolymere oder auch zufällige Copolymere).
Für Polyethylenglycol wurde eine Vielzahl von Mitteln verwendet, um die Polyethylenglycolmoleküle an das Protein anzubinden. Im allgemeinen werden die Polyethylenglycolmolekille an das Protein vermittels einer reaktiven Gruppe gebunden, die sich auf dem Protein befindet. Aminogruppen, wie jene auf Lysinresten oder am N-Terminus, sind für derartiges Anbinden günstig. Zum Beispiel stellt Royer (US-Patent Nr. 4,002,531, oben) fest, daß reduktive Alkylierung für Anbinden von Polyethylenglycolmoleküle an ein Enzym verwendet wurde. EP 0 539 167, veröffentlicht am 28. April 1993, Wright, "Peg Imidites and Protein Derivatives Thereof" stellt fest, daß Peptide und organische Verbindungen mit freier/freien Aminogruppe(n) mit einem Imidat-Derivat von PEG oder verwandten wasserlöslichen organischen Polymeren modifiziert werden. US-Patent Nr. 4,904,584, Shaw, erteilt am 27. Februar 1990, betrifft die Modifikation der Anzahl von Lysin-Resten in Proteinen für die Anbindung von Polyethylenglycolmolekülen vermittels reaktiver Amingruppen.
Ein spezifisches therapeutisches Protein, das chemisch modifiziert worden ist, ist Granulozyten-Kolonie-stimulierender Faktor, "G-CSF". Siehe europäische Patentveröffentlichung EP 0 401 384, EP 0 473 268 und EP 0 335 423.
Ein weiteres Beispiel ist mit Polyethylenglycol versehenes IL-6, EP 0 442 724, mit dem Titel "Modified hIL-6," (siehe gleichzeitig anhängige U. S. S. N. 07/632,070), welches Polyethylenglycolmoleküle offenbart, die zu IL-6 hinzugegeben sind. EP 0 154 316, veröffentlicht am 11. September 1985, berichtet Umsetzen eines Lyphokins mit einem Polyethylenglycolaldehyd.
Die Fähigkeit, MGDF zu modifizieren, ist im Stand der Technik unbekannt, da die Empfindlichkeit eines jeden einzelnen Proteins gegenüber Modifikation durch die spezifischen Strukturparameter desjenigen Proteins bestimmt wird. Darüberhinaus ist die Wirkung einer derartigen Modifikation auf die biologische Eigenschaften eines jeden Proteins aus der Technik nicht vorhersagbar. Infolge der vielen klinischen Anwendungen von MGDF, wie hierin angeführt, ist ein derivatisiertes MGDF-Protein mit geänderten Eigenschaften wünschenswert. Derartige Moleküle können eine erhöhte Halbwertszeit und/oder Aktivität in vivo aufweisen ebenso wie andere Eigenschaften.
Das Versehen von Proteinmolekülen mit PEG wird allgemein zu einer Mischung aus chemischen modifizierten Proteinmolekülen führen. Zur Veranschaulichung: Proteinmoleküle mit fünf Lysinresten und einer freien Aminogruppe am N-Terminus, umgesetzt in dem obigen Verfahren, werden zu einer heterogenen Mischung führen, wobei einige sechs Polyethylenglycolkomponenten, einige fünf, einige vier, einige drei, einige zwei, einige eine und einige null aufweisen. Und, unter den Molekülen mit mehreren Polyethylenglycolanteilen können die Polyethylenglycolanteile nicht an der selben Stelle auf verschiedenen Molekülen angebunden sein. Es wird häufig erwünschenswert sein, ein homogenes Produkt zu erhalten, das im wesentlichen vollständig eine oder eine geringe Anzahl (z. B. 2-3) von modifizierte(n) Proteinspezies enhält, die hinsichtlich der Anzahl oder Stellen der chemischen Anteile, wie PEG, variieren. Nichtsdestoweniger können Mischungen aus, z. B., mit einem, zwei und/oder PEG versehenen Spezies wünschenswert oder tolerierbar für eine gegebene therapeutische Indikation sein.
Eine Variabilität der Mischung von Charge zu Charge wäre nachteilig beim Entwickeln eines therapeutischen mit PEG versehenen Proteinprodukts. Bei einer derartigen Entwicklung ist die Vorhersagbarkeit der biologischen Aktivität wichtig. Zum Beispiel ist gezeigt worden, daß im Falle nicht-selektiver Konjugation von Superoxiddismutase mit Polyethylenglycol mehrere Fraktionen des modifizierten Enzyms vollständig inaktiv waren (P. McGoff et al. Chem. Pharm. Bull. 36 : 3079-3091 (1988)). Siehe auch Rose et al., Bioconjugate Chemistry 2 : 154-159 (1991), die die selektive Anbindung der Linkergruppe Carbohydrazid an die C- terminale Carboxylgruppe eines Proteinsubstrates (Insulin) berichten. Man kann keine derartige Vorhersagbarkeit haben, wenn sich das therapeutische Protein in der Zusammensetzung von Charge zu Charge unterscheidet. Einige der Polyethylenglycolanteile können an einigen Stellen nicht so stabil gebunden sein wie an anderen und dies kann dazu führen, daß diese Anteile vom Protein dissoziiert werden. Wenn solche Anteile zufällig angebunden sind und deshalb zufällig dissoziiert werden, dann können natürlich die Pharmakokinetiken des therapeutischen Proteins nicht präzise vorhersagbar sein.
Es ist auch ein derivatisiertes MGDF-Produkt wünschenswert, worin es keinen Verbindungsanteil zwischen dem Polymeranteil und dem MGDF-Anteil gibt. Ein Problem mit den obigen Verfahren besteht darin, daß sie typischerweise einen Verbindungsanteil zwischen dem Protein und dem Polyethylenglycolmolekül benötigen. Diese Verbindungsanteile können antigenisch sein, was beim Entwickeln eines therapeutischen Proteins auch von Nachteil ist.
Ein Verfahren, das keine Verbindungsgruppe umfaßt, wird beschrieben in Francis et al., in: "Stability of protein pharmaceuticals: in vivo pathways of degradation and strategies for protein stabilization"(Hrsg. Ahern., T. und Manning, M. C.) Plenum, New York, 1991). Auch Delgado et al. "Coupling of PEG to Protein By Activation with Tresyl Chloride, Applications In Immunoafflnity Cell Preparation", in: Fisher et al., Hrsg., Separations Using Aqueous Phase Systems, Applications In Cell Biology and Biotechnology, Plenum Press, N. Y., N. Y. 1989, S. 211-213, schließt die Verwendung von Tresylchlorid ein, was dazu führt, daß es keine Verbindungsgruppe zwischen dem Polyethylenglycolanteil und dem Proteinanteil gibt. Dieses Verfahren kann schwierig anzuwenden sein, um therapeutische Produkte herzustellen, da die Verwendung von Tresylchlorid toxische Nebenprodukte liefern kann.
Chamow et al., Bioconjugate Chem. 5 : 133-140 (1994) berichten über die Modifikation von CD4-Immunadhäsin mit mono-Methoxypolyethylenglycol ("MePEG-Glycol")-Aldehyd mit tels reduktiver Alkylierung. Die Autoren berichten, daß 50% des CD4-Ig durch selektive Reaktion an der α-Aminogruppe des N-Terminus mePEG-modifiziert war. Eben dort auf Seite 137. Die Autorenberichten auch, daß die in vitro-Bindungsfähigkeit des modifizierten CD4- Ig (an das Protein gp 120) sich mit einer Rate verringerte, die mit dem Umfang der MePEGylierung (des Versehens mit MePEG) korrelierte. A.a.O.
Somit besteht ein Bedarf an MGDF-Derivaten und, genauer gesagt ein Bedarf für mit PEG- versehenem MGDF. Es besteht auch ein Bedarf für Verfahren, derartige Derivatisierungen auszuführen.

Zusammenfassung der Erfindung

In einem Aspekt sieht die vorliegende Erfindung neue Polypeptide vor, die spezifisches Megakaryocyten-Wachstum und/oder -Entwicklung fördern ("Mpl-Liganden" oder "MGDFs"), die im wesentlichen frei (d. h. isoliert) von anderen Proteinen sind (d. h., Säugerproteinen in dem Fall, daß ein Mpl-Ligand aus einer Säugetierquelle erhalten wurde). Derartige Proteine können aus Zellquellen gereinigt werden, die die Faktoren gewöhnlicherweise oder nach Induktion mit anderen Faktoren produzieren. Sie können auch durch rekombinante gentechnologische Techniken hergestellt werden. Mpl-Liganden können weiter synthetisiert werden durch chemische Techniken, oder eine Kombination der oben angeführten Techniken.
Die Mpl-Liganden dieser Erfindung sind erhältlich in ihrer nativen Form aus Säugetierquellen. Zwei beispielhafte Mpl-Liganden, die aus aplastischem Hundeplasma (caninem Plasma) isoliert wurden, sind hierin in dem Abschnitt mit den Beispielen beschrieben. Es ist jedoch in anderen Beispielen hierin beschrieben worden, daß nah verwandte Mpl-Liganden in aplastischem Plasma von sowohl Menschen- als auch Schweinequellen vorhanden sind. Bemerkenswerterweise ist die Aktivität von einem jeden Mpl-Liganden vom Menschen, Schwein und Hund spezifisch inhibierbar durch die lösliche Form des murinen Mpl-Rezeptors, was zeigt, daß all diese Mpl-Liganden (ebenso wie jene aus anderen Säugerquellen einschließlich muriner Liganden) nahe verwandt sind sowohl auf struktureller Ebene als auch auf Aktivitätsebene.
Man erwartet, daß Mpl-Liganden vom Menschen, Schwein und anderen Säugetieren aus natürlichen Quellen isoliert werden können mittels Verfahren, wie im wesentlichen hierin be schrieben. Siehe Beispiel 10. Entsprechend betrifft diese Erfindung allgemein Mpl-Liganden, wie beispielsweise von Hunden, Schweinen, Menschen, Mäusen, Pferden, Schafen und Kaninchen. Besonders bevorzugte Mpl-Liganden sind jene von Hunden, Schweinen und Menschen.
Zusätzlich sind Gene, die menschliche Mpl-Liganden codieren, von einer menschlichen fötalen Nieren- und Leberbibliothek kloniert und sequenziert worden, wie im Abschnitt mit den Beispielen unten beschrieben. Man hat bei zwei menschlichen Polypeptidsequenzen Aktivität in einem auf Zellen basierenden Test festgestellt (siehe Beispiel 4). Diese Sequenzen unterscheiden sich in ihrer Länge, weisen aber eine Identität über einen langen Bereich ihrer Aminosäuresequenzen auf. Die identischen Teile weisen Homologie zu Erythropoietin auf. Die Mpl-Liganden werden hierin auch als Megakaryocytenwachstums- und Entwicklungsfaktoren (MGDFs) bezeichnet; alle allgemeinen Bezugnahmen auf Mpl-Liganden sollen gelten für all jene, die hierin als MGDFs bezeichnet werden und umgekehrt. Unter "MGDF-Polypeptid" wird ein Polypeptid verstanden, das eine Aktivität aufweist, spezifisch das Wachstum und/oder die Entwicklung von Megakaryocyten zu stimulieren oder zu inhibieren. Beispiele für solche Polypeptide werden hierin offenbart.
Man hat gefunden, daß die Mpl-Liganden der vorliegenden Erfindung spezifisch in der Megakaryocyten-Familie aktiv sind, Reifung und/oder Proliferation von Megakaryocyten steigern, wie in den Tests der Beispiele 2 und 4 unten gezeigt. Unter "spezifisch" wird verstanden, daß die Polypeptide biologische Aktivität aufweisen in einem relativ größeren Umfang hinsichtlich Megakaryocyten verglichen mit vielen anderen Zelltypen. Man erwartet von jenen, die betreffend Megakaryocyten stimulierend sind, daß sie eine in vivo-Aktivität zur Stimulierung der Produktion von Plättchen aufweisen durch die Stimulierung der Reifung und Differenzierung von Megakaryocyten.
Zwei bevorzugte Mpl-Liganden aus einer Hundequelle weisen apparente Molekulargewichte von etwa 25 kd und 31 kd auf, wie bestimmt durch Natriumdodecylsulfatpolyacrylamid- Gelelektrophorese (SDS-PAGE) unter nicht reduzierenden Bedingungen. Beide Proteine werden während des gleichen Reinigungsprotokolls gereinigt, welches in dem Abschnitt mit den Beispielen unten detailliert beschrieben wird.
Zwei bevorzugte menschliche Liganden, MGDF-1 und MGDF-2 sind 332 bzw. 174 Aminosäuren lang, nicht einschließend ein mutmaßliches Signalpeptid aus 21 Aminosäuren. Diese Sequenzen und ein drittes verwandtes Molekül, MGDF-3 sind in FIGs 11 und 12 gezeigt.
Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sind Fortsätze zur Isolierung und Reinigung der Mpl-Liganden der vorliegenden Erfindung oder Fragmenten davon aus Säugerquellen, bevorzugterweise Ganzblut, Serum oder Plasma. Aplastisches Blut, Serum oder Plasma sind bevorzugte Ausgangsmaterialien. Aplastisches Blut, Serum oder Plasma kann erhalten werden durch ein Verfahren, welches Bestrahlen eines Säugetiers mit einer Strahlenquelle wie bspw. Cobalt-60 bei einem Strahlungsumfang von etwa 400-800 Rad umfaßt, um sie aplastisch zu machen. Ein solches Verfahren ist in der Technik bekannt, wie bspw. angeführt in den in Beispiel 1 unten angeführten Publikationen. Im Falle von Menschen kann bestrahltes Blut, Plasma oder Serum erhalten werden von einem Patienten nach Strahlentherapie, zum Beispiel um Krebs zu behandeln.
Danach wird das aplastische Blut, Serum oder Plasma einem Reinigungsprozeß unterworfen. Das Reinigungsverfahren, das durch die vorliegende Erfindung vorgesehen wird, umfaßt die folgenden Schlüsselprozeduren: Lektinaffinitätschromatographie und Mpl- Rezeptoraffinitätschromatographie. Eine jede dieser Verfahrensweisen führt zu einer etwa 300-500-fachen Reinigung der 25 und 31 kd Proteine aus aplastischem Hundeplasma. Andere Standardproteinreinigungsprozeduren können mit den obigen Verfahrensweisen eingeschlossen werden, um die Mpl-Liganden der vorliegenden Erfindung weiter zu reinigen, wie jene unten detailliert beschriebenen Verfahrensweisen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung schließt Polynukleotide ein, die für die Expression eines Säuger-Mpl-Liganden-Proteins codieren. Derartige DNA-Sequenzen können eine isolierte DNA-Sequenz einschließen, die für die Expression von Säuger-Mpl-Liganden- Proteine codiert, wie hierin beschrieben. Die DNA-Sequenzen können auch 5'- oder 3'- nicht codierende Säuger-Sequenzen einschließen, die die Mpl-Liganden codierende Sequenz flankieren. Die DNA-Sequenzen können weiter ein aminoterminales Signalpeptid codieren. Derartige Sequenzen können durch ein jegliches bekanntes Verfahren hergestellt werden, einschließlich vollständiger oder teilweise chemischer Synthese. Die Codons können zur Expression in der für die Expression ausgewählten Wirtszelle optimiert sein (z. B., E. coli oder CHO-Zellen).
In der vorliegenden Erfindung sind auch rekombinante DNA-Moleküle vorgesehen, wobei jedes Vektor-DNA und eine DNA-Sequenz umfaßt, die für einen Säuger-Mpl-Liganden codiert. Die DNA-Moleküle sehen die Mpl-Liganden-DNA in operativer Verbindung mit einer regulatorischen Sequenz vor, die in der Lage ist, die Replikation und Expression von Mpl- Liganden in einer ausgewählten Wirtszelle zu steuern. Wirtszellen (z. B. bakterielle Zellen, Säuger-, Insekten-, Hefe- oder Pflanzenzellen), die mit derartigen DNA-Molekülen transformiert sind, sind auch zur Verwendung bei der Expression eines rekombinanten Mpl- Ligandenproteins durch die vorliegende Erfindung vorgesehen.
Die DNA-Moleküle und transformierten Zellen der vorliegenden Erfindung werden auch in einem anderen Aspekt verwendet, nämlich in einem neuen Verfahren zum Herstellen rekombinanten Säuger-Mpl-Ligandenproteins oder Peptidfragmenten davon. Bei diesem Verfahren wird eine Zellinie, die mit einer DNA-Sequenz transformiert ist, die für die Expression von Mpl-Ligandenprotein oder einem Fragment davon (oder einem rekombinaten DNA-Molekül, wie oben beschrieben) in operativer Verbindung mit einer geeigneten regulatorischen oder Expressionskontrollsequenz kodiert, die in der Lage ist, Expression des Proteins zu kontrollieren, unter geeigneten Bedingungen kultiviert, was Expression der rekombinanten DNA erlaubt. Dieses beanspruchte Verfahren kann in einer Anzahl von bekannten Zellen als Wirtszellen zur Expression des Proteins verwandt werden. Gegenwärtig bevorzugte Zellinien zum Herstellen von Mpl-Liganden sind Säugerzellinien (z. B. CHO-Zellen) und bakterielle Zellen (z. B. E. coli).
Für die Produktion von Mpl-Liganden in E. coli ist es bevorzugt, Met- und Lys-Reste am N- Terminus des Proteins, das exprimiert werden soll, zu verwenden, da die Ausbeute an Expressionsprodukt typischerweise höher ist. Ein besonders bevorzugtes Expressionsprodukt ist menschlicher Met-Lys-MGDF mit insgesamt 165 Aminsäuren (d. h. Met&supmin;²Lys&supmin;¹[1-163] MGDF (zählend von der ersten Aminosäure des reifen Proteins). Nach Reinigen des in einer bakteriellen Zelle, wie E. coli, exprimierten Produktes können die terminalen Met-Lys-Reste durch Behandlung mit einem Enzym wie Dipeptidase (z. B. Cathepsin C) entfernt werden.
Das exprimierte Mpl-Liganden-Protein wird dann aus der Wirtszelle, dem Zellysat oder Kulturmedium geerntet durch geeignete herkömmliche Mittel. Das konditionierte Medium kann verarbeitet werden durch dieselben Reinigungsschritte oder Modifikationen davon, wie verwendet, um den Mpl-Liganden aus aplastischem Plasma zu isolieren (siehe Beispiel 7).
In einem noch weiterem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden rekombinante Mpl- Ligandenproteine vorgesehen. Diese Proteine sind im wesentlichen frei von anderen Säugermaterialien, insbesondere Proteinen. Die Mpl-Liganden-Proteine dieser Erfindung sind auch dadurch gekennzeichnet, daß sie eine oder mehrere der physikalischen, biochemischen, pharmakologischen oder biologischen Aktivitäten, wie hierin beschrieben, aufweisen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch chemisch modifizierten MGDF, der einen MGDF- Proteinanteil umfaßt, der an wenigstens ein wasserlösliches Polymer geknüpft ist, und Verfahren zur Herstellung und Verwendung derartiger Zusammensetzungen. Insbesondere schließt die vorliegende Erfindung chemisch modifizierten MGDF ein, wobei die MGDF- Spezies mit reaktiven Polyethylenglycolmolekülen umgesetzt wird, um PEG an MGDF anzubinden. Eine solche Anbindung kann erreicht werden durch Pegylierungsreaktionen, die hierin diskutiert werden, wie Acylierung oder Alkylierung. Acylierung oder Alkylierung mit PEG kann ausgeführt werden unter Bedingungen, wobei das Hauptprodukt mit einem PEG oder mehreren PEGs versehen wird. Das Versehen mit mehreren PEGs ("Polypegylieren") umfaßt im allgemeinen Anbinden von PEG an die s-Aminogruppen von Lysinresten und kann zusätzlich Versehen von PEG am N-Terminus des Polypeptids vorsehen. Versehen mit einem PEG ("Monopegylierung") umfaßt bevorzugterweise Anbinden von PEG an die α- Aminogruppe am N-Terminus des Proteins. Die Ausbeute und Homogenität derartiger Reaktionen, bei denen die Verbindung mit einem Peg versehen wird, kann verstärkt werden vermittels eines Typs reduktiver Alkylierung, die selektiv die α-Aminogruppe des N-terminalen Rests eines MGDF-Protein-Anteils modifiziert und dadurch selektive Anbindung eines wasserlöslichen Polymeranteils am N-Terminus des Proteins vorsieht. Dies liefert eine im wesentlichen homogene Herstellung von Polymer-MGDF-Proteinkonjugatmolekülen, ebenso (wenn Polyethylenglycol verwendet wird) ein Präparat von mit PEG versehenen MGDF- Protein-Molekülen, wobei der Polyethylenglycolanteil direkt an den Proteinanteil angekoppelt ist.
Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung sieht pharmazeutische Zusammensetzungen vor, die eine therapeutisch wirksame Menge von isoliertem natürlicherweise vorkommenden oder rekombinantem Mpl-Liganden, der mit einem wasserlöslichen Polymer, wie Polyethylengly col, derivatisiert werden kann, zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger, Verdünnungsmittel oder Bindemittel enthält. Diese pharmazeutischen Zusammensetzungen können bei Verfahren zur Behandlung von Erkrankungszuständen oder Erkrankungen verwendet werden, die durch einen Mangel an Megakaryocyten und/oder Plättchen ebenso wie bei einem in vivo Mangel des Mpl-Liganden gekennzeichnet sind. Sie können auch prophylaktisch verwendet werden, um erwartete Megakaryocyten- oder Plättchendefizienten (z. B. infolge Operationen) zu verbessern.
Somit können die Mpl-Liganden der vorliegenden Erfindung bei der Behandlung von aplastischen Anämien verwendet werden, z. B., um die Produktion von Plättchen in Patienten mit beeinträchtigter Plättchenproduktion (z. B. AIDS-Patienten oder Patienten, die sich einer Krebs-Chemotherapie unterziehen) zu erhöhen.
Mpl-Ligand kann verwendet werden, um Bluterkrankungen wie Thrombocytopenie zu behandeln. Mpl-Ligand kann verwendet werden als eine beigeordnete Therapie für Knochenmarkstransplantatpatienten. Derartige Patienten könnten Menschen oder andere Säuger sein. Man erwartet, daß ein Mpl-Ligand von einer anderen Spezies auch in einer anderen Spezies nützlich ist.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist, deshalb, ein Verfahren zum Behandeln dieser und anderer pathologischer Zustände, die aus einem Mangel an Plättchen resultieren, durch Verabreichung einer therapeutischen Menge einer pharmazeutischen Zusammensetzung, wie oben beschrieben, an einen Patienten. Diese therapeutische Verfahren können einschließen Verabreichen, gleichzeitig oder sequentiell zusammen mit Mpl-Liganden, einer wirksamen Menge von wenigstens einem weiteren Megakaryocyten-Kolonie-stimulierenden Faktor, einem Cytokin (z. B. EPO), einem löslichen Mpl-Rezeptor, Hämatopoietin, Interleukin, Wachstumsfaktor oder Antikörper einschließen.
Ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sieht Antikörper (z. B. polyklonal, monoklonal, humanisiert und rekombinant) und Antikörperfragmente vor, die gerichtet sind gegen einen (d. h. reaktiv mit einem) Säuger-Mpl-Liganden oder ein Ligandenfragment. Als Teil dieses Aspektes umfaßt die Erfindung deshalb Zellen, die in der Lage sind, derartige Antikörper (z. B. Hybridomas im Falle monoklonaler Antikörper) zu sekretieren und Verfahren zu deren Produktion und Verwendung bei diagnostischen und therapeutischen Prozeduren.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Test einer Körperflüssigkeit auf die Anwesenheit von Mpl-Liganden. Ein solcher Test könnte Antikörper verwenden, die spezifisch einen Mpl-Liganden erkennen, in einem Einzelantikörper- oder einem Sandwich- Format. Ein solcher Test könnte verwendet werden, um zu bestimmen, ob ein Patient der externen Verabreichung von Mpl-Liganden bedarf und/oder ob ein solcher Patient wahrscheinlich einen Plättchenmangel oder Störung erfahren wird. Solche Tests könnten in einem Kitformat enthalten sein, einschließlich positiver und negativer Kontrollen, Antikörper und anderer Kitstandardkomponenten.
Weitere Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden nach Betrachtung der vorliegenden detaillierten Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen davon offensichtlich werden.

