DE69428321T2 - 1,2-dioxetane mit verbesserter chemilumineszenz - Google Patents

1,2-dioxetane mit verbesserter chemilumineszenz

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Description

    Gebiet der Erfindung:
  • Die Erfindung betrifft chemilumineszierende 1,2-Dioxetanderivate, die enzymatisch unter Zersetzung aktiviert werden können und die durch die Zersetzung Licht freisetzen. Die Dioxetane sind insbesondere charakterisiert durch die Anwesenheit eines aromatischen (Phenyl- oder Naphthyl-) Ringes, gebunden an das Dioxetan, wobei der Ring eine meta-substituierte oder abtrennbare, enzymatisch spaltbare Gruppe trägt, die, wenn sie gespalten wird, das Phenoxyanion oder Naphthyloxyanion des Dioxetans und in der 4- oder 5-Stellung im Falle von Phenyl beispielsweise eine Elektronen-abgebende oder Elektronen-anziehende Gruppe zurücklässt. Durch Auswahl der Identität des Substituenten in der 4- oder 5-Stellung (Z-Gruppierung) können besondere Aspekte der chemilumineszierenden Eigenschaften des Dioxetans, einschließlich der Halbwertszeit, der Quantenausbeute, dem S/N-Verhältnis usw., geändert werden.
    • Hintergrund der Erfindung:
  • 1,2-Dioxetanenzymsubstrate sind als hocheffiziente chemilumineszierende Reportermoleküle zur Verwendung in Enzymimmunoassays und Nukleinsäuresondenassays einer großen Vielzahl von Typen gut etabliert. Diese Assays ergeben eine bevorzugte Alternative zu den bekannten Assays, die auf Radioisotopen, Fluorphoren, komplizierter Farbverschiebung, sekundärer Reaktion und Ähnlichem beruhen. Die Dioxetane, die für diesen Zweck entwickelt wurden, umfassen solche, die in der U. S. Patentschrift 4 978 614 wie auch U. S.-Patentschrift 5 112 960 beschrieben werden. In der U. S.-Patentschrift 4 978 614 wird unter anderem 3-(2'- Spiroadamantan)-4-rnethoxy-4-(3"-phosphoryloxy)phenyl-1,2-dioxetan beschrieben, welches weltweite Beachtung gefunden hat und unter dem Warenzeichen AMPPD erhältlich ist. In der U. S.-Patentschrift 5 112 960 werden Verbindungen beschrieben, bei denen der Adamantylstabilisierungsring an jeder Brückenkopfstellung mit einer Vielzahl von Substituenten, einschließlich Hydroxyhalogen und Ähnlichen, substituiert ist, wobei die sonst statische oder passive Adamantylstabilisierungsgruppe in eine aktive Gruppe umgewandelt wird und an der Zersetzungskinetik des Dioxetanrings teilnimmt. Verbindungen dieses Typs haben ähnlich internationale Beachtung gefunden, da sie ein schnelleres und stärkeres Signal bei vielen Anwendungen als AMPPD geben. CSPD ist ein Spiroadamantylphenylphosphatdioxetan, das einen Chlorsubstituenten an der Adamantylgruppe trägt, und, wie AMPPD, erhältlich ist von Tropix, Inc. of Bedford, Mass.
  • Verbindungen dieses Typs wurden insbesondere zur Verstärkung der Empfindlichkeit in Assays für die Anwesenheit von Analyten in niedrigen Konzentrationen, wie 10&supmin;¹²M und niedriger, entwickelt. Bei bestimmten Anwendungen werden Verbindungen dieses Typs zusammen mit Verstärkern verwendet, um Analyten in einer Konzentration von 10&supmin;¹²M oder darunter nachzuweisen. Diese Verstärkungsmittel, die natürliche und synthetische wasserlösliche Makromoleküle umfassen, werden detailliert in der US-Patentschrift 5 145 772 beschrieben. Bevorzugte Verstärkungsmittel umfassen wasserlösliche polymere quarternäre Ammoniumsalze, wie Poly(vinylbenzyltrimethylammoniumchlorid) (TMQ), Poly(vinylbenzyltributylammoniurnchlorid) (TBQ) und Poly(vinylbenzyldimethylbenzylammoniumchlorid) (BDMQ).
  • Diese Verstärkungsmittel verbessern das chemilumineszierende Signal der Dioxetan- Reportermoleküle offensichtlich, indem sie eine hydrophobe Umgebung schaffen, bei der das Dioxetan sequestriert wird. Wasser, ein nichtvermeidbarer Bestandteil der meisten Assays, bedingt durch die Verwendung von Körperfluiden, ist ein natürliches "Abschreckmittel" für die Dioxetan-Chemilumineszenz. Die Verstärkungsmoleküle schließen offensichtlich Wasser von der Mikroumgebung, in der die Dioxetanmoleküle oder mindestens der angeregte Zustand der imitierenden Spezies vorliegen, aus, was eine verstärkte Chemilumineszenz ergibt. Andere Wirkungen, die mit der Verstärker-Dioxetan-Zwischenwirkung assoziiert sind, könnten ebenfalls zur Chemilumineszenzverstärkung beitragen.
  • Zusätzliche Vorteile werden durch die Verwendung ausgewählter Membranen, einschließlich Nylonmembranen und behandelte Nitrocellulose, wodurch eine ähnliche hydrophobe Oberfläche für Assays auf Membrangrundlage geschaffen wird, und andere Membranen, die mit Polymeren des Verstärkertyps wie beschrieben beschichtet sind, erhalten.
  • Trotzdem ist es ein allgemeines Ziel der Industrie, die Wirkung dieser stabilisierten chemilumineszierenden Dioxetan-Reportermoleküle zu verbessern, die Maschinenlesbarkeit, Empfindlichkeit und die Leistungsaspekte der Immunoassays, abhängig von dem Chemilumineszenzsignal, das durch die Doxetane freigesetzt wird, zu verbessern.
  • Zur Erläuterung des Hintergrundes und wie in all den oben erwähnten Patentschriften beschrieben, werden die enzymatisch aktivierten Dioxetane als Reportermoleküle als Substrate für Enzyme, die die enzymlabile Gruppe, gebunden an den aromatischen Substituenten am Dioxetanring spalten, verwendet. Somit ist das Enzym, beispielsweise alkalische Phosphatase, alleine vorhanden oder covalent gebunden oder sonst komplexiert mit entweder einem Antigen oder einem Antikörper in bekannten Antigen-Antikörper-Ligandenbindungsassays oder einer Nukleinsäuresonde bei Nukleinsäureassays. Das bzw. der enzymtragende Antigen oder Antikörper oder die Nukleinsäuresonde wird dann mit dem Analyten vermischt, von dem angenommen wird, dass er das Targetantigen oder die Nukleinsäuresequenz enthält, bei Bedingungen, die eine Komplexierung oder Hybridisierung zwischen dem Antigen-Antikörper oder der Sonden/Nukleinsäuresequenz erlauben. Nach dem Auswaschen oder Abtrennen alles nichtkomplexierten oder nichthybridisierten Materials wird das Dioxetansubstrat zugegeben. Wenn der vermutete Analyt vorhanden ist, wird das Enzym die enzymlabile Gruppe an dem aromatischen Substituenten des Dioxetans, beispielsweise Phenyl oder Naphthyl, spalten, wobei das Phenoxy- oder Naphthyloxyanion-Zwischenprodukt gebildet wird. Dieses Anion zersetzt sich durch Elektronenübertragung durch den aromatischen Ring, wobei der Dioxetanring gespalten wird und zwei Produkte auf Carbonylgrundlage gebildet werden. Die Spaltung/Zersetzungsreaktion ist das lichtfreisetzende Geschehen.
  • Zur Automatisierung klinischer Assays, und damit ein wesentlicher Durchsatz erhalten wird, sind fortgesetzte Verringerungen in der Halbwertszeit oder T1/2 des Dioxetans, wie auch eine Verringerung der Dauer der Zeit, die erforderlich ist, um die maximale Lichtemmision des Reportermoleküls zu erhalten, wünschenswert. Gleichzeitig ist es zum Nachweis von Analyten in extrem niedrigen Konzentrationen, unter beispielsweise 10&supmin;¹²M, wünschenswert, die Intensität des Signals des Dioxetan-Reportermoleküls zu verbessern, und es ist gleichzeitig wünschenswert, eine Erhöhung des Hintergrundgeräusches, bedingt durch nicht-enzymatisch-induzierte Lichtfreisetzung, zu verringern, so dass die Gesamtempfindlichkeit des Assays verbessert wird. Es wird daher nach weiteren Verbesserungen bei chemilumineszierenden Dioxetan- Reportermolekülen gesucht.
    • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Obige und andere Aufgaben werden durch eine neue Klasse von Dioxetanen gelöst, die insbesondere durch einen Substituenten am aromatischen Ring, gebunden an das Dioxetan zusätzlich zu der meta-substituierten enzymlabilen Gruppe, charakterisiert sind. Die neuen erfindungsgemäßen Dioxetane besitzen die folgende allgemeine Struktur
  • worin R C&sub1;-C&sub1;&sub2;-Alkyl, Phenyl, Naphthyl, Phenyl-C&sub1;-C&sub1;&sub2;-alkyl oder Naphthyl-C&sub1;-C&sub1;&sub2;-alkyl, bevorzugt C&sub1;-C&sub4;-Alkyl, bedeutet, X eine enzymlabile Gruppe bedeutet, die durch ein spezifisches Enzym gespalten werden kann, das diese Gruppe erkennt, wobei ein Phenoxy- oder Naphthoxyanion zurückbleibt, und es bedeutet bevorzugt Phosphat, Galactosid oder Glucuronid. Y¹ und Y² bedeuten unabhängig Wasserstoff oder eine Elektronen-abgebende oder -anziehende Gruppe, und sie bedeuten bevorzugt Wasserstoff, Methoxy, Carboxy oder Halogen, und am meisten bevorzugt bedeutet einer der Substituenten Y¹ und Y² Wasserstoff, während der andere Chlor bedeutet, und Z bedeutet eine Elektronen-aktive Gruppe, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Chlor und Alkoxy mit 1-6 Kohlenstoffatomen. Z ist an dem Phenylring vorhanden und in 4- oder 5-Stellung vorhanden.
  • Durch Auswahl der besonderen Identität und Stellung von Z können spezifische Eigenschaften des chemilumineszierenden Verhaltens des Dioxetans, einschließlich der Chemilumineszenz-Halbwertszeit (T1/2), der Zeit bis zur maximalen Emission, eine maximale Emissionswellenlänge und die Chemilumineszenz-Signalintensität, beeinflusst werden.
    • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • In den Fig. 1 und 2 wird die Wirkung von Dinatrium-3(4-methoxyspiro[1,2-dioxetan- 3,2'-(5'-chlor)tricyclo-[3.3.1.1.3,7]decan]-4-yl)phenylphosphatdioxetan (CSPD) mit der erfindungsgemäßen Verbindung Dinatrium-2-chlor-5-(4-methoxyspiro[1,2-dioxetan-3,2'-(5'-chlor)- tricyclo-[3.3.1.1.3,7]decan]-4-yl)phenylphosphat, wo die Phenylgruppierung einen Chlorsubstituenten in der 4-Stellung trägt, (CDP-Star) verglichen. Bei Fig. 2 ist ein Chemilumineszenzverstärker, Polyvinylbenzyltributylammoniumchlorid, vorhanden.
  • Fig. 3 zeigt einen Vergleich zwischen CSPD und CDP-Star auf einem Nylonmembranassay für biotinyliertes pBR322-35mer.
  • Die Fig. 4 und 5 sind Reproduktionen von Kodak XAR-5-Filmbelichtungen von Western-Blotting-Assays, durchgeführt an Nylon- und PVDF-Membranen, wo CSPD und CDP-Star verglichen werden.
  • Die Fig. 6, 7 und 8 sind Reproduktionen eines Röntgenfilms, wo CSPD- und CDP- Star-Inkubationen von 10 Minuten, 70 Minuten bzw. 19 Stunden gegenüber gestellt sind, eines Assays, durchgeführt mit Nylonmembranen für das Hefegen RPB 1.
  • Die Fig. 9 ist eine Reproduktion von Röntgenfilmbelichtungen, wo der Chemilumineszenznachweis von DNA-Sequenzleitem, durchgeführt an Nylonmembranen, dargestellt ist, und wobei CSPD und CPD-Star verglichen werden.
  • Die Fig. 10 und 11 sind elektrophotographische Abzüge der Röntgenfilmbilder von der DNA Sequenzierung, erhalten unter Verwendung der beanspruchten Dioxetane. Diese werden mit dem derzeitigen technischen Standard, CSPD, verglichen.
  • Die Fig. 12 bis 21 sind elektrophotographische Abzüge von Dot-Blot-Assay- Ergebnissen auf Membranen wie angegeben, wobei die erfindungsgemäß beanspruchten Dioxetane, Dioxetane, die erfindungsgemäß nicht beansprucht werden, und die im Handel erhältlichen Standards CSPD und AMPPD verglichen werden. Die Membranen, auf denen diese Assays durchgeführt werden, sind in den Figuren angegeben.
    • GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die erfindungsgemäßen Dioxetane sind kritisch durch Substituenten am aromatischen Ring, gebunden an die Dioxetane, charakterisiert, wobei der Ring den Elektronenübergang in das Aryloxyanion bestimmt, was zur Zersetzung und Chemilumineszenz führt. Somit besitzen die erfindungsgemäßen Phenyldioxetane die folgende allgemeine Struktur (I),
  • Die Adamantyl-stabilisierten Dioxetane der beanspruchten Erfindung tragen zwei Substituenten am Phenylring, zusätzlich zu dem Bindungspunkt des Dioxetans, wie auch 0, 1 oder 2 Nicht-Wasserstoffsubstituenten am Adamantylring. Diese Substituenten charakterisieren kritisch die Elektroneneigenschaften des Dioxetans, des Oxyanions und sein Zersetzungsverhalten. Die Identitäten jedes Substituenten werden im Folgenden aufgeführt.
  • R bedeutet C&sub1;-C&sub1;&sub2;-Alkyl, Phenyl, Naphthyl, Phenyl-C&sub1;-C&sub1;&sub2;-alkyl oder Naphthyl-C&sub1;-C&sub1;&sub2;alkyl. R bedeutet bevorzugt C&sub1;-C&sub4;-Alkyl, bevorzugter C&sub1;-C&sub3;-Alkyl, am meisten bevorzugt Methyl. Die Identität von R kann hinsichtlich der Löslichkeitsverhältnisse optimiert werden, wobei unübliche Analyten oder Puffer besondere Probleme darstellen können. Jeder der Substituenten Y¹ und Y² bedeutet individuell und unabhängig Wasserstoff, eine Hydroxylgruppe, einen Halogensubstituenten, eine Hydroxy-C&sub1;-C&sub1;&sub2;-alkylgruppe, eine Halogen-C&sub1;-C&sub1;&sub2;-alkylgruppe, eine Phenylgruppe, eine Halogenphenylgruppe, eine C&sub1;-C&sub1;&sub2;-Alkoxyphenylgruppe, eine C&sub1;-C&sub1;&sub2;- Alkoxyphenoxygruppe, eine Hydroxy-C&sub1;-C&sub1;&sub2;-alkoxygruppe, eine Cyanogruppe, eine Amidgruppe, eine Carboxylgruppe oder substituierte Carboxylgruppe, eine C&sub1;-C&sub1;&sub2;-Alkoxygruppe und andere ähnliche Elektronen-aktive Spezies. Bevorzugte Identitäten für einen von Y¹ und Y² sind Chlor, Hydroxy und Methoxy, wobei der andere Wasserstoff bedeutet.
  • X ist eine durch Enzyme spaltbare Gruppierung. Durch geeigneten Kontakt mit einem geeigneten Enzym wird X von dem Molekül abgespalten, wobei der Sauerstoff gebunden an den Phenylring, und somit ein Phenoxyanion zurückbleibt. X ist idealerweise Phosphat, Galactosid, Acetat, 1-Phospho-2,3-diacylglycerid, 1-Thio-D-glucosid, Adenosintriphosphat, Adenosindiphosphat, Adenosinmonophosphat, Adenosin, α-D-Glucosid, β-D-Glucosid, β-D-Glucuronid, α-D-Mannosid, β-D-Mannosid, β-D-Fructofuranosid, β-Glucosiduronat, P-Toluolsulfonyl-Largininester und P-Toluolsulfonyl-L-argininamid. X ist bevorzugt Phosphat, Galactosid oder Glucuronid, am meisten bevorzugt Phosphat. Es ist wichtig zu bemerken, dass bei Substitution am Phenylring OX in Metastellung, bezogen auf die Bindungsstelle des Dioxetanrings, steht, d. h. es nimmt die Dreistellung ein.
  • Z kann entweder in der Vier- oder Fünfstellung vorhanden sein. Z ist ein Elektronenaktiver Substituent, wobei durch den Charakter der Elektronenaktiven Spezies (Elektronenabgebend oder Elektronen-anziehend) die verschiedenen Aspekte der Dioxetangruppierung optimiert werden. Als Beispiel kann eine Elektronen-abgebende Gruppe, wie eine Methoxygruppe, den Dioxetan-Phenoxyanion-Zersetzungsvorgang verstärken, indem die Übertragbarkeit der freien Elektronen von der aromatischen Ring-O&supmin;-Donorgruppe zum Dioxetanring erleichtert wird. Im Gegensatz dazu würde Chlor als Elektronen-anziehende Gruppe die Fähigkeit der Übertragung der freien Elektronen zu dem Dioxetan verringern oder verschlechtern, wodurch die Zersetzungsreaktion und die Lichtemission verlangsamt würden, obgleich schließlich ein Lichtsignal mit größerer Intensität erhalten würde. Dies steht im Gegensatz zu der Einwirkung des Elektronen-anziehenden Substituenten an der Adamantylgruppe, wie Chlor, wodurch die Lichtemission wesentlich beschleunigt wird und Tln stark verringert wird. Von überraschender Signifikanz ist die Tatsache, dass die Substitution in der Sechsstellung besonders unerwünscht ist. Solche sechs-substituierten Phenyldioxetane zeigen ungewöhnlich schnelle Zersetzungskinetik und fast keine Lichtemission. Obgleich die Anmelderin sich nicht auf diese Theorie beschränken will, wird angenommen, dass dieses Verhalten auf sterische Gründe zurückzuführen ist, d. h. dass der Orthosubstituent den Phenylring so "dreht", dass er den Dioxetanring durch eine Reihe sterischer Kräfte (keine Elektronenübertragung) destabilisiert, und dass der Substituent in der Sechsstellung, beispielsweise Methoxy, an dem Elektronenübergang nicht teilnimmt. Wie im Folgenden diskutiert, ergeben Versuche, bei denen 6-substituierte Phenyldioxetane involviert sind, im Wesentlichen kein Signal.
  • Bevorzugte Ausführungsformen der Dioxetane (I), wie in Anspruch 1 beansprucht, sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche 2 bis 13.
  • Dioxetane des oben beschriebenen Typs ohne Vorhandensein des Z-Substituenten werden, wie zuvor erwähnt, in den zuvor zugeordneten Patentschriften beschrieben. Patente, die Dioxetane dieses Typs ohne Einschluss der Y- und Z-Substituenten betreffen, wurden ebenfalls der Wayne State University zugeordnet, wie 4 962 192. Die Substitution des Z-Substituenten an den Dioxetanen erfordert die Entwicklung der Synthese von trisubstituierten Phenylphosphonaten, die im Folgenden unter dem Titel "Neue trisubstituierte Phenyl-1,2-dioxetanphosphate" beschrieben wird. Die Synthese dieser Verbindungen über den im Folgenden beschriebenen Weg umfasst die Herstellung neuer trisubstituierter Benzole. Wie im Folgenden beschrieben, ist eine beispielhafte Verbindung, die bei der Synthese der Dioxetane dieser Klasse involviert ist, 3- Chlor-5-methoxybenzaldehyd. Diese trisubstituierten Verbindungen sind Schlüsselprodukte bei einer Vielzahl von Synthesewegen, wobei das 1,3,5-Substitutionsmuster ein allgemein bevorzugtes und vielfach anwendbares Muster ist. Es ist die Meinung der Anmelderin, dass diese Zwischenprodukte niemals zuvor hergestellt wurden, und sie sind bei dem im Folgenden angegebenen Syntheseweg mit einem Stern versehen.
    • NEUE TRISUBSTITUZERTE PHENYL-1,2-DIOXETANPHOSPHATE Synthese
  • Im Handel erhältliche Reagenzien werden so, wie sie erhalten werden, ohne weitere Reinigung verwendet. Baker-Silicagele (60-200 Mesh für den Grammmaßstab und 230-400 Mesh für den Milligrammmaßstab) wurden für die Flashchromatographie verwendet. ³¹P NMR- Spektren wurden in ppm, bezogen auf Phosphorsäurestandard angegeben. Die Hochauflösungsmassenspektralanalysen wurden von J. L. Kachinski in der Johns Hopkins Universität durchgeführt. Die Synthesen der Dioxetane 3 und 4 wurden gemäß dem im Folgenden für die Dioxetane 1 bzw. 2 beschriebenen Verfahren durchgeführt. Die Ausbeuten, Schmelzpunkte (nichtkorrigiert) und Spektralergebnisse sind für isolierte Zwischenprodukte zusammengefasst. 3-Chlor-5-methoxy-4-trifluormethansulfonyloxybenzaldehyd (5).
  • Eine Lösung von 5-Cl-Vanillin¹ (13,0 g, 70 mmol), Chloroform (4 ml) und Pyridin (16 ml) wurden bei 0ºC gerührt. Die Zugabe von Trifluormethansulfonsäureanhydrid (12,4 ml, 75 mmol) bei 0ºC im Verlauf von 30 Minuten ergab eine saubere Bildung des Triflats. Das Reaktionsgemisch wurde zwischen EtOAc und 3 N HCl verteilt, mit verdünnter Salzlösung gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und bei verringertem Druck eingedampft. Die Reinigung des entstehenden gelben Öls durch Silicagelsäulenchromatographie (30% EtOAc/Hexane) ergab 18,5 g (83%) Triflat 5 in Form gelber Kristalle.
  • IR (CHCl&sub3;, cm&supmin;¹): 1705, 1590, 1461, 1425, 1225, 1205, 1132, 1049, 875, 624
  • ¹H-NMR (ppm): 3,99 (3H, s), 7,44 (1H, d, J = 1,6 Hz), 7,57 (1H, d, J = 1,7 Hz), 9,92 (1H, s) *3-Chlor-5-methoxybenzaldehyd (6).
  • Das Triflat 5 (9 g, 28 mmol), Palladium(11)-acetat (120 mg, 0,5 mmol), 1,1'- Bis(diphenylphosphino)ferrocen (620 mg, 1 mmol), und CH&sub3;CN mit HPLC-Qualität (10 ml) wurden gut in einer rostfreien Stahlbombe, die mit Teflon ausgekleidet war, vermischt. Nach der Zugabe von frisch hergestelltem pulverisierten Protonenschwammformiat² (7,84 g, 30 mmol) wurde die Bombe dicht verschlossen und auf 90ºC während 4 Stunden erhitzt. Das gekühlte Reaktionsgemisch wurde dann zur Entfernung der Protonenschwarnmkristalle filtriert, zwischen EtOAc und 3 N HCl verteilt, einmal mit verdünnter Salzlösung und verdünnter NaHCO&sub3; gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und eingedampft. Die Silicagelchromatographie (15% EtOAc/Hexane) ergab 4,25 g (88,5%) Chlormethoxybenzaldehyd 6.
  • Fp. 45ºC.
  • IR (CHCl&sub3;, cm&supmin;¹): 2835, 1700 (C=O), 1590, 1576, 1461, 1425, 1380, 1320, 1280, 1265, 1144, 1050, 850, 695
  • ¹H-NMR (ppm): 3,84 (3H, s), 7,13 (1H, m), 7,26 (1H, m), 7,41 (1H, m), 9,89 (1H, s)
  • Massenspektrum (EI, 70 eV): Genaue Masse berechnet für C&sub8;H&sub7;ClO&sub2; 170,0135, gefunden 170,0134. 3-Chlor-5-methoxybenzaldehyddimethylacetal (7).
  • Eine Methanollösung (20 ml) vom Benzaldehyd 6 (8,76 g, 51 mmol) wurde sauber in Dimethylacetal 7 in Anwesenheit von Trimethylorthoformiat (5,62 ml, 51 mmol) und einer katalytischen Menge an p-Toluolsulfonsäure überführt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Triethylamin auf pH 7 abgeschreckt, zu einem geringen Volumen eingedampft und zwischen EtOAc und NaHCO&sub3; verteilt. Die organische Schicht wurde getrocknet, bei verringertem Druck eingedampft und durch Silicagelchromatographie (10% EtOAc/Hexane) gereinigt, wobei 10,68 g (96%) Acetal 7 als hellgelbes Öl erhalten wurden.
  • IR (CHCl&sub3;, cm&supmin;¹): 2960, 2938, 2830, 1596, 1578, 1458, 1270, 1104, 1050, 989, 872, 865, 840
  • ¹H-NMR (ppm): 3,31 (6H, s), 3,79 (3H, s), 5,31 (1H, s), 6,85 (1H, s), 6,88 (1H, s), 7,04 (1H, s) Diethyl-1-methoxv-1-(3-chlor-5-methoxyphenyl)methanphosphonat (8).
  • Triethylphosphit (3,2 ml, 19 mmol) wurde tropfenweise zu einer Lösung von Acetal 7 (4,0 g, 18,5 mmol), Bortrifiuoridetherat (2,3 ml, 19 mmol) und CH&sub2;Cl&sub2; (20 ml) bei 0ºC gegeben. Nach langsamen Erwärmen des Reaktionsgemisches auf Raumtemperatur (30 min) wurde die Lösung mit verdünnter NaHCO&sub3; verteilt, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet, eindampft und an Silicagel (40%-100% EtOAc/Hexane) gereinigt, wobei 4,6 g (77,5%) Phosphonat 8 als hellgelbes Öl erhalten wurden.
