DE69430322T2

DE69430322T2 - Chemilumineszenz-assay mittels energietransfer

Info

Publication number: DE69430322T2
Application number: DE69430322T
Authority: DE
Inventors: Irena Bronstein; Brooks Edwards; John Voyta
Original assignee: Tropix Inc
Current assignee: Applied Biosystems LLC
Priority date: 1993-12-23
Filing date: 1994-12-23
Publication date: 2002-11-14
Anticipated expiration: 2014-12-24
Also published as: DE69430322D1; CA2179726A1; ATE215696T1; US5753436A; EP0736174A4; EP0736174A1; EP0736174B1; US6287767B1; US5849495A; WO1995017672A1; AU1518195A; JPH09507571A

Description

Technisches Anwendungsgebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft Chemilumineszenz-Assays mittels Energietransfer zur Bestimmung der Präsenz bzw. der Mengen einer biologischen Substanz in oberflächengebundenen Assays unter Verwendung von 1,2-Dioxetan zusammen mit hydrophoben fluorometrischen Substraten wie z. B. AttoPhosTM als Chemilumineszenzsubstrat für enzym-markierte fluorometrische Substratziele oder Sonden. Die Chemilumineszenz des Dioxetan-AttoPhosTM-Akzeptorsubstratpaares kann durch das Hinzufügen eines Polymerverstärkers verbessert werden. Weitere Verbesserungen sind durch das Hinzufügen von AttoPhosTM und dann 1,2-Dioxetan, in dieser Reihenfolge, möglich.

