TW496870B - Compositions methods for stimulating megakaryocyte growth and differentiation - Google Patents

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TW496870B
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Timothy D Bartley
Jakob M Bogenberger
Robert A Bosselman
Pamela Hunt
Olaf B Kinstler
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Description

496870 經濟部令夬標準局員工消費合作社印製 Λ7 B7 五、發明説明（1 ) g明頜域 本發明係有Η新類蛋白質，於本文中同義地稱為MpI配 體或MGDFs *其可剌激巨核ffi胞的生長並增加巨核妞胞的 分化或成热，最終效應為增加血小板的數目。此外，也提 出從天然來源取得均質形式的蛋白質與经由重姐遺傳工程 技術製備彼等之方法。 於另一部份中，本發明概.括地有Η新穎的MGDF衍生物類 別，其中該MGDF分子係接著到水溶性聚合物者.•及製備婢 等分子的方法。於又另——部/份，中*本發明係有M MGDF衍生 物，·其屮MGDF分子係接到一或多"種聚乙二醇：（”PEG”)者， 及其製備方法。 發明背吾 本發明包含至少兩種廣闊的研究領域。第一種係有W巨 核细胞的發育及其阐後產生血小板*而第二種係有Μ生長 因子受體族的多肽成員，本文稱之為ΜρΙ受體者，及其配 β。下文即分別概述這些研究領域。 Α.#巨铉焖朐杳牛血小垢 血小板為循環鈕胞，其對於流血的遏止和血液凝结具有 重要性。巨核细胞為血小板的妞胞源且係源自共同的骨箱 前體鈕胞一其可衍生成所有的造血妞胞系。該共同的前體 细胞稱為多種作用性幹妞胞或PPS'C。 ’ 巨核细胞前身妞胞的層系係以在活體外(JLil y i tj-α.)對 應於適當生長因子的培養***中所出現的巨w核细胞（MK) 群落之出現時間和尺寸為基礎的。釋放形成單位巨核妞胞 一 4 一 本紙法尺度適用中gg家標辛（CNS ) Α4規格（2丨0 Χ 297公釐） --1---------- (請乏之_5?^琴貧) 訂 線 496870 經濟部中夬標注局員二消貧合作社印製
AT B7 五、發明説明（2 ) (BFU-MK)為最原始的巨核细胞前身细胞。BFU-MK被認為 到最後會產生眾多群落形成性單位巨核妞胞（CFU-M)， 其為更分化的MK前身妞胞。 隨著MK细胞進行後鑕的分化，其即失去進行有絲***的 能力但取得核内再複製的能力。核内再複製（或核内有絲 ***）為在沒有妞胞***時，细胞内發生核***之現象。 核内再複製到最後會専致成為多倍體的MK。進一步的HK成 热化促成構成血小板特徵的妞胞質小器官和膜I等组成物 >之 取得。 …_ 血小k係经由未確定清楚的备序從成热MK產生的'該程 序经推測為MK物理裂殖•或菜1他楗制之结果。巨核妞胞内 大悬膜構造的β察導致血小板形成模型，其中一界線膜系 铳在妞胞體内«括出新生態血小板。另一種血小板形成模 型係由下逑S察發展出者，亦即，巨核ffl胞會形成限制在 血小板尺寸間段的長妞胞質突起，由該突起，血小板可能 因骨Μ及/或肺内的血流壓力而分離出來。這些细胞質突 起即為Becke「和DeBruyn所稱的前血小板以反映其所假設 的在血小板形成中的前體角色。參看Becker and DeBruyn, Aier. J. Anat. 145-183 (1976) ° 圏1表出巨核妞胞和血小板發展的各種前《细胞之總荑 。圓中最左邊的妞胞為PPSC，而豳中在PPSC右邊的其他鈕 胞為BFU-MK，接著為CFU-MK。圖中緊接在PPSC右邊正進行 核内再複製的妞胞為成熟的巨核妞胞。由於^核内有绦*** • ' 的结果•該S胞已變成多倍體。緊接其右邊的構造體包含 一 5 一 本纸法又度適用中ϋ國家標洋（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背云之洼意事項寫本一貝) •裝 線 496870
五、發明説明（ 從瑤热巨核细胞的多倍體核發出的長鈕胞質突_ ° 最右邊為妞胞質突起经裂殖所產生的許多血小板° 下列有κ上面對於巨核®胞成热和血小板產生的 某些先前文獻摘列： 1· Williams, N. and Levins, R.F./ British jcurnB^ Hae-azolcgy 52:. 173-130 (1SS2). 2· Levin, J., Molecular Biology and DifferentiBCio^ °-M eg aka ryo c y t e 5, pub . Wilev-Liss, Inc··· i 一 (19>〇)· 3 . * Gewirtz, A.M., The 3iolcgy of Hematopoiesis； pub. Wiley-Liss r Inc . : 123-132 (1550). 請 % n 背 ir 之 ί % 本 t
Han, Z.C·, sc (1SS1) · .·
Hepatol. 54: 3*
Miauvenhuis, H.K. and Sixna^ J./ iVev z^ng. Med. 327: 1312-1813 (1592). 6. Long, M., Stem Cells 11： 33-40 (1993).
節 固 τ^ 的 成 形 板 ,、inu B 經濟部中夬標準局員工消費合作杜印製 0 受 係 生 產 的 板 小 血 示 顯 據 數 量 大 的 生 產 所 室 驗 實 多 許 而 解 了 〇 ♦未力 尚能 先種 原這 性有 雜具 •複都 的子 序因 程長 物生· 生類 種人 這多 。 許 節有 調示 所顯 子前 因目 疲在 丨生 素產 介：的 嫌板 姐-小 多血 •k進 有增 。 而 次池 層胞 胞细 细身 .重前 多大 在擴 生由 發经 節可 調} 胞 S 细ne 核ki 巨to 本纸乐尺度適用宁11家標莩（（：>^)‘*\4規格（2丨0/ 297公沒） 496870 經濟部中夬標这局員工消費合作社印¾ A7 . B7五、發明説明（·=) 。第二组體液生長因子係用為作用在更為分化的细胞以促 進核内再複製之成热化因子。此外，似乎有兩種獨立的生 物回饋遐路來調節這些程序。 有幾種譜系的非特定性造血生長因子對成热化施加重 要的影響。粒性细胞一巨噬妞胞群落剌激因子（GM-CSF) ，間白素-3 ( IL-3) ，IL-6，IL-11 ，白血病抑制因子（ L IF )，和促紅血球生長素，（ΕΡ0)等分別倨別地依其對 MK尺寸，數目或倍數性等之影響而在活體外珥示促進人$ MK成热化。LIF ，IL-6,-和等的MK成熟化效懕相對 於IL-3*部份加成性者（LIF知几刊）或完:全加成性者（ IL-11)。從這些先前文獻這類數據可推測在活體内 (in γίχο )可能需要姐纗介素姐合以促進HK成热化。 下列所列為一些Η於巨核细胞調節和血小板產生的先前 文獻之摘述： norrman, R. et al., Blood Cells 13: 75-35 (1337) Murphy, M.J., Hematolocy/Oncology Clinics of ^crth Λ-nsrica 3 (3): 465-473 (1988). r.orr^an, R#/ Bleed 74 (4): HSo-1212 (1339). -l.M. and Cohen, J.L,, Clzn. Pharmacol. Ther.f 46 (3): 250-256 (1939). Gewirtz, A.M. and Calabrecta, 3., Int. J. Cell Cloning a: 257-275 (1SS0). miliars, N., Progress in Growth Factor Research 2： Sl-35 (139。）· -7 — 本紙ft尺度適用令g国家;CNS ) A4規格（210Χ 297Α/ί1 ^' 3 . 9. 10. 11. 12. 裝 丁 、-0 線 496870 Λ7 __ B7 五、發明説明（5 ) 13. Gordon, M.S. and Hoff r^an, R·, Blood 80 (2): 302-207 (13S2). 14 . Hunt, ?· et al., Ξχρ. rlematol. 21: 372-2S i (1993). 15· Hunt, ?. et ai·, Ξχρ · Hesnatol. 21: 1295-1304 (1S33). 此外，也有報導（參看#考資料16)提及在人類再生不 能性血清中含有異於IL-3*粒性细胞群落剌激因子，和烴 淋巴妞胞調理過的培養基中所含因子等之巨核妞胞群落剌 激活性。不過，促成該活性的分子並未被分難出或在先前 技蕕中被鑑定過。 ./ _ 16.- Mazur, E.M., et al., Blood 76*290-297' (1990) 〇 二一 C·HpI 夸箱 骨铤增生性白血病病毒（MPLV)為一種老鼠複製缺陷性 逆轉錄酶病毒，其會引起被感染哺乳動物發生念性白血病 。據發現MPLV所表現的基因中有一部份编碼著融合到與组 嫌介素受體族，包含GM-CSF，G-CSF ，和ΕΡ0等的受體相 W連的序列之病毒所具逆轉錄K病毒被膜（或外蛋白質般 )° 上述MPLV基因的表現具有一有趣的生物學性質，亦即會 引起各種類型的老鼠前身妞胞立即取得對增生與终端成热 化的生長因子無Η性。再者，有些被MPLV急性轉'形的骨链 妞胞培養物中含有巨核细胞•顯示MPLV基因與巨核妞胞生 長/分化之間有某種關礙] - 目前已被公認者，MPLV病毒基因（稱為y-MpI )在晡乳 一 8 — 本紙乐尺度適用中SIS家標李（CNS Μ4規格（2〖0Χ 297公釐） {·-、"¥c 裝· 線 經濟部中夬標·"局員二消f合作社印製 496870 經濟部中央標李局員工消費合作社印裝 Λ7 B7____ 五、發明説明（° ) 動物细胞中有一同系物*其被稱為妞胞Mpl基因（或 c-Mp〗）。使甩γ-Μρ卜衍生探頭，可選殖出對患於人類 c-Mpl.基因的cDHA。參看PCT公開申請V0 92/07074 ( 1992年4月30日公開；於下文討論之）。序列分析證明被 c-Mpl基因產物所編碼的蛋白質，就像同系的v-MpI基因 產物一般，靥於高度保守性姐織介質受體超族（ superfaini ly ) ° 這種细胞基因.，c-Mp1 ，基於经由RHAse探頭保護和 RT-PCR等實驗發現在正常<]、m的骨餡，脾和胎肝等之中有 其表現、但在其他组缣内則沒表現之结果被認為·其在造 血中扮有楗能性角色。特別者” c-Mpl係在巨核细胞上進 行表現。此外也證實人類细胞基因*人類c-Hpl ，係在 CD 34陽性细胞，包括纆純化的巨核鈕胞和血小板等之内進 行表現。CD34為顯示早期造血前身妞胞的抗原。fc外，將 秦 CD34陽性妞胞接觸對c-Hpl bRNA或訊息圼反義（ ant卜sense)的寡去氧核苷酸時會明顯地抑制CFU-MK巨核 妞胞前身的群落彤成能力，但對於紅血球與粒巨噬妞胞等 的前身則沒有影*。 由上述数據和觀察结果推斷c-Mpl编碼一妞胞表面分子 ，在本文稱之為Mpl受體，其结合到一配體而活化該受S ，可能導致巨核细胞的產生及/或發育。 ' PCT專利公開V0 92/07074係有88從來自人類和老鼠兩 種來源的c-Mpl產生之蛋白質序列。該基因產物如上面解 釋過者被認為是一受體•其係由至少三屆共同區或域所構 (請先3讀背vtr之，¾事項一^||寫本買) 裝 線 本纸杀尺度適月中国國家樣準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 496870 經濟部中夬標準局員二消費合作杜印¾ Λ7 B7五、發明説明（/ ) 成，一细胞外域，一透膜域，及一细胞内（或妞胞質）域 。連接在一起時，這三域即構成完整的Mpl受體。該PCT 公報也提出一種可溶性的受體形式，其實質地對患於成热 c-Mpl蛋白質的S3胞外域。其细胞内域含有一疏水性區， 其在经由透膜區連接到該蛋白質的细胞外域時，即促使整 俚蛋白質圑聚而不溶。相反地，當c-Hpl基因產物的细胞 外域舆該透膜域和细胞内域分開時，其即變成可溶，因灶 •該蛋白質的妞胞外形式被稱為該受體的”可溶”彤式。 下列為某些與上述y-Mp 1」和c-Mpl受體與基因相Η麻的 說明之先前文獻： ' < · 17. Wendlir.g, ? ·, ez al., Leukemia 3 {1): 4 7 5-430 (1339).' ’ 13 . Weridlirig, Γ., ec al., Blood 73 (5) : lloi-1157 (1903). 13. Scuyri, M., et al., Cell 63: 1137-1147 (15SO). 20. Vigon, I·, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5540-5544 (1992). 21· Sko.da, R.C·, et: al·, ΓΛβ £/*£30 vJourna! 12 (7): 2545-2553 (1993). ， 22. Ocawa, M., 31cod 81 (11)： 2344-2853 (1993). * v-- · 、 . 23· N·, et al·, 82 (5) : 1395-1401 (1993). 24. Wendling, F, ec al ·, Wood 80 : 24 6a (1933) · (請先驾者0之注意事項寫本頁 •裝 訂 本紙杀尺度適用申12家標这（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐） 496870 Λ 7 Β7 經濟部中夬糅这局員二消費合作社印¾ 五、發明説明（8 ) D ·能夠剌激也小垢畜生的琢爾之篇导 最近有報導提及在北美，西歆和日本等境内的醫療中心 正K逐渐的速率S施血小板滘输。參看Gordon, H,S, a n d Η o f f a a η , R · , B 1 ο o d 8 0 (2 ) : 3 0 2 - 3 0 7 ( 1 9 9 2 )。這 種增加大半是因醫學技術的進步及下逑技術的更大幅增加 ，例如，心臟手術及骨Μ，心，和肝等的移植等。劑量加 強作為癌症患者和HIV-1流行性的输送治療手段也助長血 小板供給的過童需求。 血小板的使用伴阐著許多1血液性S染病及同種異體免疫 的傳.运可能性。此外，純化血小β板的製備為·昂貴的努力， 因而這種血小板的增加使用會-增高整體醫療費用。因此之 故，對於製僙供人類用的血小板之新穎且改良的方法存在 著緊急需要。 增加血小板製備的範例先前作法分逑如下： 美國專利第5,032,396號報導間白素-7 (IL-7)能夠剌 激血小板產生。間白素-7也稱為淋巴妞胞生成素-1且為一 種促淋巴妞胞生成性生長因子，能夠剌激骨Μ内的Β-和 Τ-细胞前身之生長。公開的PCT申請序號88/03747 ( 198δ年10月19日申請）和1988年10月24日申請的&洲專利 申請第88309977.2號都掲示经由重姐DHA’s技術製備哺乳 動物IL-7的DHA ，戟證，和相關的方法。於該美國專利中 提出的數據顯示IL-7可增加·正常和半致死地照射過的小鼠 之循環血小板。 - 美國專利第5,087,448號揭示经由用間白素：6處治晡乳 (請先絮讀背面之：/χ意事項一 寫、本一貝 .裝 本纸ft又度適用中SS家標卒（CNS ) A4規格（2丨0乂 297公澄) 496870 Β7 經濟部.〒夬標，洋局員工消費合作社印製 五、發明説明（9 ) 動物可剌激巨核鈕胞和血小板的增生。重组人類間白素為 一種具有多重生物活性的26,000分子量醣蛋白。該專利中 提出的數據顯示IL-6具有在活體外增加巨核ffi胞群落的效 應。 上述專利沒有提及任何有《本發明所提的MpI配體。 雖然有上逑諸揭示，對於晡乳動物體内的巨核细胞及/ 或血小板之新剌激劑仍有強烈需求存在。 有Μ仆畢改W MGDF的背# 由於重组DNA技術的進展/结_果使得目前治療用蛋白質可 取得遘查形式且充分的供應量^這些種蛋白:質的化'學衍生 物可以有效地阻斷蛋白水解酵_寒以免與蛋白質主鐽本身行 物理接觸，因而防止降解。其他的優黏包括，在某些情況 下，增加治療性蛋白質的安定性和循環時間及減低抗原性 。不過，必須提及者特殊蛋白質的改質效應是無法預測的 。有一篇說明蛋白質改質和融合蛋白質的評論文章為 Francis, ”Focus on Growth Factors" 3-4-10 (Hay 1 9 9 2 )(為 M e d i s c「i p t , Μ o u n t v i e w C o u r t , F r i e「n Barnet Lane, London N20， OLD, UK所出版）。 聚乙二酵（"PEG”或” pes”）為已用於治療性蛋白質產物 的製備之一種這類化學品。例如，Adagen®，一種经聚乙 二醇化的腺苷脫胺薛方劑即经許可用以治療嚴重'的併發性 免疫缺乏疾病；聚乙二醇化的超氧物技化酶已在臨床實作 中用以治療頭部創傷；聚乙二醇化α -甘擾含已被試用於 第I期肝炎臨床治療中；聚乙二醇化的葡糖腦苷脂醻和聚 一 裝 線 本紙乐尺度適用中ga家標这（CNS ) Α4規格（2丨0X29H$ ) 496870 M濟部中夬標洋局員二消费合作杜印製 A7 B7_五、發明説明（1Q ) 乙醇化的血紅素都已報導處於臨床前試驗中。對於某些蛋 白質，接著聚乙二醇後迓證明可對抗蛋白水解作兩， S a d a , e t a 1 . , J . Feraentation Bioengineering 71 ·· 137-139 (1991)，且已有接著某些聚乙二醇部份Si之方法 可用。參看美國專利第4,179,337號，Davis et al., ”Non-Ianunogenic Polypeptides” ， （1979年 12月 18日核 發）；和美國專利第 4,002,53 1 號》Royer, "Modifying E n z y π e s with Polyethylene Glycol and Product Produced The「eby”，（ 197_/年，1 月 11 日核發）。有闞的 評論可着看 Abuchovski et al·，·於” Enzynes: as Drugs”中 (J . S . Holcerberg and J. Roberts, e d s. p p. 367-383 (1981)) 〇 別的水溶性聚合物也已被用來改質蛋白質，例如，乙二 醇/丙二醇共聚物•羧甲基纖維素，葡聚糖，聚乙烯醇， 聚乙烯基吡咯烷酮，聚-1,3-二噁茂烷，聚-1,3,6-三氧 陸園，乙烯/頭丁烯二酸酐共聚物，及聚胺基酸（均聚物 或無規共聚抱）等。 以聚乙二醇而言，巳有多種手段被用來將聚乙二醇分子 接著到蛋白質上。通常係经由蛋白質上的反應性基將聚乙 二醇連接到蛋白質。睽基，和離胺酸殘基上或N-端上者* 即為方便供這種接著所甩者。例如.Royer (上列美國專 利第4,002,531號）提及使用逭原性烷基化將聚乙二醇分 子接著到酵素。1993年4月28日公開的Vrirht, ΕΡ0 539 167, ^ Peg Inidates and Protein DeriYates —1 3 — 本纸乐尺度適用中3國家標牟（CNS ) Μ規格（210Χ 297公釐） (請先35讀背5之;±意事項 '本一貝 ·.裝 *1Τ 線 496870 Λ7 Β7 五、發明説明（11 )
Thereof”中提及甩PEG的醯亞胺酯衍生物或相鼷的水溶性 有楗聚合物改質具有自由胺基的肽和有櫬化合物。1 990年 2月27日核發给Shaw的美國專利第4,904,584號係有K甩 以蛵由反應性胺基接著聚乙二醇分子而將蛋白質所含許多 離胺酸殘基予以改質之方法。 裝 一種经化學改質過的特殊治療性蛋白質為粒性妞胞群落 剌激因子，WG-CSF” 9參看，歐洲專利公報EP 0 401 384, EP 0 473 2δ8 ，和 EP 0 335 423等。 _ 另一例子為聚乙二醇化的，ΕΡ 0 442 724，發明名 稱為”改質hIL-6” （參看共同&請中的U · S.:S · … 07/632,070)，其揭示加到Ij^ 6中聚乙二醇分子。1985年 9月11日公開的EP 0 154 316提及甩淋巴细胞活與聚乙二 醇醛反應。 線 改質MGDF的能力在技舊中係未知者》其原因在於各個別 蛋白質對改質的感受性係決定於該蛋白質的特定構造參數 之故。再者，這種改質對各蛋白質所具生物學性質的影銮 從技蕕上是不可預測者。如本文所述者，由於MGDF的許多 臨床懕用，因此需要有改變性質的衍化MGDF產物。彼等分 子可能具有在活體内增加的半生期及/或活性，及其他性 質等。 經濟部中央標^局員工消费合作.14印^ 蛋白質分子迻聚乙二醇化後通常會等致化學改'質蛋白質 分子混合物。舉例而言，具有5涸離胺酸殘基和在H-端的 一倨自由胲基以上述諸方法反懕後可等致異节混合物，有 些具有6倨聚乙二醇部份β，有些具有5届，有些3饀， 本紙法又度通用中国國家榡莩（CNS ) Α4規格（2:0X297公釐） 496870
AT _ B7 五、發明説明（U ) 有些2屆，有些1倨而有些則無。此外，於具有幾涸的分. 子中，其聚乙二醇部份g可能在不同分子上不接著到相同 的位置。常需要的是得到均質產物*其中含有全郐只有一 種或少數種（如2-3 )改質蛋白質物種，其在化學物種， 如PEG的數目及/或位置等有變異。話雖如比，對於某一 治療激示而言，如單一，二一及或三一聚乙二醇化物種的 混合物可能為遘當者或可容/忍者。 每批混合物的變異性在開發治療性聚乙二醇化蛋白質產 * 4 物時可能為不利者。於這種·發中，生物活性的可預剷性 是重要每素。例如，業烴證明有超氧物歧化酶與聚乙 二醇的非選擇性结合之情況中_，有幾倨部份的改質酶素係 完全無活性者（P· McGoff et al·, Chen· Phara·
Bull· 36:3079-3091 (198δ))。亦參看，R0se et al·, Bioconjugate Cheaistry 2:154-159 (1991)，其中 報導聯结劑基羰醯肼對蛋白質基質（胰島素）C-篛羧基的 選擇性連接。若治療性蛋白質的组成每批不同時*就不能 具有這種預S性。有些聚乙二醇部份體在某些位置上可能 不像在其他位置结合得一樣安定•而這種情形可能等致彼 等部份體從蛋白質上解雛出來。當然，若這種部份S係無 規地接著且可能因而無規地解離時，則該治療性蛋白質的 藥物動力學就不能正.確地預測。/ 另外高度裔要者為衍化MGDF產物中在聚合物部份體與 MGDF部份體之間沒有聯结部份體者。上文所1述方法的一項 問題在於其典型地済要在蛋白質與聚乙二醇分子之間有一 度適用中S3家標李（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） (对^之：/Z意事項β!寫本一貝 一裝 線 經濟部中央標绛局員工消费合作社印^ 496870 經濟部中央標莩局員工消费合作社印¾ Λ7 B7 ___ 五、發明説明Γ13 ) 麻结部份體。這些聯结部份Si可能具抗原性，這點在開發 治療性蛋白質時也是不利者。 —種不含聒结基的方法戧於F「ancis et al·, ”Stability of Protein Pharnaceuticals : in vivo pathways of degradation and strategies for protein stabilization” (Eds. Ahern. , T· and Manning：, M.C· ) Plenu 屋，，Nev York, 1991)之中。此外 ，在 Fisher etal·,编輯的”Separations Using · i Aqueous Phase Systeas, Applications I n Cell ^ * .. Biology and Biotechnology, PlenuB Press, Η.Υ.» Ν·Υ· 1989 pp· 211-213 中二 ID elgado et al·的 "Coupling of PEG to Protein By Activation with Tresyl Chloride, Applications In Iiiunoaffinity C e 1 1 P r e p a r a t i ο n ” 一 文中提及使用 t r e s y 1 c h 1 o r i d e * 其可等致聚乙二醇部份體與蛋白質部份體之間沒有驊结基 。由於t「esyl chU「ide的使用可能產生毒性副產物•因 fc該方法可能雔以甩來製成治療性產物。 Chaiov et al., Bioconjugate Chea. 5^133-140 (1994)報等到甩一甲氧基一聚乙二醇（"MePEG二醇）醛烴由 逭原性烷基化改質CD4免疫吸附素（CD4 iinunoadhesin )。作者提及有50S的CD4-Ig经在N-端的α/胺基之選 擇性反懕而被PEG-改質（上引資料•第137頁）。此外 ，該作者也提及該改質CD4-Ig (對蛋白質^ 120)的活S 外结合能力會以與Me PEG化程度相闞麻的速率減低（同上 一 16 — 尺度適月申^國"家標注（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先之d意一爭項111寫太頁 .裝 訂 線 496870 A7 B7五、發明説明（14 ) M濟部央標準局員工消賢合作杜印製 綜上所述，對於MGDF衍生物存在著一種需求•且，更特 定言之，對聚乙二醇化MGDF有所需求。此外，也存在著對 於進行這種衍化的方法之需求。 發明粧怵 於一部份中，本發明提出一種多肽，其可特定地促進巨 核鈕胞生長及/或發育（'MpI配體”或”MGDFs”），且其 實質地不含（亦即，分離出者）其他蛋白質（如，於得自 晡乳動物來源的MpI配體i情況中，哺乳動物蛋白質）。 這種蛋胃白質可從烴由天然地或用其他因子謗等下產生因子 的细胞來源纯化出。其亦可用姐遺傳工程技術產生。 ΜρΙ配體更可经由化學技術，或上述技術的姐合合成而得 Ο 本發明Mpl配體可從哺乳動物源以其固有形式製得。本 發明實施例節段中述及從犬的再生不能性血漿中分離出範 例Μί>1配g。不過，在本發明其他實施例中也證明從人類 和豬等兩來源的再生不能性血漿中也存在著密切相闢的 Mpl配體。值得注意者，人，豬和狗等的Mpl配體的届別 活性都會被老鼠MpI受S的可溶形式所特定地抑制•顯示 所有這些Mpl配體（及來自其他哺乳動物，包括老鼠等來 源者）在構造和活性水平土都密切相翮著。 人》豬和其他哺乳動物Mpl配體預料都可從天然來源g 由本文詳述之程序分離而得。參看實拖例1¾。綜上所逑， 本發明《括地包含晡乳動物MpI配體，例如得自拘，豬， (诗先巧贫20之洼意事項^;寫大二貝) .絮. •V5
•M -17- 本戌乐尺度適用中11國家標辛（(：：>；$)六4規格（2丨0.犬297公釐） 496870 ____ B7 五、發明説明（15 ) 人，小鼠，馬，羊和兔子等者。特別較佳的Mpl配體是得 自狗，豬和人者。 ft外，也從人胎&和犴庳選殖出编碼人類mpi配a的基 因並定其頌序，如後面實施钶中所說明者。定出在妞胞基 分析中具有活性的兩種人類多肽序列（參看實施例4 )。 這兩序列的長度彼比不同，但在其胺基酸順序中有一大段 是相同者。該相同的部份對紅血球生成素具同糸性。該
MpI配體在本文内也稱為巨核®胞生長和發胥因子（ • » MGDFs );對於Mpl配體的有一般參考資料也應用於本 文所稱'的MGDF，且反之亦然。'"«HGDF多肽”一詞的意思為具 有可特定地剌激或抑制巨核裡1胞生長及/或發育的活性之 多肽*本文要掲示這種多肽的範例。 本發明Mpl配體經發現在巨核细胞品系中具特定活性， 可增大巨核妞胞的成热作用及/或增殖，如後面的實陁例 2和4分析中所顯示者。”特定地”一詞意為相對於許多其 他细胞類型而言，該多肽對巨核细胞顯示出相對較大程度 的生物活性。對於巨核妞胞具有剌激性者，預期可经由對 巨核S3胞的成热化和分化等之剌激而具有在活體内剌激血 小板產生之活性。 經濟部中夬樣·孽局員工消費合作杜印製 (請先/>1意事項寫本¥; 兩種得自犬源的較佳MpI配體具有烴十二烷基碕酸钠聚 丙烯醢胺凝穋電泳法（SDS-PAGE)在非适原性條'件下測得 約25 kd和31 kd的表18分子量。於後面貫施例中詳述的相 同纯化程序中纯化出兩種蛋白質。 1 兩種較佳的人類配體，MGDF-1和MGDF-2*長度分別為 一 18 一 本紙ft尺度適用宁gg家標毕（CNS ) ‘Μ規格（2丨0 X29了公釐） 496870 經濟部0·-夬禕莩局員工消費合作··；4印製 Λ7 B7 五、發明説明（16 ) 332和173胺基酸，不包括21饀胺基酸的擬定信號肽。這 些序列，及第三種相覲分子，MGDF-3，皆示於圖11和〗2。 本發明的另一部份為從哺乳動物源，較佳者全血液，血 清或血漿分難和纯化本發明Hpl配體或其片段的方法。再 生不能性血液，血清或血漿為特別較佳的起始物。再生不 能性血液，血清或血漿可由下述方法取得；用辐射源，例 如鈷- 60，Μ約400-800霄得（Rad)的辐射水平照射哺乳 動物使其再生不能。這種程序係技藝中已知者，如下文實 施例1中所引文獻中所說明< 曼。於人類的情況中，经照射 的血液，血漿或血清可得自辐射治療，如治:療癌症後的患 者。 之後，對該再生不能性血液，血清或血漿施以纯化程序 。本發明所提出的纯化方法包括下列貼鍵程序：外源擬集 素親和層析術和MP1受體親和層析術。這些程序都可導致 得自犬再生不能性血漿的25至31 kd兩蛋白質達到約 300-50 0倍的纯化。其他的標準蛋白質纯化程序也可與上 述程序一些包含在本發明方法中以進一步纯化本發明的 Μί>1配體，如下文詳细說明的程序。 本發明的另一部份包括嘏碼哺乳動物ΜρΙ配體蛋白質的 表現之多核苷駿。這種DNA序列可能包括堳碼本文所逑晡 乳動物Mpl配體蛋白質表現的经j*析DNA序列。’彼等DNA 序列也包括在該Mpl配體密碼序列兩倒的5,和3,晡乳動物 非密碼序列。彼等DNA序列可更編碼胺基端&信號肽。彼等 _ 1 · 序列可经由已知方法製得，包括完全或部份的化學合成。 一 19 一 本紙&尺度適用中33家禱这（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） (請-§贫227之2意事^^:寫本頁) 裝 線 496870 Λ7 B7