Kurze Beschreibung der Figuren

Viele Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden offensichtlich werden nach Durchsicht der Figuren, wobei:
Fig. 1 einen Überblick über die Entwicklung und Reifung von Megakaryozyten und Plättchen darstellt.
Fig. 2 zeigt, daß löslicher muriner Mpl-Rezeptor im wesentlichen vollständig die Fähigkeit von Plasma von bestrahlten Hunden ("aplastische Kanine" oder "APK9") inhibiert, Megakaryozytenentwicklung zu induzieren. Der Test für Megakaryozytenentwicklung war der in Beispiel 2 beschriebene.
Fig. 3 zeigt, daß eine Aktivität, die aus APK9 durch Lektinaffinität und Mpl- Rezeptoraffinitätschromatographie-Verfahrensweisen ("Mpl-Ligand") angereichert ist, das Wachstum von 1A6.1 Zellen stimuliert und daß löslicher muriner Mpl- Rezeptor dieses Wachstum blockiert.
Fig. 4 zeigt einen Überblick über die Reinigungsschritte, die bei der Reinigung von 25 und 31 kd Formen von caninem Mpl-Rezeptor von aplastischem Caninenplasma umfaßt.
Fig. 5 zeigt die Reinigung von Mpl-Liganden durch Umkehrphasen-HPLC (RP-HPLC). Fraktion 21 enthält hochgereinigten 31 kd Mpl-Liganden; Fraktion 22 enthält eine Mischung der 31 kd und 25 kd Mpl-Liganden; und Fraktion 23 enthält hochgereinigten 25 kd Mpl-Liganden.
Fig. 6 zeigt einen Vergleich von Mpl-Liganden-Aktivitäten in Umkehrphasen-HPLC (C4- Säule)-Fraktionen, die die 25 und/oder 31 kd Mpl-Ligandenproteine enthalten.
Fig. 7 zeigt die Anzahl von Kulturen von CD34-ausgewählten peripheren Blutzellen, die mit APK9, Mpl-Liganden und verschiedenen anderen Faktoren stimuliert wurden.
Fig. 8 zeigt die Anzahl von Gesamtleukozyten, die von Kulturen von CD34-ausgewählten peripheren Blutzellen hergestellt wurden, die mit APK9, Mpl-Liganden und verschiedenen anderen Faktoren stimuliert wurden.
Fig. 9 zeigt den Prozentsatz an Megakaryozyten, die in Kulturen von CD34-ausgewählten periphären Blutzellen produziert werden, die mit APK9, Mpl-Liganden und verschiedenen anderen Faktoren stimuliert wurden.
Fig. 10 zeigt, daß menschlicher 1L-3 nicht bei Mpl-Liganden-induzierter Megakaryozytenentwicklung beteiligt ist.
Fig. 11 zeigt die cDNA und abgeleitete Aminosäuresequenzen von menschlichem MGDF- 1 und MGDF-2.
Fig. 12 zeigt die cDNA und abgeleitete Aminosäuresequenzen von menschlichem MGDF- 3.
Fig. 13 zeigt einen Vergleich zwischen MGDF-1 und MGDFs (Mpl-Liganden) von einer caninen Quelle (A) und einer murinen Quelle (B).
Fig. 14 zeigt ein Beispiel für MGDF-Acylierung unter Verwendung von N- Hydroxysuccinimidyl (NHS)-aktiven Estern von mono-Methoxy-Polyethylenglycol, um zu einem mit mehreren PEG versehenen Produkt zu führen.
Fig. 15 zeigt ein Beispiel für nicht spezifische reduktive MGDF-Alkylierung unter Verwendung von mono-Methoxy-Polyethylenglycolaldehyden, um zu einem mit mehreren PEG versehenen Produkt zu gelangen.
Fig. 16 zeigt ein Beispiel ortsspezifischer reduktiver MGDF-Alkylierung an der α- Aminogruppe des N-terminalen Restes unter Verwendung von mono- Methoxypolyethylenglycolaldehyden, um zu einem im wesentlichen mit einem PEG versehenen Produkt zu gelangen.
Fig. 17 zeigt Größenausschluß (SEC)-HPLC-Analyse von MePEG-MGDF-Konjugaten, die hergestellt wurden unter Verwendung von aktivierten Derivaten von MePEG mit einem Molekulargewicht von 20 kDa:
A. Poly-MePEG-MGDF-Konjugat, hergestellt durch MGDF-Acylierung mit NHS-Ester aus MePEG (PEG 11)
B. Poly-MePEG-MGDF-Konjugat, hergestellt durch MGDF-Alkylierung mit MePEG-Aldehyd (PEG 20);
C. Mono-MePEG-MGDF-Konjugat, hergestellt durch MGDF-Alkylierung mit MePEG-Aldehyd (PEG 16).
Fig. 18 zeigt Plättchenzahlen von Mäusen, die mit rekombinantem menschlichem MGDF behandelt wurden: offene Raute = von CHO abgeleiteter 22-353 MGDF; offene Kreise = nicht mit PEG versehener 22-184 MGDF von E. coli (d. h. 1-163 MGDF); und geschlossene Kreise = mit PEG versehener 22-184 MGDF von E. coli.
Fig. 19 zeigt ein Reinigungsflußdiagramm für r-HuMGDF.
Fig. 20 zeigt die Wirkung von r-HuMGDF (E. coli 1-163) auf Plättchenzahlen in einem murinen Carboplatinmodell. Man injizierte Balb/c-Mäusen intraperitoneal eine einzige Dosis von Carboplatin (1,25 mg/Maus) am Tag 0. Die mit Bindemittel alleine behandelte Gruppe erhielt kein Carboplatin. Nach vierundzwanzig Stunden injizierte man carboplatin-behandelten Mäusen subcutan entweder Bindemittel oder 100 ug/kg r-HuMGDF täglich für den Rest der Studie. (n = 10 für jede Gruppe; 5 Tiere wurden bei jedem zweiten Zeitpunkt zur Ader gelassen).
Fig. 21 zeigt die Wirkung von r-HuMGDF (E. coli 1-163) auf Plättchenzahlen in Mäusen, die mit Strahlung behandelt wurden. Balb/c-Mäuse wurden mit einer einzelnen Dosis von 500 Rad Gamma-Bestrahlung (Cäsium-Quelle) am Tag 0 bestrahlt. Die mit - Bindemittel alleine behandelte Gruppe wurde nicht bestrahlt. Nach vierundzwanzig Stunden injizierte man bestrahlten Tieren subkutan entweder Bindemittel oder 100 um/kg r-HuMGDF täglich für den Rest der Studie. (n = 8 für jede Gruppe; 4 Tiere wurden bei jedem zweiten Zeitpunkt zur Ader gelassen).
Fig. 22 zeigt die Wirkung von r-HuMGDF (E. coli 1-163) auf Plättchenzahlen in mit einer Kombination aus Strahlung und Carboplatin behandelten Mäusen. Balb/c-Mäuse wurden mit einer einzelnen Gamma-Strahlendosis von 500 Rad (Cäsiumquelle) bestrahlt und Carboplatin verabreicht (1,25 mg/Maus) am Tag 0. Nach vierundzwanzig Stunden injizierte man den beeinträchtigten Tieren subkutan entweder Bindemittel oder 100 um/kg r-HuMGDF täglich für den Rest der Studie (n-8 pro Gruppe). Ohne r-HuMGDF-Unterstützung überlebten die meisten Tiere diese Studie nicht. In der Kontrollgruppe überlebte eines von acht Tieren. In der behandelten Gruppe überlebten acht von acht Tieren.
Fig. 23 zeigt die Wirkung von r-HuMGDF (E. coli 1-163) auf strahlungsinduzierte Thrombocytopenie bei Rhesusaffen. Rhesusaffen wurden einer Bestrahlung unterworfen (700 cGy Co-80). r-HuMGDF (n = 3) oder menschliches Serumalbumin (n = 9) (jeweils 25 ug/kg/Tag) wurde subkutan für 18 aufeinanderfolgende Tage verabreicht beginnend 24 Stunden nach Bestrahlung. Blutzellanalysen wurden mit einem elektronischen Blutzellanalysegerät durchgeführt. Jedes Symbol stellt den Mittelwert (+/- Standardfehlerabweichung) dar.
Fig. 24 zeigt die Wirkung von mit PEG versehenem und glykolisiertem r-HuMGDF auf Plättchenzahlen in Mäusen, die mit Carboplatin und Bestrahlung behandelt waren. Die Mäuse wurden der Kombination aus Carboplatin und Bestrahlung ausgesetzt, wie beschrieben für die für Fig. 22 durchgeführten Studien. Subkutane Injektionen des angezeigten Präparats von r-HuMGDF (50 ug/kg/Tag) wurden täglich für die Dauer der Studie gegeben, beginnend vierundzwanzig Stunden nach dem Insult. Blutzellzahlen wurden genommen an dem angezeigten Tag unter Verwendung eines elektronischen Zellzählers (Sysmex, Baxter).
Fig. 25 zeigt die synthetische Gensequenz für rekombinanten menschlichen MGDF, Aminosäuren 1-163, mit E. coli-optimierten Codons.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Zusätzliche Aspekte und Vorteile der Erfindung werden für die Fachleute nach Betrachtung der folgenden Beschreibung offensichtlich werden, die die Praxis der Erfindung detailliert darstellt.
Die neuen Säugetier-Megakaryozytenwachstum-fördernden und/oder plättchenproduzierenden Faktoren, hier bezeichnet als Mpl-Liganden, die von der vorliegenden Erfindung vorgesehen werden, sind homogene Proteine, die im wesentlichen frei von Assoziation mit anderen Proteinmaterialien sind. Bevorzugterweise sind die Proteine etwa zu 90% frei von anderen Proteinen, besonders bevorzugt etwa zu 95% frei von anderen Proteinen und am bevorzugtesten etwa zu ≥95% frei von anderen Proteinen. Diese Proteine können mittels rekombinanter Techniken hergestellt werden, um Produktion von reinem, aktivem Mpl-Liganden in großer Menge zu ermöglichen, der für therapeutische Anwendungen hilfreich ist. Alternativ können solche Proteine erhalten werden in einer homogenen Form von aplastischem Säugetierblut, Plasma oder Serum, oder von einer Säugetierzelline, die Mpl-Liganden sekretiert oder expri miert. Weiterhin kann der Mpl-Ligand oder aktive Fragmente davon chemisch synthetisiert werden.
Allgemein werden unter "Mpl-Liganden", wie hierin in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung verwendet, die Mpl-Liganden verstanden, die hierin offenbart werden, ebenso wie aktive Fragmente und Varianten davon, welche detaillierter unten beschrieben sind.
Zwei bevorzugte Mpl-Liganden von einer kaninen Quelle mit apparenten Molekulargewichten von etwa 25 kd und 31 kd, wie bestimmt durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid- Gelelektrophorese (SDS-PAGE) unter nichtreduzierenden Bedingungen. Beide Proteine werden gereinigt während desselben Reinigungsprotokolls, welches in dem Abschnitt unten betreffend Beispiele detailliert beschrieben ist. So binden beispielsweise beide dieser Mpl- Liganden Weizenkeimlektin und immobilisierten Mpl-Rezeptor. Die 25 kd Form schließt die folgende Aminosäure ein:
Ala-Pro-Pro-Ala-Xaa-Asp-Pro-Arg-Leu-Leu-Asn-Lys-Met-Leu- Arg-Asp-Ser-His-Val-Leu-His-Xaa-Arg-Leu-Xaa-Gln-Xaa-Pro- Asp-Ile-Tyr (SEQ ID NO : 1).
Die 31 kd Form schließt eine Aminosäuresequenz wie folgt ein:
Ala-Pro-Pro-Ala-Xaa-Asp-Pro-Arg-Leu-Leu-Asn-Lys-Met-Leu- Arg-Asp-Ser-His-Val-Leu-His (SEQ ID NO : 2).
Die "Xaa"-Aminosäuren, die in SEQ ID NOS: 1 und 2 gezeigt sind, sind nicht mit Sicherheit bekannt, aber man nimmt an, daß sie Cystein, Serin, Threonin oder (weniger wahrscheinlich) Trypthophan sind.
Aus den obigen Sequenzen ist ersichtlich, daß der 31 kd Ligand wenigstens einen Teil der 25 kd Form umfaßt. Insbesondere sind die ersten 21 Aminosäuren des 31 kd Proteins exakt die gleichen, wie jene des 25 kd Proteins. Dieser Beweis und insbesondere die Tatsache, daß beide Proteine Aktivität in den Mpl-Ligandenaktivitätstests, wie hierin gezeigt, aufweisen, führt zu der Schlußfolgerung, daß beide Proteine eng verwandt sind hinsichtlich Struktur und Aktivität. Es ist wahrscheinlich, daß sich die 31 kd Form des Proteins von der 25 kd Form in un terschiedliche C-Terminale Sequenz, unterschiedlicher Glykosilierung und/oder unterschiedlichem Splicen des die Proteine codierenden Gens unterscheiden.
Zusätzlich zu der obigen Sequenzinformation wurde eine weitere Sequenz während des Sequenzierens der 25 kd Bande vor dem letzten Reinigungsschritt (unter Verwendung von Umkehrphasen-HPLC) bestimmt. Man fand diese Sequenz assoziiert mit der 25 kd Bande unter nicht reduzierenden Bedingungen, aber nicht reduzierenden Bedingungen, was impliziert, daß sie das Ergebnis einer Spaltung des 25 kd Proteins in zwei Teile (z. B. durch eine Protease) ist, deren Teile durch eine Disulfidbrücke zusammengehalten werden. Diese Sequenz lautet:
Thr-Gln-Lys-Glu-Gln-Thr-Lys-Ala-Gln-Asp-Val-ASp-Val-Leu-Gly-Ala- Val-Ala-Leu (SEQ ID NO : 3)
Obwohl die präzise Stelle der SEQ ID NO : 3 in der Sequenz des 25 kd Proteins unklar ist, unterstützt die Analogie mit anderen Cytokinen, wie Erythropoietin, die Möglichkeit, daß die Sequenz in der Nähe von Aminosäure 114 in dem 25 kd Protein auftritt. Es sollte festgehalten werden, daß es wahrscheinlich, wenngleich unbewiesen, ist, daß SEQ ID NO : 3 auch in dem 31 kd Protein auftritt, wahrscheinlich wieder beginnend in der Nähe von Aminosäure 114. Diese Sequenzinformation wird zusätzlich detailliert im Beispiel 7 diskutiert.
Seit den ersten Reinigungsexperimenten der caninen Liganden, oben zusammengefaßt, ist nun ein Gen kloniert worden, das für einen caninen Liganden codiert. Als ein Ergebnis ist festgestellt worden, daß die Aminosäuresequenz dieses caninen Liganden in seiner ganzen Länge diejenige in Fig. 13A angegebene ist. Auf der Grundlage von Molekulargewichtsberechnungen wird vorausgesagt, daß die caninen 25 kd und 31 kd Liganden C-terminal prozessierte Formen des in Fig. 13A gezeigten Liganden in seiner ganzen Länge sind. Zusätzlich ist ein muriner Mpl-Ligand erhalten worden mit der in Fig. 13B angegebenen Sequenz.
Solche gereinigten Liganden können auch durch spezifische Aktivität in dem menschlichen Megakaryocytentest von Beispiel 2 mit wenigstens 5,7 · 109 Megakaryocyten-Einheiten/mg gekennzeichnet werden. Eine Megakaryocyten-Einheit ist definiert als die Menge an Material, das zur Produktion von so vielen Megakaryocyten führt, wie ein Mikroliter APK9-Standardkontrolle unter Verwendung des im Beispiel 2 beschriebenen Tests.
Derartige gereinigte Liganden sind auch gekennzeichnet durch eine spezifische Aktivität in dem Mpl-abhängigen Zellwachstumstest von Beispiel 4 mit wenigstens etwa 6,9 · 109 Zellwachstums-Einheiten/mg. Eine "Zellwachstums-Einheit" ist definiert als die Menge an Ligand, die erforderlich ist, um zu einem Wachstum von 200 1A6.1 Zellen in dem Test von Beispiel 4 zu führen.
Die vorliegende Tabelle 1 zeigt zusätzliche spezifische Aktivitätsberechnungen für tatsächlich gereinigte canine Mpl-Liganden, die gemäß dieser Erfindung hergestellt wurden. Tabelle 1
Fast man die obige Information zusammen, so sind einige beispielhafte Mpl-Liganden der vorliegenden Erfindung gekennzeichnet durch eine oder mehrere der folgenden biochemischen und biologischen Eigenschaften:
(a) solche Mpl-Liganden werden aus aplastischem caninen Plasma (Hundeplasma) isoliert;
(b) solche Mpl-Liganden weisen apparente Molekulargewichte von etwa 25 kd oder 31 kd auf, wie bestimmt durch 12-14% Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid- Gelelektrophorese (SDS-PAGE) unter nicht-reduzierenden Bedingungen;
(c) die Mpl-Liganden umfassen die folgenden Aminosäuresequenzen: SEQ ID NO : 1, im Falle des 25 kd Proteins; oder SEQ a NO : 2, im Falle des 31 kd Proteins;
(d) die Mpl-Liganden umfassen zusätzlich die Aminosäuresequenzen SEQ a NO : 3 (besonders bevorzugt in dem 25 kd Protein);
(e) die Mpl-Liganden binden an Weizenkeimlektin;
(f) die Mpl-Liganden binden an immobilisierten löslichen murinen Mpl-Rezeptor;
(g) die Mpl-Ligandenaktivität kann in vitro durch löslichen Mpl-Rezeptor inhibiert werden;
(h) die Mpl-Liganden binden an eine Anionenaustauschsäule bei einem pH von etwa 8-9.
Die biologischen Aktivitäten von bevorzugten Mpl-Liganden der vorliegenden Erfindung werden durch ihre Fähigkeit gezeigt, spezifisch das Wachstum und Entwicklung von Megakaryocyten in dem Megakaryocytenwachstum-fördernden Test von Beispiel 2 zu stimulieren. In diesem Test stimuliert Mpl-Ligand die Differenzierung von menschlichen peripheren CD34&spplus;- Zellen (d. h. CD-34 Zellen, die durch Immunadsorption selektiert sind) während einer 8 Tage dauernden Kulturperiode. Megakaryocyten werden identifiziert durch Färben mit spezifischen anti-Plättchenantigen-Antikörper und mikroskopisch gezählt. MPL-Ligand stimuliert auch das Wachstum der faktorabhängigen Zellinie, 1A6.1. Bei Abwesenheit von MPL-Liganden werden die Zellen sterben. Die Zahl von 1A6.1 Zellen wird nach 2 Tagen in Kultur mit MPL- Liganden bewertet.
Die oben beschriebenen Mpl-Liganden weisen spezifische Aktivitäten auf, wie in Tabelle 1 oben beschrieben.
Als Quellen für die Mpl-Liganden wurden aplastisches Säugetierblut, Plasma oder Serum bestimmt. Man erwartet nicht, daß die Quelle für derartige Liganden durch solche bekannten Quellen beschränkt ist und kann andere Säugerkörperflüssigkeiten, davon erhaltene Zellen etc. einschließen.
Die Reinigung nativer Mpl-Liganden aus Säugetierquellen basiert auf zwei Schlüsselreinigungsschritten:
(a) Lektinaffinitätschromatographie, bevorzugterweise unter Verwendung von Weizenkeimagglutinin; und
(b) Affinitätschromatographie mit immobilisiertem Mpl-Rezeptor.
Zusätzliche Schritte können eingeschlossen sein, um das Protein weiter zu reinigen, wie Ionenaustauschchromatorgraphie, Gelflltrationchromatographie und Umkehrphasenchromatographie.
Die tatsächlich verwendeten Reinigungstechniken, um Mpl-Liganden aus aplastischem caninen Plasma zu erhalten, umfaßt die folgenden Schritte (siehe Beispiel 7):
(a) Lektinaffinitätschromatographie (Weizenkeimagglutinin-Chromatographie ist besonders bevorzugt);
(b) Affinitätschromatographie mit löslichem Mpl-Rezeptor (Mpl-X) (bevorzugterweise unter Verwendung von immobilisiertem murinen Mpl-X);
(c) Ionen (Anionen- oder Kationen-)Austauschchromatographie (bevorzugterweise Anionenaustauschchromatographie; ganz besonders bevorzugt unter Verwendung einer Mono Q-Säule);
(d) Gelfiltrationschromatographie unter dissoziierenden Bedingungen (bevorzugterweise unter Verwendung von Superdex 200 plus SDS); und
(e) Umkehrphasenchromatographie (bevorzugterweise unter Verwendung einer C-4- Säule).
Homogener Säugetier-Mpl-Ligand, einschließlich menschlichem Liganden, kann erhalten werden, indem die obigen Reinigungsprozeduren auf aplastisches Blut, Serum oder Plasma oder andere Quellen für menschlichen Mpl-Liganden, z. B. Zell- oder Gewebequellen, angewandt wird. Es ist nicht erforderlich, daß die Schritte in einer speziellen Reihenfolge vorgenommen werden, aber die angegebene Reihenfolge ist bevorzugt. Verfahrensweisen zum Kultivieren einer Zell- (oder Gewebe-)Quelle, von der man finden kann, daß sie Mpl- Liganden produziert, sind den Fachleuten bekannt und können verwendet werden, z. B., um die Versorgung mit Ausgangsmaterial zu vergrößern.
Mpl-Ligand oder ein oder mehrere Peptidfragmente davon können auch mittels rekombinanter Techniken hergestellt werden. Um die DNA-Sequenz für einen speziellen Mpl-Liganden zu erhalten, wird das gereinigte Mpl-Ligandenmaterial reduziert und optional mit einer Protease, wie Trypsin, verdaut. Enzymatische Fragmente werden isoliert und sequenziert mittels herkömmlicher Techniken. Alternativ, wie in den Beispielen hierin exemplarisch dargelegt, kann das intakte gereinigte Protein direkt auf der Grundlage der Menge des zur Verfügung stehenden Proteins in dem möglichen Umfang sequenziert werden und dann kann die sequenzierte Region analog zu den sequenzierten tryptischen Fragmenten in der nachfolgenden Prozedur verwendet werden. Oligonucleotidsonden werden synthetisiert unter Verwendung des genetischen Codes, um alle möglichen Sequenzen vorherzusagen, die die Aminosäuresequen zen des/der sequenzierten Fragmente(s) codiert. Bevorzugterweise werden mehrere degenerierte Sequenzen als Sonden erzeugt. Das Mpl-Liganden-Gen wird identifiziert durch Verwenden dieser Sonden, um eine genomische Säugetiergenbank oder andere Quelle zu screenen. Alternativ kann die mRNA von einer Zeliquelle für Mpl-Liganden verwendet werden, um eine cDNA-Genbank herzustellen, die mit den Proben gescreent wird, um die cDNA zu identifizieren, die das Mpl-Liganden-Polypeptid codiert. Weiterhin kann die PCR-Technik verwendet werden, um die cDNA-Sequenz, unter Verwendung geeigneter Primer, zu verlängern.
Wenn man diese Sonden verwendet, um eine genomische Genbank zu screenen, wird ein DNA-Klon erhalten. Um einen Klon mit der ganzen Länge zu erhalten, können Sonden auf der Grundlage der erhaltenen DNA-Sequenz verwendet werden, um die Genbank erneut zu screenen und gegen die Mpl-Liganden-DNA-Sequenz in ihrer ganzen Länge zu hybridizieren.
Die menschliche cDNA für Mpl-Liganden kann auch erhalten werden, indem ein menschlicher genomischer Klon in seiner ganzen Länge in einen Expressionsvektor subkloniert wird, dieser in COS-Zellen transfiziert wird, eine cDNA-Genbank von diesen transfizierten COS- Zellen hergestellt wird und durch Hybridisieren auf Mpl-Liganden-cDNA gescreent wird. Ist die gesamte cDNA einmal identifiziert, kann sie oder ein Teil von ihr, der für ein aktives Fragment von Mpl-Liganden codiert, in irgendeinen aus einer Vielzahl von Expressionsvektoren eingeführt werden, um ein Expressionssystem für Mpl-Liganden oder ein oder mehrere Fragmente davon herzustellen.
Durch eine solche Verwendung rekombinanter Techniken werden bevorzugte DNA- Sequenzen erhalten, die das Mpl-Liganden-Polypeptid codieren. Die vorliegende Erfindung betrifft auch diese DNA-Sequenzen, die frei sind von Assoziationen mit DNA-Sequenzen, die für andere Proteine (d. h. isolierte) codieren, und für Expression von Mpl-Liganden- Polypeptiden mit einer Mpl-Ligandenaktivität (z. B. Megakaryozytenwachstum und/oder - Entwicklung) codieren. Diese DNA-Sequenzen schließen jene Sequenzen ein, die den ganzen oder ein Fragment des Mpl-Liganden codieren und jene Sequenzen, die, bevorzugterweise unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an die cDNA-Sequenzen hybridisieren (siehe, T. Maniatis et al. Molecular Cloning (A Laboratory Manual); Cold Spring Harbor Laboratory (1982), Seiten 387 bis 389).
Beispielhafte stringente Hybridisierungsbedingungen sind Hybridisierung in 4 · SSC bei 62- 67ºC, gefolgt von Waschen in 0,1 · SSC bei 62-67ºC für etwa eine Stunde. Alternativ sind beispielhafte stringente Hybridsierungsbedingungen Hybrisierung in 45-55% Formamid, 4 · SSC bei 40-45ºC.
DNA-Sequenzen, die an die Sequenzen für Mpl-Liganden unter relaxierten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren und die für Mpl-Ligandenpeptide mit biologischen Mpl-Liganden- Eigenschaften codieren, codieren auch für neue Mpl-Liganden-Polypeptide dieser Erfindung. Beispiele derartiger Hybridisierungsbedingungen mit relaxierter Stringenz sind 4 · SSC bei 45-55ºC oder Hybridisierung mit 30-40% Formamid bei 40-45ºC. Zum Beispiel codiert eine DNA-Sequenz, die Regionen mit signifikanter Homologie, beispielsweise, Stellen für Glykosylierung oder Disulfldbrücken, mit den Sequenzen von Mpl-Ligand teilt und ein Protein mit einer oder mehreren biologischen Mpl-Liganden-Eigenschaften codiert, codiert klar ein Mpl- Liganden-Polypeptid, selbst wenn eine derartige DNA-Sequenz nicht stringent an die Mpl- Liganden-Sequenz(en) binden würde.
Allelische Variationen (natürlicherweise auftretende Basenaustausche in der Speziespopulation, die zu einer Änderung in einer Aminosäure führen können oder auch nicht) von DNA- Sequenzen, die die Peptidsequenzen von Mpl-Liganden codieren, sind auch in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen, ebenso wie Analoge oder Derivate davon. In ähnlicher Weise sind auch in der Erfindung umfaßt DNA-Sequenzen, die für Mpl-Liganden-Polypeptide codieren, die sich aber in der Codonnutzung unterscheiden infolge der Degeneration des genetischen Codes oder Variationen in den DNA-Sequenzen von Mpl-Liganden, die durch Punktmutationen oder durch induzierte Modifikationen verursacht sind, um die Aktivität, Halbwertszeit oder Produktion der dadurch codierten Polypeptide zu erhöhen.
Man folgte einem Klonierungsverfahren, wie unten in Beispiel 11 angegeben, und kam zu dem Ergebnis der Aminosäure- und cDNA-Sequenzen der menschlichen Proteine MGDF-1, MGDF-2 und MGDF-3, die hierin offenbart sind. MGDF-1 ist als Aminosäuren 22-353 in Fig. 11 gezeigt und enthält 332 Aminosäuren. MGDF-2 ist ein verkürzter Teil von MGDF-1 und ist als Aminosäuren 22-195 in Fig. 11 gezeigt. MGDF-2 enthält deshalb 174 Aminosäuren. MGDF-3 ist als Aminosäure 22-289 in Fig. 12 gezeigt und enthält 265 Aminosäuren. In jedem hierin offenbarten MGDF ist das Molekül, das das Signalpeptid einschließt, das als Aminosäuren 1-21 sowohl in Fig. 11 als auch Fig. 12 gezeigt ist, auch Teil der Polypeptide der vorliegenden Erfindung, aber es ist bevorzugterweise für aufzuweisende Megakaryocyten- Wachstum und Entwicklungsaktivität entfernt. Zusammenfassend sind MGDFs 1-3 wie folgt definiert:
In den hierin gezeigten Tests waren MGDF-1 und MGDF-2 aktiv, wohingegen MGDF-3 nicht aktiv war.
Auf der Grundlage der hierin präsentierten Aktivitätsdaten wird die Hypothese aufgestellt, daß menschlicher MGDF in vivo als ein im wesentlichen inaktives oder weniger aktives Vorläuferpolypeptid exprimiert ist, das variable C-terminale Aminosäuren aufweist. Nach Spaltung der C-terminalen Aminosäuren (ebenso wie des Signalpeptids) behält/behalten die prozessierte Form(en) des Moleküls die Aktivität oder werden aktiver. Mit Blick auf die obige Hypothese wird angenommen, daß MGDF-1 möglicherweise des Prozessierens bedarf (z. B. Spaltung mit einer Protease), um seine Aktivität aufzuweisen. Die Tatsache, daß eine verkürzte Form von MGDF-1 (d. h. MGDF-2) aktiv ist, stützt diese Hypothese.
Konditioniertes Medium von menschlichen Nieren-293-Zellen (Invitrogen), transfiziert mit dem MGDF-1-Gen, zeigt keine Aktivität in dem Zelltest von Beispiel 4 unten. Andererseits wurde in anderen Zellinien (z. B. 32 D-Zellen), für dieses Molekül keine Aktivität festgestellt. Es wird die Hypothese aufgestellt, daß dies bedeutet, daß 293-Zellen in der Lage sind, das MGDF-1-Molekül zu prozessieren, mutmaßlicherweise durch Verkürzung, so daß das in erster Linie für die Aktivität verantwortliche Molekül eine verkürzte Form ist, wohingegen die 32 D-Zellen nicht in der Lage sind, das Molekül zu prozessieren.
Mit Blick auf die obige Hypothese können verschiedene aktive Moleküle aus Verkürzungen der als MGDF-1 (Fig. 11) angegebenen Sequenz resultieren. Strukturmerkmale, die innerhalb der Cytokinfamilie, wie Erythropoietin (EPO), konserviert sind schließen vier α-helikale Bündel und vier Cysteine ein. Bezugnehmend auf die MGDF-1-Sequenz ist Cys 172 das am meisten C-terminal gelegene Element dieser evolutionär konservierten und funktionell wesentlichen Strukturen. Deshalb sind bevorzugte Verkürzungsvarianten von MGDF-1 jene, die C-terminale Verkürzungen von Aminosäure 173 bis 353 aufweisen (zusammen mit Spaltung des Signalpeptids). Bevorzugterweise werden der Sequenz von MGDF-I von 50 bis 185 Aminosäuren vom C-Terminus fehlen, besonders bevorzugt von 90 bis 172 Aminosäuren vom C-Terminus. Wie hierin offenbart glaubt man, daß das Signalpeptid 21 Aminosäuren lang ist; das Signalpeptid kann jedoch 23 Aminosäuren aufweisen, auf der Grundlage der Sequenz von MGDF-1. Entsprechend werden auch Polypeptide entsprechend den hierin präsentierten, die aber an Position 24 von Fig. 11 oder 12 starten, speziell ins Auge gefaßt.
Das folgende sind einige spezifische bevorzugte Varianten von MGDF-1, die Aktivität auf weisen können (d. h. die Fähigkeit, Wachstum von Megakaryocyten und/oder Plättchen zu fördern; oder inhibitorische/stimulatorische Aktivität hinsichtlich des natürlichen Rezeptors):
In einigen Klonen fehlten die Aminosäure 133-136 in der MGDF-1-Sequenz, so daß Sequenzen, die den oben angegebenen entsprechen, bei denen aber diese Aminosäuren fehlen (und die C-terminale-Aminosäureanzahl um 4 nach unten angepaßt wird) auch aktiv sein können.
In einem Klon, der ein Terminationscodon an Position 192 aufwies, wurde ein Ala-Rest anstelle eines Thr-Restes gefunden, wie gezeigt an Position 191 in Fig. 11. Deshalb schließt die Erfindung Varianten von MGDF-Molekülen ein, bei denen Position 191 Ala ist anstelle von Thr.
MGDF-3 ergibt sich aus Entfernen einer Sequenz, die hierin als IVS-S (intervenierende Sequenz-5) bezeichnet wird, da diese Sequenz innerhalb des fünften Exons in der Sequenz gespliced wird. Da das 5'-Ende von IVS-5 innerhalb eines Codons auftritt führt ihre Entfernung zu einer Verschiebung des Leserahmens in der restlichen Sequenz von MGDF, von der man sieht, daß sie beginnend an Position 160 von MGDF-3 bis zum Ende des Moleküls erfolgt.
Man hat für MGDF-3 selbst nach Transfektion in 293-Zellen und Testen des resultierenden konditionierten Mediums auf Aktivität in dem zellbasierten Test von Beispiel 4 noch keine Aktivität gefunden. Im Unterschied zu MGDF-1, sind 293-Zellen offensichtlich nicht in der Lage, MGDF-3 in eine aktive Form zu prozessieren. Nichtsdestotrotz kann, auf der Grundlage der Verkürzungshypothese, wie oben in Zusammenhang mit MGDF-1 dargestellt, eine Verkürzung der C-terminalen Aminosäuren von MGDF-3 zu Aktivität führen. Zum Beispiel kann C-terminale Verkürzung von MGDF-3 um von 40 bis 102 Aminosäuren zu Aktivität führen.
Bevorzugterweise werden 50 bis 90 Aminosäuren entfernt. Zwei spezifische bevorzugte Varianten von MGDF-2 sind:
Bei allen hierin offenbarten Mpl-Liganden, einschließlich der oben angeführten beispielhaften MGDFs, kann ein Methionylrest am N-Terminus vorhanden sein, insbesondere, wenn derartige Peptide in bakteriellen Wirtszellen exprimiert werden.
Mpl-Liganden-Polypeptide können auch hergestellt werden durch bekannte herkömmliche chemische Synthese. Verfahren zur Konstruktion der Polypeptide der vorliegenden Erfindung durch synthetische Mittel sind den Fachleuten bekannt. Die synthetisch konstruierten Mpl- Liganden-Polypeptidsequenzen können, da sie primäre, sekundäre oder tertiäre Struktur- und Konformationsmerkmale mit den Mpl-Liganden-Polypeptiden teilen, biologische Mpl- Ligandeneigenschaften mit diesen gemeinsam haben. Somit können sie als biologisch aktive oder immunologische Substituenten für natürliche, gereinigte Mpl-Liganden-Polypeptide in therapeutischen und immunologischen Prozessen verwendet werden.
Modifikationen in den Peptiden oder DNA-Sequenzen, die Mpl-Liganden codieren, können von einem Fachmann unter Verwendung bekannter Techniken hergestellt werden. Interessierende Modifikationen in den Mpl-Ligandensequenzen können einschließen den Ersatz, Insertion oder Deletion eines ausgewählten Aminosäurerestes in den codierenden Sequenzen. Mutagenesetechniken für derartige Ersetzung, Insertion oder Deletion sind den Fachleuten wohlbekannt. [Siehe, z. B., US-Patent Nr. 4,518,584.] Konservative Austausche in von 1 bis 20 Aminosäuren sind bevorzugt. Bevorzugte Nukleotide können erzeugt werden durch pro teolytische Enzyme, oder durch direkte chemische Synthese. Derartige Varianten sind innerhalb der Wortbedeutung von Mpl-Liganden-Polypeptiden und Polynukleotiden der vorliegenden Erfindung enthalten.
Spezifische Mutationen der Sequenzen des Mpl-Liganden-Polypeptids kann Modifikationen einer Glycosylierungsstelle (z. B. Serin, Threonin oder Asparagin) umfassen. Das Fehlen von Glycosylierung oder nur teilweise Glycosylierung resultiert aus Aminosäuresubstitution oder -Deletion an irgendeiner Asparagin-verbundenen Glycosylierungserkennungsstelle oder an irgendeiner Stelle des Moleküls, die durch Addition von O-gebundenem Kohlenhydrat modifiziert ist. Eine Asparagin-gekoppelte Glycosylierungsstelle umfaßt eine Sequenz aus drei Peptiden, die spezifisch durch geeignete zelluläre Glycosylierungsenzyme erkannt wird. Diese Sequenzen aus drei Peptiden sind entweder Asn-Xaa-Thr oder Asn-Xaa-Ser, worin Xaa irgendeine Aminosäure außer Pro sein kann. Eine Anzahl von Aminosäuresubstitutionen oder Deletionen an einer oder beiden der ersten und dritten Aminosäureposition einer Glycosilierungserkennungsstelle (und/oder Aminosäuredeletion an der zweiten Postion) führt zur Nicht- Glycosylierung an der modifizierten Sequenz aus drei Peptiden. Expression einer solchermaßen geänderten Nukleotidsequenz liefert Varianten, die an der Stelle nicht glycosyliert sind.