Stand der Technik

Chemilumineszenz-Assays zur Feststellung der Präsenz oder Konzentration einer biologischen Substanz gewannen in den vergangen Jahren zunehmend an Aufmerksamkeit als eine schnelle, empfindliche und einfach lesbare Methode zur Durchführung von Bio-Assays. Bei solchen Assays wird eine Chemilumineszenz-Verbindung als Meldermolekül verwendet, wobei das Meldemolekül als Reaktion auf die An- bzw. Abwesenheit des erwarteten Bio-Polymer chemiluminesziert.
Eine breite Palette an chemilumineszenten Verbindungen wurde als mögliche Meldermoleküle identifiziert. Eine Klasse von Verbindungen, der viel Aufmerksamkeit geschenkt wird, ist 1,2-Dioxetan. 1,2-Dioxetan kann durch das Hinzufügen einer Stabilisatorgruppe zu mindestens einem der Kohlenstoffatome des Dioxetan-Rings stabilisiert werden. Ein Beispiel einer Stabilisatorgruppe ist spirogebundenes Adamantan. Solches Dioxetan kann weiterhin an der anderen Kohlenstoffposition durch einen Arylanteil, vorzugsweise Phenyl oder Naphthyl, ersetzt werden, wobei der Arylanteil durch einen Sauerstoff ersetzt wird, der wiederum an eine enzym-labile Gruppe gebunden ist. Bei Kontakt mit einem Enzym, das in der Lage ist, die labile Gruppe zu spalten, wird die Oxyanion des Dioxetans gebildet und führt damit zum Abbau des Dioxetans und spontaner Chemilumineszenz. Eine große Vielfalt solcher Dioxetane sind im US-Patent 5,112,960 beschrieben. Dieses Patent konzentriert sich auf Dioxetan, das einen Substituenten auf der Adamantyl stabilisierenden Gruppe trägt, wie z. B. Halo-Substituenten, Alkylgruppen, Alkoxylgruppen und ähnlichen. Solches Dioxetan stellt einen Fortschritt gegenüber früher anerkannten Dioxetan wie z. B. 3-(4-Methoxyspiro [1,2- dioxetan-3,2'-tricyclo]-3.3.1.13,7]decan]-4-yl) Phenylphosphat und vor allem dessen Dinatriumsalz, das im Allgemeinen unter der Bezeichnung AMPPD bekannt ist, dar. Das mit Chlor substituierte Gegenstück, das die stabilisierende Adamantyl- Gruppe von einer passiven Gruppe, die die Abbaureaktion erlaubt, in eine aktive Gruppe konvertiert, die zu einem verbesserten Chemilumineszenzsignal aufgrund des schnelleren Abbaus des Dioxetananions, höheren Signal-Rausch-Verhältnissen und besserer Empfindlichkeit führt, ist unter der Bezeichnung CSPD bekannt. Andere Dioxetane, wie z. B. Phenyloxy-β-D- galactopyranosid (AMPGD) sind auch bekannt und können als Meldermoleküle eingesetzt werden. Diese Dioxetane und ihre Vorbereitung werden in sich selbst nicht als ein Aspekt dieser Erfindung angesehen.
Assays, die diese Dioxetane verwenden, beinhalten konventionelle Assays, wie z. B. Southern-, Northern- und Western-Blot-Assays, DNA-Sequenzierung, ELISA sowie andere Flüssigphasen- und Mischphasen-Assays, die auf Membranen und Tropfen durchgeführt werden. Im Allgemeinen werden die Verfahren gemäß herkömmlichen und bekannten Protokollen durchgeführt. Hiervon ausgenommen ist der Detektionsschritt. In DNA-Assays ist die biologische Zielsubstanz durch eine DNA- Sonde gebunden wobei ein Enzym kovalent oder indirekt damit verbunden ist und die Sonde der auf einer Membran blockierten Probe beigemischt ist, um eine Hybridisierung zu ermöglichen. Danach werden überschüssige Enzymkomplexe entfernt und Dioxetan zu der hybridisierten Probe hinzugefügt. Nach der Hybridisierung wird das Dioxetan vom gebundenen Enzym aktiviert, was zum Abbau des Dioxetans und zur Chemilumineszenz führt. In Lösungsphasen-Assays wird das Enzym häufig an eine Nukleinsäuresonde konjugiert oder mit einem Antikörper immun-komplex vermittelt, der auf die biologische Zielsubstanz reagiert, wobei nicht gebundene Komponenten entfernt werden und das Dioxetan hinzugefügt wird und die Chemilumineszenz durch den Abbau des durch die Menge des anwesenden Enzyms aktivierte Dioxetan verursacht wird. In Fällen in denen das Enzym selbst das Ziel ist, muss das Dioxetan nur zur Probe hinzugefügt werden. Es soll nochmals darauf hingewiesen werden, dass eine Vielfalt von Assay- Modalitäten entwickelt wurde, die in den US-Patenten US 5,112,960 sowie US 4,978,614 beschrieben ist.
Es ist bekannt, dass lichtlöschende Reaktionen vorkommen wenn der Dioxetan-Abbau in einer protonischen Lösung wie z. B. Wasser stattfindet. Da die Proben, die den fraglichen Analyten vermutlich entweder enthalten bzw. nicht enthalten, im Allgemeinen biologische Proben sind, finden diese Assays gewöhnlich in einer wässrigen Umgebung statt. Die lichtlöschenden Reaktionen können daher die Chemilumineszenz beträchtlich reduzieren, die aufgrund des Abbaus des Dioxetans beobachtet werden kann. In Assays in denen niedrige Bestimmungen bestimmter Analyten vorkommen, wie z. B. Nukleinsäuren, Virusantikörper und sonstige Proteine, vor allem solche, die in Lösung oder in lösungsfesten Phasensystemen vorbereitet werden, kann die beobachtete reduzierte Chemilumineszenz, zusammen mit den unvermeidlichen Hintergrundsignalen, die Empfindlichkeit der Assays so reduzieren, dass extrem niedrige Mengen biologischer Substanzen nicht entdeckt werden können. Eine Methode, wie man dieses Problem beheben kann, ist das Hinzufügen wasserlöslicher Makromoleküle, zu denen sowohl natürliche als auch synthetische Moleküle zählen. Dies ist ausführlich in US- Patent US 5,145,772 beschrieben.
Ähnlich befasst sich US-Patent 4,978, 614 mit dem Hinzufügen von verschiedenen wasserlöslichen "Verstärkungs"- Mitteln zur Probe, obgleich das Patent sich mit dem Problem der Unterdrückung unspezifischer Bindereaktionen in festen Assays befasst. US-Patent 5,112,960 verwendet bevorzugt wasserlösliche, polymere und quaternäre Ammoniumsalze wie z. B. Poly(vinylbenzyltrimethylammoniumchlorid) (TMQ) Poly(vinylbenzyltributylammoiniumchlorid) (TBQ) und Poly(vinylbenzyldimethylbenzylammoniumchlorid) (BDMQ), die als wasserlösliche, polymere und quaternäre Ammoniumsalze bekannt sind, die Chemilumineszenz verstärken und eine höhere Empfindlichkeit zur Folge haben, indem sie das Signal-Rausch- Verhältnis erhöhen. Ähnliche Phosphonium- und Sulphonium- Polymersalze werden ebenfalls offengelegt.
Diese Verstärkung wird, zumindest teilweise, durch die Bildung von hydrophoben Regionen erreicht, in denen die Dioxetanoxyanion maskiert ist. Der Abbau in diesen hydrophoben Regionen verstärkt die Chemilumineszenz, da wasserbasierte, lichtlöschende Reaktionen unterdrückt werden. Unter den anerkannten wasserlöslichen, quaternären Polymersalzen, die verwendet werden, erbringt TBQ eine unerwartet hohe Verstärkung durch diesen hydrophoben, Regionen bildenden Mechanismus.
Die Verstärkung der Chemilumineszenz, die durch das Hinzufügen von wasserlöslichen Polymersubstanzen wie polymeren Ammonium-, Phosphonium- und Sulphonium-Salzen erreicht wird, kann weiterhin durch die Hinzunahme, in einer wässrigen Probe, eines Zusatzstoffes verbessert werden, der die Fähigkeit des quaternären Polymersalzes verbessert, die Dioxetanoxyanion und das Meldemolekül im erregten Zustand in einer hydrophoben Region zu maskieren. Deshalb erzeugt die Kombination des quaternären Polymersalzes und des Zusatzstoffes zusammen einen Anstieg der Verstärkung, der diejenige bei weitem übertrifft, die separat durch das Hinzufügen des quaternären Polymersalzes oder des Zusatzstoffes möglich ist, was im Falle eines Tensids oder wasserlöslichen Polymers die Chemilumineszenz begrenzt verstärken kann. Die synergistische Kombination des quaternären Polymersalzes und der Zusatzstoffe erbringt einen Verstärkungseffekt, der eine niedrigaktive, verlässliche Bestimmung selbst in wässrigen Proben durch die Verwendung von 1,2-Dioxetan möglich macht. Die quaternären Polymersalze, zusammen mit den Zusatzstoffen, verstärken genügend, um einen dramatischen 4- bis 5-fachen Anstieg bei Werten unter 0,005 Prozent bis 0,001 Prozent zu verzeichnen. Das stärkere Signal und die verbesserten Signal-Rausch-Verhältnisse werden durch den Zusatz von weiteren Mengen quaternären Polymersalzes, dem Zusatzstoff oder beiden zusammen erreicht, und zwar in Mengen, die bis zu 50% oder mehr betragen können. Im Allgemeinen bewegen sich die Mengen für quaternäres Polymersalz und Zusatzstoffe vorzugsweise innerhalb eines Bereiches von 0,01-25 Prozent, vorzugsweise von 0,025-15 Prozent nach Gewicht. Die Einzelheiten dieser Verbesserung sind in US-Anmeldung 08/031,471 (entspricht WO-A-94 2182) beschrieben.
US-Patent 5, 208,148 beschreibt eine Klasse von Fluoreszenzsubstraten zur Bestimmung von Glykosidaseenzym produzierenden Zellen. Das Substrat ist ein Fluoroeszenzdiglykosid, das ein nichtfluoreszierendes Substrat ist, bis es durch Glykosidaseenzyme in der Zelle hydrolysiert wird und bis ein Fluoreszenz-Bestimmungprodukt erreicht ist, das zwischen 460 nm und 550 nm erregbar ist. Die fluoreszenzenzymatischen Hydrolyseprodukte werden spezifisch gebildet und angemessen in lebenden Zellen aufbewahrt und sind nicht toxisch für die Zellen. Das Substrat kann unter physiologischen Bedingungen in die Zellmembran eindringen. Deshalb ermöglicht die Erfindung Analyse, Sortieren und Klonen der Zellen und die Überwachung der Zellentwicklung in vitro und in vivo. Jedoch werden diese fluoreszierenden Produkte in der Einzelzelle und innerhalb spezifischer Organellen der Einzelzellen erst dann entdeckt, nachdem die spektralen Eigenschaften der Substrate durch einen Argonlaser mit Hilfe seiner Hauptwellenlängen erregt sind.
Bekannte fluoreszierende Emitter finden bereits zusammen mit Dioxetan in Bio-Assays Anwendung. US-Patente 4,959,182 und 5,004,565 beschreiben Methoden und Kompositionen von Energietransferverbesserungen von Chemilumineszenz durch 1,2- Dioxetan. Diese Patente verwenden eine fluoreszierende Mizelle, die ein Tensid und ein fluoreszierendes Co-Tensid verwendet, das in der Massenphase der verwendeten Pufferlösung vorkommt. Das fluoreszierende Co-Tensid kommt in einer Form vor, die jederzeit Fluoreszenz mittels Energietransfer durchführen kann. Bei Kontakt mit der Festphase die ein enzymmarkiertes, Ligand bindendes Paar enthält, neigt der fluoreszierende Anteil dazu, mit der Mizelle in der Massenphase assoziiert zu bleiben. Wenn ein fluoreszierendes Co-Tensid auf der Festphase deponiert wird, dann geschieht das irgendwo in Bereichen, die das immobilisierte Ligand bindende Paar enthalten sowie in Bereichen, die kein solches Paar beinhalten. Das führt dann zum Problem, dass die fluoreszierenden Emitter nie mit dem immobilisierten Enzym- Konjugat assoziiert sind bzw. bleiben.
Deshalb ist die zum Energietransfer vom Dioxetan zum fluoreszierenden Emitter benötigte Nähe nicht effizient. Weiterhin führt die Tatsache, dass die fluoreszierenden Emitter irgendwo auf der Festphasenmatrix deponiert werden können dazu, dass diese Methode keine Spezifität bei der Verwendung in gebundenen Assays erlaubt. Die Mehrheit der Beispiele in den Patenten 1182 und 1565 sind Lösungsphasenenzym-Assays oder chemisch ausgelöste Experimente, die keine Enzyme verwenden. Diese Beispiele passen besser zu den Massenphasen-Co-Mizellen als Mittel zur Förderung der Nähe des Dioxetananionenproduktes mit dem Energie aufnehmendem, fluoreszierendem Tensid. Das einzige Beispiel eines Festphasen-Assays ist in den Spalten 29 und 30 beschrieben. Dieser ELISA-Assay zeigt, dass Licht auf einer gesunden Oberfläche im Bereich von 112 ng bis 1,3 ng des S- Antigens produziert wird. Es gibt jedoch keine Kontrollexperimente, die die Lichterzeugung aus dem Experiment mit der gleichen Dosisreaktion zeigen, aber Dioxetan und CTAB- Tenside bei gleichzeitiger Abwesenheit von fluoreszierenden Co-Tensiden verwenden. Deshalb kann nicht nachgewiesen werden, wie wirksam der Energietransfer auf der festen Oberfläche nun tatsächlich ist. Natürlich ist dieses fluoreszierende Co- Tensid kein nichtfluoreszierendes Enzymsubstrat wie AttoPhos. Deshalb ist die vorliegende Erfindung im Rahmen derer ein fluoreszierender Energieakzeptor direkt und örtlich auf einer Oberfläche vom gleichen Enzym, das den Dioxetanenergiespender katalytisch abbaut, erzeugt wird, nicht durch den Stand der Technik offengelegt.
Es gibt verschiedene grundlegende Probleme in Bezug auf fluoreszierende Substrate, die in Oberflächen- oder Blotting- Experimenten verwendet werden. Eines davon ist, dass die Erregung des dephosphorylierten Chromophors mit einem Laser oder einer Lampe mit einem Filter oder Monochromator durchgeführt werden muss. Diese Lichtquellen sind jedoch nicht nur umständlich, sonder sie erhöhen außerdem die Kosten für den Assay. Dieser notwendige und wichtige Schritt der Erregung der mit Hilfe von UV/Blaulicht durchgeführt wird, ist Ursache für ein zweites Problem, nämlich die Autofluoreszenz der Membran bzw. der Oberfläche und anderer fester Stützen, die gewöhnlich fluoreszierende Aufheller und anderes erregbares Fluorophor sowie erregte, in biologischen Proben enthaltene Chromophoren (d. h. Proteine und Nukleinsäuren) enthalten. So ein fluoreszierendes Signal der Oberfläche oder der Membranunterstützung und Quellen, die nicht aus dephosphorylierten oder aktivierten Substraten stammen, tragen zu den unakzeptablen Werten von Hintergrundrauschen bei, die die Empfindlichkeit und Spezifität des Assays beachtlich senken, so dass solche Substrate nicht verwendet werden können.
Bekannte fluoreszierende Emitter werden zusammen mit Dioxetan in nichtgebundenen Assays verwendet. Das führt jedoch zum Problem, dass die fluoreszierenden Emitter nicht mit dem Enzym-Konjugat assoziiert bleiben. Deshalb ist die für den Energietransfer vom Dioxetan zum fluoreszierenden Emitter benötige Nähe nicht möglich. Außerdem ermöglichen die Emitter aufgrund der Tatsache, dass die fluoreszierenden Emitter nicht mit dem Enzym-Konjugat assoziiert bleiben, keine Spezifität, wenn sie in gebundenen Assays verwendet werden.
Deshalb bleibt es trotz der Fortschritte obiger Assays in der Chemilumineszenz-Technologie weiterhin das Ziel der Branche, ein Chemilumineszenz-Assay bereitzustellen, dass insgesamt intensivere Signale und damit ein höheres Maß an Empfindlichkeit und Spezifität ohne die Verwendung teurer, umständlicher Laser oder Lampen bietet, um die Präsenz, Konzentration oder beides einer biologischen Substanz in einer Probe zu bestimmen. Es gibt bereits 1,2-Dioxetanverbindungen die ein ausgezeichnetes Potenzial als Meldemoleküle für Chemilumineszenz aufweisen. Es ist jedoch immer noch notwendig, die Empfindlichkeit und Spezifität der Chemilumineszenz der 1,2-Dioxetanmoleküle zu verbessern, indem ein effizienter fluoreszierender Emitter bereitgestellt wird, der in engem Kontakt mit dem Dioxetan bleibt und damit den notwendigen Energietransfer ermöglicht und außerdem eine sensitive und spezifische Bestimmung des Ziels erbringt.