  • IR (CHCl&sub3;, cm&supmin;¹): 2990, 1591, 1573, 1458, 1254 (P=O), 1050 (P-O), 1025 (P-O), 969, 870, 687
  • ¹H-NMR (ppm): 1,24 (3H, t, J = 7 Hz), 1,26 (3H, t, J = 7 Hz), 3,37 (3H, s), 3,78 (3H, s), 4,01-4,09 (4H, m), 4,40 (1H, d, J = 16 Hz), 6,83 (1H, t, J = 2 Hz), 6,88 (1H, qt, J = 2Hz), 6,98 (1H, qt, J = 2 Hz) 3-Chlor-5-methoxy-1-(methoxytricyclo[3.3.1.1.3,7]dec-2-ylidenmethyl)benzol (9).
  • Phosphonat 8 (4,62 g, 14 mmol) und 2-Adamantanon (2,58 g, 17 mmol) wurden in wasserfreiem THF (35 ml) unter Argon gelöst und auf -68ºC gekühlt. Die tropfenweise Zugabe von Lithiumdiisopropylamid (18,6 mmol) in wasserfreiem THF (20 ml) erzeugte das Ylid, gefolgt von der nachfolgenden Olefinbildung des Ketons. Das Reaktionsgemisch wurde langsam auf Raumtemperatur im Verlauf von 2 h erwärmt und dann bei 75ºC 1 h gerührt. Die Lösung wurde zwischen EtOAc/NH&sub4;Cl verteilt, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet, eingedampft und durch Silicagelchromatographie (2% EtOAc/Hexane) gereinigt, wobei 2,5 g (55%) Enolether 9 als Öl erhalten wurden.
  • ¹H-NMR (ppm): 1,55-1,95 (12H, m), 2,61 (1H, br s), 3,21 (1H, br s), 3,28 (3H, s), 3,78 (3H, s), 6,74 (1H, s), 6,80 (1H, s), 6,87 (1H, s) 3-Chlor-5-hydroxy-1-(methoxytricyclo[3.3.1.1.3,7]dec-2-ylidenmethyl)lbenzol (10).
  • Die Entmethylierung zu Enoletherphenol 10 verlief glatt beim Erhitzen des Enolethers 9 (2,5 g, 7,8 mmol) in DMF (14 ml) bei 155ºC in Anwesenheit von Natriumethanthiolat (11,7 mmol). Beim Kühlen wurde das Gemisch zwischen EtOAc und NH&sub4;Cl verteilt, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und im Hochvakuum zur Entfernung von restlichem DMF eingedampft. Die chromatographische Reinigung (Silicagel, 20% EtOAc/Hexane) ergab 2,3 g (96%) Phenol als Öl, welches beim Stehen kristallisierte. Verreiben des Feststoffes mit 5% EtOAc/Hexane ergab farblose Kristalle, Fp. 133ºC.
  • IR (CHCl&sub3;, cm&supmin;¹): 3584 (OH), 3300 (OH), 2910, 190, 1310, 1285, 1163, 1096, 1080, 1011, 900, 840
  • ¹H-NMR (ppm): 1,73-1,96 (12H, m), 2,62 (1H, br s), 3,20 (1H, br s), 3,32 (3H, s), 5,65 (1H, br s), 6,73 (1H, s), 6,79 (1H, m), 6,85 (1H, s) Pyridinium-3-chlor-5-(methoxytricyclo[3.3.1.1.3,7]dec-2-ylidenmethyl)-phenylphosphat (11).
  • Triethylamin (450 ul, 3,2 mmol) wurde unter Argonatmosphäre zu dem Enolether 10 (709 mg, 2,3 mmol), gelöst in wasserfreiem THF (10 ml), gegeben. Die Lösung wurde auf 0ºC gekühlt, wobei zu diesem Zeitpunkt 2-Chlor-2-oxo-1,3,2-dioxaphospholan (Fluka, 285 ul, 3,0 mmol) tropfenweise zugegeben wurde. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur erwärmt, schnell durch eine mit Argon gespülte Säule unter Inertatmosphäre zur Entfernung von Triethylammoniumhydrochloridkristallen geleitet. Nach dem Spülen des Kristallkuchens mit THF wurde die Lösung verdampft und trockengepumpt, wobei rohes Phospholan 11a erhalten wurde.
  • Das Öffnen des Phospholanrings durch Reaktion von 11a mit NaCN (vakuumgetrocknet, 179 mg, 3,65 mmol) in wasserfreiem DMF (6 ml) unter Argon ergab das gewünschte β- Cyanoethyldiesterphosphat 11b, wie auch die Regeneration des Enoletherphenols 10. Die Entfernung von DMF im Hochvakuum unter Erwärmen des Kolbens auf 55ºC ließ ein Gemisch der Verbindungen 10 und 11b als gelb-oranges Öl zurück.
  • Das obige Gemisch wurde in Methanol (8 ml) gelöst und bei 40ºC in Anwesenheit von NaOMe (1 ml 4,25M NaOMe/MeOH, 6,4 mmol) gerührt, wobei eine β-Eliminierung der Cyanoethylgruppe erfolgte und das Enoletherphosphat 11 als Dinatriumsalz gebildet wurde. Nach dem Verdampfen des Methanols wurde der Feststoff in Wasser gelöst und mit minimal EtOAc zur Gewinnung von Phenol 10 (333 mg) verteilt. Die Reinigung der wässrigen Phase durch präparative HPLC unter Verwendung eines CH&sub3;CN/H&sub2;O-Gradienten durch eine Polystyrolsäule (PLRP-S. Polymer Laboratories), gefolgt von Ionenaustausch mit Pyridiniumtoluolsulfonat (Amberlyst-IR 120+ Harz) und Lyophilisierung ergab 448 mg (78% über 3 Stufen, entsprechend dem wiedergewonnenen Phenoletherphosphat 11 als flockiges, fast farbloses Pulver.
  • IR (CHCl&sub3;, cm&supmin;¹): 2910, 1590, 1567, 1278, 1160, 1095, 945
  • ¹H-NMR (ppm): 1,73-1,96 (12H, m), 2,63 (1H, br s), 3,20 (1H, br s), 3,32 (3H, s), 5,89 (1H, s), 6,72 (1H, m), 6,79 (1H, t, J = 2 Hz), 6,85 (1H, d, J = 2 Hz)
  • ³¹P-NMR (ppm): 54 (1P) Dinatrium-3-chlor-5-(methoxyspiro[1,2-dioxetan-3,2'-tricyclo[3.3.1.1.3,7]decan-4-yl')-1- phenylphosphat (1).
  • Eine Lösung des Enoletherphosphats 11 und 5,10,15,20-Tetraphenyl-21H,23H-porphin (TPP, 0,5 ml einer 2%igen Lösung in CHCl&sub3;, ausgedrückt durch das Gewicht) in CHCl&sub3; (8 ml) wurde mit einer 250 W Hochdruck-Natriumlampe bei 10ºC belichtet, während ein Sauerstoffstrom durch die Lösung geleitet wurde. Ein 5-mil Stück eines Kapton-Polyimidfilms (DuPont) wurde zwischen die Lampe und das Reaktionsgemisch gelegt, um unerwünschte UV- Bestrahlung herauszufiltern. Die analytische HPLC (UV-Detektor bei 270 nm) zeigt eine vollständige Dioxetanbildung beim Bestrahlen während 5 min. Nach dem Verdampfen des Chloroforms bei 0ºC wurde der Rückstand in Eiswasser in Anwesenheit von Na&sub2;CO&sub3; (27 mg, 0,25 mmol) gelöst und durch präparative HPLC, wie oben beschrieben, gereinigt. Die Fraktionen wurden gefroren und bei 0ºC lyophilisiert und ergaben 65,3 mg (90%) Dioxetan 1 als flockiges, farbloses Pulver. TLC des Dioxetans zeigte eine blaue Chemilumineszenz bei der thermischen Zersetzung beim Erhitzen. Die enzymatische Spaltung des Phosphats induzierte ebenfalls eine chemilumineszierende Zersetzung in wässrigen Lösungen.
  • ¹H-NMR (D&sub2;O, ppm): 0,93 (1H, d, J = 13 Hz), 1,21 (1H, d, J = 13 Hz), 1,44-1,69 (10H, m), 2,16 (1H, br s), 2,78 (1H, brs), 3,14 (3H, s), 7,20 (2H, br s), 7,30 (1H, s)
  • ³¹P NMR (D&sub2;O, ppm): 54 (1P) 3-Chlor-5-hydroxybenzaldehyddimethylacetal (12).
  • 5-Chlor-3-methoxybenzaldehyddimethylacetal (7, 3,21 g, 14,8 mmol) wurde mit Natriumethanthiolat (19 mmol) in DMF (14 ml) unter Erhitzen auf 150ºC entmethyliert. Das entstehende Phenol 12 wurde gekühlt, zwischen EtOAc und NH&sub4;Cl verteilt, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet, verdampft und zur Trockene im Hochvakuum eingedampft, um restliches DMF zu entfernen. Die chromatographische Reinigung (Silicagel, 20% EtOAc/Hexane) ergab 2,75 g (92%) Phenol 12 als gelbes Öl. Eine analytische Probe des Öls kristallisierte bei der weiteren Reinigung, Fp. 153ºC.
  • IR (CHCl&sub3;, cm&supmin;¹): 3580 (OH), 3325 (OH), 2940, 2830, 1599, 1585, 1449, 1350, 1155, 1105, 1055, 894, 845
  • ¹H-NMR (ppm): 3,32 (6H, s), 5,30 (1H, s), 5,73 (1H, br s), 6,81 (2H, m), 7,01 (1H, s) 3-Chlor-5-pivaloyloxybenzaldehyddimethylacetal (13).
  • Phenol 12 (2; 7 g, 13,3 mmol) und Triethylamin (2,8 ml, 20 mmol) in CH&sub2;Cl&sub2; (20 ml) wurden bei 0ºC gerührt. Die Zugabe von Trimethylacetylchlorid (1,64 ml, 13,3 mmol) ergab klar den Pivaloylester. Die Standardaufarbeitung ergab das rohe Pivaloat 13 als Öl, das dann bei der nächsten Reaktion ohne Reinigung verwendet wurde. Es wurde kein Gewicht bestimmt. Die kleine Probe wurde durch präparative TLC ihr die spektrale Charakterisierung gereinigt.
  • IR (CHCl&sub3;, cm&supmin;¹): 2980, 2940, 1749 (C=O), 1585, 1448, 1349, 1250, 1150, 1109, 1056, 898
  • ¹H-NMR (ppm): 1,34 (9H, s), 3,31 (6H, s), 5,36 (1H, s), 7,06 (2H, br s), 7,31 (1H, s) Diethyl-1-methoxy-1-(3-chlor-5-nivaloyloxyphenyl)methanphosphonat (14).
  • Eine Lösung von Acetal 13, Bortrifluoridetherat (2,6 ml, 21 mmol) und CH&sub2;Cl&sub2; (10 ml) wurde bei -78ºC gerührt. Durch die Zugabe von Triethylphosphit (3,0 ml, 17,5 mmol) wurde das Acetal in das Phosphonat 14 umgewandelt. Die Aufarbeitung und Reinigung (Silicagel, 10% EtOAc/Hexane) ergab 2,43 g Öl (47% über 2 Stufen).
  • IR (CHCl&sub3;, cm&supmin;¹): 2995, 2980, 1750 (C=O), 1600, 1581, 1442, 1247 (P=O), 1110, 1028 (P-O), 975, 890
  • ¹H-NMR (ppm): 1,22-1,26 (6H, d von t, J = 2 Hz, 7 Hz), 1,31 (9H, s), 3,39 (3H, s), 4,02- 4,08 (4H, m), 4,44 (1H, d, J = 16 Hz), 7,04 (2H, m), 7,27 (1H, br s), 3-Chlor-5-pivaloyloxy-1-(methoxy-(5'-chlor tricyclo[3.3.1.1.3,7]dec-2- ylidenmethyl)benzol (15).
  • Phosphonat 14 (2,4 g, 6,1 mmol) wurde in wasserfreiem THF (10 ml) unter Argon gelöst und auf -68ºC gekühlt. Die tropfenweise Zugabe von Lithiumdiisopropylamid (6,6 mmol) in wasserfreiem THF (7 ml) bei niedriger Temperatur ergab das Ylid, was durch eine tiefe Färbung erkennbar war. Nach 5 min wurde eine THF-Lösung von 5-Chlor-2-adamantanon (941 mg, 5 mmol) zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde langsam auf Raumtemperatur im Verlauf von 40 min erhitzt, und anschließend wurde bei 75ºC während 1 h zur vollständigen Olefinbildung erhitzt. Die Lösung wurde zwischen zwischen EtOAc und NH&sub4;Cl verteilt, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und eingedampft, wobei ein rohes Gemisch aus Enoletherpivaloat 15 und dem entsprechenden Enoletherphenol 16 erhalten wurde. Das rohe Öl wurde ohne weitere Reinigung bei der folgenden Hydrolyse verwendet. Eine kleine Probe wurde durch präparative TLC für die spektrale Charakterisierung gereinigt.