五、發明説明G 經濟部中夬標洋局員工消費合作社印製 該等密碼子可经最 進行表現〔如，大 此外，本發明也 vector DHA)和 IS DHA分子提供Mp 1 主妞胞内的複製與 態。本發明也提出 DHA分子轉彤過的 胞，昆蟲掘胞•酵 本發&的D N A分 種新穎的製備重组 之方法。於該方法 現之D Η A序列（或 制蛋白質表現的適 合狀態而轉形所得 條件下進行培養。 胞作為蛋白質表現 Mpl g體的鈕胞系 菌妞胞（如•大腸 用大腸桿菌生產 蛋白質H-端之Het 典型地較高之故。 胺基酸的Met-Lys [卜 163] MGDF (從 遘化以在经選擇甩來表現的宿主S胞内 腸桿菌（L· Π 〇 1 ?)或C Η 0妞胞）。 提出重姐DNA分子，各包括載SiDNA ( 碼一晡乳動物Mpl配體的DHA序列。該 配體DHA與能舞導引MpI配體在所選宿 表琨之調節性序列一起處於搡锿鍺合狀 用以表現.重姐MpI配體蛋白質的经這種 宿主细胞（如，细菌细胞 '晡乳動物@ 母妞胞或/植_物细胞等）。 子和经轉形细，都用於另一部份中，一 哺乳動物MiL配體蛋白質，或其fe片段 中•用K编碼MpI蛋白質或其片段的表 如上所述之重姐DHA分子）與一能夠控 當調節性或表現控制性序列處於操縦締 细胞系於可使重组DNA進行表現的適當 該專利申請方法可以採用許多已知的细 用之宿主细胞。本發明較速合於產生 為哺乳動物妞胞系（如，CH细胞）和妞 桿菌）。
MpI配體時，較佳者為採用在要表現的 和L y s殘基，i其所得表現產'物的產率 特別較佳的表現產物為全部具有165倕 人類 MGDF (亦即，Metw-'lys-1 成热蛋白質的第一倨胺基酸開始S號） 20 本紙乐尺度適用令3国家標注（〇^)六4規格（210犬297公/$) 背 云 之 意 太 Έ 496870 ___B7 _ 五、發明説明（13 ) 。將在鈕菌细胞，如大腸桿菌之内表現所得產物予以纯化 出之後，可用酵素，例如二肽酶（如，组織蛋白酶C)等 處理而税除掉鐽端Met-Lys殘基。 然後，以適當的傳铳手段從宿主妞胞，细胞溶裂物或焙 養基内收取表現出的Hpl配題蛋白質。調理過的培養基可 羥由相同的纯化步猱或其修改步猱，如從再生不能性血漿 中分難MpI配體所用者予虔理（參看實施例7 )。 於本發明另一部份中，提出重组MpI配體蛋白質。這些 • * 蛋白質實質地不含其他哺乳/動，物質*尤其是蛋白質。本 發明Mpl配體蛋白質的其他特徵-在於含有一:或多種本文所 述的物理.，生化學，藥學或0等活性。 本發明也有藺由MGDF蛋白質部份體連接到至少一種水溶 性合物所構成的化學改質HGDF，以及這種姐合物的製備方 法及其使用。特別者，本發明包括化學改質MGDF，其中該 MGDF物種係與反B性聚乙二醇分子反懕而使PEG接著到 MGDF。這種接著可用本文討論過的聚乙二醇化反應予以完 成，例如，用醱基化或烷基化反應等。用PEG進行醯基化 或烷基化反窓可在主要產物為一聚乙二醇化或多聚乙二醇 化之條件下進行。多聚乙二醇化通常包括將PEG接著到離 胺酸殘基的ε-胺基且可另外包括在多肽的H -端聚乙二酵 化。一聚乙二醇化較佳者包括將#EG接著在蛋白'質Ν-端的 α -胺基。該一聚乙二醇化反應的產率和均一性可经由一 種堪原性烷基化予以增進，該種反懕係將MGtF蛋白質部份 βΗ -嬙殘基的α -胺基予以選擇性地改質，藉而侄成水溶 本纸杀尺度逍用中SS家標辛（CNS ) Α4規格（2!0;<297公釐） (請先 之注意事項寫本頁 -裝 線 經濟部中夬標绛局員工消資合作社印製 496870 Λ： Β7 五、發明説明 19 性聚合物部份體選擇性接著到蛋白質的端。如灶可得實 質均一的聚合物/MGDF蛋白質结合體分子的製備及（若使 用聚乙二醇時）使聚乙二醇部份體直接偁合到蛋白質部份 體的聚乙二醇化MGDF蛋白質分子之製備。 本發明的另一部份提出醫藥组合物，其含有治療有效量 經濟部中夬標.洋局員工消費合作杜印裂 的經難析之天然發生或重组Hpl配體，其可用水溶性聚合 物•例如聚乙二醇予以衍化，過；及g藥可接受的載趕，稀 釋劑，或賦形劑。這種醫藥组合物可甩於治療其特徵為p 核细胞及/或血小板缺乏以-及」活體内（丨117丨1〇)^1配體 缺乏等的疾病狀態或疾病之方i中。其亦可顏防性、用來 改菩預測的巨核ffl胞或血小板^乏（例如，因手術而致者 )° 依此，本發明的Mpl配體可以用來治療再生不能性貧血 症，例如，增強血小板產生受損患者的血小板產生（例如 •AIDS·患者或正進行癌症化學治療的患者）。^1配體可 用來治療血液疾病，例如，血小板減少症。Mpl配體可用 於骨越移植患者的輔助治療。這類患者可為人類或其他晡 乳動物。得自一物種的MpI配體也預期可用於另一物種。 所以·本發明的另一部份為一種治療用血小板缺乏所専 致的這些和其他病理狀態之方法，其包括给患者狠甩治療 有效量的上述醫藥姐合物。這種给療方法可包括'與Mpl配 體同時或頫序地給用有效董的至少一種別的巨核鈕胞群落 剌激因子，组銪介素（如EP0)，可溶性MpI受體，造血 素，間白素，生長因子，或抗體等。 一 22 — 本纸乐尺度適用申SS家標注（CNS ) A4規格（2丨0,< 297公沒） (請先yd背云之：：5¾事項寫大二貝 裝 訂 496870 經濟部中夬標注局員工消费合作.社印製 Λ7 Β7 五、發明説明（2G ) 本發明的另一部份提出抗體（多株，單株，人化，和重 姐等型），和抗體片段•其係對抗晡乳動物Mpl配體或配 脖片段者（亦即，對彼等具反應性者）。所Μ，本發明該 部份中的一部份包括能夠分泌這種抗體的妞胞（如，在單 株抗體情況中的雜種瘤（h y b「i d ο β a s )，及其製镨方法與 其在診斷或治療程序中的兩途等。 本發明的另一部份為體液，含有MpI配體之分析。這種分 析可採用以單一抗體或”三明治”（sandvich).格式特定地 辨識Mpl配趙之抗體。這種/分_析可Μ用來判定患者是否需 要由外^給用ΜρΙ配體及/或這種患者是否1可能经歴血小 板缺乏或疾病。這種分析可貞|1包含在配套藥方式中》内含 陽性和陰性的對照，抗體》及其他標準配套藥劑成份。 本發明的其他部份和優點可從後面較佳實施例的詳钿說 明而獲得閜明。 _ 滄匾之簡玖銳明 本發明的許多特性和優點可從繪圖的閱覽而變得明顯， 其中： 圃1所示為巨核细胞和血小板的發育和成热化之綜蓂。 圖2所示為可溶性老鼠ΜρΙ受體實質地完全抑制受照射 拘血漿（”再生不能性犬血漿”或” APK9”）誘導巨核妞胞發 Η之能力。巨核细胞發頁的分析^於實施例2中、 圈3所示為APK9S外源擬集素和Hpl受體兩種親和層析 術程序增強的活性（”Mp1配體”）剌激1Α6.Ί细胞的生長 及可溶性老鼠Mpl受體阻斬該生長之情形。 -裝 訂 線 一 23 - 本纸法尺度通用中g國家標李（CNS ) A4規格（：!丨0 X 297公釐） 496870 Λ7 B7 _ 五、發明説明（21 ) 團4所示為從再生不能性犬血漿纯化25和31 kd兩形式 的犬Mpl受β所包含的純化步驟缌覽。 團5所示為甩逆相HPLC (RP-HPLC)純化ΜρΙ配體。洗提 份21含有高度純化的31 kd HpI配體；洗提份22含有31 kd和25 kd兩種Mpl配嫒的混合物；而洗提份23含有高 度純化的25 kd MpI配超。 圖6所示為含有25及/或.31 kd兩種MpI配體蛋白質的 逆相HPLC(C4管柱）洗提份中之Mpl配體活性.的比較。. 圖7所示為JgCD34-選擇^_的周圍血液细胞培養物甩 APK9，hpl配體和各種其他因¥予以剌激所:產生的'巨核妞 胞之数目。 圖δ所示為SCD34-選擇過的周圍血液细胞培養物用 ΑΡΚ9，Mpl配體和各種其他因子予以剌激而產生的缌白血 球数目。 團9所示為经CD34-選擇邊的周圍血液细胞培養物甩 APK9，MpI S體和各種其他因子予以剌激而產生的巨核鈕 胞百分比。 圖10所示為未#與在Mp卜配體-誘導巨核妞胞發甭中的 人類IL-3。 圖11所示為cDHA和推演所得人類MGDF-1和HGDF-2的胺基 酸順序。 " 圈12所示為cDHA和推演所得人類MGDF-3的胺基駿顒序。 圈13所示為HGDF-1與得自犬源（A)和老鼠1源（B)的 、 -；. MGDFs (MplSSf)之間的比較。 一 2 4 — 本紙乐尺度適用tS國家糅李（CNS ) Μ規格（210X 297公釐） (請先黑之·一基某III寫木頁 '裝 線 經濟部中夬標準局員工消費合作社印製 496870 Λ7 B7 五、發明説明（22 ) 鼷14所示為用一甲氧基-聚乙二醇的N-羥基丁二醯亞胺 基（HHS)活性酯將MGDF醯化等到聚乙二醇化產物之實施钶 Ο 圚15所示為用一甲氧基-聚乙二醇醛進行非特定性 MGDF還原性烷基化得到多聚乙二醇化產物之例子。 圖16所示為用一甲氧基一聚乙二醇醛在N-端殘基的α-胺基進行部位特定性MG DF還，原性综基化等致實質的單聚乙 二醇化產物之實例。 圖17所示為用MV 20kDa MePJG活化衍生物製得的 “？£0-)^0?结合物之粒度排外^£(：)[1?1^分:析结果_; A.甩MePEG (PEG 11)的將MGDF醱化製成的多 -MePEG-MGDF-结合物； B·甩MePEG醛（PEG 20)將MGDF烷基化製成的多 -MePEG-MGDF-结合物； C.用MePEG醛（PEG 16)將MGDF烷基化製成的單 -MePEG-MGDF-结合物。 圖18所示為用重姐人類MGDF處理小鼠後的血小板計數之 空心菱形=CH〇-衍生22-353 MGDF ;空心圓=未聚乙二醇 化的大腸桿菌22 -1 84 MGDF (亦即，1-163 MGDF);及空 ’心圓=聚乙二醇化的大腸桿菌22-184 MGDF。 匾19所示為7-HuMGDF的纯化流/程圖。 圖20所示為在老鼠Carboplat in模型中7 -HuMGDF (大 腸桿菌卜163 )對血小板計數的影《，於第、日時，用單 劑的CarbopUtin (1.25奄克/小鼠经腹膜内注射 一 25 — "^^^度適用中3國家標洋（〇^)八4規格（2丨0/ 297公釐） (請先½讀背云之注意事ιρι寫本頁 •一· 訂 ^6870
經濟部中夬標準局員二消贫合作.杜印製 五、發明説明（23) Balb/C小鼠。只有賦形劑的组則不加Ca「b〇pUUri 。於 小時後，於研究的其餘天数内每天用陚形劑或1〇〇 ^ s/ks 7 -HuHGDF经皮下注射gCarboplatin-處理的動物 ° (每〜组，n = 10;於每隔一時點，將5隻動物放血）。 圖21所示為7 -HuMGDF的（大腸桿菌卜163 )對於经照 射虔理遇的小鼠所具血小板計數的影響。在第〇天甩5 00 雷得輻射（緦源）單劑.量照射Balb/c小鼠。只含賦彤 劑的组未受照射。於24小時後，在其餘的研究天數内每天 甩賦彤劑或100 z/s/ks 7」Hu_MGDF经皮下注射受照射動物 (每一ί§·η = 8 ;於每隔一時鈴時將4隻動:物放血·）。 圖22所示為7 -HuMGDF的腸桿菌卜1 6 3 )對於经照 射和Carboplatin组合處理過的小鼠所具血小板計数之影 響。於第0天時，用500雷得7 -辐射（緦源）照射 Balb/c小鼠並給甩Carboplatin (1.25毫克/小鼠）於 24小時後•在其餘研究天數中每天用賦形劑或1〇〇 ^ g/kg 7-HuMGDF烴皮下注射試驗動物（每姐n = 3 )。沒有 7 -HuHGDF的支撐時，大部份的動物在此研究中都不能殘 存。於對照组中，8隻動物中有1隻殘存。於處理组中， 8隻鲂物中δ隻都存活。 圖23所示為7 -HuMGDF的（大腸桿菌卜1 6 3 )對於@河 猴照射誘導血小板減少症之影W。使恆河猴接受、射（ 7 00 cGy Co-80 )。於照射後24小時起的18連績天中，g 皮下绘用7 -HuMGDF (n = 3)或人類血清白蛋泊（(各 為25¾克/公斤/天）。甩電子血球分析儀進行血球分析 一 2 6 一 本紙乐尺度適；ga家標注（CNS ) A4規格（210X297公浚) (請先父贫呈一之_一爭項III! 一貝) •裝 ，·α 線 496870 經濟部中夬標绛局員工消费合作社印製 AT B7五、發明説明（24 ) 。每一符號代表平均值（+/- sei )。 匾24所示為经聚乙二醇化與糖苷化的7 -HuMGDF對於经 Carboplatin和照射等處理過的小鼠所具血小板計數之影 響。依圖22進行的研究所逑對小鼠施以Ca「bopIatin和照 射之组合處理。於處理後2 4小時開始的天數中，每天经皮 下注射所示7-HuMGDF製萷（50微克/公斤/天）。甩電 子血择計数器（Sysssex，Ba.xter)於所示天進行血球計數 0 圖25所示為具有大腸桿菌/最化密碼子的重姐人類 , * MGDF，匕基酸卜163之合成基因-序列。 發明夕洚^銳明 本發明的其他部份和優點可由諳於灶技者從思考下列詳 逑本發明搡作的說明中明顧得知。 本發明所提出的新穎哺乳動物巨核细胞生長促進，及/ 或血小板產生因子*稱為MpI配體者為實質地不與其他 31種含蛋白質物質締合之均一蛋白質。較佳者，該蛋白質 中有約9 0X不為其他蛋白質，特別較佳者•有約9 5 5!不為 其他蛋白質，且最佳者約有298X不為其他蛋白質。這些 蛋白質可经由重组技術產生，Μ大量製備供治療愿用所甩 的纯活性Mpl配體。另外，這種蛋白質可從晡乳動物再生 不能性血液，血漿或血清，或從故分泌或表琨Mp] S體的 晡乳動物妞胞系等Μ均勻形式取得。再者，也可g由化學 合成得到Mpl配體或其活性片段。 I、 * 槪括而言，本發明所用”Mpl配體”之意為本發明所揭示 (請先托專\0.之泛意事項|||^寫本一貝) —裝
、1T 線 一 27- 本纸ft尺度適用中家標卒（CNS ) A4規格（2i0,< 297公釐） 496870 Α7 Β7 五、發明説明（25) 的，於下文較詳妞說明的MpI配體及其活性片段和變化形 式。 丨裝 得自犬源的兩種較佳MpI配體具有用十二烷硫駿納聚丙 烯醢胺凝g電泳（SDS-PAGE)在非适原條件下澜定的表觀 分子量：約25 kd和31 kd。這兩種蛋白質都是用後面實施 例節段中詳逑的相同纯化程序予K纯化.。例如，兩種MpI 配體都结合麥芽外源凝集素，並固定化MP1受體。該25 kd 形式包含下示胺基酸序列： ^
I
Ala-?ro^?ro-Ala-Xaa-As?-?ro-Arg-Leu-Leu-Asn-Ly3-Met-Leu-
Asp-Ser-rns-Val-Leu-His-Xaa-Arg-Leu-Xaa^GIn-Xaa-Pro-
Asp-Iis-Tyr (SEQ ID NC: 1)*.- 訂 該31 kd.形式包含下示胺基酸序列\ ^-^~A-S~X2.a-Asp-Pro-.2Lrg-Leu-Lci:-Asn~Lvs-Met-Leu-Arg-Asp-Ser-His-Val-Leu-His (SZQ ID NO: 2). SEQ ID N0S:1和2中的"Xaa”胺基酸為不能確定地得知者 ’不過預料其為半胱胺酸，綵胺酸，蘇胺酸，或（較不可 能者）色胺酸。 經濟部中夬標辛局員二消費合作社^製 從上示兩序列可以看出該31 kd配體包含至少一部份的 2 5 k d形式。特別者，該3 1 k d _白質的前面2 ί届肢基酸 與25 kd蛋白質所含者完全相同。此證據，及特別者，兩 種蛋白質在本文所提MP1配體活性分析中都凜有活性之車 茛，可以推斷兩種蛋白質在構造和活性上有非常密切的Μ 496870 _____B7 五、發明説明（2S ) 鞯。該31 kd形式的蛋白質與該25 kd彤式在编碼彼等蛋 白質的基因之差示Ο端頋序，差示糖基化及/或差示接合 等方面可能有不同。 除了上逑序列資料外，在最化纯化步摄（用逆相HPLC) 之前，對25 kd分離帶的序列分析中澜定出另一序列。該 序列经發現係在非堪原條件下而不是在适原性條件下與 25 kd帶締合，顯示其為該》5 kd蛋白質被切斷成兩部份 (如，经由蛋白酶作用者）的结果，該兩部份；係由二硫鍵 维繫在一起的。該序列為_
Thr-Gin-Lys-Glu-GIn~Thr-Lys-Ala-Gln-Asp-VaI-Leu-Giy-Ala-
Val— Ala一Leu (SZQ ID NG: 3)— ， 雜然SEQ ID N0:3在25 led蛋白質序列中的正確位置尚 不清礎，不過，類似於其他细胞活素，例如促紅血球生成 素等者•該序列可能發生於25 kd蛋白質中睽基驗114之 附近。必須提及者，有可能，雜則尚未證明者，SEQ ID H0: 3也發生於該31 kd蛋白質内，也許同樣地淀胺基駿 114附近起始。該序列資料在簧施例7中會另外予以詳细 討論。 自從如上文β述者，犬配體的初始纯化實驗之後，至今 已選殖出編碼該犬配體的基因。k结果為已定出如圖13Α 所示的該犬配體的全長度胺基酸顚序。基於分子量計算， 可預潮該25 kd和31 kd犬配題為圈13 Α所^示全長度配g 的C-媸定理形式。另外也得到一種老鼠Hpl配體，其具有 本紙ft尺度逍用中國國家標李CNS ) A4規格（210X297公釐） (詩先K讀背云之注意事項ί -裝丨 π{?7·本一貝 線 經濟部中夬標辛局員工消费合作ii印製 496870 Λ7 五、發明説明 圈13B所示之顧序。 彼等纯化配體也可Μ甩實腌例2所述人類巨核妞胞分析 予Κ鑑定其比活性，而為至少約5·7 X 1〇θ巨核妞胞單位 /毫克。一届巨核妞胞單位的定義為導致產生與1微升 ΑΡΚ9標準對照用實施例2所逑分析法所得一樣多的巨核细 胞之物質量。 這種纯化配體的其他特激.為其在實施例4的Μί>卜依賴性 细胞生長分析中所得比活性至少約6.9 X l〇Q细胞生長單 位/毫克。”妞胞生長單位」的_定義為在實施例4分析中導 致20 0 1 A6. 1细胞生長所箱配jf 11。 下面的表1列出根據本發@際纯化所得犬Mpl配體的 其他特殊活性計算： (诗先¾讀背云之注意事項寫本頁) 装· 訂
Mp 1配體 31 kd 25 kd 表 1 1A6. 1分析 (望份/豪克） 6.52 X 10° 10.5 X 10° 人類M e g分析 (罝位/¾京） 5.7 X 10° 14 X 10® .¾濟部中夹媒绛扃負v\消贫合作社印一^ 缌括上述資料，本發明的一些範例MpI配S具有下列一 或多項生化和生物性質·· ’ U)彼等Mpl配題係從犬的再生不能性血漿分艨出來的
• - L ; . (b)彼等Mpl配體具有依12-14X十二烷疏酸納聚丙烯醯 30 ^^^^1用中§国家標立.:（：>^)‘*\4規格（2;0;< 297公釐） 496870 經濟部中夬標.洋局員工消費合作社印¾ Λ7 _ B7五、發明説明（23 ) 胺凝接電泳法（SDS-PAGE)在非遢原性條件下澍得之約 25 kd或31 kd的表観分子量； (c) 彼等MpI配體包含下列胺基駿序列·· 於25kd蛋白質的倩況中，SEQIDH0:1 ;或 於31 kd蛋白質的情況中，SEQ ID NO :2 ; (d) 彼等MpI配體另包含胺基酸序列SEQ ID Η0··3 (特 別較佳者為在25 kd蛋白質，内者）； (e) 彼等Mpl配體會结合到麥芽外源凝集累； (f) 彼等MpI配體會结合/到_经固定化的可溶型老鼠Mpl 受體；， '·， U)彼等MpI配體的活性活體外（in Yitro)會被可 溶性Hpl受體所抑制·，及 (h)彼等MpI配體在約δ-9的pH值下會结合到陰離子交 換管柱上。 本發明較佳Mpl配體的生物活性係K其在實施例2的巨 核细胞生長促進分析中特定地剌激巨核细胞生長和發育之 能力而展現的。於該分析中，在8天培養期間，Mpl配體 剌激人類周圍血液CD34‘妞胞（亦即，经免疫吸附所選出 的CD-34妞胞）的分化。巨核细胞係甩特定的抗一血小板 抗原抗體予K染色鑑定並以顧微術計数者。HpI配體也剌 激因子一依賴性鈕胞系，1A6. 1 、之生長。於沒'有MpI配 娌之情況中，ffl胞會死亡。在用Mpl配體掊養2天後，估 算1Α6· 1鈕胞数。 " 上逑Mpl配體具有如上面表1所列之比活性。 (請先聞請背云之注意事項β寫本I) Ρ一· •裝 訂 線 一 31 一 本纸法尺度適用中S3家標这（CNS ) Α4規格（2丨0乂 297公釐） 496870 Λ7 B7 五、發明说明（29 )
Mpl配S源已被澍定過為再生不能性晡乳動物血液，血 漿，或血清。不過•彼等配B的來源並不預期受限於這些 已知來源而可能包括其他的晡乳動物體液，從彼等所得妞 胞等。 從哺乳動物源纯化天然MpI配II的程序係根據下列兩種 翡鍵性纯化步猱： (a) 外源凝集素親和層析，術，較佳者係用麥穿凝集素； 及 . (b) 经固定化的Mpl受雅/親ja層析術。 此外，可以包括其他步揉K 1T—步纯化蛋：白質/例如離 子交換層析術，膠濾層析術，JlO逆相層析術等。_ 實際上用以從犬再生不能性血漿取得Mpl配體的纯化技 術包含下列步發[(#看，實施例7)： (a) 外源凝集素親和層析術（麥芽凝集素層析術為特別 較佳者）； (b) 可溶性Mpl受體（MP卜X)親和層析術（較佳者，使 用经固定化的老鼠Hp卜X); (c) 難子（陰離子或陽«子）交換層析術（較佳者，甩 陰離子交換層析術；特別較佳者，用Mono Q管柱）； (d) 猱漶層析術*係在解離狀況下進行的（較佳者，使 / ， 用 Superdex 200 + SDS);及 (e) 逆相層析術（較佳者，使用04管柱）。 對再生不能性血液，血清或血漿，或其他u哺界動物MpI 配體源，例如，钿胞或姐嫌等來源施以上面的纯化程序即 -32 — 本纸ft尺度適用tgg家標这（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (騎先Μ:ΰ背5之泾意事項1||^寫本頁 -裝- 經濟部中夬標.準局員工消費合作.社印¾ 496870 Λ7 _B7 五、發明説明（3(3 ) 可得到均一的晡乳勡物Mpl配體，包括人類配Si。這些步 R並不要求以特殊順序進行，不遇仍以上面所列順序較為 逋當。焙養可用來產生Mpl配體的妞胞（或姐嫌源）之程 序係諳於此技者所已知且可用來，例如，擴大起始物的供 給者。
Mpl配體或其一或多種肽片段也可以烴由重姐技術來產 生。為了得到特別Mp 1配體.的DN A序列，要將純化Mp 1配 體物予以退原並視霈要蛋白酶，如胰蛋白酶予K消化。用 傳统技術分離出酵素分解片/段_並定其順序。另外，如本發 明實施例所舉例說明者，可將倨鈍化蛋白:質根據'可得蛋 白質的量直接定其序列到可能1釣程度•然後以類似於下逑 程序中的巳定頹序之胰蛋白_分解片段使用該已定順序的 區段。用遺傳密碼合成寡核苷酸探頭以預滴缅碼巳定顒序. 的片段所具胺基酸顚序之所有可能順序。較佳者，產生幾 種簡併性序列以作為探頭。用這些探頭篩選晡乳動物基因 姐庫或其他來源而鑑別出MpI配體基因。此外，也可以用 取自Mpl配體细胞源的*RHA製備cDHA庳，然後甩探頭對其 進行篩選以鑑別编碼MpI配體多肽的cDHA。再者*可以甩 連當的引物KPCR技術來擴充cDHA序列。 使用這些探頭篩選基因组庳後•即可得到DHA条（ clone)。為了得到全長度系•可k用根據所得DHA序列之 探頭再篩選該庫並雜交到全長度MpI配體DHA序列。
MpI配體的人類cDHA也可K烴由將全長度h人類基因姐系 分殖到表琨媒體内，將其轉移慼染到cos细胞中，用這些 一 33 - 本纸法尺度適用中ag家標準（CNS ) A4規格（：Μ0·Χ 297公釐） (請先閎讀背云之..2意事項寫本頁 訂 線 經濟部·〒夬標注‘局員工消费合作杜印裝 496870 經濟部中夬樣.洋局員二消賢合作.社印¾ _ B7_ 五、發明説明（3Ί ) 轉移慼染COS ffl胞製備cDHA庳並经由雜交Mf>l SgcDHA進 行篩選等程序製得。在完整cDNAiS鑑定出後，可將該 cDHA或其缗碼MpI配體活性片段的任何部份等到多種表現 媒S中的任何一種之内而製備成該Mpl配II或其一或多種 片段之表現系統。 迓由重组技術的這種使用，可得到煽碼MpI配體多肽的 較佳DNA序列。本發明也包_括這些DNA序列，其不和编碼 其他蛋白質的DNA序列相締合（亦即，其為隔離者），且 * » 其编瑪具有MpI配超活性亦_即，巨核妞胞生長及/或發 展）·的ίίρΐ SB多肽之表現。^些DHA序列:包括综碼整倨 MpI配體或其片段的序列及雜·較佳者在嚴緊雜交狀態 下雜交到cDHA序列之序列〔#看，T. Maniat is et al ., Molecular Cloning (A Laboratory Manual)； Cold Spring Harbor Laboratory )1982), 387 至 389 頁〕。 範例嚴緊雜交條件為在62-67 下，於4 X SSC中雜交 ，接著在62-67 t；下，於0·1 X SSC中洗約1小時。另外 *範例嚴緊雜交條件為在40-45它下，於45-55¾罕醯胺， 4 X SSC中雜交。 於鬆弛雜交條件下雜交到HpI配娌的序列且编碼具有 Mpl配體生物性質的Mpl配體肽之DNA序列也編碼本發明 新穎Mpl配體。這種经鬆弛嚴緊嶷交條件的例子'為在 4 5 - 5 5 Ό 下，4 X S S C ，或甩 3 0 - 4 0 3ί 甲醯胺在 4 0 - 4 5 下 雜交。例如，與Mpl配體序列共有明顯同^性區域，例如 一 * ，糖基化或二疏键结等部位且埵碼具有一或多種Mpl配體 (請先之注意事項頁 裝 訂 線 本祆乐尺度適用占ga家標注（CNS ) Α4規格（2丨0,<297公屋） 496870 __ _B7___ 五、發明説明（32) 生物性質的蛋白質等之DHA序列顯然地编碼Hpl配體多狀 ，即使這種DHA序列不會嚴緊地雜交到該MpI配體序列亦 然。 此外，本發明也包括编碼HpI配體肽序列的DHA序列之 對偶基本變異體（在物種群中自然發生的可能會或不會等 致胺基酸變化的鹼變化），及其類似物或衍生物。類似地 ，本發明也包含编碼Mpl配^多肽但因遺傳密碼簡併性® 成密碼子使甩的不同之DHA序列，或因點突變.或誘導改.質 藉Κ增進所編磚多肽的活性半生期或產生等所引起的 ΜΡ1·配_體DHA序列之變異體。^ 遵從後面實施例11所述選痕1§序而導致本文所揭示的人 類蛋白質MGDF-1，MGDF-2，和MGDF-3的胺基酸序列和 cDHA序列。MGDF-1為圖11所示的胺基酸22-353且含有332 倨胺基酸。MGDF-2和MGDF-1的截取部份，而為在匾11中所 列的胺基酸22-195。所以，MGDF-2含有174倨胺基酸。 MGDF-3為匾12中所列的胺基酸22-289而含有268借胺基羧 。於本發明所揭示的每一 MGDF中，包含信號肽的分子，例 如圖11和12兩者之中的胺基酸卜21也為本發明多肽的一部 份•不過，對於要展現的巨核ffl胞生長和發育活栓而言* 最好將其脫除掉。摘要而言· MGDF1-3的定義如下： (讀先拳V/1事項寫本\貝 裝 線 經濟部卞夬樣注局員二消資合作杜印製 HGDF-1 胺基酸 22 -3 53 ’ 圖11 HGDF-2 胺基酸 22-195 圖11 HGDF-3 胺基酸 22-289 圖1 2 1 於本發明所提諸分析中 ，MGDF-1和MGDF-2皆具活性而 一 3 5 — 本糸杀尺度適用中国1[家標莩（〇>；$)六4見袼（2丨0.乂 297公釐） 496870 Λ7 B7 M濟部中夹褚绛v\消贫合作社印装 五、發明説明（33 ) MGDF-3則否。 基於本發明所提活性 in vivo )表現成賁質 其含有可變的C-端胺基 )之後，該经處理形式 。從上述候說看來，相 理（如，用蛋白酶切斷 MGDF-2)具有活性之事 用MGDF-1基因轉染遇 基（活體外原）在後面 活性。另一方面，在其 看到該分子的活性。據 夠處理MGDF-1分子，也 活性的分子為经截取之 子。 自上述寂說來看，從 導致多種活性分子。在 (EP0)内保守住的構造 胱胺酸。#看MGDF-1序 且機能性必要的構造之 MGDF-1截取變形體為具 (伴阐著信號肽之切断 要從C-端除去50至185 去90至172桓胺基酸。
數據，候設人 地非活性或較 駿。於切去C-的分子即持有 信MGDF-1為展 )。，截取形式 實即可支持此 的人Ws 293 實施例的细 他细胞^，如 信，這種结果 許是烴由截取 彤式，而32D 類HGDF係在活體内（ 低活性的前體多肽， 端胺基酸（及信號肽 活性或變得更具活性 現其活性可能需要處 的 MGDF-1 (即， 假說。. . 细胞之烴調理過焙養 胞分析:中確實展現出 32D迎胞之中，則未 可能代表293细胞能 •使得基本上促成該 细胞則不能處理該分 MGDF-1序列（圖11)烴截取後可能 细胞活素族，如，促紅血球生成素 特點包括四條α -嫘旋束和四倨半 列，Cys 172為這些演化性地保守 最C-端元件。所以，較佳的 有胺基酸ί73至3 53的C:5S截取段 )之任何者。較佳者，MGDF-1序列 倨瞭基酸*特別較佳> /從C端除 如本發明所揭示者*信號肽的長度 36 適用宁家標辛（CNS ) A4規格（210X 297公釐 (請先之·.一^事項本頁 -裝 -C-5 496870 Α7 Β7 五、發明説明（34 ) 被 認為 是21 倨胺 基 酸 ，· 不 過，根 據 MGDF-1 的 順 序 9 該 信 號 肽 可能 具有 23倨 胺 基 驗 0 綜上所 述 ，本發 明 也 特 S9 包 括 對 懕 於本 文所 提但 從 圖 11或 12的位 置 24起始 之 多 肽 〇 下面 所列 為可 能 具 有 活 性（亦 即 ，促成 巨 核 m 胞 及 / 或 血 小板 生長 的能 力 ί 或 對 自然受 體 的抑制 / 剌 激 活 性 等 ) 的 某些 特別 較佳 之 HGDF-1 變體： HGDF -4 胺 基 酸 22-172 圖 11 HGDF-5 胺 基 酸 22-177 圖 11 . MGDF -6 胺 基 酸 < 22-191 圖 11 HGDF-7 胺 基 酸 22-198 圖 11 1 HGDF -8 胺 基 酸 2 2-is 5 圈 11 HGDF -11 胺 基 酸 22-184 圖 11 I---------裝丨 (诗先3辱f / 大二貝 於某些纯系中，不含MGDF-1序列中的胺基酸1 33-136 ， 因此，對應於上面所列，但不含這些胺基酸（而其C-端胺 基酸编號向下減4調竪）之序列也可能具有活性。
