ES2312348T3 - Control inmunologico de niveles de beta-amiloide in vivo. - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo biespecífico, caracterizado por la capacidad para cruzar la barrera hematoencefálica, que tiene una primera especificidad para el receptor de transferrina y que tiene una segunda especificidad para un estado de transición adoptado por Beta-amiloide durante hidrólisis, y une preferencialmente un análogo de estado de transición que imita el estado de transición adoptado por Beta-amiloide durante hidrólisis como un enlace amida predeterminado, y que cataliza la hidrólisis de Beta-amiloide en el enlace amida predeterminado.

Description

Control inmunológico de niveles de \beta-amiloide in vivo.

Antecedentes de la invención

La enfermedad de Alzheimer es una forma progresiva y en última instancia fatal de demencia que afecta a una parte sustancial de la población de mayores. El diagnóstico definitivo en la autopsia depende de la presencia de lesiones neuropatológicas cerebrales marcadas por una alta densidad de placas seniles. Estos depósitos extracelulares se encuentran en el neo-córtex, el hipocampo y la amígdala así como en las paredes de los vasos sanguíneos meningíticos y cerebrales. El principal componente de estas placas es un péptido \beta-amiloide de 39 a 43 residuos. Cada placa contiene aproximadamente 20 fmoles (80 picogramos) de este péptido de 4 kDa (Selkoe y col., J. of Neuchemistry 46: 1820 (1986)). La apolipoproteína E y las marañas neurofibrilares formadas por la proteína tau asociada a microtúbulos están también a menudo asociadas con la enfermedad de Alzheimer.

El \beta-amiloide se escinde proteolíticamente a partir de una proteína de membrana integral llamada la proteína precursora de \beta-amiloide. El gen que codifica para esta proteína en seres humanos se encuentra en el cromosoma 21 (St. George-Hyslop y col., Science 235: 885 (1987), Kang y col., Nature 325: 733 (1987)). Numerosas células y tejidos cultivados (por ejemplo cerebro, corazón, bazo, riñón y músculo) expresan esta proteína precursora de \beta-amiloide y segregan también el fragmento \beta-amiloide de 4 kDa dentro de medios de cultivo, aparentemente como parte de una ruta de degradación normal.

Mientras que es difícil una relación causal absoluta entre \beta-amiloide o las placas que él forma y la enfermedad de Alzheimer, hay una amplia evidencia para respaldar el papel patógeno de \beta-amiloide. Por ejemplo los pacientes con síndrome de Down tienen una copia extra del gen de la proteína precursora de \beta-amiloide debido a la trisomía del cromosoma 21 (St. George-Hyslop y col., Science 235: 885 (1987), Kang y col., Nature 325: 733 (1987)). Ellos desarrollan correspondientemente una neuropatología de enfermedad de Alzheimer de aparición temprana los 30-40 años de edad. Además, la enfermedad de Alzheimer familiar de aparición temprana puede resultar de mutaciones en el gen de proteína precursora de \beta-amiloide que se halla dentro de o cerca de la secuencia de \beta-amiloide (Hardy, J., Nature Genetics 1: 233 (1992)). Estas observaciones son consistentes con la noción de que la deposición de \beta-amiloide en forma de placas en el cerebro se acelera mediante una elevación en su concentración extracelular (Scheuner y col., Nature Med. 2: 864 (1996)). El hallazgo de que \beta-amiloide es directamente neurotóxico tanto in vitro como in vivo (Kowall y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 7247 (1991)), sugiere que \beta-amiloide agregado soluble, no las placas por sí mismas, puede producir la patología.

Las observaciones han indicado que la formación de placa amiloide puede llevarse a cabo mediante un mecanismo de tipo cristalización (Jarrett y col., Cell 73: 1055 (1993)). De acuerdo con este modelo, la semilla que inicia la nucleación de placas es un \beta-amiloide que es de 42 ó 43 aminoácidos de largo (A\beta_{1-43}). El núcleo que determina la velocidad formado por A\beta_{1-42} o A\beta_{1-43} permite a péptidos A\beta_{1-40} o más cortos contribuir al crecimiento rápido de un depósito amiloide. Este fenómeno de nucleación se demostró in vitro por la capacidad de A\beta_{1-42} para causar la agregación instantánea de una solución cinéticamente estable, sobresaturada de péptidos A\beta_{1-40}. Este hallazgo ha conducido a la posibilidad de que A\beta_{1-40} sea relativamente inofensivo en ausencia de los péptidos de nucleación A\beta_{1-42} o A\beta_{1-43}. Es más, se han encontrado niveles elevados de estos péptidos largos en la sangre de pacientes con enfermedad de Alzheimer familiar (Scheuner y col., Nature Med. 2: 864 (1996)). Además, se que encontró A\beta_{1-42} o A\beta_{1-43} era la forma predominante depositada en las placas cerebrales de muchos pacientes con enfermedad de Alzheimer (Gravina y col., J. of Biol. Chem. 270: 7013 (1995)).

Dado el papel central jugado por \beta-amiloide, ha llegado a ser crecientemente importante entender la interrelación entre las diferentes reservas de estas moléculas en el cuerpo. El \beta-amiloide libre presente en la sangre surge lo más probablemente a partir de péptido liberado por escisión proteolítica de proteína precursora de \beta-amiloide en células en los tejidos periféricos. Asimismo la mayoría del \beta-amiloide libre encontrado en el cerebro y en el fluido cerebroespinal se deriva probablemente a partir de péptido liberado por escisión de secretasa de proteína precursora de \beta-amiloide expresada en células cerebrales. Los péptidos son idénticos sin importar su origen, y los resultados de diversos estudios sugieren una intercomunicación entre estas reservas.

Sumario de la invención

Un aspecto de la presente invención es un anticuerpo biespecífico que cataliza hidrólisis de \beta-amiloide en un enlace amida predeterminado como se define en la reivindicación 1. En una realización, el anticuerpo se une preferiblemente a un análogo de estado de transición que imita el estado de transición adoptado por \beta-amiloide durante hidrólisis en un enlace amida predeterminado y también se une a \beta-amiloide natural con suficiente afinidad para detectar usando un ELISA. En otra reivindicación, el anticuerpo se une preferiblemente a un análogo de estado de transición que imita el estado de transición adoptado por \beta-amiloide durante hidrólisis en un enlace amida predeterminado, y no une \beta-amiloide natural con afinidad suficiente para detectar usando un ELISA. Los anticuerpos generados se caracterizan por el enlace amida que ellos hidrolizan. Los anticuerpos específicos incluyen aquellos que catalizan la hidrólisis en los enlaces de amiloide entre residuos 39 y 40, 40 y 41, y 41 y 42, de \beta-amiloide.

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Otro aspecto de la presente invención es un anticuerpo vectorizado que se caracteriza por la capacidad para cruzar la barrera hematoencefálica y se caracteriza también por la capacidad para catalizar la hidrólisis de \beta-amiloide en un enlace amida predeterminado. El anticuerpo vectorizado es un anticuerpo biespecífico y el anticuerpo vectorizado tiene una primera especificidad para el receptor de transferrina y una segunda especificidad para un estado de transición adoptado por \beta-amiloide durante hidrólisis. Los anticuerpos vectorizados específicos incluyen aquellos que catalizan la hidrólisis en los enlaces amiloides entre residuos 39 y 40, 40 y 41, y 41 y 42, de \beta-amiloide.

Los anticuerpos de la presente invención se pueden usar en un procedimiento para secuestrar \beta-amiloide en la corriente sanguínea de un animal administrando por vía intravenosa anticuerpos específicos para \beta-amiloide al animal en una cantidad suficiente para incrementar retención de \beta-amiloide en la circulación. Las solicitudes terapéuticas incluyen tratar pacientes diagnosticados con, o en riesgo de enfermedad de Alzheimer.

Se ha descrito también un procedimiento para secuestrar el \beta-amiloide libre en la corriente sanguínea de un animal inmunizando un animal con un antígeno que consta de un epitope que está presente en \beta-amiloide endógeno para el animal bajo condiciones apropiadas para la generación de anticuerpos que unen \beta-amiloide endógeno. Las aplicaciones terapéuticas de este procedimiento incluyen tratar pacientes diagnosticados con, o en riesgo de enfermedad de Alzheimer.

Los anticuerpos de la presente invención se pueden usar en un procedimiento para reducir niveles de \beta-amiloide en el cerebro de un animal administrando intravenosamente los anticuerpos que son específicos para \beta-amiloide endógeno al animal en una cantidad suficiente para incrementar retención de \beta-amiloide en la circulación del animal. Los anticuerpos son anticuerpos catalíticos que catalizan hidrólisis de \beta-amiloide en un enlace amida predeterminado. Los anticuerpos pueden ser bien monoclonales o bien policlonales. En una realización, los anticuerpos reconocen específicamente epitopes en el extremo C-terminal de \beta-amiloide A\beta_{1-43}.

Se describe también un procedimiento para reducir niveles de \beta-amiloide en el cerebro del animal, inmunizando al animal con un antígeno que consta de un epitope que está presente en \beta-amiloide endógeno bajo condiciones apropiadas para la generación de anticuerpos que unen \beta-amiloide endógeno. En una realización, el antígeno es un análogo de estado de transición que imita al estado de transición adoptado por \beta-amiloide durante hidrólisis en un enlace amida predeterminado. En una realización preferida, el antígeno está constando de A\beta_{10-25}. Preferiblemente, los anticuerpos generados tienen una afinidad más alta por el análogo de estado de transición que por \beta-amiloide natural, y catalizan hidrólisis de \beta-amiloide endógeno.

Se proporcionan también procedimientos similares que utilizan o generan anticuerpos que catalizan la hidrólisis de \beta-amiloide para reducir niveles de \beta-amiloide circulante en un animal, y también para evitar la formación de placas amiloides en el cerebro de un animal. Además, se proporcionan procedimientos para disgregar placas amiloides presentes en el cerebro de un animal utilizando o generando anticuerpos que catalizan la hidrólisis de \beta-amiloide.

Se pueden usar anticuerpos de la presente invención para desagregar placas amiloides presentes en el cerebro de un animal administrando por vía intravenosa anticuerpos biespecíficos vectorizados al animal en una cantidad suficiente para causar reducción significativa en niveles de \beta-amiloide en el cerebro del animal. Los anticuerpos biespecíficos vectorizados son competentes para transcitosis a través de la barrera hematoencefálica, y tienen la capacidad de catalizar hidrólisis de \beta-amiloide endógeno en un enlace amida predeterminado tras unirse. Los anticuerpos biespecíficos vectorizados se unen específicamente al receptor de transferrina.

Se describe también un procedimiento para generar anticuerpos que catalizan hidrólisis de una proteína o polipéptido inmunizando un animal con un antígeno que consta de un epitope que tiene un análogo de estatina que imita la conformación de un estado de transición de hidrólisis predeterminado del polipéptido, bajo condiciones apropiadas para la generación de anticuerpos para el estado de transición de hidrólisis. Este procedimiento se puede usar para generar anticuerpos catalíticos para \beta-amiloide. Se proporciona también un procedimiento similar, que utiliza análogos de enlace peptídico reducidos para imitar la conformación de un estado de transición de hidrólisis de un polipéptido.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 es un listado de secuencia de aminoácidos (SEQ ID Nº.: 1) del péptido \beta-amiloide de 43 residuos (A\beta).

La figura 2 es un listado de secuencia de aminoácidos (SEQ ID Nº.: 2) del péptido antigénico elaborado a partir de la secuencia N-terminal de \beta-amiloide (A\beta_{1-16}).

La figura 3 es un listado de secuencia de aminoácidos (SEQ ID Nº.: 3) del péptido antigénico elaborado a partir de la región central de \beta-amiloide (A\beta_{10-25}).

La figura 4 es un listado de secuencia de aminoácidos (SEQ ID Nº.: 4) (A\beta_{35-43}) del péptido antigénico elaborado a partir de la secuencia C-terminal de \beta-amiloide.

La figura 5 es una representación en diagrama de datos a partir de un ELISA que compara unión de anticuerpo monoclonal a A\beta_{35-43} y a A\beta_{1-43} frente a la unión de anticuerpo monoclonal a A\beta_{1-40}.

La figura 6 indica los enlaces amida en el péptido elaborado a partir de la secuencia C-terminal de \beta-amiloide (SEQ ID Nº.: 4) que se reemplazan independientemente con un resto de estatilo, para generar los diferentes análogos de estados de transición de estatina del péptido.

La figura 7 indica los enlaces amida en el péptido elaborado a partir de la secuencia central de \beta-amiloide (SEQ ID Nº.: 3) que se remplazan independientemente con un resto estatilo, para generar los diferentes análogos de estado de transición de fenilalanina estatina del péptido.

La figura 8 es una comparación estructural entre el péptido \beta-amiloide nativo y el análogo del péptido \beta-amiloide de fenilalanina estatina de estado de transición.

La figura 9 es una comparación estructural entre el péptido \beta-amiloide nativo y el análogo del péptido \beta-amiloide de estado de transición de enlace peptídico reducido.

La figura 10 es una representación en fórmula de la región C-terminal nativa de \beta-amiloide, y el análogo de estado de transición de fosforamidato de la región C-terminal de \beta-amiloide (A\beta_{35-43}).

La figura 11 indica el estado de transición teórico para hidrólisis peptídica mediante peptidasas de cinc, comparadas con imitadores de fosfonato y fosfonamidato.

La figura 12 es una comparación estructural del péptido \beta-amiloide nativo y el péptido \beta-amiloide de fosfonamidato que tiene el enlace peptídico entre Gly 38 y Val 39 reemplazado por un enlace fosfonamidato.

La figura 13 es una representación en diagrama de datos a partir de un ELISA que valora la unión de anticuerpos monoclonales generados para análogos de péptido \beta-amiloide en el estado de transición, al A\beta_{1-43} normal y al péptido \beta-amiloide en el estado de transición de fenilalanina estatina.

La figura 14 es una representación en diagrama de datos a partir de un ELISA que compara unión de anticuerpos al péptido \beta-amiloide en el estado de transición de estatina frente a A\beta_{1-43} nativo y A\beta_{1-40} nativo.

La figura 15 es un gráfico de datos que muestra la escisión de ^{125}I-A\beta-sefarosa mediante anticuerpos monoclonales generados para análogos del estado de transición de \beta-amiloide.

La figura 16 es una representación en diagrama de datos que cuantifica el anclaje de anticuerpo biespecífico a células positivas en receptor.