  • IP (CHCl&sub3;, cm&supmin;¹): 2935, 1750 (C=O), 1595, 1571, 1450, 1420, 1397, 1275, 1160, 1110, 1024, 918, 906, 887, 829
  • ¹H-NMR (ppm): 1,34 (9H, s), 1,68-1,78 (4H, m), 2,14-2,25 (7H, m), 2,77 (1H, br s), 3,30 (3H, s), 3,42 (1H, br s), 6,88 (1H, d, J = 1,5 Hz), 7,04 (1H, m), 7,11 (1H, d, J = 1,5 Hz) 3-Chlor-5-hydroxy-1-(methoxv-(5'-chlor)tricyclo[3.3.1.1.3,7]dec-2-ylidenmethyl)benzol (16).
  • Rohes Pivaloat 15 wurde bei Raumtemperatur mit K&sub2;CO&sub3; (1,45 g, 10,5 mmol) in 10 ml Methanol hydrolysiert. Die Verdampfung des Methanols, gefolgt von der Standardaufarbeitung und Reinigung (Silicagel, 30% EtOAc/Hexane) ergab 1,095 g (63% über 2 Stufen) ein hellgelbes Öl, welches beim Stehen verfestigte. Reiben des gebildeten Feststoffes ergab farbloses kristallines Enoletherphenol 16, Fp. 130ºC.
  • IR (CHCl&sub3;, cm&supmin;¹): 3590 (OH), 3300 (OH),, 2935, 1595, 1163, 1100, 1082, 1030, 911
  • ¹H-NMR (ppm): 1,69-1,83 (4H, m), 2,14-2,27 (7H, m), 2,77 (1H, br s), 3,30 (3H, s), 3,41 (1H, br s), 5,21 (1H, br s), 6,67 (1H, d, J = 1,5 Hz), 6,81 (1H, m), 6,84 (1H, d) Dinatrium-3-chlor-5-(methoxyspiro[1,2-dioxetan-3.2'-(5'-chlor)tricyclo[3.3.1.1.3,7]decan]-4-yl)-1-phenylphosphat (2).
  • Triethylamin (230 ul, 1,65 mmol) wurde unter Argonatmosphäre zu Enolether 16 (356 mg, 1,05 mmol), gelöst in wasserfreiem THF (5 ml), gegeben. Die Lösung wurde auf 0ºC gekühlt, zu diesem Zeitpunkt wurde 2-Chlor-2-oxo-1,3,2-dioxaphospholan (Fluka, 143 ul, 1,55 mmol) tropfenweise zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur erwärmt und schnell durch eine mit Argon gespülte Säule unter Inertatmosphäre zur Entfernung der Triethylammoniumhydrochloridkristalle geleitet. Nach dem einmaligen Spülen des Kristallkuchens mit THF wurde die Lösung zur Trockene verdampft und abgepumpt, wobei das rohe Phospholan 17a erhalten wurde.
  • Das Öffnen des Phospholanrings durch Umsetzung mit NaCN (vakuumgetrocknet, 69 mg, 1,4 mmol) in wasserfreiem DMF (5 ml) unter Argon ergab das gewünschte β- Cyanoethyldiesterphosphat 1%. Nach Entfernung von DMF im Hochvakuum unter Erwärmen des Kolbens auf 55ºC blieb das rohe Diesterphosphat als oranges Öl zurück.
  • Eine Lösung aus Cyanoethylphosphat 17b und 5,10,15,20-Tetraphenyl-21H,23H porphin (TPP, 1,5 ml einer 2%igen Lösung in CHCl&sub3; pro Gewichtseinheit) in CHCl&sub3; (10 ml) wurde mit einer 250 W Hochdruck-Natriumlampe bei 10ºC bestrahlt, während ein Sauerstoffstrom durch die Lösung geleitet wurde. Ein 5-mil Stück Kapton-Polyimidfilm (DuPont) wurde zwischen die Lampe und das Reaktionsgemisch gegegeben, um unerwünschte UV-Bestrahlung herauszufiltern. Die analytische HPLC (UV-Detektor bei 270 nm) zeigte eine vollständige Dioxetanbildung beim Bestrahlen während 15 Minuten. Nach Verdampfen des Chloroforms bei 0ºC wurde der Rückstand in Methanol gelöst, und die Schutzgruppe wurde mit NaOMe (0,5 ml von 4,25M NaOMe/MeOH, 2 mmol) abgespalten, wobei Dinatriumphosphatdioxetan erhalten wurde. Nach der β-Eliminierung der Cyanoethylgruppe wurde das Lösungsmittel bei 0ºC verdampft und der Rückstand in Eiswasser gelöst. Die Reinigung mit präparativer HPLC, wie oben beschrieben, gefolgt von der Lyophilisierung bei 0ºC, ergab 289 mg (60% über 4 Stufen) Dioxetan 2 als ein flockiges, farbloses Pulver.
  • ¹H-NMR (D&sub2;O, ppm, Gemisch aus Syn-/Anti-Isomeren): 0,86 (1H, d), 1,13 (1H, d, J = 14 Hz), 1,30 (1H, d), 1,37 (1H, d), 1,45-2,07 (18H, m), 2,27 (1H, br s), 2,32 (1H, br s), 2,95 (2H, br s), 3,09 (3H, s), 3,11 (3H, s), 7,0-7,3 (4H, br s), 7,25 (1H, s), 7,28 (1H, s) 3,5-Dimethoxybenzaldehyddimethylacetal (18).
  • IR (CHCl&sub3;, cm&supmin;¹): 2958, 2935, 1598, 1460; 1426, 1357, 1190, 1154, 1101, 1053, 840
  • ¹H-NMR (ppm): 3,32 (6H, s), 3,78 (6H, s), 5,28 (1H, s), 6,41 (1H, m), 6,60 (2H, m), 3-Hydroxy-5-methoxybenzaldehyddimethylacetal (19).
  • IR (CHCl&sub3;, cm&supmin;¹): 3590 (OH), 3345 (OH), 2940, 2830, 1600, 1462, 1432, 1355, 1190, 1150, 1110, 1055, 841
  • ¹H-NMR (ppm): 3,32 (6H, s), 3,77 (3H, s), 5,28 (1H, s), 6,37 (1H, d, J = 2 Hz), 6,53 (1H, br s), 6,58 (1H, br s) 3-Methoxy-5-pivaloyloxvbenzaldehyddimethylacetal (20). (73% über 3 Stufen, Öl)
  • IR (CHCl&sub3;, cm&supmin;¹): 2960, 2935, 1741 (C=O), 1608, 1597, 1462, 1350, 1273, 1190, 1139, 1115, 1056, 999, 902, 848
  • ¹H-NMR (ppm): 1,34 (9H, s), 3,31 (6H, s), 3,80 (3H, s), 5,35 (1H, s), 6,57 (1H, d, J = 2 Hz), 6,75 (1H, br s), 6,87 (1H, br s) Diethyl-1-methoxy-1-(3-methoxy-5-pivaloyloxyphenyl)methanphosphonat (21). (40%, Öl)
  • IR (CHCl&sub3;, cm&supmin;¹): 2990, 2980, 1742 (C=O), 1606, 1590, 1463, 1272, 1240, 1136, 1110, 1100, 1055, 1023, 970
  • ¹H-NMR (ppm): 1,21 (3H, t, J = 3 Hz), 1,23 (3H, t), 1,32 (9H, s), 3,39 (3H, s), 3,78 (3H, s), 4,06 (4H, m), 4,44 (1H, d, J = 16 Hz), 6,56 (1H, m), 6,72 (1H, m), 6,85 (1H, m) 3-Methoxy-5-pivaloyloxy-1-(methoxytricyclo[3.3.1.1.3,7]dec-2-ylidenmethyl)benzol (22a.
  • IR (CHCl&sub3;, cm&supmin;¹): 2910, 1740 (C=O), 1600, 1580, 1460, 1325, 1272, 1140, 1114, 1097, 1079, 1055
  • ¹H-NMR (ppm): 1,35 (9H, s); 1,56-1,96 (12H, m), 2,68 (1H, br s), 3,23 (1H, br s), 3,31 (3H, s), 3,80 (3H, s), 6,53 (1H, t, J = 211z), 6,61 (1H, br s), 6,72 (1H, m)
    • 3-Hydroxy-5-methoxy-1-(methoxvtricyclo[3.3.1.1.3,7]dec-2-ylidenmethyl)benzol (22).
  • (64%, weiße Kristalle, Fp. 159ºC)
  • IR (CHCl&sub3;, cm&supmin;¹): 3590 (OH), 3320 (OH), 2910, 1591, 1342, 1150, 1098
  • ¹H-NMR (ppm): 1,78-1,97 (12H, m), 2,68 (1H, br s), 3,23 (1H, br s), 3,33 (3H, s), 3,78 (3H, s), 5,49 (1H, s), 6,37 (1H, m), 6,45 (2H, m)
    • Pyridinium-5-methoxy-3-(methoxytricyclo[3.3.1.1.3,7]dec-2-ylidenmethyl)-1-phenylphosphat
  • (23). (62%, farbloses flockiges Pulver)
  • IR (CHCl&sub3;, cm&supmin;¹): 2911, 1584, 1448, 1425, 1328, 1149, 1099, 960, 870
  • ¹H-NMR (ppm): 1,68-1,92 (12H, m), 2,63 (1H, br s), 3,17 (1H, br s), 3,23 (3H, s), 3,68 (3H, s), 6,55 (1H, br s), 6,72 (1H, br s), 6,76 (1H, br s), 6,98 (1H, br s)
    • Dinatrium-5-methoxy-3-(methoxyspiro[1,2-dioxetan-3,2'-tricyclo[3.3.1.1.3,7]decan]-4- yl)-1-phenylphosphat (3).
  • (85%, weißes, flockiges Pulver)
  • ¹H-NMR (D&sub2;O, ppm): 0,98 (1H, br d), 1,22 (1H, br d), 1,46-1,76 (10H, m), 2,20 (1H, br s), 2,78 (1H, br s), 3,14 (3H, s), 3,74 (3H, s), 6,91 (1H, br s), 6,68-6,97 (2H, sehr breites Signal)
  • ³¹P-NMR (D&sub2;O, ppm): 44,8 (1P)
    • 3-Hydroxy-5-methoxy-1-(methoxy-(5'-chlor)tricyclo(3.3.1.1.3,7]dec-2-ylidenmethyl)- benzol (24).
  • (63%, weiße Kristalle, Fp. 134ºC)
  • IR (CHCl&sub3;, cm&supmin;¹): 3590 (OH), 3330 (OH), 2930, 1610, 1591, 1450, 1430, 1341, 1150, 1100, 1080, 1056, 1028, 829
  • ¹H-NMR (ppm): 1,68-2,40 (11H, m), 2,82 (1H, br s), 3,31 (3H, s), 3,42 (1H, br s), 3,78 (3H, s), 6,37-6,41 (3H, m)
    • Dinatrium-5-methoxy-3-(methoxyspiro[1,2-dioxetan-3.2'-(5'-(5'-chloricyclo-[3.3.1.1.3,7- decan-4-yl)-1-phenylphosphat (4).
  • (57% über 4 Stufen, weißes, flockiges Pulver)
  • ¹H-NMR (D&sub2;O, ppm, Gemisch aus Syn-/Anti-Isomeren): 0,94 (1H, br d), 1,19 (1H, br d), 1,42 (1H, br d), 1,50 (1H, br s), 1,58 (1H, br d), 1,67-2,16 (17H, m), 2,38 (1H, br s), 2,40 (1H, br s), 3,00 (2H, br s), 3,15 (3H, s), 3,16 (3H, s), 3,73 (3H, s), 3,74 (3H, s), 6,90 (1H, br s), 6,93 (1H, br s), 6,65-7,00 (4H, sehr breites Signal)
  • ³¹P NMR (D&sub2;O, ppm, Gemisch aus Syn-/Anti-Isomeren): 44,8 (2P)
    • Literaturstellen
  • 1. Das 5-Chlorvanillin wurde wie bei Hann und Spencer (J. Am. Chem. Soc., 1927, 49: 535-537) beschrieben synthetisiert, Fp. 163ºC.
  • 2. Protonenschwammformiat (N,N,N'N'-Tetramethyl-1,8-naphthalindiammoniumformiat): Ameisensäure (98%, 1,2 ml, 31 mmol) wurde zu einer Lösung von Protonenschwamm (6,8 g, 32 mmol) und CH&sub2;Cl&sub2; (8 ml) bei 0ºC gegeben. Nach dem Erwärmen aufRaumtemperatur wurde das Lösungsmittel verdampft, und das Protonenschwammformiat kristallisierte in Form farbloser Kristalle unter Trocknen im Hochvakuum mit geringem Erwärmen. Die Protonenschwammformiatkristalle (Fp. 79ºC) müssen bald nach der Herstellung verwendet werden, da Ameisensäure beim Stehen verdampft und Protonenschwamm zurückbleibt (Fp. 50ºC).
  • Unter anderen erfindungsgemäßen Verbindungen innerhalb der Struktur der Formel (I) besitzt eine besonders bevorzugte Verbindung die Struktur:
  • Der Name dieser Verbindung ist Dinatrium-2-chlor-5-(4-methoxyspiro[1,2-dioxetan-3,2'- (5'-chlor)tricyclo [3.3.1.13,7]decan]-4-yl)-1-phenylphosphat.
  • Diese Verbindung wird im Allgemeinen als CDP-Star bezeichnet. Sie kann, wie im folgenden Reaktionsschema dargestellt, synthetisiert werden.