於一纯系中·在位置192具有一終止密碼子，因ft在匾 11中的位置191處係KAla殘基取代Thr殘基。所以》本 發明包括MGDF分子中，位置191係以Ala取代Th「之變S Ο MGDF-3係因脫除掉本文稱之為IVS-5 (間插序列-5)的 序列後所得者，Μ該序列是接合左原序列的第五外顯子内 之故。由於IVS-5的5’端係發生在一密碼子之内，其脫除 會等致剎餘MGDF序列的移碼，其可看出是從'GDF-3的位置 〆 · 160開始發生到該分子的末端為止。 一 37 — 本纸伕尺度適用中3S家標李（CNS ) A4規格（210 X 297公屋） 線 經濟部中夬標莩局員工消貧合作社印製 496870 經濟部中夬橾注局員工消費合作杜印製 B7 五、發明説明（35 ) 至今為止，將MGDF-3本身轉染到293 ffi胞内並用實施例 4的S跑基分析檢驗所得烴諝理培養基的活性時•皆未發 現有活性。顯然地*不像HGDF-1者· 293细胞不能夠將 MGDF-3處理成活性形式。雖然如此，根據上文與MGDF-1相 醖的截取假說，從MGDF-3截取掉Ο端胺基酸也可能専致活 性。例如，將MGDF-3截取掉Ο端40至102倨胺基酸即可等 致活性。較佳者，除掉5 0至.9 0個胺基酸。兩種特別較佳的 MGDF-2變體為·· MGD卜9 胺基酸 2 2-1_79 圖12 HGDF-10 胺基酸 22-19σ 圖 12 於本文所掲示的所有Mpl Rjg，包括上列範例HGDFs在 内，N-端可能含甲疏胺醯殘基，尤其是在彼等多肽係在鈕 Μ宿主细胞内表現者之時。
Mpl配體多肽也可能经由已知的傳统化學合成予以製成 。以合成手段構成本發明多肽的方法係諳於此技者所知悉 者。经由合成方法構成的Mpl配體多肽序列•藉著與Mpl 配體多肽共有的一级，二级或三鈒構造與構像特性，也可 能具有與彼等相同的MpI配Μ生物性質。因此，其可做為 天然经纯化Mpl配體多肽的生物活性或免疫學替代物以届 於治療和免疫等程序中。 肽或垢碼Mpl配體的DH A序列#之中的改質可'由諳於此 技者用已知技術完成。Mp I配體序列中的標的改質可包括 密碼序列中所選胺基駿殘基的替換，嵌入或躺轉。彼等替 換•嵌入或刪除所用突變彤成技術皆為諳於此技者所热知 一 38 一 本纸法尺度適用tgg家標达（CNS ) A4規格（2丨0X297公釐） (讀先VT讀背云之注意事項寫本頁) 裝 訂 496870 Λ7 B7 五、發明説明（3 6 ) 者〔參看，例如，美國專利第4,518.5δ4號〕。最好是在 1至20寂基酸之保守性變化。較佳的肽可经由蛋白分解酵 素，或经由直接化學合成而產生。這些種變體也包括在本 發明ΜρΙ配體多肽和多核苷酸之意義内。
MpI配體多狀序列的持殊突變可能包括糖基化部位（如 ，絲胺酸，蘇睽酸，或天冬胺鐘胺）之改質。在任何天冬 胺酵胺一礙结糖基化辨議部，位或在分子上经由添加〇_聯结 館而改質的任何部位等所發生的胺基酸替換或劃除可導费 糖基化的不存在或只部份糖·基_化。天冬胺醢胺一驊结的糖 - ·禮 .- 基化辨識部位包括被適當的细胞-糖基化酵素:所特定 '地辨議 之三肽序列。這些三肽序列可^ As n-Xa a-Thr或 As「-Xaa-Ser ，其中Xaa可為p「〇以外的任何其他胺基酸 。在糖基化辨議部位的第一或第三或兩者的胺基酸位置發 生的多種胺基酸替換或刷除（及/或在第二位置的胺基酸 刪除）會専致該经改質三狀序列的非糖基化。彼等變質核 苦酸序列的表現會產生在該等位置未發生糖基化之赛體。 其他的MGDF類似物/衍Φ物 MGDF序列（HpI配體）的其他類似物和衍生物，其可保 留全部或部份的HGDF (MpI配體）活性者，也可以由諳於 此技者從本發明掲示而製備成。彼等改質也包括在本發明 之内。 ’ ’ 更特別者，本發明也《括地包括化學改質MGDF组成物及 製備和使用彼等之方法。本揭示顯露出可以效質》00卩並增 〆 · _ 進其性質。 一 39 - 本纸乐尺度適用中11國家標这（（：>；：5)六4規格（210,< 297公釐）
項P 装. ir 經濟部中夬標準局員工消费合作社印t 496870 Λ7 Β7 五、發明説明（37 ) 經濟部中夬標.洋局員工消f合作社印製 於一部份中，本發明係有HHGDF產物，其係由MGDF蛋白 質箱结到至少一種水溶性聚合物部份體所構成者。 於另一部份中*本發明係有ggMGDF產物，其中該HGDF蛋 白質係聯结到至少一®聚乙二醇分子。 於另一部份中，本發明係有闞经由醯基或烷基鍵结接著 到至少一届聚乙二醇分子的MGDF分子。 MGDF的聚乙二醇化可甩技.藝中已知的任何聚乙二醇化反 應進行。參看，例如："Focus on Growth Faqtors 3(2) I :4-10 (1992) EP 0 154311; EP 0 401 384;及本文所 引與聚乙二醇化相翮的其他文獻較佳者，：該聚乙二醇化 係兩反應性聚乙二醇分子（或二類似的反懕性水溶性聚合物 )g由醯基化反懕或烷基化反懕進行的。至灶於下文要更 詳细地討論聚乙二醇衍化的這些較佳手段。 烴由醢基化的聚乙二醇化通常包括用聚乙二醇（PEG)的 活性酯衍生物與MGDF蛋白質之反應。任何種已知的或Μ後 發現的反應性PEG分子都可用來進行MGDF的聚乙二諄化。 較佳的活化PEG酯為酯化到N-羥基丁二醯亞胺（"HHS”）之 PEG 。如本文所甩者，”醢基化”意欲包括但不侷限於下逑 類似的MGDF與水溶性聚合物，如PEG之間的鐽结：S胺· 肢甲酸醋，胺酷等。參看B i oconjugate Chen· 5:133-140 (1994)。其反應條件可選自聚乙二醇化技S中 已知者或Μ後開發出者，不過必須避開會使質的. MGDF物種抑活化之條件：如溫度，溶劑和ΡΗ等。下文要說 一 4 0 一 表紙ft尺度適用宁21國家標这（CNS ) Α4規格（2丨0乂297公沒） '裝 •V5 ^6870 經濟部中央標绛局員工消費合作社印¾ AT ^__ B7 __五、發明説明（33 ) . 明—般用於MG DFs的聚乙二醇化之反應條件。圖14示出甩 ~甲氧基- PEG的NHS酯進行的範例反應。 迓由醢基化進行的聚乙二醇化通常會等致多聚乙二醇化 MGDP產物，其中雔胺酸的ε -胺基係经由豳基聒结基被聚 乙二醇化者。較佳者，該連接鐽结為醱胺。另外較佳者， 所得產物實質地僅為（如，295¾ )——，二一或三一聚 乙二醇化。不過，通常會以.與所用的持殊反懕條件有藺之 量形成某些具有較高聚乙二醇化程度之物種（最高達到， MGDF所含離胺基e -胺基的-最_大數目加上MGDF胺基端的一 倨σ -胺基）。必要時，可用標1纯化技術：，包括'例如 ，透析，鹽析，超濾，齄子交^層析術，膠濾層析術和電 泳等從混合物，特別者未反應物種之中分離出更纯化的聚 乙二醇化物種。 摈某化 經由烷基化的聚乙二醇化通常包括用PEG的末嬙醛衍生 物與蛋白質，如MGDF，在适原劑存在中反懕。如上文討論 的醯基化一般，要在下文說明其反應條件。 羟由烷基化的聚乙二醇化也可能導致多一聚乙二醇化 MGDF。圖15示出MGDF的範例适原性烷基化反麽，其產生多 聚乙二醇化產物。比外•可以经由搡縱本文所述反懕條件 以使聚乙二醇化有利於寶質地只备生於MGDF物種、-端的α -肢基（亦即，單一聚乙二醇化物種）。圖16示出MGDf^ 一倨範例适原性烷基化反懕，其產生單一聚之二醇化產物 。於單一聚乙二醇化或多一聚乙二醇化任一情況中，該 一 41 一 尺度適用令§ 3家標这（CNS )八4規格(ΤΓ^297公釐)
(請先¥讀背面之·s意Mr項寫本I •Ϊ 裝 線 496870 經濟部中夬標注局員二消f合作社印製 __B7_ 五、發明説明（39 ) PEG基最好是经由-(ΓΗζ-ΗΗ-基接著到蛋白質上。特別指 -CH2_基時，這類鍵结在本文中稱之為”烷基”鐽结。 羟由還原性烷基化K產生單一聚乙二醇化產物之衍化反 應係利甩HGDF中可供衍化的不同類型一级胺基所具差別反 應性（離跤酸相對於H-端）。該反窓係在可利用難胲酸殘 基的ε -鞍基與蛋白質Η-端殘基的α -胺基之間的p](a差 異之pH值下進行的（參看下文）。经由這種選擇性衍化， 即可控制具反應性基，如醛基的水溶性聚合物對蛋白質之 接著：與該聚合物的接合主·要_係在蛋白質的N-端進行而對 其他反應性基，如離胺酸的飼键·胺基，則未:發生明、頭的改 質。於一重要部份中，本發明二提出一聚合物/ HGDF蛋白質 接合分子（意即MGDF蛋白質上實質地只在單一位置（如， 295S )接著一聚合物分子）之實質均一製備。更特定言 之，若使用聚乙二醇時，本發明也提出一種聚乙二醇化 MGDF蛋白質，其不具可能的抗原性聯结劑，且其係以聚乙 二醇分子直接偶合到MGDF蛋白質上而形成者。 綜上所逑，於一較佳部份中，本發明係有關聚乙二醇化 MGDF，其中該PEG基係经由醯基或烷基而接著的。如上文 討論遇者，這種產物可為一一聚乙二醇化或多一聚乙二酵 化者（亦即，含有2-6倨，較佳者，2-5倨PEG者）。該 PEG通常是接著到蛋白質所含胺i酸的0(或£胺'基，不g •也包括PEG接著到蛋白質所含任何胺基之上者；彼等胺 基可在逋當反應條件下具有足夠反應性而接1"著拜pEG基。 本發明一聚乙二醇化MGDF為一特別較佳的分子姐合。相 本纸法尺度適用令is家標洋（CNS ) A4規格（：:丨0X297公釐） :| 1 —II，-· -1 量：二 1 fit (讀先3贫58之：5拳項寫本一貝)
T___ *T. In - I 線 496870 經濟部中夬標这局員二消費合作杜印製 __B7_ 五、發明説明) 對於多聚乙二醇化MG DF衍生物而言，一聚乙二醇化衍生物 就多種理由看來都是較有利者。 一聚乙二醇化衍生物比多聚乙二醇化衍生物較容易純化 ，因而通常更為均一。如上所逑者，一聚乙二醇化反懕可 以進行得使聚乙二醇部份體只接著到N -端胺基酸的α -胺 基。於MGDF所含幾倨難胺酸殘基中的任何一倨•及可能的 其他部位都可能發生額外的.聚乙二醇接著。所以，多聚乙 二醇化MGDF衍生物傾向於為更非均一混合物。一聚乙二劈 I 化衍生物的產率通常也高於多-聚乙二醇化衍生物的產率。 於醯基化和烷基化兩者之中所·用的聚合物:分子可選自水 溶性聚合物或其混合物之中。二所選聚合物必須是水溶性者 ，使其所接著的蛋白質不會在水環境，例如在生理環境中 沉澱。所選聚合物最好必須迻過改質κ具有單一反應性基 ，例如供醯基化的活性酯，或供烷基化的醛，使得如本發 明方法所提出者，可Κ控制聚合度。較佳的反應性pEG醛 為聚二醇丙醛，其具有水安定性，或其- Ci-Ca。烷氧基或 芳氧基衍生物（參看，美國專利第5,252,714號）。該聚 合物可為分支或不分支者。較佳者，對於末端產物製劑的 治療甩途而言，該聚合物須為輅藥可接受者。該水溶性聚 合物可選自下列所成姐合之中：聚乙二醇，一甲氧基一聚 乙二醇，葡聚糖，聚（乙烯基Dtt咯烷酮）聚乙'二醇，丙 二醇均聚物’聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物，多氧乙基化 多元醇（如，丙三醇）和聚乙烯醇等。對於I酷基化反麽， 所選聚合物必須具有單一反恩性酯基。而對於本發明堪原 (請先 之二大•頁 -裝 訂 線 衣紙乐尺度逍/?]中S3家標夂（CNS ) Μ規格（2丨〇乂 297公;5 ) 496870 Λ7 ________ B7 五、發明説明（41 ) 性烷基化而言，所選聚合物必須具有單一反惠性醛基。通 常，該水溶性聚合物不會選自天然發生的糖基殘基，以其 一般而言，可用晡乳動物重姐表現***更方便地製得之故 。該聚合物可具任何分子量，且可為分支或未分支者。 可供本發明所用的一特別較佳之水溶性聚合物為聚乙二 醇，縮寫為PEG 。如本發明所用者，聚乙二醇意欲包括已 被甩來衍化其他蛋白質之任.何形式的PEG *例如，一 -(Ci-Cxo)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇。 如本發明所用者，MGDF係·定_義為包括本發明所逑MGDF的 各種彤式。例如，全長度或经截—取者，糖基:化或未糖基化 等形式的MGDF都包括在内。下二面所列為要衍化的較佳 MGDF分子（於各例中，其嘏號都是根據圖u的胺基酸编號 I--------- ’裝-- (請.备讀背云之項寫本頁) 經濟部中夬標辛局員二消費合作社印«. MGDF-1 胺 基 酸 22 -353 圖 11 HGDF -2 胺 基 酸 22 -195 圖 11 HGDF -4 胲 基 酸 22 -172 圖 11 HGDF -11 胺 基 酸 22 -184 圖 11 HGDF -12 胺 基 酸 22 -353 圖 11 HGDF -13 胺 基 酸 27 -195 圖 11 HGDF -14 胺 基 酸 27 -172 圖 11 HGDF -15 胺 基 酸 27 184 Π5Π W 11 上逑 較佳 物 種 可 為 经糖 基 化， 未 糖 基 化， 或 去 糖 者， 最好 是 未 经 糖 基化 者 。其 可 甩 细 菌 (¾ 9 大 焉 或晡 乳動 物 ( 如 $ CH0 ) 妞胞 等 重 姐 方式 製 成 〇 線 44 本纸ft尺度適用中國S家標李（CNS ) A4規格（2，1〇,<297公釐） 496870 經濟部中夬標逢局員工消f合作社印裝 ___B7_ _五、發明説明（42 ) 下面所列為本發明特別較佳的化學衍化分子小组（於各 例中，其為有经由醯基或烷基而接著的——或多一，如 2-4 β PEG部份體）： 聚乙二醇化MGDF-11 聚乙二醇化MGDF-4 聚乙二醇化MGDF-2。 一般而言，化學衍化可在用以使生物活性物質與活化聚 合物分子進行反懕之任何遘當條件下進行。製.備聚乙二醇 ( 化MGDF的方.法R括地包含下·列-步驟：（a)用MGDF多肽與聚 乙二醇（例如PEG的反應性酯或$衍生物）：在可使MGDF接 到一或多倨PEG基之條件下反_懕，及（b)取得該反應產物 。通常，醯基化反應所用的最佳反懕條件係依倨系根據已 知參數和所欲结果而定者。例如，PEG ••蛋白質比例越大 ，則多一聚乙二醇化產物的百分比越大。 製備實質均一群的——聚合物/MGDF蛋白質接合分子所 用之适原性烷基化通常包括下列步猱：U)用MGDF蛋白質 與反應性PEG分子在還原性烷基化條件下反應*其中所周 pH值係適合於使該MGDF蛋白質胺基端的α -胺基發生選擇 性改質者；及（b)取得反懕產物。 為了得到實質均一群的一一聚合物/ MGDF蛋白質接合分 子，該适原性烷基化反應條件為ΐ使水溶性聚合物部份體 選擇性地接著到MGDF 端者。這種反®條件通常可提供 難胺駿胺基與Η-端α-胺基之間的ρΚ»差異、為50S 的胺基被質子化而另外503!為否之pH值）。ΡΗ值也會影銮 (請先閑讀背面之;±意事本一貝 '裝 •1Τ 線 一 4 5 — 太纸法尺度適用中SS家標洋（CNS ) A4規格（2丨0X 297公釐） 496870 Λ7 __B7 五、發明説明（43 ) 所兩的聚合物/蛋白質比例。概括而言，若pH愈低，則需 要兩到較大超量的聚合物/蛋白質比例（亦即，H -端α-胺基的反應性愈低，就需要愈多的聚合物以達到最適條件 )。若pH越高，就不需要這種大的聚合物：蛋白質比例（ 亦即，可得愈多反麽性基時，就需要較少的聚合物分子） 。對本發明目的而言，該pH通常係在3-9 ，較佳者3-6範 圍之内。 ， 另一項重要的考盧為聚合物的分子量。通常，聚合物分 子量越高’可接到蛋白質的·聚-合物分子數目愈少。同樣地 •在最適化彼等參数之時，也必-須考慮聚合：物的分·支。概 括而言，分子量越高（或分支二越多），則聚合物：蛋白質 比例越高。一般而言，對於本發明所涵蓋的聚乙二醇化反 應，較適當的平均分子量為約2 kDa至約100 kDa ("約 ”一字代表土 lkDa)。較佳的平均分子量為約5kDa至 約50 kDa，特別較佳者為約12 kDa至約25 kDa。水溶性聚 合物對MGDF蛋白質的比例通常為1:1至100:1 ，較佳者（ 對於多一聚乙二醇化而言）為1:1至20:1及（對於——聚 乙二醇化而言）1 ·· 1至5 ·· 1 。 使用上逑條件時，還原性烷基化可使聚合物選擇性地接 著到Η端具有α -胺基的任何MGDF蛋白質，且提供實質均 一的一聚合物/MGDF蛋白質接合由之製備。”一/聚合物/ MGDF蛋白質接合物”一詞在比係甩以指含有單一倨聚合物 分子接著到一届HGDF蛋白質分子之姐成物。1 一聚合物/ HGDF蛋白質接合物較佳者具有一倨接到Ν-端而非離胺酸所 本饫法尺度適用宁113家璋这（〇^).*\4現格（210/<297公釐） -雷二11 1 雷· I *-又，IIII (讀先父讀背复灌|||寫本頁 線 經濟部申夬標準局—工消費合作社印t -t - _1 fn— —tm vn nn tm I-1¾ ft— 496870 經濟部中夬標绛局員二消费合作杜^製 Λ7 ____ _B7五、發明説明（以） 具K基倒基上之聚合物分子。該製餚較佳者有大於9〇3;的 一聚合物/ MGDF蛋白質接合物，且更佳者有大於95χ的一 聚合物/ MGDF蛋白質接合物，其餘可觀測到的分子為未反 ®者（亦即，沒有聚合物部份體的蛋白質）。下面的實施 例提供含有至少約90S —聚合物/蛋白質接合物，和含 10¾未反應蛋白質之製備物。該一聚合物/蛋白質接合物 具有生物活性。 ， 對於本發明适原性烷基化而言，該遝原劑必須是在水笋 液中具安定性者且較佳者為·只#能夠适原在該遢原性烷基化 初始程序中形成的希夫（Schiff)酸。較佳:的适原'劑為選 自硼氫化鈉，氰硼氫化納，二^烷基硼烷，三甲鞍基硼烷 和吡啶硼烷等之中者。特別較佳的适原劑為氰硼氫化納。 其他反應參數，例如溶劑，反麽時間，溫度等，及產物 纯化手段，都可根據公開的有關用水溶性聚合物衍化蛋白 質之資料依届系分別決定（參看本文所引文獻）。範例S 節將在下面的實施例節段中說明。 可以選擇经由醯基化及/或烷基化方法來製備聚合物/ 蛋白質接合分子，且本發明所提供的儍點可K選擇混合物 所含一聚合物/蛋白質接合物比例。因此，必要時’可K 製備接著不同數目的聚合物分子之各種蛋白質的混合物（ 如•二一，三一，四一，等）並*用本發明方法'製成的一 聚合物/蛋白質接合物姐合在一起，而得具有預定比例的 一一聚合物/蛋白質接合物。- . 下面的搡作寶施例演示化學改質MGDF之製億和经由酵基 (請先Μ·望2Β之：Vi意事一:寫本一貝) -裝
、1T 線 一 47 — 本紙ft尺度適;？1中i；g家標洋（CNS ) A4規格（2丨0 X 297公沒） 496870 經濟部中夬標莩局—二消f合作杜 Λ7 _,_B7__ 五、發明説明（4° ) 化與烷基化予以聚乙二醇化的MG DF之製镅。因此，本發明 的其他部份係有闢這些製備。 概括而言，经由給甩本發明聚合物/ MGDF可以減谖或舒 解的病況包括上文有閭MGDF分子通盤說明中提及者。不過 ，本發明揭示的聚合物/MGDF分子比未衍化分子而言可具 有其他的活性，增加或減低的活性，或其他特性。 於本發明另一部份中，提，出含有上述化學改質MGDF分子 的醫藥姐合物。這種S藥组合物可含有本文所.載有Μ未衍 化MGDF分子的任何成份。· _ 随著後績研究的進行，有Η治··療不同病人:的不同病況所 需適當劑量水平之資料會陸绿UB現，且一般热練工作者於 考處接受者的治療情況，年舲和一般健康情形等，即可確 定連當的劑量。槪括而言，其劑量為0.01微克/公斤體重 (只計算蛋白質的質量，未包括化學改質）至300微克/ 公斤（同上）之間。較遴當的劑量通常為5微克/公斤體 重至100微克/公斤體重，特別較佳者為10微克/公斤體 重至75微克/公斤體重。 本發明也提出製備MGDF (亦即，MpI配體）多肽或其活 性片段之方法。本發明的一種方法包括將編碼Mpl配體多 肽的cDHA導到表現媒體中以製備成MpI配體表現***。周 該媒體轉染所選宿主妞胞並予以奋養。因此，本/發明方法 包括培養連當的妞胞或细胞系，其係用對於在已知調節序 列的控制下進行MpI配體多肽的表琨有编碼i之DHA序列轉 染過者。該等調節序列包括啟動區序列，终止區片段及導
PV 裝 訂 線 一 4 8 一 本紙ft尺度適用中gg家漂注（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 496870 Λ7 B7 — — 五、發明説明) (討先i之注意事寫本頁) 引/控制蛋白質在適當宿主细胞内的表現之其他連當序列 。然後從焙養基（或若係在细胞内表現時，從细胞）以諳 於此技者所热知的恰當手段收取，分難和純化表現出來的 因子。此外，美國專利第5,272,071號中揭示的方法也預 期可用於本發明多核苦酸/多肽。 適當的妞胞或钿胞系可為哺乳動物细胞，例如田鼠蒴巢 细胞（CH0)或3T3S胞。適用哺乳動物宿主细胞的選擇及 轉化，焙養，擴大，篩選和產物生產與纯化等.方法都是技 S中已知者。參看，例如**Geih ins and Saab rook,
Hature 293 : 620-625 (1981) f 或另外，Kaufman et al·, Mol. Cell Biol·, 5 (?i: 1750-1759 (1985)或 經濟部中夬標.洋局員二消费合作社印¾ 11(^1〇01：31.,美國專利第4,419,446號。其他逋用的晡 乳動物ffl胞系為猴子COS-1和COS-7细胞系，及CV-1细胞 系。其他典型晡乳動物宿主鈕胞包括S長類妞胞系和S齒 類细胞系，包括羥轉化细胞系在内。正常二倍體细胞，初 级姐織活體化（in vit「o)培養所衍生的妞胞品系，以及 原植物等也都逋合所用。候選细胞可為在選擇基因中有基 因型地缺乏者，或可含有顯性作用選擇基因者。其他適當 的哺乳動物细胞系包括但不限於HeLa，小鼠L-929细胞’ 衍生自瑞士 Balb-c或HIH小鼠的3T3系，BHK或HaK倉鼠 细胞系等。 ’ 類似地可用為適合於本發明的宿主细胞者為细菌妞胞。 例如，各種大腸桿菌品系（如，HB101 ，DH§a、，DH10, 和MC1061等）皆為生物技術領域中所熟知的宿主娌抱。另 一 4 9 — 本祅法尺度通用中SS家標莩（CNS )六4迓格（2!0乂 297公釐） 496870 A7 ___ B7 五、發明説明（47 ) 外，祜草桿菌（subt i Lis )，辰單胞菌屬（
Ls..eu dob〇n a ^ sip .),其他的桿菌羼（R ^ r ί 1 1 u 5； spd ·) ’鏈徽菌屬（S t.r e p t ο 1 y c e s s p p .)等的各種Sr系也可以 用於本發明方法中。 諸於此技者所知悉的多種酵母鈕胞品系也可甩為宿主妞 胞K表現本發明的多肽。另外，於必要時，也可以用昆蟲 细胞作為本發明方法中的宿，主细胞。#看，例如，
Hiller et al., Genetic Engineering 8· 277-298 r (1986)及其__中所引參考文獻·。- 本發明也提出重组分子或媒體1用於新穎:MP 1配體多肽 的表現方法中。這些媒體含有4 pi配體DHA序列且其單獨 地或與其他序列组合地编碼本發明Mpl配體多肽（有或無 信號呔者）或其活性片段。另外，摻合上述改質序列的媒 體也為本發明的實施例且可甩於產生Mpl配體多肽。本發 明方法所用的媒體也含有经選擇的調節序列，其與煸碼本 發明序列的DH A處於搡作締合狀態且能夠在所選宿主钿胞 中導引其複製和表現。 有一媒體為PXM ，其特別適合於在COS细胞中的表現〔 Y.C. Yang et al·, Cell 47:3-10 (1936)〕。另一種連 合於在哺乳動物妞胞，如，CH0细胞之中的表現之媒體為 PEMC2B1 。本發明所述哺乳動物i胞表現媒體可'兩諸於此 技者所热知的技術予以合成。諸媒體所含諸成份，例如， 複製子，選擇基因，強化因子•啟動區等，¼可得自.夭然 來源或甩已知程序合成。參看，Kaufean et al., J. 一 5 0 — 本纸&尺度適用申2國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）
(請先巧巧背f/..Vi意事項寫本I 裝 線 M濟部中央標準局員二消费合作社印製 496870 經濟部中夬揉这局員二消費合作社印S- A 7 B7 五、發明说明（48 ) Μ〇1· Biol· 159 : 511-521 (1932);和 Kaufaan， Pr〇c· Hatl· Acad· Sci. USA 82:689-693 (19δ5)。此外•媒體 DHA可包含全部或部份的牛乳頭狀瘤病毒基因组〔Lusky et al·, Cell 3δ:39 卜 401 (19S4)〕且可在细胞系，如 C 127小鼠妞胞等之内複製成S定的附加體元素。這些媒n 轉染到逋當的宿主细胞後可等致ΜρΙ配體多肽的表現。 有眾多類型係技藝中已知用於哺乳動物，昆蟲，酵母， 真菌和细菌等的表現者之其他適當表現媒體也.可以用於該 f 目的0 - * ^ • · 本發明方法和姐合物所要治療，病況通常:為包含既存的 巨核细胞/血小板缺乏或預期^來有巨核细胞/血小板缺 乏者（例如，因為已計畫的手術者）。彼等病況通常具活 鸦内活性MpI配體缺乏（暫時性或永久性）的结果。血小 板缺乏的一般術語為血小板減少症，因此，本發明方法和 姐合物概括地可用以治療血小板減少症。 血小板減少症（血小板缺乏）可因幾種原因而發生，包 括用各種藥物進行的化學治療和其他治療，放射治療，手 術*意外事故血液損失，與其他特殊的疾病情況等。包含 血小板減少症且可根據本發明予以治療的代表性特殊病況 有··再生不能性貧血，自發性血小板減少症，會等致血小 板減少症的轉移性腫瘤，***性ώ斑狼捃，脾腫大，方康 尼氏§5[候群（Fanconi SyndroBe)，維生素Β12较乏，葉 酸缺乏，梅一黑格林畸型（May-Hegglin anoagly)，. Viskott-Ald「ich徵候群，和陣發性睡眠性血紅蛋白尿症 一 5 1 一 尽紙ft尺度適用中gg家標这（CNS ) A4規格（110X 297公釐） ----------士义------丁 ,\吞 (請先事寫本一貝)
496870 Λ7 B7 五、發明説明（a ) 等。比外，對於AIDS的某些治療也會導致血小板減少症（ 如，AZT )。某些創傷通合症也可能從血小板數目的增加 受益。 有關預期的血小板玦乏，例如，因未來的手術所致’可 以在需要血小板之前的幾天到幾小時，先眼用本發明的 Mpl配體。對於緊急情況，如，意外事故和大量流血，可 以將該Mpl配體與血液或纯_化血小板一起給用。 本發明Mpl配體也可以用來剌激巨核细胞K外的某些细 胞類別，尺要這種钿胞係可·表-現Mpl受體者。與這種表現 ΜρΓ受體的细胞相翮聯，且其對Ip 1配體的:剌激有反應之 病況也在本發明範圍之内。，-1 在本發明所提活性分析中本身不具活性的MGDF分子可在 活體外或活體内用為Mpl受體的調整劑（如，抑制劑或剌 激劑）。 本發明多肽可單獨使用，或與其他细胞活性，可溶性 Mpl受體•造血因子，間白素，生長因子或抗體等组合使 甩於上述病況的治療之中。 綜上所述，本發明的另一部份為用以治療上逑病況的治 療组合物。這種组合物包含治療有效量的Mpl配體多肽或 其具治療效用的片段，與醫藥可接受截劑。該載劑物質可 為注射水，較佳者，補充其他常^晡乳動物施用的溶液所 甩物質。典型者，Mpl配體治療劑可用由纯化蛋白質配合 一或多種生理可接受的截萷，賦形劑，或稀'•釋坪所構成的 姐合物形式進行给藥。中性媛衝鹽水或混合著血清白蛋白 -52- 本纸ft尺度逯用中S國家標辛（CNS ) A4規格（2丨0 X 297公釐） — ill — I— I- -¾ - - 1 · 1 · I ― - -I > (請先云之..一二意5^^寫本頁 訂 線 經濟部中夬標绛局—二消費合作社印製 496870 一 _B7___ 五、發明説明（5〇) 的鹽水皆為代表性遘當載劑。較佳者，該產品係离配成與 逋當賦形劑（如，蔗糖）一起的冷凍乾燥物。其他檁準載 劑，稀釋劑，和賦彤劑等也可視需要加入。別的代表性组 合物有Tr is媛衝劑，pH 3.0和乙酸鹽嫒衝劑，pH 5·〇,其 於各例中，可更包含山梨糖醇。 本發明姐合物可以非迓腸地系铳性給藥。另外，本發明 姐合物可经靜Μ內或皮下給，藥。Κ条统性給藥時，本發明 裝 所用治療组合物可為無熱原，非经腸地可接受.之水溶液形 ( 式。這種發蔡可接受的蛋白·質液之製備，就其pH，等接 性，·安定性等而言，都是技藝所0及者。 ： 訂 治療上述病況的方法中所用二劑量之道決定於主治醫師， 考慮可能改變藥物作用的各種因素後決定之，彼等因素包 括，例如，病人年舲，病況，體重，性別和食物，任何感 染的嚴重性，給藥時間和其他臨床因素等。一般而言，每 日劑量要在0·卜1 0 00微克Mpl配體蛋白質或其片段/公斤 體重。 經濟部令夬標绛局負二消資合作社印装 本發明治療方法，姐合物和多肽等也可K用來，單獨地 或與其他妞胞活素，可溶性Mpl受體，造血因子·間白素 ，生長因子或抗體等配合而用於治療具有其他徵候及血小 板缺乏等特徴之病況。據預期者，Mpl配體分子经證明可 與一般造血性剌激劑，如11-3¾ G M-CDF等组合而局Μ治療 某些形式的血小板減少症。其他巨核捆胞剌激因子，如， 臟e g - C S F ，幹细胞因子（S C F )，白血症抑制L因子（L I F )， 制溷素M (0SM)，或其他具有巨核妞胞剌激活性的分子等 一 5 3 — 本纸法尺度適用中国a家標注（CNS ) 規格（2丨0,< 297公釐） 496870 Λ7 B7 經濟部中夬標注局員工消資合作社印¾ 五、發明説明（°1 ) 也可以與HP1配體一起使甩。可甩於這種共同施藥的其他 代表性鈕胞活素或造血因子包括IL-Ια，IL-1/3，IL-2, IL-3， IL-4， IL-5， IL-6， IL-11 ，群落剌激因子-1 (CSF-1)，CM-CSF，粒狀妞胞群落剌激因子（G-CSF), ΕΡ0，干擾素- a (IFN-a) ，IFN-/3，或 IFH-7 等。另 外，可以同時地或依次地施用有效董的可溶性晡乳動物 Mpl受體，其似乎具有使到，達成热形式的巨核细胞斷片成 血小板之效悤。依此，施甩Mpl配體（以增進.成熟巨核释 胞的数目），接著施甩可溶·性_Ηρ 1受體（將配體抑活化並 使成热巨核细胞產生血小板）預-期可為特別:有效的剌激血 小板產生之手段。上述劑量可/jg調整以補償治療组合物中 的這種附加成份。被治療病人的進展可用傳统方法來監測 Ο 這些新穎多肽的其他甩途在於開發用標準方法產生的抗 脖。例如，包括可與本發明MP1配體反懕的抗體及彼等抗 體的反應性片段。彼等抗體可為多株，單株，重姐，嵌合 型，單鍵及/或雙特定性等者。彼等抗體片段可為對本發 明Mpl配體具有反®性的任何片段，例如，Fab’Fab，，等 。此外，本發明也提出雜交S，其係用Mpl配體或其片段 作為抗原给所選哺乳動物’接著用已知技術將該動物的抱 胞（如，脾细胞）與某些種癌妞ik融合而產生永'生化的妞 胞系。本發明也包括產生這種细胞系所用的方法及對抗本 發明人類Mpl配體多肽的全部或部份之抗體％ 一 * * 該抗體可具有治療用途，例如抑制MP1配體與其受體的 一 5 4 一 本纸ft尺度边用中S國家標孪（CNS ) A4規格（210X29?公釐） (請先閑讀背£之洼意事項1||寫本一貝 -裝 訂 線 496870 經濟部中夬標毕局員工消費合作杜印製 A 7 ___ B7_五、發明説明（52 ) 结合等。該抗S更可用於活體内（in Yivo )和活β外（ in vit「o )診斷用途，例如，Κ標示形式偵檢g疲中 HpI配體之存在。 本發明提出下面的實施例以更完整地閜釋本發明。另外 ，這些實施例也提出本發明的較佳實施例，但除非另外指 示，否則，這些實施例並不意欲甩以限制本發明的範圍。 下面S施例逑及的許多程序]所用標準方法，或逋當的取代 程序，皆在廣被公認的分子生物學手冊中有所.提及，例如 i ，SaHbrootet al·· ”MoleciLlar Cloning”，第 2 版， Cold Spring Harbor Laboratory Press ( 1 987)和 in Ausubel et al·,(编輯）r rent Protocols, in Molecular Biology'· Greene associates/Viley Interscience， Nev York (1990)等0 實施例1 再牛不能袢犬ίήτ想 依下面文獻中所述，但以45 0雷得的全身照射施加於接 受者以製備烴肝燐脂處理的犬再生不能性血漿（"ΑΡΚ9Π) 或正常犬血漿（”ΗΚ9”） ·· ‘· .-azu^, anci south, ：<. Ξχρ. nematol. 13:1164-1172 (1935). . (請先¥讀背面之注意事el _裝— tc寫木\貝 訂 線 2· .^.^iaga, κ., South, K., Cohen, J. L., - and Mazur, Ξ,Μ. Blood 69： 485-492 (1937).. 一 5 5 — 本纸ft尺度適用中g國家標辛（CNS ) A4%格（210 X 297公釐） 496870 Λ7 ____B7_ 五、發明説明（53 ) 3 · y-z'drr ^./ basilica, D., Nevton, J.L., Cohen, J.L., Charland, C·, Sohl, P.A.Λ and Narendran, A. Bleed 76: 1771-1732 (1990). 實施例2 人頷朐分析 裝 分析APK9和分段APK9剌激從CD34♦前身胞的人類巨核 妞胞之發展。经CD34-選過.的妞胞係依所述得自周圍血液 细胞（Hokon, M.H., Choi, E·, Nichol, J.U·, t