La figura 17 es una representación en diagrama de datos obtenidos a partir de experimentos diseñados para localizar la transcitrosis de anticuerpo biespecífico vectorizado en el cerebro.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a procedimientos basados en inmunología para controlar niveles de \beta-amiloide en el cuerpo de un animal. La invención se basa en el hallazgo de que los anticuerpos específicos para \beta-amiloide son capaces de unirse a \beta-amiloide en presencia de un nivel fisiológico de seroalbúmina humana. La invención se basa también en el hallazgo de que un animal puede tolerar la presencia de anticuerpos específicos para \beta-amiloide en cantidades suficientes para secuestrar \beta-amiloide en la corriente sanguínea.

Un aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento para secuestrar \beta-amiloide libre en la corriente sanguínea de un animal. Las formas soluble e insoluble de \beta-amiloide presentes en un animal están en equilibrio dinámico. El \beta-amiloide soluble se piensa que se transloca entre la sangre y el fluido cerebroespinal. Los agregados de \beta-amiloide insolubles se depositan a partir de la reserva soluble en el cerebro, como placas amiloides. Los resultados detallados en la sección de Ejemplificación más adelante indican que la administración intravenosa de anticuerpos específicos para \beta-amiloide a un animal impiden el paso de \beta-amiloide soluble fuera de la circulación periférica. Esto tiene lugar debido a que los anticuerpos específicos de \beta-amiloide, que están restringidos a la circulación periférica, se unen al \beta-amiloide y lo secuestran en la circulación. Tal secuestro se lleva a cabo por administración intravenosa de una cantidad apropiada de anticuerpos específicos para \beta-amiloide al animal. La cantidad de anticuerpo que es suficiente para producir secuestro depende de diversos factores (por ejemplo, características específicas del anticuerpo a administrarse, el tamaño, metabolismo, y salud general del animal) y están para determinarse en una base caso por caso.

Los anticuerpos administrados pueden ser anticuerpos monoclonales, una mezcla de diferentes anticuerpos policlonales, anticuerpos policlonales, o cualquier combinación de los mismos. En una realización, los anticuerpos se unen a la región C-terminal de \beta-amiloide. Tales anticuerpos se unen específicamente a la especie menos abundante, pero más nociva A\beta_{1-43} en la sangre en oposición a la menor y menos perjudicial A\beta_{1-40}. En otra realización, se administra una combinación de anticuerpos que tienen especificidad para diversas regiones de \beta-amiloide. En otra realización, se administran anticuerpos que catalizan la hidrólisis de \beta-amiloide, discutidos en más detalle más adelante, bien solos o bien en combinación con otros anticuerpos anti-\beta-amiloide.

El animal al que se administran los anticuerpos es cualquier animal que tenga \beta-amiloide soluble circulante. En una realización, el animal es un ser humano. El ser humano puede ser un individuo sano, o alternativamente, puede sufrir de o estar en riesgo de una enfermedad en la que se piense que los niveles de \beta-amiloide elevados juegan un papel, por ejemplo una enfermedad neurodegererativa tal como enfermedad de Alzheimer.

Se describe también un procedimiento para secuestrar \beta-amiloide libre en la corriente sanguínea de un animal estimulando una respuesta inmune en el animal para \beta-amiloide endógeno. El resultado detallado en la Ejemplificación más adelante indica que un animal puede tolerar la inducción de una respuesta inmune que produce anticuerpos para \beta-amiloide endógeno, y que la presencia de tales anticuerpos alterará la distribución de \beta-amiloide en el cuerpo, en una manera similar al procedimiento anteriormente descrito de administrar anticuerpos de unión a \beta-amiloide. La respuesta inmune a \beta-amiloide endógeno se genera inmunizando al animal con uno o más antígenos que constan de epitopes presentes en el \beta-amiloide endógeno. Los epitopes presentes en los antígenos inoculados pueden corresponder a epitopes presentes en cualquier región de la molécula \beta-amiloide. En una realización preferida, los epitopes encontrados en la región C-terminal del \beta-amiloide se usan para generar anticuerpos que se unen específicamente a la especie A\beta_{1-43} en oposición a la especie menor A\beta_{1-40}. En una realización alterna, se administra una combinación de diferentes epitopes para generar una diversidad de anticuerpos para \beta-amiloide. Se generó una respuesta inmune más generalizada inmunizando bien con una mezcla de diferentes antígenos de péptidos pequeños o bien con el péptido \beta-amiloide de 43 residuos de longitud total. En otra realización, los antígenos usados para inoculación incluyen análogos de estado de transición de péptidos \beta-amiloides para inducir anticuerpos que tienen actividad catalítica dirigida hacia hidrólisis de \beta-amiloide, descrita en detalle más adelante.

La inmunorreactividad de los antígenos se puede aumentar con una diversidad de procedimientos, muchos de los cuales implican acoplar el antígeno al vehículo inmunógeno. Además, se conocen y están disponibles diversos procedimientos para alguien de habilidad en la técnica para potenciar específicamente la inmunogenicidad de moléculas endógenas o los epitopes contenidos en ellas. Se pueden hacer diversas modificaciones al/a los antígeno(s) descrito(s) en el presente documento para volverlo(s) más compatible(s) para uso humano. Por ejemplo, el/los péptido(s), pueden modi-
ficarse mediante ingeniería genética dentro de vehículos antigénicos apropiados, o se pueden diseñar vacunas de DNA.

Las técnicas anteriores para secuestrar \beta-amiloide en la circulación son también útiles para reducir los niveles de \beta-amiloide en el cerebro. Debido a que la formación de placas amiloides en el cerebro es dependiente, al menos en parte, de los niveles de \beta-amiloide libre presentes en el cerebro, recudir los niveles de \beta-amiloide cerebrales de un animal reducirá, a su vez, la formación de placas amiloides en el cerebro. Por lo tanto, las técnicas anteriores son útiles para evitar la formación de placas amiloides en el cerebro de un animal. Esto es especialmente aplicable a un animal que se considera en riesgo para el desarrollo de placas amiloides; un riesgo que puede resultar de una predisposición genética o de factores ambientales. La administración de anticuerpos, o la inmunización del animal para producir anticuerpos endógenos, para \beta-amiloide puede ser de beneficio terapéutico para un animal tal (por ejemplo, un ser humano quien tiene una historia familiar de enfermedad de Alzheimer, o quien está diagnosticado con la enfermedad).

Otro aspecto de la presente invención se refiere a anticuerpos que se caracterizan por la capacidad para catalizar la hidrólisis de \beta-amiloide a un enlace amida predeterminado. Los Experimentos detallados en la sección de Ejemplificación demuestran la generación de diferentes anticuerpos que tienen actividades proteolíticas hacia \beta-amiloide. Tales anticuerpos se generan inmunizando a un animal con un antígeno que es un análogo del estado de transición del péptido \beta-amiloide. Un análogo del estado de transición imita el estado de transición que adopta \beta-amiloide durante la hidrólisis de un enlace amida predeterminado. Los análogos de estado de transición útiles para generar los anticuerpos catabólicos incluyen, sin limitación, estatina, fenilalanina estatina, fosfonato, fosfonamidato, y análogos del estado de transición de enlace peptídico reducido.

Los anticuerpos generados para epitopes únicos para el estado de transición se unen preferencialmente a \beta-amiloide en el estado de transición. La unión de estos anticuerpos estabiliza el estado de transición, que conduce a hidrólisis del enlace amida correspondiente. El enlace amida particular a hidrolizarse se elige en base al producto de escisión deseado. Por ejemplo, la escisión de \beta-amiloide de longitud total en dos fragmentos peptídicos que no se puedan agregar en placas amiloides sería de uso terapéutico en los procedimientos descritos en el presente documento. Los anticuerpos pueden ser bien monoclonales o bien policlonales. Se han hecho y se han usado como antígeno en la generación de anticuerpos monoclonales que catalizan la escisión en el enlace indicado varios de tales imitadores de estados de transición. Estos antígenos y los anticuerpos generados se enumeran en la Tabla 8 de la sección de Ejemplificación. Los anticuerpos generados para antígenos que tienen imitadores de estado de transición incorporados a un enlace amida específico, unirían los estados de transición de hidrólisis naturales de estos enlaces en \beta-amiloide nativo, estabilizando el estado de transición y catalizando escisión en ese enlace.

Al menos se generan dos clases diferentes de anticuerpos mediante los procedimientos anteriores. La primera clase une preferencialmente al análogo del estado de transición, y también reacciones cruzadas detectables con \beta-amiloide natural usando el ELISA detallado en la sección de Ejemplificación para detectar unión. La segunda clase se une al análogo del estado de transición, y no reacciona de forma cruzada detectablemente con \beta-amiloide natural usando el procedimiento de ELISA detallado en la sección de Ejemplificación para detectar unión. Ambas clases de anticuerpos tienen valor potencial como anticuerpos catalíticos. Las respectivas afinidades de unión de un anticuerpo anti-estado de transición es probable que reflejen su actividad en catalizar hidrólisis. Se piensa que con el fin de que un anticuerpo tenga actividad en catalizar hidrólisis de una proteína, debe poseer al menos una capacidad mínima para unirse al estado natural (no de transición) de la proteína. Los anticuerpos que retienen unión significativa para \beta-amiloide, (que reaccionan de forma cruzada con \beta-amiloide natural) pueden ser más eficientes en catalizar hidrólisis debido a una mayor eficiencia de unir el \beta-amiloide. Una vez unido, estos anticuerpos fuerzan a la proteína dentro de una conformación de estado de transición para escisión hidrolítica. Alternativamente, los anticuerpos que sólo reaccionan de forma cruzada con \beta-amiloide natural, aunque menos eficientes en unir \beta-amiloide nativo, están probablemente siendo mas eficientes en forzar el \beta-amiloide unido en la conformación del estado de transición para escisión hidrolítica. Se señalaría que el fallo en detectar unión de los anticuerpos anti-estado de transición a \beta-amiloide natural mediante los procedimientos de ELISA presentados en la Ejemplificación en el presente documento no refleja necesariamente una incapacidad para unir \beta-amiloide natural suficientemente para funcionar como un anticuerpo catalítico. Más probablemente, una falta de detección refleja meramente las limitaciones en sensibilidad del ensayo.

Los anticuerpos que tienen afinidad sustancial para los productos de escisión predichos del péptido \beta-amiloide nativo se pueden someter a inhibición de producto y deben por lo tanto presentar recambio bajo. Tales anticuerpos indeseados se pueden identificar mediante exploración secundaria usando péptidos que contienen epitopes de los productos de escisión predichos (por ejemplo, por medio de ELISA).

En una realización preferida, los anticuerpos son monoclonales. Los anticuerpos monoclonales se producen inmunizando un animal (por ejemplo, ratón, conejillo de Indias, o rata) con el antígeno análogo del estado de transición, y subsiguientemente produciendo hibridomas del animal, mediante procedimientos estándar. Los hibridomas que producen los anticuerpos monoclonales deseados se identifican mediante exploración. Un ejemplo de un procedimiento de exploración se presenta en la sección de Ejemplificación que sigue. En otra realización, los anticuerpos son policlonales. Los anticuerpos policlonales se generan inmunizando a un animal (por ejemplo, un conejo, pollo o cabra) con antígeno y obteniendo sueros a partir del animal. Los anticuerpos policlonales que tienen las especificidades de unión deseadas se pueden purificar adicionalmente a partir de los sueros mediante alguien de habilidad en la técnica a través de la ruta de experimentación de rutina.

Los anticuerpos catalíticos específicos para \beta-amiloide se pueden generar alternativamente en un individuo por el uso de vacunas antiidiotípicas diseñadas para provocar la producción de anticuerpos catalíticos. Tales vacunas se describen en la descripción de Raso y Paulus (Solicitud de Patente de los EE.UU. 09/102.451, ANTI-IDIOTYPE VACCINES TO ELICIT CATALYTIC ANTIBODIES, presentada por los solicitantes el 22 de junio, 1988, actualmente en trámite), los contenidos de la cual se incorporan en el presente documento mediante referencia.

Otro aspecto de la presente invención es el uso de estatina y análogos de enlaces peptídicos reducidos para provocar que los anticuerpos catalíticos tengan actividad proteolítica. La sección de Ejemplificación más adelante detalla los procedimientos para usar análogos de estatina como antígeno en la producción de los anticuerpos catalíticos, y también enumera ejemplos de anticuerpos anti-estado de transición generados usando estos procedimientos. El resto "estatilo" se deriva de inhibidores de estado de transición de proteasa evolucionados de forma natural como amastatina, pepstatina y bestatina. Estos inhibidores basados en la estatina que se dan en la naturaleza se han usado para bloquear de forma efectiva la actividad de aminopeptidasas, proteasas aspárticas y la proteasa de VIH. Los péptidos sintéticos que contienen un residuo de estatina ofrecen características nuevas para la inducción de anticuerpos catalíticos. El resto de estatilo tiene una geometría de enlaces tetraédrica, su longitud se prolonga a lo largo de dos unidades de CH_{2}, tiene un grupo OH estratégicamente situado y la estructura no tiene carga. La presencia de las unidades de CH_{2} adicionales se espera que provoque un sitio de combinación de anticuerpo más prolongado, y los anticuerpos que poseen este sitio prolongado inducirán presión extra sobre el sustrato peptídico, produciendo una catálisis acelerada. Además, se piensa que el grupo -OH en estos análogos de estatina se aproxima mejor a la posición y química del estado de transición verdadero. Los análogos del estado de transición basados en estatina provocarían por lo tanto una clase de anticuerpos que es significativamente diferente de aquellos obtenidos usando los análogos de fosfonato cargados negativamente usados más comúnmente.

Los análogos de enlace peptídico reducido introducen una configuración tetraédrica, sin incrementar la distancia entre aminoácidos y residuos. Esta característica se aproximaría más cercanamente a la verdadera geometría del estado de transición, que los análogos usados previamente. Una amina secundaria cargada positivamente reemplaza el nitrógeno de amida del polipéptido natural y provocaría una cadena lateral cargada negativamente completamente en una posición sitio proximal en el sitio de combinación de anticuerpos. La presencia de tales grupos glutamilo o aspartilo complementarios en el anticuerpo ayudara a la catálisis mediada por anticuerpos de escisión peptídica por medio de un intercambio ácido-base. Los análogos del estado de transición basados en enlaces peptídicos reducidos provocarían por lo tanto una clase de anticuerpos que son significativamente diferentes de aquellos obtenidos usando los análogos de fosfonato cargados negativamente. Los análogos de enlace peptídico reducido y los análogos de estatina se pueden usar para producir antígenos de análogos de estado de transición específicos para una amplia diversidad de proteínas o polipéptidos. Estos antígenos se pueden usar a su vez para generar los anticuerpos catalíticos respectivos.