    • 4-Chlor-3-methoxybenzaldehyddimethylacetal 3
  • Ein heterogenes Gemisch aus Methanol (2 ml), CH&sub2;Cl&sub2; (3 ml), 4-Chlor-3- methoxybenzaldehyd (2 g, 11,7 mmol; hergestellt wie von R. M. Riggs et al. in J. Med. Chem., 30 1887, 1987, beschrieben), Trimethylorthoformiat (1,7 ml, 15,5 mmol) und ein großer Kristall aus p-Toluolsulfonsäure werden bei Raumtemperatur eine Stunde gerührt. Zusätzliches MeOH (1 ml) und Kristalle aus p-Toluolsulfonsäure werden zugegeben, und die Lösung wird erwärmt, bis sie homogen ist. Nach Beendigung der Reaktion wird die Lösung 5 Minuten mit überschüssigem festen NaHCO&sub3; gerührt und zur Entfernung der Lösungsmittel durch Rotation eingedampft. Die Paste wird in 40 ml EtOAc gelöst, gegen verdünnte NaHCO&sub3;-Lösung verteilt und eingedampft, wobei ein helibraunes Öl erhalten wird. Die Reaktion wird mit weiteren 2 g 4-Chlor-3- methoxybenzaldehyd wiederholt, und beide Produktöle werden vereinigt, wobei 4,37 g (86%) Dimethylacetal 3 erhalten werden.
  • IR (rein, cm&supmin;¹): 2930, 2810, 1582, 1580, 1483, 1460, 1402, 1348, 1268, 1100, 1059, 989, 861, 827, 790
  • ¹H-NMR (CDCl&sub3;, ppm): 3,30 (6H, s), 3,90 (3H, s), 5,33 (1H, s), 6,95 (1H, d), 7,03 (1H, s), 7,32 (1H, d)
    • Diethyl-1-methoxy-1-(4-chlor-3-methoxyphenyl methanphosphonat 4
  • Eine Lösung aus Dimethylacetal 3 (4,3 g, 20 mmol), über Sieben getrocknetes CH&sub2;Cl&sub2; (20 ml) und Triethylphosphit (4,1 ml, 24 mmol) wurde unter Argon bei -78ºC gerührt. Bortrifluorid-etherat (2,95 ml, 24 mmol) wurde tropfenweise bei -78ºC zugegeben, die Lösung wurde 5 min gerührt und über Nacht bei -20ºC stehen gelassen. Am nächsten Tag wurde das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur erwärmt und 5 Stunden zur Beendigung der Phosphonatbildung gerührt. Unter heftigem Rühren wurde die Reaktion mit festem NaHCO&sub3;, gefolgt von 40 ml gesättigter NaHCO&sub3;-Lösung, abgeschreckt. Nachdem die Gasbildung aufhörte, wurden 40 ml CH&sub2;Cl&sub2; und 20 ml H&sub2;O zugegeben, das Biphasengemisch wurde getrennt, und die CH&sub2;Cl&sub2;-Phase wurde gewonnen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und eingedampft. Nach dem Pumpen im Vakuum wurde das Öl an einer Silicagelschicht unter Eluierung mit CH&sub2;Cl&sub2; gereinigt, wobei das Phosphonat 4 als hellgelbes Öl (6,01 g, 99%) erhalten wurde.
  • IR (rein, cm&supmin;¹): 2980, 2930, 1590, 1580, 1480, 1460, 1408, 1280, 1250, 1095, 1055, 1025, 967, 871, 809, 790, 754, 728
    • 4-Chlor-3-methoxy-1-(methoxy-(5'-chlor)tricyclo[3.3.1.1.3,7]dec-2-ylidenmethyl)benzol 5
  • Phosphonat 4 (3,2 g, 10 mmol) wurde in 30 ml trockenem THF unter Argon gelöst und auf -78ºC gekühlt. Die tropfenweise Zugabe von nBuLi (2,3M, 4,4 ml, 10,1 mmol) ergab ein gelb-organges Phosphonatylid. Nach dem Rühren der Ylidlösung während 10 min wurde 5- Chlor-2-adamantanon (1,75 g, 9,5 mmol), gelöst in 8 ml THF, tropfenweise zu dem Ylid bei -78ºC gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde langsam auf Raumtemperatur im Verlauf von 45 min erwärmt und 2 Stunden am Rückfluss erhitzt. Nach dem Kühlen wurde das THF im Vakuum abgestreift, und das Produkt wurde zwischen EtOAc/Hexanen (1 : 1) und verdünntem NaHCO&sub3; verteilt. Die organische Schicht wurde über NaHCO&sub3; getrocknet. Die organische Schicht wurde über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet, das Lösungsmittel abgestreift und an Silicagel (2-4% EtOAc/Hexane) gereinigt, wobei 3,3 g (96%) Enolether 5 als farbloser, viskoser Gummi erhalten wurden.
    • 4-Chlor-3-hydroxy-1-(methoxy-(5'-chloricyclo[3.3.1.1.3,7]dec-2-ylidenmethyl)benzol 6
  • Die Entmethylierung zu dem Enoletherphenol 6 verlief glatt beim Erhitzen des Enolethers 5 (3,3 g, 9,3 mmol) in 22 ml DMF bei 135ºC in Anwesenheit von Natriumethanthiolat (14 mmol) während 1,5 h. Das Reaktionsgemisch wurde abgekühlt und zwischen 50 ml EtOAc, 100 ml 1M NH&sub4;Cl und 10 ml gesättigter NaHCO&sub3;-Lösung verteilt. Die organische Phase wurde gewonnen und gut mit Wasser gewaschen, während die wässrige Phase einmal mit EtOAc gewaschen wurde. Die EtOAc-Schichten wurden vereinigt, mit Salzlösung gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und vom Lösungsmittel im Vakuum abgestreift. Das Rohöl wurde an einer Silicagelsäule unter Eluierung mit 50%igem CH&sub2;Cl&sub2;/Hexane gereinigt, wobei 3,6 g Phenol 6 als Rohöl erhalten wurden. Die weitere Reinigung durch Kristallisationen aus gekühlter 15%iger CH&sub2;Cl&sub2;/Hexane-Lösung ergab das Phenol 6 als Feststoff (2,18 g, 68%).
  • IR (CHCl&sub3;, cm&supmin;¹): 3530 (OH), 3300 (OH), 2920, 2845, 1568, 1478, 1308, 1190, 1166, 1090, 1079, 1042, 1020, 821
  • ¹H-NMR (CDCl&sub3;, ppm): 1,57-2; 28 (11H, m), 2,75 (1H, br s), 3,27 (3H, s), 3,41 (1H, br s), 5,57 (1H, s), 6,79 (1H, dd, J = 8 Hz, 2 Hz), 6,93 (1H, d, J = 2 Hz), 7,28 (1H, d, J = 8 Hz)
    • Natrium-2-cyanoethyl-2-chlor-5-(methoxy-(5'-chlor)tricyclo[3.3.1.1.3,7]dec-2-ylidenmethyl)-1-phenylphosphat 7
  • Zu einer Lösung aus Phenol 6 (0,75 g, 2,2 mmol), Triethylamin (400 ul, 2,86 mmol) und wasserfreiem THF (8 ml) wurde 2-Chlor-2-oxo-1,3,2-dioxaphospholan (Fluka, 240 ul, 2,6 mmol) bei Raumtemperatur unter Argon gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 3 Stunden gerührt, wobei während dieser Zeit Triethylammoniumhydrochlorid ausfiel. Die Lösung wurde von dem Niederschlag mit einer Spritze mit Baumwollspitze unter starkem Argonfluss abpipettiert. Der Niederschlag wurde mehrere Male mit Ether gespült, und die vereinigten Lösungen und Waschlösungen wurden im Vakuum eingedampft, wobei ein Schaum erhalten wurde, der vor der Einwirkung von Feuchtigkeit geschützt wurde.
  • Der Schaum wurde in wasserfreiem DMF (4 ml) gelöst und mit trockenem NaCN (140 mg, 2,8 mmol) bei Raumtemperatur 24 h gerührt, wobei β-Cyanoethylphosphatdiester gebildet wurde. Das Reaktionsgemisch wurde im Hochvakuum bei 55ºC zur Entfernung von DMF an der Pumpe erhitzt, wobei der Phosphatdiester 7 als Gummi zurückblieb. Der rohe Phosphatdiester wurde ohne weitere Reinigung photooxygeniert.
    • Syn- und Anti-Dinatrium-2-chlor-5-(4-methoxyspiror 1,2-dioxetan-3,2'-(5'-chlor)tricvclo[3.3.1.1.3,7]decanl-4-yl)phenylphosphat 1
  • Der Phosphatester 7 wurde in 20 ml 10% MeOH/CHCl&sub3; gelöst, zu der Lösung wurde 5,10,15,20-Tetraphenyl-21H,23H porphin (TPP, 0,8 ml einer 2 mg/ml CHCl&sub3;-Lösung) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde mit Sauerstöffgesättigt und mit einer 250 W Hochdruck- Natriumdampflampe, umwickelt mit einem Kapton-Film, bei 5ºC bestrahlt, während Sauerstoff durch die Lösung geleitet wurde. Die analytische Umkehrphasen-HPLC-Analyse zeigte eine vollständige Dioxetanbildung bei der Bestrahlung während 20 min. Die Lösungsmittel wurden im Vakuum bei Raumtemperatur abgestreift, der Rückstand wurde an der Pumpe im Hochvakuum unter Bildung eines Gummis behandelt, und der Gummi wurde bei -20ºC gelagert.
  • Das rohe Cyanoethylphosphatdiesterdioxetan 8, gelöst in 11 ml MeOH, wurde mit Natriummethoxid (0,5 ml 25%-iges NaOMe in MeOH) bei Raumtemperatur während 30 min der Schutzgruppenabspaltung unterworfen. Nach Beendigung der β-Eliminierung der Cyanoethylgruppe wurden 2 ml gesättigte NaHCO&sub3;-Lösung zugegeben und das MeOH am Rotationsverdampfer entfernt. Wasser mit HPLC-Qualität (15 ml) wurde zugegeben, und die braune Lösung wurde durch ein 0,45 u Nylonfilter geleitet. Das Lösungsvolumen wurde auf 40 ml mit Wasser von HPLC-Qualität eingestellt und durch präparative HPLC gereinigt, wobei ein CH&sub3;CN/H&sub2;O- Gradient durch eine Polystyrolsäule (PLRP-S, Polymer Laboratories) verwendet wurde. Die gefriergetrockneten Fraktionen ergaben 0,81 g (ausgehend von Phenol 6 : 74%) Dioxetan 1. Die analytische Umkehrphasen-HPLC an einer Polystyrolsäule unter Verwendung eines Gradienten aus Acetonitril und 0,1% NaHCO&sub3; und die UV-Detektion bei 270 nm, zeigte einen Peak mit einer Vorderlaufschulter, der ein Gemisch aus Syn- und Anti-Isomeren darstellte. Eine Probe des Produktes wurde als Isomerengemisch in 0,1M Diethanolaminpuffer (1mM MgCl&sub2;) bei pH 10 gelöst. Nach der Behandlung mit alkalischer Phosphatase wurde Licht wie erwartet emittiert, was bestätigte, dass das Produkt das 1,2-Dioxetan der angenommenen Struktur war.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin einen Kit zur Durchführung eines Assays unter Verwendung eines chemilumineszierenden Dioxetan-Reportermoleküls, umfassend das Dioxetan nach einem der Ansprüche 1 bis 13, und ein Enzym, das in wässriger Lösung die Gruppierung X des Dioxetans spalten kann.
  • Bevorzugte Ausführungsformen dieses Kits sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche 14 bis 22.
  • Die Erfindung betrifft schließlich auch ein Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit eines Enzyms in einer Probe, das die Behandlung der Probe eines Dioxetans der Ansprüche 1 bis 13 und den Nachweis der Freisetzung des Lichts, das dabei auftritt, umfasst, wobei das Enzym die enzymlabile Gruppe X spaltet, und wobei der Nachweis des Lichts, das freigesetzt wird, die Anwesenheit des Enzyms in einer Probe anzeigt.
  • Bevorzugte Ausführungsformen dieses Verfahrens sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche 24 bis 28.
    • BEISPIELE
  • Verschiedene erfindungsgemäße Dioxetane wurden hergestellt, und es wurden ihre wesentlichen Eigenschaften geprüft. Eingeschlossen als hergestellte und getestete Dioxane sind solche, worin R Methyl, X Phosphat und Y² Chlor bedeuten, und Z in der 4- oder 5-Stellung eines Phenylrings vorhanden ist. In den folgenden Tests werden diese Dioxetane mit im Handel erhältlichen Standards CSPD® und AMPPDTM verglichen.