I
Hornkohl , A. , Arakawa, T*.^and Hunt, P . Molecular Biology of Haeaatopoiesis 3 Π 5-31, 19 9:4 )並'接注在 經漭部中夬糅注局員二消费合作社印¾ 下面的培養基中：Iscove’s改-S Dulbecco*s培養基（ IMDM; GIBC0 ， G「and Island, HY)，其中補充著 U毅胺 SKPen-Strep (Irvine Scientific, Santa Ana, CA ) 和1 OS肝燐素處理過，血小板貧乏性人類AB血漿。另外也 包含2-S硫基乙醇（10-4 μ)，丙飼酸（110微克/毫升 )，險固醇（7.8微克/ ¾升），腺苷，鳥喋呤，胞嘧啶 核苷，尿嘧啶核苷，狗腺嘧啶核苷，2-去氧胞嘧啶，2-去 氧腺喋呤，2-去氧鳥嘌呤（各10微克/毫升* Sigsa ); 人類重姐胰島素（10微克/¾升），人類鐵傅邋蛋白（ 300戧克/奄升），大豆脂質（IX，BoehrMnger Mannhein, Indianapolis, IN);人類重组驗性适缠母细 胞生長因子（2奈克（ns) /奄克，Genzyue,
Ca*b「idSe，ΜΑ);人類重姐上皮妞胞生長卤子，（I5,奈克 /奄升），血小板（衍生）生長因子（10奈克/毫升， 一 5 6 — 本纸ft尺度適用宁S園家標洋（CNS ) Α4規格（210X29了公釐） 496870 Λ7 Β7 五、發明説明（54) (請先聞讀背A之：V』意事項寫本頁 Α麗gen, Inc·, Thousand Oaks, CA)。將 CD34-選擇迎胞 置於2 x 105毫升培養基，15徴升最後體積，的 T e r a s a k i -型微滴板（V a n s u a「d，I n c · , N e p t u n e , H J ) 。將鈕胞置於37t)，53： C02/空氣的溼氣箱内，直接用 IX戊二醛固定到培養洞，並接注單株抗體調合物（抗 -GPIb ，抗-GPIIb， （Biodesign )和抗-GPIb (Dako, Carpinteria, CA )後一起，溫育8天。甩鏈抗生物素蛋白 -/3 -半乳糖苷酶偵檢***（HistoMark ，Kirkegaa「d ,
I and Perry )展開免疫反應·。，在逆栢顯微鏡下以ΙΟΟχ放大 率計數以Μ色鑑別出來的巨核®，。其结果:表成平均巨核 钿胞数/洞士平均值標準誤差JiSEM)。於某些例子中，將 數據表成”巨核细胞單位/奄升”，其中係將某樣品誘等 的巨核妞胞發甭程度相對於該實驗的陽性APK9標準樣而鲟 一化。一單位係定義成可導致與1微升APK9標準樣相同巨 核妞胞數目所需物質量。若其可被5-10微克/毫升HPL-X (克溶性MpI受體）阻斷時*其活性即被認可係來自MPL 配體者。 M濟部中夫螵.二消資合祚社印装 APK9係已被證明在該糸铳中含有可剌激人類巨核鈕胞發 育的因子。CD34選擇S胞與l〇S NK9焙趸8天後，頚示可忽 略數目的Μ色染色巨核细胞，而CD34-選擇细胞舆10S A ΡΚ9溫育8天後，顯示非常大数目的藍色染色巨核妞胞。 H2顯示出將逐增濃度的Mp卜X加到人類巨核迪胞培養 糸统時可逐增地阻新巨核妞胞發育。於Mp 1 (濃度大於5 一 1 . 微克/毫升時，即完全抑制。於該實驗中，係用53： APK9 一 57 - 用 tai 家& ( CNS ) A4 規格（210X 297 公沒） 496870
五 '發明説明（55 剌激C D 3 4 -選 配體）交互作 且顯示APK9本 另外在此也 ϋ活性存在於 IScove培養基 流出物）经收 物洗提到1 0毫 4-倍後，進行 之中時¥發育 加到管柱的相 在10S未结合 lOS洗提集液 洞。管柱施加 升Mp卜X在該 將老鼠 擇鈕胞。其结果證明與MP1-X ( 用的活性對於人類巨核鈕胞發育 身含有MpI配體。 證明對於人頚巨核细胞發育為必 APK9中。將APK9 ( 135毫升）稀 中，施加到Mp1-X親和管柱上。 集並湄縮到原，積後，才進行分 升的1 Μ N a C 1中，取2 0 X集液经. 分析。CD34- ‘_擇细胞單獨培育 成巨核细胞。與5»，A P K 9 —起培 同集疲）則發48 士 S倨巨核 物中培育的妞胞不會發育成巨核 中培育的细胞發展成120 士 44届 物與洗提集液兩者的活性都會被 分析中實質完全地抑制。 實施例3 或人頷Mt>]专鸦《染轫去鼠钿朐 娱定的Mp 1 係必需者， 需的Μ p 1配 釋6 -倍到 未结合物（ 析。將结合 透析並濃@ 在該培養基 育的裀胞（ 细胞/洞。 细胞。在 巨核细胞/ 5微克/毫 (讨先Mi/ί背云之么意一爭項一！Pi寫本一貝 裝 訂 A . 复_鼠Μ p 1专轉 將全長度老鼠Mpl受BcDNA分殖到含有衍生自Moloney 氏老鼠肉瘤病毒LTR的轉錄故動區之表現截體中。取5微 兖該構成物與1微克可選擇標記質/體pWLNeo (St「atagene )共一電孔洞焙養到IL-3依賴性老鼠细胞系之中（32D ， 純系23; Greenberger et al., PNAS 80:29131-2936 (1983))。將妞胞培養五天後，從程序中回收，再置於含 58 用令家標辛（CNS )六4規格（2丨0 X297公釐） ^687〇 Λ7 B7 五、發明説明㈣） 旖先>τ«背云之i意事項芎大·頁) 有 800 微克 / 毫升 Geneticin (G418, SUea)和 1 奈克 / 奄升老鼠IL-3的選擇培養基中溫甭。接著將存活妞胞分成 2 X 105 S胞庫並培養到長出可供進一步分析的群落為止 。取六份群落用多株兔子抗跃血清MFACS分析進行MpI受 賴表面表現檢驗。選出一份群落用上逑相同抗肽血清進行 FACS揀選。g由在10X APK9和Geneticin中生長而選擇出 母细胞系的單妞胞纯系。在.APK9中選擇35天後，將细胞保 持在1奈克/奄升老鼠IL-3之中。用其中的一分殖系，. 1 A6. 1 ·於該研究體中。-」一 Β . . λ類Md 1夸娉 * - 將全長度人頚Mpl受體序列—（VUon, I. et al·, .¾ 經濟部中夬標準局員工消費合作·杜印¾ PNAS 89:5640-5644 (1992))分殖到含有 Moloney 氐老鼠 肉瘤病毒轉錄故動區的表現載體内（與老鼠受體相同的載 «§ )。取6微克該構成物和6微克的兼性營養逆轉錄_病 毒包装構成物（Landau, N.R·, Littiian, D.R., J. Virology 66:5110-5113 (1992))甩 CaP〇4 晡乳動物轉染 配套藥劑（Stratagene)轉染到3 X 10β 293细胞中。於 2天後及再度於4天後對相同的细胞重轉染。於最後轉染 後的當天，將該293细胞與IL-3依賴性老鼠妞胞系（32D •纯系 23; Greenberger et al.， PHAS 80:2931-2936 ( 1 98 3 ))共同培養。於24小時後、在BSA梯度中分難出 32D 妞胞帶（Path-o-cyte; Miles Inc·)。將該细胞於 1奈克/毫升老鼠IL-3中擴大，然後在20X、P|C9中翠擇生 長。用多株兔子抗肽血清M FACS進行該钿胞的受體鈕胞表 一 5 9 一 本扶ft尺度適用肀国國家標洋（CNS ) A4堤格（2丨0 X 297公釐） 496870 Λ7 B7 五、發明説明（57 ) 面表現之揀選。所得鈕胞所辑後即用於分析中。 實施例4 1 A6 · 1 Md】 g鸦分圻 將1A6.1 ®胞洗除IL-3培養物並在Terasaki-型微滴板 中於補充10S眙牛血清（FCS) ，Geneticin (800徵克/毫 升），和 U pen/strep (Gibco)的 aMEM (Gibco)中以 1:1系列試樣稀釋進行再平，板培養（1000细胞/15徵升缌 鸦積/洞）。於48小時後，甩顯微術測定每洞的活细胞.數 。一活性單位的定義於分析/轧加入5-10微克/奄升Μρ卜X 即可完全阻断時*即視為係來氐Mpl配體者：。在ΑΡΚ9中的 Mpl配體活性平均為4400 士 5i5單位/毫升再生不能性血 漿。除非另外指出，否則Mpl配體活性單位係在1A6.1分 析中定義者。 用人類HpI受體基因慼染過的细胞進行的分析（實施例 3B)基本上係以與用1A6.1妞胞者相同的方式進行。 實施例5 小鼠，狗，豬和人箱豸枣滬的洱牛不能袢而雄或命渣中佥 有Mp卜配昍
MpI配體存在於小鼠，犬，豬和人類來源的再生不能性 血漿或血潦中（表2 )。從預照射及12天的後照射（500 雷得）後之BDF1小鼠採集血漿。klA6.1分析檢驗該血漿 證賁有2000單位/奄升的活性，其可被Mpl-X (10微克/ 奄升）實質完全地抑制。经照射小鼠的血漿i也在人類巨核 妞胞分析中圼陽性，顯示出有1833單位/毫升之活性。從 一 6 0 一 本纸法尺度適用中I!國家標注（CNS ) A4規格（2丨0 X297公釐） (請先¥ :一Ϊ事項寫本一貝 裝. 訂 經濟部中夬標注局員二消資合作社印製 496870 五、發明説明（53 預照射和10天 於1A6. 1分析 中都偵檢出活 。從預照射及 漿。於1A6.1 兩分析中，都 MpI g體活性 得人類再生不 者。將取自.6 9 03·單位/毫 用10微克/毫 14倨再生不能 整體地，其顯 ，其可被10微 小鼠I L - 3數據 组鈕胞活性可 升的Mp 1 -X所 B7 後照射（450雷得）處理過的狗採取血漿。 和人類巨核妞胞分析中檢驗該血漿。兩分析 性且會被Hpl-X ( 10微克/毫升）完全抑制 10天後照射（ 650雷得）處理過的豬收集血 分析和人類巨核ffl胞分析中檢驗該血漿。於 顯示出相當於犬再生不能性血漿中所發現的 (可被10微克,/毫升的Mp卜X所抑制）。取 能性血清。該物係從骨越移植病.人身上取挦 屆病人的血清H1A6.1分析檢驗，顯示出 升之活性，其中有18X係來自：Mp1 ‘II (可 升的Mp1-X予UII制）。此外，也甩取自 性病人的血清以人類巨核细胞分析檢驗之。 示出實質的活性，914巨核®胞單位/毫升 克/奄升的Mp卜X予以完全抑制。另外加入 以顯示出1A6.1分析的特定性。雖然這種重 誘専該妞胞系的生長，但其不被10微克/奄 阻斷。 請 % 讀 背 云 之 * m I裝 訂 線 經濟部中央標注局員二消f合作社印^ 61 冬纸乐尺度適用〒1S家標辛（CNS ) A規格（21〇X 297公笼 496870 AT ____B7五、發明説明（D9 ) 1A6.1细胞分析 人類巨核鈕胞分析 」_單位/牽升). (巨炫Μ朐里位/豪并） 掊赛某 + Hd1-X 掊莠某 +Hd1-X 正常小鼠 0+/-0 〇+/-〇 0+/-0 0+/-0 再生不能性小鼠 2000 0 1833 未實施 正常犬 0V-0 0+/-0 0+/-0 0+/-0 再生不能性犬 4400+/-539 0+/-0 < 792V-125 (W-0 正常豬· 0+/-0 0./-0 ^ 0+/-0’ (W-1 再生不能性豬 / 0 0—— 1 8 + - 8 0/1 0+/-0 0./-0 0./-0 0+/-0 再生不能性人 903+/-64 114./-33 941+/-178 〇+/-〇 nurIL3 6000./-565 6000+/-565 未實施 未S拖 (請先Μ讀背云之·注意事寫本頁) 裝 訂 經濟部中央標绛局員工消费合作社印¾ 實施例6 Mp〗g睹剌激1Α6.1拥昀牛再及λ類芦按拥跑發I Mpl配Β (於外源凝集素與親和層析術等程序後增湄至 少約100,000-倍，參看實施例7 )可剌激1A6.1 «3胞系的 生長和來自CD34-選擇過.的周圍血球之人類巨核妞胞發展 ，其偽劑量相Μ性方式者。匾2和3顯示出來启Mp 1 .配體 的可反Κ出活性，因在兩分析中，其活性皆可被Μρ^Χ所 線 _ - 62 - 本成乐尺度边用中g國家標辛（CNS ) Α4$咯（2丨0 Χ 297公沒） 496870
AT _B7__ 五、發明説明（60 ) 完全阻斷之故。 此外*本系發明人也證明FACS純化過的周圍血gCD34* 细胞在舆Mpl SS -起焙育（於fc例中為100單位/毫升 •9天）時，會發育成基因型地正常成熟巨核妞胞。此即 確定纯化MpI配體具有舆粗APK9相同的對巨核细胞之效懕 。此外*本實驗使用的是經纯化的CD34+鈕胞（100X CD34·)，而非通常只含30750X CD34♦的gCD34-選擇之 细胞。 f 實施例7 * 犬H d丨紀鸦，饨仆 I · « 沭 一 純化出對Mpl受賴顯示出配體預期的活性之蛋白質（ 25 kd和31 kd)。從受照射犬的血漿以採用麥芽凝集素 (VGA)親和層析術，MpI受Si親和層析術，陰難子交換層 析術，接漶層析術，和C 4逆相層析術等的程序纯化出蛋白 質。參看匾4有Μ該純化程序的綜覽。該25 kd和31 kd Mpl配體係经高度纯化到表觀均一性且g澍定為含有本文 所掲示的胺基酸序列者。 1 ·方法 A.血雄的滑瀋化 M濟部中夬標注局員二消費合作社印製 (請先閔讀背云之洼意事項^^寫本一貝 將得自被照射狗的冷凍血漿（缌共20升）（參看S施例 1 )在4艺解凍隔夜；較大瓶子的解凍係在室溫起始數小 時後，才放在冷房内。以1 1 , 000 :< s離心6時脫除.不溶 物。兩含有0·01Χ疊氮化納的磷酸鹽媛衝鹽水，pH 7.3 ( 一 63 — 本纸ft尺度逍用中§1家標洋（CNS ) A4規格（210 X29?公釐） 496870
AT B7 五、發明説明（S1 ) PBS / β氮鹽）稀釋該血漿並以1·2徴米漶器過濾。該澄 清化程序典型地専致起始物約2-倍的稀釋。 Β · 容g溶隼％親和層圻诳 所有搡作都在4 X：下進行。將迻澄清化的血漿（分成兩 批）加到巳在PBS /叠氮鹽中平衡遇的固定化麥芽凝集素 管柱（1升，10 X 12公分，EY實驗室）。於加上樣品後 •甩PBS / *氮鹽從管柱洗，出未结合物，接著用0.5 Μ HaCl/ 20 T「is-HCl，pH 8洗提。然後•甩0.35 Μ Ητ t 乙醢基葡糖.胺（GlcHAc) ，0··5» Μ HaCl，20 *Μ Tris-HCl * pH 8洗提出被VGA管柱结合住<的ΜρΙ配體:活性。在預流 過或洗出液份中都不能偵檢出4pl配體活性。 經濟部中夬標这局負二消f合作i:印製
C , Hp丨-X夸轉鋇和匾圻旃 所用的可溶性老鼠MpI受體（Mp卜X )係對麽於該MpI 受Si的整巷ffi胞外域減去位置483的T「p (參看，Vigon, et al·, 8:2607-2615 (1993))。為了使 MpI 配體對 Μρ1-Χ受體親和管柱的结合最逋化，將VGA洗提集液用薄 膜超漶器（10,000分子量截止值，？110，&^!<:〇〇)及依 序稀釋調整到0.2 Μ的NaCl予Μ濃縮。將濃鍤後的VGA集 液以0· 9考升/分的流速施加到20毫升b-ΜρΙ-Χ (老鼠 MpI可溶性受體）/CNB「活化Sepha「ose管柱上（2·6 X 4·2公分，1·5毫克*-Μρ1-Χ /毫升樹脂）。用40¾升 PBS / ®氮盥以〗.5奄升/分洗該管柱，接著用1〇 Βχ Tris-HCl，1 M HaCb 1 aM CHAPS，ρΗ 8·〇^ 行高鹽.洗狳 (405 毫升）〇 然後用 2〇BMCAPS，lMHaCI，5*M —64 — 尽絲尺度適〶f gg家_ ( CNS ) A規格（21Q x 297公沒） 496870 經濟部中央樣孪局員工消費合作杜印製 A7 _____ B7五、發明説明（62 ) CHAPS，pH 10.5洗提該管柱。收集連當的液份。於每一 获份加入Tr is以中和其pH。 Mp1-X受體親和管柱的洗提曲線经SDS-PAGE和23 0 nB 吸光度分析都顯示在1-4液份有早期蛋白質尖峰，而主要 的配體活性係在第5液份後洗提出者。 D. Mono-Q焓囍孑夺梅蘑坼诳 將幾隻Mp1-X受體親和管，柱的最高纯度洗提份合併，澴 縮並相對於 20 bM Tris-HCl， 5 bM CHAPS， pH 8.7透濾到< 58 · 5笔升的最後體積。Μ 28·〇吸光度估澍集液的蛋白質 濃度為0.12¾克/奄升（約7 f克缌蛋白質:）。將該集液 以〇 · 5奄升/分施加到已平衡二& 2 0 bM T「is-HCl.，5 ·Μ CHAPS， pH 8.7之中的 Mono Q HR 5/5 管柱（Pharmacia )。於27分鐘期間，用在相同嫒衝液中達到0.36 MHaCl 的線形梯度洗提該管柱。然後用到0.54 M Hal的6分鐘梯 度洗該管柱*且最後以0.9 M HaCl進行一步猱洗滌。以1 奄升洗提获份進行收集。 Mono Q管柱的洗提分佈顯示於預流疲和洗滌液份中未偵 檢到Mp 1配S，而只偵檢到可忽略的蛋白質。大部份的 配體活性S在起始NaCl梯度階段中的洗提液份5-7中 洗提出。在洗提份8-10觀察到活性”肩”，接著在洗提份 11M5出現第二倨主要尖峰。 於活性洗提份中KSDS-PAGE (非逭原性）観察到一明頚 的25 kd帶。該帶的強度直接對麽於洗提份ΐ的Mpl.配S 活性。於洗提液份3和4中不含該帶（無活性）。於洗提 ，裝 一 65 一 本纸ft尺度通用中家標李（CNS ) Α4規格（210 Χ 297公釐） 496870 Λ7 B7 五、發明说明（63 ) 份5和6中有明顯活性（1A6.1活性峰）且在洗提份 11-14中有類似的強染色帶（1A6.1活性峰）。於洗提份 15和16的集液中有弱帶，其對麽於洗提份16中的明顯較低 活性。 E · 凝糝洗提窨賒 用Mono Q洗提份5和6或Mono Q洗提份13和14的液份進 行凝穋洗提實驗。為這些實联，製備洗提份5和6 (各6徵 升）或13和14 (各7.5微升）的集疲，與SDStPAGE樣品嫒 t 衝液（非退J性）混合後，·加$U2S SDS凝穋上。於電泳 完華後，切出標的電泳道（1毫1)並用刮_刀將該切條 切成小片。將該切片轉移到1 -S毫升微離心苷内，其内巳 先装著0.5毫升PBS/5sMCHAPS ，再於4它下溫和攪拌 隔夜。於第二天，稍微旋轉彼等管後，取出液份*再將該 樣品相對於補充BSA作為載體蛋白質的Iscove氏培養基進 行透漶。经透漶後的樣品即用於分析中。 其结果顧示出有兩届Mpl配體活性尖峰。一尖峰對應於 凝繆的25 kd區，而第二届Mpl配體活性尖峰則出現在 31 led區内。 F · Superdfix 2 0 0 6¾ 將Mono Q陰《子交換管柱所得13-16洗提液份，及第二 Mono Q分離所得兩屆相同洗提液份等合併並兩薄膜超逋器 (Centricon-10，Aiicon.)予 Μ 濃縮。加人 SDS 到 〇·1Χ 的 最後濃度，並將該樣品注射到SuPe「dex 20(T HR 10/30 (Pharmacia)管柱上。甩0.3毫升/分流速將該管柱平衡 一 66- 度適用中113家^辛（CNS M4規格（210/<297公沒i 1 i I- ! ...... :--1 y-i - 1 i 1 士^靈·… (請先父讀背念之項寫本一貝 丁 -" 線 496870
五、發明説明（64 ) (請先間贫2a之2意事:寫大二貝 到 50 bM Tris-HCl，0,15! SDS，pH 7.5 之中，並在室溫下 操作。收集1分鏟洗提液。其结果為樣品中的大部份蛋白 質係在洗提份32-40中洗提出，而在洗提份42-46偵檢到 MpI配體活性。SDS-PAGE洗提份分析顯示在活性洗提份中 有明頭的25 kd帶。 G . 0_4逆囪 ΗΡ1.Γ 將5^6「(^¥ 200洗提份4 3，-46合併液或單獨的洗提份 42甩薄膜超濾器（^丨<:「〇(：〇^10 ,Aiicon)予.K瀠缩。將 t -5 經濟部中央標绛局員工消f合作社印¾ 濃缩集液分別施加到1 X 1〇〇_奄米C4逆相微孔洞管柱（ SynCh「oPak RP-4 )上。將該管”柱平衡在 0··'04Χ TFA / 水 中（谖衝液A );煖衝液Β為J〇.〇355! TFA/80X乙腈。於 注射樣品之後，於4分鐘期間實施到45 X B的線形梯度， 接著，於40分鐘期間施以到75X B的線形梯度。其流速為 7 5»升/分。洗提份42的纯化结果表於圖5中。在其洗提 份21-23中觀察到明顯的Mpl配體活性尖峰。用這些洗提 份在14S聚丙烯醢胺凝g上，於非逐原與适原兩種條件下 分析。洗提份21含有單一 31 kd帶；洗提份23含有一單一 寬25 kd帶；而洗提份22同時含25 kd和31 kd兩區的帶 。未看到其他明顯的帶。要提及者，早期凝鏐洗提實驗已 認為兩區都有MpI配趙活性。於非适原性凝穋的所有洗提 份都S察到小的高分子童帶，但i适原性凝接中則未能看 到0 H· 9^ MSI 31 kd 】配餺的媸序..¾.分析，. 在含有活性的C4 RP-HPLC洗提份上進行卜端序列分析。 一 67 一 本纸法尺度適闫中国国家標洋（CNS ) A4規格（BOX 297公釐） 496870 Λ7 B7 經濟部，f夭標注局員二消f合作幺印製 五、發明説明（55 ) 這些蛋白質酒出的序列都已列於前文。除了對懕於25 kd 帶的主要序列（為所加樣品缌量的至少90X)，序列分析 另偵檢到兩®少量序列（其係與上面G中所逑小雜質帶相 结合者）。舆已知序列比對之後顯示出該兩少量序列的犬 Ig重鏈和k鐽。必要時，可以施用另一纯化步猱，例如， 較佳者*另一膠滤步猱，使這些少S雜質的量進一步減低 〇 I · C4饨化洗提份中MdI配鸦活件之吐於 圈6數據顯示C4 RP-HPLCj_析步揉所得洗提份22和23中 的活性係貧質地相等的。洗提份12含有25 kd和31 kd兩 帶的混合物，而洗提份23只含i 25 kd帶。取各洗提份的 液份予以稀釋1:45000 。稀釋後的洗提份實質地同樣可剌 激1A6.1细胞生長（洗提份22，5400细胞/润；洗提份 23，6000鈕胞/洞）。將稀釋後的洗提份與逐增濃度的 Hpl-Χ —起溫育。該等洗提份對Mpl-Χ的抑制作用有同等 的敏感性，兩者都含被7-1.4微克/奄升所完全阻斷。這 種结果顯示每一洗提份中的活性蛋白質為具有同等生物活 性的MP1配體物種。 貢拖例8 «^丨 E镅相對於茸他丙孑對g炫朐荈育夕咔餃 有許多重组因子或有桷化合物’，例如大戟二β醇肉豆蔻 酸乙酸酯（ΡΜΑ)等據報等會影響巨核细胞生長或發育。因 此’乃研究這些因子對於CD34-選擇周圍血、的影響.。於 培養物中依所示加入人類重姐間白素3 (IL-3，l-2奈克 (請§讀背面之_事項寫本買) •裝. ，-口 線 本纸3：尺度適用中國1家禚洋（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 496870 Λ7 _ Β7 五、發明説明（6S ) . /奄升），幹®胞因子（SCF ，50奈克/毫升）*間白素 δ (IL-6*25奈克/奄升），促紅血球生成素（ΕΡ0 ，1 單位/毫升），白血病抑制因子（LIF ，10奈克/毫升） *和粒狀鈕胞一巨噬鈕胞群落一剌激因子（GM-CSF，25奈 克 / 毫升，ABgen, Inc.);間白素 11 (IL-11 ， 25奈克 /毫升，R + D***，Minneapol is, MN )，大戟二β醇肉 豆蔻酸乙酸酯（PHA ，1〇-'〇 M，SUaa)等。Mpl配體的 用量為275單位/毫升，APK9的甩量為5¾ (相.當於22〇釋 位/奄升）。组合試驗的因/子，別試驗時的相同濃度 使用。k培養8天後，將细胞直-接固定在洞:中並染色巨核 «5胞（n = 6洞每狀況）或計數^细胞数目（n = 3洞每狀況 )。數據係表為平均值士 SEM 。 圓7顧示APK9和Mpl配體都可導致最大數目的巨核细胞 /洞。IL-3也専致巨核钿胞發展，尤其是與SCF姐合使用 時。IL-6，IL-11 ，或ΕΡ0等，於單獨時或與IL-3组合時 ，對巨核细胞數目都很少影W。PMA ，LIF和GM-CSF都很 少影響。圓8為來自相同買驗的數據，顯示出每洞所得缌 #5 胞数（”® 胞率 ”（Cellula「ity)) 。APK9 和 Mpl 配體對 鈕胞率影響很少，而IL-3和SCF具有中等影響。SCF與 U-3组合時具有最大影*。用匾7和3所示数據來計算每 洞的巨核细胞百分比，如圖9中命示者。顯然地，可等致 每焙養洞最大巨核细胞百分比的因子為Mpl配體一 APK9中 的活性成份。這種结果顯示出Mpl配體對巨I核押胞的持定 性。 一 6 9 — 尽紙乐尺度適用中S国家標孪（CNS ) A4規格（2丨0乂297公釐） 請§尊云之：¾ 一爭項 寫太一貝 經濟部中夬標準局—工消費合作杜印製 496870 Λ： B7 五、發明説明（67 ) 實施例9
Hd丨S；髎的曰铉细跑仴谁活件與人類I L - 3無Si-MpI配體在用為實拖例2所述培養基的補充物時可剌激 人類巨核妞胞的發育。雖然IL-3不是該培養基的成份’但 其在該焙養基所含正常人類血漿中仍以不能測得之低水平 存在。不逄，即使在其存在，IL-3亦不涉及Mpl配體一誘 導巨核细胞生成之中。此點_示於圖之中。2奈克/毫升 的Π-3在人類巨核钿胞分析中可専致14,900巨.核细胞單悴 /笔升之活性。此活性會被·抗，IL-3 (3.3微克/毫升； Genzyie, Cambridge, MA)抑制m 。8 2 0 3.巨核细胞單位 /毫升的Μ p 1配體不會被抗-li - 3所抑制。 寊拖例10 jgKol紀賴之分析 I . g诫 诗先¥*?;至十v/-i意事項寫本頁 ^ΙΙΗ· 装 經濟部中夬樣孪局員二消f合作社印製 具 有 Hpl 配體 活 性 的 受 照 射 豬 血 漿所 得 蛋 白 質 VGA 親 和 層 析 術， Hp 1 受 體 親 和 層 析 術 f 離子 交 換 層 析 術 和C4逆 相 HPLC等予 Μ鑑 定 〇 該 活 性 也 纆 由 從 SDS- 聚 丙 烯 醯 胺凝 的 切 條 洗提 出來 進 行 鑑 定 0 曆 析 術 註 釋 VGA 親 和管 柱 施 加 4. 4 X 10® 單 位 回 收 3 . 4 X 10β 單 位 Hp 1 受 體管 柱 拖 加 2 . 7 X 10® 單 位 回 收 2 . 4 X 10° 單 位， Ho no Q離子 交換 施 加 2 · 4 X 10® 單 位 —7 0 一 本纸ft尺度適用中as家结洋（CNS ) A4規格（2ί〇Χ 297公屋） 496870 Λ7 B7 五、發明説明（68 經濟部中夬標.Λ局員二消費合作社印¾ 回收4.4 X 1〇β單位 於洗提份23 -25回收到活性 明顯區別出兩活性，其一出現在 約1δ kd·另一在約28 kd。 實施钶11 人頟Mp丨-SR鸦，人頟MGDF之撰稍 下面概述出兩種作法：_ I ·第一蒱代弄件铒铕作法 A · 人類頭之轰生 根據k蛋白質的胺基端序列.計許多簡併:性PCR'引物。 用不同的引物配對從人類基因」體DHA擴大該MGDF基因。在 用有義引物 5f GCH CCN CCN GCH TGY GA 3· (SEQ ID H0:4) *其编碼犬蛋白質的前五倨胺基駿（SEQID H0:1 )及反義引物：5’ GCA RTG YAA CAC RTG HGA RTC 3’ （SEQ ID N0:5)，其编碼 SEQ ID H0:1 的胺基酸 16 至 21*進行40倨擴大循環之後，將PCR產物於2.0X瑱脂糖凝 穋上於TBE媛衝液中洗提。 從瓊脂糖凝穋切出63 bp帶並用相同的引物姐再擴大。 將該PCR產物選殖在PCR II載B中（Invit「ogen, San Diego)。經由DHA序列分析篩選出眾多純系。使用编碼類 似於犬MGDF蛋白質的肽之質SI DH〗作為起源以產生兩以篩 S cDM A庫的放射性探頭。該基因所缅碼的胺基酸序列如下 所示： " pH 6.0 C4逆相HPLC 凝摄洗提實驗 裝 訂 71 本纸法尺度適用中ga家標辛（CNS ) Α4堤格（2丨0 Χ 297公釐） 496870 AT B7五、發明説明（δ9 ) Ala-Prc-*Prc-Ala-Cys-Asp-Leu-Arg-VaI-Leu-5er-Lys-Leu-Leu-Arg-Asp-Ser-His-Val-Leu-His (SZQ ID NO: 5) 用含有人類MGDF的瓊脂糖帶以熱PCR產生該探頭。典型 的100微升PCR反懕含有下列成份。 模板DHA 2- 3 u 1 5 ’引物（SEQ ID H0：4) 1 u 1 , 2 0 p μ ο 1 e s 3 ’ 引物（SEQ ID HO ： 5) 1 u 1 , 2 0 piο 1 e s 10 X嫒衝液 1 _ 10 u 1 dATP (0.1 iH) *•2 u 1 * dTTP (10 1 M) * 一 2. u 1 dGTP (10 a H) 2 u 1 · dCTP (0.1 mH) 2 u 1 dCTP, p32 (10 u C / u 1 ) 5 u 1 dATP, p32 (10 u C / u 1) 5 u 1 Taq DNA 聚 合酶 0 . 5 u 1 , 2. 5 單 β 7k 77 u 1 總體積 100 u 1 (請先閎讀背*之-;1意事項一$寫本\貝 經濟部中夬標洚局—二消費合作社印¾ 纊大反應條件如下所列 起始加熱 冷卻配對 擴展 變性 9、X：，2分鐘 53 t：，30秒 72V，30秒 i 94t： ，30秒 一 72一 本纸乐尺度適用t国S家標孪（CNS ) Α4規格（2【〇Χ 297公釐）