La administración de los anticuerpos catalíticos de \beta-amiloide respectivos descrita anteriormente se puede usar en los procedimientos descritos anteriormente para 1) secuestrar el \beta-amiloide en la corriente sanguínea de un animal, 2) reducir niveles de \beta-amiloide en el cerebro de un animal, y 3) evitar la formación de placas amiloides en el cerebro de un animal, para generar los resultados análogos. Los experimentos presentados en la Ejemplificación demuestran que la inmunización de un animal con un estado de transición análoga da como resultado la generación de una respuesta inmune para producir anticuerpos que reconocen el estado de transición, y que catalizan la hidrólisis de la proteína \beta-amiloide. Esto indica que los análogos del estado de transición se pueden usar como antígenos en estos procedimientos para inducir la producción de anticuerpos en el animal que reconoce y cataliza escisión de \beta-amiloide endógeno.

Están también comprendidos en la presente invención procedimientos que implican reducir niveles generales de \beta-amiloide en un animal a través de la acción proteolítica de los anticuerpos catalíticos descritos anteriormente. La presencia de anticuerpos catalíticos funcionales en la circulación de un animal reducirá el nivel de \beta-amiloide intacto en la circulación mediante escisión hidrolítica selectiva. De acuerdo con ello, la presente invención proporciona un procedimiento para reducir niveles de \beta-amiloide circulante en un animal introduciendo los anticuerpos catalíticos descritos anteriormente dentro del animal. La administración de los anticuerpos al animal es preferiblemente por medio de administración intravenosa. Tales anticuerpos son bien monoclonales, bien monoclonales mixtos, bien policlonales o bien cualquier mezcla de los mismos. El origen del anticuerpo puede afectar la semivida del anticuerpo en el animal; los anticuerpos de especies menos relacionadas es más probable que se reconozcan como extraños por el sistema inmune del animal. Preferiblemente, los anticuerpos administrados se derivan de especies cercanamente relacionadas con el animal, para maximizar la semivida y minimizar las reacciones adversas por el huésped. La administración de fragmentos de anticuerpo de región variable aislados puede producir resultados beneficiosos a este respecto.

La presente invención también proporciona un procedimiento para reducir niveles de \beta-amiloide circulante en un animal inmunizando al animal con un análogo en el estado de transición de \beta-amiloide para inducir producción de anticuerpos catalíticos endógenos. El uso y diseño de tales vacunas se describe anteriormente, y se detalla en la sección de Ejemplificación más adelante.

La reducción de niveles de \beta-amiloide en la circulación de un animal se espera que desplace el equilibrio de \beta-amiloide en el cuerpo, y en última instancia conduzca a una reducción en los niveles de \beta-amiloide en el cerebro del animal a través de acción masiva. A este respecto, la presente invención proporciona procedimientos para reducir los niveles de \beta-amiloide en el cerebro de un animal, bien administrando anticuerpos catalíticos al animal, o bien administrando un análogo del estado de transición para inducir producción de anticuerpos endógena. De ello se sigue que estos procedimientos tienen también valores como procedimientos para prevenir la formación de placas amiloides en el cerebro de un animal, dado que la reducción resultante en los niveles de \beta-amiloide en el cerebro de un animal evitaría la formación de placas amiloides. Estos procedimientos también tienen valor como procedimientos para desagregar placas amiloides presentes en el cerebro de un animal, dado que las evidencias indican que los niveles de \beta-amiloide cerebrales más bajos pueden conducir a la disgregación de las placas.

Otro aspecto de la invención proporciona un procedimiento más directo de alterar la distribución de \beta-amiloide en el cerebro administrando realmente anticuerpos anti-\beta-amiloide al cerebro. Los procedimientos anteriormente descritos para reducir niveles de \beta-amiloide y para evitar agregación de placas amiloides dependen de intercambio entre reservas de \beta-amiloide en la sangre, tejidos, fluido cerebroespinal y el cerebro, dirigiéndose el intercambio mediante una disrupción mediada por anticuerpos del equilibrio entre estas reservas diferentes. En contraste, la administración de anticuerpos anti-\beta-amiloides al cerebro afectará directamente a la agregación de \beta-amiloide. La evidencia presentada en la sección de Ejemplificación más adelante indica que la unión de ciertos anticuerpos anti-\beta-amiloides inhibe la agregación inicial de \beta-amiloide in vitro, y también disgrega complejos \beta-amiloides preformados in vitro. Además, si el péptido insoluble está en equilibrio con un nivel bajo de \beta-amiloide soluble, entonces un anticuerpo de unión anti-\beta-amiloide podría alterar este equilibrio y disolver gradualmente el precipitado. Estas observaciones indican que la presencia de anticuerpos de \beta-amiloide en el cerebro inhibirá directamente la formación de placas de \beta-amiloide y también disgregará las placas preformadas desbaratando el equilibrio dinámico entre \beta-amiloide soluble y \beta-amiloide fibrilar depositado en forma de placas. Además, se espera que un anticuerpo catalítico altamente activo destruya placas de \beta-amiloide insolubles escindiendo hidrolíticamente los péptidos agregados constituyentes.

Una manera de suministrar anticuerpos al cerebro es produciendo anticuerpos vectorizados competentes para transcitosis a través de la barrera hematoencefálica. Los anticuerpos vectorizados se producen uniendo covalentemente un anticuerpo a un agente que promueve administración a partir de la circulación a un destino predeterminado en el cuerpo. Los ejemplos de moléculas vectorizadas que pueden atravesar la barrera hematoencefálica se encuentran en la técnica previa (Bickel y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 90: 2618-2622 (1993); Broadwell y col., Exp. Neurol. 142: 47-65 (1996)). En estos ejemplos, los anticuerpos se unen a otra macromolécula, siendo los anticuerpos el agente que promueve la administración de las macromoléculas. Un ejemplo de un agente tal es un anticuerpo que se dirige hacia un componente de la superficie celular, tal como un receptor, que se transporta a partir de la superficie celular. Ejemplos de anticuerpos que confieren la capacidad para realizar transcitosis a través de la barrera hematoencefálica incluyen, sin limitación, anticuerpos de receptor antiinsulina, y también receptores antitransferrina (Saito y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 92: 10227-31 (1995); Pardridge y col., Pharm. Res. 12: 807-816 (1995); Broadwell y col., Exp. Neurol. 142: 47-65 (1996)). El primer anticuerpo está unido covalentemente a un anticuerpo que une \beta-amiloide. Alternativamente, acoplar los anticuerpos de \beta-amiloide con ligandos que se unen a estos receptores (por ejemplo, insulina, transferrina, o lipoproteína de baja densidad) producirá un anticuerpo vectorizado competente para administrar al cerebro a partir de la circulación (Descamps y col., Am. J. Physiol. 270: H1149-H1158 (1996); Duffy y col., Brain Res. 420: 32-38 (1987); Dehouck y col., J. Cell Biol. 138: 877-889 (1997)).

Un resto del vector puede estar químicamente unido al anticuerpo \beta-amiloide para facilitar su administración dentro del sistema nervioso central. Alternativamente, el resto se puede modificar mediante ingeniería genética dentro del anticuerpo como un componente integral. Este componente del vector puede ser por ejemplo, un anticuerpo de receptor de antitransferrina o un anticuerpo de receptor de antiinsulina que se une a los receptores presentes en las células endoteliales de capilares del cerebro (Bickel y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 90: 2618-22 (1993); Pardridge y col., J. Pharmacol. Exp. Ther. 259: 66-70 (1991); Saito y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 92: 10227-31 (1995); Friden y col., J. Pharm. Exper. Ther. 278: 1491-1498 (1996)) que forman la barrera hematoencefálica. El anticuerpo bifuncional resultante se unirá a los receptores apropiados en la cara luminal del vaso (Raso y col., J. Biol. Chem. 272: 27623-27628 (1997); Raso y col., J. Biol. Chem. 272: 27618-21622 (1997); Raso, V. Anal. Biochem. 222: 297-304 (1994); Raso y col., Cancer Res. 41: 2073-2078 (1981); Raso y col., Monoclonal antibodies as cell targeted carriers of covalently and non-covalently attached toxins in receptor mediated targeting of drugs, vol. 82. G. Gregoriadis, G. Post, editores J. Senior y A. Trouet. NATO Advanced Studies Inst., Nueva York 119-138 (1984)). Una vez unidos al receptor, ambos componentes del anticuerpo biespecífico pasan a través de la barrera hematoencefálica mediante el proceso de transcitosis. Los anticuerpos anti-\beta-amiloide que han entrado en el cerebro interactúan directamente tanto con placas de \beta-amiloide como con la reserva soluble de \beta-amiloide. Se ha estimado que se pueden lograr en el cerebro concentraciones de macromoléculas en el intervalo de 10^{-8}-10^{-7} M usando administración mediada por vector por medio de estos sitios objetivo de proteína enriquecida de capilares de cerebro (Naness y col., Life Sciences 55: 1643-1650 (1994); Lerner y col., Science 252: 659-667 (1991)). De forma importante, el vector parece seguro dado que los animales dosificados diariamente durante 2 semanas con un anticuerpo receptor de antitransferrina no presentaron ninguna pérdida de integridad de la barrera hematoencefálica, usando una sonda de sacarosa radiactiva (Broadwell y col., Exp. Neurol. 142: 47-65 (1996)).

La Ejemplificación detalla la producción de anticuerpos biespecíficos vectorizados que se unen a \beta-amiloide. Los anticuerpos biespecíficos experimentan transcitosis a través de la barrera hematoencefálica por medio de una primera especificidad que une el receptor de transferrina. El uso de anticuerpos que se unen al receptor de transferrina para administración de agentes a través de la barrera hematoencefálica se describe por Friden y col., en las Patentes de los Estados Unidos Nº.: 5.182.107; Nº.: 5.154.294, Nº.: 5.833.988; y Nº.: 5.527.527; los contenidos de las cuales se incorporan en el presente documento mediante referencia.

Los resultados de experimentos presentados en la sección de Ejemplificación que sigue indican que los anticuerpos biespecíficos producidos mantienen sus especificidades distintas y se desarrollan a través de la barrera hematoencefálica dentro del parénquima cerebral y los capilares cerebrales de un animal vivo cuando se administran por vía intravenosa.

Los procedimientos alternos para la producción de anticuerpos biespecíficos se han descrito para reactivos biespecíficos modificados mediante ingeniería genética o para producirlos intracelularmente fusionando los dos clones de hibridoma diferentes (Holliger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 6444-6448 (1993); Milstein y col., Nature 305: 537 (1983); Mallander y col. J. Biol. Chem. 269: 199-206 (1994)). Los anticuerpos biespecíficos vectorizados producidos mediante estas técnicas se pueden usar también en los procedimientos de la presente invención.

Dado que la introducción de anticuerpos completos en el cerebro pudo ser perjudicial si son para fijar complemento y promover lisis de células neuronales mediada por complemento, puede ser beneficioso producir y utilizar reactivos biespecíficos F(ab')_{2} vectorizados menores. Se ha mostrado que el \beta-amiloide agregado por sí mismo puede fijar complemento en la ausencia de cualquier anticuerpo y que la inflamación resultante puede contribuir a la patología de la enfermedad de Alzheimer. La posibilidad de anticuerpo anticerebral que tenga un efecto similar se puede reducir grandemente eliminando la región Fc del anticuerpo. Además, dado que el acoplamiento de las mitades de Fab' usa las cisteínas de la región de articulación intrínseca, no se necesita añadir ningún grupo de enlace sustituyente ajeno. La entrada más rápida y más eficiente dentro del cerebro representa otra ventaja potencial que puede proporcionar reactivos F(ab')_{2} o Fv_{2} menores para administración intracerebral. Además, los dos tipos de moléculas vectorizadas pueden tener biodistribución diferente y características de semivida en plasma diferentes (Spiegelberg y col., J. Exp. Med. 121: 323 (1965)).

Dependiendo de su diseño, los anticuerpos biespecíficos anti-\beta-amiloides en el cerebro pueden reducir \beta-amiloide soluble y depósitos de \beta-amiloide mediante tres mecanismos potenciales. Un anticuerpo biespecífico anti \beta-amiloide que une fuertemente \beta-amiloide soluble no sólo secuestrará el péptido sino que, debido a flujo de salida de moléculas vectorizadas a partir del sistema nervioso central (Kang y col., J. Pharm. Exp. Ther. 269: 344-350 (1994)), puede llevar también el \beta-amiloide unido fuera del cerebro, liberándolo dentro de la corriente sanguínea. Un mecanismo de evacuación tal conduciría a una ciclación continua de \beta-amiloide fuera del cerebro. Además, si los anticuerpos tienen actividad catalítica, reducirán directamente los niveles de \beta-amiloide dañino mediante degradación. Dado que los anticuerpos catalíticos presentan recambio, cada anticuerpo puede inactivar muchas moléculas de \beta-amiloide. Así se ha de administrar mucho menos anticuerpo biespecífico vectorizado dentro del cerebro para lograr la reducción deseada de \beta-amiloide.

Para ser efectivos los sitios anti-\beta-amiloide de un anticuerpo biespecífico deben estar vacíos antes de pasar fuera de la sangre y dentro del cerebro. Por lo tanto la concentración de anticuerpo biespecífico en animales debe exceder el nivel de \beta-amiloide que circula en la sangre. Los cálculos llevados a cabo basados en niveles de \beta-amiloide conocidos (Scheuner y col., Nature Med. 2: 864-870 (1996)) y en un nivel de plasma de intervalo medio de anticuerpo biespecífico esperado en un animal tratado indicaron que el 99,9% de los anticuerpos biespecíficos que entran en el cerebro tendrán sitios de combinación anti-\beta-amiloide no ocupados.

Otra manera de administrar anticuerpos al cerebro es mediante infusión directa de anticuerpos anti-\beta-amiloide dentro del cerebro de un animal. Esta técnica da a estos anticuerpos acceso inmediato a \beta-amiloide en el cerebro sin tener que cruzar la barrera hematoencefálica. La infusión directa puede llevarse a cabo mediante infusión parenquimática o intracerebroventricular directa (Knopf. Y col., J. Immunol. 161: 692-701 (1998)). Brevemente, el animal se anestesia y sitúa en un marco estereotáxico. Se hace una incisión medial sagital en el cuero cabelludo para exponer el cráneo y la fascia subyacente se raspa hacia fuera. Se perfora un agujero para admitir una longitud esterilizada de un tubo hipodérmico de acero inoxidable, que se hace avanzar estereotáxicamente de tal forma que su punta se sitúa apropiadamente en el cerebro. Se añade después una cánula guía al cráneo y se sella. La cánula permanece en su lugar para infusiones múltiples de anticuerpo en el cerebro. Un bolo de solución a 50 mg/ml estéril de un anti-\beta-amiloide monoclonal se puede infundir durante un periodo de 2-8 minutos dentro de un animal inmovilizado por medio de una cánula de inyección.