Offenlegung der Erfindung

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung beseht deshalb darin, eine Methode zur Bestimmung der Präsenz oder der Menge einer biologischen Substanz in biologischen, oberflächengebundenen Assays auf Lösungsbasis mit Hilfe von 1,2-Dioxetan-Spendermolekülen zusammen mit einem fluoreszierenden Akzeptoremitter zu erbringen, die ein erhöhtes Maß an Empfindlichkeit oder Signal-Rausch-Verhältnis ohne Verwendung von externen Lichtquellen für Erregungszwecke erbringt.
Obige Aufgaben werden von der vorliegenden Erfindung erfüllt, die eine Methode zur Bestimmung der Präsenz oder der Mengen einer biologischen Substanz in einer biologischen Probe bereitstellt, wobei die Methode folgende Schritte umfasst: a) Bildung eines enzymkonjugierten Bindemittels (Antikörper oder DNA-Sonde) mit dem biologischen Liganden der Probe; b) das Hinzufügen eines hydrophoben fluorometrischen Substrates wie z. B. AttoPhosTM und 1,2-Dioxetan zum gebundenen enzymkonjugierten Bindemittel, c) wobei das Enzym des enzymkonjugierten Bio-Polymers eine enzymspaltbare Gruppe wie z. B. einen Phosphatanteil von AttoPhosTM und vom Dioxetan abspaltet, worauf das Dioxetan mit Hilfe eines Emitters im erregten Zustand abgebaut wird, so dass der Energietransfer vom Chemiliumineszenz-Emitter im erregten Zustand auf das dephosphorylierte AttoPhosTM erfolgt wobei dieser Anteil emittiert wird und d) Bestimmung der Präsenz oder der Menge der biologischen Substanz in Abhängigkeit Fluoreszenzmenge. Die beanspruchte Methode der vorliegenden Erfindung wird in Anspruch 1 dargelegt.
Die Aufgaben werden weiterhin von der vorliegenden Erfindung erfüllt, die außerdem ein Kit für die Durchführung eines Bio-Assays zur Bestimmung der Präsenz oder Konzentration einer biologischen Substanz bereitstellt, wobei die Substanz entweder an die Oberfläche gebunden oder in einem Lösungs- Assay gefunden wird und das Kit folgende Elemente beinhaltet:
a) einen Enzym-Komplex der stabil an eine oberflächengebundene biologische Substanz bindet b) ein 1,2-Dioxetan das bei Kontakt mit dem Enzym-Komplex in ein Abbauprodukt abgebaut wird, das seine Energie übertragen kann und c) AttoPhosTM. Das Kit der vorliegenden Erfindung wie in Anspruch 13 beansprucht.