    • Chemilumineszenz-Detektion von alkalischer Phosphatase in Lösung
  • Alkalische Phosphatase (5,25 · 10&supmin;¹&sup7; mol) wurde in 0,5 ml 0,1M Diethanolamin, 1 mmol MgCl&sub2;, pH 10, enthaltend 0,4 mmol Dioxetan, bei Raumtemperatur inkubiert. Die Chemilumineszenz (insgesamt 5 Sekunden) wurde in einem Berthold LB952T-Luminometer nach 5,10, 20, 30, 44, 50 und 60 Minuten gemessen. In den Fig. 1 und 2 werden die Wirkungen von CSPD® und CDP-StarTM verglichen. In Fig. 1 ist ein Vergleich von CSPD® und CDP-StarTM als relative Lichteinheiten (RLU) gegenüber der Zeit graphisch dargestellt. Der Durchschnitt der drei Wiederholungen ist graphisch dargestellt. In Fig. 2 sind die Ergebnisse dargestellt, die man bei einem anderen Satz von Proben, enthaltend 1 mg/ml chemilumineszierendes Verstärkungspolymer Polyvinylbenzyltributylammoniumchlorid, erhält.
    • Chemilumineszenz-Detektion von biotinyliertem pBR322-35mer auf Nylonmembran
  • Biotinyliertes pBR322-35mer (13,1 pg in 1 ul) wurde in Form von Flecken auf ein kleines Stück positiv geladener Nylonmembran (Tropilon-PlusTM) aufgetragen. Die Membran wurde vollständig getrocknet, und DNA wurde an der Membran mit einer UV-Vernetzung (120 mJ/cm²) fixiert. Die Membran wurde mit PBS befeuchtet und dann in Blockierungspuffer (0,2% 1-BlockTM, 0,5% SDS in PBS) während 10 Minuten in einem Streptavidin-alkalische- Phosphatase-Konjugat (Avidx-APTM, Tropix; verdünnt mit 1 : 5000 Blockierungspuffer) während 20 Minuten inkubiert und dann einmal während 5 Minuten mit Blockierungspuffer und dreimal während 5 Minuten mit Waschpuffer (0,5% SDS in PBS) gewaschen. Die Membranen wurden dann zweimal während 5 Minuten mit Assaypuffer (0,1 M DEA, 1 mmol MgCl&sub2;, pH 10,0) gewaschen. Schließlich wurden die Membranen zugeschnitten und in einem kleinen Quadrat heißverschweißbarem Kunststoff mit 40 ul 0,25 mmol CSPD oder CDP-Star (verdünnt mit Assaypuffer) versiegelt. Das versiegelte Membranstück wurde unmittelbar an ein Rohr geklebt (vorinkubiert bei 22ºC) und in ein Turner Modell 20e Luminometer (Turner Designs; Inc. Mountain view, CA) gestellt. Die Lichtemission wurde alle 5 Minuten während einer Zeit von 24 Stunden bei 22ºC aufgezeichnet. Die Fig. 3 ist eine graphische Darstellung der Chemilumineszenzintensität (RLU) gegen die Zeit für CSPD und CDP-Star.
    • Chemilumineszenz-Detektion von Westerblotted humanes Transferrin
  • Gereinigtes humanes Transferrin (Boehringer/Mannheim Cat #1317 415) wurde serienmäßig mit 1X SDS-PAGE-Beladungspuffer (0,06 M Tris-HCl, pH 6,8, 2,25% Glycerin, 0,5% β- Mercaptoethanol, 2% SDS, 0,05% Bromphenolblau) verdünnt. Die Verdünnungen wurden bei 95ºC während 5 Minuten erhitzt, und 5 ul verdünnte Probe wurde pro Gelbahn aufgetragen. Die Proben wurden elektrophoretisch gemäß SDS-PAGE an 10%igen Polyacrylamid-Minigelen unter Verwendung einer Hoefer SE250-Minigelvorrichtung getrennt. Jeder Blot enthielt 10, 3, 3, 1, 1, 0,37, 0,12 und 0,04 ng Mengen an Transferrin. Nach der Elektrophorese wurden die Gele und Membranen mit Transferpuffer (5 mmol MOPS, pH 7,5, 2 mmol Natriumacetat, 20% Me- OH) für 15 Minuten äquilibriert. Das Protein wurde auf PVDF (TropifluorTM) und eine positiv geladene Nylon (Tropilon-PlusTM)-Membran während 1 Stunde bei 90 V bei 4ºC übertragen. Die Blots wurden in Blockierungspuffer (BB-1 [0,2% 1-BlockTM, 0,1% Tween-20 in PBS] wurde für PVDF und BB-2 [3% 1-BlockTM, 0,1% Tween-20 in PBS] wurde für Nylon verwendet), während 30 Minuten inkubiert. Die Blots wurden dann mit Kaninchen-polyclonalem antihumanen Transferrin (Boehringer/Mannheim Cat #615 015; verdünnt 1 : 5000 in einem geeigneten Blockierungspuffer) während 30 Minuten inkubiert und dann zweimal während 5 Minuten gewaschen (PVDF mit BB-1 und Nylon mit Waschpuffer [0,1% Tween-20 in PBS]). Danach wurden die Blots mit Ziegen-anti-Kaninchen-IgG-alkalische-Phosphatase-Konjugat (Tropix; verdünnt 1 : 10.000 in einem geeigneten Blockierungspuffer) während 20 Minuten inkubiert und dann zweimal während 5 Minuten wie oben gewaschen. Die Blots wurden dann zweimal während 5 Minuten in Assaypuffer (0,1M DEA, 1 mmol MgCl&sub2;, pH 10,0) gewaschen. Schließlich wurden die Blots mit 0,25 mmol CSPD oder CDP-Star (verdünnt in Assaypuffer) während 5 Minuten inkubiert. Überschüssige Substratlösung wurde von den Blots ablaufen gelassen, sie wurden in Kunststoff-Report-Hüllen gegeben und auf einem Kodak XAR-5-Film belichtet. Die an Nylon- und PVDF-Membranen erhaltenen Ergebnisse sind in den Fig. 4 bis 5 dargestellt.
    • Chemilnmineszenz-Detektion eines einzelnen Copy-Hefegens an einer Nylonmembran
  • Die gesamte genomische DNA aus der Hefe Saccharomyces cerevisiae wurde mit EcoR1- und Bg/l 11-Restriktionsendonukleasen abgebaut. 5,0-, 0,- und 0,05 ug-Mengen von jedem DNA-Digest wurden durch Elektrophorese in einem horizontalen 0,8% Agarose 1X TBE- Gel getrennt. Nach der Elektrophorese wurde das Gel in 1,5M NaCl, 0,5M NaOH, während 45 Minuten zur Denatuerierung der DNA eingeweicht und dann in einem Neutralisationspuffer (1M Tris, 1,5M NaCl, pH 7,4) 45 Minuten inkubiert. Die DNA wurde auf positiv geladene Nylonmembranen (Tropilon-PIusTM) durch Über-Nacht Kapillarübertragung unter Verwendung von 20X SSC übertragen. Die Membranen wurden an der Luft getrocknet, und die DNA wurde durch UV an die Membran bei 120 mJ/cm² vernetzt. Ein 1 kb Bg/l 11-Fragment, aus dem Hefegen RPB 1 herausgeschnitten, wurde am Gel gereinigt und durch eine Random-Primingreaktion, bei der Biotin-14-dCTP eingearbeitet wurde, biotinyliert. Die Membranen wurden während 30 Minuten bei 68ºC in einer Hybridisierungslösung (7% SDS, 0,25M Na&sub2;PO&sub4;, 1,0 mmol EDTA) hybridisiert, über Nacht bei 68ºC mit 5 ml frischer Hybridisierungslösung, enthaltend 5 ng/ml denaturierter Sonde, hybridisiert und dann aus der Hybridisierungslösung entfernt und wie folgt gewaschen: Zweimal während 5 Minuten mit 2X SSC, 1% SDS bei Raumtemperatur; zweimal während 15 Minuten mit 0,1X SSC, 1% SDS bei 68ºC; und zweimal für 5 Minuten in 1X SSC bei Raumtemperatur. Die Membranen wurden dann während 10 Minuten in Blockierungspuffer (0,2% Casein, 0,5% SDS, PBS) und 20 Minuten mit 1 : 5000 Verdünnung AVIDx-APW in Blockierungspuffer inkubiert. Sie wurden dann im Blockierungspuffer während 5 Minuten, dreimal während 10 Minuten mit Waschpuffer (0,5% SDS, PBS) und zweimal während 2 Minuten in Assaypuffer (0,1M Diethanolamin, 1,0 mmol MgCl&sub2;, pH 10,0) gewaschen, und anschließend erfolgte eine Inkubierung während 5 Minuten in 0,25 mmol Dioxetan in Assaypuffer. Nach dem Ablaufenlassen von überschüssiger Substratlösung wurden die Membranen in Kunststoff eingewickelt und auf einen Röntgenfilm belichtet. Es erfolgten Belichtungen von 60 Minuten, nach 10 Minuten, 70 Minuten, 19 Stunden nach der Substratinkubierung. Die Vergleiche zwischen CSDP und CDP-Star sind in den Fig. 6, 7 und 8 dargestellt.
    • Chemilumineszenz-Detektion von DNA-Seciuenzleitern
  • DNA-Sequenzierungsreaktionen wurden mit dem Tropix SEQlightTM-Kit unter Verwendung von biotinyliertem (-20) Universalprimer und einzelsträngiger M13 mp18-Matrizen- DNA durchgeführt. Reaktionsprodukte wurden an einem 6% Polyacrylamid-8M-Harnstoff-Gel getrennt, durch Kapillarwirkung auf Tropilon-PIusTM-Nylon-Membranen transferriert und auf der Membran durch UV vernetzt (Gesamtbestrahlung - 120 mJ/cm²). Eine Chemilumineszenz- Detektion wurde durchgeführt, indem die Membran 10 Minuten in Blockierungspuffer (0,2% i- BIockTM, 0,5% SDS, PBS) für 20 Minuten in Konjugat-Lösung (1/5000-Verdünnung von Avidx-AP-Streptavidin-alkalische Phosphatase-Konjugat in Blockierungspuffer) inkubiert wurde, dann einmal 5 Minuten mit Blockierungspuffer, 3 · 5 Minuten mit Waschpuffer (0,5% SDS, PBS) und 2 · 2 Minuten mit Assaypuffer (0,1M Diethanolamin, 1 mmol MgCl&sub2;, pH 10) gewaschen wurde. Jeder Membranstreifen wurde für 5 Minuten entweder mit 0,25 mmol CSPD oder CDP-Star in Assaypuffer inkubiert. Alle Schritte wurden bei Raumtemperatur in einem großen, heißgesiegelten Kunststoffbeutel unter mäßigem Schütteln (140 bis 170 Upm) durchgeführt. Es wurde ein Vergleich von CSPD und CDP-Star an drei Punkten angestellt. Die Zeit nach Inkubation mit Substrat und Belichtungszeit bei einem Kodak XAR-5-Röntgenstrahl-Film sind bei Fig. 9 angegeben.
  • Weitere Untersuchungen liefern Werte wie Quantenausbeute (durchgeführt von einem unabhängigen Labor nach dem unten angegebenen Verfahren), T1/2 und die Emissionswellenlängenmaxima. Diese Dioxetane werden durch eine Ziffer gekennzeichnet, und in den Tabellen wird nach der Ziffer die Identität des Substituenten am Adamantylring, wenn es einen gibt, gefolgt von der Identität des Z-Substituenten, angegeben. In den getesteten Verbindungen ist X Phosphat. Werte für die Quantenausbeute und T1/2 werden sowohl für Dioxetan allein in 0,1 molarem DEN als auch in Gegenwart eines Verstärkungsmittels, Sapphire 11, erhalten.
    • Protokoll zur Bestimmung der Quantenausbeute
  • 500 ul 3,2 · 10&supmin;&sup4;M-Lösung eines Dioxetans in 0,1M DEN pH 10,0, wurden in ein 12 · 75 mm-Röhrchen bei 20ºC gegeben. Die Lösung wurde in einem gekühlten Wasserbad 10 Minuten lang auf 20ºC äquilibriert. 2 ul alkalische Phosphatase-Suspension wurden zu dem Röhrchen, das Dioxetan enthielt, gegeben und unverzüglich eine Sekunde lang verwirbelt und in das 20ºC- Wasserbad gestellt. Das Röhrchen wurde dann in ein MGM-Optocomp®-I-Luminometer gestellt, und das Lichtsignal wurde bei Integrationszeiten von 1 Sekunde gemessen. Nachdem das Lichtsignal gemessen worden war, wurde das Röhrchen in das 20ºC-Wasserbad zurückgestellt, und die Messung wurde wiederholt. Die Gesamtimpulse für das Dioxetan wurden aus den Intensitätsdaten bestimmt. Die Gesamtimpulse, die für eine gegebene Dioxetankonzentration beobachtet wurden, ist das Produkt der Photonennachweiseffizienz (PDE) des Luminometers, der Quantenausbeute an Dioxetan und der Anzahl der Moleküle, die fähig ist, Licht zu emittieren (Konzentration an dephosphorylierten Dioxetanen). PDE für das MGM-Optocomp-I- Luminometer wurde als 2,56 · 10&supmin;³ bestimmt, gemessen mit einem Biolink®-absoluten Standard und unter Verwendung der bekannten Spektralantwort des Luminometer-PMT und dem bekannten Emissionsspektrum der Dioxetane. Die Quantenausbeute wird errechnet, indem die gemessenen Gesamtimpulse durch die PDE und die Konzentration des Dioxetan dividiert werden.