La administración de anticuerpos catalíticos dentro del cerebro de un animal por medio de uno de los procedimientos descritos anteriores, se puede usar también para disgregar las placas amiloides presentes en el cerebro. La ventaja de administrar un anticuerpo catalítico específico de \beta-amiloide dentro del cerebro es doble. El péptido \beta-amiloide se destruye permanentemente por tales anticuerpos y, debido a que la catálisis es continua, cada anticuerpo inactiva muchas moléculas de \beta-amiloide objetivo en el cerebro. Así se ha de infundir mucho menos anticuerpo dentro del sistema nervioso central para lograr la reducción deseada de \beta-amiloide.

La cantidad de anticuerpo a administrarse o suministrarse al animal sería suficiente para causar una reducción significativa en niveles de \beta-amiloide en el cerebro del animal. La cantidad apropiada dependerá de diversos parámetros (por ejemplo, el anticuerpo particular usado, el tamaño y metabolismo del animal, y los niveles de \beta-amiloide endógeno) y está por determinarse en una base caso por caso. Tal determinación está dentro de los medios de alguien de habilidad normal en la técnica a través de nada más que investigación de rutina.

Se espera que se puedan lograr beneficios adicionales con respecto a disminuir niveles de \beta-amiloide de cerebro y que se puedan evitar o disgregar placas amiloides por usar una combinación de una o más de las aproximaciones anteriormente descritas.

Ejemplificación

Sección 1

Retención de \beta-amiloide en la circulación Síntesis de Antígenos de Péptido \beta-amiloide

La secuencia de aminoácidos del péptido \beta-amiloide de 43 residuos (A\beta) se lista en la Figura 1. Para determinar que sitios en este péptido A\beta son los más idóneos para terapia mediada por anticuerpos, se eligen tres regiones clave (aminoterminal, central y carboxiterminal) del A\beta de 43-mer para generar vacunas específicas de especies. Estos péptidos acortados sirvieron como epitopes antigénicos para inducir una respuesta de anticuerpo altamente específica.

Los anticuerpos monoclonales para la región aminoterminal de A\beta han mostrado en el pasado tener la capacidad de solubilizar agregados de A\beta (Solomon y col., Proc. Natl. Acad. Sci EE.UU. 94(8): 4109 (1997); Solomon y col., Proc. Natl. Acad. Sci EE.UU. 93(1): 452 (1996)). Un péptido constituido por la región aminoterminal de A\beta se diseñó de forma similar para los presentes experimentos (mostrado en Fig. 2 y listado en SEQ ID Nº.: 2) y se usó obteniendo anticuerpos específicos de aminoterminal que unen A\beta. Se añadió un residuo de Cys al extremo C-terminal de la secuencia de A\beta proporcionando un grupo de enlace adecuado para acoplar este péptido a una proteína transportadora de antígenos tal como hemocianina de lapa de California activada por maleimida (KLH).

Se sintetizó también un péptido que comprende la región central de A\beta (mostrado en Figura 3 y listado en SEQ ID Nº.: 3). Se situó un residuo de Cys en el extremo N-terminal de la secuencia de A\beta proporcionando un grupo de enlace de sulfhidrilo para acoplar el péptido a las proteínas transportadoras antigénicas tales como KLH activada por maleimida.

Para producir un antígeno para provocar una respuesta inmune dirigida contra los extremos carboxiterminales de A\beta (Suzuki y col., Science 264: 1336 (1994)), se sintetizó un decapéptido que comprende la región N-terminal de A\beta, con un residuo de Cys adicional en el extremo N-terminal (mostrado en Fig. 4, y listado en SEQ ID Nº.: 4). La sustitución de Cys se diseñó proporcionando un grupo de enlace sulfhidrilo para acoplar un péptido a proteínas transportadoras antigénicas tales como KLH.

Acoplar los Péptidos a una Proteína Vehículo Antigénica

Los diferentes Cys que contienen péptidos A\beta están unidos individualmente por enlace tioéter a KLH activada por maleimida. Una vacuna de A\beta multivalente se produjo también uniendo simultáneamente todos de estos tres péptidos a KLH activada por maleimida. Además la longitud total de A\beta de 43-mer se unió a KLH usando glutataldehído.

Anticuerpos Obtenidos con las Vacunas de \beta-amiloide

Se inmunizaron ratones BALB/c normales mediante procedimientos estándar con las vacunas de A\beta unido a KLH anteriormente descritas. Los ratones bien se sangraron o bien se sacrificaron para eliminación del bazo para producción de hibridomas. Se caracterizaron sueros y anticuerpos monoclonales obtenidos para unión de A\beta.

La Tabla 1 muestra los resultados de un funcionamiento de ELISA con suero diluido 1/100 a partir de dos ratones control no inmunizados frente a suero diluido 1/100 y 1/1000 de un ratón que se inmunizó con una vacuna de péptido A\beta de región central-KLH. El péptido A\beta libre se adsorbió directamente sobre la placa de microvaloración para evitar detección de anticuerpos anti-KLH en el suero.

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TABLA 1 ELISA para Unión al Péptido A\beta de Región Central

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Los anticuerpos monoclonales obtenidos contra este péptido A\beta de región central y producidos por fusión de hibridoma se identificaron usando el ensayo de ELISA anteriormente descrito. Se llevó a cabo un ensayo de unión determinando si los anticuerpos anti-A\beta monoclonales identificados se unen a los péptidos A\beta de longitud total. Se incubó sonda ^{125}I- A\beta_{1-43} con secreciones de hibridoma a partir de los clones indicados. Se usó un procedimiento de separación de polietilenoglicol estándar detectando anticuerpo unido a ^{125}I- A\beta_{1-43} (Tabla 2). Los resultados presentados en la Tabla 2 indican que los anticuerpos generados para los fragmentos peptídicos también se unen en toda la longitud de A\beta_{1-43}.

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TABLA 2 Ensayo de Unión a ^{125}I-A\beta_{1-43}

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Se ha comunicado que cuando se añade ^{125}I-A\beta_{1-40} al plasma humano, 89% se une a albúmina (Biere y col., J. of Biol. Chem. 271 (51): 32916 (1996)). Esto produce la preocupación de que la albúmina unida pueda interferir con la unión de anticuerpos. Los ensayos de unión se llevaron a cabo en presencia y ausencia de seroalbúmina, determinando si la unión a albúmina interfiere con unión de anticuerpos a A\beta. La capacidad de anticuerpo anti-A\beta monoclonal 5A11 purificado para unir ^{125}I-A\beta_{1-40} no se afectó por la presencia de seroalbúmina humana (HSA) a 60 mg/ml, aunque esto fue un exceso molar de 500 veces por encima de la concentración de anticuerpo (Tabla 3). Estos resultados indican que la capacidad de los anticuerpos para unir y secuestrar A\beta en la sangre no estará atenuada por la presencia de otras proteínas de unión.

TABLA 3 Unión de ^{125}I-A\beta_{1-40} en la Presencia de Seroalbúmina Humana

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Producción de Anticuerpos Monoclonales

Un ratón se inmunizó con un conjugado de KLH del péptido de la región central A\beta_{10-25}. (Este antígeno peptídico tuvo un análogo de estado de transición de fenilalanina estatina a un enlace amida, discutido adicionalmente en la sección II, más adelante). Se llevó a cabo una fusión de hibridoma y los anticuerpos monoclonales resultantes se analizaron para caracterizar la especificidad de la respuesta inmune a la vacuna. Los sobrenadantes de hibridoma producidos en la fusión se examinaron usando ELISA para valorar su unión al péptido A\beta_{1-43}.

Los anticuerpos monoclonales producidos se determinaron uniendo al péptido A\beta_{1-43} adsorbido directamente sobre una placa de ELISA. Las reacciones de color fuertes se obtuvieron en este ELISA usando sólo 10 \mul de sobrenadante de hibridoma mientras que la adición de medios sola produjo color precedente bajo. Estos resultados indican que los anticuerpos no sólo se unen al inmunógeno peptídico pequeño sino que son también reactivos con el A\beta_{1-43} de longitud total. De forma importante, los antígenos unidos al péptido A\beta libre de vehículo se adsorben directamente sobre placas de microvaloración, mostrando su especificidad por el péptido más que por el vehículo inmunógeno. La afinidad alta de anticuerpo monoclonal 5A11 (Tabla 3) se obtuvo a partir de esta fusión de hibridoma.

Un segundo ratón se inmunizó con un conjugado de KLH del análogo de A\beta_{35-43} que comprende la región C-terminal de A\beta. Se examinó suero del ratón por reacción con A\beta_{1-43} adsorbido directamente sobre los pocillos de ELISA. Los resultados del ensayo se presentan en Tabla 4. El bazo de este ratón se usó después para un hibridoma de fusión caracterizando adicionalmente la especificidad de su respuesta inmune. De forma importante, ninguno de los ratones inmunizados con vacunas A\beta o de los ratones que producen ascitis anti- A\beta presentaron efectos de la enfermedad aunque algunos de aquellos anticuerpos inducidos reaccionaron de forma cruzada con A\beta de ratón y con proteína precursora amiloide de ratón.

TABLA 4 ELISA para Unión de Antisuero Dirigido al Péptido A\beta Carboxiterminal

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Se examinaron anticuerpos monoclonales de clones de hibridoma generados anteriormente para unión del péptido A\beta_{35-43} carboxiterminal pequeño y del péptido de longitud total A\beta_{1-43}. Los resultados se presentan en figura 5. Los anticuerpos monoclonales unidos al lugar geométrico carboxiterminal en cada uno de estos péptidos A\beta libres de vehículo se adsorbieron directamente a la placa de microvaloración, confirmando su especificidad por el péptido más que por el vehículo inmunógeno. Los clones se probaron también con A\beta_{1-40} identificando anticuerpos que no reaccionan con esta versión de 40 residuos de aminoácido, acortada, de A\beta y así se unirán específicamente al extremo carboxiterminal de A\beta_{1-43} (Fig. 5). Usada terapéuticamente, esta vacuna provocaría anticuerpos que se unirán preferentemente a la especie de A\beta_{1-43} menos abundante, pero más nociva en la sangre a diferencia de la menor y menos perjudicial especie de A\beta_{1-40}.

En un experimento separado, los ratones se inmunizaron con una vacuna que consta de un cóctel de tres antígenos KLH-péptidos distintos (Figuras 2-4) que representan las regiones distintas de \beta-amiloide (Fig. 1). Los ratones control se inmunizaron solo con KLH. Los antígenos se emulsionaron en coadyuvante de Freunds completo antes de la primera inyección y en coadyuvante de Freund incompleto para inyecciones subsiguientes. Las pruebas se llevaron a cabo en suero diluido de estos ratones inmunizados con A\beta-KLH determinando la presencia de anticuerpos anti-A\beta específicos. Los péptidos A\beta_{1-16}, A\beta_{14-25}, A\beta_{34-43}, A\beta_{1-40}, y A\beta_{1-43} se usaron identificando especificidad de anticuerpos. Los péptidos se adsorbieron directamente sobre una placa de ELISA. Los resultados se presentan en la Tabla 5. Los resultados indican que ratones inmunizados con el cóctel de los antígenos de tres péptidos produjeron suero que contenía anticuerpos que reaccionan con los péptidos aminoterminal, de la región central y carboxiterminal, así como con el A\beta de longitud total de 40-mer y con el A\beta de longitud total de 43-mer. La presencia constante de este espectro de anticuerpos anti-A\beta será muy efectiva en unir todo el A\beta soluble en la circulación periférica de un animal vacunado.

TABLA 5 ELISA para Medir los Anticuerpos de Suero Presentes en Ratones Inmunizados

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Ensayos de Vacunas en Primates No Humanos

Dada la importancia potencial de terapia de vacuna de \beta-amiloide para pacientes humanos de enfermedad de Alzheimer, se ha probado una preparación de vacuna de péptidos A\beta basada en alumbre en primates no humanos. La producción de anticuerpos y los estudios de seguridad para las vacunas de \beta-amiloide compatibles con seres humanos han comenzado en monos macacos cangrejeros (Macaca fascicularis). Este sistema animal es altamente relevante para aplicaciones humanas dado que la secuencia de aminoácidos predicha de \beta-amiloide en estos primates es idéntica que en humanos, y su fisiología básica y sus sistemas inmunes se aproximan mucho a aquellos que se encontrarán en una situación clínica. Los monos macacos cangrejeros se vacunaron mensualmente y se sangraron periódicamente haciendo seguimiento de los niveles de anti-A\beta en el suero. Los monos se observaron también para cualesquiera efectos morbosos.

Los monos macacos cangrejeros montaron una respuesta inmune fuerte hacia una inyección individual de la preparación de vacuna más simple compuesta del péptido amiloide de longitud total adsorbida sobre un gel de hidróxido de aluminio. La especificidad de aquellos anticuerpos anti-\beta-amiloide tempranos se caracterizó mediante ELISA usando diversos fragmentos de péptido A\beta (Tabla 6). Este análisis indicó que los monos produjeron anticuerpos que se unen al péptido de longitud total y reaccionan con sus regiones aminoterminal, central y carboxiterminal.

TABLA 6 ELISA para Medir los Anticuerpos de Suero Presentes en Macaca fascicularis Vacunados con A\beta

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De forma importante, los monos vacunados están perfectamente sanos y parecen compatibles con los anticuerpos anti-A\beta que han estado circulando en su cuerpo durante por encima de tres meses. Hasta ahora, no hay efectos secundarios patentes debidos a reacción cruzada de los anticuerpos anti-A\beta con proteína precursora de \beta-amiloide que se da en la naturaleza u otros componentes vitales. Estos animales se observaron de cerca por un veterinario, y no han presentado ningún signo de enfermedad autoinmune, enfermedad de complejo inmune o cualquier otra reacción adversa/tóxica a la vacunación.

En experimentos que continúan se llevarán a cabo inyecciones de refuerzo como por procedimientos usuales. Los sueros producidos se someterán a seguimiento para especificidad de anticuerpos y parámetros de afinidad según la respuesta inmune se intensifica y madura. En la terminación, se llevarán a cabo una necropsia completa y un examen histopatológico en los monos. Se evaluarán también vacunas de A\beta modificado por ingeniería genética, discutido más adelante, en los monos macacos cangrejeros para determinar si probarán ser incluso mejores inmunógenos.

Los Anticuerpos Afectan la Distribución de ^{125}I-A\beta en Ratones Normales

Los anticuerpos anti-A\beta en la circulación no pueden cruzar la barrera hematoencefálica en un grado significativo y por lo tanto actuarían como un reservorio que evita que ^{125}I-A\beta_{1-40} alcance el cerebro. Este efecto de retención se demostró midiendo los niveles sanguíneos en ratones 4 horas después de inyectarlos con cantidades iguales de ^{125}I-A\beta_{1-40} bien solo o bien junto con nuestro anticuerpo monoclonal 5A11 anti-A\beta (Tabla 7). El paso de ^{125}I-A\beta_{1-40} fuera de la circulación periférica se restringió grandemente en animales que recibieron concomitantemente el anticuerpo anti-A\beta específico. Ese hallazgo amplia los resultados in vitro obtenidos con el anticuerpo 5A11 (Tabla 3) demostrando que el anticuerpo puede unir de forma efectiva A\beta en un animal experimental. La observación de que los animales tratados con este anticuerpo retuvieron 10 veces más ^{125}I-A\beta_{1-40} en la circulación indica que la distribución en el equilibrio de A\beta en el cuerpo puede alterarse dramáticamente mediante secuestro selectivo en la sangre.