Zusätzliche Analoge/Derivate von MGDF

Andere Analoge und Derivate der Sequenzen von MGDF (Mpl-Liganden), die MGDF (Mpl- Liganden)-Aktivität ganz oder teilweise beibehalten, können auch hergestellt werden durch einen Fachmann, dem die hierin gemachte Offenbarung zur Verfügung steht. Derartige Modifikationen sind auch von dieser Erfindung umfaßt.
Genauer gesagt schließt die vorliegende Erfindung auch breit chemisch modifzierte MGDF- Zusammensetzungen und Verfahren zur Herstellung und Verwendung derselben ein. Die vorliegende Offenbarung enthüllt, daß es möglich ist, MGDF zu modifizieren und seine Eigenschaften zu stärken.
In einem Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein MGDF-Produkt, das ein MGDF- Protein umfaßt, das an wenigstens einen wasserlöslichen Polymeranteil gebunden ist.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein MGDF-Produkt, worin das MGDF-Protein an wenigstens ein Polyethylenglycolmolekül gebunden ist.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung MGDF-Moleküle, die an wenigstens ein Polyethylenglycolmolekül mittels einer Acyl- oder Alkylverbindung angebunden ist.
Versehen von MGDF mit PEG kann ausgeführt werden durch irgendeine in der Technik bekannte Pegylierungsreaktionen. Siehe z. B.: Focus on Growth Factors 3 (2): 4-10 (1992); EP 0 154 316; EP 0 401 384; und die anderen hierin zitierten Publikationen, die sich auf Pegylierung beziehen. Bevorzugterweise wird die Pegylierung ausgeführt mittels einer Acylierungsreaktion oder einer Alkylierungsreaktion mit einem reaktiven Polyethylenglycolmolekül (oder einem analogen reaktiven wasserlöslichen Polymer). Diese bevorzugten Mittel zur Derivatisierung mit Polyethylenglycol werden nun detaillierter diskutiert werden.

Acylierung

Pegylierung durch Acylierung umfaßt im allgemeinen Umsetzen eines aktiven Esterderivates von Polyethylenglycol (PEG) mit einem MGDF-Protein. Irgendein bekanntes reaktives PEG- Molekül kann verwendet werden, um die Pegylierung von MGDF auszuführen. Ein bevorzugter aktivierter PEG-Ester ist PEG, das mit N-Hydroxysuccinimid ("NHS") verestert ist. Wie hierin verwendet, wird "Acylierung" so betrachtet, daß sie ohne Beschränkung die folgenden Arten an Verbindungen zwischen MGDF und einem wasserlöslichen Molekül, wie PEG, umfaßt: Amid, Carbamat, Urethan und dergleichen. Siehe Bioconjugate Chem. 5 : 133- 140 (1994). Reaktionsbedingungen können ausgewählt werden von irgendwelchen von denen, die in der Technik der Pegylierung oder den nachfolgend entwickelten bekannt sind, sollten aber Bedingungen vermeiden, wie Temperatur, Lösungsmittel und pH, die die zu modifizierende MGDF-Spezies inaktivieren würden. Reaktionsbedingungen, die allgemein für Pegylierung von MGDFs gelten, werden unten beschrieben werden. Eine beispielhafte Reaktion mit einem NHS-Ester von mono-Methoxy-PEG ist in Fig. 14 dargestellt.
Pegylierung durch Acylierung wird allgemein zu einem mit mehreren PEG versehenen MGDF-Produkt führen, worin die Lysin-s-Aminogruppen über eine Acylverbindungsgruppe pegyliert (mit einem PEG versehen). Bevorzugterweise wird die Zwischenverbindung ein Amid sein. Bevorzugterweise wird das resultierende Produkt auch im wesentlichen nur (z. B. 95%) mit eins, zwei oder drei PEG versehen sein. Es werden jedoch normalerweise einige Spezies mit höherem Grad an Pegylierung (bis zur maximalen Anzahl von 6- Aminosäuregruppen von Lysin von MGDF plus eine a-Aminogruppe am Aminoterminus von MGDF) in Mengen gebildet werden, die von den spezifischen verwendeten Reaktionsbedingungen abhängen. Wenn erwünscht, können höher gereinigte mit PEG versehene Spezies von der Mischung getrennt werden, insbesondere unreagierte Spezies, durch Standardreinigungstechniken, einschließlich, unter anderem, Dialyse, Aussalzen, Ultrafiltration, Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltrationchromatographie und Elektrophorese.