<、發明説明（70) 經濟部中夬糅孪局員工消費合作杜印& 在 P e「k i η E 1 a e r G e n e A p S y s t e b 9 6 0 0 中進行 4 0 届擴大循 壞。 將產物通過一推進管柱（Stratagene, San Diego ) ° 取1微升的探頭置於閃爍計數器内計数。於雜交混合物中 加入含有1至3百萬計數/毫升之探頭。 B · 拾If直之樓成 人類胎肝聚A+RHA係購自Clontech實驗室。.用約4微衷 的RHA進行cDNA合成，其中/係，接著到含有Xba I部位的 甚核苷^之無規六Η物，5，GATT CGC GTT CTA GAN NNH HHT 3 ’， （SEQ ID NO :7)進行發。 使甩Gibco-BRL程序來產生雙股cDNA。將Eco R I-Bst X I 轉接子（Invitrosen, San Diego )連接到 5 股 cDNA，接著用限制酵素，XbaI ，消化。在S500 Sephacryl 管柱（Life Technologies, Inc.)上進行 cDHA的尺寸選擇。將大於400 bp的cDNA連接到已用Eco RI和Xba I消化遇的晡乳動物表現載！Ιυ19·8 (Ma「tin, F，，Cell 6 3:203 -2 1 1 (1 990 ))。將勝任的大腸桿 Μ DH10细胞轉化並將所得cDNA庳分派成各為100,000 cDNA的 7倨庫。 c · 篩環人/康 從Clontech購得在入gtll中的人類胎腎庳·效價為650 百萬Pfu / ¾升。甩PCR產生的探頭（參看1客）篩選約 2百萬姮菌斑。於56Ό下，在6XSSC ，5XDenhardt， 一 73 一 本纸法尺度適周中S國家標孪（CNS ) A4規格（Z10 X 297公釐） (請先洼意事項寫木頁 一 •裝. 訂 線 496870 ___B7__ 五、發明説明（71 ) 0.1S SDS，100微克/毫升，單股鲑精DNA之中進行雜交 1 5小時。 進行多次篩選。從單一菌斑擴大DNA並兩编碼SEQ ID N0:6中胺基駿7至13的内引物5’ AGT TTA CTG AGG ACT CGG AGG 3’ （SEQ ID H0:8)進行雜交以鑑定真正的正樣。 D · ρΠΝ A鴒的快涑搪大（RACiLL 人類胎腎和眙肝的聚腺苷酸化RHA係購自Clontech。取 1 微克的 RHA 用寡 5’ TTC GGC CGG ATA GGC CTT TTT ΤΤΤ ΤΤΤ ΤΤΤ 3· (DEQ ID H-b匕9)作為引物進行逆轉錄。 甩 GiLC0-BRL cDHA合成配套_-劑（Life T^chnolosies Inc·, Cat· tt 13267-013)產—生第一股 cDHA。最後題稹為 30微升。添加500 bM EDTA到10 bM最後濃度以停止該反 懕並保持在-20 t：。 對於初姶PCR ，每反懕係用0.5微升的cDHA作為模板。 用引體SEQ ID H0:9和競爭物寡5’ TTC GGC CGG ΑΤΑ GGC CTT ΤΤΤ ΤΤΤ ΤΤΤ ΤΤ-Ρ 3’ （SEQ ID Η0:10)作為反義 引物，而用编磚SEQ ID Ν0:6所含胺基酸5到11的寡核苷 酸 5’ TGC GAC CTC CGA GTC CTC AG 3’ （SEQ ID Η0:11) 作為有義引物。用前述程序：94 Ό起始焙育2分鐘後，在 941C ’ 30秒；651：，30秒；72它，30秒；進行40借擴大循 環。使兩 P e r k i η E 1 e「G e n e A m p S y s t e a 9 6 0 0 進行該擴大 Ο 用有義引物，编碼SEQ ID N0:6所含胺基隹δ到14的 、 1
5* GAG TCC TCA GTA AAC TGC TTC GT 3f (SEQ ID -74- 本纸尜尺度適用宁S國家禕牟（CNS ) A4規格（2丨0X29?公釐） (請，先父讀背今v/,.νΗ象寫本頁 •裝 :¾濟部中夬標这.局員工消費合作社印¾ 496870
AT B7 五、發明説明（72 ) Κ0··12)，而用SEQ ID H0:9和SEQ ID H0:10作為反義引物 進行重β。進行40俚擴大循環，其中冷卻配對係在651下 買施。在0.8S瑱脂糖凝穋上進行該PCR產物的分難，並在 UV光下照相。可看到在〇·8至1.2 kb附近有分離帶。 然後將PCR產物選殖到載體PCR II (Invitrogen)之中 。拂選出別群落並用Qiagen配套藥劑cat ΙΠ2143和 12145分離質體。用載體引，物完成雙股染枓引發的序列分 析。使用各種類型的GCG软體分析該序列。 E . V筘-\ ’引物伸屏 為了 ^離出全長度MGDF基因的—序列，乃甩不同的'始犴庳 姐合作為模板進行3’和5’引物展。對於c D Η A 5 ’引物的 擴大，係從每一姐合各取約20奈克的cDHA作為模板。使用 對MGDF具特定性，編碼SEQ ID H0:6所含胲基酸12至17的 反義引物 5’ GGA GTC ACG AAG CAG TTT AC 3’ （SEQ ID Η0··13 )與 5’載 βν19·3 有義引物 ^ CCT TTA CTT CTA GGC CTG 3* (SEQ ID N0:14)。進行30倨擴大循環，其中 冷卻配對係在53t)實施。用编碼SEQ ID N0:6所含胺基酸 1 至 6 的反義引物 5’ GAG GTC ACA AGC AGG AGG A 3’ (SEQ ID Η0··15 )和載體引物SEQ ID N0:14進行30届重叠 循環。 對於MG DF cDH As 3’端的引物#展，係使用反義載嫒引 物 5’ GGC ATA GTC CGG GAC GTC 3’ （SEQ ID H0:16 )與 對MGDF具特定性•編碼SEQ ID.H0:6所含至6的 引物 5 ’ TCC TCC TGC, TTG TG A CCT C 3 ’ (SEQ ID HO ： 17 一 75 一 本紙杀尺度適用中ϋ3家標辛（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） (請先«贫5^7之注意一爭項|^寫太\貝 -裝 線 Μ濟部中夬標绛局員工消貧合作社印製 496870
五、發明説明（73 ) , )。進行30届擴大循環•其中冷卻配對係在58t：實施。 甩MGDF引物SEQ ID Ν0:12和載S引物SEQ ID Ν0:16進行 30届循環的重叠擴大。特定性帶出現於姐合编號1 ，7和 δ中，將其選殖於PCR II載體内。從單一群落純化所得質 體DHA再羟纯化並分析出序列。 F · 令#麻λ類HGDF^^之分雜 有許多起始純系缺乏MGDF蓝基端的一部份，係因使甩部 份的MGDF序列進行引發和重叠之故。甩依上遮5’引物伸展 t S 驗得到的序列—引物 5’ C-CAiGGA AGG ATT CAG GGG A 3’ （SEd ID N0:18)作為有義引，。用載體与丨物SEQ ID N0:16作為反義引物。進行35>届循環的擴大，其中冷卻配 對係在5810下進行。接著，使用對HGDF具特定性，含有 Sal I 部位的引物 5f CAA CAA GTC GAC CGC CAG CCA GAC ACC CCG 3’ （SEQ ID H0:19)與載 Η 引物（SEQ ID K0:15 )進行35S循環的重叠。將所得PCR產物選殖於 PCR II戰體中笼定其序列。 I ·第二e代宪袢撰葙作用 A · 女MGDF Μ -端rDMA之锇箱 根據前面節段中所述犬MGDF H-端胺基酸序列設計簡併 性募核眘駿引物並甩於聚合薛鍵型反懕（PCRs)中作為引物 K擴大编iiMGDF的cDHA序列。甩腎樣品以Chonzynski和 Sacchi的異硫氰酸胍法（Biochea· 162:156-159 (19δ7) )製備總RHA 。甩阐機引物一轉接子5· GGffcqG ΑΤΑ. GGC CAC TCH ΝΗΗ ΝΗΤ 3’ （SEQ ID Ν0··20)以 MoMULV 逆轉 一 76 一 本纸杀尺度適用今ϋ國家禕立（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 請先閎讀背Γδ之注意W.項 写太一貝) 經濟部中夬標注局員二消贫合作杜印製 496870 經濟部中夬橾这局—工消费合作社印製 Λ< ____Β7__五、發明説明（74 ) 録S§製備第一股cDHA並作為棋版用於後鑛PCRs中。 PCR係在0.5微升，約50奈克的cDHA上進行，其中使周 编碼SEQ ID NO : 1所含胺基酸卜6的有義股引物一引物A 5’ GCN CCH CCH GCH TGY GA 3’ （SEQ ID N0:4)，及引物 B 5’ GCA RTG NAG HAC RTG HGA RTC 3’ （SEQ ID H0:5) 或引物 C 5f GCA RTG YAA NAC RTG HGA RTC 3’ （SEQ ID H0:21 ) *其為编碼SEQ ID，H0:1所含胺基酸16-21的反 義股引物，其在5’端有加上三俚額外的核苷酸以缯加冷卻 配對安定性。用Taq聚合酶/的上CR係進行35至45倨循環， 直到在&脂糖凝膠電泳分析上有·，明顯產物帶:為止。對於前 面兩倨PCR循環•其冷卻配對> 猱係在37 1C下進行2分鐘 ;對於其餘的循環，係在50Ό下冷卻配對1分鐘。於每次 反應中都觀察到多重產物帶。用巴斯德氐吸管尖端收集包 含具有大略預期尺寸（66 bp)的帶之凝穋部份並甩相同的 引物配對再擴大。根據製造商的說明將DHA產物選殖到載 fiPCR II (Invitrogen)之内。定出三纯系序列並發現其 係在一讀碼内，编碼預期的犬MGDFcDHA ，殘基1-21。於 這種方式得到獨特的犬MGDF cDNA序列，其跨越密磚子6 的第三核苷酸到密碼子15的第三倨核苷酸。用這些纯系之 一作為棋板以製備经標示的犬MGDF cDHA探頭。 B · 人頷眙肝cDN/廑之捸成 用人胎犴（International Institute for the AdvanceBent of Medicine, E x t on, ΡΑ) ^1^ 将姐雜痒裂 於5·5 M硫氰酸ffi中並MCsTFA (Pharmacia)雛心纯化而 (請先閎讀背:&之注意事\?^^寫本\貝 »{· -裝 訂 一 77 一 本紙法尺度通用中国國家標孪（CNS ) A4規格（210X297公釐） 496870 Λ7 B7 五、發明説明（75) 分《出RNA 。用寡（dT)25dynabeads選擇出聚腺苷酸化 RHA (Dynal，根據製造商的說明）。甩該RNA K供cDNA合 成用的 Superscript 質體***（Life Technologies, Inc.)製備雙股CDHA，但不同處在於使用不同的騎结子轉 接子：5* TTG GTG TGC ACT TGT G 3’ （SEQ ID N0:22)和 5 ’ C A C A A G T G C A C A C C A A C C C C 3 ’ （ S E Q I D N 0 : 2 3 )。 於尺寸選擇之後，將該cDHA.取向地嵌到晡乳動物表現載體 PBCB的Bst XI和Hot I部位（pBCB係衍生自質體Rc/CMV.， InYit「ogen，其含有pUC19 -kjS，CMV啟動區和BGH聚腺 苷駿化_位）。將連接後的D N A -電嵌入到電:勝任性细菌株 10 B (Life Technologies, Luc·)之中。 C · λ眙阡cDN A篩撰MGDF 將人胎肝庫的《器複製體於64 t；下與放射標示犬MG DF Η -端cDNA PCR產物雜交18小時（5 X SSPE，2 X D e n h a r d t · s，0 · 0 5 X 焦磷酸納，0 · 5 S； S D S，1 0 0 微克 / 奄 升酵母tRHA溶解產物和100微克/毫升的菱性跬精DNA ) 。將漶器置於641C下，5 X SSPE，0.5X SDS之中洗滌並靜 置隔夜。分離出雜交到該探頭的兩種不同纯系並分析之。 D · 人類MGDF 之羌琨 將從MGDF cDNA纯系所纯化出的DHA轉染到293 EBHA妞 88 ( I n v i t「〇 g e n )内。用1 . 5徴竞的D H A與7 . 5微升的 Lipofectaaine ( Life Techη ο 1 ogies, Inc·)在 1 00 微 升無血清DMEM中混合。在室溫下溫育20分鐘售，將該 DHA-Lipofectaaine 混合物加到 400 微升 DMEM，IX 血清（ (讀先VT讀背云之：νϊτ項芎本一貝 -—ϋ ί I 置I·· > -----
-I— i 1 I 訂 -Km Hi —It* 線 78 一 -------- --- 3·釁1 IP· != »1 l«t i I i-»—m 用中家標注（CNS ) A4規格 (210 X 297公釐） 496870 Λ： B7 五、發明説明（7S )
Fetal Clone II)中達5 X 10s ffl胞/洞（24洞正方形 GreUe「培養板）並在3713焙育6小時。將500微升的 DMEM，203!血清（Fetal Clone II)加到 S3 胞上。16 小時 之後，吸取出培養基並加入500微升的DMEM，13{血清（ Fetal Clone II) 。72小時後，收集調理過的培養基並鏟 心通過0.22微米旋轉蒸發。分析該調理培養基所含MGDF生 物活性。 _ 丨裝 1 .人額HGDF^I的描沭和活性_ 根據上述選殖程序，得到/圖_11 (MGDF-1和MGDF-2; SEQ ID H0:24，25;和 26，27)與&12 (MGDF-3; SEQ ' I D H0:28 ，29)所示的人類cD H.i純系。圖中所示這些序列各 訂 含一鞍基酸卜21的推定信號序列，所以，各情況中，成热 蛋白質係從胺基酸22開始的。 線 用上面賓施例4A所述妞胞基分析WMGDF 1-3進行活性分 析之结果列於下面的表3和4中。於表3中，用各構成物 轉染過的293 EBN A妞胞，在2天培養後收集其調理培養基 ，並在 1A6.1 妞胞（32D/au「-MPL + ) +/- 10 微克 /¾ 升 經濟部.?夬標绛局員工消背合作社印裝 u「-MPL-X之上進行試驗。於表4中，甩各構成物轉染過 的293 EBHA妞胞，在4天焙養後，收集其諝理培養基並在 32D/aii「-MPL♦细胞（實拖例 3A)和 32D/hu-MPL·妞胞（S 拖例3B)之上試驗，可以看出，乂類MGDF-1和MGDF-2對於 表現老鼠和人類兩種形式的Mp 1之鈕胞系都有活性》而 MGDF-3則無。表現人類HP1受體的妞胞系對^於人類 〆 f MGDF-1和MGDF-2的反懕性大於表現老鼠Mpl受體的鈕胞系 一 79 — 度適用中g S家標洋（CNS ) A4規格（2丨0 ;< 297公菝） 496870 Λ7 B7
經濟部中夬標李局員二消費合作社印製 W 發明説明（77 ) 之反懕性。 表3 U/· 1 U/il 純為 (-aiur-HPL-X) fflur-HPI.X) 培養基 0 0 PBC0 (對照 質 體） • 〇 0 HGDF-1 12,800 .800 HGDF-1 (重 複 ) I 12,2.0 0 566 HGDF-2 4 5 2 5*' 400 HGDF-2 (重 複 ) 12^J3 0 1131 HGDF-3 0 0 MGDF-3 (重 複 ) 0 0 APK9對照 4400+/-400 0 表 4 U/il U/il 純系 32D/iur-MPL+ HGDF-1 1600 25,600 MGDF-2 6400 50,000 MGDF-2 (重 複 ) 6 4 0 0 50,000-100,000 下面的表 5 顯示出人類MGDF-1和MGDF -2SL32p/hii-RPL 细胞（實施例3 B ) 的活性會被可溶性人類Mpl受賴（ 一 80 — 本袄杀尺度適用令IS家標注（CNS ) A4規格（210 X 297公沒） 訂 線 ^6870 經濟部中夬標注.局員二消費合作杜印¾ ____B7__五、發明説明（73 ) hu-MPL-X)所實質完全地抑制。Hu-HPL-X係存在於從產生 該蛋白質的CH0妞胞收集到的調理培養基内。該CH0 hu-HPL-X調理焙養基係g濃堵120 -倍後，再加到焙養物内 ，濃度為6.6X。從對照姐CH0培養物收集到的調理培養基 對分析沒有影W。該分析係依實施例4B所示進行，不同S 在於係在3天後才評估存活鈕胞。 表 5 . 妻升 U/奄升 娃為 (-Hu->m:-X) ( + H:u-MPl，X) MGDF-1 5iD Ο HGDF-2 270 Ο 人類巨炫睢分祈 HGDF-1和MGDF-2都可誘専周圍血疲CD34-選擇SB胞形成 巨核®胞，但MGDF-3則否。表6中所逑實驗基本上是依寘 施例2中所述者進行，不同處在於該周圍血球係迓CD34-選擇過但未洗淨者且該焙養物係在7天後收取者。從每種 293 EBNA MGDF構成物所得謂理培養基係以20X最後β積 ♦/- 30微克/奄升au「-MPL-X之條件使用。ΑΡΚ9對照樣係 K 6S最後體積使用。 (請先閱讀背面之·，/x意事磺 ?本百； 裝 線 本氓泫尺度適用中sa家標注（CNS ) A4規格（2丨0 /< 297公釐） 496870 Λ7 _____B7 五、發明説明（79 ) 表 6 純系 巨核《9胞/洞 _ C-iur-MPl.-X) 巨核细胞/ ( + n!iir-MPL~ 載Μ對照樣 0 0 ΑΡΚ9對照樣 100 + / - 3 0 HGDF-1 142 + /- 48 17 2 HGDF-2 100 ", 3 6+/-2 MGDF-2重複 86 + / - 10 .0 HGDF-3 2 ( + /·- 一 2 0 S施例>2 (#无之注意事項^11寫本\3: 經濟部中夬標注局員工消f合作.杜Μα「χ 下面的實施例說明12種不同」的聚乙二醇化MGDF分子， PEG9-PEG12和PEG14-PEG21 ，之合成。於各例中，被聚乙 二醇化的MGDF分子為大腸桿菌衍生的MGDF-11 (從信號肽 開始嘏號時為胺基酸22-184;從成熟蛋白質開始埸號時為 胺基駿1-163 )。下面的表7-10摘要出有醏全部這些聚乙 二醇化物種的妞節。 12.1 用活化MePFlG衍牛物链/HMGDF而郸借名- MftPFIG-MGDF捺合物 多-MePEG(20kDa)-MGDF培合物（PFH 11)夕剪僚 將冷卻遇（4 t；)的MGDF(2.5奄克/毫升）/0·1 Μ BICIHE嫒衝疲，pH 8之溶液加到ί〇-倍莫耳超量'的固體 HePEG 丁二 g 亞胺基丙験酯（MV 20 kDa) (Shearwater Polyiers, Inc.)之中。溫和撗拌Μ溶解該絮命物並在室 溫下湛績進行反應。 於反應過程中的蛋白質改質程度係甩粒度排斥（SEC) —8 2 — 本虼法尺度適用卞11国家標李（〇>^)4*\4規格（2丨0>( 297公釐） 496870 Λ7 B7 五、發明説明（80 ) HPLC 予 Μ 監潮，其係使 MSuperdex 200 HR 10/30 管柱（ Pharmacia Biotech )，Μ〇·1 Μ K 酸紡媛街液 pH 6.9, 流速0.7奄升/分進行的。 在30分鐘時點進行反懕混合物的SEC HPLC分析時顯示反 應混合物中未留下自由蛋白質。於該時點，加入無菌水使 反應混合物中的蛋白質濃度減低到1毫克/毫升並用數滴 Ο·5 Μ乙酸將混合物的pH值.調整到4 。 然後用 SP Sepharose HP (Pharnacia Biotech)難子·交 換樹脂M離子交換層析術·從曼剌的MePEG和其他反懕副產 物中分~離出MePEG-HGDF接合物π 將反應混合物加到（2 · 5笔：^ /毫升樹脂）管柱上•用 3倨管柱體積的起始媛衝液A (20 bM磷酸納，pH 7.2· 15X甘油）洗提出未反思的HePEG 。之後，用10®管柱趕 積，0X至30S終端媛衝液B (1 M NaCl /媛衝液A)的線形 梯度洗提出MePEG-MGDF接合物。於280 nn監測洗提液。將 含有多- MePEG-MGDF接合物的洗提液合併，濃縮並無滹過 滹0 將該纯化逄的多-MePEG-MGDF接合物用TS1C-GEL G 4000SVXL和G2000SWXL兩串接在一起的膠濾管柱進行 SEC HPLC分析。以280 η*的UV吸光度偵檢蛋白質。用 bio-rad穋溏標準品作為球形蛋^質分子量標瘡物。 從圈17A可>乂看出，SEC HPLC頭露出製備物中有兩倨主 要成份（約圼2比1比例），其洗提位置分i別声《於， 370·9 kDa和155.0 kDa球形蛋白質。亦#看下面的表8 -83 - 用中SS家標李（CNS ) A4規格（2丨0 X 297公釐)" (請先閎請背云之;1意事項|||^寫大二貝 裝 訂 經誇部中喪梂绛扃負v\消資合作社印一 496870 經濟部，〒夬標注局員工消费合作社印製 Λ： Β7五、發明説明（81 ) Ο 用MV = 6-50 kDa的MePEGs之丁二醢亞胺基酯進行MGDF留 化製備成的接合物PEG 9 ，PEG 10和PEG 12也是Μ類似方 式進行。表7摘列出這些製備所用的主要反懕#數。 表8列出這些接合物的SEC HPLC分析结果。 12.2 用HePEG薛將MGDFg原袢烷甚化郸備多-MfiPFIG-MGDF捺合物 ^ 多-MePEG (20kDa)-HGDF捽会物（ΡΡ1Π 20)之郸借‘ 於经冷卻（4 1C )，攪拌·中，的MGDF ( 2奄升，2· 5奄克 / 奄升3 /100 ·Μ磷酸納.PH>/20 Na:CNBH3 溶液中 加入10-倍莫耳過量的一甲氧_基一聚乙二醇醛（MePEG ) (平均分子量20 kDa)並將反懕混合物置於相同溫度下堪 鑛攪拌。 於反思遇程中的蛋白質改質程度係用SEC HPLC監滴者， 其中使用 S u p e r d e X 2 0 0 H R 1 0 / 3 0 管柱（P h a「b a c i a Biotech) ，Μ0·1Μ 磷酸納媛衝液 PH 6.9，0.7¾ 升 / 分流速進行洗提。 於16小時後，SEC HPLC分析頭示有起始量90¾以上的蛋 白質被改質。此時，用無菌水稀釋反應混合物使反S混合 物中的蛋白質濃度成為1毫克/牽升並將其PH值調整到4 (0 · 5 Μ乙酸）❶ 用 SP Sepharose HP (Pharaacia Biotech)離子交換樹 脂K離子交換層析術從剌餘的MePEG和其他1齊副產.物中 分難出MePEG-MGDF接合物。 一 8 4 — 冬.纸杀尺度適用中S3家標这（CXS )六4規格（210 X 297公沒） 496870
經濟部中夬標注局—工消費合作钍印製 五、發明説明（82 ) 將反懕混合物施加到苷柱上（2.5奄克/毫升樹脂）並 用3届管柱體積的起始嫒衝液A (20 bM«酸納，pH 7.2, 15X甘油）洗提出未反應MePEG 。之後，用10®管柱鸦積 * 0X至30S終端煖街液B (1 M HaCl /媛衝液A)的埭形梯 度洗提出MePEG-MGDF接合物。於2δ0 πβ監測洗提莪。將含 有多-HePEG-MGDF接合物的洗提液合併，濃縮及無菌過漶 Ο 用串接在一起的TSK-GEL G4000SVXL和G2000SVXL接薄 管柱對经纯化的多-MePEG-^GD_F接合物進行SEC HPLC分析 。以2δ0 nB UV吸光度偵檢蛋白-質。用BI0-:RAD驂’滅標準 品作為球形蛋白質分子量標誌j。 從圖17B可Μ看出，SEC HPLC揭露出該製備物中有兩種 主要成份（分別佔全量的52X和47X)，其洗提位置分別對 應於359.4 kDa和159.3 kDa球形蛋白質。亦參看表8 。 以類似方式，用MV = 6-25 kDa的MePEG醛進行MGDF的适 原性烷基化而製備得接合物PEG 18，PEG 19和PEG 21。表 7摘列出這些製備所用的主要反懕參數。 表8列出這些接合物的SEC HPLC分析结果。 12.3 瘦著部份宑N -端α -防某務的一田氢某一聚乙二S riKGDF捽合物之脚借 二-MpPEnUOkDabMGDF 捺合& (ΡΡ：Π 16)之郸借 於经冷卻（4 Ό) ·授拌中的MGDF(2奄升，2.5牽克 /毫升）/100 ιΜ磷酸納，pH.5/20 Nat”H3溶液中 加入5-倍莫耳超量的一甲氧基—聚乙醇醛（MePEG )(平 一 8 5 一 本姝法尺度適用中3 1家標辛（CNS ) A4規格（2!0 ,< 29?公釐) (請备背面之審1111直頁 丨裝 訂 線 496870 Λ7 B7 五、發明説明（33) 均分子量20 kDa)並於相同溫度下攉績授拌反應混合物。 於反窓過程中的蛋白質改質程度係甩SEC HPLC監潮者， 其中使甩 S u p e r d e X 2 0 Ο H R 1 0 / 3 0 管柱（P h a「a a c i a Biotech) 磷駿納媛衡液PH 6.9，〇·7毫升/ 分流速進行洗提。 於16小時後，SEC HPLC分析顯示有起始量90Χ Κ上的蛋 白質被改質。此時，用無菌水稀釋反應混合物使反應混合 物中的蛋白質濃度減低到1毫克/毫升並將反應混合物的 pH值調整到4 (〇·5 Μ乙驗.<)。 兩 SP Sepharose HP (Pharadcia Biotech)離子交換樹 脂以離子交換層析術從剌餘的lePEG和其他反應副產物中 分難出MePEG-MGDF接合物。 將反應混合物拖加到管柱上（2.5毫克/毫升樹脂）並 甩3届管柱體積的起始媛衝疲A (20 mM磷酸納，pH 7.2， 15S甘油）洗提出未反應的MePEG 。之後，用20倨管柱體 積，0X至25S的终端媛衝液B (1 M NaCl /煖衝液A)線形 梯度洗提出MePEG-MGDF接合物。於280 ns監測洗提液。將 含有多- MePEG-MGDF接合物的洗提液合併，瀠縮及無菌遇 滹。 用4-20X預澆鑲梯度凝膠（H0VEX)以十二烷基硫酸納聚 丙烯醱胺凝泳法澍定一-MePEG-MGDF接合物/之均一性 。顯示出一倨對麽於46.9 kDa蛋白質位置的主要帶。 用串接在一起的 TSK-GEL G40 00SWXL 和 G1000SVXL 膠 «· 一 86 - 度適用中H國家標莩（CNS ) A4規格（2I0 X 297公釐）
(許先意事項III、寫太I •一· 經涛部中夫揉绛局— V\消贫合作社印袁 496870 • Λ7 B7 五、發明说明（84) 管柱對经纯化的多-HePEG-MGDF接合物進行SEC HPLC分析 。K230 n* UV吸光度偵檢蛋白質。用BI0-RAD鏐濾標準 品作為球形蛋白質分子量標詰物。 從圈17C可W看出，SEC HPLC掲S出該製備物中有一巷 主要成份，其洗提位置對應於181.1 kDa球形蛋白質。亦 參看表Θ 〇 Μ類似方式，用MV = 6-25，kDa的MePEG醛進行MGDF的适 原性烷基化而製備得一 -MePEG-MGDF接合物PgG 14，PEG, 15和PEG 17。表7摘列出這：備所用主要反麽#数。 表9 出這些接合物的SEC HP‘LC分析结果：。 (請先闈讀背备之注意事^寫本頁) 装 1Τ 經濟部中夬標注局—工消贫合作社印製 -87 - 本纸ft尺度適用中 g 1 $:¾ ( CNS ) Λ4^"( 210^ 297^^7 496870 Λ7 B7 五、發明説明（8: 表 7 MGDF改質反應參數摘要 m m 反襄性 MePEG_反K铉伴_ 類別 MW HGDF pH溫度，時間，莫耳比 cone·. 小時 MePEG/ 經濟部中夬標，毕局員工消費合作社印裂
太纸ft尺度適用中g國家標注（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閣讀背&之注意事項寫本頁 丨裝
•1T 線 496870 Λ7 B7 五、發明説明（86 表 8 SEC HPLC鑑定多-MePEG-MGDF特性摘要 编碼 反懕性 MePEG 表觀MW by 成份量，
PEG 9 NHS 6kDa 87 . 9 75
PEG 10 NHS 6kDa 69.2 14(shoulder) (請先¥贫2^7之;±意事項！||||:寫大二貝 •裝
PEG 11 NHS 20kDa 一 370. 68