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TABLA 7 El Anticuerpo Anti-A\beta Impide el Paso de ^{125}I-A\beta_{1-40} Fuera de la Circulación

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Vacunas Modificadas Genéticamente

Las vacunas de antígeno \beta-amiloide modificadas mediante ingeniería genética para usar en seres humanos se están desarrollando actualmente con el fin de inducir niveles protectores de anticuerpos anti-\beta-amiloide. Se modificarán fragmentos de \beta-amiloide en vacunas de A\beta quiméricas que incorporan restos de vehículo altamente inmunógenos para incrementar la respuesta antigénica apropiada en un paciente humano. Los motivos transportadores adecuados para uso incluyen toxoide de difteria (DT) y el antígeno nuclear de la hepatitis B (HBcAg). Estos representan sistemas de administración poderosos para péptidos \beta-amiloides, y se conocen por inducir una respuesta inmune excelente, de valoración alta cuando se usan con alumbre como un coadyuvante.

DT está autorizado para usarse como una vacuna conjugada para H. influenzae de tipo B y vuelve a este inmunógeno dependiente de células T. La expresión de DT en E. coli recombinante es alta. Uno o más de los péptidos \beta-amiloides anteriormente descritos se fusionará en el extremo C-terminal del dominio catalítico de DT, o en cada extremo de dominios de unión de transmembrana/receptor combinados de DT. Las fusiones producidas se usarán con un coadyuvante de gel de hidróxido de aluminio para generar vacunas potentes.

Las valoraciones altas de anticuerpos dirigidos contra epitopes heterólogos se han producido usando los sistemas de administración de HBcAg y el coadyuvante de gel de hidróxido de aluminio. HBcAg tiene varias ventajas distintas como un compañero de fusión de péptidos de A\beta. El sitio interno inmunodominante entre los aminoácidos 75 y 81 puede acomodar secuencias heterólogas hasta 45 aminoácidos. El núcleo se autoensambla dentro de partículas más grandes que 27 nm que son altamente inmunógenas. Además HBcAg puede producirse en E. coli recombinantes a niveles elevados.

Las vacunas modificadas mediante ingeniería genética producidas se probarán para su efectividad en placas de reducción o evitación usando ratón y otros modelos animales relevantes. La producción de anticuerpos y los ensayos de seguridad para las vacunas se llevarán a cabo en monos macacos cangrejeros.

Procedimientos de la Invención

Síntesis peptídica. El A\beta_{1-40} de 40-mer, el A\beta_{1-43} de 43-mer, y los tres péptidos A\beta pequeños A\beta_{1-16}, A\beta_{10-25}, y A\beta_{35-43}, se sintetizaron mediante química de Fmoc automatizada estándar. Los péptidos sintetizados recientemente se purificaron mediante HPLC y su composición se verificó mediante análisis de espectro de masas y de aminoácidos. El A\beta de 43-mer se obtuvo a partir de una fuente comercial (Bachem, Torrance, CA).

Conjugación de Péptidos \beta-Amiloides a Inmunógeno

Vehículos. Los péptidos A\beta pequeños se unieron a la proteína transportadora de KLH con el fin de volverla antigénica. Un residuo en Cys se situó estratégicamente en el extremo N o C-terminal de estos péptidos A\beta proporcionando un grupo de enlace acoplado para acoplarlos por medio de un enlace tioéter a proteínas vehículo activadas por maleimida. Este enlace es estable y une el péptido en una orientación definida. La adición de \sim20 péptidos/KLH se obtiene típicamente mediante este procedimiento de conjugación. Se unieron los péptidos A\beta de longitud total, más largos, a proteínas vehículo usando un procedimiento de acoplamiento con glutaraldehído.

Cóctel de Antígenos \beta-amiloides. Los tres péptidos A\beta mostrados en las Figuras 2-4 se conjugaron individualmente cada uno a KHL. 20 \mug de cada uno de estos tres conjugados se mezclaron después de forma conjunta. Esta mezcla se emulsionó con coadyuvante de Freunds y se inyectó por vía intraperitoneal en ratones. Inyecciones de refuerzo por vía intraperitoneal mensuales subsiguientes usaron la misma mezcla de cóctel emulsionada en coadyuvante incompleto de Freunds. Los ratones control recibieron un protocolo de inmunización similar pero usando KLH que no se hubo conjugado con los péptidos A\beta.

Inmunización de Ratones. Se inmunizaron ratones BALB/c normales mediante procedimientos estándar con las vacunas de A\beta unidas a KLH descritas anteriormente. Brevemente, se inyectaron ratones por vía intraperitoneal con antígeno emulsionado en coadyuvante de Freunds completo, seguido por una segunda ruta en coadyuvante de Freunds incompleto. Los ratones se reforzaron por vía intravenosa con antígeno en PBS tres días antes de sangrarlos o de retirar el bazo para fusiones de hibridomas para producir anticuerpos monoclonales.

Ninguno de los ratones inmunizados con vacunas de A\beta o los ratones que producen ascitis anti-A\beta presentan efectos morbosos aunque algunos de los anticuerpos reaccionaron de forma cruzada con A\beta de ratón y con proteína precursora de amiloide de ratón.

ELISA. La presencia de anticuerpos antipéptido unidos se reveló usando una sonda de IgG antirratón marcada con peroxidasa seguida por el sustrato cromogénico (Engvall y col., Immunochemistry 8: 871-875 (1971)).

Ensayo de Unión. Tanto A\beta_{1-43} como A\beta_{1-40} se marcaron radiactivamente con ^{125}I. El péptido yodado se separó del material no marcado mediante HPLC dando esencialmente actividad específica cuantitativa (\sim2000 Ci/mmol) (Maggio y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 5462 (1992)). Se incubó la sonda ^{125}I-A\beta_{1-43} durante 1 hora a 23ºC con medios de hibridoma tomados a partir de clones de hibridoma que producen anticuerpos anti-A\beta monoclonales. Se usó un procedimiento de separación estándar de polietilenoglicol detectando la cantidad de ^{125}I-A\beta_{1-43} unido a anticuerpo.

Vacunas de \beta-amiloide para Primates. El inmunógeno usado era un péptido A\beta sintético que comprende aminoácidos 1-41 de la proteína A\beta. Este péptido se purificó mediante HPLC y se secó por congelación y después se resuspendió en agua estéril a una concentración de 1,5 mg/ml. La vacuna se preparó mezclando 7,5 ml de un coadyuvante de gel de hidróxido de aluminio al 2% (Alhydrogel, Superfos Biosector, Dinamarca), referido en el presente documento como gel de aluminio, con 7,5 ml del péptido. Las pruebas mostraron que todo el péptido se adsorbió al gel de alumbre, con 7,5 ml del péptido. Las pruebas mostraron que todo el péptido se adsorbió al gel de alumbre después de mezclar durante 12 horas a 25ºC.

Los monos se vacunaron inicialmente mediante inyección intramuscular (i.m.) de 0,5 ml del péptido con alumbre adsorbido. Se administró una segunda vacunación (refuerzo) de la misma preparación de vacuna (0,5 ml) un mes más tarde. Se darán inyecciones mensuales idénticas subsiguientes (refuerzos) hasta que se termine el experimento.

Vacunas Modificadas por Ingeniería Genética. Los restos de vehículo altamente inmunógeno se usarán construyendo vacunas quiméricas de A\beta. Los restos usados incluirán toxoide de difteria (DT) y el antígeno nuclear de la hepatitis B (HBcAg). El sistema de expresión de HBcAg se utilizará (Schodel y col. Infect. and Immun. 57: 1347-1350 (1989); Schodel y col., J. of Exper. Med. 180: 1037-1046 (1994); Schodel y col., J. of Virology 66: 106-114 (1992); Millich y col. Annals New York Academy of Sciences: 187-201 (1993)). El extremo aminoterminal del dominio catalítico de HBcAg tiene una secuencia señal que permitiría a la proteína de fusión secretarse dentro del medio de cultivo. El medio de cultivo se concentrará usando un dispositivo de ultrafiltración de Amicon grande, y el concentrado se cromatografió después en una columna de Superdex 75 grande. Los productos recombinantes obtenidos a partir del interior de células lisadas se separarán de las proteínas bacterianas usando una combinación de intercambio iónico y de FPLC de exclusión por tamaño.

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Sección II

Obtener anticuerpos monoclonales con antígenos de estado de transición Antígenos peptídicos del estado de transición

Se sintetizaron diferentes tipos de antígenos peptídicos del estado de transición para usar en la generación de anticuerpos que reconocen preferencialmente (hidrólisis) estados de transición de A\beta en una posición de enlace amida predeterminada.

Se sintetizó una serie de análogos (Sta) del estado de transición que abarcan la región carboxiterminal de A\beta (Cys-Met-Val-Gly-Gly-Val/Sta-Val/Sta-Ile/Sta-Ala-Thr). El reemplazo del enlace peptídico escindible propuesto entre Val_{39} y Val_{40}, Val_{40} e Ile_{41}, e Ile_{41} y Ala_{42}, con un resto "estatilo" (-CHOH-CH_{2}-CO-NH-) se diseñó obteniendo anticuerpos catalíticos que escinden hidrolíticamente A\beta en uno de estos sitios (Fig. 6). Un resto de Cys se situó en la posición N-terminal de estos péptidos proporcionando un grupo de enlace adecuado para acoplamiento con una proteína transportadora activada por maleimida.

Se sintetizó una serie de análogos de estado de transición (PhSta) de fenilalanina estatina (PhSta) que abarcan la región central de A\beta (Cys-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe/PhSta-Phe/PhSta-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-amida) en este laboratorio.

El reemplazo del enlace peptídico escindible propuesto entre Phe_{19} y Phe_{20}, y entre Phe_{20} y Ala_{21}, con un resto estatilo (-CHOH-CH_{2}-CO-NH-) se diseñó obteniendo anticuerpos catalíticos que escinden hidrolíticamente A\beta en uno de estos sitios (Fig. 7). Un resto de Cys se situó en el extremo C-terminal de estos péptidos proporcionando un grupo de enlaces sulfhidrilo acoplando los péptidos a proteínas transportadoras antigénicas, activadas con maleimidas tales como KLH.

Se hizo una comparación estructural (Fig. 8) entre el péptido A\beta nativo y el péptido A\beta de fenilalanina estatina usando una estación de trabajo de gráficos. Un algoritmo de minimización de energía (2000 iteraciones) se aplicó disponiendo cada péptido en la conformación más favorable.

El enlace peptídico (-CO-NH-) entre Phe_{19} y Phe_{20} se reemplazó con un resto "estatilo" (-CHOH-CH_{2}-CO-NH-) y se aplicó una minimización de energía. Esta orientación muestra la diferencia entre el enlace peptídico plano (-CO-NH-) de A\beta natural (izquierda) contra el resto de "estatilo" tetraédrico, prolongado (-CHOH-CH_{2}-CO-NH-) en el péptido del estado de transición (derecha).

Un anticuerpo que combina sitio complementario a un análogo de estado de transición de estatina tetraédrica forzará el enlace peptídico plano del sustrato de A\beta en una conformación similar al estado de transición. Tal distorsión catalizaría la escisión de A\beta en esa posición en la secuencia peptídica.

Se exploró también la posibilidad de usar un enlace peptídico reducido para imitar el estado de transición durante la hidrólisis de un enlace amida. Una unión de enlace peptídico reducido se puede situar fácilmente en casi cualquier sitio en la molécula de A\beta para producir un análogo de estado de transición de enlace peptídico reducido. Este análogo se puede usar también para obtener anticuerpos catalíticos que escindirán hidrolíticamente A\beta en el sitio elegido. El análogo de A\beta de estado de transición de enlace peptídico reducido fabricado fue el péptido de la región central (Gln-Lys-Leu-Val-Phe-CH_{2}-NH_{2}^{+}-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Cys-amida); [calculado 1,342 (M+1); observado 1,344].

Se hizo una comparación estructural (Fig. 9) entre el péptido de A\beta nativo y el análogo de A\beta de estado de transición de enlace peptídico reducido usando una estación de trabajo de gráficos. El enlace peptídico (-CO-NH-) entre Phe_{19} y Phe_{20} se reemplazó con un enlace peptídico reducido (-CH_{2}-NH_{2}^{+}-) y se aplicó minimización de energía. La orientación mostrada indicó la diferencia entre el enlace peptídico plano (-CO-NH-) de A\beta natural (izquierda) frente al resto tetraédrico correspondiente (-CH_{2}-NH_{2}^{+}-) en el análogo del estado de transición de enlace peptídico reducido (derecha). Se aplicó un algoritmo de minimización de energía (2000 iteraciones) disponiendo cada péptido en la conformación más favorable.

Se ha sintetizado también un análogo de estado de transición de fosfonamidato de la región carboxiterminal de A\beta (Fig. 10). Se diseñó reemplazo del enlace peptídico escindible propuesto entre Gly_{38} y Val_{39} con un resto fosforamidato (-PO_{2}^{-}-NH-) obteniendo anticuerpos catalíticos que escindirán hidrolíticamente A\beta en este sitio. El residuo de N-acetil-Cys se situó en la posición de Leu_{34} proporcionando un grupo de enlace adecuado acoplando este péptido a un proteína transportadora antigénica. Las estructuras en la figura 11 representan el estado de transición teórico para hidrólisis de péptidos mediante peptidasas de cinc, frente a estructura de y los imitadores de fosfonato y fosfonamidato. Los intermedios de estado de transición tetraédrico similar se conocen por formarse mediante reacción con cada una de las cuatro clases de enzimas proteolíticas, las serina-peptidasas, cisteína-peptidasas, aspártico-peptidasas y metalopeptidasas.

Se hizo una comparación estructural entre el péptido A\beta nativo y el péptido A\beta fosforamidato en el estado de transición (Fig. 12) usando una estación de trabajo de gráficos. El enlace peptídico (-CO-NH-) entre Gly_{38} y Val_{39} se reemplazó con un enlace fosfonamidato (-PO_{2}^{-}-NH-) y se aplicó una minimización de energía. La orientación mostrada en Figura 12 ilustra la diferencia entre el enlace peptídico plano (-CO-NH-) de A\beta nativo (izquierda) frente al enlace fosfonamidato tetraédrico (-PO_{2}^{-}-NH-) correspondiente en el péptido del estado de transición (derecha).