Alkylierung

Pegylierung durch Alkylierung umfaßt im allgemeinen Umsetzen eines terminalen Aldehyd- Derivates von PEG mit einem Protein, wie MGDF, in Gegenwart eines Reduktionsmittels.
Wie bei der Acylierung, oben diskutiert, werden die Reaktionsbedingungen unten beschrieben.
Pegylierung durch Alkylierung kann auch zu mit vielen PEG versehenem (polypegyliertem) MGDF fUhren. Eine beispielhafte reduktive Alkylierungsreaktion mit MGDF um ein mit vielen PEG versehenes Produkt zu ergeben, ist in Fig. 15 gezeigt. Zusätzlich kann man die Reaktionsbedingungen manipulieren, wie hierin beschrieben, um Pegylierung im wesentlichen nur an der α-Aminogruppe des N-Terminus der MGDF-Spezies (z. B. eine mit einem PEG versehene Spezies) zu bevorzugen. Eine beispielhafte reduktive Alkylierungsreaktion mit MGDF, um ein mit einem PEG versehenes Produkt zu ergeben, ist in Fig. 16 gezeigt. In jedem Fall der Monopegylierung oder Polypegylierung werden die PEG-Gruppen bevorzugterweise an das Protein vermittels einer -CH&sub2;-NH-Gruppe angebunden. Mit spezifischem Bezug auf die -CH&sub2;-Gruppe wird dieser Typ der Verbindung hierin als eine "Alkyl"-Verbindung bezeichnet.
Derivatisierung mittels reduktiver Alkylierung, um ein mit einem PEG versehenes Produkt herzustellen, nutzt unterschiedliche Reaktivitäten verschiedener Aminogruppen (Lysin gegenüber der N-terminalen) aus, die für die Derivatisierung in MGDF verfügbar sind. Die Reaktion wird bei einem pH (siehe unten) durchgeführt, der einem erlaubt, Vorteil zu ziehen aus den pKa-Differenzen zwischen den &epsi;-Aminogruppen der Lysinreste und dem der α- Aminogruppe des N-terminalen Restes des Proteins. Durch solch selektive Derivatisierung wird das Anbinden eines wasserlöslichen Polymers, das eine reaktive Gruppe, wie einen Aldehyd, enthält, an ein Protein kontrolliert: die Konjugation mit dem Polymer erfolgt vorherrschend am N-Terminus des Proteins und es erfolgt keine signifikante Modifikation anderer reaktiver Gruppen, wie der Lysinseitenkettenaminogruppen. In einem wichtigen Aspekt sieht die vorliegende Erfindung ein im wesentlichen homogenes Präparat aus Monopolymer/MGDF-Proteinkonjugatmolekülen vor (was ein MGDF-Protein bedeutet, an das im wesentlichen nur ein Polymermolekül (d. h. 95%) an einer einzelnen Stelle angebunden ist). Genauer gesagt sieht die vorliegende Erfindung, wenn Polyethylenglycol verwendet wird, auch mit PEG versehenes MGDF-Protein vor, dem mögliche antigene Verknüpfungsgruppen fehlen und bei dem das Polyethylenglycolmolekül direkt an das MGDF-Protein gekoppelt ist.
Somit betrifft, in einem bevorzugten Aspekt, die vorliegende Erfindung mit PEG versehenen MGDF, wobei die PEG-Gruppe(n) über Acyl- oder Alkylgruppe angebunden ist/sind. Wie oben diskutiert, können derartige Produkte mit einem oder vielen PEG versehen sein (z. B. enthaltend 2-6, bevorzugterweise 2-5 PEG-Gruppen). Die PEG-Gruppen sind an das Protein allgemein angeknüpft an den a- oder s-Aminogruppen der Aminosäuren, aber es wird auch ins Auge gefaßt, daß die PEG-Gruppen an irgendeine Aminogruppe angeknüpft sind, die an das Protein angeknüpft ist, die ausreichend reaktiv ist, um an eine PEG-Gruppe angebunden zu werden unter geeigneten Reaktionsbedingungen.
Mit einem PEG versehene MGDF-Derivate dieser Erfindung sind besonders bevorzugte Gruppen von Molekülen. Verglichen mit den mit vielen PEG versehenen MGDF-Derivaten sind die mit einem PEG versehenen Derivate aus verschiedenen Gründen vorteilhaft.
Die mit einem PEG versehenen Derivate sind leichter zu reinigen und deshalb im allgemeinen homogener als die mit vielen PEG versehenen Derivate. Monopegylierung kann ausgeführt werden, so daß der Polyethylenglycolanteil nur an die α-Aminogruppe der N-terminalen Aminosäure angebunden ist, wie unten beschrieben. Anbindung zusätzlicher Polyethylenglycolgruppen kann erfolgen an irgendeinem der mehreren Lysin-Reste in MGDF und, möglicherweise, an andere Stellen. Aus diesem Grund neigen mit vielen PEG versehene MGDF- Derivate zu heterogeneren Mischungen. Die Ausbeuten der mit einem PEG versehenen Derivate sind im allgemeinen auch höher als die für die mit vielen PEG versehenen Derivate.
Die Polymermoleküle, die sowohl bei dem Acylierungs- als auch Alkylierungsansatz verwendet werden können, sind ausgewählt aus wasserlöslichen Polymeren oder einer Mischung davon. Das ausgewählte Polymer sollte wasserlöslich sein, so daß das Protein, an das es angebunden ist, nicht in einer wässrigen Lösung, wie in einer physiologischen Umgebung, präzipitiert. Das ausgewählte Polymer sollte so modifiziert sein, daß es eine einzelne reaktive Gruppe aufweist, wie einen aktiven Ester für Acylierung und einen Aldehyd für Alkylierung, bevorzugterweise so, daß der Umfang der Polymerisation kontrolliert werden kann, wie in den vorliegenden Verfahren vorgesehen. Ein besonders reaktiver PEG-Aldehyd ist Polyethylenglycolpropionaldehyd, der wasserstabil ist, oder mono C&sub1;-C&sub1;&sub0;-Alkoxy- oder Aryloxy- Derivate davon (siehe US-Patent 5,252,714). Das Polymer kann verzweigt oder unverzweigt sein. Bevorzugterweise wird das Polymer, für eine therapeutische Verwendung des Endproduktpräparates, pharmazeutisch akzeptabel sein. Das wasserlösliche Polymer kann ausgewählt werden aus der Gruppe, die, z. B. Polyethylenglycol, mono-Methoxy-Polyethylenglycol, Dextran, Poly(N-vinylpyrrolidon)polyethylenglycol, Propylenglycol-homopolymere, ein Po lypropylenoxid/ethylenoxid-Copolymer, polyoxyethylierte Polyole (z. B. Glycerin) und Polyvinylalkohol umfaßt. Für die Acylierungsreaktionen sollte das/die ausgewählte(n) Polymer(en) eine einzelne reaktive Estergruppe aufweisen. Für die vorliegende reduktive Alkylierung sollte der/die ausgewählte(n) Polymer(en) eine einzelne reaktive Aldehydgruppe aufweisen. Im allgemeinen wird das wasserlösliche Polymer nicht ausgewählt sein aus natürlicherweise vorkommenden Glycosylresten, da diese gewöhnlicherweise bequemer durch rekombinante Säugetierexpressionssysteme hergestellt werden. Das Polymer kann ein beliebiges Molekulargewicht aufweisen und gerade, verzweigt oder unverzweigt sein.
Ein besonders bevorzugtes wasserlösliches Polymer zur Verwendung hierin ist Polyethylenglycol, abgekürzt PEG. Wie hierin verwendet, soll Polyethylenglycol eine jegliche Form von PEG umfassen, die verwendet worden ist, um andere Proteine zu derivatisieren, wie mono-(C&sub1;-C&sub1;&sub0;)-Alkoxy- oder Aryloxy-Polyethylenglycol.
Wie hierin verwendet, ist MGDF so definiert, daß es eine jegliche der verschiedenen Formen von MGDF umfaßt, die hierin beschrieben sind. Zum Beispiel sind alle vollständig langen oder verkürzten glycosylierten oder nicht-glycosylierten Formen von MGDF eingeschlossen. Das folgende sind bevorzugte MGDF-Moleküle, die derivatisiert werden sollen (in einem jeden Fall bezieht sich die Nummerierung auf die Aminosäuren, die gemäß Fig. 11 nummeriert sind):
Die oben bevorzugten Spezies können glycosyliert, nicht glycosyliert, oder deglycosyliert, bevorzugterweise nicht glycosyliert sein. Sie können rekombinant in entweder bakteriellen (z. B., E. coli) oder (z. B., CHO-)Zellen hergestellt werden.
Die folgenden sind besonders bevorzugte Untergruppen chemisch derivatisierter Moleküle dieser Erfindung (in einem jeden Fall sind sie Mono- oder Poly-, z. B. 2-4, PEG-Anteile, die über eine Acyl- oder Alkylgruppe angebunden sind):
mit PEG versehener MGDF-11
mit PEG versehener MGDF-4
mit PEG versehener MGDF-2.
Allgemein kann chemische Derivatisierung unter irgendeiner geeigneten Bedingung vorgenommen werden, die verwendet wird, um eine biologisch aktive Substanz mit einem aktivierten Polymermolekül umzusetzen. Verfahren zum Herstellen von pegyliertem MGDF wird im allgemeinen die Schritte umfassen (a) Umsetzen eines MGDF-Polypeptids mit Polyethylenglycol (z. B. ein reaktives Ester- oder Aldehydderivat von PEG) unter Bedingungen, unter denen MGDF an eine oder mehrere PEG-Gruppen angebunden wird, und (b) Erhalten des/der Reaktionsprodukte(s). Im allgemeinen werden die optimalen Reaktionsbedingungen für die Acylierungsreaktionen von Fall zu Fall auf der Grundlage von bekannten Parametern und dem erwünschten Ergebnis bestimmt werden. So ist zum Beispiel der Prozentsatz an mit vielen PEG versehenem Produkt umso größer, je größer das Verhältnis PEG: Protein ist.
Reduktive Alkylierung, um eine im wesentlichen homogene Population an mono- Polymer/MGDF-Proteinkonjugatmolekül zu erzeugen, wird im allgemeinen die Schritte umfassen: (a) Umsetzen eines MGDF-Proteins mit einem reaktiven PEG-Molekül unter reduktiven Alkylierungsbedingungen, bei einem pH, der geeignet ist, um selektive Modifikation der α-Aminogruppe an dem Aminoterminus des MGDF-Proteins zu erlauben; und (b) Erhalten des/der Reaktionsprodukte(s).
Für eine im wesentlichen homogene Population von mono-Polymer-MGDF-Protein- Konjugatmolekülen sind die reduktiven Alkylierungsreaktionsbedingungen jene, die selektives Anbinden des wasserlöslichen Polymeranteils an den N-Terminus von MGDF erlauben. Derartige Reakionsbedingungen sehen im allgemeinen pKa-Differenzen zwischen den Lysin- Aminogruppen und der α-Aminogruppe am N-Terminus vor (wobei der pIN der pH ist, bei dem 50% der Aminogruppen protoniert sind und 50% nicht). Der pH beeinflußt auch das Verhältnis Polymer zu Protein, das verwendet werden soll. Im allgemeinen wird, wenn der pH · niedriger ist, ein größeren Überschuß an Polymer gegenüber Protein wünschenswert sein (d. h. je weniger reaktiv die N-terminale a-Aminogruppe ist, desto mehr Polymer wird benötigt, um optimale Bedingungen zu erzielen). Wenn der pH höher ist, braucht das Polymer: Protein- Verhältnis nicht so hoch zu sein. (d. h. reaktivere Gruppen sind verfügbar, so daß weniger Polymermoleküle notwendig sind). Zu Zwecken der vorliegenden Erfindung wird der pH im allgemeinen innerhalb des Bereichs von 3-9, bevorzugterweise 3-6 fallen.
Eine weitere wichtige Betrachtung ist das Molekulargewicht des Polymers. Im allgemeinen ist die Anzahl der Polymermoleküle umso geringer, die an das Protein angebunden werden kann, je höher das Molekulargewicht des Polymers ist. In ähnlicher Weise sollte eine Verzweigung des Polymers beim Optimieren dieser Parameter beachtet werden. Im allgemeinen gilt, je höher das Molekulargewicht (oder je mehr Verzweigungen es gibt), um so höher ist das Polymer: Protein-Verhältnis. Im allgemeinen ist für die Pegylierungs-Reaktionen, die hierin betrachtet werden, das bevorzugte mittlere Molekulargewicht etwa 2kDa bis 100 kDA (wobei der Begriff "etwa" ± 1 kDa bedeutet). Das bevorzugte durchschnittliche Molekulargewicht beträgt etwa 5 kDa bis etwa 50 kDa, besonders bevorzugt etwa 12 kDa bis etwa 25 kDa. Das Verhältnis wasserlösliches Polymer zu MGDF-Protein wird im allgemeinen von 1 : 1 bis 100 : 1 reichen, bevorzugterweise (für Polypegylierung) 1 : 1 bis 20 : 1 und (für Monopegylierung) 1 : 1 bis 5 : 1.
Unter Verwendung der oben angegebenen Bedingungen wird reduktive Alkylierung selektives Anbinden des Polymers an beliebiges MGDF-Protein vorsehen, das eine a-Aminogruppe an seinem Aminoterminus aufweist und ein im wesentlichen homogenes Präparat aus Monopolymer/MGDF-Proteinkonjugat vorsehen. Die Bezeichnung "Monopolymer/MGDF- Proteinkonjugat" wird hierin so verwendet, daß es eine Zusammensetzung bezeichnet, die ein einzelnes Polymermolekül umfaßt, das an ein MGDF-Proteinmolekül angebunden ist. Das Monopolymer/MGDF-Proteinkonjugat wird bevorzugterweise ein Polymermolekül aufweisen, das am N-Terminus angeordnet ist, aber nicht an Lysinaminoseitengruppen. Das Präparat wird bevorzugterweise zu mehr als 90% Monopolymer/MGDF-Proteinkonjugat sein und bevorzugtererweise mehr als 95% Monopolymer MGDF-Proteinkonjugat, wobei der Rest der beobachtbaren Moleküle unumgesetzt ist (d. h. Protein, dem der Polymeranteil fehlt). Die Beispiele unten sehen ein Präparat vor, welches aus mindestens etwa 90% Monopolymer/Proteinkonjugat und etwa 10% nicht umgesetztes Protein besteht. Das Monopolymer/Proteinkonjugat weist biologische Aktivität auf.
Für die vorliegende reduktive Alkylierung sollte das Reduktionsmittel in wässriger Lösung stabil sein und bevorzugterweise in der Lage sein, nur die Schiffsche Base zu reduzieren, die im anfänglichen Prozeß der reduktiven Alkylierung gebildet wird. Bevorzugte Reduktionsmittel können ausgewählt werden aus der Gruppe, die Natriumboronat, Natriumcyanoboronat, Dimethylaminboran, Timethylaminboran und Pyridinboran umfaßt. Ein bevorzugtes Reduktionsmittels ist Natriumcyanoboronat.
Andere Reaktionsparameter, wie Lösungsmittel, Reaktionszeiten, Temperaturen, etc. und Produktreinigungsmittel, können leicht von Fall zu Fall bestimmt werden auf der Grundlage der publizierten Information betreffend Derivatisierung von Proteinen mit wasserlöslichen Polymeren (siehe hierzu die hierin zititierten Veröffentlichungen). Beispielhafte Details sind in dem Beispielabschnitt unten gezeigt.
Man kann wählen, eine Mischung aus Polymer/Proteinkonjugatmolekülen durch Acylierungs- und/oder Alkylierungsverfahren herzustellen und der hierin vorgesehen Vorteil besteht darin, daß man den Anteil von Monopolymer-Proteinkonjugat, der in der Mischung vorhanden sein soll, auswählen kann. Somit kann man, falls erwünscht, eine Mischung verschiedener Proteine mit verschiedenen Anzahlen von angebundenen Polymermolekülen herstellen (d. h. di-, tritetra-, etc.) und mit dem Monopolymer/Proteinkonjugatmaterial kombinieren, das unter Verwendung der vorliegenden Verfahren hergestellt ist, und eine Mischung haben mit einem vorabbestimmten Anteil an Monopolymer/Proteinkonjugat.
Die Arbeitsbeispiele, die unten angeführt sind, zeigen die Herstellung von chemisch modifiziertem MGDF und die Herstellung von mit PEG versehenem MGDF vermittels Acylierung und Alkylierung. Somit betreffen andere Aspekte der vorliegenden Erfindung diese Präparate.
Allgemein schließen Zustände, die durch Verabreichung des vorliegenden Polymer/MGDFs vermindert oder moduliert werden können, jene ein, die oben für MGDF-Moleküle allgemein beschrieben wurden. Die hierin offenbarten MGDF-Moleküle können jedoch zusätzliche verstärkte oder verringerte Aktivitäten, oder andere Merkmale aufweisen, verglichen mit den nicht-derivatisierten Molekülen.
In einem noch weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden pharmazeutische Zusammensetzungen der obigen chemisch modifizierten MGDF-Moleküle vorgesehen. Derartige pharmazeutische Zusammensetzungen können irgend einen der hierin für nicht-derivatisierte MGDF-Moleküle beschriebenen Bestandteile enthalten.
Wenn weitere Studien durchgeführt werden, wird Information erhalten werden betreffend geeignete Dosierungsmengen zur Behandlung verschiedener Zustände bei verschiedenen Patienten und der normale Fachmann wird unter Beachtung des therapeutischen Umfelds, Alter und allgemeinen Gesundheitszustand des Empfängers, in der Lage sein, geeignete Dosierung zu ermitteln. Im allgemeinen wird die Dosierung zwischen 0,01 ug/kg Körpergewicht (wobei die Masse des Proteins alleine, ohne die chemische Modifikation berechnet wird) und 300 ug/kg (auf derselben Grundlage) betragen. Die bevorzugte Dosis wird allgemein von 5 ug/kg Körpergewicht bis 100 ug/kg Körpergewicht reichen, besonders bevorzugt von 10 ugfkg Körpergewicht bis 75 ug/kg Körpergewicht.
Die vorliegende Erfindung sieht auch ein Verfahren zum Herstellen von MGDF (d. h. Mpl- Liganden)-Polypeptiden oder aktiven Fragmenten davon vor. Ein Verfahren der vorliegenden Erfindung umfaßt Einführen der cDNA, die ein Mpl-Liganden Polypeptid codiert, in einen Expressionvektor, um ein Expressionsystem für Mpl-Liganden herzustellen. Eine ausgewählte Wirtszelle wird mit dem Vektor transfiziert und kultiviert. Das Verfahren dieser Erfindung umfaßt daher Kultivieren einer geeigneten Zelle oder Zellinie, die mit einer DNA-Sequenz transflziert worden ist, die für Expression eines Mpl-Ligandenpolypeptid codiert unter der Kontrolle bekannter regulatorischer Sequenzen. Regulatorische Sequenzen schließen Promotor-Fragmente, Terminator-Fragmente und andere geeignete Sequenzen ein, die die Expression des Proteins in einer geeigneten Wirtszelle steuern/kontrollieren. Der exprimierte Faktor wird dann wiedergewonnen, isoliert und aus dem Kulturmedium gereinigt (oder von der Zelle, wenn intrazellulär exprimiert) durch geeignete, den Fachleuten bekannte Mittel. Zusätzlich werden auch die in US-Patent 5,272,071 offenbarten Verfahren als für die erfindungsgemäßen Polynukleotide/Polypeptide anwendbar erachtet.
Geeignete Zellen oder Zellinien können Säugerzellen, wie chinesische Hamsterovarienzellen (CHO) oder 3T3-Zellen sein. Die Auswahl geeigneter Säugerwirtszellen und Verfahren zur Transformation, Kultur, Amplifikation, Screening und Produktherstellung und Reinigung sind in der Technik bekannt. Siehe, z. B., Gething and Sambrook, Nature 293 : 620-635 (1981), oder alternativ, Kaufman et al., Mol. Cell. Biol., 5 (7): 1750-1759 (1985) oder Howley et al., U. S. Pat. No. 4,419,446. Andere geeignete Säugerzellinien sind die Affenzellinien COS-1 und COS-7 und die CV-1 Zellinie. Weitere beispielhafte Säugerwirtszellen schließen Primatenzellinien und Nagerzellinien ein, einschließlich transformierter Zellinien. Normale diploide Zellen, Zellstämme, die in vitro von Primärgewebekulturen abgeleitet sind, ebenso wie primäre Explantate, sind ebenfalls geeignet. Kandidatenzellen können einen genotypischen Mangel im Selektionsgen aufweisen, oder können ein dominant wirkendes Selektionsgen enthalten. Andere geeignete Säugerzellinien schließen ein, sind aber nicht darauf beschränkt, HeLa-, Maus-L-929-Zellen, 3T3-Linien, die abgeleitet von Swiss-, Balb-c oder Nil-Mäusen, BHK oder HAK-Hamsterzellinien.
In ähnlicher Weise nützlich als Wirtszellen, die für die vorliegende Erfindung geeignet sind, sind bakterielle Zellen. Zum Beispiel sind die verschiedenen Stämme von E. coli (z. B. HB101, DHSa, DH10 und MC1061) als Wirtszellen auf dem Gebiet der Biotechnologie gut bekannt. Verschiedene Stämme von B. subtilis, Pseudomonas spp., andere Bacillus spp., Streptomyces spp. und dergleichen können auch bei diesem Verfahren verwendet werden.
Viele Stämme von Hefezellen, die den Fachleuten bekannt sind, sind auch als Wirtszellen zur Expression der Polypeptide der vorliegenden Erfindung verfügbar. Zusätzlich, wo erwünscht, können Insektenzellen als Wirtszellen in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Siehe, z. B. Miller et al., Genetic Engineering 8 : 277-298 (1986) und darin zitierte Literaturstellen.
Die vorliegende Erfindung sieht auch rekombinante Moleküle oder Vektoren zur Verwendung in dem Expressionsverfahren für neue Mpl-Liganden-Polypeptide vor. Diese Vektoren enthalten die Mpl-Liganden-DNA-Sequenzen und die alleine oder in Kombination mit anderen Sequenzen für Mpl-Liganden-Polypeptide (mit oder ohne Signalpeptiden) der vorliegenden Erfindung oder aktive Fragmente davon codieren. Alternativ sind auch Vektoren, die modifizierte Sequenzen enthalten, wie oben beschrieben, Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung und hilfreich bei der Herstellung von Mpl-Liganden-Polypeptiden. Der in dem Verfahren verwendete Vektor enthält auch ausgewählte regulatorische Sequenzen in operativer Verbindung mit den DNA-codierenden Sequenzen der Erfindung und ist in der Lage, die Replikation und Expression davon in ausgewählten Wirtszellen zu steuern.
Ein Vektor ist pXM, der besonders erwünscht ist bei Expression in COS-Zellen [Y. C. Yang et al., Cell 47 : 3-10 (1986)]. Ein weiterer Vektor, der für Expression in Säugerzellen erwünschenswert ist, z. B. CHO-Zellen, ist pEMC2B1. Säugerzellexpressionsvektoren, die hierin beschrieben sind, können synthetisiert werden durch den Fachleuten auf diesem Gebiet gut bekannte Techniken. Die Komponenten der Vektoren, z. B. Replicons, Selektionsgene, Enhancer, Promotoren und dergleichen, können aus natürlichen Quellen erhalten werden oder durch bekannte Verfahrensweisen synthetisiert werden. Siehe Kaufman et al., J. Mol. Biol. 159 : 511-521 (1982); und Kaufman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 : 689-693 (1985). Alternativ kann die Vektor-DNA das ganze oder einen Teil des Rinder-Papilloma-Virusgenoms enthalten [Lusky et al., Cell 36 : 391-401 (1984)] und in Zellinien, wie C127-Mauszellen, als ein stabiles episomales Element repliziert werden. Die Transfektion dieser Vektoren in geeignete Wirtszellen kann zur Expression der Mpl-Liganden-Polypeptide führen.
Andere geeignete Expressionsvektoren, von den viele Typen in der Technik für Säuger-, Insekten-, Pilz-, und bakterielle Expression bekannt sind, können auch zu diesem Zweck verwendet werden.
Die durch die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung zu behandelnden Zustände sind im allgemeinen jene, die einen existierenden Megakaryocyten/Plättchen- Mangel oder einen erwarteten zukünftigen MegakaryocytenlPlättchen-Mangel (z. B. wegen geplanter Operation) umfassen. Derartige Zustände werden gewöhnlicherweise das Ergebnis eines Mangels (temporär oder permanent) von aktivem Mpl-Liganden in vivo sein. Die generische Bezeichnung für Plättchenmangel ist Thrombocytopenie und somit sind die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung im allgemeinen verfügbar für die Behandlung von Thrombocytopenie. Thrombocytopenie (Plättchenmangel) kann vorliegen aus verschiedenen Gründen, einschließlich Chemotherapie und anderer Therapie mit einer Vielzahl von Wirkstoffen, Strahlentherapie, Operation, zufällig eintretender Blutverlust und andere spezifische Erkrankungszustände. Beispielhafte spezifische Erkrankungszustände, die Thrmobocytopenie umfassen und gemäß diese Erfindung behandelt werden können, sind: Aplastische Anämie, idiopathische Thrombocytopenie, metastatische Tumoren, die zu Thrombocytopenie führen, systemischer Lupus erythemato des Splenomegalie, Fanconi- Syndrom, Vitamin B12-Mangel, Folsäuremangel, May-Hegglin-Anomalie, Wiskott-Aldrich- Syndrom und paroxysmale nächtliche Hämoglobinurie. Auch bestimmte Behandlungen von AIDS fuhren zu Thrombocytopenie (z. B. AZT). Bestimmte Wundheilungserkrankungen können auch von einer Erhöhung der Plättchenanzahl profitieren.
Mit Blick auf erwarteten Plättchenmangel, z. B. durch zukünftige Operation, könnte ein Mpl- Ligand der vorliegenden Erfindung mehrere Tage bis mehrere Stunden vor dem Plättchenbedarf verabreicht werden. Hinsichtlich akuter Situationen, z. B. zufällig auftretender und massiver Blutverlust, könnte ein Mpl-Ligand verabreicht werden zusammen mit Blut oder gereinigten Plättchen. Die Mpl-Liganden der vorliegenden Erfindung können auch nützlich sein beim Stimulieren bestimmter Zelltypen, die verschieden sind von Megakaryocyten, wenn man feststellt, daß derartige Zellen Mpl-Rezeptoren exprimieren. Zustände, die mit derartigen Zellen verbunden sind, die dem Mpl-Rezeptor exprimieren, die auf Stimulierung durch den Mpl-Liganden antworten, sind auch innerhalb des Umfangs dieser Erfindung.
MGDF-Molekiile, die selbst nicht in den hierin dargestellten Aktivitätstests aktiv sind, können als Modulatoren (z. B. Inhibitoren, oder Stimulanzien) der Mpl-Rezeptoren in vitro oder in vivo nützlich sein.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können auch alleine, oder in Kombination mit anderen Cytokinen, löslichem Mpl-Rezeptor, hämatopoietischen Faktoren, Interleukinen, Wachstumsfaktoren oder anderen Antikörpern bei der Behandlung der oben angegebenen Zustände verwendet werden. Deshalb sind ein noch weiterer Aspekt der Erfindung therapeutische Zusammensetzungen zur Behandlung der oben angegebenen Zustände. Derartige Zusammensetzungen umfassen eine therapeutisch wirksame Menge eines Mpl-Liganden- Polypeptids oder ein therapeutisch wirksames Fragment davon in Zusammenmischung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger. Das Trägermaterial kann Wasser für Injektion sein, bevorzugterweise ergänzt mit anderen Materialien, die in Lösungen zur Verabreichung an Säugetieren üblich sind. Typischerweise wird ein Mpl-Ligandentherapeutikum in der Form einer Zusammensetzung verabreicht werden, die gereinigtes Protein in Verbindung mit einem oder mehreren physiologisch akzeptablen Trägern, Bindemitteln oder Verdünnungsmitteln umfaßt. Neutrale gepufferte Saline oder Saline gemischt mit Serumalbumin sind beispielhafte geeignete Träger. Bevorzugterweise wird das Produkt als ein Lyophilisat unter Verwendung geeigneter Bindemittel (z. B. Saccharose) formuliert. Andere Standardträger, Verdünnungsmittel und Bindemittel können, wie erwünscht, eingeschlossen sein. Weitere beispielhafte Zusammensetzungen sind Tns-Putler, pH 8,0 und Acetatpuffer, pH 5,0, die, in einem jeden Fall, weiter Sorbitol einschließen können.
Die vorliegenden Zusammensetzungen können systemisch parenteral verabreicht werden. Alternativ können die Zusammensetzungen intravenös oder subkutan verabreicht werden. Wenn systemisch verabreicht, können die therapeutischen Zusammensetzung zur Verwendung in dieser Erfindung in der Form einer Pyrogen-freien, parenteral akzeptablen wässrigen Lösung sein. Das Herstellen solcher pharmazeutisch akzeptabler Proteinlösungen mit gebotener Berücksichtigung des pH, der Isotonizität, der Stabilität und dergleichen liegt innerhalb des Könnens in der Technik.
Das Dosierungsschema, das in einem Verfahren zur Behandlung der oben beschriebenen Zustände umfaßt ist, wird bestimmt werden durch Konsultieren eines Arztes, Betrachten verschiedener Faktoren, die die Wirkung von Wirkstoffen modifizieren, z. B. das Alter, Zustand, - Körpergewicht, Geschlecht und Ernährung des Patienten und die Schwere einer Infektion, Zeitpunkt der Verabreichung und andere klinische Faktoren. Im allgemeinen sollte das tägliche Schema im Bereich von 0,1 bis 1000 Mikrogramm Mpl-Ligandenprotein oder Fragmenten davon pro Kilogramm Körpergewicht sein.
Die therapeutischen Verfahren, Zusammensetzungen und Polypeptide der vorliegenden Erfindung können auch verwendet werden alleine oder in Kombination mit anderen Cytokinen, löslichem Mpl-Rezeptor, hämatopoietischen Faktoren, Interleukinen, Wachstumsfaktoren oder Antikörpern bei der Behandlung von Erkrankungszuständen, die gekennzeichnet sind durch andere Symptome, ebenso wie Plättchenmangel. Es wird erwartet, daß sich ein Mpl- Ligandenmolekül als nützlich bei der Behandlung mancher Formen von Thrombocytopenie in Kombination mit allgemeinen Stimulatoren der Hämatopoese, wie 1L-3 oder GM-CSF, erweisen wird. Andere Megakaryocyten-Stimulierungsfaktoren; d. h. meg-CSF, Stammzellfaktor (SCF), Leukämie-inhibitorischer Faktor (LIF), Oncostatin M (OSM), oder andere Moleküle mit Megakaryocyten-stimulierender Aktivität, können auch mit Mpl-Liganden verwendet werden. Zusätzliche beispielhafte Cytokine oder hämatopoietische Faktoren für derartige Mitverabreichung schließen ein 1L-1 alpha, 1L-1 beta, 1L-2, 1L-3, 1L-4, 1L-5, 1L-6, 1L-11, Kolonie-stimulierender Faktor-1 (CSF-1), GM-CSF, Granulocyten-Kolonie-stimulierender Faktor (G-CSF), EPO, Interferon-alpha (IFN-alpha), LFN-beta oder IFN-gamma. Es kann weiterhin nützlich sein, entweder gleichzeitig oder sequentiell eine wirksame Menge eines löslichen Säugetier-Mpl-Rezeptors zu verabreichen, was eine Wirkung dahingehend aufzuweisen scheint, daß Megakaryocyten veranlaßt werden, in Plättchen zu zerfallen, nachdem die Megakaryocyten die reife Form erreicht haben. Somit erwartet man, daß Verabreichung von Mpl-Liganden (um die Anzahl von reifen Megakaryocyten zu erhöhen), gefolgt von Verabreichen des löslichen Mpl-Rezeptors (um den Liganden zu inaktivieren und zu erlauben, daß die reifen Megakaryocyten Plättchen produzieren), ein besonders wirksames Mittel ist, um Plättchenproduktion zu stimulieren. Die oben angeführte Dosierung würde eingestellt werden, um für derartige zusätzliche Komponenten in der therapeutischen Zusammensetzung zu kompensieren. Der Fortschritt des behandelten Patienten kann mit herkömmlichen Verfahren überwacht werden.
Andere Verwendungen dieser neuen Polypeptide liegen im Bereich der Entwicklung von Antikörpern, die durch Standardverfahren erzeugt werden. Somit werden auch Antikörper, die mit den MpI-Liganden der vorliegenden Erfindung reagieren, ebenso wie reaktive Fragmente derartiger Antikörper, ins Auge gefaßt. Die Antikörper können polyklonal, monoklonal, rekombinant, chimär, einzelkettig und/oder bispezfisch, etc. sein. Die Antikörperfragmente können ein jegliches Fragment sein, das mit dem Mpl-Liganden der vorliegenden Erfindung reaktiv ist, wie, Fab, Fab' etc. Durch die vorliegende Erfindung werden auch Hybridomas vorgesehen, die erzeugt werden, indem Mpl-Liganden oder ein Fragment davon als eine Antigen einem ausgewählten Säugetier präsentiert werden, gefolgt von Fusionieren von Zellen (z. B. Milzzellen) des Tieres mit bestimmten Krebszellen, um immortalisierte Zellinien durch bekannte Techniken zu erzeugen. Die Verfahren, die verwendet werden, um derartige Zellinien und Antikörper zu erzeugen, die gegen das ganze oder Teile eines Mpl-Liganden-Polypeptids der vorliegenden Erfindung gerichtet sind, sind auch von dieser Erfindung umfaßt.
Die Antikörper können therapeutisch verwendet werden, so um ein Binden von Mpl-Liganden und seinem Rezeptor zu inhibieren. Die Antikörper können weiterhin verwendet werden für in vivo und in vitro diagnostische Zwecke, so in markierter Form, um die Anwesenheit von Mpl-Liganden in einer Körperflüssigkeit nachzuweisen.
Die folgenden Beispiele sind aufgenommen, um die vorliegende Erfindung vollständiger zu veranschaulichen. Zusätzlich sehen diese Beispiele bevorzugte Ausführungsformen der Erfin dung vor, sollen aber deren Umfang nicht beschränken, sofern nicht anders angezeigt. Standardverfahren für viele der in den folgenden Beispielen beschriebenen Verfahrensweisen, oder geeignete alternative Verfahrensweisen, werden in weit anerkannten Handbüchern der Molekularbiologie vorgesehen, wie, z. B., Sambrock et al., Molecular Cloning, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1987) und in Ausubel et al., (Hrsg.), Current Protocols in Molecular Biology, Greene associates/Willey Interscience, New York (1990).

Beispiel 1

Aplastisches canines Plasma

Mit Heparin versetztes aplastisches canines Plasma ("APK9") oder normales canines Plasma ("NK9") wurde wie in den folgenden Literaturstellen beschrieben hergestellt, ausgenommen daß den Empfängern Gesamtkörperbestrahlung von SO rad verabreicht wurden:
1. Mazur, E. und South, K., Exp. Hematol. 13 : 1164-1172 (1985).
2. Arriaga, M., South, K., Cohen, J. L. und Mazur, E. M., Blood 69 : 486-492 (1987).
3. Mazur, E., Basilico, D., Newton, J. L., Cohen, J. L., Charland, C., Sohl, P. A., und Narendran, A., Blood 76 : 1771-1782 (1990).