Bevorzugte Methoden zur Ausführung der Erfindung

Die hier vorliegende Erfindung wird im folgenden mit Bezugnahme auf die entsprechenden Abbildungen näher erläutert. In diesen Abbildungen werden die geeigneten Ausführungsformen dargestellt. Diese Erfindung kann jedoch unabhängig von den hier dargestellten Ausführungsformen in den verschiedensten Formen ausgeführt werden und ist in der Auslegung nicht auf die angegebenen Ausführungsformen begrenzt. Der Antragsteller führt diese Ausführungsformen hier mit dem Ziel einer genauen und vollständigen Bekanntgabe und zur ausführlichen Verdeutlichung der Ausführungsmöglichkeiten der Erfindung an Fachexperten auf diesem Gebiet an. Es wird angezeigt, dass das fluorometrische Substrat nicht speziell, außer auf Hydrophobie, begrenzt ist, wie im folgenden näher erläutert wird. Beispielsubstrate sind im US Patent Nr. 5,208,148 aufgeführt.
Bei dieser Erfindung wird ein hydrophobes, fluorometrisches Substrate, verwendet. Dabei ist eine Verbindung beabsichtigt, die nach Aktivierung durch ein Enzym, das in einem Donator durch Bildung von Dioxetane und darauffolgendem Abbau einen Energietransfer herbeiführt, welches in einen angeregten Zustand versetzt wird und emittiert. Da der Donator hydrophob ist, muss das Substrat, sobald es aktiviert ist, in den selben hydrophoben Regionen ausreichend hydrophob sein, in denen der Donator übergeht, damit es maskiert werden kann und Energie erzeugt und transferiert wird.
Die angegebene Erfindung wird unter den Bedingungen eines Verfahrens zur Bestimmung des Vorkommens und der Menge einer Substanz oder in einer biologischen 1,2-Dioxetan-Substanz eines in Lösung befindlichen (Solution-Phase) Assays unter Verwendung des hydrophoben fluorometrischen Substrats AttoPhosTM erläutert. Weiterhin wird das Kit der dargestellten Erfindung zur Bestimmung des Vorkommens und der Menge einer Substanz unter Verwendung eines geeigneten Enzymkonjugats, eines 1,2-Dioxetane und AttoPhosTM dargestellt. Weitere fluorometrische Substrate können verwendet werden.
Die Erfinder haben als Erste bei Ihren Untersuchungen entdeckt, dass 1,2-Dioxetan in Verbindung mit AttoPhosTM die Genauigkeit und Sensorik von oberflächengebundenen Assays verbessert. Weiterhin vermindern diese Assays unter Verwendung von 1,2-Dioxetan zusammen mit AttoPhosTM den Bedarf an Lichtquellen, die zur Erregung erforderlich sind.
Genauer gesagt basiert die dargestellte Erfindung auf einer hohe Quantenausbeutung an Fluoroszenz, einer Oberflächenaffinität erzeugt durch AttoPhosTM und gekoppelt mit der durch das Enzym aktivierten Chemilusmineszenz durch 1,2 Dioxetan als Erregerquelle für das dephosphorylierte AttoPhosTM. Dadurch wird dephosphoryliertes AttoPhosTM an der Oberfläche produziert, verbleibt eng in der Nähe des Enzyms im gesamten Assay verteilt, und es erfolgt die Erregung durch den Akzeptor - dephosphoryliertes AttoPhosTM kann ohne weitere externe Instrumentenausrüstung und ohne mögliche Erregung von Chromophoren, die anders als dephosphoryliertes AttoPhosTM aufgebaut sind, angewendet werden.
Dieses Verfahren kann zur Bestimmung des Vorkommens oder der Menge einer biologischen Substanz an einer biologischen Probe angewendet werden. Das Verfahren besteht aus den folgenden Phasen: a) Bildung eines enzymgebundenen Trägerkomplexes (Antikörper oder Nukleinsäuresonde) mit einer biologischen Probe einer biologischen Substanz b) Hinzuführung von AttoPhosTM und 1,2-Dioxetan zum enzymgebundenen Trägerkomplex der biologischen Substanz c) wobei die Enzyme des Enzymkonjugats sich in zwei Phosphatteile, bestehend aus AttoPhosTM und Dioxetane spalten, und dadurch das Dioxetan mittels eines Energietransfers, der aus dem Erregungszustand des Dioxetane im Donator an den dephosphorylierten AttoPhosTM Abnehmer entsteht, in einen Erregungszustand versetzen, zum Abbau bringen und Lumineszenz erzeugt und d) Bestimmung des Vorkommens oder der Menge der biologischen Substanz aus dem Erhalt der Menge an Lumineszenz
Das Kit der dargestellten Erfindung dient außerdem der Bestimmung des Aufkommens, der Menge oder der Konzentration an Biopolymer und setzt sich zusammen aus:
a) einem Enzymkomplex, der sich nach Zusatz einer biologischen Substanz mit dieser verbindet b) eines 1,2- Dioxetans, das nach Kontakt mit dem Enzym innerhalb des Enzymkomplexes in ein Abbauprodukt zerfällt, welches sich in einem angeregten Zustand befindet und c) AttoPhosTM
Die Assays und Kits dieser Erfindung verwenden wasserlösliche Chemilumineszenz aus 1,2-Dioxetan. Wie vorhergehend bereits aufgeführt sind diese Dioxetane in ihrer Form weitgehend gebräuchlich, und ihre Identität und Herstellung an sich kein neuartiger Aspekt dieser Erfindung ist. Im allgemeinen können alle Chemilumineszenz Dioxetane, die in wasserhaltigen Speichern zur Führung des Assays ausreichende Löslichkeit und Stabilität aufzeigen, die in Interaktion mit einem Enzym Abbauen und eine Chemilumineszenz- Reaktion hervorrufen können und die Enzymspaltung einer labilen Gruppe des Enzyms, die den Abbau herbeiführt, in Verbindung mit dieser Erfindung angewendet werden.
Generell haben die 1,2-Dioxetane, die sich für diese Erfindung eignen, die allgemeine Formel:
Z = H, Cl, andere Halogene, Alkyl, Carboxyl- oder Alkoxylgruppen R¹ ist ein Alkyl mit bis zu 20 C-Atomen oder Aryl oder Aralkyl mit bis zu 12 C-Atomen Y ist Phenyl oder Naphtyl, mit einer Elektronspendergruppe oder Elektronentzugsgruppe substituiert oder unsubstituiert
R² ist an Y zum Dioxetane metasubstituiert oder inkonjugiert und ein Oxalat (OX), wobei
X eine enzymspaltende Gruppe ist, die bei Spaltung Dioxetanphenoxy oder Naphthoxy Anion hinterlässt.
Geeignete Dioxetane sind in der US Patentanmeldung Nr. 08/057,903 (WO-A-9426726) aufgeführt.
Geeignete Dioxetane sind solche, bei denen X ein Phosphatteil ist.
Besonders geeignete Dioxetane enthalten das Chemilimuneszenz- Substrat AMPPD sowie CSPD und insbesondere deren Dinatriumsalz. Verfahren zur Herstellung dieser Dioxetane sind in den obengenannten, öffentlich erteilten Patenten sowie beispielsweise in dem US-Patent Nr. 4,857,652 der Wayne State University aufgeführt. Die Herstellung, Reinigung und Isolierung der Dioxetane sind an sich keine neuartigen Aspekte dieser hier bekannt gegebenen Erfindung, auf die hiermit der Anspruch auf Erteilung eines Patents erhoben wird. AttoPhostm ist ein hochsensitives, fluoreszentes Substrat zur Detektion der alkalischen Phosphatase. Die chemische Struktur von AttoPhostTM ist bisher unbekannt. Die chemischen Eigenschaften von AttoPhosTM hingegen sind bekannt. AttoPhosTM wurde von JLB Scientific entwickelt und ist unter der Katalognummer 1670A im JLB Scientific Katalogs von 1993 verzeichnet.
Die physikalischen und chemischen Eigenschaften von AttoPhostTM sind folgende:
AttoPhosTM ist eine blasse, gelbe kristalline gebundene Substanz mit einem Molekülgewicht von ungefähr 580 g/Mol. Die Wechselzahl (Turnover Number TN) des Molekülgewichts beträgt für AttoPhosTM 85.400 Moleküle AttoPhosTM pro Minute und pro Molekül der alkalischen Phosphatase in 2,40 M DEA (Diethanolamin) pH 9.0, 0,23 mM MgCl&sub2; und 0,005% NaN. Die Löslichkeit von AttoPhosTM beträgt ≥ 10 mM in einem wässrigen 2.4 M DEA Puffer mit pH 9.0. Der optimale alkalische Phosphatase Umwandlung wird bei einer Substratkonzentration von 0,5-1,5 mM AttoPhosTM erreicht. AttoPhostTM besitzt einen Km Wert von 0.030 mM und einen molaren Absortionsgrad von 31,412.
Nachgewiesen ist, dass AttoPhosTM bei Kontakt mit alkalischen Phosphatasen zu einem fluoreszenten Emitter wird. Das Molekulargewicht des fluoreszenten Emitters beträgt ungefähr 290 g/Mol. Dieser fluoreszente Emitter besitzt eine maximale Anregung in der sichtbaren Reichweite von 430-450 nm und eine beobachtete Fluoreszenz von 550-570 nm in einem DEA Puffer. Die besten Vorraussetzungen für die Anregung liegen bei 440 nm mit einer Emission von 550 nm. Der fluoreszente Emitter erhält ebenfalls eine maximale Emission bei 560 nm und eine große Verschiebung der Aborbierungs- und Emissionsmaxima (Stoke Shift) bei 140 nm. Die Raman-Emission des Wassers tritt bei 470 nm mit einer Anregung bei 413 nm ein. Der fluoreszente Emitter erreicht sein Maximum bei 418 nm mit einem Koeffizienten von 26.484 in 0,392 M Na&sub2;CO&sub3; und einem pH von 11,0 und wird wird bei einem ph Wert > 10,0 vollkommen ionisiert.