Un sitio de combinación de anticuerpos complementario con el análogo de estado de transición tetraédrica en la derecha de la Fig. 12, forzará el enlace normalmente plano del péptido de sustrato de A\beta en la izquierda dentro de una conformación similar al estado de transición. Tal distorsión de enlace se espera que catalice la escisión hidrolítica del péptido A\beta en el enlace Gly_{38}-Val_{39}.

Inmunización con Antígenos Peptídicos en el Estado de Transición

Los antígenos peptídicos se acoplaron al vehículo inmunógeno KLH antes de inmunización de ratones. Se usaron protocolos estándar inmunizando ratones BALB/c con los péptidos de A\beta unidos a KLH descritos en las secciones precedentes. Brevemente este procedimiento usó inyección por vía intraperitoneal de los diferentes antígenos emulsionados en coadyuvante de Freunds completo, seguida por una segunda ruta en coadyuvante de Freunds incompleto. Tres días antes de fusión de hibridoma, los ratones BALB/c se reforzaron por vía intravenosa con antígeno en PBS.

Se llevó a cabo una fusión de hibridoma usando el bazo de un ratón inmunizado bien con una mezcla de los antígenos del estado de transición de fenilalanina estatina generados (Figura 7), bien con una mezcla de los antígenos de A\beta del estado de transición de estatina (Sta) generados (Figura 6), bien con antígeno de A\beta del estado de transición del enlace peptídico reducido generado (imitador del estado de transición situada entre Phe_{19}- Phe_{20}), o bien con antígeno de A\beta del estado de transición de fosforamidato generado (imitador del estado de transición situada entre Gly_{38}-Val_{39}). Los anticuerpos monoclonales enumerados en la Tabla 8 se generaron a partir de estos ratones.

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TABLA 8

8

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Demostración de Unión de A\beta mediante Anticuerpos Generados

Fue muy importante demostrar que los anticuerpos monoclonales anti-A\beta y anti-estado de transición de A\beta se unieron al péptido A\beta_{1-43} natural para el que se diseñaron para secuestrarlo o escindirlo. Para hacer esto, se marcaron radiactivamente A\beta_{1-40} y A\beta_{1-43} con ^{125}I y el péptido yodado se separó del material no marcado mediante HPLC. La sonda se incubó bien con anticuerpos anti-A\beta purificados o bien con medios tomados de clones de hibridoma que producen anticuerpos anti-A\beta. La cantidad de ^{125}I-A\beta_{1-43} unida a anticuerpo se determinó usando un procedimiento de separación de polietilenoglicol. Los resultados del experimento se presentan en la Tabla 3.

Los datos en la Tabla 3 demostraron la capacidad del anticuerpo anti-A\beta monoclonal 5A11 para unir un alto porcentaje de ^{125}I-A\beta_{1-40}. Este ensayo de unión se usó examinando clones y anticuerpos purificados (Tabla 3) por su capacidad para unir A\beta. Procedimientos similares pueden servir también como la base para un ensayo de desplazamiento para medir la fuerza de unión relativa de péptidos A\beta no marcados diferentes. (Nota: con anticuerpos catalíticos muy eficientes este ensayo de unión se puede haber llevado a cabo en hielo para asegurar que no ocurre ninguna escisión de A\beta durante la 1 hora de tiempo de incubación). El ensayo identificó rápidamente clones que producen anticuerpos anti-A\beta de alta afinidad.

Los anticuerpos monoclonales de hibridomas obtenidos usando el antígeno A\beta-KLH del estado de transición de fenilalanina estatina se examinaron mediante ELISA valorando su unión tanto al péptido A\beta_{1-43} normal como al péptido A\beta del estado de transición. Se encontraron dos patrones principales (Fig. 13).

Un grupo de anticuerpos (la parte izquierda de la Fig. 13) se unió al péptido de estado de transición que inmuniza y se sometió a reacción cruzada fuertemente con el péptido A\beta_{1-43} nativo (se adsorbió cada uno directamente sobre la placa de ELISA). El segundo grupo (la parte derecha) mostró una preferencia de unión alta por el péptido A\beta del estado de transición de fenilalanina estatina y se hizo reaccionar mínimamente con A\beta_{1-43}.

Las reacciones de color fuertes se obtuvieron en este ELISA usando sólo 10 \mul de sobrenadante de hibridoma mientras que los medios de hibridoma solos o PBS dieron un antecedente bajo (Fig. 13). Estos resultados demostraron que el examen con ELISA comparativo, aunque sólo proporciona una medida semicuantitativa de unión, proporciona un medio para identificar anticuerpos monoclonales que son altamente selectivos para, y lo más reactivos con, el estado de transición. De forma importante, el experimento se llevó a cabo con péptidos A\beta libres de vehículo adsorbidos directamente en placas de microvaloración, indicando especificidad de anticuerpo para péptido A\beta más que para el vehículo.

Estos hallazgos indicaron que varios de los anticuerpos del estado de transición anti-A\beta generados eran únicos. Se unieron tanto a los péptidos de fenilalamina estatina-A\beta como a los péptidos normales-A\beta. Su reconocimiento selectivo del estado de transición y su reacción cruzada más débil con A\beta_{1-43} nativo sin embargo indican que su interacción de unión es muy diferente de aquella mostrada por anticuerpos anti-A\beta nativo convencionales. Esto indica adicionalmente que estos anticuerpos nuevos pueden ser capaces de forzar al péptido nativo A\beta dentro de una conformación que se parece al estado de transición para escisión hidrolítica. De forma importante algunos de los anticuerpos que mostraron sólo unión mínima a A\beta_{1-43} en este ELISA, presentarán reactividad cruzada con el péptido natural usando un ensayo de unión a ^{125}I-A\beta_{1-43} altamente sensible (Tabla 3).

Se llevaron a cabo también ELISA para investigar la unión de anticuerpos anti-análogos de estatina tanto al péptido A\beta_{1-43} normal como al péptido A\beta de estado de transición de estatina (Figura 14). Los anticuerpos unidos a la posición C-terminal de estos péptidos A\beta libres de transportador (adsorbidos directamente a la placa de microtitulación) confirmaron su especificidad anti-péptido. La mayoría de los anticuerpos reconoció preferencialmente el estado de transición de A\beta de estatina, pero reaccionaron de forma cruzada con A\beta_{1-43} nativo. Esto indica que estos anticuerpos nuevos son capaces de forzar al péptido nativo A\beta dentro de una conformación que se parece al estado de transición para escisión hidrolítica de sus aminoácidos C-terminales. Tal escisión se predice para convertir A\beta_{1-43} en péptidos más cortos potencialmente menos dañinos, como A\beta_{1-40} o A\beta_{1-39}.

El clon 11E9 tuvo la preferencia más fuerte por el análogo de estatina y puede ser el más probable para cambiar la actividad catalítica (Fig. 14). Diversos clones no presentaron ninguna diferencia en su reactividad con el péptido A\beta nativo frente al péptido A\beta del estado de transición de estatina. Los clones se probaron también con A\beta_{1-40} identificando anticuerpos que no reaccionan con esta versión de 40 aminoácidos, acortada, de A\beta (Fig. 14). Usados terapéuticamente, tales anticuerpos unirían/escindirían de forma preferente la especie A\beta_{1-43} menos abundante, pero más nociva en la sangre opuesta a la menor y menos perjudicial A\beta_{1-40}.

Ensayos Proteolíticos de A\beta de Fase Sólida y TLC

Un ensayo de A\beta marcado con ^{125}I de fase sólida se desarrolló examinando sobrenadantes de hibridoma de anticuerpos anti-estado de transición para actividad proteolítica específica. El péptido Cys-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Glu-Asp-Val-Gly-Tyr-amida (SEQ ID Nº.: 5) que abarca aminoácidos 14-25 de A\beta se marcó radiactivamente y se acopló a un gel reactivo con tiol, de yodoacetil-sefarosa formando un enlace irreversible. El producto se incubó con un anticuerpo anti-estado de transición y se ensayó para la liberación progresiva de péptido marcado con ^{125}I soluble a partir de la matriz de fase sólida. La liberación de radiactividad a partir de ^{125}I-A\beta-sefarosa se usó identificando actividad catalítica (Fig. 15). El ensayo se verificó mediante la capacidad de varias proteasas deferentes para hidrolizar rápidamente este sustrato de A\beta unido a Sefarosa. El péptido fue fácilmente accesible para escisión proteolítica como se revela mediante una liberación de péptido marcado con ^{125}I que se incrementa con el tiempo de incubación.

Los resultados presentados en Figura 15 indican que los medios que contienen anticuerpos de varios clones liberaron péptido marcado con ^{125}I a una velocidad mayor que otros clones a partir de esta fusión o los controles de medio de PBS y de medio de Hy. Se pueden obtener, purificar y probar grandes cantidades de estos anticuerpos a concentraciones más altas logrando velocidades mucho más rápidas de escisión y verificando que los anticuerpos están actuando en un modo catalítico usando cinéticas de enzimas convencionales. Cambiando la composición del péptido marcado con ^{125}I se puede usar esta misma estrategia para ensayar reactivos de anticuerpos con regiones diferentes
de A\beta.

Se ideó un ensayo de autorradiografía basado en cromatografía en capa fina para obtener evidencia más definitiva para escisión mediada por anticuerpos de A\beta. Los clones de estado de transición de A\beta de fenilalanina estatina seleccionados se expandieron e indujeron producción de ascitis. Los diferentes anticuerpos monoclonales se aislaron usando sefarosa de proteína A. Se usaron dos péptidos marcados, A\beta_{1-40} y uno de 17-mer, que comprende aminoácidos 9-25 de A\beta, para probar escisión de péptidos. Los anticuerpos se añadieron a los péptidos marcados con ^{125}I, se dejaron incubar y la mezcla de reacción se detectó sobre láminas de capa fina de poliamida que se desarrollaron en diferentes disolventes. La migración de productos marcados con ^{125}I se continuó exponiendo la lámina usando un sistema de fosfoimager cuantitativo. La cuantificación de los diferentes fragmentos peptídicos marcados producidos indicó que la adición de los anticuerpos a los péptidos A\beta condujo a rotura significativa de los péptidos A\beta comparados con los péptidos no tratados (PBS).

Disgregación de \beta-amiloide mediante Anticuerpos Monoclonales

La autoagregación de péptidos A\beta sintéticos se ha mostrado previamente conduciendo a estructuras microscópicas que se parecen a placas amiloides en el cerebro (Solomon y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 94: 4109-12 (1997); Solomon y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 93: 452-5 (1996)) que muestran la misma fluorescencia verde brillante hasta exposición a tioflavina T. Estos agregados son muy estables y usualmente requieren detergentes abrasivos o ácidos fuertes para disolverse. Sin embargo, se ha demostrado que la unión de ciertos anticuerpos monoclonales anti-A\beta puede inhibir de forma efectiva la agregación inicial de este péptido y también puede disgregar complejos de A\beta preformados (Solomon y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 94: 4109-12 (1997); Solomon y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 93: 452-5 (1996)).

Se usó un ensayo radiactivo examinando rápidamente los diferentes anticuerpos monoclonales producidos por los presentes experimentos para una capacidad de disolver los agregados de A\beta preformados, elaborados con péptido A\beta soluble marcado con ^{125}I y no marcado. Se incubó una alícuota del agregado marcado bien con PBS, bien con el anticuerpo 5A11 anti-A\beta o bien con una cantidad igual de un anticuerpo de ratón irrelevante (7D3, anti-receptor de transferrina humana), y el nivel de radioactividad liberada se midió subsiguientemente (Tabla 9). El anticuerpo 5A11 específico de A\beta solubilizó el 80% de los agregados de A\beta mientras que una cantidad igual del anticuerpo control tuvo sólo un efecto menor, sugiriendo que el equilibrio se desplazó por unión mediada por anticuerpos de A\beta soluble.

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TABLA 9 Solubilización de Agregado ^{125}I-A\beta_{1-40} mediante Anticuerpo Anti-A\beta_{1-40} Monoclonal

9

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Producción de Anticuerpos Biespecíficos Anti-A\beta/Anti-Receptor Vectorizados

Los anticuerpos anti-A\beta se unieron a anticuerpos receptores anti-transferrina (anti-TfR) que sirvieron como vectores para administración de los anticuerpos anti-A\beta dentro del cerebro. El anticuerpo monoclonal de ratón 7D3 se usó como la parte anti-TfR de la construcción. 7D3 es específica para el receptor humano e inmunotiñe selectivamente los capilares corticales en tejido cerebral humano normal (Recht y col., J. Neurosurg. 72: 941-945 (1990)). La unión del anticuerpo al receptor no se bloquea por un exceso de transferrina humana. El epitope reconocido por este anticuerpo está por lo tanto distante del sitio de unión de receptor-ligando. Los anticuerpos biespecíficos construidos con este anticuerpo 7D3 y un anticuerpo anti-A\beta se predicen para ser útiles para terapia en pacientes con enfermedad de Alzheimer.

Para estudios en modelos de ratón de enfermedad de Alzheimer se obtuvo un anticuerpo monoclonal de receptor de transferrina antirratón producido en la rata. Este anticuerpo también parece reconocer un epitope de receptor de transferrina que no implicará unión a ligando. El anticuerpo por lo tanto no tiene ningún efecto sobre proliferación celular cuando se usan líneas murinas.

Se llevó a cabo una serie de ensayos funcionales después de la completación de la síntesis, purificación y análisis de tamaño de los anticuerpos biespecíficos de receptor anti-A\beta/antitrasferrina. El anticuerpo biespecífico vectorizado, compuesto de un anticuerpo monoclonal de rata dirigido contra el receptor de transferrina de ratón más el anticuerpo monoclonal anti-A\beta 5A11 de ratón, se probaron para la capacidad de unirse a células de ratón que llevan receptor de transferrina. Se detectaron ambos componentes del anticuerpo biespecífico en la membrana celular mediante citofluorometría (Fig. 16) cuando este dúplex se hizo reaccionar con células de ratón positivas en receptor de transferrina y se investigó usando bien un reactivo anticuerpo secundario fluorescente específico de IgG de rata o bien un reactivo anticuerpo secundario fluorescente específico de IgG de ratón.

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La capacidad del reactivo híbrido para unir ^{125}I-A\beta se comparó favorablemente con aquella del anticuerpo anti-A\beta parental (Tabla 10).