Beispiel 2

Menschenmegakaryocytentest

APK9 und fraktioniertes APK9 wurden auf die Fähigkeit getestet, Entwicklung von menschlichen Megakaryocyten aus CD34+-Vorläuferzellen zu stimulieren. CD34-ausgewählte Zellen wurden aus periphären Blutzellen erhalten, wie beschrieben (Hokom, M. H., Choi, E., Nichol, J. L., Hornkohl, A., Arakawa, T., und Hunt, P., Molecular Biology of Haematopoiesis 3 : 15-31, 1994) und wurden im folgenden Kulturmedium inkubiert: Iscoves's modifiziertes Dulbecco's Medium (IMDM; GIBCO, Grand Island, NY), supplementiert mit 1% Glutamin Pen-Strep (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) und 10% heparinisiertes, Plättchen-armes, menschliches AB-Plasma. Auch waren eingeschlossen 2-Mercaptoethanol (10&supmin;&sup4; M), Brenztraubensäure (110 ug/ml), Cholesterin (7,8 ug/ml), Adenosin, Guanin, Cytidin, Uridin, Thymidin, 2- Deoxycytosin, 2-Deoxyadenosin, 2-Deoxyguanosin (jeweils 10 ug/ml, Sigma), menschliches rekombinantes Insulin (10 ug/ml), menschliches Transfernn (300 ug/ml), Soyabonenlipide (1%, Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN); menschlicher rekombinanter basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (2 ng/ml, Genzyme, Cambridge, MA), menschlicher rekombinater epidermaler Wachstumsfaktor (15 ng/ml), Plättchen-gewonnener Wachstumsfaktor (10 ng/ml, Amgen, Inc., Thousand Oaks, CA). CD34-ausgewählte Zellen wurden bei 2 · 105/ml Kulturmedium ausplattiert, Endvolumen 15 ul, in Näpfen von Mikrotiterplatten von der Terasaki- Art (Vanguard, Inc., Neptune, NY). Die Zellen wurden bei 37ºC für 8 Tage in 5% CO&sub2; in Luft inkubiert, direkt an Kulturnäpfe mit 1% Glutaraldehyd fixiert und mit einem Cocktail aus monoklonalem Antikörper (anti-GPIb, anti-GPIIb, (Biodesign) und anti-GPIb (Dako, Carpinteria, CA) inkubiert. Die Immunreaktion wurde mit einem Streptavidin-beta- Galactosidase-Nachweissystem (HistoMark, Kirkegaard und Perry) entwickelt. Megakaryocyten, identifiziert durch eine blaue Farbe, wurden mit einem Umkehrphasenmikroskop bei einer Vergrößerung von 100x gezählt. Die Ergebnisse wurden als die durchschnittlich Anzahl von Megakaryocyten pro Napf +/- Standardfehler des Mittels dargestellt (SEM). In einigen Fällen wurden Daten in Form von "Megakaryocyten-Einheiten/ml" angegeben, wo das Maß, in dem eine gegebene Probe Megakaryocyten entwickelte, auf die positive APK9- Kontrolle für dasjenige Experiment normalisiert wurde. Eine Einheit wird definiert als die Menge an Material, die zur selben Anzahl von Megakaryocyten führt, wie 1 ul APK9- Standard. Aktivität wurde auf Mpl-Liganden beruhend akzeptiert, wenn es mit 5 bis 10 ug/ml Mpl-X (löslicher Mpl-Rezeptor) blockiert werden konnte.
Man hat gezeigt, daß APK9 einen Faktor(en) enthält, der/die die Entwicklung von menschlichen Megakaryocyten in diesem System stimuliert. C34-ausgewählte Zellen, inkubiert mit 10% NK9 für 8 Tage, zeigen eine vernachlässigbare Anzahl von blaugefärbten Megakaryocyten, wohingegen CD34-ausgewählten Zellen, die mit 10% APK9 für 8 Tage inkubiert werden, eine große Anzahl von blaugefärbten Megakaryocyten zeigen.
Fig. 2 zeigt, daß ansteigende Konzentrationen an Mpl-X, die zu dem Kultursystem aus menschlichen Megakaryocyten hinzugesetzt wurden, in zunehmenden Maße die Megakaryocytenentwicklung blockieren. Bei Konzentrationen an Mpl-X von mehr als 5 ug/ml ist die Inhibierung vollständig. In diesem Experiment wurden CD34-ausgewählten Zellen mit 5% APK9 stimuliert. Dies zeigt, daß eine Aktivität, die mit Mpl-X interagiert (mutmaßlich Mpl- Ligand) notwendig ist für Entwicklung von menschlichen Megakaryocyten und impliziert, daß der Mpl-Ligand selbst in ATK9 vorhanden ist.
Man hat weiter hierin gezeigt, daß die Mpl-Ligandenaktivität, die für die Entwicklung von menschlichen Megakaryocyten erforderlich ist, in APK9 vorhanden ist. APK9 (135 ml) wurde 6-fach in Iscoves's Medium verdünnt und auf eine Mpl-X-Affinitätsäule aufgebracht. Nicht-gebundenes Material (Durchfluß) wurde gesammelt und auf das ursprüngliche Volumen vor dem Test konzentriert. Gebundenes Material wurde in 10 ml 1M NaCl eluiert und 20% des Pools wurde diafiltriert und 4-fach für den Test konzentriert. CD34-ausgewählte Zellen, die im Medium alleine inkubiert wurden, entwickelten keine Megakaryocyten. Zellen, die in 5% APK9 (der gleiche Pool, wie er auf die Säule aufgetragen wurde) inkubiert wurden, entwickelten sich zu 48 +/- 44 Megakaryocyten pro Napf. Zellen, die in 10% des ungebundenen Materials inkubiert wurden, entwickelten sich nicht zu Megakaryocyten. Zellen, die in 10% des Elutionspool inkubiert wurden, entwickelten sich zu 120 +/- 44 Megakaryocyten pro Napf. Sowohl die Säulenbeladungs- als auch die Elutionspoolaktivitäten wurden im Test im wesentlichen vollständig mit 5 ug/ml Mpl-X inhibiert.

Beispiel 3

Transfektion von murinem oder menschlichem Mpl-Rezeptor in eine murine Zellinie

A. Muriner Mpl-Rezeptor

Die murine Mpl-Rezeptor-cDNA in ihrer ganzen Länge wurde in einen Expressionsvektor subkloniert, der einen Transkriptionspromotor umfaßt, der vom LTR von Moloney Murine Sarcoma-Virus stammte. 5 ug dieses Konstruktes und 1 ug des Plasmids mit selektierbarem Marker pWLNeo (Stratagene) wurden in eine 1L-3-abhängige murine Zellinie (32D, Klon 23; Greenberger et al., PNAS 80 : 2931-2936 (1983)) co-elektroporiert. Die Zellen wurden für S Tage kultiviert, um sich von der Prozedur zu erholen, dann in Selektionsmedium inkubiert, das 800 ug/ml Genetecin (G418, Sigma) und 1 ng/ml murines 1L-3 enthielt. Die überlebenden Zellen wurden dann in Pools aus 2 · 105 Zellen aufgeteilt und kultiviert, bis eine Population auswuchs, die weiter analysiert werden konnte. Sechs Populationen wurden auf Oberflächenexpression von Mpl-Rezeptor durch FACS-Analyse getestet unter Verwendung eines polyklonalen Antipeptid-Serums. Eine Population wurde für FACS-Sortieren ausgewählt unter Verwendung desselben Antipeptid-Serums, wie zuvor. Einzelzellklone der Elternzellinie wurden durch Wachstum in 10% APK9 und Geneticin ausgewählt. Nach Selektion in APK9 für 35 Tage wurden die Zellen in 1 ng/ml murinem 1L-3 gehalten. Einer der Subklone, 1A6.1, wurde für diese Arbeit verwendet.

B. Menschlicher Mpl-Rezeptor

Die menschliche Mpl-Rezeptorsequenz in ihrer ganzen Länge (Vigon, L, et al., PNAS 89: 5640-5644 (1992)) wurde in einen Expressionsvektor subkloniert, der den Transkriptionspromoter von Moloney Murine Sarcoma-Virus enthielt (derselbe Vektor, wie beim murinen Rezeptor). Sechs ug dieses Konstruktes und 6 ug eines amphotrophen retroviralen Verpackungskonstrukts (Landau, N. R., Littman, D. R. J. Virology 66 : 5110-5113 (1992)) wurden in 3 · 106 293-Zellen transfiziert unter Verwendung eines CaPO&sub4;-Säugetier-Transfektionskits (Stratagene). Dieselben Zellen wurden nach zwei Tagen erneut transfiziert und nochmals nach vier Tagen. Am Tag nach der letzten Transfektion wurden die 293-Zellen mit der IL-3- abhängigen murinen Zellinie (32D, Klon 23; Greenberger et al., PNAS 80 : 2931-2936 (1983)) co-cultiviert. Nach 24 Stunden wurden die 32D-Zellen gerettet und in einem BSA-Gradienten (Patn-o-cyte; Miles Inc.) in einer Bande gefäßt. Die Zellen wurden in 1 mg/ml murinem IL-3 expandiert und dann auf Wachstum in 20% APK9 selektiert. Die Zellen wurden für Rezeptorzelloberflächenexpression durch FACS sortiert unter Verwendung eines polyklonalen Kaninchen-Antipeptid-Serums. Die Zellen wurden nachfolgend in den Tests verwendet.

Beispiel 4

1A6.1-Test auf Mpl-Liganden

1A6.1-Zellen wurden freigewaschen von Kultur-1L-3 und erneut plattiert (1000 Zellen/15 ul Gesamtvolumen/Napf) in Mikrotiterplatten von der Terasaki-Art in alpha MEM (Gibco), supplementiert mit 10% fötalem Kälberserum (FCS), Geneticin (800 ug/ml) und 1% Pen/Strep (Gibco) in seriellen 1 : 1-Verdünnungen der Testproben. Nach 48 Stunden wurde die Anzahl lebender Zellen pro Napf mikroskopisch bestimmt. Eine Aktivitätseinheit wurde definiert als diejenige Menge an Aktivität, die zu 200 lebenden Zellen pro Napf führte. Aktivität wurde definiert beruhend auf Mpl-Liganden, wenn sie vollständig blockiert werden konnte durch Einschließen von 5-10 ug/ml Mpl-X im Test. Mpl-Liganden-Aktivität von APK9 ergab einen Mittelwert von 4400 +/- 539 Einheiten/ml aplastischen Plasmas. Sofern nicht anders angezeigt, werden Einheiten von Mpl-Liganden-Aktivität in dem 1A6.1-Test definiert.
Tests mit Zellen, die mit dem Gen für menschlichen Mpl-Rezeptor transflziert waren (Beispiel 3D), wurden im wesentlichen in der gleichen Art und Weise durchgeführt, wie mit den 1A6.1-Zellen.

Beispiel 5

Beweis, daß Mpl-Ligand in aplastischem Plasma oder Serum von Maus-, Hunde-, Schweine- und Menschenquellen vorhanden ist

Mpl-Ligand ist im aplastischen Plasma oder Serum von murinen, caninen, porcinen und menschlichen Quellen vorhanden (Tabelle 2). Plasma wurde von BDF1-Mäusen vor Bestrahlung und 12 Tage nach Bestrahlung (500 Rad) gesammelt. Plasma wurde in dem 1A6.1- Test getestet, wo es eine Aktivität von 2000 Einheiten/ml zeigte, die im wesentlichen vollständig durch Mpl-X (10 ug/ml) inhibierbar war. Bestrahltes Mausplasma war auch im Menschenmegakaryocatentest positiv, wo es eine Aktivität von 1833 Einheiten/ml zeigte. Plasma wurde von Hunden vor Bestrahlung und 10 Tage nach Bestrahlung (450 Rad) gesammelt. Das Plasma wurde sowohl im 1A6.1-Test als auch im Menschenmegakaryocytentest getestet. Die Aktivität wurde nachgewiesen und war durch Mpl-X (10 ug/ml) in beiden Tests vollständig inhibiert. Plasma wurde von Schweinen vor Bestrahlung und 10 Tage nach Bestrahlung (650 Rad) gesammelt. Das Plasma wurde sowohl im 1A6.1-Test als auch im Menschenmegakaryocytentest getestet. In beiden Tests zeigte es Mpl-Liganden-Aktivität (inhibierbar durch 10 ug/ml Mpl-X), vergleichbar derjenigen, die in aplastischem caninen Plasma gefunden wird. Serum von aplastischen Menschen wurde erhalten. Dieses Material wurde von Knochenmarkstransplantationspatienten gesammelt. Das Serum von sechs Patienten wurde getestet im 1A6.1 Test, wo es eine Aktivität von 903 Einheiten/ml aufwies, von der 88% auf Mpl- Liganden beruhte (inhibierbar mit 10ug/ml Mpl-X). Seren von 14 aplastischen Patienten sind auch im Menschenmegakaryocytentest getestet worden. Als eine Gruppe zeigten sie wesentliche Aktivität, 941 meg-Einheiten pro ml, die vollständig durch 10 ug/Mpl-X inhibierbar war. Murine 1L-3-Daten sind eingeschlossen, um die Spezifität des 1A6.1-Tests zu zeigen. Obwohl dieses rekombinante Cytokin Wachstum der Zellinie induziert, wird es nicht durch 10 ug/ml Mpl-X blockiert. Tabelle 2

Beispiel 6

Mpl-Land stimuliert 1A6.1-Zellwachstum und Entwicklung von menschlichen Megakaryocyten

Mpl-Ligand (angereichert mindestens etwa 100.000-fach nach Lektin- und Affinitätschromatographieprozeduren, siehe Beispiel 7) stimuliert das Wachstum der 1A6.1-Zellinie und die Entwicklung von menschlichen Megakaryocyten von CD34- ausgewählten peripheren Blutzellen in einer Dosis-abhängigen Art und Weise. Die verantwortliche Aktivität beruht auf Mpl-Liganden, wie gezeigt in Figs. 2 und 3, da die Aktivitäten in beiden Tests vollständig mit Mpl-X blockiert werden kann.
Es ist auch von den Erfindern gezeigt worden, daß sich FACS-gereinigte CD34&spplus;-Zellen aus peripherem Blut, wenn inkubiert mit Mpl-Liganden (100 Einheiten/ml für 9 Tage in diesem Fall), in phänotypisch normale, reife Megakaryocyten entwickeln. Dies begründet, daß gereinigter Mpl-Ligand die gleiche Wirkung auf Megakaryocyten hat, wie rohes APK9. Weiterhin verwendet dieses Experiment gereinigte CD34&spplus;-Zellen (100% CD34&spplus;), im Unterschied zu CD34-ausgewählten Zellen, die im allgemeinen nur 30-50% CD34&spplus; sind.

Beispiel 7

Reinigung von caninem-Mpl-Liganden

I. Zusammenfassung

Proteine (25 kd und 31 kd), die Aktivitäten aufweisen, die für einen Liganden für den Mpl- Rezeptor vorhergesagt wurden, wurden gereinigt. Die Proteine wurden aus dem Plasma von bestrahlten Hunden nach einem Schema gereinigt, das Weizenkeimagglutinin (WGA)- Affinitätschromatographie, Mpl-Rezeptor-Affinitätschromatographie, Anionenaustausch- chromatographie, Gelfiltrationschromatographie und C4-Umkehrphasen-HPLC verwendet. Siehe, Fig. 4 für einen Überblick dieses Reinigungsschema. Die 25 kd und 31 kd Mpl Liganden sind hoch gereinigt worden zu apparenter Homogenität und man hat bestimmt, daß sie die hierin offenbarten Aminosäuresequenzen enthalten.

II. Verfahren

A. Klärung von Plasma

Gefrorenes Plasma (insgesamt 20 Liter) von bestrahlten Hunden (siehe Beispiel 1) wurde über Nacht bei 4ºC aufgetaut. Das Auftauen größerer Flaschen wurde bei Raumtemperatur für mehrere Stunden begonnen, bevor sie in den Kühlraum gegeben wurden. Unlösliches Material wurde durch Zentrifugation für sechs Stunden bei 11.000 xg entfernt. Das Plasma wurde verdünnt mit Phosphat-gepufferter Saline, pH 7,3, die 0,01% Natriumazid (PBS/Azid) enthielt, und durch ein 1,2 um Filter gefilter. Das Klärverfahren führt typischerweise zu einer etwa 2-fachen Verdünnung des Ausgangsmaterials.

B. Weizenkeimagglutinin-Affinitätschromatographie.

Alle Maßnahmen wurden bei 4ºC durchgeführt. Das geklärte Plasma (in zwei Chargen) wurde auf eine Säule aus immobilisiertem Weizenkeimagglutinin aufgetragen (1 Liter, 10 · 12 cm, E Y Laboratories), äquilibriert in PBS/Azid. Nach Auftragung der Probe wurde ungebundenes Material von der Säule mit PBS/Azid abgewaschen, gefolgt von einem Waschen mit 0,5 M NaCl in 20 mM Tris-HCl, pH 8. Mpl-Liganden-Aktivität, gebunden durch die WGA-Säule, wurde mit 0,35 M N-Acetylglucosamin (GIcNAc), 0,5 M NaCl, 20 mM Tris- HCl, pH 8 eluiert. Mpl-Liganden-Aktivität konnte im Durchfluß oder in den Waschfraktionen nicht nachgewiesen werden.

C. Mpl-X-Rezeptor-Affinitätschromatographie

Der löslich murine Mpl-Rezeptor (Mpl-X), der verwendet wurde, entspricht der vollständigen extrazellulären Domäne des Mpl-Rezeptors ohne Trp an Position 483 (Siehe Vigon, et al., 8: 2607-2615 (1993)). Um Binden von Mpl-Liganden an die Mpl-X-Rezeptor-Affmitätssäule zu optimieren, wurde der WGA-Elutionspool konzentriert unter Verwendung eines Membranul trafilters (Ausschluß bei Molekulargewicht 10.000, YM-10, Amicon) und NaCl- eingestellt auf 0,2 M durch nachfolgende Verdünnung. Der konzentrierte WGA-Pool wurde auf eine 20 ml m-Mpl-X (löslicher muriner Mpl-Rezeptor)/CNBr-aktivierte Sepharose-Säule auftgetragen (2,6 · 4,2 cm, 1,5 mg m-Mpl-X pro ml Harz) bei einer Flußrate von 0,9 ml/min. Die Säule wurde mit 40 ml PBS/Azid bei 1,5 ml/min gewaschen, gefolgt von einem Waschen mit hohem Salzgehalt (405 ml) mit 10 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, 1 mM CHAPS, pH 8,0. Die Säule wurde dann mit 20 mM CAPS, 1 M NaCl, 5 mM CHAPS, pH 10,5 eluiert. Geeignete Fraktionen wurden gesammelt. Tris wurde zu jeder Fraktion hinzugesetzt, um den pH zu neutralisieren.
Sowohl die SDS-PAGE als auch die Absorbanz bei 280 nm des Elutionsprofils einer Mpl-X- Rezeptor-Affinitätssäule offenbaren einen frühen Proteinpeak in Fraktionen 1-4, während die Mpl-Liganden-Hauptaktivität nach Fraktion 5 eluierte.

D. Mono-Q-Anionenaustauschchromatographie

Die reinsten Fraktionen von mehreren Mpl-X-Rezeptoraffinitätssäulen wurden kombiniert, konzentriert und diafiltriert gegen 20 mM Tris-HCl, 5 mM CHAPS, pH 8,7 auf ein Endvolumen von 58,5 ml. Die Proteinkonzentration des Pools wurde durch Absorbanz bei 280 nm auf 0,12 mg/ml (etwa 7 mg Gesamtprotein) geschätzt. Der Pool wurde bei 0,5 ml/min auf eine Mono Q HR 5/5 Säule (Pharmacia), äquilibriert in 20 mM Tris-HCl, 5 mM CHAPS, pH 8,7, geladen. Die Säule wurde mit einem linearen Gradienten auf 0,36 M NaCl im selben Puffer über 27 Minuten eluiert. Die Säule wurde dann gewaschen mit einem 6-minütigen Gradienten auf 0,54 M NaCl und mit einer Schrittwaschung bei 0,9 M NaCl. Fraktionen von 1 ml wurden gesammelt.
Das Elutionsprofil der Mono-Q-Säule zeigt, daß kein Mpl-Ligand und vernachläßigbares Protein im Durchfluß und den Waschfraktionen nachgewiesen werden konnte. Viel der Mpl- Liganden-Aktivität eluiert in Fraktionen 5-7, während der anfänglichen Stufen/Phasen des NaCl-Gradienten. Eine "Aktivitätsschulter" wird in Fraktionen 8-10 beobachtet, gefolgt von einem zweiten Hauptpeak, der Fraktionen 11-15 umfaßt.
Eine distinkte 25 kd-Bande wird in SDS-PAGE (nicht-reduzierend) in den aktiven Fraktionen beobachtet. Die Intensität der Bande entspricht direkt der Mpl-Ligandenaktivität in den Frak tionen. Die Bande fehlte bei Fraktionen 3 und 4 (keine Aktivität). Sie war auffallend in Fraktionen 5 und 6 (1A6.1-Aktivitäts-Peak) und eine ähnliche, intensiv gefärbte Bande war vorhanden in Fraktionen 11-14 (1A6.1-Aktivitäts-Peak). Die Bande ist schwach im Pool von Fraktionen 15 und 16, entsprechend der wesentlich geringeren Aktivität in Fraktion 16.

E. Gelelutionsexperimente

Gelelutionsexperimente wurden durchgeführt unter Verwendung von Aliquots von Mono-Q- Fraktionen 5 und 6 oder Mono-Q-Fraktionen 13 und 14. Für diese Experimente wurden Pools von Fraktionen 5 und 6 (jeweils 6 ul) oder 13 und 14 (jeweils 7,5 ul) hergestellt, mit SDS- PAGE-Probenpuffer (nicht-reduzierend) gemischt und auf 12% SDS-Gele aufgetragen. Nach Abschluß der Elektrophorese wurden interessierende Spuren in Stücke geschnitten (1 mm) und die Stücke mit Rasierklingen in kleine Stücke gewürfelt. Die Stücke wurden in 1,5 ml Mikrofugenröhrchen überführt, die 0,5 ml PBS/5 mM CHAPS enthielten und vorsichtig über Nacht bei 4ºC geschüttelt. Am nächsten Tag wurden die Röhrchen kurz zentrifugiert, ein Aliquot entfernt und die Probe gegen Iscoves Medium diafiltriert, das mit BSA als ein Trägerprotein supplementiert war. Die diafiltrierten Proben wurden einem Test unterzogen.
Die Ergebnisse zeigen, daß zwei Peaks an Mpl-Liganden-Aktivität beobachtet werden können. Ein Peak entspricht der 25 kd-Region des Gels, während ein zweiter Peak an Mpl- Liganden-Aktivität in der 3lkd-Region beobachtet wurde.

F. Superdex 200-Gelfiltration.

Fraktionen 13-16 von der Mono-Q-Anionenaustauschsäule, ebenso wie zwei äquivalente Fraktionen von einer zweiten Mono-Q-Fraktionierung wurden kombiniert und konzentriert unter Verwendung eines Membranultrafilters (Centricon-10, Amicon). SDS wurde zu einer Endkonzentration von 0,1% hinzugegeben und die Säule auf eine Superdex 200 HR 10/30 (Pharmacia)-Säule injiziert. Die Säule wurde in 50 mM Tris-HCl, 0,1% SDS, pH 7,5 bei einer Flußrate von 0,3 ml/min äquilibriert und bei Raumtemperatur betrieben. Fraktionen von einer Minute wurden gesammelt. Die Ergebnisse bestanden darin, daß das meiste des Proteins in der Probe in Fraktionen 32-40 eluierte, wohingegen die Mpl-Liganden-Aktivität in Fraktionen 42-46 nachgewiesen wird. Die Analyse von Fraktionen-SDS-PAGE zeigte eine distinkte 25 kd-Bande in den aktiven Fraktionen.

G. C&sub4;-Umkehrphasen-HPLC.

Superdex 200-Fraktionen 43-46, kombiniert oder Fraktion 42 alleine, wurden konzentriert unter Verwendung eines Membranultrafilters (Microcon-10, Amicon). Die konzentrierten Pools wurden getrennt auf eine 1 · 100 ml C4-Umkehrphasensäule mit Mikrobohrung (Syn- Chropak RP-4) aufgetragen. Die Säule wurde in 0,04% TFA in Wasser (A-Puffer) äquilibriert; B-Puffer war 0,035% TFA in 80% Acetonitril. Nach Injektion der Probe wurde ein Gradient auf 45% B über 4 Minuten angelegt, gefolgt von einem linearem Gradienten auf 75% B über 40 Minuten. Die Flußrate betrug 75 ml/min. Die Reinigungsergebnisse von Fraktion 42 werden in Fig. 5 dargestellt. Distinkte Peaks mit Mpl-Liganden-Aktivität wurden in Fraktionen 21-23 beobachtet. Diese Fraktionen wurden auf einem 14% Polyacrylamidgel unter nicht reduzierenden und reduzierenden Bedingungen analysiert. Fraktion 21 war zusammengesetzt aus einer einzelnen 31 kd-Bande; Fraktion 23 war zusammengesetzt aus einer einzelnen, breiten 25 kd-Bande und Fraktion 22 enthielt Banden sowohl in der 25 kd- als auch 31 kd-Region. Keine anderen signifikanten Banden waren sichtbar. Beachte, daß frühere Gelelutionsexperimente Mpl-Liganden-Aktivität beiden Regionen zugewiesen hatten. Eine einzelne kleinere Bande mit hohem Molekulargewicht wurde in allen Fraktionen des nichtreduzierenden Gels gefunden, konnten aber nicht im reduzierenden Gel beobachtet werden.

H. N-terminale Sequenzanalyse von 25 kd und 31 kd Mpl-Liganden.

N-terminale Sequenzanalyse wurde auf C&sub4;- RP-HPLC-Fraktionen durchgeführt, die Aktivität enthielten. Die für diese Proteine bestimmten Sequenzen sind oben berichtet. Zusätzlich zu der Hauptsequenz entsprechend der 25 kd Bande (wenigstens 90% der gesamten aufgetragenen Probe) wies das Sequenzieren zwei kleinere Sequenzen nach (die mit der kleineren kontaminierenden Bande, die in Teil G oben beschrieben wurde, assoziiert waren). Vergleiche mit bekannten Sequenzen offenbarten, daß die kleineren Sequenzen schwere canine Ig-Kette und Kappa-Kette waren. Wenn erwünscht, konnten diese kleinen Unreinheiten quantitativ durch Anwenden eines weiteren Reinigungsschrittes, wie bevorzugterweise eines weiteren Gelfiltrationsschrittes, verringert werden.

I. Vergleich von Mpl-Liganden-Aktivitäten in den C4-gereinigten Fraktionen.

Fig. 6 zeigt Daten, die belagen, daß die in Fraktionen 22 und 23 von dem C4-RP-HPLC- Chromatographieschritt vorhandenen Aktivitäten im wesentlichen äquivalent sind. Fraktion 22 enthält eine Mischung der 25 und 31 kd Banden, wohingegen Fraktion 23 nur die 25 kd- Bande enthält. Aliquots einer jeder Fraktion wurden 1 : 45.000 verdünnt. Die verdünnten Fraktionen stimulierten 1A6.1-Zellwachstum im wesentlichen gleich (Fraktion 22, 5.400 Zeilen pro Napf; Fraktion 23, 6.00 Zellen pro Napf). Die verdünnten Fraktionen wurden mit zunehmenden Konzentrationen an Mpl-X inkubiert. Die Fraktionen waren gleich empfindlich gegenüber Inhibierung durch Mpl-X, wobei beide vollständig mit 7-1.4 ug/ml blockiert wurden. Dies zeigt an, daß das/die aktive Protein(e) in jeder Fraktion Mpl-Ligandenspezies mit äquivalenter biologischer Aktivität sind.