PEG 12 NHS 50kDa 865.6 53 訂 PEG 18 醛 6 k D a 84 . 6 60 PEG 19 醛 12kDa 218 59 線 PEG 20 醛 20kDa 359 52 Μ濟部中夬糅注局員二消費合作社印製 PEG 21 醛 25k Da 450 . 5 54 89 本纸乐尺度適用中SS家標洋（CNS ) Α4規格（2ί0·Χ 297公釐） 496870 Λ： Β7 五、發明説明（87) 表 -Me PEG-MG DF接合物的表観分子量 编碼 反悤性 HePEG 表観MV by SEC, kDa 表觀MV by SDS PAGR.kDa 頷Sil MV PRG 14 —Μ 6 kDa 44 . S 27.7 PRG 15 g? 1 2 k D a r - 104.7 PRG 1 6 s? 2 0 k D a *m . i :46-9 FKG 17 s? 2 5 k D a 22R . 4. 5 5.5 …
I 背 云 之 ).士 意 事 項 1 M濟部中央標孪局員二消費合作杜印¾ 12.4 祖甲氣某聚（7,二_)莳將HfiDFiS ff袢悖甚化而製 Μ 二 MaPF(W1 ? kDa )-MGDF捽会物 下逑程序導致本文稱之為PEG 22的純化分子。 將5 -倍過童的甲氧基聚乙二醇醛（MePEG ;亦即， OHC-(CH2)2〇-(CH2-CH20)n-CH3 ;式中 n =重複數使其分子 量約為 12 kDa) (Shearwater Polyaers )加到保持在 5 1C下的2.5毫克/奄升MG DF溶液（大腸桿菌衍生物， 1-163) /100 乙酸納* pH 5.0之中。於混合10分鐘後 ，加入足量的氰硼氫化納（Aid「ich )使其在反'應混合物 内達到20bM濃度。 將該混合物置於約5 C下擯拌16小時。於七符間结束時 ，加入足量的纯化水，USP ，使MGDF瀠度成為1毫克/奄 90 本纸ft尺度適用tn国家標洋（CNS M4規格（) 496870 B7 五、發明説明（33 ) (請先巧讀背云之注意事續一儀寫本頁 升。將其濾遇0.2微米真空漶器。Μ這種方式製得90奄克 的反患產物。於該反應產物混合物中加入少量的1.0 Μ -驗 價磷駿鹽和1Η氫氧化钠等溶液使其達到10 磷酸鹽， pH δ . δ溶获。 將該接合物在陽離子交換管柱上纯化。製備具有7.5公 分床高的40毫升SP-Sepharose高性能管柱。甩平衡媛衝液 (10 bM磷酸鹽，pH 6.9、含15S甘油）平衡該管柱。Μ 0.15菅柱體積（CV) /分鐘的速率裝填管柱到2.2毫克/ 毫升樹脂。接著甩平衡媛衝·洗到基線。兩1 〇倨管柱體積 的狻衝液A (20 {酸鹽，pH 7.2，含15Χ :甘油）'到媛衝 液B (媛衝疲A加0.3MNa C ΰ線形梯度洗提該管柱。流 速都保持在前後皆為0.15 CV /分。於280 ηι監滴洗提液 訂 0 以SDS-PAGE凝穋分析洗提份，將含DiPEG接合物的洗提 份合併再《過0.2微米單元。 實施例13 聚乙二醇化MGDF分孑的牛物沃袢 線 A· PEG-9- PEG-12和 PEG-14- PEG-21 澜量甩重组人類MGDF處理遇的小鼠之血小板計數，其结 果列於圈U中。將上團說明所示滾度的未聚乙二醇化CH0 一衍生22-353 (空心菱形），未聚乙二醇化的大腠桿Μ 22-U4 (空心圓）和——.聚乙二酵化的大腸桿菌22 - 1 84 ( 赏心圍）等经皮下注射到正常Balb/c小鼠内，、每天一.次， 注射5天。本實驗所甩的聚乙二酵化“1)17為卩£(] (亦即 __ 一 91 - 申 gg 家標莩（CNS) Ad 規格（210乂 297公变） 496870
AT B7___ 五、發明说明（8> ) ,20kd的——聚乙二醇化MGDF 22-184 (團1)，係產生 自大膳桿菌者）。於最後一次注射的24小時後，從尾部靜 赈的小锂切口採集試驗血液。用Sysiex電子血球分析儀（ Baxter Diagnostics, Inc. Irvine, CA )進行血球分析 。數據係表成4隻動物的測定平均值+/-平均值的標準傾 差。其他血球#數，例如，總白血球計數或紅血球計數等 不受這種處理所影W。 · 其他形式的重组人類MGDF亦如上述進行檢驗.。下面的表 f 10列出甩50.微克/公斤/天或丄0微克/公斤/天的所示形 式之7 -HuMGDF處理遇的小鼠之1小板計數。数據4隻動 物的平均值*其標準誤差以斜#表示。 表 10 (請先鬮.贫212:之洼意事項1^寫本\貝) -裝· som / ^ lr / ^ 1 0 ®京/公Ff /夭 形式 ' 沍治(f (H=w ^ ^ pry 5 ^3 rn CHO 22-353 4343 309 . 257 1 so £. coii 22-18^ 2021 ! 29 143 9 13 PEG 9 2728 55 23 5 9 34 PEG 10 2431 291 155 5 12 S PEG 11 377S 59 13 51 73 PEG 12 3385 15 S 1740 S3' F£G 14 2567 SO 2020 63 PEG 15 4 402 57 2334 cc PEG 16 4511 239 2215 2 2 PEG 17 4140 183 3113 u* 、2 S1 PEG 18 4 58 〇 59 2S31 129 PEG 19 2 930 • 330 413 9 80 PEG 20 2 94 2 235 305 4 339 PEG 21 4195 ! 145 40G2 97 「S線 529 25 ~~ 9 2 一 0疼尺度相 + 2! S CNS ) Λ4^ ( ΖΙΟχίΤτΛν^ ) —線 496870 經濟部t夹梂绛局— v\消貧合作社印袁 _ B7五、發明説明（9Q ) 恙1 0詳蜢 於下面所列中，被聚乙二醇化的MGDF分子為大腸桿菌衍 生的MGDF-11 (從信號肽開始纈碼時的胺基酸22-134，或 為從成热蛋白質開始编號的胺基酸卜163)，如前面寘施 例12中所逑者。 名稱 聚 乙二醇化 P E.G平均 分孑S 合成甩的反懕 PFG分孑 PEG 9 多 _聚乙二醇化 1 -6* kj) a MePEG的 HHS酯 PEG 10 多 聚乙二醇化 6 kDa^ MePEb 的 NHSgg PEG 11 多 聚乙二醇化 2 0U)a MePEG 的 HHSSi PEG 12 多 聚乙二酵化 50kDa MePEG的 HHS酯 PEG 14 — -聚乙二酵化 6 kDa MePEG醛 PEG 15 — -聚乙二醇化 12kDa MePEG醛 PEG 16 一 -聚乙二醇化 20kDa HePEG醛 PEG 17 一 -聚乙二醇化 25kDa MePEG醛 PEG 18 多 -聚乙二醇化 6 kDa MePEG醛 PEG 19 多 -聚乙二醇化 1 2 k D a MePEG醛 PEG 20 多 -聚乙二醇化 20kDa MePEG醛 PEG 21 多 -聚乙二醇化 25kDa MePEG醛 «胃計數為沒有施用任何物質的正常動物所得值。 一 93- ( CNS ) A4規格（210X29H$ ) (诗先父Μ至t5vi?lT,\e寫本\貝 •裝 、-夕 線 496870
AT B7 五、發明説明（9 1 ) 顯然地，重姐人類MGDF的聚乙二醇化對於該分子增加接 受動物的血小板計数之能力沒有不良影響•且事S上可能 使大腸桿菌產物22-134的活性增高到與CH0-衍生22-353分 子的活性同大或較大。 、 B · PRG-22 圓24列出PEG-22所得结果。值得注意者，PEG-22所得血 小板計數的正常化對全長度_CH0衍生MGDF，PEG-16或 PEG-17等都較早數天即發生。 實^倒14 重组人額「1 -1 Ml #-士隄揑苠中：的羌孭' 要在大膜桿菌内表現7 -HuiLGDF時，要將編碼成热蛋白 質前163假肢基酸的序列用最佳的大腸桿菌密碼子予以化 學合成。此外，在基因的5’端加入编碼胺基酸一甲碕肢酸 和S胺基一的DNA序列。如此，該序列所镅碼的7 -HuMGDF蛋白質長度為從Met-Lys開始的165饀肢基酸。 經濟部中夬標注局員二消f合作枉印¾ (诗先閎讀背云之洼意事項一τρϋ寫本頁) (卜163)基因的合成分幾俚步K完成。第一 ’用最佳的大腸桿菌密碼子化學合成表出基因接合片段的 互箱寡核苦酸（長度60-70 bp)。於該合成期間，在成热 基因的5’端加上甲硫胺酸和難胺酸兩胺基駿的密碼子而在 基因的3’端放置一停止密碼子。比外，分別在基因的極 5 ·和3’端加上供限制酵素Xbai和HindIII用的切蹰部位， 且在起始甲疏胺酸上游連當距離處加上一合成核糖g结合 部位。第二，將各基因片段的互補寡核苷酸i予祕冷卻配對 。第三’用聚合酶鍵型反應擴大這些届別合成基因片段。 一 9 4 — 本纸乐尺度逯/?! tgg家標辛（CNS) A4規格（210χ 297公沒了 496870 B7 五、發明説明（92 ) 第四，然後將经擴大的片段分殖到速當載體内。第五，確 定分殖片段的序列。第六，將倨別片段連接在一起並再分 殖到遘當載ϋ内*重新構成全長度7-HuHGDF (1-163)基 因。最後，確認重構成·基因的序列。 在5’和3’兩端分別倒接Xba I和Hind III限制部位的合 成7 -HuMGDF基因片段含有核糖體结合部位，ATG起始密 碼孑，鏞碼成熟Met Lys 7 rHuMGDF蛋白質的序列，及停 止密瑪子。 4 將上述片段選殖到乳糖誘^胜表現載B PAMG11的Xba I 和Hind III兩部位。該pAMGll戟If為具有pRi〇0-衍'生複製 源的低複本數質體。表現質體+AMG 11可以從質賴. PCFM1656 (ATCC U 69576， 1994年 2 月 24日登錄）经由 PCR重®寡突變形成製造一系列部位導向驗基變化而衍生 成。從緊接到質體複製啟動區PcopB的5’之Bglll部位（ 質體bp tt 180)開始且向質體複製基因進展*其驗對變動 如下： (讀先之洼意事項$寫大二貝 經濟部中夬標準局員工消費合作社印¾ 一 95 一 本紙^尺度適用中3!1家標毕（（：>；5)六4規格（2丨0乂 297公釐·) 496870 經濟部中夬標孪局ί工消f合作社印¾
AT B7 五、發明説明（93 )
Cr-MGl 1 bo ^ _ PCFH1.656 中的 bp _ 改雯成PAHG11中的bp 204 T/A C/G X 423 A/T G/C τ 509 G/C A/T i 617 -- 嵌入兩屆G/C bp # o7S G/C T/A i 980 T/A C/G i 994 G/C Λ/Τ ΐ 1004 A/T , C/G t 1007 C/G Τ/Λ i 1023 A/T « T/A X 1047 - C/G 一. T/A ί 1173 G/C ^ T/A Ψ 1466 G/C _ T/A X 2028 G/C b?剧除 X 2137 C/G T/A X 2480 A/T T/A i 24S9-2502 AGTG ere·:· TCAC CAGT 2β42 TCCGAGC bp副除 > r*· ^ ^ z0"* ^ i 參 3435 G/C A/T 孝 3446 G/C : A/T i 3543 Λ/Τ T/A 4489-4512 一 一- 嵌入 .'-bps G.^CTCACTAGTGTC：GACCTGCr.G CTCGAGTGATCACAGCTGGACGTC (SZQ ：ID NOS : 30 和31) 一 9 6 一 (請先8讀背*之;^意事項^|^寫本頁 裝 ―丨_^ --5 本紙杀尺度適用中g國家標孪（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 70 8 6 經濟部中夬標率局員工消費合作社印製 AT B7五、發明説明（94) 且將獨特的Aatll和CUI兩限制部位之間的DNA序列用下 示寡核苷酸予K取代： A三：工1 (H353) 5 r CTCATAATTTTT^JULAAATTC.VTTTGAOJLVrGCTAAAATTCTT — 3 f TGCAGAGTATT^^ATTTTTT^.GTAiJ^CTGTTTACGATTTTA.\G^-- -GATTA.VTATTCTC^TTGTGAGCGCTCACAATTTAT 3 f -CTAATTAT>^AGTT^CACTCGCGAGTGTTA-^TAGC 5 f ( Clal (^4435) ‘ (SZQ :D NOS: 32 和 33) . ··… 選‘殖到pAMGII内的7-HuMGILE之表現係由具有下示序列 的合成乳糖誘専性啟動區，如，Ps4 ，所驅動者： 5, gacgtctcat^ttttt^^ttcatttgac^^ -ATTCTTGATTAATATTCTCAATTGTGAGCGCTCACAATTTATCGAT 3 f · (SEQ ID NG: 34 ) 該Ps4啟動區會被大陽桿菌Ucl基因的產物，乳糖陞遏物 (LacI)所阻遏。 接著將PAHG1卜7-HuMGDF質g轉形到含有等位基 因的大腸桿菌K-12品系中。lac〆.等位基因為lacl放動區 内的一突變，其可增加La cl的表現，且等致Ps4啟動區的 蛋白質表琨之更嚴緊控制。所以•在該品系> /於沒.有乳 糖之情況中* 7 -HuMGDF的表現會被LacI所阻遏。於添加 (诗先3讀背云之·ί思事項f貝 裝 丁 ·\-ά 一 97 一 本纸伕尺度適用中§3家標这（〇^)六4規格（2丨0;< 297公釐） —11 >.— - - - - —— — - -- . - . - - - ---496870 Μ濟部中央標.达局員工消費合作杜印¾ B7 五、發明説明（95 ) 乳糖後，LacI蛋白質對Ps4啟劻區上的搡縱基因（ ope「ato「）部位之结合會減低，因而起始從Ps4的7 -HiiMGDF之轉錄。本實腌例所甩大腸桿菌宿主钿胞係在 1994年11月30日登錄為ATCC It 69717者。 用PAMG1卜7 -HuMGDF質體轉形該大腸桿菌宿主ATCC林 69717並根據下列醱酵說明予以生長。將大腸桿菌品系接 種到Lu「ia肉湯中，然後在.3 0Ό下培育約12小時。接著將 該钿胞無菌地轉移到装著批料焙養基（20克/.升酵母萃取
I 物；3,4克/升檸樣；15克·/jKsHPCU; 15奄升Dov P 20 00 ; 5 克 / 升葡萄糖；1 克</ 升 MgS(U.:7H2〇;'5.5 奄 升/升微量金饜· 5.5奄升的維生素）的醱酵器内。 該程序的批次相堪績到培養物在600 Π1的光密度為5.0 土 1.0為止。然後用第一進料培養基（700克/升葡萄糖； 6·75克/升MgS04.7H20)起始而開姶進料一批次相。於每 一確定時程中每隔2小時調整進料速率。當培養物在600 na的光密度到達20_25時，即開始第二進料培養基（129 克/升胰蛋白酶脾；258克/升酵母萃取物）的起始。將 第二進料培養基保持在固定流速，而第一進料培養基則要 SB»調整。於婺届醱酵過程中的溫度都保持在約30Ό下。 該培養物於裔要時•添加酸或驗以維持在約pH 7。S由謂 整S酵器内的攪動及空氣繪入速$和氧氣输入速率以維持 所需的溶氧水平。當焙養物在600 na的光密度到達57-63 時，起始第三進枓培養基的添加。以固定流1速將第三進科 培養基（ 3 00克/升乳糖）導到醱酵器内；中斷第一進料 一 9 8 — 本紙ft尺度適用國家標辛（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (讀先每寫本育) 丨裝 丁 496870 A7 B7 五、發明説明（9° ) 培養基的添加並將第二進料培養基的滾速改成新的固定速 率。於第三進料焙養基起始添加後，持鑕醱酵10小時。於醱 酵结束時，將焙養物冷卻到15 士 5 r。離心收取妞胞。將 所得ffl胞糊包裝後，貯存在< -60 t：。 依上文所述在大腸桿菌中生產的重姐MGDF，其純化係依 下文所述進行。將1300克的妞胞糊懸浮在約13升的10 ·Μ EDTA中，並K15,000 psi通高壓勻化器。將破裂的妞胞 »浮液離心並將沉著丸再懸浮於10升的10 iM.EDTA中。_ 心該S浮液並將2 00克的沉·著_九溶解在2升的10 Tris，3 Μ 胍氫氯化物，10 bMITT ，5 aM:EDTA ，pH 8.7之中。將該溶液慢慢地稀.繹_到200升的10 nM CAPS * 3 Μ豚，30S甘油，3 ιΜ胱胺，1 光胱胺酸，pH 10·5 之中。 在室溫下，將稀釋溶液慢慢攒拌16小時後，將pH值調整 到6.8 。將已調整pH的溶液澄清化後，加到已用磷 醭钠，1·5 Μ豚，1.5S甘油，pH 6.8平衡過的2升CM Sepharose管柱上。於加完後，用10 aM S{酸納’ 15S甘 袖，pH 7.2洗該管柱。然後，用0至0·5 Μ氣化納梯度， 1〇 磷酸钠，pH 7.2洗提MGDF。 將CM洗提液滾缩後，用10,000分子量截止率的潯膜與 1〇 ιΜ磷酸钠，PH 6.5進行媛衝？^交換。對所得濃度約2 杗克/奄升的濃縮溶液用姐鏃蛋白酶C在周溫下运理9〇分 _ ( 500比1莫耳比）。 .
然後將該溶液加到已甩10 sM磷酸納，15X甘油* pH 99 中a國家標辛（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請frvi讀背今5VJ意事項^貝 -裝. 丁 •-夕 線 496870 Λ7 B7 五、發明説明p ) (讀背云之ί事項寫本¥; 7.2平衡遇的1.2升SP高性能Sepha「use管柱上。加完後 ，甩0.1至0,25 Μ氯化納梯度，10 ·Μ磷酸钠，pH 7.2洗 提出MGDF 。 於SP高性能管柱的洗提液中加入疏酸銨至0.6 Η 。將洗 提液加到已用10 8iM磷酸納*0·6 Μ硫酸銨，pH 7.2平衡 過的1.6升Phenyl Toyopearl管柱上。用0.6至0 Μ硫駿 按梯度，10 βΜ磷酸納，pH，7.2洗提出MGDF尖峰。 將該Phenyl To yopearl洗提液湄缩並甩10,000分子董襌
I 止薄膜進行緩衝液交換至10· dlH T「is，5X山梨糖醇，pH 7 · 5之中。 < : 實陁i 1 5 ^ -HuHGDF 隄揑MI-16 3 ) 的活鸦囟Φ物桦皙 線 :¾濟部中夫標绛局負二消費合作社印袈 用依上面實施例14所述製得的7-HuMGDF (大腸桿菌 1-163 )進行老鼠體内的生物效能評估。於五倨連續天内 以逐增劑量的7-HuMGDF皮下注射到正常的雄Balb/c小鼠 惶内。所用劑量範圍為15微克/公斤/天到1500微克/公 斤/天。於最後注射後24小時•用電子血球計數器（ Sysaex, Baxter)測量血球計數。结果観察到隨著妞胞活 素滾度對數地遞增，其血小板計數有線型增加。在該系铳 中，血小板計數在1 500微克/公斤/天時增加到基線值的 300X。其他血球參數，例如白血ii或紅血球等的計数，或 血球容積等都不受此處理所影《。 從皮下注射300微克/公斤/天7 -HuMGD>、（大腸桿菌 1-163 )六天的老鼠收取血小板並評估其對應於ADP的凝 一 100 — 大.紙法尺度適用宁囯国家標李（〔>^)人4規格（2丨0/ 297公釐) 496870 經濟部中央標孪局員工消费合作.社印裝 ____B7_ 五、發明説明（S3 ) 集能力。其数據顯示取自被處理動物的血小板與取自對照 動物的血小板實際上是不能區別者，其中兩姐群對於血小 板激動劑，ADP ，都有同等的敏感性。 比外·也評估7 -HuMGDF濟除與化學治療及/或辐射相 Μ的血小板減少症之能力。於這些研究中使用會引起人類 明顯血小板減少症的化學治療劑* ca「boplaUn 。於研究 開始時，用1.25毫克carbopjatin皮下注射Balb/c小鼠。 於2 4小時後，在研究的《餘天數，每天用100.微克/公斤 /天7 -HuMGDF (大腸桿菌·\-J63 )，或賦形劑，注射小 鼠。到-9夭時，賦形劑處理的7J、鼠之血小計數降到正 常值的約15S ，但用7 -HuMGHE處理的小鼠，則仍保留在 基線水平（圖20)。對於照射研究，對小鼠施Μ 500雷得 7 -辐射（鍩源）之單一劑量。其為次致死劑量，可在第 11天時，導致90J!血小板計數減低程度。到第21天為止， 血小板計数仍未回復到正常值。在第1天到第20天中，每 天給被照射小鼠給甩7 -HuMGDF (大腸桿菌1-163)(100 緻克/公斤/天）時，血小板計數降低情況比用賦形劑處 理的小鼠較不嚴重且更快速回復到基線水平（圖21)。為 了在極端且長期血小板減少模式中試驗7-HiiMGDF ，乃组 合施兩Ca「boplatin和辐射（圖22)。在這種情況中，血 小板計数降低到極低水平，（正^值的3-5X)，且大部份 的動物（7/δ )在此處理中都不能存活。不過，當研究期 間•每天以皮下注射100微克/公斤/天的、-Hu M GDF窠 理這些動物時，血小板減少症有明頭地消除，更快速地回 一 1 0 1 — 本纸乐尺度適用中国S家標莩（CNS ) Α4規格（2丨ΟΧ 297公釐） (請先父讀背云之注意事項 寫本頁) -裝 旅 496870 Λ* B7 五、發明説明（9 ) 復到基線計數，且所有经7 -HuMGDF-庳理的動物（δ/8)都 存活。 -裝 另外，也在恆河猴内評估7 -HuMGDF 。於10天（第0 天至第9天）期間，對正常恆河猴施以皮下注射2.5或 25徴克/公斤/天。於較低劑量姐中，血小板計數在第 12天增加400X，而在較高劑量组中，其亦在第12天增加 700X。於停止注射後’在第，2 5-30天，血小板計數回復到 正常值。白血球計數和紅血球計數都不受此运理所影響。
I 線 其外，也在嚴重血小板減·少尤的5長類模型中試驗7 -HuMGDF (大腸桿菌1-163)(圖13)。動物接受照射（ 700雷得，鈷源）後，在第天導致血小板計數減低到正 常值的1-2S。到第35-40天時，血小板計數回復到正常值 。相反地，每天用7 -HuMGDF (25微克/公斤/天）庑理 的经照射勡物，其血小板計數只降低到正常值的1 0 X且平 均不低於20,000/微升一血小板減少症病人進行血小板注 蝓的制動點。於经7 -HuMGDF -庑理動物中，也更快速回 復到基線計數值；在第20天即發生。 經濟部中夬樣莩局員二消f合作社印製 齧齒類和《長類兩種研究所得這些活體内數據可完全地 支持下逑概念，亦即7-HuMGDF (大腸桿菌卜163)為一種 強力治療劑，具有明顯地影《臨床相Μ性血小板減少症之 能力。 ’ 赏施例1 6 CHO 昀怯恙莶牛7 -HuMGDF 1-3 3 2 法 用可表現編碼HGDF卜3 3 2的cDHA之经轉染田鼠蒴巢妞胞 -102- 本纸乐尺度適用中g國家標洋（CXS ) A4規格（210X297公釐） 496870 Λ7 B7 五、發明説明（1QQ ) 在適當放動區並聪结到编磚可擴大選擇標誌，DHFR*的基 因等之下產生糖基化7-HuMGDF卜332 。可供CHO细胞内 表現出MGDF的遘當放動區為SRa。#看Mol. Cell. .裝 ,νί
Biol· 8:466-472 (1988)和 VO 91/13160 (1991)。可供 CH0鈕胞内表現出MGDF的適當載體為pDSRa2 ‘。參看VO 90/1 436 3 ( 1 9 90 )。代表性CH0细胞系可在標準妞胞培養 基内產生分泌出的MGDF，其產量可為10-20毫克/升，不 過可增加到25至之100毫克/升。要用典型迎胞系來產生 MGDF時，可將培養液擴大/其方式為將其以黏附生長方式 通入具淪下列组成的培養基之ST浮液或组雜搶養容器内： 等比例的Dulbecco氐改質EagU氐培養基（DMEM)和 Haa’s F12 (DMEM/F12, Gibco)，加上 5 到 10X 胎牛血清 (FBS)或经透析胎牛血清和aethotrexate (MTX)(必要時 :MTX的典型濃度為200-600 nM) Μ維持選擇壓力。該培 養基必須補充額外的非必需胺基酸（HEAA’s)和毅胺醯胺 。懸浮培養物可以容易地從接種（分配）密度1-4 X 105 ffl胞/¾升繁殖到最大密度〜1 X 1〇β细胞/毫升，於該 點將焙養液经由稀釋到較大體積，使起始妞胞湄度為所指 定的分配密度而擴大培養。 經濟部中央標孪局員二消費合作社印製 要在滾餌中產生MGDF時，必須用磁攪拌旋轉容器放置到 溫控環境（37 土 1Ό)，或有儀i設備，经控制的攪拌槽 生物反懕器系铳中以產生速當的懸浮液體積和钿胞密度。 滾動瓶（例如，850立方公分Falcon滾動）Si必須>乂每瓶 1·5至3 X 1〇7细胞的起始密度接種並補充添加生長培養 一 103 — 本祆法又度通用中US家標洋（CNS ) A4堤格（210X 297公釐） 496870 M濟部中夬標·τί局員二消費合作il印製 Λ7 _____B7_五、發明説明（1Q1 ) 基（DMEM/F12 ，加 5-10X FBS ，1 X N E A A和 1 X L-穀胺 醯胺），其量要適合於在3-4天内產生匯集單層（ 150-300毫升/艇）。該生長培養基必須周碳酸氢納遘當 地緩衝到pH 6.7至7.2 K與60 -90 naiHg分壓的二氧化碳平 衡。艇子必須通入103； C02 /空氣並置於滾動架（〜1 「Pi)上*於37 土 1 1C下焙養3-4天。於匯集後，須將滾 動瓶經由傾注或抽吸生長培.養基而轉換成無血清的生產培 養基；用等滲媛衝疲，例如Du lb ecco、磷酸鹽媛衝鹽水.（ D-PBS)，洗摇該瓶，50-1001^升/瓶；然後加人遇當體積 _ * 的碳酸氫鹽谖衝，無血清DMEM/F1 2 ( 1:1 ) (:200 -300奄升 /联），其中補充著NEAA’s和^6-穀胺藤胺及硫酸飼以減少 共價聚集（1-20 αΜ)。瓶子必須通入105! C02 /空氣並 在滾動架（〜1 rp* )上，37土 1 Ό下培甭6 土 1天，或直 到代謝活性驅使葡萄糖水平到低於0.5克/升及/或pH水 平低於6·6為止。從瓶内倒出或抽出K收集謂理培養基並 補充如上所逑的新鲜無血清生產焙養基以供其他的收集之 用。這種程序可進行到該细胞不再持續無血清生產及滾動 瓶泥S為止。 收集到的調理培養基可烴由通過0.45微米及/或0.2微 米濟器（Sartorius Sartobran pH or Poll)進行間端微 «純化處理。濾後的調理焙養基須冷卻到4 tT，然後， 暫時貯存在4 t：，或立即用交叉流動超漶系铳（如， Filtron ΥΗ_5〇 )予以濃縮和透析到低離子為摩。超.滅和 透漶必須在4· t：下進行以減少蛋白質降解。詷理焙養基必 (請先/2意W·項^一^芎大二貝 裝 丁 -" 線 -104- 本紙法尺度適用中HU家標辛（CNS ) Μ規格（210X 29 7公釐） 496870 Λ7 B7 五、發明説明（102) 須用緩衝水溶获（如，10 璘酸鉀，pH S.8)透析後才 進行層析術纯化步猱。 (請先¥攻背5之;*±一意事頊^||寫大，頁 調理培養基中的產物品質可甩非适原性SDS-PAGE西方點 染法予K監剷；該法可頭菸出樣品中的含聚集，單體，和 蛋白分解降解HGDF的相對量。 另一種甩CH0细胞產生MGDF的方法為將表現MGDF的细胞 糸調適到無血潦培養基；如_G ibco S-SFM II之中。可K S 由系列地通到含有最低或無血清補充的培養基.内而調適卸 胞。若該细胞系可在這種培/養_基内持續生長同時產生充分 • 1Ί 量的分泌MGDF時，即可经由系列-地通入邋增:地較大培養體 積内擴大接種培養，然後接注二到適當生產容器内（儀控攪 拌榷生物反惠器）並在最佳生長條件（pH，養份，溫度， 氧氣，剪切速率）之下增生到其最大存活密度而進行生產 。於最佳生產點（烴由澍量產物量和品質而實驗地決定） *即從該生物反應器收集焙養物，並利用微米一尺寸深度 過漶或次微米交叉流動微濾而從調理培養基脫除掉妞胞。 若將甩深度過漶時，必須用次微米間端過漶將培養基進一 步澄清後，才依上文所逑予Μ濃縮和透析。 ▲ 山 f ， τ 經濟部中夬標技局員工消f合作社印¾ 雖然本發明巳在上文经《括地及以其較佳實施例而說明 過’不過，要了解者，諸於比技^者可從上述說明而加以 變異和修改。所κ，後附申請專利範圍意欲將所有這些變 異涵蓋在本發明所申請的專利範圍之内。^ 外’為了蘭明有13本發明的背景及於特別情況中，提 -105 - 本纸泫尺度適用中gil家禕辛（CNS ) A4規格（2!0X29H$ ) 496870 經濟部中夬標準局—工消費合作杜印製 五、發明説明（丨θ 适有ρ其搡作的其他韶節等所引述的文默和其他資料都供 於太文中κ為參考。 徼牛勃於台滢之寄存 m體pBCB (MGDF2)(於大暘稈菌Ab UC中）已於84年3月28 Θ寄存於食品工寨發展码究所（卩[R D Π，寄存.综號：C C R C 940086 ^ 誓聘pBCB (MfiDn ) (·於大場捍-萬Ab leC中）已於84年3月2S 日寄存於F i R D ί，寄存編號·· C C R C 9 4 0 0 8 7。 · « r 表現質體ΜΜΓ』Mel.Us MGDF(於大腸桿gFM15 φ )已於8 4年3月2 8日寄存於F i R D Γ，寄存编號·： ： C C R C 9 4 0 0 8 8 ° -一·一 大場揑Μ ·Κ 1 2 F Μ 1 5已於8 4年3月2 8日寄存於F I R D ί，寄存 滔號：C C R C 9 5 0 0 0 2。 中國貪鼠函巢韶孢秩p〇(H2 60nM已於84年3月28日寄存 於 F I R D I，寄存绽號：C C R C 9 6 0 0 2 5。 S 讀 背 云 之 .*主 意 言 ^7 尽 頁 本祆乐尺度適用中§S家標这（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 496870 經濟部夬標準局員二消費合作社印裂