    • Berechnung der Halbwertszeit für die Lichtemission im Stationärzustand
  • Aus den Turner-Luminometer-Ablesedaten wurde das Maximumsignal gemessen. Das Maximumsignal minus die Turner-Licht-Ableseeinheiten in 30-, 150-, 300- oder 600-Sekunden- Intervallen, wurde errechnet und gegen die Zeit in Sekunden graphisch aufgetragen. Aus den Diagrammen wurde zur Bestimmung der Halbwertszeit eine exponentielle Gleichung errechnet. Die Halbwertszeiten der Dioxetane wurden ebenfalls direkt aus den Turner-Luminometer-Ausdrucken bestimmt.
    • Emissionsmaxima
  • Zu 2 ml einer Lösung mit pH 10, von 0,4 mmol Dioxetan, 0,1M Diethanolamin, 1 mmol MgCl&sub2;, wurden 9,9 · 10&supmin;¹¹M alkalische Phosphatase gegeben. Die Lösung wurde 5 Minuten in einem Spex-Fluorolog-Fluorimeter äquilibriert und dann 5 Mal bei 0,5 s/nm auf Chemilumineszenz-Emission durchgemustert. Das Chemilumineszenz-Emissionswellenlängenmaximum wurde aufgezeichnet.
    • Chemilumineszenz-DNA-Sequenzieruns
  • Eine DNA-Sequenzierung mit Chemilumineszenz-Detektion wurde durchgeführt, wie es im Tropix SEQ-LightTM-Protokoll beschrieben ist. Kurz zusammengefaßt, DNA-Sequenzierungsreaktionen wurden mit biotinylierten Primern unter Verwendung von M13-Einzelstrang- Phagen-DNA als Matrize initiiert. Die Reaktionsprodukte wurden durch 8 M-Harnstoff- Denaturierungs-PAGE getrennt, durch Kapillarwirkung horizontal auf Tropilon-Plus-Nylonmembran transferriert und auf der Membran durch Belichtung mit UV-Licht, unter Verwendung eines Spectronics SpectroLinker XL-1500 bei 200 mJ/cm², vernetzt. Die Membranen wurden mit Blockierungspuffer (0,2% I-BlockTM, 0,5% Natriumdidodecylsulphat/SDS, in Phosphatgepufferter Salzlösung/PBS [20 mmol Natriumphosphat, pH 7,2, 150 mmol NaCl]) für 10 Minuten inkubiert, mit einer 1 : 5000-Verdünnung Avidx-AP-Streptavidin-alkalische Phosphatase in Blockierungspuffer für 20 Minuten inkubiert, 5 Minuten in Blockierungspuffer gewaschen, 3 · 5 Minuten mit Waschpuffer (0,5% SDS, PBS) gewaschen, 2 · 5 Minuten mit Assaypuffer (0,1M Diethanolamin, 1 mmol MgCl&sub2;, pH 10) gewaschen und dann für 5 Minuten mit Dioxetanlösung (CSPD, 140-17 oder 128-87, verdünnt auf 0,25 mmol in Assaypuffer) inkubiert. Die Membranen wurden abtropfen gelassen, in einer Kunststoffmappe verschweißt und auf einem Kodak XAR-5- Röntgenfilm belichtet. Für das Dioxetan 128-87 war die Belichtungszeit 70 Minuten und für 140-17 80 Minuten, in beiden Fällen 65 Minuten nach Substratzugabe. Für den Vergleich Dioxetan 128-87 gegen CSPD war die Membranbelichtungszeit 5 Minuten nach einer 24stündigen Inkubation mit Substrat; Fig. 10 und 11. Details dieses Protokolltyps sind im Tropix SEQlightTM-DNA-Sequenzierungssystem, erhältlich von Tropix, Inc., wiedergegeben.
  • 00,1M DEA, pH 10, 25ºC
  • Dioxetankonzentration: 3,7 · 10&supmin;&sup7;M bis 6 · 10&supmin;&sup6;M
  • *Vergleichsverbindungen
  • 0,09M DEA + 0,1% Sapphire II, pH 9,95, 25ºC
  • Dioxetankonzentration: 1,8 · 10&supmin;&sup7;M bis 6,1 · 10&supmin;&sup9;M
  • * Vergleichsverbindungen
  • Um die Wechselwirkung des Dioxetans oder mindestens des Emitters in angeregtem Zustand mit, Verstärkungsmitteln des Typs, der zur Verwendung im Zusammenhang mit Dioxetanen bekannt ist, positiv zu beweisen, wurde die Wellenlänge für das Emissionsmaximum in Abwesenheit eines Verstärkungsmittels, in Gegenwart von BDMQ und auf einer Nylonmembran nachgewiesen. Die Daten sind in der folgenden Tabelle angegeben.
  • * Vergleichsverbindungen
    • DOT-BLOT-ASSAYS
  • Wie oben beschrieben wurde, sind die Dioxetane der vorliegenden Erfindung zur Verwendung in Dot-Blot-(Punktautoradiogramm)-Assays geeignet. Die Dioxetane, die nach dem oben beschriebenen Syntheseweg synthetisiert werden, werden in Dot-Blot-Assays verwendet. Bei Bestätigung des Fehlens von Chemilumineszenz bei den Dioxetanen, die an den Z- Substituenten in der 6-Position tragen, sollte betont werden, dass Verbindung 140-62 ein konstantes Fehlen eines Signals oder unter optimalen Bedingungen ein kaum nachweisbares Signal zeigte. Entsprechend lieferte das Dioxetan mit dem Methoxy-Substituenten in der 6-Position mit einem Chlorsubstituenten am Adamantylring, 140-73, im Dot-Blot-Assay kein Signal, was wiederum das Fehlen von Chemilumineszenzaktivität in 6-substituierten Metaphosphatphenyldioxetanen bestätigt (Fig. 12 bis 21).
  • Nitrocellulose- und Nylonmembranen wurden mit einer biotinylierten 35 Basen langen Oligonukleotidsonde betüpfelt. Die Sonde war in 1X SSC verdünnt, was zu einer Ausgangsverdünnung von 210 pg führte. Folgende 1 : 2-Verdünnungen der Ausgangsverdünnung wurden auf die Membranen getüpfelt, 12 Punkte insgesamt. Die Membranen wurden getrocknet, einer optimalen UV-Vernetzung (120 mJ/cm²) unterworfen, für 30 Minuten in Blockierungspuffer (Nitrocellulose: 0,2% I-Block, 0,1% Tween-20, 1X PBS; Nylon: 0,2% I-Block, 0,5% SDS, 1X PBS) gesperrt, 20 Minuten in einer 1 : 5000-Verdünnung von Streptavidin-alkalische Phosphatase-Konjugat, verdünnt in Blockierungspuffer, inkubiert und wie folgt gewaschen: 1 · 5 Minuten in Blockierungspuffer; 3 · 5 Minuten in 1xPBS, 0,3% Tween-20 (Nitrocellulose) oder 3 · 5 Minuten in 1X PBS, 0,5% SDS (Nylon); 2 · 5 Minuten in Substratpuffer (0,1M Diethanolamin, 0,1 mmol MgCl&sub2;, pH 10); 1 · 5 Minuten in einer 1/20-Verdünnung von Nitro-Block (Tropix, Inc. Bedford, MA), verdünnt in Substratpuffer (Nitrocellulose Experiment Only); und 2 · 5 Minuten in Substratpuffer (Nitrocellulose Experiment Only). Die Membranen wurden mit 0,25 mmol Dioxetan, verdünnt in Substratpuffer, 5 Minuten inkubiert. Mehrere Membranen, sowohl in den Nitrocellulose- wie auch in den Nylon-Experimenten, wurden mit 0,25 mg/ml Calfax DB- 45, Calfax 10L-45 oder Calsoft T-60 (Pilot Chemical Company, Los Angeles, CA), 1,0 mg/ml Tween-20, 1,0 mg/ml Nitro-Block und 0,25 mmol Dioxetan, verdünnt in Substratpuffer, für 5 Minuten inkubiert. Diese Membranen wurden keiner 1 : 20-Verdünnung von Nitro-Block unterworfen. Die Membranen wurden dann auf einem Röntgenfilm belichtet und entwickelt.
  • Aus den obigen Resultaten ist zu erkennen, dass elektronenanziehende Gruppen, die an den aromatischen Ring des Dioxetans angefügt sind, die Kinetik der Lichtemission verändern, wobei sie dazu neigen, das Chemilumineszenzsignal zu verstärken. Dagegen beschleunigen elektronenabgebende Gruppen T1/2 offensichtlich durch Erleichterung des Elektronenübergangs von Sauerstoff durch die aromatische Gruppe an das Dioxetan. Auf diese Weise können durch geeignete Auswahl der Natur und Fähigkeit des elektronenabgebenden oder elektronenanziehenden Substituenten Z und gleichzeitiger Auswahl des geeigneten Substituenten für den Adamantylring, wenn gewünscht, Dioxetane spezifischer Merkmale, einschließlich optimierter Signalintensität, optimierter Geschwindigkeit, spezifischer Emissionswellenlänge und dergleichen, erhalten werden.
  • Diese Dioxetane können für Assays jeden Typs eingesetzt werden, in denen ein Enzym, das zur Spaltung des Dioxetans fähig ist, allein vorliegt oder an ein Element des endgültigen Komplexes, den der Analyt, wenn er vorhanden ist, bilden wird, binden kann. Herkömmliche Assayformate sind dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt und werden in den Patenten, die oben als Hintergrund der Erfindung beschrieben sind, erläutert. Eine beispielhafte Offenbarung geeigneter Assays ist im US-Patent 5 112 960 zu finden und dasselbe wird hier als Referenz aufgenommen. Dieses Assayformat per se, das für die verstärkte Leistung hier durch die Dioxetane der Erfindung sorgt, stellt keinen Aspekt der Erfindung dar.
  • Die erfindungsgemäßen Dioxetane, wie auch ihre Zwischenprodukte, wurden sowohl durch eine allgemeine Beschreibung wie auch durch spezifische Ausführungsformen offenbart. Zusätzlich wurde die Dioxetanleistungsfähigkeit allgemein und anhand von Beispielen beschrieben.

Claims (28)

1. Dioxetan der Formel (1)
worin Y¹ und Y² unabhängig H, eine Hydroxylgruppe, ein Halogen, eine unsubstituierte C&sub1;-C&sub1;&sub2;-Alkylgruppe, eine Hydroxy-C&sub1;-C&sub1;&sub2;-alkylgruppe, eine Halogen-C&sub1;-C&sub1;&sub2;-alkylgruppe, eine Phenylgruppe, eine Halogenphenylgruppe, eine C&sub1;- C&sub1;&sub2;-Alkoxyphenylgruppe, eine C&sub1;-C&sub1;&sub2;-Alkoxyphenoxygruppe, eine Hydroxy-C&sub1;-C&sub1;&sub2;-alkoxygruppe, eine Cyanogruppe, eine Amidgruppe, eine C&sub1;-C&sub1;&sub2;-Alkoxygruppe oder eine Carboxylgruppe bedeuten, mit der Maßgabe, dass Y¹ und Y² nicht gleichzeitig Wasserstoff bedeuten, worin R C&sub1;-C&sub1;&sub2;-Alkyl, Phenyl, Naphthyl, Phenyl-C&sub1;-C&sub1;&sub2;- alkyl oder Naphthyl-C&sub1;-C&sub1;&sub2;alkyl bedeutet, worin X eine enzymlabile Gruppe, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Phosphat, Galactosid, Acetat, 1-Phospho-2,3-diacylglycerid, 1-Thio-D-glucosid, Adenosintriphosphat, Adenosindiphosphat, Adenosinmonophosphat, Adenosin, α-D-Glucosid, β-D-Glucosid, β-D-Glucuronid, α-D-Mannosid, β-D-Mannosid, β-D-Fructofuranosid, β- Glucosiduronat, P-Toluolsulfonyl-Largininester und P- Toluolsulfonyl-L-argininamid bedeutet, und Z eine elektronenaktive Gruppe, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Chlor und Alkoxy mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, bedeutet und die 4- oder 5-Stellung des Phenylrings einnimmt, wobei die Verbindung 4-(3-Phosphat-4-methoxyphenyl)-4-methoxyspiro[1,2-dioxetan-3,2'-adamantan], Tetraethylarutioniumsalz ausgeschlossen ist.
2. Dioxetan nach Anspruch 1, worin Z ein Chlor- oder Methoxy-Substituent in der 5-Stellung bedeutet.
3. Dioxetan nach Anspruch 2, worin Z Chlor bedeutet.
4. Dioxetan nach Anspruch 3, worin Y² Wasserstoff und Y¹ Chlor bedeutet.
5. Dioxetan nach Anspruch 1, worin Z Ethoxy oder Chlor bedeutet und in der 4-Stellung steht.
6. Dioxetan nach Anspruch 5, worin Z Chlor, Y² Wasserstoff und Y¹ Chlor bedeutet.
7. Dioxetan nach Anspruch 1, worin Z Methoxy in der 5- Stellung, Y² Wasserstoff und Y¹ Chlor bedeutet.
8. Dioxetan nach Anspruch 4, Anspruch 6 oder Anspruch 7, worin X eine Phosphatgruppierung bedeutet.
9. Dioxetan nach Anspruch 8, worin R C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl bedeutet.
10. Dioxetan nach Anspruch 1, worin Y² Wasserstoff, Y¹ Chlor, Z -OCH&sub3; in der 5-Stellung, R Methyl und X Phosphat bedeutet.