TABLA 10 Unión de ^{125}I-A\beta a Anticuerpo Biespecífico

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Para asegurar que ambas de estas actividades de unión residen en el anticuerpo biespecífico, se trataron células positivas en receptor de transferrina con el reactivo híbrido, se eliminó por lavado el material no unido, y después las células con anticuerpo unido se expusieron a ^{125}I-A\beta_{1-40}. Después de eliminar por lavado A\beta no unido, la radiactividad unida a células se comparó con las células control que se habían preparado de forma idéntica excepto por omisión del pretratamiento con anticuerpo biespecífico. Los resultados se presentan en Tabla 11, y verifican la especificidad dual de este anticuerpo biespecífico mostrando claramente que se puede unir simultáneamente a la membrana celular y unir ^{125}I-A\beta_{1-40}.

TABLA 11 Unión Mediada por Anticuerpos Biespecíficos de ^{125}I-A\beta a células Positivas en Receptor

11

Transcitosis de Anticuerpo Biespecífico dentro del Cerebro

Se acopló un anticuerpo de receptor de transferrina antirratón monoclonal de rata a un anticuerpo monoclonal de ratón (obtenido a partir de American Type Culture Collection (ATCC TIB 219), también designado R17 217.1.3 (Cell. Immunol. 83: 14-25 (1984)), de tal forma que la entrada de esta nueva construcción biespecífica vectorizada en el cerebro pudo someterse a seguimiento. El anticuerpo biespecífico se marcó con ^{125}I y se inyectó por vía intravenosa dentro de ratones normales. Después de diferentes longitudes de tiempo los ratones se sacrificaron y la cantidad de anticuerpo biespecífico marcado con ^{125}I que cruzó la barrera hematoencefálica y entró en el cerebro se calibró mediante un procedimiento de depleción capilar de ratón (Friden y col., J. Pharm. Exper. Ther. 278: 1491-1498 (1996); Triguero y col., J. Neurochem. 54: 1882-1888 (1990)).

La cantidad de anticuerpo biespecífico vectorizado encontrado en el parénquima cerebral o fracciones capilares cerebrales se midió siguiendo centrifugación de densidad diferencial del homogenado cerebral. Estos valores se trazaron como una función del tiempo después de inyección intravenosa (Fig. 17). La redistribución dependiente del tiempo de anticuerpo biespecífico marcado radiactivamente a partir de los capilares y dentro del parénquima fue consistente con su paso a través de la barrera hematoencefálica endotelial cerebral (Joachim y col., Nature 341: 6239: 226-30 (1989)). Incluso se espera que ocurra acumulación mayor en el parénquima si los anticuerpos se unen a A\beta en las placas cerebrales del ratón que lleva placas.

Someter a Seguimiento la Distribución Cerebral de Anticuerpo Biespecífico en Ratones Vivos

La capacidad para seguir la entrada y acumulación de anticuerpos biespecíficos vectorizados en el cerebro de ratones vivos ayudará grandemente en el desarrollo del tratamiento de ratones portadores de placas. Un desarrollo tal permitiría estudios en el curso del tiempo y reduciría grandemente problemas con variabilidad inter-ratón. Los estudios preliminares con anticuerpos biespecíficos marcados con ^{125}I se llevaron a cabo determinando si la inmunoescintigrafía era factible en este sistema. Como una primera etapa, bien el anticuerpo biespecífico vectorizado marcado radiactivamente (^{125}I-R17/5A11) o bien un anticuerpo biespecífico control no vectorizado se administraron a ratones distintos. Las imágenes cerebrales secuenciales se acumularon a 1, 6, 24 y 48 horas tras administración intravenosa de las sondas de anticuerpos biespecíficos marcadas con ^{125}I. Aunque esta técnica sufrió de un dificultad en determinar cuanto de la señal se debía a los niveles de radiactividad llevada por la sangre que circulaba a través del cerebro, se destacaron distinciones significativas en el cerebro de ratones tratados con el anticuerpo biespecífico reactivo de receptor de transferina de ratón frente a aquellos que reciben el anticuerpo biespecífico control. Cuando se usó el agente vectorizado, los niveles cerebrales se incrementaron entre 1 y 6 horas y después declinaron a un nivel mucho más bajo a 24 y 48 horas. Los ratones tratados con el control no mostraron ningún incremento entre 1 y 6 horas. La razón para los niveles cerebrales disminuidos a 24 horas y de ahí en adelante no se conoce pero podría deberse a deshalogenación de las sondas de anticuerpo biespecífico de tal forma que se libera ^{125}I libre. Se pueden utilizar procedimientos alternativos que usen marcas radiactivas tales como ^{11}In (Sheldon y col., Nucl. Med. Biol. 18: 519-526 (1991)) o ^{99m}Tc (Texic y col., Nucl. Med. Biol. 22: 451-457 (1995)) unido al anticuerpo biespecífico vectorizado en futuros experimentos si el uso de yodo presenta un problema técnico. Esta tecnología de formación de imágenes será útil para determinar si anticuerpos biespecíficos vectorizados menores (por ejemplo F(ab')_{2}) con diferentes propiedades físicas y una biodistribución alterada penetrarán dentro del cerebro de forma más efectiva.

Heterodímeros F(ab')2 para Transporte Mediado por Vector dentro del Cerebro

La introducción de anticuerpos completos dentro del cerebro pudo ser perjudicial si eran para fijar complemento y promover la lisis mediada por complemento de las células neuronales. El desarrollo de reactivos biespecíficos de F(ab')_{2} vectorizados más pequeños se espera que evite este problema. Se ha mostrado que A\beta agregado por sí mismo puede fijar complemento en la ausencia de cualquier anticuerpo y que la inflamación resultante puede contribuir a la patología de la enfermedad de Alzheimer. La posibilidad de anticuerpo anticerebral que tiene un efecto similar se reduciría grandemente eliminando la reacción de Fc del anticuerpo. Además, dado que el acoplamiento de las mitades de Fab' usa las cisteínas de la región bisagra intrínseca, no se necesita añadir ningún grupo de unión a sustituyente ajeno.

La entrada más rápida o más eficiente dentro del cerebro representa otra ventaja potencial que reactivos F(ab')_{2} o Fv_{2} menores proporcionan para administración intracerebral. Tales agentes biespecíficos modificados se pueden preparar y comparar con anticuerpos híbridos de tamaño completo por su efectividad relativa en alcanzar el cerebro, cruzando la barrera hematoencefálica y afectando el desarrollo de placas de A\beta, mediante los procedimientos descritos en el presente documento. Es importante destacar, sin embargo, que sólo se encuentran diferencias menores cuando se comparó la capacidad de reactivos biespecíficos de receptor antitransferrina de tamaño diferente para administrar toxinas dentro de células mediante endocitosis mediada por receptor (Raso y col., J. Biol. Chem. 272: 27623-27628 (1997)). Esta observación podría indicar que se verán pequeñas variaciones para transcitosis a través de las células endoteliales de capilares del cerebro que forman la barrera hematoencefálica. Por lo menos sin embargo alguien esperaría que los dos tipos de moléculas vectorizadas tengan biodistribución diferente y características de semivida en el plasma diferentes (Spiegelberg y col., J. Exp. Med. 121: 323 (1965)).

Procedimientos de la Invención

Síntesis de Antígeno. Los péptidos del estado de transición de estatina y fenilalanina estatina se sintetizaron usando química de Fmoc automatizada. Se compraron comercialmente Fmoc-estatina (Sta), [ácido N-Fmoc-(3S,4S)-4-amino-3-hidroxi-6-metil-heptanoico] y Fmoc-"fenilalanina estatina" (PhSta), [ácido N-Fmoc-(3S, 4S)-4-amino-3-hidroxi-5-fenilpentanoico]. Cada péptido se probó para pureza mediante HPLC y su composición se verificó mediante análisis de espectro de masas y de aminoácidos.

La estrategia diseñada y los procedimientos para sintetizar péptidos de estado de transición basados en fosfonamidato y basados en fosfonato son sencillos (Bartlett y col., Am. Chem. Society 22: 4618-4624 (1983); Bartlett y col., Biochemistry 26: 8553-8561 (1987)). La parte N-terminal del péptido (N-acetil-Cys-Met-Val-Gly) se elaboró usando química de Fmoc automatizada estándar. Después de escisión a partir de la resina el N-acetil-tetrapéptido se trató con disulfuro de piridina protegiendo su grupo sulfhidrilo. Un cloruro ácido del éster de monometilfosfonato de Cbz-glicina (Bartlett y col., Am. Chem. Society 22: 4618-4624 (1983); Bartlett y col., Biochemistry 26: 8553-8561 (1987)) se acopló con Val-Val-Ile-Ala-amida que se sintetizó mediante química de Fmoc automatizada. El último aminoácido de A\beta, THr, se omitió debido a los problemas potenciales con su grupo hidroxilo desprotegido. El producto, Cbz-Gly-PO_{2}-NH-Val-Val-Ile-Ala-amida tiene un enlace fosfonamidato (éster metílico) entre los residuos Gly y Val. A continuación, el grupo bloqueante Cbz se retiró usando hidrógeno de tal forma que el péptido N-acetil-Cys-Met-Val-Gly se podría añadir al extremo aminoterminal de este péptido de estado de transición mediante enlace peptídico de HBTU activado. El tratamiento con mercaptoetanol y esterasa de hígado de conejo se usó desbloqueando el péptido. Cada componente clave en el sistema de síntesis se probó para pureza mediante HPLC y su composición se verificó mediante análisis de espectro de masas y de aminoácidos.

Una unión de enlace peptídico reducida se situó en los sitios indicados en la molécula de A\beta. Se usó química de Fmoc automatizada para comenzar la síntesis del péptido. Un aminoaldehído de Fmoc presintesitado se añadió después manualmente y después la imina se redujo, la síntesis automatizada se reanudó (Meyer y col., J. Med. Chem. 38: 3462-3468 (1995)).

Acoplamiento de Antígeno a Anticuerpo. Los péptidos A\beta de estado de transición se acoplaron a KLH activado con maleimida mediante procedimientos estándar (Partis y col., J. Pro. Chem. 2:263-277 (1983)), con el fin de provocar una respuesta inmune. Un residuo de Cys se situó específicamente en el extremo N - o C-terminal de los péptidos proporcionando un grupo de unión adecuado para acoplarlos por medio de un enlace tioéter a proteínas transportadoras de maleimida activadas. Esta unión estable une al péptido en una orientación definida. La adición de -20 péptidos/KLH se ha obtenido en base al contenido de aminoácidos del estado de transición según se determinó por análisis de aminoácidos de los hidrolizados conjugados (Tsao y col., Anal. Biochem. 197: 137-142 (1991)).

Inmunización de Ratones. Se usaron protocolos estándar inmunizando ratones con los péptidos A\beta unidos a KLH descritos en las secciones precedentes. Brevemente este procedimiento uso inyección intraperitoneal de los diferentes antígenos emulsionados en coadyuvante de Freunds completo, seguido por una segunda ruta en coadyuvante de Freunds incompleto. Tres días antes de la fusión del hibridoma, se reforzaron los ratones BALB/c por vía intravenosa con antígeno en PBS.

Después de 1 mes se suministró a los animales un refuerzo por vía intraperitoneal usando el antígeno emulsionado con coadyuvante incompleto. El suero de estos animales se analizó por anticuerpos anti-péptidos mediante ELISA. Los ratones BALB/c que mostraron producción de anticuerpos abundante se reforzaron mediante una inyección por vía intravenosa con antígeno y tres días más tarde se usaron generando clones de hibridoma que segregan anticuerpos monoclonales.

Ninguno de los ratones inmunizados con vacunas de A\beta o de los ratones que producen ascitis anti-A\beta mostraron efectos morbosos aunque algunos de esos anticuerpos inducidos reaccionan de forma cruzada con A\beta de ratón y proteína precursora de amiloide de ratón.

Producción de Hibridoma I. Se llevó a cabo una fusión de hibridoma usando el hígado de un ratón inmunizado con el antígeno A\beta-KLH de estado de transición de fenilalamina estatina. Las células del bazo de ratones con la valoración más alta se fusionaron con células NS-1 de mieloma de ratón estableciendo hibridomas de acuerdo con procedimientos estándar (Köler y col., Nature 256: 495 (1975); R. H. Kenneth, Fusion Protocols. Monoclonal Antibodies, eds. R. H. Kenneth, T.J. McKearn y K.B. Bechtol. Plenum Press, Nueva York, páginas 365-366 (1980)).

Ensayo de Unión de ^{125}I-A\beta. Se marcaron radiactivamente ^{125}I-A\beta_{1-43} y ^{125}I-A\beta_{1-40} con ^{125}I y el péptido yodado se separó después del material no marcado mediante HPLC dando actividad específica cuantitativa (\sim2000 Ci/mmol) (Maggio y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 5462-5466 (1992)). Esta sonda se incubó durante 1 hora a 23ºC bien con anticuerpos anti-A\beta purificados o bien con medios tomados de clones de hibridoma que producen anticuerpos anti-A\beta. Un procedimiento de separación de polietilenoglicol se usó detectando la cantidad de ^{125}I-A\beta_{1-43} unido a anticuerpo. Usando dilución en serie, este ensayo puede proporcionar afinidades de unión relativas para los diferentes sobrenadantes de hibridoma o anticuerpos purificados.

Ensayo Proteolítico de A\beta en Fase Sólida. Se desarrolló un ensayo de A\beta marcado con ^{125}I en fase sólida para examinar sobrenadantes de hibridoma de anticuerpos anti-estado de transición por actividad proteolítica específica. El péptido Cys-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Tyr-amida (SEQ ID Nº.: 5) que abarca aminoácidos 14-25 de A\beta se marcó radiactivamente con ^{125}I y el péptido yodado se separó después de material no marcado mediante HPLC. El péptido A\beta altamente radiactivo se acopló a un gel de yodoacetil-sefarosa, reactivo con tiol, formando una unión irreversible. Se añadieron anticuerpos al A\beta marcado, que se ensayaron para liberación progresiva de péptido marcado con ^{125}I soluble a partir de la matriz de fase sólida a pH 7, 25ºC. Este ensayo se verificó por la capacidad de varias proteasas diferentes en hidrolizar rápidamente este sustrato A\beta unido a sefarosa. La liberación de péptido marcado con ^{125}I soluble se incrementó con el tiempo de incubación.

Aunque A\beta se escindió mediante varias proteasas que se dan en la naturaleza, las pruebas preliminares indicaron que la interferencia de niveles altos de hidrólisis de antecedentes no fue un problema cuando se ensayaron sobrenadantes de hibridomas de clones que produjeron anticuerpos catalíticos. Una precaución adicional que se puede tomar contra proteasas exógenas es llevar a cabo todas las fusiones celulares de hibridomas y cultivar células en medios libres de suero.