Beispiel 8

Vergleich von Mpl-Liganden mit anderen Faktoren auf die Entwicklung von Megakaryocyten

Es ist berichtet worden, daß eine Anzahl rekombinanter Faktoren oder organischer Verbindungen, wie Phorbolmyristinacetat (PMA), Megakaryocytenwachstum oder -Entwicklung beeinflussen. Entsprechend wurden die Wirkungen dieser Faktoren auf CD34-ausgewählte Zellen des peripheren Blutes untersucht. Menschliches rekombinantes Interleukin 3 (1L-3, 1-2 ng/ml), Stammzellfaktor (SCF, 50 ng/ml), Interleukin 6 (1L-6, 25 ng/ml), Erythropoietin (EPO, 1 Einheit/ml), Leukämie-inhibierender Faktor (LIF, 10 ng/ml) und Granulocyen- Macrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF, 25 ng/ml, Amgen, Inc.); Interleukin 11 (1L-11, 25 ng/ml, R+D Systems, Minneapolis, MN); Phorbolmyristinacetat (PMA, 1010 M, Sigma) wurden zu Kulturen zugesetzt, wie angegeben. Mpl-Ligand wurde bei 275 Einheiten/ml verwendet, APK9 wurde bei 5% (entsprechend 220 Einheiten/ml) verwendet. Die in Kombination getesteten Faktoren lagen in der gleichen Konzentration vor, wie wenn sie einzeln getestet wurden. Nach 8 Tagen in Kultur wurden die Zellen direkt in den Näpfen fixiert und auf Megakaryocyten gefärbt (n = 6 Näpfe pro Zustand) oder auf Gesamtzellzahl gezählt (n = 3 Näpfe pro Zustand). Die Daten sind als Mittel +/- SEM dargestellt.
Fig. 7 zeigt, daß APK9 und Mpl-Ligand zur größten Anzahl an Megakaryocyten pro Napf führten. 1L-3 führte auch zu Megakaryocyten-Entwicklung, insbesondere in Kombination mit SCF. 1L-6, 1L-11 oder EPO hatten eine geringe Wirkung auf Megakaryocytenzahlen, entweder alleine oder in Kombination mit 1L-3. PMA, LIF und GM-CSF hatten eine geringe Wir kung. In Fig. 8 sind Daten von demselben Experiment, die die Gesamtzahl an pro Napf gefundenen Zellen ("Zellularität") zeigen. APK9 und Mpl-Ligand hatten geringe Wirkung; auf Zellularität, wohingegen 1L-3 und SCF bescheidene Wirkungen aufwiesen. SCF und 1L-3 in Kombination wiesen die größten Wirkungen auf. Die in FIGS. 7 und 8 gezeigten Daten wurden verwendet, um Prozentzahlen an Megakaryocyten pro Napf zu berechnen, wie in Fig. 9 gezeigt. Der Faktor, der zum höchsten Prozentsatz an Megakaryocyten pro Kulturnapf führt, ist klar Mpl-Ligand, der aktive Bestandteil in APK9. Dies zeigt die Spezifität von Mpl- Liganden hinsichtlich Megakaryocyten.

Beispiel 9

Die Megakaryocyten-fördernde Aktivität von Mpl-Liganden hängt nicht von menschichem IL-3 ab

Mpl-Ligand stimulierte die Entwicklung von menschlichen Megakaryocyten, wenn er als eine Ergänzung zu dem in Beispiel 2 beschriebenen Kulturmedium verwendet wird. Obwohl 1L-3 kein Bestandteil des Mediums ist, könnte es in nicht-nachweisbar geringen Mengen im normalen menschlichen Plasma vorhanden sein, das im Medium vorhanden ist. Selbst wenn es vorhanden ist, ist 1L-3 jedoch nicht bei der Mpl-Liganden-induzierten Megakaryopoese beteiligt. Dies ist in Fig. 10 gezeigt. 1L-3 enthält bei 2 ng/ml eine Aktivität im Menschen meg- Test von 14.900 meg-Einheiten/ml. Diese Aktivität wird zu 97% mit anti-1L-3 (3, 3 ug/ml; Genzyme, Cambridge, MA) inhibiert. Mpl-Ligand bei 8203 meg-Einheiten/ml wurde nicht mit anti-1L-3 inhibiert.

Beispiel 10

Analyse von Mpl-Liganden vom Schwein.

J. Zusammenfassung

Proteine von Plasma von bestrahlten Schweinen mit Mpl-Liganden-Aktivität wurden mit WGA-Affinitätschromatographie, Mpl-Rezeptor-Affinitätschromatographie, Ionenaustauschchromatographie und C&sub4;-Umkehrphasen-HPLC charakterisiert. Die Aktivität wurde auch durch Elution von Stücken aus SDS-Polyacrylamidgelen charakterisiert.

Beispiel 11

Klonieren des menschlichen Mpl-Liganden, menschlicher MGDF

Zwei Ansätze werden im folgenden dargestellt:

I. Erster beispielhafter Klonierungsansatz

A. Erzeugen einer Sonde für menschlichen MDGF

Eine Anzahl degenerierter PCR-Primer wurden konstruiert auf der Grundlage der Aminoterminussequenz des caninen Proteins. Verschiedene Primer-Paare wurden verwendet, um das MGDF-Gen von menschlicher genomischer DNA zu amplifizieren. Nach 40 Amplifikationszyklen unter Verwendung der Sense-Primer 5' GCN CCN CCN GCN TGY GA 3' (SEQ ID NO : 4), kodierend für die ersten fiinf Aminosäuren des caninen Proteins (SEQ a NO : 1) und der Antisense-Primer: 5' GCA RTG YAA CAC RTG NGA RTC 3' (SEQ a NO : 5), kodierend für Aminosäuresequenzen 16 bis 21 von SEQ ID NO : 1 wurde das PCR-Produkt auf einem 2% Agarosegel in TBE-Puffer laufen gelassen.
Die 63 bp Bande wurde aus dem Agarosegel ausgeschnitten und unter Verwendung des gleichen Primer-Satzes erneut amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde in den PCR II-Vektor (Invitrogen, San Diego) kloniert. Eine Anzahl Kolonien wurden durch DNA-Sequenzierung gescreent. Die Plasmid-DNA, die ein Peptid ähnlich dem caninen MGDF-Protein kodiert, wurde als die Quelle verwendet, um eine radioaktive Sonde zu erzeugen, um die cDNA-Genbanken zu screenen. Die durch das Genfragment kodierte Aminosäuresequenz lautet wie folgt:
Die den menschlichen MGDF enthaltende Agarose-Bande wurde verwendet, um die Sonde durch heiße PCR zu erzeugen. Eine typische PCR-Reaktion von 100 ul enthielt die folgenden Bestandteile:
Matrizen-DNA 2-3 ul
5' Primer (SEQ a NO : 4) 1 ul, 20 pMol
3' Primer (SEQ ID NO:S) 1 ul, 20 pMol
10 · Puffer 10 ul
dATP (0,1 mM) 2 ul
dTTP (10 mM) 2 ul
dGTP(10mM) 2ul
cCTP (0,1 mM) 2 ul
dCTP, P³² (10 uC/ul) 5 ul
dATP, P³² (10 uC/ul) S ul
Taq-DNA-Polymerase 0,5 ul, 2,5 Einheiten
Wasser 77 ul
Gesamtvolumen 100 ul
Die Amplifikationsbedingungen waren wie folgt:
anfängliches Aufheizen 94ºC, 2 Min.
Anellieren 53ºC, 30 Sek.
Verlängerung 72ºC, 30 Sek.
Denaturierung 94ºC, 30 Sek.
40 Amplifikationsrunden wurden in einem Perkin Eimer GeneAmp System 9600 durchgeführt.
Das Produkt wurde gereinigt, indem es durch eine Drucksäule geleitet wurde (Stratagene, San Diego). Ein 1 ul der Sonde wurde in einem Scintillationszähler gezählt. Proben, die 1 bis 3 Millionen Zähler pro ml enthielten, wurden zu der Hybridisierungsmischung zugegeben.

B. Konstruktion einer Genbank von fötaler Leber

PolyA&spplus;-RNA von menschlicher fötaler Leber wurde von Clontech Laboratories gekauft. Etwa 4 ug RNA wurden für cDNA-Synthese verwendet, bei der das Primen durchgeführt wurde unter Verwendung eines Zufallshexamers, 5' GTA CGC GTT CTA GAN NNN NNT 3' (SEQ ID NO : 7), das an ein Oligo geknüpft war, das eine Xba-I-Stelle enthält.
Das Gibco-BRL-Protokoll wurde verwendet, um die doppelsträngige cDNA zu erzeugen. Der Eco R I-Bst X I-Adaptor (Invitrogen, San Diego) wurde an die doppelsträngige cDNA ligiert, gefolgt von Verdau mit dem Restriktionsenzym Xba I. Größenselektion der cDNA wurde auf einer S500 Sephacryl-Säule (Life Technologies, Inc.) durchgeführt, cDNAs größer als 400 bp wurden an den Säugerexpressionsvektor v19.8 (Martin, F., Cell 63 : 203-211 (1990)) ligiert, der bereits mit Eco RI und Xba I verdaut war. Kompetente E. coli DH10-Zellen wurden transformiert und die resultierende cDNA-Genbank in sieben Pools mit jeweils 100.000 cDNA aufgeteilt.

C. Screenen der Lambda-Genbank

Eine Genbank von menschlicher fötaler Niere in Lambda gtl 1 wurden von Clontech mit einem Titer von 650 Millionen Pfu/ml gekauft. Etwa 2 Millionen Plaques wurden mit einer Sonde gescreent, die durch PCR erzeugt war (siehe oben). Hybridisierung wurde in 6 · SSC, 5 · Denhardt, 0,1% SDS, 100 ug/ml einzelsträngiger Lachssperma-DNA für 15 Stunden bei 56ºC durchgefühirt.
Mehrfache Screeningrunden wurden durchgeführt. DNA wurde von Einzelplaques amplifiziert und mit dem internen Primer 5' AGT TTA CTG AGG ACT CGG AGG 3' (SEQ ID NO: 8) hybridisiert, der die Aminosäuren 7 bis 13 in SEQ a NO : 6 kodierte, um die echten Positiven zu identifizieren.

D. 3 prime-schnelle Amplifikation von cDNA-Enden (RACE)

Polyadenylierte RNA von menschlicher fötaler Niere und fötaler Leber wurde von Clontech gekauft. Ein Mikrogramm RNA wurde revers transkribiert unter Verwendung des Oligos 5' TTC GGC CGG ATA GGC CTT III ITT TTT TTT 3' (SEQ ID NO : 9) als Primer.
Der Gibco-BRL cDNA-Synthesekit (Life Technologies Inc., Cat. # 18267-013) wurde verwendet, um die Erststrang-cDNA zu erzeugen. Das Endvolumen betrug 30 ul. Die Reaktion wurde durch Hinzufügen von 500 mM EDTA auf eine Endkonzentration von 10 mM gestoppt und bei -20ºC gehalten.
Für anfängliche PCR wurde 0,5 ul cDNA als die Matrize pro Reaktion verwendet. Der Primer SEQ a NO : 9 und das Kompetitor-Oligo-5' TTC GGC CGG ATA GGC CTT TTT TTT ITT TT-P 3' (SEQ a NO : 10) wurden verwendet als die antisense-Primer, während das Oligonukleotid 5' TGC GAC CTC CGA GTC CTC AG 3' (SEQ a NO : 11), das für Aminosäuren 5 bis 11 von SEQ a NO : 6 kodierte, als der sense-Primer verwendet wurde. Vierzig; Am plifikationsrunden wurden durchgeführt unter Verwendung des folgenden Protokolls: 94·ºC, 30 Sek; 65ºC, 30 Sek; 72ºC, 30 Sek, nach einer anfänglichen 2-minütigen Inkubation bei 94ºC. Für die Amplifikation wurde ein Perkin Eimer GeneAmp System 9600 verwendet.
Das Ineinanderschachteln wurde ausgeführt unter Verwendung des sense-Primers 5' GAG TCC TCA GTA AAC TGC TTC GT 3' (SEQ a NO : 12), der für Aminosäuren 8 bis 14 von SEQ ID NO : 6 kodiert, während SEQ a NO : 9 und SEQ a NO : 10 als die antisense-Primer dienten. Vierzig Ampliflkationsrunden wurden durchgeführt mit Anellieren bei 45ºC. Die PCR-Produkte wurden auf einem 0,8% Agarosegel laufengelassen und dann unter UV-Licht photographiert. Es waren Banden um 0,8 bis 1, 2 kb sichtbar.
Die PCR-Produkte wurden dann in den Vektor PCR 11 (Invitrogen) kloniert. Einzelne Kolonien wurden aufgenommen und Plasmide wurden isoliert unter Verwendung des Qiagen-:Kits Katalognr. 12143 und 12145. Doppelstrangiges Farbstoff geprimtes Sequenzieren wurde durchgeführt unter Verwendung der Vektorprimer. Die Sequenzen wurden durch verschiedene Typen von GCG-Software analysiert.

E. 5' und 3'-Primerverlängerung

Um die Sequenz des MGDF-Gens in seiner ganzen Länge zu isolieren, wurden 3'- und 5'- Primerverlängerungen ausgeführt unter Verwendung verschiedener Pools der Genbank von fötaler Leber als die Matrize. Für die Amplifikation der 5 Primer der cDNA wurden etwa 20 ng cDNA von einem jeden Pool als Matrize verwendet. Ein MGDF-spezifischer antisense- Primer 5' GGA GTC ACG AAG CAG TTT AC 3' (SEQ ID NO : 13), der für Aminosäuren 12 bis 17 von SEQ ID NO : 6 kodiert, und der 5'-Vektor v19.8-sense-Primer 5' CCT hA CTT CTA GGC CTG 3' (SEQ ID NO : 14) wurden verwendet. Amplifikation wurde für 30 Zyklen mit Anellieren bei 53ºC ausgeführt. Ineinanderschachteln wurde vorgenommen für 30 Zyklen mit den antisense-Primern 5' GAG GTC ACA AGC AGG AGG A 3' (SEQ a NO: 15) , der für Aminosäuren 1 bis 6 von SEQ ID NO : 6 kodierte, und dem Vektorprimer SE'Q ID NO : 14.
Für die Primerverlängerung der 3'-Enden der MGDF-cDNAs wurden der antisense- Vektorprimer 5' GGC ATA GTC CGG CAC GTC G 3' (SEQ ID NO : 16) und der MCDF- spezifische Primer S' TCC TCC TGC TTG TGA. CCT C 3' (SEQ a NO : 17), der für Ami nonsäuren 1 bis 6 von SEQ ID NO: 6 kodiert, verwendet. Die Amplifikation wurde für 30 Zyklen mit Anellieren bei 58ºC durchgeführt.
Ineinanderschachtelungsamplifikation für 30 Zyklen wurde durchgeführt unter Verwendung der MGDF-Primer SEQ ID NO : 16. Spezifische Banden erschienen in Pools mit den Nummern 1, 7 und 8, die in den PCR 11-Vektor kloniert wurden. Gereinigte Plasmid-DNA von Einzelkolonien wurde gereinigt und sequenziert.

F. Isolieren von vollständigen Klonen von menschlichem MGDF

Vielen der anfänglichen Klone mangelt es an einem Teil des Aminoterminus von MGDE, da ein Teil der MGDF-Sequenz nicht zum Primen und Ineinanderschachteln verwendet wurde. Primer 5' CCA GGA AGG ATT CAG GGG A 3' (SEQ a NO : 18), dessen Sequenz von den fünf Primerverlängerungsexperimenten erhalten wurde, wie oben beschrieben, wurde als der sense-Primer verwendet. Der Vektorprimer-SEQ a NO : 16 diente als der antisense-Primer. 35 Amplifikationsrunden wurden ausgeführt mit Anellieren bei 58ºC. MGDF-spezifischer Primer 5' CAA CAA GTC GAC CGC CAG CCA GAC ACC CCG 3'(SEQ a NO : 19) mit einer Sal I-Stelle und der Vektorprimer (SEQ a NO : 15) wurden zum Ineinanderschachteln für 35 Zyklen verwendet. Das PCR-Produkt wurde in PCR II-Vektor kloniert und sequenziert.

II. Zweiter beispielhafter Klonierunsgansatz

A. Klonierung von caniner MGDF-N-Terminus-cDNA

Degenerierte Oligonukleotidprimer wurden konstruiert auf der Grundlage der caninen MGDF-N-Terminus-Aminosäuresequenz, die in dem obigen Abschnitt beschrieben wurde, und als Primer bei Polymerase-Kettenreaktionen (PCRs) verwendet, um MGDF-kodierte cDNA-Sequenzen zu amplifizieren. Gesamt-RNA wurde hergestellt von caninen Nieren- Proben durch das Guanidinium-Isothiocyanat-Verfahren von Chomzynski und Sacchi (Biochem. 162 : 156-159 (1987)). Erststrang-cDNA wurde hergestellt mit einem Zufallspimer- Adapter 5' GGC CGG ATA GGC CAC TCN NNN NNT 3' (SEQ a NO : 20) unter Verwendung von MoMULV reverser Transkriptase und als Matrize in nachfolgenden PCRs verwendet.
PCR wurde an 0,5 Mikrolitern durchgeführt, etwa 50 ng, der cDNA unter Verwendung von Primer A 5' GCN CCN CCN GCN TGY GA 3' (SEQ a NO : 4), ein sense-Strangprimer kodierend für Aminosäuren 1-6 von SEQ ID NO : 1, und entweder Primer B S' GCA RTG NAG NAC RTG NGA RTG 3' (SEQ ID NO : 5) oder Primer C S' GCA RTG YAA NAC RTG NGA RTC 3' (SEQ ID NO : 21), die antisense-Strangprimer sind und für Aminosäuren 16 bis 21 von SEQ ID NO : 1 mit drei zusätzlichen Nukleotiden an den 5'-Termini kodieren, um Anellierungstabilität zu erhöhen. PCR mit Taq-Polymerase wurde für 35 bis 45 Zyklen durchgeführt, bis Produktbanden in der agarosegelelektrophoretischen Analyse sichtbar waren. Für die ersten zwei Zyklen der PCR wurde der Reanellierungsschritt durchgeführt bei 37ºC für zwei Minuten. Für den Rest der Zyklen wurde Anellieren bei 50ºC für eine Minute durchgeführt. Mehrfachproduktbanden wurden in jeder Reaktion beobachtet. Teile des Gels, die Banden von etwa der erwarteten Größe (66 bp) enthielten, wurden gesammelt mit der Spitze einer Pasteurpipette und erneut amplifiziert mit demselben Primer-Paar. Die DNA- Produkte wurden in Vektor PCR 11 (Invitrogen) kloniert entsprechend den Anweisungen des Herstellers. Drei Klone wurden sequenziert und man fand, daß sie, in einem Leserahmen, die erwartete canine MGDF-Sequenz, Reste 1 bis 21, kodierten. Auf diesem Wege wurde eine einzigartige canine MGDF-cDNA-Sequenz erhalten, die sich von der Region von dem dritten Nukleotid von Codon 6 bis zum dritten Nukleotid von Codon 15 erstreckt. Einer dieser Klone diente als die Matrize zur Herstellung einer markierten caninen MGDF-cDNA-Sonde.

B. Konstruktion von cDNA-Genbank von menschlicher fötaler Leber

RNA ist von menschlicher fötaler Leber (International Institute for the Advancement of Medicine, Exton, PA) durch Gewebelyse in 5, 5 M Guanidiniumthiocyanat und Reinigung mittels CsTFA (Pharmacia)-Zentrifugation isoliert worden. Polyadenylierte RNA wurde ausgewählt unter Verwendung von Oligo (dT)25-Dynabeads (Dynal, entsprechend den Anweisungen des Herstellers). Doppelsträngige cDNA wurde von dieser RNA unter Verwendung von Superscript-Plasmid-System für cDNA-Synthese (Life Technologies, Inc.) verwendet mit der Ausnahme, daß ein anderer Linker-Adaptor: S' TTG GTG TGC ACT TGT G 3' (SEQ ID NO: 22) und 5' CAC AAG TGC ACA CCA ACC CC 3' (SEQ ID NO : 23) verwendet wurde. Nach Größenselektion wurde diese cDNA direktional in die Bst XI und Not I-Stellen des Säugerexpressionsvektors pBCB (pBCB ist abgeleitet vom Plasmid Rc/CMV, Invitrogen, umfassend das puc 19 Rückgrad, den CMV-Promotor und die BGH-Polyadenlyrierungsstelle) inseriert. Die ligierte DNA wurde in den elektrokompetenten Bakterienstamm 10B (Life Technologies, Inc.) elektroporiert.

C. Screenen von cDNA-Genbank von menschlicher fötaler Leber auf MGDF

Filterreplikate der Genbank von menschlicher fötaler Leber wurden gegen radioaktiv markiertes canines N-Terminus-cDNA-PCR-Produkt (5x SSPE, 2 · Denhardt's, 0,05% Natriumpyrophosphat, 0,5% SDS, 100 ug/ml Hefe-tRNA-Lysat und 100 ug/ml denaturierte Lachssperma-DNA) bei 64ºC für 18 Stunden hybridisiert. Die Filter wurden gewaschen bei 64º'C in 5 · SSPE, 0,5% SDS und über Nacht exponiert. Zwei verschiedene Klone, die an diese Sonde hybridisierten, wurden isoliert und analysiert.

D. Expression von cDNA-Klonen von menschlichem MGDF

Gereinigte cDNA von MGDF-cDNA-Klonen wurde transfiziert in 293 EBNA-Zellen (Invitrogen). 1,5 ug DNA wurden gemischt mit 7,5 ul Lipofektamine (Life Technologies, Inc.) in 100 ul serumfreiem DMEM. Nach einer 20-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wurde die DNA-Lipofectamin-Mischung zu 5 · 105-Zellen/Napf (quadratische Greiner-Platte mit 24 Näpfen) in 400 ul DMEM, 1% Serum (Fetal Clone 11) zugegeben und für sechs Stunden bei 37ºC inkubiert. 500 ul DMEM, 20% Serum (Fetal Clone 11) wurde zu den Zellen zugesetzt. 16 Stunden später wurde das Medium abgesaugt und 500 ul DMEM, 1% Serum (Fetal Clone 11) wurde hinzugesetzt. 72 Stunden später wurde das konditionierte Medium gesammelt und durch einen 0,22 Micron Rotationsfilter zentrifugiert. Das konditionierte Medium wurde auf biologische MGDF-Aktivität getestet.

III. Beschreibung und Aktivität von menschlichen MGDF-Klonen

Auf der Grundlage der oben beschriebenen Klonierungstrategien wurden die in Fig. 11 (MGDF-1 und MGDF-2; SEQ ID NOS: 24, 25 und 26, 27) und Fig. 12 (MGDF-3; SEQ a NOS: 28, 29) gezeigten menschlichen cDNA-Klone erhalten. Eine jede dieser Sequenzen in den Figuren enthält eine mutmaßliche Signalsequenz von Aminosäuren 1 bis 21, so daß in jedem Fall die reifen Proteine bei Aminosäure 22 starten.
Die Ergebnisse von Aktivitätstest unter Verwendung des Zell-basierten Tests, beschrieben in Beispiel 4A oben, mit MGDFs 1-3 sind in Tabellen 3 und 4 unten gezeigt. In Tabelle 3 wurde konditioniertes Medium von mit einem jeden Konstrukt transfizierten 293 EBNA-Zellen nach 2 Tagen in Kultur gesammelt, dann auf 1A6.1-Zellen (32D/mur-MPL+) +/- 10 ug/ml mur- MPL-X getestet. In Tabelle 4 wurde konditioniertes Medium von mit jedem Konstrukt transfizierten 293 EBNA-Zellen nach vier Tagen in Kultur gesammelt, und dann auf sowohl 32D/mur-MPL+-Zellen (Beispiel 3A) als auch 32D/hu-MPL+-Zellen (Beispiel 3B) getestet. Wie ersichtlich, stellte man fest, daß menschlicher MGDF-1 und MGDF-2, nicht aber MGDF-3 bei Zellinien aktiv ist, die sowohl murine als auch menschliche Formen von Mpl exprimieren. Die den menschlichen Mpl-Rezeptor exprimierende Zelle antwortet stärker auf menschlichen MGDF-1 und MGDF-2, als die Zellinie, die den murinen Mpl-Rezeptor exprimiert. Tabelle 3 Tabelle 4
Die nachfolgende Tabelle 5 zeigt, daß die Aktivitäten von menschlichem MGDF-1 und MGDF-2 auf 32DIhu-MPL+-Zellen (Beispiel 3B) im wesentlichen vollständig durch löslichen menschlichen Mpl-Rezeptor (hu-MPL-X) inhibiert werden. Hu-MPL-X war als konditioniertes Medium vorhanden, das von CHO-Zellen, die das Protein produzieren, gesammelt wurde. Das CHO-hu-MPL-X-konditionierte Medium wurde 120-fach konzentriert, dann zu den Kulturen zu 6, 6% zugegeben. Konditioniertes Medium von Kontroll-CHO-Kulturen wies im Test keine Wirkung auf. Der Test wurde durchgeführt, wie in Beispiel 4B beschrieben, ausgenommen, daß die lebenden Zellen nach drei Tagen bewertet wurden. Tabelle 5

Menschenmegakaryocytentest

MGDF-1 und MGDF-2, nicht aber MGDF-3, induzierten die Bildung von Megakaryocyten von CD34-ausgewählten Zellen aus peripherem Blut. Das in Tabelle 6 beschriebene Experiment wurde im wesentlichen wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt, ausgenommen, daß die Zellen des peripheren Blutes ohne Abschwemmen CD34-ausgewählt waren und die Kultur nach sieben Tagen geerntet wurde. Konditioniertes Medium von einem jeden 293-EBNA- MGDF-Konstrukt wurde verwendet bei 20% Endvolumen +/- 30 ug/ml mur-MPL-X. APK9- Kontrolle wurde bei 6% Endvolumen verwendet. Tabelle 6

Beispiel 12

Das folgende Beispiel beschreibt die Synthese von 12 verschiedenen mit PEG versehenen MGDF-Moleküle, PEG 9 - PEG 12 und PEG 14 - PEG 21. In einem jeden Fall war das mit PEG versehene MGDF-Molekül von E. coli gewonnener MGDF-11 (Aminosäuren 22-184, gezählt vom Anfang des Signalpeptids, oder Aminosäuren 1 bis 163, gezählt vom Anfang des reifen Proteins). Details betreffend all diese mit PEG versehenen Spezies sind in den Tabellen 7 bis 10 unten zusammengefaßt.