A7 B7五、發明説明（1Q4) 序列表 (1) 一般資訊： (i )申請人·· AMGEH IHC. (η)發明名辑：剌激巨核鈕胞生長與分化之姐合物與方法 (iii) 序列數：34 (iv) 通訊地址： (A) 收信人：Angen Inc· . (B) 街名：1840 Dehavil land Drive r (C) 市名：Thousand Oaks - ·- (D) 州名：加利佛尼亞 \ (E) 國名：美國 一 (F) 郵遞區號：9132(Μ7δ9 (ν)計算機可讀形式 (Α)媒體類型：軟碟 (Β)計算機：IBM PC可相容 (C) 搡作系铳·· PC-D0S/MS-D0S (D) 軟體：Patentln Release JU.0, Version Ιί1·25 (vi)現有申請数據·· (A) 申請號： (B) 申請日期： (C) 分頚： ’ (vffi)代理人/事務所資訊： (A)名辑：Cook, Robert R· (C)參考/檔號·· A-290-C (請先閔讀背云之·注意事項寫本頁 -裝 線 一 107 — 本紙泫尺度適用_国§家標孪（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 496870 Λ7 B7五、發明説明（1 〇 5 ) 經濟部中夬標莩局負工消f合作杜印製 (2) SEQ ID Ν0··1 的資料： (i )序列特性： (A) 長度：31胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (C) 股型：單股 (D) 拓樸學：線型 ， (ii)分子類別：蛋白質 ( (xi)序列說明：SEQ ID Η0:1: · _ Ala Pro Pro Ala Xaa Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Het Leu Arg Asp 1 5 l〇l 15 Ser His Val Leu His Xaa Arg Leu Xaa Gin Xaa Pro Asp lie Tyr 20 25 30 (2) SEQ ID N0:2 的資料： (i )序列特性： (A) 長度：21胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (C) 股型··單股 (D) 拓撲學：線型 (ii)分子類別：蛋白質 / (xi)序列說明·· SEQ ID N0:2: -108- 本紙伕尺度適用中§1家標达（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (诗背云之注意事項寫本\貝 裝 496870 Λ7 B7 五、發明説明（106)
Ala Pro Pro Ala Xaa Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Met Leu Arg Asp 15 10 15
Ser His Val Leu His 20 (2) SEQ ID N0:3 的資料： (i) 序列特性： β (A) 長度：17胺基酸 (B) 類型：胺基駿 - (C) 股型：單股 、 (D) 拓撲學：線型 _ (ii) 分子類別：蛋白質 (xi)序列說明：SEQ ID N0:3:
Thr Gin Lys Glu Gin Thr Lys Ala Gin Asp Val Leu Gly Ala Val Ala 15 10 15
Leu (2) SEQ ID H0:4 的資料·· (i) 序列特性： (A) 長度：17醮對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓撲學：線型 ^ 〆 *
(ii) 分子類別：cDHA 一 109 — 本纸杀尺度適用中g國家標注（CNS ) A4規格（210X29?公釐） (讀先¥讀背云之2意事項一！|||5寫本頁 '裝 經濟部中夬標孪局員工消費合作社印製 496870 經濟部中夬標孪局員工消費合作杜印製 B7 五、發明説明（1Q?) (xi)序列說明：SEQ ID H0:4: GCNCCNCCHG CNTGYGA 17 (2) SEQ ID K0:5 的資料： (i )序列特性： (A) 長度：21驗對 (B) 類型：核酸 . (C) 股型：單股 (D) 拓撲學：線形 _ (ii)分子類別：cDNA ^ : (xi)序列說明·· SEQ ID H0:5: _ GCARTGYAAC ACRTGNGART C 21 (2) SEQ ID N0:6 的資料： (i )序列特性： ， (A) 長度：21胺基酸 (B) 類型：賅基酸 (C) 股型：單股 (D) 拓撲學：線形 (ii)分子類別：蛋白質 (xi)序列說明：SEQ ID H0:6: * ' Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp 15 10 15 Ser His Val Leu His " • 1 20 (請先父讀背面之泾意事項\雇、寫本¥; ·一. 裝 訂 線 一 110- 本纸乐尺度適用中IS家標注（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 496870 經濟部中央標·τΛ局負二消贫合作社印製 Λ7 B7五、發明説明（]Q8) (2) SEQ ID H0:7 的資料： (i )序列特性： (A) 長度：21鹼對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓撲學：線彤 (ii)分子類別：cDNA , (xi)序列說明：SEQ ID N0:7: i GTACGCGTTC TAGANNNNNN T •一21 (2) SEQ ID N0:8 的資枓： 一一 (i )序列特性： (A) 長度：21鹼對 (B) 類型：核駿 (C) 股型：單股 (D) 拓撲學：線形 (ii )分子類別·· cDHA (xi)序列說明：SEQ ID Ν0··8: AGTTTACTGA GGACTCGGAG G 21 (2) SEQ ID H0:9 的資料·· ， (i )序列特性： (A) 長度·· 30驗對 1 (B) 類型：核酸 辞土贫讀背云之項寫本頁) 裝 線 -111 一 本纸乐尺度適用中国3家標莩（〇^)八4说格（2丨0>： 297公釐） 496870 經濟部中央標孪局負工消費合作社印製 Λ7 B7五、發明説明) (C) 股型：單股 (D) 拓撲學：線形 (ϋ )分子類別：cDNA (xi)序列說玥：SEQ ID H0:9: TTCGGCCGGA TAGGCCTTTT TTTTTTTTTT 30 (2) SEQ ID N0:10 的資料·· , (i) 序列特性： (A) 長度：29驗對 - (B) 類型：核酸 _ < (C) 股型：單股 一 (D) 拓撲學：線彤 (ii) 分子類別：cDNA (xi)序列說明：SEQ ID N0:10: TTCGGCCGGA TAGGCCTTT TTTTTTTTT 29 (2) SEQ ID N0:11 的資料： (i)序列特性： (A) 長度：20驗對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 ’ (D) 拓撲學：線形 (ii )分子類別：cDHA ^ (xi)序列說明：SEQ ID H0:11: (訐先聞讀背5之·.;x意事項ml寫本一貝 •i· 裝
TJ -112- 本紙乐尺度適用中家標準（CNS ) A4規格（210X 297公浚） 496870 經濟部中夬標.洋局員工消費合作杜印¾ A7 B7五、發明説明（11Q) TGCGACCTCC GAGTCCTCAG 20 (2) SEQ ID H0:12 的資料： (i )序列特性： ' (A) 長度：23驗對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓撲學：線胗 (ii )分子類別：cDNA - ^ (xi)序列說明：SEQ ID Η0··12: 、 GAGTCCTCAG TAAACTGCTT CGT „ 23 (2) SEQ ID N0:13 的資料： (i)序列特性： (A) 長度：20鹼對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓撲學：線彤 (ii )分子類別：cDNA (xi)序列說明：SEQ ID H0:13: GGAGTCACGA AGCAGTTTAC ’ 20 (2) SEQ ID N0:14 的資料： v (i )序列特性： (實真MSB之，¾事Vf III寫本買 ---:裝 一 113 — • - -1 - Bin i Hi I ί 本纸乐尺度適用中S國家標李（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 496870
AT B7 五、發明説明（n〗） (A) 長度：18鹸對 (B) 類型：核馥 (C) 股型：單股
(D) 拓撲學：線彤 (ii)分子類別：cDHA (xi)序列說明：SEQ ID N0:14: CCTTTACTTC TAGGCCTG , 18 丨裝 (2) SEQ ID H0:15 的資料： · _ (i ) ·序列特性： ^ : (A) 長度：19鹼對 _ (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股
(D) 拓撲學：線形 (ii)分子類別：cDHA (xi)序列說明：SEQ ID N0:15: GAGGTCACAA GCAGGAGGA 19 (2) SEQ ID N0:16 的資料： (i)序列特性： -¾濟部t夬標·Λ局員工消f合作杜印¾ (A) 長度：19驗對 ’ (B) 類型：核羧 (C) 股型··單股 & (D) 拓揆學··線彤 -114- 本饫泫尺度適用中1国家標準（〇^)六4規格（210)< 297公釐） 496870 經濟部中央標莩局員工消費合作社印製 Λ7 B7五、發明説明（2 ) (ϋ )分子類別：cDHA (xi)序列說明：SEQ ID H0:16: GGCATAGTCC GGGACGTCG 19 (2) SEQ ID H0:17 的資料·· (i) 序列特性： (A) 長度：19鹼對 ’ (B) 類型：核酸 t (C) 股型··.單股 ·一 (D) 拓撲學：埭彤 ^ (ii) 分子類別：cDHA — (xi)序列說明：SEQ ID H0:17: TCCTCCTGCT TGTGACCTC 19 (2) SEQ ID N0:18 的資料： (i )序列特性： (A) 長度：19驗對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓撲學：線形 (ii)分子類別：cDHA (xi)序列說明：SEQ ID N0:18:. CCAGGAAGGA TTCAGGGGA 19^ (讀先之..s寫太一貝 -裝 ,ν·3 一 115 — 本纸乐尺度適用_11国家標李（〇^)六4規格（2丨0/ 297公釐） 496870
AT B7 五、發明説明（11:) (2) SEQ ID H0:19 的資料： (請先閨讀背V37之注意事項e、寫本頁 (i)序列特性： (A) 長度：30鹼對 (B) 類型：核駿 (C) 股型：單股 (D) 拓撲學：線彤 (ii )分子類別：cDHA , (xi)序列說明：SEQ ID H0:19: < CAACAAGTCG ACCGCCAGCC AGACACCCCG - _ 30 (2) SEQ ID H0:20 的資料： 一 (i )序列特性： (A) 長度·· 24«(對 (B) 類型：核駿 (C) 股型：單股
(D) 拓樸學：線形 (ii )分子類別：cDHA (xi)序列說明：SEQ ID H0:20: GGCCGGATAG GCCACTCHNH NHNT 24 經濟部中夬標洋局員工消费合作社印製 (2) SEQ ID H0:21 的資料： ’ (i )序列特性： (A) 長度·· 21驗對 ^ (B) 類型：核酸 -116- 本纸朵尺度適用中园国家標準（CNS ) Α4規袼（2丨0)< 297公釐） 496870 經濟部中夬標辛局負工消费合作社印製 * A7 B7 五、發明説明（1U) (C) 股型：單股 (D) 拓撲學：線彤 (ii )分子類別：cDNA (xi)序列說明：SEQ ID N0:21: GCARTGYAAN ACRTGHGART C 21 (2) SEQ ID H0:22 的資料： ， (i) 序列特性： t (A) 長度：16鹼對 -·- • .-- (B) 類型··核酸 π (C) 股型：單股 一 (D) 拓撲學：線形 (ii) 分子類別：cDNA (xi)序列說明·· SEQ ID Η0··22: TTGGTGTGCA CTTGTG 16 (2) SEQ ID H0:23 的資料： (i)序列持性： (A) 長度：20鹸對 (B) 類型··核酸 (c)股型：單股 / (D)拓撲學：線形 .(ϋ)分子類別：cDHA " (xi)序列說明：SEQ ID N0:23: (诗先閔讀背云之..二意事一本\貝 —裝 線 -117- 本纸ft尺度適用中I；国家禕注（CNS ) Μ規格（210X 297公釐） 496870 B7 五、發明説明（ 11.
CACAAGTGCA CACCAACCCC 20 (2) SEQ ID H0:24 的資料： (i)序列特性： (A) 長度·· 1342鹼對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓撲學：線形 (II )分子類別.：cDHA (ix)特點： (A)名稱/Μ鍵詞：CDS • (B)位置：99-1094 (xi)序列說明：SEQ ID N0:24: so (讀先>1讀背云之洼意事項！^寫本\貝 »i. 丨裝 -" 一 C二*"7^ i *7 二一一 一广一一、、β 一 广一，，产产一一、、^ ·% ^ ^ ^«产一 ^ ^ -i* 'W'---•二、- Ll'wmCd 一錢·，* 二“ r.O'w 'WWW Li'w -» Lw· · > ^ D —勹 1 ^ μ ^ W · «» W · * «-Μ 二 « «» W _ · 線 經濟部.0:夭標.洋局員二消費合作社印¾ 人 118· 本紙泫尺度適用中H国家標洋（CNS )以規格（210X 297公5 ) 496870 B7 11 五、發明説明（ vj*w -. -c- L;r·匕、-L^jr. L * ^ ·ό 二·一_--，· L c L ^ i 、,·· e ·、
Ala Cv3 A3p leu Ar^ Vai Le^ Ser Lys Leu Leu λζς A3p Ser Hi3 Vaj ^ ' 10 15 ' 20 匕二· ^wΓ二 二\^w Λ ΟΛ - Ο Λ^：\^ ^ΛΌ - ^J'w L w·' 1·，Λ·Γ U ^ w * - - Ο L w - ·_〜Λ Leu His Ser Arg Leu Ser Gin Cys Pro Giu val His Pro Lau Pro Thr 25 30 35 209 一广一产 ^一^·· 产广广 I"•广外··^ 广一 <· 产、^·^ 〜一一 '户一一 一严 广一、 ^*'' 一产一 '、、 \ /^ - vj - ^ L- - Ό ^ ^ ^Tw； b 丄 * _ r-*s^w 1 ^ ^;όλ ^;λλ ^ r^-r-r* .-ν^ ?ro Vai Leu leu Pro Ala Val A5p ?he Ser Leu Gly Giu Trp Ly3 Thr 40 4*5 50 257 L‘，Lj ·'· e <ολ^ λ-γ.<ο L:-r.Vw r·‘一 L. ι ό ^;^λ C^-λ L; ι ο 厶惠- Gin Mec Giu Glu T.^r Ly3 Ala Gin A2p lie Leu GIv Ala Val Thr Leu 55 " SO 55 305 • Ό 1 J 'ΟΛ^； \Z L'^3 Λ Ό ^JV-Λ ^w'^V； ^Γ^Λ ^ r：L. - 4 Ow Leu Leu Giu Glv Val Mec. rJ.a Ala Arc Glv Gin Leu GIv Pro Thr Cvs 70 75 ' ^ " 30 ^ 35
J3 J I fm» 雪— Hi 1 *V (ΐ;‘先之.¾¾•項寫太頁 C，z"'严’ e 广一广广一广广广、广 一〜 —广一 一、 广、广广一 ^ 广^，广，^ 广一产 一内 • ''«^ · ^»^ * · ‘ 'w ^ m « ^ >1^ « >w « Ά Nw ά A Leu Ser Ser leu Leu Gly Gir. Leu Ser Giy Gin Val Arg Leu Leu Leu SO - 95 100 401 G产一广Λ«^广，产 z··'^· 、产八广—^7 广、广β 广、产广一，广^ 一 ^>«々， 广广—β 、/—一 w A -* V'W ^ A ^•'w N^ « ^ 'w λ"\ Gly Ala Leu Glr. Ser Lau Leu Gly T^r Gin Lau ?ra Pro Gin Gly Arg ：〇5 no 112 443 -Φ 、广 ^ 、严， 广―《^广 X/·^ 、、广 一广户 β 、、，广 β 产 、一 ^ 一一 产一广 ^ ^ ^ ^ ^ 广，f * * · ‘ ^ "W «Γ\'s^ ***'<w Ά ^-* ^ - * '^# « ^ 'w ''w «Γ*k^ 'W ·*^^—· ^W Ti"iz Thz \Jlξ H:5 LiVs Λ5c PrG A^r· A^丄三 Z1 e ?r.0 ί-e’二 Se— *3】二卜:丄2 I2Q ' ' 125 130 C-^ C — C^：.-\ GoA r-AG G-G CG- --C C.〇 .---^ CTT GTA GGA GGG TCC ACC Leu Leu Arg Gly lys Val Ar^ ?r.e Le5·； Me二 Lev: vai G1 y G1 y Ser Tr.r 125 ^ * 140 :45 * * , C · W r·O^J ^ ^TO w Vw W.' k w ··九一二，一' v^w · C 4 L w W ·，·ΌΛ .Ί W -S'-i Cys v*a I ?.zz Arg Ala ? ro ?:::: T乂二 T.^r Ala Va i ? ro Ser Arg Thr > 5〇 7-5 * * -- •ww «»W«J -»WN^ ·—— 一一 广一負 % >/·、 f"* 一广 ·\'ρ 广 '产广，产 内·' 啤，一 ^ ^ Μ* ^ ««« ^ ^ -w - L · ·' U 二.一 •一 ·ί·' L c rur.L· ^γ-γ-ό L· -. w 、一' ，」-九广九· · 一 · c\j·， i « w Seir Leu Vi 1 二eu Thr Leu Λ5r； G:u Leu ?rc Λ5r* Ajtcr Ttr Ser GLv Lsu 170 ::3 — 130 線-- 經濟部中夬標.洋局員工消費合作杜印製 • -、·匕病·，。 ·ί·，. r·*· w · - 一 ••九· c^> · w:· L:、一 ···-:·' ·ί , ·Ί · 、:、;v- · w - 、ro、r v -- -eu Giu Tr.r Λ-Γ. ?hs T.u.r Ala Ser Λ1= Arr ::、: Th：: Gly Ser Gly leu ，二、 ，9〕 ，二3. ·*· ^ *" ^ ^ 内广 '产 广一' ^ /«* ^ /** ^ 广一一 、、X* ^ stm ^ j^» *»-· m>m ^-* mm ^ #w« ^ % 負 c ，一. 'w.-.L·，·'^ be·， •一一 ·όλ w ··—，·、：二· - l w · . c.sj 丄 、^參、:L, · w r-~.w 二e'二 1/5 Trp Glr. Glr. Gly ?^e λ二ς ΛΙ = Ι_·_··2 二le ? ro Gly Leu leu Λ^γ. 2GC * ：：5 2：0 .-^ ， ， > -"^ ^ ^-"^ ^ >· ^ —· ^ ^ «Μ 、 y·^ ^ ^ ^rn ^ ^ ^ /^ y ^ 啤 /—* ^ 負·^ 、 · — · · *W · •w · * <S* *w · ^ 'W ^ W 广m^\ — 一一 ·’· · ·—''W · SnJ ·——•*,'W ··* *-«·^ ·* — ·* QLr* Tr 3 5 r Arcr Ξ e， Leu Λ〇c G二' 二’二？ rz 31 v 一 v · e，，二 2 n \z^ 二 *15 勹，二 ，气〇 -i η c ---- c -l υ 上二二 人 119· 本纸ft尺度適用中HS家標注（CNS ) Α4規格（：：0/29了公釐） 496870
五 經濟部中夬標绛局員二消費合作社印裝 、發明説明 产，λ ^ w Ο ^-Τ· - w His Glu Leu 230 ；^7) 二 Θi c，二 ’ ·/ 〜，一i， 一、* 一 * · W · · SW ^mm ψ A · » 〜 · « 4 \^·^ a 'w » •w *w N*» · ·’· 。、 Glv Leu Pr.e ?r2 G1 v ? ro Ser ki * 240 * 、广 ^*· ^/*·^·* 广··广—' 广一—广一— ，一一 — 一广， 产—， 、一、 一产、 一 、—， 一μ一 •-*'^«? ·* '-'- k-Λ Lr^w 'w w〇 Ό.-.w .-·· · ^ . w«-. ν^\-；Λ r.'w.-V . ^.Λ G·，·。 .'Vw.，· sT〇-w Arg ::.: Leu Gly Ala ?rc .-^p lie Ser Ser Giy Tr.r Ser Λ〇ρ Thr G：y 250 ' 255 ^ 250 * T ^ β 广一严 广 β、 广一六 、、^ p 一产广 '，一 一六 一 一， 一、一 广^•一觸 θ/ι·· 广—、 ^ /*· ^ % 0^m 丄、^ w c w r-r〜l -、w 匕、· · i λ 二 -w - U w · ·、w 、一-· ·η^ w ' ‘ Ser Leu ?ro ?ro Λ2Γ. Leu Glr. ?ro Gly Tyr Ser ?ro Se;: ?ro Thr Hi2 265 270 ^ 275 丄 “· ‘Ί · ^.λο - ···. L. k Pro Pro Thr Gly Gl^ Tyr Thr Le-J 230 * ' -235 mm mm 产一， ^ ^ ^，一一 ，一一 S ^ 口一〇 1L 二 1«! 0 ·* q 3 Γ-S” :嫌二 290 二匕w vww- ^ L： ^ 'w L^.'^r ^ ^ L·'。 Lww C - *〇 C - T^r Pro Val Val Gin Leu Hi^ Pro L^u Leu 295 300 c【】5 A5o G A 3 Γ - O c r c n- 〜 e 一一 λ , ^ w - i 'w - Όν^ - — w ·' d '―q Se: p — ^ 381 329 1025 1 广^广 、/·*·/^ 广/*· 一 、一一 、产一广产一广一” r 一、 x，广 ·% 广' 一广户 ^ww w -r.'w^ V^,--,Ίw r-.'^'w ^ L· · -： Vw-一' :九·' 4 W、 Thr Pro Thr Pro Thr Ser Pro Leu Leu ώη T^r.Se: 210 315 ，、、'-一广 产、、 严产《<· 一， -γιλ^ 'w · Ό 丄 ^ Lr^:vj ^ - Gin A_sn Leu Ser Gl- GIu Glv 330 * 一一产，/·% 一 p p 一内 〜、· 二· Ο 丄 一 · 一 Ο · Ό 丄··\ · 一一，p 一ρ , • *W · 4Γ\\ιμ> · — · 'w 丄 1 二， ACC CAC ,:T ·二：：-{ ‘ 3 1073 (請先驾管甲ν/..ri事項、^11^寫本\貝 裝 ,220 一一严〆•产 ' 一，^ ^ 、广一 /*» 一^ Λ 广，' 負 /»，一一 心vΓ·，0 W W - sj 九•一一- ΌΌ.-·^·-«Γ.^Λ-- ^ > ^ ^ ^ ^ ^ y 、、、产一 一、 ，、广，产产^ ， uru-*.'sjVw w w - ^ λ ι ·^λλόn'w 二二：τ一—一-一，•二η 、/"* > /*·，— ^ ^ ^ 0m /-^ 、产、、/*% ^ p^m ^ <-^ <-«^ r^m ·—· 、严 ^ /—·、^ ^ ^ ^、 •Ί - c · ·，九·，•二- ·，‘，一'«τΊ 4 _ w •“•eri-'w%- ^ __- ^ :·:〜'〇··〜，-，··*，· /· Λ ^ 0fm ， O·^；丄 *w · ·' 丄 ._ · ^ · >^^·，· (2) SEQ ID H0:25 的資料： (i )序列特性： (A) 長度：332胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (D)拓揆學··線彤 (ii)分子類別：蛋白質 (xi)序列說明：SEQ ID H0:25: :er ? rc .-.la 1 Arg A^p 5er Hi3 ? rc Leu
r v ^ L 33，， • 一 p -n Q^u V£1 一 120- 本紙泫尺度適用_§國家標莩（CNS ) A4規格（210X297公釐）
1304 1342 -5 線 ο 7 8 B7 五、發明説明（ 11
Giy Glu Trp lys Thr Gin Me* G：u G：u Tr.r L%，2 Ala Gin .-.2^ '：：e Leu 50 55 ' 60 *
Gly Ala Vai Tr.r Let 70
Glu Gly Vai Mei Ala Ala Arg Gly Gin * 75 3 0
Leu Giy Pro Thr Cys Leu Ser Ser lau Leu Giy Gin Leu Ser G.y Gin 35 90 * 95 Vai Arg Leu leu Leu Gly Ala Leu Glz Ser Leu Leu Gly Thr Glr； Leu 100 - 105 110 ?r。？::〇 Glr· Gly Arg Thr Ala Ly3 Asp ?ro Λ3Π Ala He ?he 115 ^ 120 125 Leu Ser ?he Gin His Leu Leu Arg Giy Lys Vai Arg ?he Leu Me" Leu 130 - 135 - - 140 - * - ’ • · 1 Vai Gly Gly Ser Thr Leu Cy3 Vai JLrg 'Arg Ala Pro ?ro Thr Thr Ala 145 150 " . 155 !〇0 Vai ?二〇 Ser Arg Thr Ser Leu Vai Leu Thr Leu A3n GIu Leu Pro A3a 155 170 175 Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr >^.z ?hs Thr Ala Ser Ala Arg Thr 130 . 135 190
Chr Giy Ser Gly Leu Leu Lys Glz Gin Gly ?he Arg Ala Lys 11 200 205 ?r3 Giy Leu Leu Asr· Gin Thr Ser Arg Ser Leu p Gin lie ?ro Giy 210 215 220 ^
Tyr Leu Asn Arg lie His Gi« Leu Leu .-«sn Giv Thr Arg Giy Leu ?hs 225 230 225 _ 240 G ο Γ π- 3 r Οι e Ξ Λ CT二 π Γ 4 Λ 2 :r Leu Giv Ala Pro Asc lie Ser Ser Giv 250 · 255 * --裝--..--- --3 線—— 經濟部中夬標，洋局員二消費合作·社印製
Thr Ser Asp Gly Ser Leu ?ro ?二 Asr· Leu Gin ?ro Giy Tyr Ser 250 2£5 f 27b , Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Giy Gin 7yr ΤΠγ Leu ?he Pro Leu 275 230 * * 235 Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Vai Vai 31n leu His Pro ^Leu leu Pro 230 295 300 - 150 ς Λ - i 1 3 3--)D D - C Λ 3 7 pn ； λμ i - ， · "^ 一一一 · · «-· « W a * · «» «» M W « W · ••擊 諸一 《 » μ W W ·«* w ·«· «^ · * <^ · * ···«» 305 310 - 315 220 Ser Tyr Thr His Ser Gin Asn Lau Ser Gin Glu Gly 325 350 ^ -121- 本纸法尺度適用中§國家標孪（CNS ) A4規格（2丨0X29了公沒） 496870 AT B7 五、發明説明（119)(2) SEQ ID H0:26 的資料·· (i) 序列特性：(A) 長度：1342餘對 (B) 類型：核駿 (C) 股型：單股 (D) 拓撲學：線型 (ii) 分子類別：cDHA (ix)特點：(A) 名稱/翮鍵詞：CDS(B) 位置：99..621(χί)序列說明·· SEQ ID Η0:26: O.G3GAGCCA C-GCCAGCC.^ GACACCCCGG CCAG.-ATGGA GCT^CTG^\ TTGCTCC7CG -^ w 丄 t w 丄· LTwri-AvjrO'w 1 ΠΛ C^j'w Ό - C*wU Gv^ -L Gw· C W - Ser Pro Ala ?ro Pro . i 5 〔e 一 7 产 了 .--La Cvs w · · 'w-Vw Leu His 二:广 广外、 产一 /· 广兩产 、/M· 一 、、、 广一—产相一 •和 广、广#·ρ ρ /••广^ ^ 一一 、·^、** ** * ^ ^ A ·"*—A A 丄 丄 广·丄 A 'W p Leu Arg Val Leu Ser 二vs Leu Leu Arcr ^-so Ser His Vai I〇 15 ^ ' 20 AC-二 AGA CTG AGC CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT 7TG CCT ACA Se:: Arg Leu 5er Gin Cys ?二o Glu Val His Pro Leu Pro T'r.r 25 ^ 30 35 (請先¾¾背面之;i意事項一觸寫本頁 ------¾.