11. Dioxetan nach Anspruch 1, worin Y² Wasserstoff, Y¹ Chlor, Z Chlor in der 5-Stellung, R Methyl und X Phosphat bedeutet.
12. Dioxetan nach Anspruch 1, worin Y² Wasserstoff, Y¹ Chlor, Z Chlor in der 4-Stellung, R Methyl und X Phosphat bedeutet.
13. Dioxetan nach Anspruch 1 mit der Formel:
14. Kit zur Durchführung eines Assays unter Verwendung eines chemilumineszierenden Dioxetan-Reportermoleküls, umfassend das Dioxetan nach einem der Ansprüche 1 bis 13, und ein Enzym, das in wässriger Lösung X von dem Dioxetan abspalten kann.
15. Kit nach Anspruch 14, weiter umfassend eine Verstärkungssubstanz zur Erhöhung des Chemilumineszenzsignals, erhalten aus dem Dioxetan bei der Spaltung der X- Gruppierung in wässriger Lösung.
16. Kit nach Anspruch 14, wobei der Assay ein Immunoassay ist und das Enzym mit einem Mittel komplexiert ist, das an einen Analyten, dessen Anwesenheit oder Konzentration nachgewiesen werden soll, binden kann.
17. Kit nach Anspruch 14, wobei der Assay ein DNA- Sonden-Assay ist, und der Kit weiter eine Membran umfasst, an der der Assay durchgeführt werden kann.
18. Kit nach Anspruch 14, weiter umfassend eine Verstärkungssubstanz zur Erhöhung des Lumineszenssignals, erhalten aus dem Dioxetan bei der Spaltung der X-Gruppierung in wässriger Lösung.
19. Kit nach Anspruch 17, wobei das Enzym mit einem Mittel komplexiert ist, das seinerseits mit einem Analyt, der in der Probe vorhanden ist, komplexiert werden kann, wobei die Anwesenheit oder Konzentration des Analyten bestimmt werden soll.
20. Kit nach Anspruch 14, wobei der Assay ein DNA- Sequenzanalyseassay ist und der Kit weiter eine Membran umfasst, an der der Sequenzanalyeassay durchgeführt werden kann.
21. Kit nach Anspruch 20, wobei der Kit weiter eine Verstärkungssubstanz zur Erhöhung des Chemilumineszenzsignals, erhalten aus dem Dioxetan bei der Spaltung der X- Gruppierung in wässriger Lösung, umfasst.
22. Kit nach Anspruch 20, wobei das Enzym mit einem Mittel komplexiert ist, das die Bindung des Enzyms an die DNA, die in dem Assay sequenziert werden soll, erlaubt.
23. Verbindung der Formel:
worin Q&sub1; CHO, CH(OCH&sub3;)&sub2; or COOM bedeutet, Q&sub2; OH, OM, (CH&sub3;)&sub3;CCOO oder OSiM&sub3; bedeutet, worin M Alkyl oder Aralkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeutet.
24. Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit eines Enzyms in einer Probe, umfassend das Inkontaktbringen der Probe mit einem Dioxetan nach einem der Ansprüche 1 bis 13, und den Nachweis der Freisetzung von Licht, die dadurch verursacht wird, wobei das Enzym die enzymlabile Gruppe X spaltet und wobei der Nachweis des Lichts, das freigesetzt wird, die Anwesenheit des Enzyms in der Probe anzeigt.
25. Verfahren nach Anspruch 24, wobei die Gruppe X Phosphat ist und das Enzym eine Alkaliphosphatase ist.
26. Verfahren zum Nachweis eines ersten Glieds eines spezifischen Bindungspaars mit ersten und zweiten Gliedern, umfassend:
den optischen Nachweis der Chemilumineszenz, gebildet durch Umsetzung eines Dioxetans nach einem der Ansprüche 1 bis 13 mit einem Enzym, welches die enzymlabile Gruppe X des Dioxetans spaltet, wobei das Enzym mit einem zweiten Glied des spezifischen Bindungspaars komplexiert wird.
27. Verfahren nach Anspruch 26, wobei das Verfahren einen Immunoassay umfasst.
28. Verfahren nach Anspruch 26, wobei das Verfahren einen Nukleinsäuresondenassay umfasst.
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Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
USRE36536E (en) * 1986-07-24 2000-01-25 Tropix. Inc. Method of detecting a substance using enzymatically-induced decomposition of dioxetanes
WO1988000695A1 (en) 1986-07-24 1988-01-28 Quest Systems, Inc. Method of detecting a substance using enzymatically-induced decomposition of dioxetanes
US6022964A (en) 1989-07-17 2000-02-08 Tropix, Inc. Chemiluminescent 1,2-dioxetanes
US5603868A (en) * 1992-10-30 1997-02-18 Abbott Laboratories Chemiluminescent electron-rich aryl-substituted 1,2-dioxetanes
JPH09507571A (ja) * 1993-12-23 1997-07-29 トロピックス・インコーポレーテッド 化学発光エネルギー移動検定
US5631167A (en) * 1995-07-31 1997-05-20 Bayer Corporation Capsule chemistry analytical methods employing dioxetane chemiluminescence
US5777135A (en) * 1995-07-31 1998-07-07 Lumigen, Inc. Di-substituted 1,2-dioxetane compounds having increased water solubility and assay compositions
US5721370A (en) * 1995-07-31 1998-02-24 Lumigen Inc. Water soluble tri-substituted 1,2-dioxetane compounds and assay compositions having increased storage stability
AU708266B2 (en) * 1995-10-17 1999-07-29 Applied Biosystems, Llc 1,2 chemiluminescent dioxetanes of improved performance
US5783381A (en) * 1995-10-19 1998-07-21 Tropix, Inc. Chemiluminescent 1,2-dioxetanes
US5834456A (en) * 1996-02-23 1998-11-10 The Dow Chemical Company Polyazamacrocyclofluoromonoalkylphosphonic acids, and their complexes, for use as contrast agents
DE69834077T2 (de) * 1997-01-14 2006-08-24 Daicel Chemical Industries, Ltd., Sakai Nitrierungs- oder carboxylierungskatalysatoren
US6660529B2 (en) 1998-07-28 2003-12-09 Pe Corporation Heteroaryl substituted benzothiazole dioxetanes
CA2338883A1 (en) 1998-07-28 2000-02-10 Tropix, Inc. Benzothiazole dioxetanes
US6555698B1 (en) * 1998-11-17 2003-04-29 Tropix, Inc. Chemiluminescent substrates for neuraminidase, assays for detection of neuraminidase and kits therefor
EP1151090B1 (de) * 1998-12-15 2009-09-02 Applera Corporation Multienzym-nachweisverfahren
CA2370520A1 (en) * 1999-04-16 2000-10-26 Komandoor Elayavalli Achyuthan Viral detection method using viral encoded enzymes and chemiluminescent substrates
US6893827B1 (en) * 2000-02-07 2005-05-17 Applera Corporation Receptor function assay for G-protein coupled receptors and orphan receptors by reporter enzyme mutant complementation
JP3975167B2 (ja) * 2001-01-08 2007-09-12 アプレーラ コーポレイション 樹状化学発光基質
US7368296B2 (en) * 2002-01-17 2008-05-06 Applied Biosystems Solid phases optimized for chemiluminescent detection
WO2004072299A1 (en) * 2003-02-12 2004-08-26 Promega Corporation Methods and kits for dual enzymatic assays whereby light is quenched from luminescent reactions
US7390670B2 (en) * 2003-02-20 2008-06-24 Lumigen, Inc. Signalling compounds and methods for detecting hydrogen peroxide
US20060079699A1 (en) * 2004-08-27 2006-04-13 Brooks Edwards Intermediate compounds and methods for synthesizing chemiluminescent dioxetane substrates
WO2006029302A2 (en) * 2004-09-09 2006-03-16 Applera Corporation Dioxetane-nanoparticle assemblies for energy transfer detection systems, methods of making the assemblies, and methods of using the assemblies in bioassays
US7451802B2 (en) * 2006-01-25 2008-11-18 Nabco Entrances, Inc. Slidable door assemblies with automatic pivot latching
JP2007225547A (ja) * 2006-02-27 2007-09-06 Fujifilm Corp 標的物質の疎水部位の検出方法
US20080248511A1 (en) * 2007-03-26 2008-10-09 Promega Corporation Methods to quench light from optical reactions
CN101462316A (zh) * 2007-12-19 2009-06-24 维斯塔斯风力***有限公司 预成型件的制备方法
WO2010101839A2 (en) 2009-03-02 2010-09-10 Life Technologies Corporation Chemiluminescent compositions, methods, assays and kits for oxidative enzymes
EP2590958B1 (de) 2010-07-08 2015-08-26 Life Technologies Corporation In-situ-chemilumineszenzsubstrate und assays damit
EP2705031B1 (de) * 2011-05-03 2018-04-11 Life Technologies Corporation Flash- und glow-1,2-dioxetane
CN103772433A (zh) * 2012-10-18 2014-05-07 深圳市美凯特科技有限公司 一种用于免疫分析的化学发光试剂amppd的合成方法
CN103073589A (zh) * 2012-12-30 2013-05-01 杭州师范大学 一种1,2-二氧环乙烷类化合物的合成方法
CN104557890A (zh) * 2015-01-12 2015-04-29 王国平 一种碳碳氧氧四元环化合物及其在质谱检测中的应用
DE102016119810A1 (de) 2016-10-18 2018-04-19 Hamilton Bonaduz Ag Schichten zum Nachweis von Sauerstoff

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1521089A (en) * 1975-11-12 1978-08-09 Valeas Srl Aminoethanol derivatives
WO1984000750A1 (en) * 1982-08-23 1984-03-01 Univ Australian Process for the preparation of 3-amino-5-hydroxybenzoic acids and derivatives and analogues thereof
US4983779A (en) * 1986-07-17 1991-01-08 The Board Of Governors Of Wayne State University Process for the preparation of vinyl ethers
US5616729A (en) * 1986-07-17 1997-04-01 Board Of Governors Of Wayne State University Enhanced chemiluminescence from 1,2-dioxetanes through energy transfer to tethered fluorescers
US5112960A (en) * 1989-07-17 1992-05-12 Bronstein Irena Y Chemiluminescent 3-(substituted adamant-2'-ylidene) 1,2-dioxetanes
CA1340590C (en) * 1986-07-24 1999-06-08 John C. Voyta Chemiluminescence enhancement
US4931223A (en) * 1986-07-24 1990-06-05 Tropix, Inc. Methods of using chemiluminescent 1,2-dioxetanes
US4978614A (en) * 1988-10-26 1990-12-18 Tropix, Inc. Method of detecting a substance using enzymatically-induced decomposition of dioxetanes
US4956477A (en) * 1987-12-31 1990-09-11 Tropix, Inc. Synthesis of 1,2-dioxetanes
US5220005A (en) * 1986-07-24 1993-06-15 Tropix, Inc. Substituted adamantyl dioxetanes
US5089630A (en) * 1987-12-31 1992-02-18 Bronstein Irena Y Dioxetanes for use in assays
US5538847A (en) * 1989-07-17 1996-07-23 Tropix, Inc. Chemiluminescent 1,2-dioxetanes
US5330900A (en) * 1987-12-31 1994-07-19 Tropix, Inc. Chemiluminescent 3-(substituted adamant-2'-ylidene) 1,2-dioxetanes
US4952707A (en) * 1988-06-30 1990-08-28 Tropix, Inc. Enzymatically-cleavable chemiluminescent fused polycyclic ring-containing 1,2-dioxetanes
US5132204A (en) * 1989-05-31 1992-07-21 Chiron Corporation Chemiluminescent double-triggered 1, 2-dioxetanes
US5326882A (en) * 1989-07-17 1994-07-05 Tropix, Inc. Chemiluminescent 3-(substituted Adamant-2'-Ylidene) 1,2-dioxetanes
AU656927B2 (en) * 1990-08-30 1995-02-23 Applied Biosystems, Llc Chemiluminescent 3-(substituted adamant-2'-ylidene) 1,2-dioxetanes
US5336596A (en) * 1991-12-23 1994-08-09 Tropix, Inc. Membrane for chemiluminescent blotting applications
US5603868A (en) * 1992-10-30 1997-02-18 Abbott Laboratories Chemiluminescent electron-rich aryl-substituted 1,2-dioxetanes

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Publication number Publication date
EP1120423A1 (de) 2001-08-01
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AU676327B2 (en) 1997-03-06
DE69434940T2 (de) 2007-11-29
KR0154209B1 (en) 1998-11-16
US5851771A (en) 1998-12-22
CA2139348A1 (en) 1994-11-24
US5840919A (en) 1998-11-24
JPH07509736A (ja) 1995-10-26
ATE334996T1 (de) 2006-08-15
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AU6774194A (en) 1994-12-12
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NO950065L (no) 1995-01-06
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EP0649417A4 (de) 1995-02-27
EP0649417A1 (de) 1995-04-26
NO309143B1 (no) 2000-12-18
FI950075A0 (fi) 1995-01-05
ATE205839T1 (de) 2001-10-15
NO950065D0 (no) 1995-01-06

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