12. 1 Herstellen von poly-MePEG-MGDF-Konjugaten durch MGDF-Acylierung mit aktivierten MePEG-Derivaten

Herstellen von poly-MePEG(20kDa)-MGDF-Konjugat (PEG 11)

Eine gekühlte (4ºC)-Lösung von MGDF (2,5 mg/ml) in 0,1 M BICINE-Puffer, pH 8, wurde zu einem zehnfachen molaren Überschuß an festem MePEG-Succinimidyl-Propionat (MW 20 kDa) (Shearwater Polymers, Inc.) zugegeben. Das Polymer wurde gelöst durch vorsichtiges Rühren und die Reaktion weiter bei Raumtemperatur durchgeführt.
Der Umfang der Proteinmodifizierung während des Verlaufs der Reaktion wurde überwacht durch Größenausschluß (SEC)-HPLC unter Verwendung einer Superdex 200 HR 10/30-Säule (Pharmacia Biotech), die mit 0,1 M Natriumphosphat-Puffer pH 6,9 bei 0,7 ml/Min. eluiert wurde.
SEC-HPLC-Analyse der Reaktionsmischung beim 30 Minuten-Zeitpunkt zeigte an, daß kein freies Protein in der Reaktionsmischung verblieben war. An diesem Punkt wurde die Protein- Konzentration in der Reaktionsmischung auf 1 mg/ml durch Hinzufügen von sterilem Wasser vernngert und der pH der Mischung auf 4 mit mehreren Tropfen 0,5 M Essigsäure eingestellt.
MePEG-MGDF-Konjugat wurde von dem überschüssigen MePEG und anderen Rekationsnebenprodukte durch Ionenaustauschchromatographie unter Verwendung von SP-Sepharose HP (Pharmacia Biotech) Ionenaustauschharz abgetrennt.
Die Reaktionsmischung wurde auf die Säule geladen (2,5 mg/ml Harz) und das nicht umgesetzte MePEG wurde mit 3 Säulenvolumina des Startpuffers A (20 mM Natriumphosphat, pH 7,2, 15% Glycerin) eluiert. Danach wurde das MePEG-MGDF-Konjugat unter Verwendung eines linearen Gradienten von 0% bis 30% in 10 Säulenvolumina des Endpuffers B (1 M NaCl in Puffer A) eluiert. Das Eluat wurde überwacht bei 280 nm. Fraktionen, die poly- MePEG-MGDF-Konjugat enthielten, wurden vereinigt, konzentriert und sterilfiltriert.
Das gereinigte poly-MePEG-MGDF-Konjugat wurde durch HPLC-SEC analysiert unter Verwendung von TSK-GEL G4000SWXL- und G2000SWXL-Gelfiltrationssäulen, die in Serie verbunden waren. Proteine wurden durch UV-Absorbanz bei 280 nm nachgewiesen. BIORAD-Gelfiltration-Standards dienten als Gewichtsmarker für globuläre Proteine.
Wie in Fig. 17A zu sehen ist, offenbart HPLC-SEC zwei Hauptkomponenten im Präparat (in etwa einem Verhältnis von 2 : 1), deren Elutionspositionen denen von 370,9 kDa bzw. 155,0 kDa globulären Proteinen entspricht. Siehe auch Tabelle 8 unten.
Die Konjugate PEG 9, PEG 10 und PEG 12, die durch MGDF-Acylierung mit Succinimidylestern mit MW = 6-SO kDa MePEGs hergestellt wurden, wurden ähnlich gehandhabt. Die Hauptreaktionsparameter, die bei diesen Präparaten verwendet wurden, sind in Tabelle 7 zusammengefaßt.
Ergebnisse von HPLC-SEC-Analysen dieser Konjugate sind in Tabelle 8 gezeigt.

12.2. Herstellung von poly-MeaPEG-MGDF-Konjugaten durch reduktive Alkylierung von MGDF mit MePEG-Aldehyden

Herstellung von poly-MegPEG(20kDa)-MGDF-Koniugat (PEG 20)

Zu einer gekühlten (4ºC), gerührten Lösung von MGDF (2 ml, 2,5 mg/ml) in 100 mM Natriumphosphat, pH S. enthaltend 20 mM NaCNBH3 wurde ein 10-facher molarer Überschuß an Monomethoxy-Polyethylenglycolaldehyd (MePEG) (durchschnittliches Molekulargewicht 20 kDa) zugegeben und das Rühren der Reaktionsmischung wurde bei der gleichen Temperatur fortgesetzt.
Der Umfang der Proteinmodification während des Verlaufs der Reaktion wurde überwacht durch SEC-HPLC unter Verwendung von Superdex 200 HR 10/30-Säule (Pharmacia I3iotech), die mit 0,1 M Natriumphosphatpuffer pH 6,9 bei 0,7 ml/Min. eluiert wurde.
Nach 16 Stunden zeigte die SEC-HPLC-Analyse an, daß mehr als 90% der anfänglichen lProteinmenge modifiziert worden ist. Zu diesem Zeitpunkt wurde die Proteinkonzentration in der Reaktionsmischung auf 1 mg/ml durch Verdünnen der Reaktionmischung mit sterilem Wasser gebracht und der pH auf 4 eingestellt (0,5 M Essigsäure).
MePEG-MGDF-Konjugat wurde von dem Überschuß an MePEG und anderen Reaktionsnebenprodukten durch Ionenaustauschchromatographie unter Verwendung von SP Sepharose HP (Pharmacia Biotech)-Ionenaustauschharz entfernt.
Die Reaktionsmischung wurde auf die Säule geladen (2,5 mg/ml Harz) und das nicht umgesetzte MePEG wurde mit 3 Säulenvolumina des Startpuffers A (20 mM Natriumphosphat, pH 7,2, 15% Glycerin) eluiert. Danach wurde das MePEG-MGDF-Konjugat unter Verwendung eines linearen Gradienten von 0% bis 30% in 10 Säulenvolumina des Endpuffers B (I M NaCl in Puffer A) eluliert. Der Eluent wurde bei 280 nm überwacht. Fraktionen, die poly- MePEG-MGDF-Konjugat enthielten, wurde vereinigt, konzentriert und sterilfiltriert.
Das gereinigte poly-MePEG-MGDF-Konjugat wurde durch HPLC-SEC analysiert unter Verwendung von TSK-GEL G4000SWXL- und G2000SWXL-Gelfiltrationssäulen, die in Serie gekoppelt waren. Proteine wurde durch UV-Absorbanz bei 280 nm nachgewiesen. BIORAD-Gelfiltrationsstandards dienten als Gewichtsmarker für globuläres Protein.
Wie aus Fig. 17B ersichtlich, enthüllt HPLC-SEC zwei Hauptkomponenten (die 52% und 47% der Gesamtmenge ausmachen) im Präparat, deren Elutionspositionen jenen von 359,4 kDa bzw. 159,3 kDa globulären Proteinen entsprechen. Siehe auch Tabelle 8.
Die Konjugate PEG 18, PEG 19 und PEG 21, durch reduktive Alkylierung von MGDF-PIEG- Aldehyden mit MW = 6-25 kDa hergestellt, wurden in ähnlicher Weise gehandhabt. Die Hauptreaktionsparameter, die bei diesen Präparationen verwendet wurden, sind in Tabelle 7 zusammengefaßt.
Ergebnisse von HPLC-SEC-Analysen dieser Konjugate sind in Tabelle 8 gezeigt.

12.3. Herstellung von Monomethoxy-Polyethylenglycol-MGDF-Konjugaten mit der Anknüpfungsstelle am N-terminalen a-Aminorest

Herstellung von mono-MePEG (20 kDa)-MGDF-Konjugat (PEG 16)

Zu einer gekühlten (4ºC), gerührten Lösung von MGDF (2 ml, 2,5 mg/ml) in 100 mM Natriumphosphat, pH 5, enthaltend 20 mM NaCNBH&sub3;, wurde ein 5-facher molarer Überschuß von Methoxypolyethylenglycolaldehyd (MePEG) (mittleres Molekulargewicht 20 kDa) zugegeben und das Rühren der Reaktionsmischung wurde bei derselben Temperatur fortgesetzt. Der Umfang der Proteinmodifikation während des Reaktionsverlaufes wurde überwacht durch SEC-HPLC unter Verwendung von Superdex 200 HR 10/30-Säule (Pharmacia Biotech), die mit 0,1 M Natriumphosphatpuffer pH 6,9 bei 0,7 ml/Min. eluiert wurde.
Nach 16 Stunden zeigte die SEC-HPLC-Analyse an, daß etwa 90% der anfänglichen Menge des Proteins modifiziert worden war. Zu diesem Zeitpunkt wurde die Proteinkonzentration in der Reaktionsmischung auf 1 mg/ml durch Verdünnen mit sterilem Wasser verringert und der pH der Reaktionsmischung auf 4 (0,5 M Essigsäure) eingestellt.
Das mono-MePEG (20 kDa)-MGDF-Konjugat wurde vom Überschuß an MePEG und anderen Reaktionsnebenprodukten durch Ionenaustauschchromatographie unter Verwendung von SP Sepharose HP (Pharmacia Biotech)-Ionenaustauschharz abgetrennt.
Die Reaktionsmischung wurde auf die Säule geladen (2,5 mg/ml Harz) und das nicht umgesetzte MePEG wurde mit 3 Säulenvolumina Startpuffer A (20 mM Natriumphosphat, pH 7,2, 15% Glyzerin) eluiert. Danach wurde das MePEG-MGDF-Konjugat eluiert unter Verwendung eines linearen Gradienten von 0% bis 25% des Endpuffers B (1 M NaCl in Puffer A) in 20 Säulenvolumina. Der Eluent wurde überwacht bei 280 nm. Fraktionen, die poly-MePEG- MGDF-Konjugat enthielten, wurden vereinigt, konzentriert und sterilfiltriert.
Die Homogenität der mono-MePEG-MGDF-Konjugate wurde bestimmt durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter Verwendung von 4-20% vorgegossenen Gradientengelen (NOVEX). Eine Hauptbande entsprechend der Position eines 46,9 kDa- Proteins wurde gezeigt.
Das gereinigte poly-MePEG-MGDF-Konjugat wurde durch HPLC-SEC analysiert unter Verwendung von TSK-GEL G4000SWXL- und G2000SWXL-Gelfiltrationssäulen, die in Serie gekoppelt waren. Proteine wurden durch UV-Absorbanz bei 280 nm nachgewiesen. Die BIO-RAD-Gelfiltrationsstandards dienten als Molekulargewichtsmarker für globuläre Proteine.
Wie aus Fig. 17C ersichtlich, enthüllt SEC-HPLC eine Hauptkomponente im Präparat, deren Elutionspositionen denjenigen eines globulären 181,1 kDa-Proteins entsprechen. Siehe auch Tabelle 9.
Mono-MePEG-MGDF-Konjugate PEG 14, PEG 15 und PEG 17, die durch reduktive MGDF- Alkylierung hergestellt wurden mit MePEG-Aldehyden mit MW = 6-25 kDa, wurden in ähnlicher Weise gehandhabt. Die Hauptreaktionsparameter, die bei diesen Präparaten verwendet wurden, sind in Tabelle 7 zusammengefaßt.
Ergebnisse der HPLC-SEC-Analysen dieser Konjugate sind in Tabelle 9 gezeigt. Tabelle 7 Zusammenfassung der MGDF-Modifikationsreaktionsparameter Tabelle 8 Zusammenfassung der poly-MePEG-MGDF-Charakteristiken nach SEC-HPLC Tabelle 9 Molekulargewichte von mono-MePEG-MGDF-Konjugaten

12.4 Herstellung von DiMePEG (12 kDal-MGDF-Konjugaten durch reduktive Alkylierung von MGDF mit Methoxpoly(ethylenglycol)aldehyd (PEG 22)

Die folgende Verfahrensweise führt zu einem gereinigten Molekül, das hierin als PEG 22 bezeichnet wird.
Ein S-facher Überschuß an Methoxypolyethylenglycolaldehyd (MePEG; d. h. OHC-(CH&sub2;)&sub2;O- (CH&sub2;-CH&sub2;O)n CH&sub3;; wo n = eine Wiederholung ist, so daß das Molekulargewicht ca. 12 kDa beträgt) (Shearwater Polymers) wurde zu einer 2,5 mg/ml Lösung von MGDF (abgeleitet von E. coli, 1-163) in 100 mM Natriumacetat, pH S. 0 bei 5 Grad Celsius hinzugegeben. Nach Mischen für 10 Minuten wurde ausreichend Natriumcyanoborohydrid (Aldrich) hinzugesetzt, um eine 20 mM-Konzentration in der Reaktionsmischung zu erhalten.
Diese Mischung wurde für 16 Stunden bei etwa 5ºC gerührt. Am Ende dieser Zeit wurde ausreichend gereinigtes Wasser, USP hinzugesetzt, um die Konzentration an MGDF auf 1 mg/ml zu bringen. Dieses wurde durch einen 0,2 Mikron Vakuumfilter filtriert. 90 mg Reaktionsprodukt wurden auf diese Weise hergestellt. Geringe Menge an 1,0 M monobasischem Phosphat und 1 N Natriumhydroxid-Lösungen wurden zu der Reaktionsproduktmischung hinzugegeben, um eine 10 mM Phosphat, pH 6,8-Lösung zu erhalten.
Das Konjugat wurde auf einer Kationenaustauschsäule gereinigt. Eine 40 ml SP-Sepharose Hochleistungssäule wurde hergestellt mit einer Betthöhe von 7,5 cm. Die Säule wurde mit Äquilibrierungspuffer (10 mM Phosphat, pH 6,8 mit 15% Glycerin) äquilibriert. Die Säule wurde bei 2,2 mg/ml Harz mit 0,15 Säulenvolumina (CV) pro Minute beladen. Dem folgte ein Waschen mit dem Äquilibrierungspuffer, bis die Basislinie erreicht wurde. Die Säule wurde mit 10 Volumina linearem Gradienten von Puffer A (20 mM Phosphat, pH 7,2 mit 15% Glycerin) bis Puffer B (Puffer A plus 0,3 M NaCl) eluiert. Die Flußrate wurde während der ganzen Zeit bei 0,15 CV pro Minute gehalten. Der Eluent wurde bei 280 nm überwacht.
Man lies SDS-PAGE-Gele von den Fraktionen laufen und diejenigen, die DiPEG-Konjugat enthielten, wurden vereinigt und durch eine 0,2 Mikroneinheit filtriert.

Beispiel 13

Biologische Aktivität von mit PEG versehenen MGDF-Molekülen

A. PEG-9 - PEG-12 und PEG-14 - PEG-21

Plättchenzahlen von Mäusen, die mit rekombinantem menschlichem MGDF behandelt wurden, wurden gemessen und die Ergebnisse sind in Fig. 18 dargestellt. Nicht mit PEG versehener von CHO abgeleiteter 22-353 (offene Raute), nicht mit PEG versehener E. coli Za-84 (offene Kreise) und mit einem PEG versehener E. coli 22-184 (geschlossene Kreise)-MGDF wurden bei den in der Beschreibung der Figuren in der oben angegebenen Konzentrationen subkutan in normale Balb/c-Mäuse einmal täglich für 5 Tage injiziert. Der mit PEG versehene MGDF, der in diesem Experiment verwendet wurde, war PEG-16 (d. h., mit einem PEG versehener MGDF 22-184 (Fig. 1), mit 20 kDa hergestellt in E. coli). Testblutungen von einem kleinen seitlichen Schnitt in eine Schwanzvene wurden 24 Stunden nach der letzten Injektion gesammelt. Blutzellanalysen wurden durchgeführt mit einem Sysmex elektronischen Blutzellanalysator (Baxter Diagnostics, Inc. Irvine, CA). Daten sind dargestellt als das Mittel von Bestimmungen bei 4 Tieren, +/- Standardfehler des Mittels (SEM). Andere Blutzellparameter, wie die Gesamtzahl weißer Blutzellen oder Zahlen roter Blutzellen, wurden durch diese Behandlung nicht beeinflußt.
Zusätzliche Formen von rekombinantem menschlichem MGDF wurden wie oben getestet. Plättchenzahlen von mit entweder 50 ug/kg/Tag oder 10 ug/kg/Tag der angegebenen Form von r-HuMGDF behandelten Mäuse sind in der folgenden Tabelle 10 gezeigt. Daten sind das Mittel von vier Tieren und die Standardfehler sind kursiv gedruckt. Tabelle 10

Legende zu Tabelle 10

Bei einem jedem der folgenden ist das MGDF-Molekül, das mit PEG versehen war, von E. coli gewonnener MGDF-11 (Aminosäuren 22-184, wenn man vom Beginn des Signalpeptids an zählt, oder Aminosäuren 1-163, wenn man vom Beginn des reifen Proteins zählt), wie im obigen Beispiel 12 beschrieben:
Die Basislinienzahlen sind die in normalen Tieren, ohne Verabreichung irgendwelcher Materialien.
Es ist klar, daß Pegylierung von rekombinantem menschlichem MGDF nicht die Fähigkeit des Moleküls negativ beeinflußt, Plättchenzahlen in Empfängertieren zu erhöhen, und tat sächlich kann sie die Aktivität von E. coli-Produkt 22-184 so erhöhen, daß sie so groß oder größer ist wie jene des von CHO-abgeleiteten 22-353-Moleküls.

B. PEG-22

Ergebnisse mit PEG-22 sind in Fig. 24 dargestellt. Bemerkenswerterweise trat eine Normalisierung der Plättchenzahlen mit PEG-22 mehrere Tage früher auf als mit dem von CHC' abgeleiteten, vollständig langen MGDF, PEG-16 oder PEG-17.

Beispiel 14

Expression von rekombinantem menschlichen MGDF (1-163) in E. coli

Um r-HuMGDF in E. coli zu exprimieren, wurde die die ersten 163 Aminosäuren des reifen Proteins kodierende Sequenz chemisch synthetisiert unter Verwendung von optimalen E. coli- Codons. Zusätzlich wurden DNA-Sequenzen, die für die Aminosäuren Methionin und Lysin kodierten, an das 5'-Ende des Gens hinzugefügt. Deshalb ist das durch diese Sequenz kodierte r-HuMGDF-Protein 165 Aminosäuren lang, beginnend mit Met-Lys. Die Sequenz dieses Gens ist in Fig. 25 angegeben.
Die Synthese des r-HuMGDF (1-163)-Gens wurde in mehreren Schritten durchgeführt. Zuerst wurden komplementäre Oligonukleotide (60-70 Basenpaare lang), die benachbarte Fragmente des Gens darstellen, chemisch synthetisiert unter Verwendung optimaler E. coli-Codons. Während der Synthese wurden die Aminosäuren Methionin und Lysin am 5'-Ende des reifen Gens erstzt, und ein · Stop-Codon an das 3'-Ende des Gens plaziert. Zusätzlich wurden Schnittstellen für die Restriktionsenzyme XbaI und HindIll an die äußersten 5'- bzw. 3'- Enden des Gens plaziert und eine synthetische Ribosomenbindungsstelle in einer geeigneten Entfernung oberhalb des Anfangsmethionins plaziert. Zweitens wurden die komplementären Oligonukleotide für jedes Genfragment anelliert. Drittens wurden diese einzelnen synthetischen Genfragmente amplifiziert unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktionen. Viertens wurden die arnplifizierten Fragmente dann in einen geeigneten Vektor subkloniert. Fünftens wurden die Sequenzen der subklonierten Fragmente verifiziert. Sechstens wurden die einzelnen Fragmente zusammenligiert und in einen geeigneten Vektor subkloniert und dadurch das r-HuMGDF (1-163)-Gen in seiner vollständigen Länge rekonstruiert. Schließlich wurde die Sequenz des rekonstruierten Gens verifiziert.
Das synthetische r-HuMGDF-Genfragment, flankiert von XbaI- und HindIII- Restriktionsstellen an den 5'- bzw. 3'- Enden, enthält eine Ribosomenbindungsstelle, das ATG-Startcodon, die Sequenz, die das reife Met-Lys-r-HuMGDF-Protein kodiert und das Stop-Codon.
Das obige Fragment wurde in die XbaI- und HindIII-Stellen des Laktoseinduzierbaren Expressionsvektors pAMGll kloniert. Der pAMGI 1-Vektor ist ein Plasmid mit geringer Kopienanzahl mit einem von pR100-abgeleiteten Replikationsursprung. Das Expressionsplasmid pAMG1l kann abgeleitet werden von Plasmid pCFM1656 (ATCC Nr. 69576, hinterlegt am 24. Februar 1994), indem eine Anzahl von ortsspezifischen Basenaustauschen durch überlappende PCR-Oligomutagenese vorgenommen werden. Beginnend mit der BgIII-Stelle (Plasmid bp Nr. 180) unmittelbar 5' zu dem Plasmidreplikationspromotor PcopB und fortschreitend zu den Plasmidreplikationsgenen lauten die Basenpaaraustausche wie folgt:
und durch substituieren der DNA-Sequenz zwischen den singulären AatII und CIaI- Restriktionsstellen mit den folgenden Oligonukleotiden:
Expression von r-HuMGDF, in pAMGII kloniert, wird durch einen synthetischen Laktoseinduzierbaren Promotor, wie Ps4, angetrieben, der die folgende Sequenz aufweist:
Der Ps4-Promotor wird von dem Laktose-Repressor (LacI) reprimiert, der das Produkt des E. coli lacl Gens ist.
Das pAMG11-r-HuMGDF-Plasmid wurde nachfolgend in einen E. coli K-12-Stamm transformiert, der das laclq-Allel trägt. Das lacfl-Allel ist eine Mutation im lacl Promotor, die die Expression von Lac erhöht und zu einer stringenteren Kontrolle der Proteinexpression vom Ps4-Promotor führt. Deshalb ist, in diesem Stamm, bei Fehlen von Laktose, die Expression von r-HuMGDF durch LacI reprimiert. Nach Hinzugeben von Lactose wird das Binden von LacI-Protein an die Operatorstelle auf dem Ps4-Promotor verringert und die Transkription von r-HuMGDF von Ps4 wird initiiert. Die in diesem Beispiel verwendete E. coli-Wirtszelle ist hinterlegt unter ATCC-Nr. 69717, vom 30. November 1994.
Der E. coli-Wirt ATCC-Nr. 69717 wurde mit dem pAMG1l-r-HuMGDF-Plasmid transformiert und entsprechend der nachfolgenden Fermentationsbeschreibung kultiviert. Der E. coli- Stamm wird in Luria-Brvhe inokuliert und dann bei 30ºC für etwa 12 Stunden inkubiert. Die Zellen werden dann aseptisch in einen Fermenter überführt, der das Chargenmedium (20 g/L Hefeextrakt; 3,4 g/L Zitronensäure; 15 g/L K2HP04; 15 ml Dow P2000; 5 g/L Glucose; 1 g/L MgSO&sub4; · 7H&sub2;O; 5,5 ml/L Spurenmetalle; 5,5 ml/L Vitamine) enthält. Die Batch-Phase des Prozesses dauert an, bis die Kultur eine optische Dichte von 5,0 +/- 1,0 bei 600 nm erreicht. Die Fed-Batch-Phase wird dann begonnen mit der Initiation des ersten Fütterungsmediums (700 g/L Glucose; 6,75 g/L MgSO&sub4;·7H&sub2;O). Die Fütterungsrate wird alle zwei Stunden nach einem etablierten Schema angepaßt. Die Initiierung des zweiten Fütterungsmediums (129 g/L Trypticase-Pepton; 258 g/L Hefeextrakt) beginnt, wenn die Kultur eine optische Dichte von 20 bis 25 bei 600 nm erreicht. Das zweite Fütterungsmedium wird bei einer konstanten Flußrate gehalten, während das erste Fütterungsmedium weiter angepaßt wird. Die Temperatur während der gesamten Fermentation wird bei etwa 30ºC beibehalten. Die Kultur wird bei etwa pH 7, 8 durch Zusetzen von Säure und Base, wie erforderlich, gehalten. Der erwünschte gelöste Sauerstofftiter wird beibehalten durch Anpassen der Rühr- und Luftzufuhr und Sauerstoffzufuhrraten in den Fermenter. Wenn die optische Dichte der Kultur 57 bis 63 bei 600 nm erreicht, wird das Zugeben des dritten Fütterungsmediums begonnen. Das dritte Fütterungsmedium (300 g/L Lactose) wird in den Fermenter mit einer konstanten Flußrate eingeführt; Zugeben des ersten Fütterungsmedium wird abgebrochen und die Flußrate des zweiten Fütterungsmediums wird auf eine neue konstante Rate geändert. Die Fermentation dauert etwa 10 Stunden nach Initiieren des dritten Fütterungsmediums. Am Ende der Fermentation wird die Kultur auf 15 +/- 5ºC gekühlt. Die Zellen werden durch Zentrifugation geerntet. Die resultierende Paste wird verpackt und bei < - 60 gelagert.
Reinigung des rekombinanten MGDF, der in E. coli wie oben beschrieben hergestellt wurde, wurde wie folgt durchgeführt. 1800 g Zellpaste wurde in etwa 18 Liter 10 mM EDTA suspendiert und durch einen Hochdruckhomogenisator bei 15.000 psi durchgeführt. Die Suspension von aufgebrochenen Zellen wurde zentrifugiert und das Pellet in 10 Liter 10 mM EDTA resuspendiert. Die Suspension wurde zentrifugiert und 200 g Pellets wurden in 2 Liter 10 mM Tris, 8M Guanidinhydrochlorid, 10 mm DTT, 5 mM EDTA, pH 8,7 solubilisiert. Diese Lösung wurde langsam in 200 Liter 10 mM CAPS, 3 M Harnstoff, 30% Glycerin, 3 mM Cystamin. 1 mM Cystein, pH 10,5, verdünnt.
Die verdünnte Lösung wwde langsam für 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und der pH wurde auf 6,8 eingestellt. Die pH-eingestellte Lösung wurde geklärt und auf eine zwei Liter cm-Sepharose-Säule gegeben, die mit 10 mM Natriumphosphat, 1,5 M Harnstoff, 15% Glycerin, pH 6,8, äquilibriert war. Nach Beladen wurde die Säule mit 10 mM Natriumplhosphat, 15% Glycerin, pH7,2, gewaschen. MGDF wurde mit einem Gradienten von 0 bis 0,5 M Natriumchlorid, 10 mM Natriumphosphat, pH 7,2 gewaschen.
Das CM-Eluat wurde konzentriert und der Puffer mit 10 mM Natriumphosphat pH 6,5 mit einer Membran mit einem molekularen Ausschluß von 10.000 ausgetauscht. Die konzentrierte Lösung, bei etwa 2 mg/L, wurde mit Cathepsin C (molares Verhältnis 500 zu 1) fii.r 90 Minuten bei Raumtemperatur behandelt.
Die Lösung wurde dann in eine 1, 2 Liter SP-Hochleistungs-Sepharose-Säule geladen, die mit 10 mM Natriumphosphat mit 15% Glycerin, pH 7,2 äquilibriert war. Nach Beladen wurde MGDF mit einem Gradienten von 0,1 bis 0,25 M Natriumchlorid, 10 mM Natriumphosphat pH 7,2, eluiert.
Ammoniumsulfat wurde zu 0,6 M zu dem Eluat von der SP-Hochleistungssäule hinzugegeben. Das Eluat wurde auf eine 1,6 Phenyl-Toyopearl-Säule geladen, die mit 10 mM Natriumphosphat, 0,6 M Ammoniumsulfat, pH 7,2, äquilibriert war. Der MGDF-Peak wurde mit einem Gradienten von 0,6 bis 0 M Ammoniumsulfat, 10 mM Natriumphosphat, pH 7,2, eluiert.
Das Phenyl-Toyopearl-Eluat wurde konzentriert und der Puffer ausgetauscht mit einer Membran mit einer molekularen Ausschlußgröße von 10.000 in 10 mM Tris; 5% Sorbitol, pH 7,5.