Das Dioxetan wird dem Enzymkomplex, der in einem biologischen Bindemittel (Antikörper oder Nuklearsonde) gebunden ist, hinzugefügt. Der Enzymkomplex wird ebenso in die biologische Zielsubstanz eingebunden.
Das Dioxetan ist daher das Substrat für die Enzyme und für die enzymkatalysierte Spaltung der labilen Gruppe des Substrats resultierend aus dem Körper des Dioxetans in Anordnung des instabilen Oxyanions und des darauffolgenden Abbaus des Dioxetans verantwortlich. Das Enzym ist gewöhnlich in eine Bindemittelhäfte, z. B. eine DNA-Sonde in einer Hybridisierungsstufe oder einem geeigneten Antikörper in einer Inkubationsphase eingebunden, um die Bindung der biologischen Substanz zu unterstützen.
Die Hybridisierungsphase kann unter Verwendung einer entsprechenden Probe in bekannten Standardverfahren durchgeführt werden.
Als Alternative zur Hybridisierungsphase kann eine Inkubationsphase mit einem geeigneten Antikörper in einem Standardverfahren durchgeführt werden.
Das Enzymkonjugat kann jedes Enzymkonjugat sein, das in der Lage ist, sich mit der biologische Substanz stabil zu binden. Beispiele solcher Enzymverbindungen sind alle ligandgebundenen Paare, Proben mit einem kovalent hinzugefügten Enzym oder ein Antikörper, der direkt einer alkalischen Phosphatase angefügt wurde. Alternativ hierzu können Nukleinsäureproben oder Antikörper indirekt mit den Enzymen über ein Biotin- (Strept)Avidin, einem Antigen-Antikörper (z. B. Degoxigenin- Antidigoxigenin, Fluoreszein-Antifluoreszein) oder anderen Typen angehängt werden. Derivatisierte alkalische Phosphatase, wie etwa alkalische Phosphatase an alkalische Streptavidin- Phosphatase angefügte Antikörper oder DNA-Proben sind die für die vorliegende Erfindung geeigneten Enzymkonjugate.
Daraufhin werden das Enzymkonjugat aus einem biologischen Substratkomplex gebildet. AttoPhosTM und die 1,2 Dioxetane werden entweder gleichzeitig dem gebundenen Enzymkonjugat hinzugefügt und mit der biologischen Substanz verbunden oder AttoPhosTM wird zur Dephosphorylierung zuerst zugegeben und dann wird nachfolgend ein 1,2 Dioxetan hinzugefügt.
Fachexperten wird es offensichtlich sein, dass es sich hierbei um eine Enzymspaltung handelt, die das energiespendende Dioxetan-Emitterfragment in unmittelbare Nähe von AttoPhosTM leitet, das ebenfalls an gleicher Stelle von demselben Enzym produziert wird. AttoPhosTM, wie auch andere fluorometrische Enzymsubstrate sind in der Füllphase selbst nicht fluoreszent. Daher wird jeder Abbau von Dioxetan, der nicht enzymatisch ausgelöst wird, in der Massenphase keinen Energietransfer ausführen. Dies würde einen Signalton erzeugen. Daher ist dies eine Enzymreaktion, die eine hydrophobe, fluoreszente Form erzeugt und die eine Immobilisierung an der Oberfläche zur Ausführung des Assays ermöglicht. Ebenso offensichtlich wird auch, dass ebenso andere hydrophobe, fluorimetrische Enzymsubstrate in der Erfindung verwendet werden können. Das oben erwähnte US Patent Nr. 5,208,148, beschreibt Fluoreszein Diglycoside, die dem Planar und Fluorphor selbst zugefügt und durch Einlagerung einer Reihe hydrophober Anteile speziell modifiziert werden. Derartige hydrophobe Substrate wären zur Ausführung des Bioassays der Erfindung geeignet, bei dem die angewendete Enzymbindung eine Glycosidase, wie etwa Beta-Galactosidase und das Dioxetan, dessen allgemeine Struktur als Beispiel (Z=Cl, R¹=Methyl, Y=Phenylene und X=Beta-D-Galactopyranoside), wie zuvor abgebildet, ist. Natürlich können die in diesem Patent präsentierten hydrophoben Hydroxyfluoreszeine als Vorprodukt für die Diglycloside mit einer anderen bekannten phosphorylierten Art zum Erhalt von hydrophoben und fluoreszenten Mono- und Diphosphat-Derivaten ersetzt werden, die für diese Erfindung geeignet sind.
Das Enzym spaltet ein Phosphatanteil von sowohl 1,2- Dioxetan als auch vonAttoPhosTM. Wenn das 1,2-Dioxetan von dem Enzym dephosphoryliert wird, geht das gebildete Oxyanion in den erregten Spenderzustand über, dessen Energie zu dem naheliegendsten Akzeptor, dem dephosphoriliertemn AttoPhosTM Emitter, der damit zum Austoß gebracht wird, transferiert. Mit anderen Worten wird die Energie von dem 1,2 Dioxetan (CS[unleserlich]D) zu dem dephosphorylierten AttoPhosTM Emitter transferiert, das wiederum die Energie in Form vom Lumineszenz freisetzt. Der Wirkungsgrad des Energietransfers erhöht sich durch das Produkt des dephosphorylierten AttoPhosTM-Akzeptors, das hydrophob und auf dessen Oberfläche der biologischen Substanz verankert ist und sich damit in unmittelbarer Nähe zum im Erregungszustand befindlichen chemilumineszenten dephosphorylierten 1,2-Dioxetanfragment befindet und dabei der Energiespender ist.
Das Dioxetan wird dem gebundenen Enzymkonjugat zusammen als Komplex mit der biologischen Substanz in einer Menge von 0,01 bis 2,5 mM, idealerweise zwischen 0,25 bis 1,0 mM, zugegeben. Am besten ist eine zugegebene Menge von 0,25 mM Dioxetan geeignet.
AttoPhosTM in 2,40 M Diethanolamine (DEA) im Wasserpuffer wird dem Enzym oder dem Enzymkonjugatbinder zusammen mit der biologischen Substanz in einer Menge von 1 bis 100 Prozent, vorzugsweise 25 bis 75 Prozent des Gesamtvolumens zugefügt. Eine zugegebene Menge an AttoPhosTM zwischen 10 und 50 Prozent zum Gesamtvolumen ist hierfür am geeignetsten.
Wie zuvor ausgeführt, wird empfohlen AttoPhosTM zur Entphosphyrilierung zuerst und nachfolgend das 1,2-Dioxetan hinzuzugeben. Die Zeitspanne zwischen der Zugabe des AttoPhosTM und der Zugabe des 1,2 Dioxetans beträgt 10 bis 60 Minuten, vorzugsweise 20 bis 40 Minuten und am geeignetsten zwischen 25 und 30 Minuten.
Das Signal kann des weiteren durch Zugabe eines wasserlöslichen Makromoleküls zusammen mit AttoPhosTM oder zusammen mit einem anderen hydropischen fluormetrischen Enzymsubstrat gesteigert werden. Vorzugsweise eignen sich wasserlösliche Polymere bei der Anwendung der Erfindung, die im allgemeinen auf polymerischen Oniumsalzen basieren, insbesondere aus Quartärsalzen, die auf Phosphor, Sulfat und vorzugsweise auf Ammoniumteilen basieren.
Die Polymere haben im allgemeinen die unten abgebildete Formel.
In dieser Formel kann jede der R¹, R², R³, eine gerade oder verzweigtkettige, nicht substituierte Alkylgruppe aus 1 bis 20 KohlenstoffKohlenstoffatomen, einschließlich z. B. Methyl, Ethyl, N-Butyl, T-Butyl, Hexyl oder eine gerade oder verzweigtkettige Alkylgruppe aus 1 bis 20 KohlenstoffKohlenstoffatomen einschließlich mit einer oder mehreren substituierten Hydroxy, Alkoxy, z. B. Methoxy, Ethoxy, Benzyloxy oder Polyoxethylethoxy, Aryloxi, z. B. Phenoxy, Amino oder substituierte Amino, z. B. Methylamino, Amido, z. B. Acetamido oder Ureido, z. B. Phenyl Ureido oder ein Fluoroalkane oder Fluoroaryl, z. B. Heptafluorobutyl, Gruppen, eine nicht substituierte Monocycloakylgruppe mit bis 3 bis 12 Kohlenstoffringen mit Kohlenstoffatomen, einschließlich z. B. Cyclohexyl oder Cyclooctyl, einer substituierten Monocycloakylgruppe mit bis 3 bis 12 Kohlenstoffringen mit Kohlenstoffatomen, einschließlich mit einer oder mehreren substituierten Alkyl, Alkoxy oder verschmolzenen Benzogruppen, z. B. Methoxycyclohexyl oder 1, 2, 3, 4 Tetrahydronaphtyl, einer Polycycloalkylgruppe mit mindestens zwei verschmolzenen Ringe, bei dem jeder 5 bis 12 Kohlenstoffatome hat, einschließlich nicht substituiert oder substituiert mit einer oder mehreren Alkyl, Alkoxy oder Arylgruppen, z. B. 1-Adamantyl oder 3-Phenyl-1-Adamantyl, einem Aryl, Akaryl oder einer Aralkylgruppe, bestehend aus mindestens einem Ring mit 6 bis 20 Kohlenstoffatomen, insgesamt nicht substituiert oder substituiert mit einer oder mehrerer Alkyl-, Aryl-, Fluor- oder Hydroxygruppen, z. B. Phenyl, Naphtyl, Pentafluorophenyl, Ethylphenyl, Benzyl, Hydroxybenzyl, Phenylbenzyl oder Dehydroabiethyl, die mit mindestens zwei der R¹, R², R³, die mit dem quartären StickstoffStickstoffatom verbunden sind, in Form eines gesättigten oder ungesättigten, substituierten oder nicht substituierten stickstoffStickstoffhaltigen, phosporushaltigen oder sulfurhaltigen Rings, bestehend aus 3 bis 5 Kohlenstoffatomen, einschließlich 1 bis 3 Heteroatome, die benzoanniliert sein können, z. B. 1-Pyridinium, 1- Imidazolium (3-Alkyl oder Aralkyl), Morpholino, Alkyl Morphorlinium, Alkylpiperidinium, N-Acylpiperidinium, Piperidino, oder Acylpiperidino, Benzoxazolium, Benzthiazolium oder Benzamidazolium besitzen.