Ensayo Proteolítico de TLC A\beta. Se usó una autorradiografía basada en cromatografía en capa fina para obtener evidencia más definitiva de escisión mediada por anticuerpos de A\beta. Se expandieron clones de estado de transición de A\beta de anti-fenilalanina estatina seleccionados e se indujo producción de ascitis. Los diferentes anticuerpos monoclonales se aislaron usando proteína A-sefarosa. El ensayo de escisión usó ^{125}I-A\beta_{1-40} y un 17-mer marcado con ^{125}I, comprendiendo aminoácidos 9-25 de A\beta. La unión de los dos péptidos marcados con ^{125}I a los anticuerpos monoclonales purificados 5A11 y 6E2 se examinó usando bien un ensayo de precipitación de PEG o bien mediante un procedimiento de co-electroforesis. La escisión de péptidos se probó añadiendo los anticuerpos a los péptidos marcados con ^{125}I, incubando y después detectando la mezcla de reacción sobre láminas de capa fina de poliamida. Los cromatógrafos se desarrollaron en diferentes disolventes (por ejemplo HCl 0,5 N, NaOH 0,5 N o tampón fosfato de pH 7) y se siguió la migración de productos de ^{125}I exponiendo la lámina usando un sistema de fosfoimager cuantitativo.

Examinar y Aislar Anticuerpos Anti-A\beta Seleccionados. Se usó un ELISA para examinar inicialmente anticuerpos monoclonales anti-A\beta y anti-péptido A\beta de estado de transición. Tanto el péptido de estado de transición como el péptido A\beta natural correspondiente se adsorbieron sobre placas de microvaloración distintas. Los sobrenadantes de hibridoma se examinaron usando dos ensayos de tal manera que la unión relativa tanto a péptidos nativos como a péptidos A\beta de estado de transición se pudo cuantificar. Los clones que producen anticuerpos monoclonales que reconocen preferencialmente el estado de transición o A\beta unido con alta afinidad se seleccionaron para expansión y estudio adicional.

Propagación y Purificación de Anticuerpos Monoclonales. Los clones seleccionados que producen anticuerpos anti-A\beta y los clones que producen anticuerpos antirreceptor se inyectaron en ratones cebados con pristano distintos. Se recogió la ascitis y se aislaron los anticuerpos monoclonales específicos. La purificación de anticuerpos a partir de ascitis se llevó a cabo usando una columna de Proteína A o alternativamente, los anticuerpos se aislaron del fluido de ascitis mediante precipitación de (NH_{4})_{2}SO_{4} y paso por una columna S-300 obteniéndose la fracción de inmunoglobulina de 150 KDa. Los fragmentos Fab monovalentes se prepararon y aislaron mediante procedimientos establecidos. Su pureza se evaluó mediante SDS-PAGE bajo condiciones reductoras y no reductoras. Se obtuvieron rutinariamente 50-100 mg de anticuerpo monoclonal purificado de cada ratón portador de ascitis.

Caracterización Adicional de Actividad Catalítica en Sustratos de A\beta. Para definir plenamente las propiedades hidrolíticas de los anticuerpos anti-estado de transición se deben hacer funcionar algunos controles muy importantes. Primero se puede verificar la capacidad para bloquear completamente la actividad de anticuerpos catalíticos con el péptido de estado de transición apropiado. Este "inhibidor" no escindible se uniría mucho más estrechamente a los sitios de combinación del anticuerpo y de este modo evitaría unión o escisión de sustrato. La especificidad de sustrato se puede establecer adicionalmente no mostrando ninguna escisión de un péptido A\beta fingido que tenga una secuencia de aminoácidos diferente. Los productos de hidrólisis se pueden caracterizar adicionalmente por HPLC, análisis de aminoácidos y análisis de espectro de masas. Los anticuerpos control que no están dirigidos contra el A\beta de estado de transición se pueden probar y se puede confirmar que no producen ninguna catálisis. Finalmente, se puede mostrar que la actividad catalítica reside en los fragmentos de Fab purificados del anticuerpo anti-estado de transición.

Los Anticuerpos Anti-A\beta Purificados Disuelven Agregados de A\beta. (Walker y col., Soc. Neurosci. Abstr. 21: 257 (1995), Zlokovic, B.V., Life Sciences 59: 1483-1497 (1996)). Los precipitados de A\beta se formaron y midieron in vitro (Yankner y col., Science 250: 279-282 (1990), Kowall y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 7247-7251 (1991)). Se usó un ensayo radiactivo examinando rápidamente los diferentes anticuerpos monoclonales producidos por una capacidad para disolver los agregados de A\beta preformados. Después de añadir ^{125}I-A\beta a péptido soluble no marcado, se formaron agregados llevando la solución a pH 5 o agitándola durante toda una noche en PBS. Se incubó una alícuota del agregado marcado durante 1 hora bien con PBS, bien con el anticuerpo anti-A\beta 5A11 o bien con una cantidad igual de un anticuerpo de ratón irrelevante (7D3, receptor de transferrina antihumana). Después de centrifugación, se midió el nivel de radiactividad en el precipitado.

Generación de Anticuerpos Biespecíficos Anti-A\beta/Anti-Receptor. Los anticuerpos anti-A\beta se acoplaron químicamente a anticuerpos anti-receptor de transferrina de ser humano y a anticuerpos anti-receptor de transferrina de ratón mediante diferentes procedimientos (Raso y col., J. Biol. Chem. 272: 27623-27628 (1997); Raso y col., Monoclonal antibodies as cell targeted carriers of covalently and non-covalently attached toxins in receptor mediated targeting of drugs, vol. 82 G. Gregoriadis, G. Post, J. Senior y A. Trouet, editores. NATO Advanced Studies Inst., Nueva York. 119-138 (1984)). Se usó una técnica de enlace tioéter rápida formando híbridos estrictamente biespecíficos usando reactivo de Traut y el reactivo heterobifuncional SMBP. Un componente se sustituyó en pequeña cantidad con grupos tiol (SH). Estos reaccionaron fácilmente formando un enlace tioéter en la mezcla con el segundo componente maleimido-sustituido (M= tras la reacción:

Ab_{A}-SH + Ab_{B}-M \rightarrow Ab_{A}-S-Ab_{B}

La filtración de gel de la mezcla de reacción en una columna S-300 produjo el dímero purificado que era de 300 KDa y tenía dos sitios para unir A\beta más dos sitios para unión a receptores de transferrina en células endoteliales de capilares del cerebro. Se formaron híbridos control no dirigidos uniendo un anticuerpo de MOPC no específico al anticuerpo anti-A\beta. Este anticuerpo híbrido unió A\beta, pero, siendo no reactivo con receptores de transferrina, no cruzaría la barrera hematoencefálica.

Los fragmentos F(ab')_{2} de los dos tipos de anticuerpos diferentes pueden estar unidos a tioéter de forma similar formando reactivos que carecen de Fc que no pueden unir complemento que podría causar de otro modo efectos neurotóxicos. Estos híbridos biespecíficos más pequeños (100 KDa) se pueden formar reduciendo los disulfuros intrínsecos que enlazan las cadenas pesadas de los fragmentos F(ab')_{2} (Raso y col., J. Immunol. 125: 2610-2616 (1980)). Los tioles generados se estabilizan y el reactivo de Ellsman (E) se usa activando estos grupos en uno de los componentes (Brennan y col., Science 229: 81-83 (1985)). Los híbridos de F(ab')_{2} exclusivamente biespecíficos se pueden formar mezclando el Fab' reducido con un Fab' activado que tiene la especificidad alterna de acuerdo con la reacción:

Fab'_{A}-SH + Fab'_{B}-SS-E \rightarrow Fab'_{A}-SS-Fab'_{B} + E-SH

La purificación en una columna S-200 aislará híbridos con un sitio para unir A\beta y un sitio para interacción con el epitope objetivo en las células endoteliales de los capilares del cerebro.

Se puede usar una aproximación similar fabricando dímeros heterobiespecíficos de cadena individual Fv unidos mediante puentes disulfuro incluso más pequeños, Fv_{A}-SS-Fv_{B} (50 kDa), para cruzar la barrera hematoencefálica. Los Fv solubles se pueden construir poseyendo una cisteína carboxiterminal para facilitar el intercambio de disulfuro mostrado en la reacción a continuación, y crear heterodímeros de 50 kDa exclusivamente:

Fv_{A}-SH + Fv_{B}-SS-E \rightarrow Fv_{A}-SS-Fv_{B} + E-SH

En comparaciones entre anticuerpo completo y bien reactivos biespecíficos basados en Fab' o bien reactivos biespecíficos basados en Fv uno al lado del otro, los últimos han mostrado ser moderadamente más efectivos en una base molar para captación celular por medio de la ruta mediada por receptor de transferrina (Raso y col., J. Biol. Chem. 272: 27623-27628 (1997)). Dado que estas construcciones más pequeñas son monovalentes para el epitope de superficie celular, esos hallazgos ahuyentan la noción de que la reticulación de dos receptores de superficie es necesaria para la captación celular de inmunocomplejos.

Ensayos Funcionales para Actividad de Unión Dual de Anticuerpos Biespecíficos. La capacidad del reactivo híbrido para unir ^{125}I-A\beta se comparó con aquella del anticuerpo anti-A\beta parental en un ensayo de unión a PEG estándar (véase Tabla 10 para ensayos de unión).

La capacidad de los anticuerpos biespecíficos apropiados para unirse a células humanas o de ratón que llevan receptor de transferrina se confirmó mediante citofluorometría. El anticuerpo biespecífico se hizo reaccionar con células humanas o de ratón positivas en receptor de transferrina y se investigó usando bien un reactivo de anticuerpo secundario fluorescente específico de rata o bien un reactivo de anticuerpo secundario fluorescente específico de ratón.

Medida de Unión de A\beta Usando ^{125}I-A\beta y una Separación de Polietilenoglicol. Para asegurar la bioespecificidad, se probaron reactivos híbridos para una capacidad mediando la unión de ^{125}I-A\beta a células que llevan receptor. Las células positivas en receptor de transferrina se trataron con el reactivo híbrido, se lavaron eliminando el material no unido y después estas células se expusieron a ^{125}I-A\beta_{1-40}. Las células se lavaron y la cantidad de radioactividad unida a célula se comparó con células control que se han preparado de forma idéntica excepto en que se omitió el pretratamiento con anticuerpo específico.

Reducción Capilar. El anticuerpo biespecífico se marcó con ^{125}I y se inyectó por vía intravenosa en ratones normales. Después de diferentes longitudes de tiempo los ratones se sacrificaron y la cantidad de anticuerpo biespecífico marcado con ^{125}I que cruzó la barrera hematoencefálica y entró en el cerebro se calibró mediante un procedimiento de reducción de capilares de ratón (Friden y col., J. Pharm. Exper. Ther. 278: 1491-1498 (1996); Triguero y col., J. Neurochem. 54: 1882-1888 (1990)). La cantidad de anticuerpo biespecífico vectorizado hallado en el parénquima cerebral o en fracciones de capilares del cerebro se midió tras centrifugación de densidad diferencial del homogenado cerebral. Estos valores se trazaron como una función del tiempo después de inyección por vía intravenosa. El paso progresivo desde los capilares dentro del parénquima indica transcitosis activa a través de la barrera hematoencéfálica.

Inmunoescintigrafía. Se puede usar también un procedimiento no invasivo para someter a seguimiento a procedimientos de administración intracerebral que implica visualizar la entrada de un anticuerpo biespecífico marcado radiactivamente dentro del cerebro de ratones vivos. El anticuerpo biespecífico vectorizado marcado radiactivamente (^{125}I-R17/5A11) o un anticuerpo biespecífico no vectorizado control se administraron a ratones distintos. Las imágenes cerebrales secuenciales se acumularon a 1, 6, 24 y 48 horas tras administración por vía intravenosa de las sondas de anticuerpo biespecífico marcado con ^{125}I. Los animales se inmovilizaron químicamente durante la exposición usando anestesia de ketamina/xilazina. La tecnología de formación de imágenes podría ser muy útil para determinar si los anticuerpos anti-A\beta circulantes evitarán que ^{125}I-A\beta administrado intravenosamente entre en el cerebro. Los datos de escintigrafía digital se cuantificaron usando los estándares y las funciones de integración dadas en el software de análisis.

Claims (10)

1. Un anticuerpo biespecífico, caracterizado por la capacidad para cruzar la barrera hematoencefálica, que tiene una primera especificidad para el receptor de transferrina y que tiene una segunda especificidad para un estado de transición adoptado por \beta-amiloide durante hidrólisis, y une preferencialmente un análogo de estado de transición que imita el estado de transición adoptado por \beta-amiloide durante hidrólisis como un enlace amida predeterminado, y que cataliza la hidrólisis de \beta-amiloide en el enlace amida predeterminado.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1 que se caracteriza adicionalmente por la capacidad para:

a) catalizar hidrólisis de la unión amida entre los residuos 39 y 40 de \beta-amiloide; o

b) catalizar hidrólisis de la unión amida entre los residuos 40 y 41 de \beta-amiloide; o

c) catalizar hidrólisis de la unión amida entre los residuos 41 y 42 de \beta-amiloide; o

d) unir preferencialmente un análogo de estado de transición que imita el estado de transición adoptado por \beta-amiloide durante hidrólisis en una unión amida predeterminada, y también unirse a -amiloide natural con afinidad suficiente para detectarse usando un ELISA; o

e) unir preferencialmente un análogo de estado de transición que imita el estado de transición adoptado por \beta-amiloide durante hidrólisis en una unión amida predeterminada, y no unir \beta-amiloide natural con suficiente afinidad para detectarse usando un ELISA.

3. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que dicho análogo de estado de transición se selecciona de un grupo constituido por estatina, fenilalanina estatina, fosfonato, fosfonamidato, análogos de estado de transición de enlace peptídico reducido.

4. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes para usar en terapia.

5. El anticuerpo de la reivindicación 4, en el que la terapia es la terapia de la enfermedad de Alzheimer.

6. El anticuerpo de la reivindicación 4 o la reivindicación 5, que cataliza la hidrólisis de \beta-amiloide endógena en un animal reduciendo niveles de \beta-amiloide circulante en el animal administrando intravenosamente los anticuerpos al animal.

7. El anticuerpo de la reivindicación 4 o la reivindicación 5 para evitar la formación de placas amiloides en el cerebro de un animal administrando los anticuerpos al animal en una cantidad suficiente para causar una reducción significativa en niveles de \beta-amiloide en la sangre del animal.

8. El anticuerpo de la reivindicación 4 o la reivindicación 5 para reducir niveles de \beta-amiloide en el cerebro de un animal administrando intravenosamente los anticuerpos al animal.

9. El anticuerpo de la reivindicación 4 o la reivindicación 5 para disgregar placas amiloides presentes en el cerebro de un animal administrando intravenosamente el anticuerpo al animal en una cantidad suficiente para causar reducción significativa en niveles de \beta-amiloide en el cerebro del animal.

10. El anticuerpo de la reivindicación 4 para disgregar placas amiloides presentes en el cerebro del animal.