Beispiel 10

In vivo, biologische Eigenschaften von r-HuMGDF (E. coli 1-163)

r-HuMGDF (E. coli 1-163), hergestellt wie in Beispiel 14 oben beschrieben, wurde in Nagetieren hinsichtlich biologischer Wirksamkeit bewertet. Normalen, weiblichen Balb/c-Mäuse injizierte man subcutan S Tage hintereinander ansteigende Dosen von r-HuMGDF. Die Dosen reichten von 15 ug/kg/Tag bis 1500 ug/kg/Tag. 24 Stunden nach der letzten Injektion wurden Blutzellzahlen gemessen unter Verwendung eines elektronischen Zellzählers (Sysmex, Baxter). Ein linearer Anstieg der Plättchenzahlen wurde mit logarithmisch ansteigenden Konzentrationen des Cytokins beobachtet. Plättchenzahlen erhöhten sich um 300% gegenüber Basislinienwerten mit 1500 ug/kgTag in diesem System. Andere Blutzellparameter wurden nicht durch diese Behandlung beeinflußt, wie die Zahlen der weißen oder roten Blutkörperchen oder der Hämatokrit.
Die Plättchen wurden von Ratten geerntet, denen man für sechs Tage subcutan 300 ug/kg/Tag r-HuMGDF (E. coli 1-163) injiziert hatte, und bewertet hinsichtlich der Fähigkeit, in Reaktion auf ADP zu aggregieren. Die Daten zeigen an, daß Plättchen von behandelten Tieren tatsächlich nicht unterscheidbar waren von Plättchen von Kontrolltieren dahingehend, daß beide Populationen im gleichen Maße empfindlich waren hinsichtlich des Plättchenagonisten ADP.
r-HuMGDF wurde auch auf seine Fähigkeit hin bewertet, Thrombocytopenie, die mit Chemotherapie und/oder Bestrahlung verbunden war, aufzuheben. Carboplatin, ein Chemotherpeutikum, das beim Menschen weitreichende Thrombocytopenie verursacht, wurde in diesen Studien verwendet. Balb/c-Mäusen wurden 1,25 mg Carboplatin am Anfang der Studie injiziert. Nach 24 Stunden injizierte man den Mäusen täglich 100 ug/kg/Tag r-HuMGDF (E. coli 1-163) oder Bindemittel für den Rest der Studie. Um Tag 9 fielen die Plättchenzahlen auf etwa 15% von normalen mit Bindemittel behandelten Mäuse, blieben aber bei Basislinientitern von mit r-HuMGDF behandeltend Mäusen (siehe Fig. 20). Für die Bestrahlungsstudien injizierte man Mäusen eine einzelne Gamma-Bestrahlungsdosis von 500 Rad (Cäsiumquelle). Dies ist eine sublethale Dosis, die zu einer 90%-igen Verringerung der Plättchenzahlen am Tag 11 führt. Plättchenzahlen kehrten bis zum Tag 21 nicht auf normale Werte zurück. Wenn r-HuMGDF (E. coli 1-163) einmal täglich (100 ug/kg/Tag) den bestrahlten Mäusen von Tag 1 bis Tag 20 verabreicht wurde, war der Abfall der Plättchenzahlen weniger gravierend und die Rückkehr zu Basislinientitern schneller als bei Mäusen mit Bindemitteln (Fig. 21). Um r- HuMGDF in einem Modell extremer und verlängerter Thrombocytopenie zu testen, wurde Carboplatin und Bestrahlung in Kombination angewandt (Fig. 22). Unter diesen Umständen vielen Plättchenzahlen auf extrem niedrige Titer (3-S% des normalen Wertes) und die meisten der Tiere (7/8) überlebten diese Behandlung nicht. Wenn jedoch diese Tiere täglich mit subcutanen Injektionen von r-HuMGDF bei 100 ug/kg/Tag für die Dauer der Studie behandelt wurden, wurde die Thrombocytopenie wesentlich aufgehoben. Die Rückkehr zu Basislinienzahlen erfolgte schneller und alle der mit r-HuMGDF -behandelten Mäuse (8/8) überlebten.
r-HuMGDF wurde auch in Rhesus-Affen bewertet. Man injizierte normalen Rhesus-Affen subcutan entweder 2,5 oder 25 ug/kg/Tag für 10 Tage (Tag 0-9). Bei der Niedrigdosisgruppe erhöhten sich die Plättchenzahlen um 400% am Tag 12 und bei der Gruppe mit höherer Dosis erhöhten sie sich ebenfalls am Tag 12 um 700%. Nachdem die Injektionen aufhörten, kehrten die Plättchenzahlen auf normale Werte am Tag 25 bis 30 zurück. Weiße Blutzellzahlen und rote Blutzellzahlen wurden durch diese Behandlung nicht beeinträchtigt.
r-HuMGDF (E. coli 1-163) wurde auch in einem Primatenmodell für schwere Thrombocytopenie (Fig. 23) getestet. Die Tiere wurden Bestrahlung (700 Rad, Cobalt-Quelle) unterzogen, was zu einer Verringerung der Plättchenzahlen auf 1-2% des Normalwertes am Tag 15 führte. Am Tag 35-40 kehrten die Plättchenzahlen auf Normalwerte zurück. Im Gegensatz dazu fielen die Plättchenzahlen bei bestrahlten Tieren, die täglich mit r-HuMGDF (25 ug/kg/Tag) behandelt wurden, auf nur 10% des Normalwertes ab und gingen im Mittel nicht unterhalb 20.000/u1, was der Auslösepunkt für Plättchentransfusionen bei unter Thrombocytopenie leidenden Menschen ist. Die Rückkehr zu Basislinienwerten war bei den r-HuMGDF- behandelten Mäusen ebenfalls schneller und erfolgte am Tag 20.
Diese in vivo-Daten von Studien an sowohl Nagetieren- als auch Primaten unterstützen voll das Konzept, daß r-HuMGDF (E. coli 1-163) ein potentes therapeutisches Agens mit der Fähigkeit ist, klinisch relevante Thrombocytopenien wesentlich zu beeinflussen.

Beispiel 16

Verfahren zur CHO-Zellkultur-Produktion von r-HuMGDF-1-332

Glycosilierter r-Hu MGDF 1-332 wird von transfizierten chinesische Hamsterovarienzellen hergestellt, die eine cDNA für MGDF 1-332 unter einem geeigneten Promotor exprimideren und die an ein Gen gebunden ist, das einen amplifizierbaren Selektionsmarker kodiert, DHFR. Ein geeigneter Promotor zur Expression von MGDF in CHO-Zellen ist SRα. Siehe Mol. Cell. Biol. 8 : 4466472 (1988) und WO 91/13160 (1991). Ein geeigneter Vektor zur Expression von MGDF in CHO-Zellen ist pDSRα2. Siehe WO 90/14363 (1990). Beispielhafte CHO- Zellinien können sekretierten MGDF im Bereich von 10-20 mg/L in Standardzellkulturmedium produzieren, können aber auch erhöht werden auf 25 bis 100 mg/L. Um MGDF mit einer typischen Zellinie zu produzieren, kann eine Kultur durch Passagieren in Suspension oder in Gewebekulturgefäßen im adhärenten Wachstumsmodus expandiert werden unter Verwendung von Medium, das aus gleichen Teilen Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) und Ham's F12 (DMEM/F12, Gibco) besteht, das mit 5 bis 10% fötalem Rinderserumalbumin (FBS) supplementiert oder mit fötalem Rinderserum dialysiert ist und Methotrexat (MTX) (sofern notwendig; typische Konzentration an MTX ist 200-600 nM), um den Selektionsdruck aufrechtzuerhalten. Dieses Medium sollte mit zusätzlichen nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA's) und Glutamin supplementiert sein. Suspensionkulturen können sich leicht zwischen Einimpf(Splitting))-Dichten von 1-4 · 105 Zellen/ml und maximalen Dichten von -1 · 10&sup6; Zellen/ml vermehren, wobei die Kulturen an diesem Punkt durch Verdünnen in größere Volumina mit anfänglichen Zelldichten bei den angegebenen Splitting-Dichten expandiert werden.
Um MGDF in Roller-Flaschen zu produzieren, muß ein ausreichendes Volumen und zelluläre Dichte von Suspensionskultur erzeugt werden unter Verwendung von entweder magnetisch gerührten Spinner-Gefäßen, die in eine temperaturkontrollierte Umgebung (37 ± 1ºC) gegeben sind, oder ein instrumentiertes, kontrolliertes, Rührkesselbioreaktorsystem. Rollerflaschen (wie bspw. 850 cm² Rollerflaschen von Falcon) sollten mit anfänglichen Dichten von 1,5 bis 3 · 10' Zellen pro Flasche beimpft werden und mit zusätzlichen Wachstumsmedium supplementiert werden (DMEM/F 12 mit 5-10% FB S. lX NEAA und 1 · L-Glutamin) in einer Menge, die ausreichend ist, um einen konfluenten Monolayer in 3-4 Tagen zu erzeugen (150- 300 ml pro Flasche). Das Wachstumsmedium sollte geeignet mit Natriumbicarbonat auf einen pH von 6,9 bis 7,2 gepuffert werden im Gleichgewicht mit Kohlendioxid bei einem Partialdruck von 60 bis 90 mm Hg. Die Flaschen sollten begast werden mit 10% CO&sub2;/Luft und auf Rollergestellen inkubiert werden (-4 Upm) bei 37 ± 1ºC für 3-4 Tage. Bei Konfluenz sollten die Rollerflaschen auf serumfreies Produktionsmedium umgestellt werden, indem das Wachstumsmedium abgegossen oder abgesaugt wird; die Flaschen mit einem isotonischen Puffer wie Dulbecco's Phosphat-gepufferte Saline (D-PBS), 50-100 ml pro Flasche, gewaschen werden; ein geeignetes Volumen an Bicarbonat-gepuffertem, Serumfreiem DMEM/F12 (1 : 1) (200-300 mL pro Flasche) supplementiert mit NEAA's und L-Glutamin und mit Kupfersulfat, um kovalente Aggregation zu minimieren (1-20 uM) hinzugegeben · wird. Die Flaschen sollten mit 10% CO&sub2;/Luft begast werden und für 6 ± 1 Tage bei 37 ± 1ºC auf Rollergestellen (-1 Upm) inkubiert werden, oder bis die metabolische Aktivität den Glucosetiter auf unterhalb 0,5 g/L und/oder den pH-Titer unterhalb 6.6 gebracht hat. Das konditionierte Medium sollte geerntet werden durch Abgießen oder Absaugen aus den Flaschen und ersetzt werden durch frisches, Serum-freies Produktionsmedium, wie oben beschrieben, für zusätzliche Ernten. Das kann fortgesetzt werden, bis die Zellen Serum-freie Produktion nicht länger ertragen können und sich von den Rollerflaschen ablösen.
Geerntetes konditioniertes Medium kann zur Reinigung durch Endpunkt-Mikrofiltration durch 0,45 um und/oder 0,2 um Filter (Sartorius Sartoban pH oder Pall) verarbeitet werden. Filter-konditioniertes Medium sollte gekühlt werden auf 4ºC, dann entweder vorübergehend bei 4ºC gelagert werden oder sofort konzentriert und dialysiert werden auf geringe Ionenstärke unter Verwendung eines Cross-Flow-, Ultrafiltrationssystem (d. h. Filtron YM-50). Ultrafiltration und Diafiltration sollten bei 4ºC erfolgen, um den Proteinabbau zu minimieren. Konditioniertes Medium sollte dialysiert werden mit einer gepufferten wässrigen Lösunt; (d. h. 10 mM Natriumphosphat, pH 6,8) vor chromatographischen Reinigungsschritten.
Produktqualität in konditioniertem Medium kann am besten überwacht werden unter Verwendung nicht-reduzierender SDS-PAGE-Western-Blots, die die relativen Mengen an aggregiertem, monomerem und proteolytisch abgebautem MGDF in den Proben enthüllen können.
Ein weiteres Verfahren zum Herstellen von MGDF aus CHO-Zellen bestünde darin, eine Zellinie dahingehend zu adaptieren, daß sie MGDF in einem serumfreien Medium, wie Gibco S- SFM 11, exprimiert. Zellen können durch serielles Überführen in Medium adaptiert werden, das minimale oder keine Serumergänzungen enthält. Wenn man eine Zellinie findet, die anhaltend in einem solchen Medium wächst, während sie die angemessenen Mengen an sekretiertem MGDF produziert, kann die Produktion fortschreiten, indem eine Inokulumkultur vermittels serieller Überführung in zunehmend größeren Kulturvolumina im Maßstab vergrößert wird, dann ein geeignetes Produktionsgefäß (ein mit Instrumenten versehener, kontrollierter Rührkesselreaktor) animpft und man der Kultur erlaubt, zu ihrer maximalen Lebenddichte unter optimalen Wachstumsbedingungen (pH, Nährstoffe, Temperatur, Sauerstoff, Scherung) zu proliferieren. Beim optimalen Produktionspunkt (wie experimentell dadurch bestimmt, daß Produktquantität- und qualität gemessen wird), kann die Kultur vom Bioreaktor geerntet werden und die Zellen können aus dem konditionierten Medium durch Tiefenfiltration im Micron-Maßstab oder Sub-Micron-Cross-Flow-Microfiltration entfernt werden.
Wenn Tiefenfiltration verwendet wird, sollte das Medium weiter durch Sub-Micron- Endpunkt-Filtration gereinigt werden vor Konzentration und Dialyse, wie oben beschrieben.
Während die vorliegende Erfindung oben sowohl allgemein als auch in Begriffen bevorzugter Ausführungsformen beschrieben worden ist, wird man verstehen, daß Variationen und Modifikationen den Fachleuten im Lichte der obigen Beschreibung einfallen werden. Deshalb sollen die beigefügten Ansprüche all jene Variationen abdecken, die innerhalb des Umfangs der Erfindung liegen, wie beansprucht.
Zusätzlich sind die Veröffentlichungen und anderen Materialien, die zitiert werden, um den Hintergrund der Erfindung zu veranschaulichen und in besonderen Fällen zusätzliche Details betreffend ihrer Ausführung vorzusehen, hierin durch Bezugnahme aufgenommen.
Die in der vorgehenden Beschreibung, in den nachfolgenden Ansprüchen und/oder dem begleitenden Zeichnungen offenbarten Merkmale können, sowohl einzeln als auch in Kombination, Gegenstand für die Realisierung der Erfindung in ihren verschiedenen Formen sein.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER: Bartley, Timothy D.
Bogenberger, Jakob M.
Bosselman, Robert A.
Hunt, Pamela
Kinstler, Olaf B.
Samal, Babru B.
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Zusammensetzungen und Verfahren zum Stimulieren des Wachstums und der Differenzierung von Megakaryocyten
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 34
(iv) KORRESPONDENZANSCHRIFT:
(A) EMPFÄNGER: Amgen Inc.
(B) STRASSE: 1840 Dehavilland Drive
(C) ORT: Thousand Oaks
(D) STAAT: Californien
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL: 91320-1789
(v) COMPUTERLESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Diskette
(B) COMPUTER: IBM-PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentln Release 1.0, Version 1.25
(vi) DATEN DER JETZIGEN ANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER:
(B) ANMELDETAG:
(C) KLASSIFIKATION:
(viii) INFORMATION ZUM ANWALT/VERTRETER:
(A) NAME: Cook, Robert R.
(C) AKTENZEICHEN: A-290-C
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 1:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 31 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKLTLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 1:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 2:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 21 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKULS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 2:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 3:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE; 17 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 3:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 4:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 17 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 4:
GCNCCNCCNG CNTGYGA 17
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 5:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 21 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 5:
GCARTGYAAG ACRTGNGART C 21
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 6:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 21 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKULS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 6:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 7:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 21 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 7:
GTACGCGTTC TAGANNNNNN T 21
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 8:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 21 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 8:
AGTTTACTGA GGACTCGGAG G 21
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 9:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 30 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 9:
TTCGGCCGGA TAGGCCTTTT TTTTTTTTTT 30
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 10:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 29 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 10:
TTCGGCCGGA TAGGCCTTTT TTTTTTTTT 29
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 11:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 11:
TGCGACCTCC GAGTCCTCAG 20
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 12:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 23 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 12:
GAGTCCTCAG TAAACTGCTT CGT 23
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 13:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 13:
GGAGTCACGA AGCAGTTTAC 20
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 14:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 18 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 14:
CCTTTACTTC TAGGCCTG
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 15:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 19 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKULS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 15:
GAGGTCACAA GCAGGAGGA 19
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 16:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 19 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 16:
GGCATAGTCC GGGACGTCG 20
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 17:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 19 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 17:
TCCTGCTGCT TGTGACCTC 19
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 18:
(i) SEQUENZBESCHREIBUNG:
(A) LÄNGE: 19 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 18:
CCAGGAAGGA TTCAGGGGA 19
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 19:
(i) SEQUENZBESCHREIBUNG:
(A) LÄNGE: 30 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE; linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 19:
CAACAAGTCG ACCGCCAGCC AGACACCCCG 30
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 20:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 24 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 20:
GGCCGGATAG GCCACTCNNN NNNT 24
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 21:
(1) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 21 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 21:
GCARTGYAAN ACRTGNGART C 21
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 22:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 16 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 22:
TTGGTGTGCA CTTGTG 16
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 23:
(1) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 23:
CACAAGTGCA CACCAACCCC 20
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 24:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LANGE: 1342 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CD5
(B) LAGE: 99..1094
(xi) SEQUENZBESCHREIBLJNG: SEQ ID NO : 24:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 25:
(i) SEQUENZENNZECHEN:
(A) LÄNGE: 332 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜls: Proyein
(xi) SEQENZENBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 25
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 26:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 1342 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 99..621
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 26:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 27:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE; 174 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 27:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 28:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 1164 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLUSSEL: CD5
(H) LAGE: 97..894
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 28:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 29:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 265 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 29:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 30:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 24 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 30:
GAGCTCACTA GTGTCGACCT GCAG 24
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 31:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 24 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 31:
CTGCAGGTCG ACACTAGTGA GCTC 24
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 32:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 80 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 32:
CTCATAATTT TTAAAAAATT CATTTGACAA ATGCTAAAAT TCTTGATTAA TATTCTCAAT 60
TGTGAGCGCT CACAATTTAT 80
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 33:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 86 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 33:
CGATAAATTG TGAGCGCTCA CAATTGAGAA TATTAATCAA GAATTTTAGC ATTTGTCAAA 60
TGAATTTTTT AAAAATTATG AGACGT 86
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 34:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LANGE: 89 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 34:
GACGTCTCAT AATTTTTAAA AAATTCATTT GACAAATGCT AAAATTCTTG ATTAATATTC 60
TCAATTGTGA GCGCTCACAA TTTATCGAT 89

Claims

1. Ein mit einer PEG-Gruppe versehenes MGDF-Polypeptid mit Aminosäuren 22-184 von Fig. 11, wobei die Polyethylenglycol- Gruppe an den N-Terminus des Polypeptids gebunden ist.

2. Ein mit einer PEG-Gruppe versehenes MGDF-Polypeptid nach Anspruch 1, wobei die Polyethylenglycolgruppe ein durchschnittliches Molekulargewicht von 2 bis 100 Kilodalton aufweist.

3. Ein mit einer PEG-Gruppe versehenes MGDF-Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2, wobei das MGDF-Polypeptid in E. Coli hergestellt worden ist.

4. Ein Verfahren zum Anbinden von wasserlöslichem Polyethylenglycol an ein MGDF-Polypeptid mit Aminosäuren 22-184 von Figur. 11, wobei das Verfahren Kontaktieren des MGDF-Polypeptids mit dem Polyethylenglycol unter Bedingungen umfaßt, so daß das MGDF-Polypeptid an das Polyethylenglycol gebunden wird, um ein am N-Terminus mit einer PEG-Gruppe versehenes MGDF-Polypeptid zu erhalten.

5. Ein Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Polyethylenglycol an das MGDF-Polypeptid gebunden wird unter reduktiven Alkylierungsbedingungen bei einem pH, der ausreichend sauer ist, um zu erlauben, daß die α-Aminogruppe am N-Terminus des MGDF-Polypeptids reaktiv ist.

6. Ein Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, wobei das MGDF-Polypeptid mit einer PEG-Gruppe mit einem Polyethylenglycol, das ein mittleres Molekulargewicht von 2 bis 100 Kilodalton aufweist, versehen ist.

7. Ein Verfahren nach Anspruch 4, 5 oder 6, wobei das MGDF- Polypeptid hergestellt wird durch Abspalten von Met&supmin;²-Lys&supmin;¹ von einem Polypeptid, das durch Expression einer DNA in einer E. coli-Zelle erhalten wurde, die ein Polypeptid mit Aminosäuren 22-184 von Fig. 11 und die Sequenz Met-Lys am N-Terminus davon kodiert.

8. Ein Verfahren nach Anspruch 4, 5 oder 6, wobei das MGDF- Polypeptid hergestellt wird durch:

a. Exprimieren einer DNA in einer E. coli-Zelle, die ein Polypeptid mit Aminosäuren 22-184 von Fig. 11 und der Sequenz Met-Lys am N-Terminus davon kodiert,

b. Isolieren des exprimierten Polypeptids,

und

c. Abspalten von Met-2-Lys-1 vom isolierten Polypeptid.

9. Eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend mit einer PEG-Gruppe versehenes MGDF-Polypeptid nach Anspruch 1, 2 oder 3 und/oder hergestellt durch das Verfahren nach Ansprüchen 4, 5, 6, 7 oder 8, und ein pharmazeutisch akzeptables Verdünnungsmittel, Adjuvans oder Träger.

10. Eine pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 9 zur Verwendung bei der Behandlung von Thromboyztenerkrankungen.

11. Eine pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 9 zur Verwendung bei der Behandlung von Thrombozytopenie.

12. Eine pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 9 zur Verwendung in der Behandlung von Thrombozytopenie, die durch Chemotherapie, Strahlentherapie oder Knochenmarktransplantation induziert ist.

13. Mit einer PEG-Gruppe versehenes MGDF-Polypeptid nach Anspruch 1, 2 oder 3 und/oder hergestellt durch das Verfahren nach Anspruch 4, 5, 6, 7 oder 8 zur Verwendung als ein Medikament.

14. Die Verwendung von mit einer PEG-Gruppe versehenem MGDF- Polypeptid nach Anspruch 1, 2 oder 3 und/oder hergestellt durch das Verfahren nach Anspruch 4, 5, 6, 7 oder 8 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Thrombozytenerkrankungen.

15. Mit einer PEG-Gruppe versehenes MGDF-Polypeptid nach Anspruch 1, 2 oder 3 und/oder hergestellt durch das Verfahren nach Anspruch 4, 5, 6, 7 oder 8 zur Behandlung von Thrombozytopenie.

16. Die Verwendung von mit einer PEG-Gruppe versehenem MGDF- Polypeptid nach Anspruch 1, 2 oder 3 und/oder hergestellt durch das Verfahren nach Anspruch 4, 5, 6, 7 oder 8 bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von durch Chemotherapie, Strahlentherapie oder Knochenmarktransplantation induzierter Thrombozytopenie.