Das Symbol X steht für ein Gegenion, das allein oder in Kombination Anteile wie etwa Halogenid, z. B. Fluorid, Chlorid, Bromid oder Iodid, Sulfat, Alkylsulfonat, z. B. Methylsulfonat, Arylsulfonat, z. B. P-Toluenesulfonat, substituiertes Arylsulfonat, z. B. Anilinonaphtylenesulfonat (verschiedene Isomere), Diphenylanthracenesulfonat, Perchlorat, Alkanoat, z. B. Acetat, Arylcarboxylat, z. B., Fluoreszeein oder Fluoreszein-Derivate, benzoheterocyclisches Arylcarboxylat, z. B., 7-Diethylamino-4-Cyanocoumann-3- carboxylat, organische Dianione wie etwa P-Terephthalat, können ebenfalls als Symbol X repräsentiert sein.
Das Symbol n repräsentiert eine Zahl, zum Beispiel des Molekülgewichts von etwa Poly(Vinylbenzyl Quartärsalzen) das von 800 bis über 200.000 (Gewichtsdurchschnitt) reichen kann, aber vorzugsweise, wie in der Strukturviskosität oder den LALLS Verfahren festgelegt, zwischen 20.000 und ca. 70.000 liegen sollte.
Methoden zur Vorbereitung dieser Polymere, der entsprechenden Copolymere und der entsprechenden Ausgangsmaterialien, in denen M Stickstoff ist, sind von G. D. Jones et al. im Journal of Polymer Science, 1958, S. 25, S. 201, in dem US-Patent Nr. 2,780,604/3,178,396/3,770,439/4,308,335/4,340,522/4,424,326/ und in der Offenlegungsschrift der Bundesrepublik Deutschlands Nr. 2,447,611 veröffentlicht.
Das Symbol M kann in den Fällen Phosphor oder Schwefel repräsentieren, wie in den entsprechenden US-Patenten Nr. 3,236,820 und 3,065,272 als Phosphonium- oder Sulfonium- Polymer, zuvor beschrieben wurde.
Methoden zur Vorbereitung dieser beiden Polymere in dieser Erfindung sind in den angegebenen US-Patenten festgelegt und sind an sich kein Aspekt dieser Erfindung.
Copolymere, die zwei oder mehrere verschiedene Onium- Seitengruppen, die bei der Erfindung angewendet werden können, sind im Folgenden dargestellt:
Die Symbole X, M&spplus;, R¹, R², R³, sind repräsentativ, wie zuvor für X, M und R¹-R³, beschrieben. Die Symbole Y und Z repräsentieren den Stoffmengengehalt der einzelnen Monomere einschließlich der Copolymere. Die Symbole Y und Z können als solche individuell von 0,01 bis 0,99 variieren, wobei die Summe jeweils 1 ergibt.
Als geeignete Anteile, ist M entweder N oder P, und R¹-R³ sind individuelle, unabhängige, Alkalyl, Cycloalkyl, Polycycloalkyl (z. B., Adamantane) Arakyl oder Aryl, bestehend aus 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, nicht substituiert oder zusätzlich substituiert mit Hydroxyl-, Amino-, Amido-, Ureidogruppen, oder mittels einer Spiroverknüpfung mit dem M- Atom verbunden, um ein heterocyclisches (aromatisch, alipathisch oder gemischt, einschließlich möglicher anderer N, S oder O Heteroatome) Oniumteil zu bilden.
X wird bevorzugt ausgewählt, um die Lösungsfähigkeit zu steigern und die ionische Stabilität wie gewünscht zu verändern und ist vorzugsweise ein Halogen, ein Sulfat oder Sulfonat. In Copolymeren können alle R¹-R³ gleich oder unterschiedlich zu den entsprechenden R¹-R³ sein. Beispiele für bevorzugte Polymere sind: Polyvinylbenzyltributyl-Phosphoniumchlorid Polyvinylbenzyltrioctyl-Phosphoniumchlorid-Co- Polyvinylbenzyltributyl-Phosphoniumchlorid Polyvinylbenzyltributyl-Ammoniumchlorid-Co- Polyvinylbenzyltriphenyl-Phosphoniumchlorid Polyvinylbenzyltribenzyldimethyl-Ammoniumchlorid Polyvinylbenzyltributyl-Ammoniumchlorid Polyvinylbenzyltrihexyl-Ammoniumchlorid-Co-Polyvinylbenzyl- Tributylammoniumchlorid (THQ-TBQ)
Diese quaternären Vinylbenzyl-Ammoniumsalzpolymere können durch Radikalpolymerisation des geeigneten Vorprodukts Monomers oder durch umfassende Alkylierung der entsprechenden tertiären Amine oder Phosphine mit Polyvinylbenzylchloriden, oder Copolymere, die eine Benzylchloridfunktion als Seitengruppe enthalten, hergestellt werden. Ein annähernd gleiches Ergebnis kann unter Verwendung anderer polimerischer alkylierend wirkender Stoffe, wie chlorometylierendes Polyphenylenoxid oder Polyepichlorohydrin erzielt werden. Die gleichen polymerischen und alkylierend wirkenden Stoffe können als Initiatoren der ringöffnenden Polymerisation von Oxazoline fungieren, das nach Hydrolyse polyethyleneimines Pfropfcolymere abgibt. Diese Copolymere können dann vorzugsweise mit Aralkylgruppen zur Abgabe des Endprodukts Polymers quaternisiert werden.
Wasserlösliche Acetale von Polyvinylalkohol und einem quaternären Formylbenzylsalz haben die Formel:
wobei jedes R&sup4;, wie in dem eingetragenen US-Patent 4,124,388 von Bronstein-Bonte aufgeführt ist, das gleiche oder ein abweichende aliphatisches Substituent und X1 ein Anion ist das zur Ausführung dieser Erfindung ebenfalls verwendet werden kann. Das einzelne quaternäre Ammoniumsalzmonomere auf Vinylbenzylbasis kann ebenfalls zur Herstellung des Poly (quaternäre Ammoniumsalz auf Vinylbenzylbasis) unter Verwendung der vorhergehend dargestellten Formel I mit anderen ethylenisch ungesättigten Monomeren copolymerisiert werden kann, die keine quaternäre Ammoniumfunktionalität besitzen, verwendet werden, um die Polymere, die als solche in den folgenden eingetragenen US-Patenten 4,322,489 von Land, 4,340,522 von Bronstein-Bonte, 4,424,326 von Land, 4,503,138 von Bronstein-Bonte, 4,563,411 von Bronstein-Bonte und 3,898,088 von Cohen et al aufgeführt sind, zu gewinnen. Diese Polymere können ebenfalls als Enhancer-Substanzen [Wirkungssteigerungssubstanzen] zur Ausführung der Erfindung verwendet werden. Diese quaternären Polymere besitzen vorzugsweise
Molekulargewichte in dem Bereich, der für das Poly (quaternäre Ammoniumsalze auf Vinylbenzylbasis) oben angegebenen Formel I.
Einem Fachexperten auf diesem Gebiet wird offensichtlich, dass der Einsatz von kationischem Mikrogel oder vernetzten Gittern geeigneter für eine direkte Bildung von Cast Membranen ist, jedoch genauso gut für die Beschichtung von vorgeformten Membranen verwendet werden kann. Diese Materialien sind allgemein als fotografische Eriochrome bekannt und können unter Zugabe einer Monomermixtur synthetisiert werden, die ein vernetzendes Teil enthält, das durch zwei ethylenische ungesättigte Gruppen substituiert wird. Quaternäres Ammonium oder Phosphoniumsalz, das Gitterenthält, kann mit Hilfe der Verfahrensweisen, die in dem US-Patent 3,958,995 von Campbell aufgeführt sind, hergestellt werden.
In Formel IV wird allgemein eine geeignete Teilmenge dieser wasserlöslichen Latex-Copolymere dargestellt, in denen die Symbole X*, R¹, R² und R³ wie oben erwähnt dargestellt sind. Die Symbole X, Y und Z geben den Stoffmengengehalt an, der zum Erhalt einer Einheit insgesamt hinzugefügt werden muß.
Ein polymerischer Enhancer, wie BDMQ, in einer Menge von 0,01 bis 26% (0,1 bis 250 mg/ml) des Gesamtvolumens, bevorzugt dem Enzym oder einem Enzymkonjugat aus biologischen Substanzquellen hinzugegeben wird; geeigneter wäre eine Menge von 0,025 Prozent bis zu 15 Prozent (25 mg bis maximal 150 mg pro ml).. Am geeignetsten ist die Zugabe von BDMQ in einer Menge von 0,1 bis 0,2 Prozent (1 bis 2 mg pro ml)..
Das ausgegebene Signal resultierend aus dem dephosphoryliertem AttoPhosTM ist ein Nebenprodukt eines ausgelösten Energietransfers aus dem Anregungszustand des Dichtfragments Dioxetan. Das ausgegebene Signal kann auf einem grünempfindlichen Film oder in dem Luminometer einer CCD Kamera erfasst werden. Die Menge der detektierten Emission spricht auf das Aufkommen von Biopolymer und auf die Menge des oberflächengebundenen Biopolymers an.
Die Menge der verwendeten biologischen Substanz ist von der Intensität der Emission abhängig.
Die Verfahren und die Kits der vorliegenden Erfindung kann zur Bestimmung des Aufkommens und der Konzentration jeglicher biologischer Substanz, wie RNA, DNA, Proteine und Haptene angewendet werden. Die Verfahren und Kits dieser vorliegenden Erfindung können zusätzlich zum Nachweis an Membranen, wie Western, Southern, Northern Blotting und DNA-Sequenzierung ausgeführt und für Assays in Lösungsphasen verwendet werden. Im lösungsbasierten Assay oder bei Einsatz von Enhancern an Polymeren, kann die Zugabe von dephosphorylierten Produkten aus AttoPhosTM und 1,2-Dioxetan Substraten erfordern und dadurch die Proximität zwischen den Donator- und Akzeptoranteilen erhöhen.