Pro Val .‘ w - Ό v-j.n.'w —- .-.'j^ . . u ϋΌΛ W;r-r. i '〇·〇 r· AC： SO 113 151 20 3 257 -eu Leu Pro Ala Val Asp ?he Ser Leu Gly GIu Trp.Lys Tr.r -〇 45 50 '
*-〈‘ I — 1— - I (HI 經濟部中夬標隼局員工消費合作社印製
^Λ\^7 Λ 丄 C U 二*^： r.'w ·^G1 Π M二-二 1 .， ，， 5 - *W —· « · ··— · Vm 办 <«4 · * · A c o. Λ-S G n Λιίc G Aao c 1/<·0 ga G 5 Λ V- λ V- 5 G 1 5 G G G u CL, T- s Λ Gc
t -e CLc r c .r: Λ1 · G I f -a G V CTG CTG GAG GGA GIG 、一产 Λ丄、J GCA GCA CGG G〇A CAA CTG GGA ccc1 ACT pm, ^ A d 253 Leu 70 Leu Giu Gly Vai M0- 7 5 ΛΙξ Ala Arc Gly Gin 30 Leu Gly ? ro —“ C:/s : 35 C7C 一 /"·、 _ ν^Λ rcc ，一， CTG G.:。 CAG CTT 7C~* GGA CAG GTC CGT CTC CTC CTT 401 Leu 5er Ser Leu Leu Giy Gin Leu Ser Giy C-In Val A:g Leu leu Leu 90 95 100 一 122— 本.¾¾尺度適用中SS家標洋（CNS ) A4規格（210X 297公釐） ο 87 V ί AT B7 五、發明説明（12Q) GG-3 CCC CTG CAG AGC CTC CTT GGA ACC CAG CTT CCT CCA CAG GGC AGG Gly Ala Leu Gin Ser Leu Leu Glv Thr Gin Leu Pro Pro Gin Giy Arg 105 110 … 449 、广一 ，广、 广—一广'P ，％产一，一 广广^ 、，一 广一一 ，一产 ，一广广%广一 7 一广广、1 广Z广 * <T^>w «Γ\ Jm V·^ 'w ·»^ ·一一"\ i 、JT\^、^ ·· <· ’^ λ » 'w « 為·、^ 'w * 辑 Thr Tr.r Ala His Lys Asp ?ro Asn Ala lie ?he Leu Ser Pr.e Glr. His 120 * ' 125 130 497 i 〇 匕-w U cλ ^v; r· r-r.\〇 i *〇 L Ό i - k U - ό λ i o L - - ϋ i -r. *^ολ * ^w w ·ί w Leu Leu Arc Gly Lys Val Arg ?he Leu Mec Leu Val Giy Gly Ser Thr 135 ^ - * 140 145 广一产 ”产•一•广一，· 一•广/*，β 广产，•广广户，'广产 、广气 广一!* 一广，^^广广θ 、广一^ ，广' % r^* ^ ''W A SmV^ ·* A~\ \w* Sm <w ^·'w i V^ W *"*· Ni^ .一· '-•^ ^ ^» *W Leu Cys Val Arg Arg Ala ?ro Pro Tr.r Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr 150 * 155 ( 150 155 广，' 广，广 广，/*· 、、广广、严广—广产广内，广一产产、7 一产 ▲ I ▲ -· Λ w i. V^ λ a Cj w^'O ^ ^ w 丄 <1 ^ · y Ό Λ _ Ό "' Ser Leu Val Leu Thr Leu Λ^α GIu Leu " 170 ·丄-λ。· - ^ ^τ·ζ^Λ Λ。- ·Ό 丄 OVTw C --乙-ϋΛ-r.lj i 〇·^τ^λ^ CAGGGATTCA GAGCC^.GAT TCCTC-GTC7G CTG^CC\AA CCTCCAGGTC CCTGGACCA-^丄 、-、γολ 丄 λ^^ όλλ^λΟ Urt 丄，*L·一k - - Ό---Λ 丄、j uri-，匕丄 k1、：丄 ‘ w ▲--匕匕‘ -二Lew 二 Λ<ον^^w·^ο ^r\\^j· - L-r*vjv^rur·匕λ 丄 l •urVw'c.-A^vrw 广广产 T 产内 一 5 /*·/··/<«>··，« r^> ^ 广_ 广产 _* 广户％、一、一 产麵^ 产产一—广产产— 广，，广，•一 ' —I 户，一 —^ 广—^，产—产·， *· w ^*** ·* »w* «w V« ^«ΓνΛν^ w a s^·""* W^'w's*# « ^ ·**· w «'wvww s.» w «**« ^ kw ^ ** ·**· ,w^«^ ·*-
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I I— I 1 -- i In HI 123. 本绒泫尺度適用申基S家標莩（CNS ) Α4規格（2丨0X297公;5 ) 496870 Λ7 Β7 五、發明説明（ 121\ (2) SEQ ID Η0:27 的資枓·· (i) 序列特性： (A) 長度：174胺基酸 (B) 類型：胺基駿 (D)拓撲學：線彤 (ii) 分子類別：蛋白質 (xi)序列說明：SEQ ID Η0··27:
Ser ?ro Ala ?-〇 r-ro Ala Cys Asp* Lej^. Vai Leu Ser Ivs Leu Leu A:? Asp :-:15 val Leu His Se: A:; leu Se: Glr‘ Cvs ?:3 Glu Val
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Pro Pro Gin Giy Arg Thr Thr 經濟部中夬糅注局員二消費合作社印装 115 Leu Ser ?he Gin Hi 130
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Vai Pro Ser Arg Thr Ser L beu Vai Leu Th: Leu Asn >1： 170 124- 本纸ft尺度適用tUS家標李（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 5870 B7 五、發明説明（ 122、 (2) SEQ ID Ν0··28 的資料：(i)序列特性： (A) 長度：1164驗對(B) 類型：核酸(C) 股型：單股(D) 拓撲學：線形 (II)分子類別：cDHA (ix)特黏： * (A)名稱/Μ鍵詞：CDS(B)位置·· 97··δ94 (xi)序列說明：SEQ ID H0:23: (請先父讀背学ϋ意事項一寫本買 裝------
、广 ***•内p、产一 ^ ^ ^ ^ ^ ^ > /—· > > 0m ^ "· ^ 0>^ ， w W'w^Λ'ον. Λ VwA^wlwww〇Vj^ww ，人ΤΛΛ ^ i UriL· -： \S ο 5 •\吞 f"* ^ >*** 0m^ ^ /0^ ^ ^ ^ -*· -¾ ^ ^ λ —^ >-% 0^· /-· ^ /-«* ^ «p% ** ^ - S-. w . .--r.'w . .-_-!.LjV^w - ΛΛ^Ό ·>- - vj i s_ .--•O'w L. WΌ Lr'w ^ U W - · Lrv--
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Cy3 Asp Ler>: Arg Vai Lau Ssr Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Vai Leu
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His Ser Arc Leu Ser Glr. Cys ?ro Glu Vai His ?ro Leu ?ro T?.r Pro 25 * 30 35 152 ¾濟部中夬標.洋局員工消费合作社印¾ W - 'w L G Lr W - - W ^ W ναΛ^ * ^ - -i. (0 ν^Γν-ίΛ wrv**\ · VJO Λ-Γ^Λ ·Ί、 Vai Leu Leu ?ro Ala Vai Asp ?he Ser · Leu Giv Glu Ίςό Lv3 Thr Glr· 40 45 , 50 ' λ 丄 Vi L;·一·ν^ι U·一·= ·Ίν^ λλ^ ν^ν^Λ L.r.Li ^γλ^ ，* 二二 L-丄 u ϋν^Λ \j x\s 匕丄 i C iCj Mec Giu Glu Thr Lys Ala Gin Asp lie Leu GIv Ala Vai Tr.r Leu Leu 55 50 65 70 L:r\^j Lru.-. 'c ιό λ^ο vjv-λ \^\^λ Lu^j ^λ:λ L-ΛΛ *Vw - ·L *^ Leu Glu Gly Vai Me* Ala Ala Arg Giv Gin Leu Gly Pro Thr Cys Leu ^ 75 · " 30 * 35 卞广' 中产r 广••产 一广 ^ 一广、广广一 ^ 广、/· 广一 p 广广” 广一广广一 /*·· 广一相广产 -Ίλ ^ 泰’一 ^ 為，〇 ^ w i Lt^ja ^Λνα x ^ x L* 丄◊ L· 丄 ^ *cko Ser Ser Leu Leu Gly Gin Leu Ser Gly Gin Vai Arg Leu Leu Leu Gly 90 * 95 * 5 2
Vf> ο 3 5 3 2 G 4 100 125* 本紙乐尺度適用令S S家標李（CNS ) A4規格（21〇 X WUx ) 496870 Λ7 B7 五、發明説明（123) GCC CTC A丄 2 LSl-
ACA GCT ^^ λ'-^γ^ L· ^ w L - - ^τ^λ .iL'w L.-v^ Lj.- L w.n. C-uLr •肩— Gin Ser Leu Leu Gly Thr Gin Leu Pro ?ra Glr. Giy Arg Thr 105 110 115 ΌΛ- ΛΛ- r^JV.:w Λ 1 W i - w --lsJ^w ^Γ-Λ L·-九 His Lys Asp ?rc Λ2Γ. Ala lie ?he L七u Ser ?he Glr. Hi3 leu " ' 12f 130 450 498 C*"C c^-Leu Arr GGA GIv
Lv3 GAC Λ3 0 AGO CAG Ser Glr. •:_AC Λ2Γ. L ‘一九 -O'sJ ：vr Tro * …- U 3 TTC ?he 140 CTC Leu TGG Τγί: TGG Trp AGC CAA 3er Gin 5e: -Go · «* TCT Ser GCT Ala 〜广·•一 广产、 广，/·· /—· ^ry ^ ^ ^ ^ ^ ·'二 L: 1 ν〇Λ^ L,--匕·，。 - L. - w lie Val Giy ·:』ρ Lys Leu Hi3 Cys leu 145 * 150 广 #· 一 ，广一 广、、 广两 ^»· 广 β、 广 ^-—· 、一一广、产 'ο-γ-λ ^；Nw.-v L;vj\j r*.-- AJLi Ser·· Gi.u V<2J. Aid A丄£L QXv lie Glr· 1£ 0 15 5 广，負 广一、’ 广一产 广、广·^ 产^一^ 一，^ 一啤 ，» 一 L …-· r“-二、《讀、· L U 丄一 k _ *、;、τ λ ^ 一，· Glu ?ro Λ5Τ. Leu Gin Vai ?ro Glv ?r:: 3 4〇 =；c^
(請先閎讀背云之注意事v^plk寫本I 裝 、、7 广广一广产一 、，、 广—一 广，， 广，严 广，” 、^·、 广一， '产—广》««一 广、、 •⑽•為 Ν·^ 一 '**·» ·""* ^ ·* * —""V。 >w «Γ\ 4b ·*Λ >W *"** ''W ·—-广·广， ^m0 ♦一 Vw A2n. ?rc :'二；lie ? ro Giu Gir. .-.3p T^.r T.^r Leu GIu 135 150 ^ 195 690 ·*ν------ ·、一 ‘Ί。 r.L/O Ό·-二、'— •一.L；V-J ，·Ό、* L^Vww όόλ .、^·，‘ .二二 3 ""ϋ"* •二*， <二_ 一擊，Τ^ ^ Γ 二η ” h_ Π1 -» 1 cn ^ ρ τ- Π:τ/ -;- 2CC ' 205 ' 210 * ^ **· ^ ^ ^ % ^ Ά % /—· ，ρ ， 广 ' /<""» ^ ^ mmm ^ ^ ^ ^ ^ /—· ·^ ' 0^ —^ ^ 产一 一 • · •"^^'•''W ·*Τ» ^ VW · w ^ . k >W ^ 'W ^»-* ^ W Γ 二I，二—一二 了，a 2,〜1Γ ί <： i”一 Γ 二··：一，二，二 ^ ^* '―广IT， D — -λ 二 二 • ••一 w 一 ，··= · · W · · · Μ» — · · · — · · ^ J ••義 Μ «· W 一 · · W · « -mmm ••‘ 一'«Μ «Μ · « ··— ,·。 ··— 一 2-5 220 J ：25 ::: '38 訂 • p 7 p β ，，广 〔一、 一产一 Se^r Ρίτ·二 w »·2 p^sη ^ 3 >^ —
.AC 广了、 T^f Vai Tyr 245 經濟部中夬標注局員二消费合作社印^ — * 'Hrf · · <w *w ·""· 'Ί···· \w> · — 'SiJVw >w •••'«w 一 W 一 * W « SmV,w J» m -m "w 'w w >-* ?—C 二二—二二_ 一、_ 。；宄 Γ 二I， i I λ ·-·;= 3-， ·二-·5 G:V i ! 3 3，，二—C ·* ^ — W 'W «· w « ···· · · ^rn O ^ w · · ^mm «_* ‘ · —w W ， •一 >«· · ^ >w Ά ▼ · · 一 · · «· · · W · · W 250 ?5f 2S0 ^ «-^ P 一 *»m 一一一 一 e 产一《« 一^^ «>« ^ ^ /"* f"* ^ ^ f"* ^ Λ 一、’一一 ’ 广广二 '二•一一 /«· ^·广％ 一一 · d- -分W . 'w Λ-w w w - _ ___k W-一一Jw 4 一，.Wwww - Λ。 k· •Vw'w w ^ - 3 _3 ·:·丄i Se:
C7.----^CACAr CCTACACCC.'. CTCCCAG.-^T CTGTCTC.-.GG .---.GGGT.-^GG TTCTCAGACA • t CTGCCGAC.-.T CAGCATTGTC TCGTGTACAG CTCCCTtCCC TGCAGGGCGC-CCCTGOG.-.GA Ci-\C7C-3ACA AGATTTCCTA CTTTC7CCTG .-----.CCC.--^-.G CCCTGGT.^--. AGGGATACAC AC-3ACTC-.---^ AGGG.^-.TCAT TTTTCACTGT Λε,λΓΤλΓ.-^. CCTTCAG.^.G CTA 10 51 1) 人 0 126· 本纸乐尺度適用申g g家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 496870 AT B7 五、發明説明（l24 ) (2) SEQ ID Ν0··29 的資料·· (i) 序列特性： (A) 長度：265胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (D)拓撲學：線彤 (ii) 分子類別：蛋白質 (xi)序列說明：SEQ ID Ν0··29:
Ser ?二〇 ?二3 Pro Ala Cys Aso Leu Val Leu Ser Lvs Leu leu - 5 1Ό.. . ·， 15 ' ASP Ser His Val Leu His Ser Arc Leu Ser Gin Cys Pro Giu Val 20 25 — 30 His Pro leu Pro T：ir Pro Val Leu Lau Pro Ala, Val As? ?he Ser Leu 25 40 4*5
Giy Giu ：rp Lys Thr Gin Met Giu Giu Thr L 50
Giy Ala Val Tr.r Leu Lau Leu Giu Giy Va] 70 ' vs Ala Gin Asp lie Leu '50 * iez Ala Ala Arg Glv Gin 75 * 33
Leu Giy ?二o Thr Cys Leu Ser Ser Lei： Leu Giy Gin Leu Ser Gly Gin 35 SO 95 Vii :'二;Leu Leu Leu Giy Ala Leu Gin Ser Leu 二eu Giy Th:: Glr: Lau 100 105 110 Pro ?::〇 Glr. Giy λζς Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asr. Ala lie ?r.e 經濟部中夬標準局員工消費合作社印¾ 1.- 120 125 Leu Ser ?’γ·3 Gin His Leu Leu Arq- Glv Lvs Aso ?he Tro lie Val' Giy 130 125 140 Asp Lys Leu His Cys Leu Ser Gin Tyr ? 150 yr Trp Leu Trp Ala Ser Giu - 150
Val Ala Ala Giy lie Gin Ser Glr* .-.sp Ser Zrp Ser .-.la G] 1S5 170 :〇 Asn (5 127- 本泜乐尺度通用中§11家標卒（CNS )·Α4規格（210X 297公釐） 496870
M濟部中夹樣·^局員二d./rl費合作社印X 五、發明説明（〗2:
Leu Gin Vai ?ra Giv Pro Asn Pro Arc lie Pro G：u Gin 7hr Arr 1HG 1S5 190 一 GIu Tn: 5er Trc Thr 195 * 200
Trp Thr leu Gin As3 205 ' ?:〇 A:g Ser ?:〇 Gly Hi2 ?he Leu A:?lie A:: :”:i2 :eu ?:3 210 215 220 Ala Thr Gin Pro Pro Ala Trp lie Phe Ser ?he Pro Pro Ser Ser 225 230 235 240 Tyr Trp Thr Vai Tyr Ala Leu Pro Ser Ser Thr Leu Ala Pro 245 250 255
Cy3 Giy Pro Ala * 250 3ra Ala Ser 255 (2) SEQ ID H0:30·的資料： (i)序列特性： (A) 長度：24驗對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓撲學：線形 (ii )分子類別：cDNA (xi)序列說明：SEQ ID Ν0··30: GAGCTCACTA GTGTCGACCT GCAG (2) SEQ ID N0:31 的資料： (i )序列特性： (A) 長度：24錶對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 24 裝 訂 128· 本紙&尺度適用中國國家標注（CNS ) 規格（210 X 297公釐） 496870 Λ7 B7 五、發明説明（12S ) (D)拓撲學：線型 (ii)分子類別：cDNA (xi)序列說明：SEQ ID H0:31: CTGCAGGTCG ACACTAGTGA GCTC 24 (2) SEQ ID N0:32 的資料： (i)序列特性： ， (A) 長度：SO驗對 (B) 類型：核酸 / _ (C) 股型：單股 ^ (D) 拓撲學：線形 _
(ϋ )分子類別：cDHA (xi)序列說明：SEQ ID N0:32: CTCATAATTT TTAAAAAATT CATTTGACAA ATGCTAAAAT TCTTGATTAA TATTCTCAAT 60 TGTGAGCGCT CACAATTTAT 80 (2) SEQ ID H0:33 的資料·· (i)序列特性： (A) 長度·· 86驗對 (B) 類型：核酸 經濟部中夬標绛局貝二消費合作社印^ (c)股型：單股 / ’ (D)拓撲學：線形 (ii )分子類別：cDHA u (xi)序列說明·· SEQ ID Η0··33: 一 129 一 本紙乐又度適用中国！1家標注（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） 496870
AT B7 五、發明説明（127 ) CGATAAATTG TGAGCGCTCA CAATTGAGAA TATTAATCAA GAATTTTAGC ATTTGTCAAA 60 TGAATTTTTT AAAAATTATG AGACGT 86 (2) SEQ ID N0:34 的資料： (i) 序列特性： (A) 長度：89驗對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓揆學：線形 * . (ii) 分子類別·· cDHA u (xi)序列說明：SEQ ID N0:34: .-1 GACGTCTCAT AATTTTTAAA AAATTCATTT GACAAATGCT AAAATTCTTG ATTAATATTC 60 TCAATTGTGA GCGCTCACAA TTTATCGAT 89 (請先聞讀背云之·>!意事項一 寫本頁) 装 線 經濟部中夬標隹.局員工消費合作社印製 130- 本纸法又度逯用中s國家標注（CNS ) A<4規格（210X 297公釐）

Claims (2)

  1. 49687( 第085116057號專利申請案 中文申請專利範圍修正本（91年6月) 8 8 8 8 ABCD P A 告本 ........... 年λ日f正 91 6. 0痛充 人類巨核細胞生長及發育因子（MGDF)多肽，其可 特定地促進人類巨核細胞生長和發育，其具有下示胺 基酸序列之胺基酸2幺195(MGDF-2) CAGGGAGCCACGCCAGCCAAS^eACGCeSQCCAGAATGGAGCTGACTGAATTGCTCCTC / MatGluLeuThrCluLeuLeuLeu 59 60 GTGGTCATGCTTCTCCTAACTGCAAGGCTAACGCTGTCCAGCCCGGCTCCTCCTGCTTGT 119 9 ValValMetLeuLeuLeuThrAlaArgLeuThrLeuSerSerProAlaProProAlaCys 28 120 GACCTCCGAGTCCTCAGTAAACTGCTTCGTGACTCCCATGTCCTTCACAGCAGACTGAGC 179 29 AspLeuArgValLeuSerLysLeuLeuArgAspSerHisValLeuHisSerArgLeuSer 48 180 CAGTGCCCAGAGGTTCACCCTTTGCCTACACCTGTCCTGCTGCCTGCTGTGGACTTTAGC 239 49 GlnCysProGluValHisProLeuProThrProValLeuLeuProAlaValAspPheSer 68 240 TTGGGAGAATGGAAAACCCAGATGGAGGAGACCAAGGCACAGGACATTCTGGGAGCAGTG 299 69 LeuGlyGluTrpLysThrGlnMetGluGluThrLysAlaGlnAspIleLeuGlyAlaVal 88 % .. . 300 ACCCTTCTGCTGGAGQGAGTGATGGCAGCACGGGGACAACTGGGACCCACTTGCCTCTCA 359 89 ThrLeuLeuLeuGluGlyValMetAlaAlaArgGlyGlnLeuGlyProThrCysLeuSer 108 • i 360 TCCCTCCTGGGGCAGCTTTCTGGACAGGTCCGTCTCCTCCTTGGGGCCCTGCAGAGCCTC 419 丨 109 SerLeuLeuGlyGlnLeuSerGlyGlnValArgLeuLeuDeuGlyAlaLeuGlnSerLeu 128 420 CTTGGAACCCAGCTTCCTCCACAGGGCAGGACCACAGCTCACAAGGATCCCAATGCCATC 479 129 LeuGlyThrGlnLeuProProGlnGlyArgThrThrAlaHisLysAspProAsnAlalle 148 480 TTCCTGAGCTTCCAACACCTGCTCCGAGGAAAGGTGCGTTTCCTGATGCTTGTAGGAGGG 539 149, PheLeuSerPheGlnHisLeuLeuArgGlyLysValArgPheLeuMetLeuValGlyGly 168 540 TCC ACCCTCTGCGTC AGGCGGGCCCC ACCCACCAC AGCTGTCCCC AGCAG AACCTCTCTA 599 169 SerThrLeuCysValArgArgAlaProProThrThrAlaValProSerArgThrSerLeu 188 600 GTCCTCACACTGAACGAGCTCCCAAACAGGACTTCTGGATTGTTGGAGACAAACTTCACT 659 189 ValLeuThrLeuAsnGluLeuProAsnArgThrSerGlyLeuLeuGluThrAsnPheThr 208 660 GCCTCAGCCAGAACTACTGGCTCTGGSCTTCTGAAGTGGCAGCAGGGATTCAGAGCCAAG 719 209 AlaSerAlaArgTkrThrGlySerGiyI^_eiiiiysT]rpGlnGlnGlyPheArgAlaLys 228 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐）
    496870 A BCD 六、申請專利範圍 720 ATTCCTGGTCTGCTGAACCAAAGG^CCAGSTCCCTGGACCAAATCCCCGGATACCTGAAC 779 229 11 ePr oGlyLeuLeuAsaG InThrSerAr gSer LeuAspG lnl lePr oG lyTyrLeuAsn 248 780 AGGATACACGAACTCTTGAATGGAACTCGTGGACTCTTTCCTGGACCCTCACGCAGGACC 839 249 ArglleHisGluLeuLeuAsnGlyThrArgGlyLeuPheProGlyProSerArgArgThr 268 840 CTAGGAGCCCCGGACATTTCCTCAGGAACATCAGACACAGGCTCCCTGCCACCCAACCTC 899: 269 LeuGlyAlaProAspIleSerSerGlyThrSerAspThrGlySerLeuProProAsnLeu 288 900 CAGCCTGGATATTCTCCTTCCCCAACCCATCCTCCTACTGGACAGTATACGCTCTTCCCT 959 289 GlnProGlyTyrSerProSerProThrHisProProThrGlyGlnTyrThrLeuPhePro 308 0-9 6 ο 9 3 CTTCCACCCACCTTGCCCACCCCTGTGGTCCAGCTCCACCCCCTGCTTCCTGACCCTTCT 1019 LeuProProThrLeuProThrProValValGlnLeuHisPfoLeuLeuProAspProSer 328 ♦ c . j -. . 、 10 2.0 GCTCCAACGCCCACCCCTACCAGCCCTCTTCTAAACACATCCTACACCCACTCCCAGAAT 1079 329 AlaProThrProThrProThrSerProLeuLeuAsnThrSerTyrThrHisSerGlnAsn 348 9 9 9 9 3 3 9 5 1 15 12 3 1 3 1X 1 1X 1080 CTGTCTCAGGAAGGGTAAGGTTCTCAGACACTGCCGACATCAGCATTGTCTCGTGTACAG 349 LeuSerGlnGluGlyEnd 1140 CTCCCTTCCCTGCAGGGCGCCCCTGGGAGACAACTGGACAAGATTTCCTACTTTCTCCTG 1200 AAACCCAAAGCCCTGGTAAAAGGGATACACAGGACTGAAAAGGGAATCATTTTTCACTGT 1260 ACATTATAAACCTTCAGAAGCTATTTTTTTAAGCTATCAGCAATACTCATCAGAGCAGCT 1320 AGCTCTTTGGTCTATTTTCTGCA 1342 〇 2. —種人類巨核細胞生長及發育因子（MGDF)多肽，其可 特定地促進人類巨核細胞生長和發育，其中該多肽具 有選自下列成員之胺基酸序列：如申請專利範圍第1項 1 之胺基酸序列之胺基酸22-191(MGDF-6)，22-198(MGDF-7) 及22-265(MGDF-8)。 3. —種人類巨核細胞生長及發育因子（MGDF)多肽，其可 特定地促進人類巨核細胞生長及發育，其中該多肽具 有選自下列成員所組成之群之胺基酸序列：如申請專 利範圍第1項之胺基酸序列之胺基酸27-353(MGDF-12)， -2- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 496870 A8 B8 C8 ____D8 六、申請專利範圍 27-195(MGDF-13)，27-172(MGDF-14)及27-184(MGDF-15)。 4· 一種人類巨核細胞生長及發育因子（MGdf)多肽，其可 特定地促進人類巨核細胞生長及發育，其中該多肽具 有選自下列胺基酸序列之胺基酸22-179(MGDF-9)或22-190(MGDF-10)， 1 AGGGAGCCACGCCAGCCAGfteMG€E(3GCCAGMTGGAGCTGACTGAATTGCTCCTCGTG “· · MetGluLeuThrGluLeuLeuLeuVal 61 GTCATGCTTCTCCTAACTGCAAGGCTAACGCTGTCCAGCCCGGCTCCTCCTGCTTGTGAC 10 ValMetLeuLeuLeuThrAlaArgLeuThrLeuSerSerProAlaProProAlaCysAsp 121 CTCCGAGTCCTCAGTAMCTGCTTCGTGACTCCCATGTCCTTCACAGCAGACTGAGCCAG 30 LeuArgValLeuSerLysLeuLeuArgAspSerHisValLeuHisSerArgLeuSerGln 181 TGCCCAGAGGTTCACCCTTTGCCTACACCTGTCCTGCTGCCTGCTGTGGACTTTAGCTTG 50 CysProGluValHisProLeuProThrProValLeuLeuProAlaValAspPheSerLeu 241 GGAGAATGGAAAACCCAGATGGAGGAGACCAAGGCACAGGACATTCTGGGAGCAGTGACC 70 GlyGluTrpLysThrGlnlfetGluGi_teI#s在 laGlnAspIleLeuGlyAlaValThr 301 CTTCTGGTGGAGGGAGTGATGGGAGCAGGGSimGMCTGGGACCCACTTGCCTCTCATCC 361 CTCCTGGGGCAGCTTTCTGGACAGGTCCGTCTCCTCCTTGGGGCCCTGCAGAGCCTCCTT 110 LeuLeuGlyGlnLeuSerGlyGlnValArgLeuLeuLeuGlyAlaLeuGlnSerLeuLeu
  2. 421, GGAACCCAGCTTCCTCCACAGGGCAGGACCACAGCTCACAAGGATCCCAATGCCATCTTC 130 GlyThrGlnLeuProProGlnGlyArgThrThrAlaHisLysAspProAsnAlallePhe 481 CTGAGCTTCCAACACCTGCTCCGAGGAAAGGACTTCTGGATTGTTGGAGACAAACTTCAC 150 LeuSerPheGlnHisLeuLeuArgGlyLysAspPheTrpIleValGlyAspLysLeuHis 541 TGCCTCAGCCAGAACTACTGGCTCTGGGCTTCTGAAGTGGCAGCAGGGATTCAGAGCCAA 170 CysLeuSerGlnAsnTyrTrpLeuTrpAlaSerGluValAlaAlaGlylleGlnSerGln 601 GATTCCTGGTCTGCTGAACCAAACGTCCAGGTCCCTGGACCAAATCCCCGGATACCTGAA 190 AspSerTrpSerAlaGluPr oAsiiLenGln¥alPr oGlyPr oAsnPr oArgl 1 ePr oGlu -3- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 60 9 .120 29 180 49 240 69 300 89 360 109 420 129 480 149 540 169 600 189 660 209 49687( A B c D 六、申請專利範圍 661 CAGGATACACGMCTCTTGMTGGMCTGGTC^AC^CTTTCCTGGACCCTCACGCAGGAC 720 210 GlnAspThrArgThrLeuGluTrpAsnSerTrpThrLeuSerTrpThrLeuThrGlnAsp 229 721 CCTAGGAGCCCCGGACATTTCCTCAGGAACATCAGACACAGGCTCCCTGCCACCCAACCT 780 230 ProArgSerProGlyHisPheLeuArgAsnlleArgHisArgLeuProAlaThrGlnPro 249 781 CCAGCCTGGATATTCTCCTTCCCCAACCCATCCTCCTACTGGACAGTATACGCTCTTCCC 840 250 ProAlaTrpIlePheSerPheProAsnProSerSerTyrTrpThrValTyrAlaLeuPro 269 841 TCTTCCACCCACCTTGCCCACCCCTGTGGTCCAGCTCCACCCCCTGCTTCCTGACCCTTC 900 270 SerSerThrHisLeuAlaHisProCysGlyProAlaProProProAlaSerEnd 289 ； 901 TGCTCCAACGCCCACCCC?TACCAGCCCTCTTCTAAACACATCCTACACCCACTCCCAGAA 960 961 TCTGTCTCAGGAAGGGTAAGGTTCTCAGACACTGCCGACATCAGCATTGTCTCGTGTACA 1020 1021 GCTCCCTTCCGTGGAGGGCGCCCCTGGGAGAGAACTGGACAAGATTTCCTACTTTCTCCT 1080 1081 GAAACCCAAAGCCCTGGTAAAAGGGATAGACAGGACTGAAAAGGGAATCATTTTTCACTG 1140 1141 TACATTATAAACCTTCAGAAGCTA 1164__________ _______________________—_________________________ — 5. 根據申請專利範圍第1至4項中任一項之多肽，其中該 多肽更在其N·端含有Met-Lys序列。 6. —種多肽，其係得自包含以下之方法··將編碼根據申 請專利範圍第1至4項中任一項之多肽之DNA引入表現 載體；在選自CHO細胞或大腸桿菌之宿主細胞中表現 所得表現載體之DNA ;並獲得多肽。 7. 根據申請專利範圍第6項之多肽，其中表現載體係選自 , pAMG llR-Hu Met Lys MGDF(CCRC 940088)、 pBCB(MGDFl)(CCRC 940087)或 pBCB(MGDF2)(CCRC 940086)，宿主細胞則選自 P〇〇12 60nM(CCRC 960025)或 K12 FM15(CCRC 950002)。 8. —種經分離的聚核苷酸，其編碼如申請專利範圍第1至 10項中任一項的人類MGDF多肽。 -4- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 496870 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 9. 根據申請專利範圍第8項之經分離多核苷酸，其為DNA 序列。 10. 根據申請專利範圍第9項之經分離多核苷酸，其為 cDNA序列。 11. 根據申請專利範圍第10項之經分離多核苷酸，其具有 顯示於如申請專利範圍第1或4項所定義之胺基酸序列 之序列。 _ 12. —種DNA載體，其係為pAMG 11載體，其包含如申請專 利範圍第9項所定義之DNA序列—，該DNA序列係操作地 聯結到Ps4啟動子及/或lac 1啟動子。 13. —種DNA載體，其係為pDSR α載體，其包含如申請專 利範圍第9項所定義之DNA序列，該DNA序列係操作地 聯結到SR α啟動子。 14. 一種宿主細胞，其係為大腸样菌，其穩定地被pAMG 11 載體轉形或轉染，該載體包含如申請專利範圍第9項所 定義之DNA序列，該DNA序列係操作地聯結到Ps4啟動 子及/或lac 1啟動子。 15. —種宿主細胞，其係為CHO細胞，其穩定地被pDSRa載 體轉形或轉染，該載體包含如申請專利範圍第9項所定 義之DNA序列，該DNA序列係操作地聯結到SR α啟動 子。 16. 根據申請專利範圍第14或15項之宿主細胞，其可表現 -5- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 496870 A8 B8 C8 D8 申請專利範圍 為該DNA序列編碼之MGDF多肽。 17. —種製備人類MGDF多肽之方法，其包括使根據申請專 利範圍第14或15項之宿主細胞於適當營養培養基中生 長並從該細胞或該營養培養基分離出該MGDF多肽。 18. 根據申請專利範圍第17項之製備人類MGDF多肽之方 法，其中該宿主細胞為大腸样菌（L coli)細胞。 19. 根據申請專利範圍第17項之製備人類MGDF多肽之方 法，其中該宿主細胞為CHO細胞。 20. —種多株抗體’其對根據申請專利範圍第1-4項中任一 項之人類MGDF多肽具有反應性。 21. —種治療具有血小板減少病況的病人之醫藥組合物， 其包含有效量的根據申請專利範圍第1-4項中任一項之 人類MGDF多肽，以及醫藥可接受之稀釋劑，佐劑，或 載劑。 22. 根據申請專利範圍第21項之醫藥組合物，其中該病況 係選自再生不能性貧血症，自發性血小板減少症，及 ? 藥物或輕射治療所導致的血小板減少症。 23. —種增加有需求病人體内成熟巨核細胞數目之醫藥組 合物，其包含有效量的根據申請專利範圍第1-4項中任 一項之人類MGDF多肽，以及醫藥可接受之稀釋劑，佐 劑，或載劑。 24. —種增加有需求病人體内血小板數目之醫藥组合物， 6 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 裝 玎 496870 8 8 8 8 A B c D 七、申請專利範圍 其包含有效量的根據申請專利範圍第1-4項中任一項之 人類MGDF多肽，以及醫藥可接受之稀釋劑，佐劑，或 載劑。 25. 根據申請專利範圍第21項之醫藥組合物，其為水溶液 形式。 26. 根據申請專利範圍第21項之醫藥組合物，其為經冷;東 乾燥形式。 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）
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