BEISPIELE

1. BEISPIEL

Western Blotting an Nitrozellulose und PVDF (Nachweis der IgG Proteine an Membranen, die auf einer Star 1 CCD Photometrik- Kamera abgebildet werden).
Verdünnte Lösungen von IgG Kaninchen wurden auf einem 10 prozentigen Polyacrylamidgel unter Anwendung von allgemeinen Standardverfahren elektrophoresiert. Die IgG Proben betrugen 200, 66,7, 22,2, 7,4 und 2,4 ng pro Bahn für Nitrocellulose und 100, 33,3, 11,1, 3,7 und 1,2 ng pro Strich für PVDF. Daraufhin wurde das Protein zur Membran wie folgt transferiert: Das Gel wurde im Transferpuffer ausgeglichen (5 mM MOPS, 2 mM Natriumacetat, 20% Methanol, pH 7,5) und daraufhin der Nitrocellulose (Schleicher und Schüll BAS85) und PVDF (Tropix) bei einer Spannung von 90 Volt eine Stunde bei 4ºC elektrotransferiert.
Nach dem Transfer wurden die Membranen mit PBS Phosphat gepufferter Kochsalzlösung durchgespült, mit 0,2 Prozent Casein und 0,1 Prozent Tween 20 in PBS (blockierender Puffer) blockiert, dann für 30 Minuten mit einer 1 zu 10.000 Dilution auf alkalischer Phosphatase konjugiertem Ziege-anti-Kaninchen Antikörper (GAR-AP) im blockierendem Puffer inkubiert, die PVDF Membranen wurden zwei Mal für 5 Minuten im blockierenden Puffer gewaschen, Die Nitrocellulose Membranen wurden zwei Mal in 0,1 prozentiger Tween 20 PBS gewaschen,
alle Membranen wurden zwei Mal für 5 Minuten in 0,1 M Diethanolamine, 1 mM MgCl&sub2;, bei pH 10 (Substratpuffer) gewaschen, für 5 Minuten in einer 1 zu 20 Verdünnung auf Nitro-Block (Tropix) in Substratpuffer inkubiert, zwei Mal für 5 Minuten in Substratpuffer gewaschen, für 5 Minuten in 0,25 mM CSPD in Substratpuffer gewaschen und AttoPhosTM unter verschiedenen Bedingungen inkubiert, in einem Plastikumschlag versiegelt, für ca. 1 Stunde inkubiert und für 5 Minuten mit einer Star I CCD Kamera (Photometrics) aufgenommen.
Chemilumineszente Bilder wurden durch die Integration des chemilumineszenten Signals für 5 Minuten mit einer Star 1 CCD Kamera (Photometrics) über eine Schnittstelle an einen Apple Macintosh IIci Computer angeschlossen, unter Verwendung IPLab Spectrum Software. Die CCD Bilder wurden in die NIH Image Software transferiert und die durchschnittliche und maximale Pixelauflösung für jeden Bereich gemessen.
Die CCD Bilder sind Bestandteile der Western Blot Abbildungen. Blot A wurde in einem 0,25 mM CSPD Substratpuffer inkubiert. Blot B wurde gleichzeitig in 0,25 mM CSPD und 50% AttoPhosTM (50% AttoPhosTM Puffer) inkubiert. Blot C wurde zuerst für 30 Minuten in 50% AttoPhoswTM (50% Substratpuffer) inkubiert, danach wurde das AttoPhosTM entfernt und die Membran zweimal für 5 Minuten in einem Substratpuffer gereinigt und dann abschließend ein 0,25 mM CSPD Substratpuffer hinzugegeben. Blot D wurde für 30 Minuten in unverdünnten Standard AttoPhosTM inkubiert, danach die Membrane zweifach für 5 Minuten in einem Substratpuffer und anschließend in einen 0,25 mM Substratpuffer gereinigt. Die Bilder wurden ca. eine Stunde nach der ersten Zugabe von CSPD erstellt. Der durchschnittliche und maximale Signalintensität für die höchste Verdünnung für jede oben beschriebene Bedingung wurde aufgezeichnet.
Die Ergebnisse zeigen, dass die maximale Intensität durch die Zugabe von AttoPhostTM und anschließende Zugabe des 1, 2 Dioxetan nach einem festgelegten Zeitpunkt erreicht wird.

2. BEISPIEL

PSA-Immunoassay [(Hybritech Prostata Spezifisches Antigen, PSA)]

Die Normwerte des Hybritech Tandem E-PSA Kits (Katalog-Nr. 4823) wurden anhand des Protokolls und der Reagenzien, die vom Hersteller geliefert wurden, quantifiziert; mit Ausnahme des Nachweisschritts. Das Assay wurde wie folgt durchgeführt: Eine Menge von 100 ul jedes Normwerts wurde in 12 · 75 mm Glasprüfröhrchen eingemessen (6 dreifache Exemplare der Nullprobe sowie je dreifache Exemplare der anderen Normwerte). Die Menge von 100 ul der mit alkalischer Phosphatase konjugierten Maus-Anti-PSA wurde in jedes Prüfröhrchen eingemessen, gefolgt von einer Perle mit erfasstem Anti-PSA- Antikörper. Die Röhrchen wurden anschließend bei Zimmertemperatur für 2 Stunden auf einer Schüttelvorrichtung mit 170 UpM inkubiert. Die Perlen wurden dreimal mit je 2 ml Hybritech Waschlösung sowie einmal mit 0,1 ml Diethanolamine, 1 mM MgCl&sub2;, bei pH 10 (Substratpuffer) gewaschen. Danach wurde das Substrat in jedes Prüfröhrchen eingemessen. Es wurden die folgenden drei Substratverbindungen getestet (200 ul pro Prüfröhrchen): 0,25 mM CSPD, 1 mg/ml BDMQ in Substratpuffer bei Zeitpunkt Null; 0,25 mM CSPD, 1 mg/ml BDMQ, 50% AttoPhosTM im Substratpuffer bei Zeitpunkt Null; 50% AttoPhosTM 1 mg/ml BDMQ in Substratpuffer für 30 Minuten, danach wurde CSPD (Endkonzentration 0,25 mM) zugegeben. Das chemilumineszente Signal wurde 25 Minuten nach der Zugabe von CSPD (oder einer CSPD/AttoPhosTM Mischung) mit einem Berthold A 952 T Luminometer gemessen.
Die Ergebnisse zeigen, dass sowohl das Signal als auch die Signal-Rausch-Verhältnisse bei Verwendung von CSPD und AttoPhosTM größer sind als bei CSPD allein. Die Schlussfolgerung ist daher, dass die Ursache für das verstärkte Signal die Anwendung von CSPD in Verbindung mit AttoPhosTM war.

Beispiel 3

Energietransfer der Lösung (Energietransfer zwischen dem dephosphorylierten AttoPhosTM und dephosphoryliertem CSPD). Es folgt eine Liste der für die Spex Emissionsspektren verwendeten Proben. Bei allen Proben wurde 0,1 M Diethanolamine, 1 mM MgCl&sub2;, bei pH 10 verwendet, um das Endvolumen auf 2 ml zu justieren. 100% Saphir entspricht 10,0 mg/ml BDMQ.
1. 0,25 mM CSPD, 50% AttoPhosTM
2. 1,0 mM CSPD, 50% AttoPhosTM
3. 0,1 mM CSPD, 50% AttoPhosTM, 20% BDMQ
4. 0,25 mM CSPD, 50% AttoPhostTM 20% BDMQ
5. 0,5 mM CSPD, 50% AttoPhosTM, 20% BDMQ
6. 1,0 mM CSPD, 50% AttoPhosTM, 20% BDMQ
7. 1,0 mM CSPD, 50% AttoPhosTM 10% BDMQ
8. 1,0 mM CSPD, 10% AttoPhosTM, 20% BDMQ
9. 1,0 mM CSPD, 50% AttoPhosTM, 2,0 mg/ml TPP (0,4)/BDMQ (0,6)
10. 1,0 mM CSPD, 50% AttoPhosTM 2,0 mg/ml TPP (0,45)/TBQ (0,55)
11. Eine 30-minütige Vorinkubation von alkalischer Phosphatase in 50% AttoPhostTM 20% BDMQ und nachfolgender Zugabe von CSPD (0,25 mM Endkonzentration) bei Zeitpunkt Null
Bei Zeitpunkt = 0 wurde jeder Probe alkalische Phosphatase beigemischt (Endkonzentration 1,12 · 10&supmin;¹¹ M) und die Küvette in das Fluoreszenzspektrometer (SPEX Fluorolog) eingeführt. Die Emissionsspektren wurden mit eingestellten Monochromatorschlitzen auf 10 mm gemessen, und das Signal wurde für 0,5 Sekunden pro nm integriert. In fast allen Fällen wurden die Spektren bei 2, 10, 20, 30, 40, 50 und 60 Minuten dokumentiert.
Diese Experimentreihe zeigt den Energietransfer von CSPD zu AttoPhosTM in einem Puffer. Derartige lösungsbasierte Assays werderumit Immunoassays verwendet, die in Puffern durchgeführt werden.
Die Ergebnisse zeigen einen Energietransfer zwischen dem dephosphorylierten Emitter von CSPD und dem dephosphorylierten AttoPhosTM. Die Ergebnisse aus Nr. 3 bis 11 zeigen weiterhin, dass dieser Energietransfer durch das Vorhandensein von wirkungssteigernden Polymeren deutlich verstärkt wird. Die Ergebnisse aus Nr. 1 und 2 zeigen einen Anstieg im Donator; der dephosphorylierte CSPD Emitter verstärkt das Signal mittels Energietransfer, d. h. die Attoemission. In diesem Fall verstärkt sich die Blau-Emission (CSPD Chemilumineszenz). Dies kann auf eine Population des Methyl-Metaoxybenzoate-Anions (CSPD Emitter) zurückgeführt werden, das sich nicht innerhalb des Energietransferwegs vom AttoTM-Akzeptor befindet. Das Ergebnis aus Nr. 8 zeigt, dass das grüne Signal durch das AttoTM verursacht wird, da bei geringer AttoPhosTM Konzentration das Signal des Energietransfers ebenfalls sehr schwach ist. Das Ergebnis aus Nr. 6 zeigt das relative Energietransfersignal bei Zugabe der Substrate in aufeinanderfolgenden Sequenzen, d. h. zuerst die Zugabe von AttoPhosTM, welches dephosphoryliert und den Grundzustandsemitter bildet, gefolgt von der Zugabe von CSPD, das nach Dephosphorylierung fragmentiert und den angeregten Zustand des Donators erzeugt, welcher seine Energie vom dephosphorylierten AttoPhostm an den akkumulierten Akzeptor weiterleitet.

BEISPIEL 4:

Nachweis von biotinylierter DNA

Biotin-markierte DNA wurde durch das Koppeln von Streptavidin an alkalische Phosphatase und nachfolgender Inkubation mit entweder CSPD 1,2-Dioxetane-Substrat zur alkalischen Phosphatase oder Mixturen aus CSPD und dem fluoreszenten Substrat der alkalischen Phosphatase AttoPhosTM nachgewiesen. Es wurde speziell biotinylierte 35mer auf eine Pall Biodyne A Nylon-Membran aufgetragen; 210 pg am oberen Ende und danach aufeinanderfolgende, im Verhältnis 1 : 3, verdünnte Lösungen. DNA wurde bei Durchführung des Tropix Southern LightTM Verfahrens bis zur Inkubationsphase des Substrats nachgewiesen. Jede einzelne Membran wurde anschließend mit einer unterschiedlichen Substratlösung wie folgt inkubiert:
1) 0,25 mM CSPD in Assaypuffer (0,1 M DEA pH 10, 1 mM MgCl&sub2;),
2) 50% AttoPhosTM-Lösung; 50% 1 mM CSPD in Assaypuffer,
3) 50% AttoPhosTM-Lösung; 50% 0,25 mM CSPD in Assaypuffer,
4) 1 mM CSPD in AttoPhosTM-Lösung,
5) Dephosphoryliertes AttoPhosTM auf Membran aufgetragen und anschließend mit 0,25 mM CSPD in Assaypuffer inkubiert,
6) AttoPhosTM-Lösung.
Das Bild wurde mit einer Photometrics Star 1 CCD Kamera in einer
Dunkelkammer ohne externe Lichtquelle erhalten
Es wurde ein verstärktes Lichtsignal von den AttoPhosTM Proben in Verbindung mit GSPD gewonnen.
Die Antragsteller haben alle Anstrengungen unternommen ihre Erfindung mit umfassender Darstellung der Ausführungsformen unter Angabe der möglichen Kombinationen zu erläutern. Dennoch ist davon auszugehen, dass eine unbegrenzte Zahl an Kombinationsmöglichkeiten existiert, deren Ausführung an dieser Stelle nicht erschöpfend dargestellt werden kann. Mit der vorangegangenen Darstellung der Erfindung erhalten jene mit gewöhnlichen Fachkenntnissen auf diesem Gebiet ausreichende Fähigkeiten wirkungsstärkende Mittel und Zusatzstoffe einzusetzen, die in den vorhergehenden Ausführungen nicht speziell aufgeführt sind. Die Erfindung ist in der Ausführung nicht auf die angeführten Beispiele begrenzt. Die Identifizierung weiterer Kombinationen zur praktischen Ausführung dieser Technologie ist mit den hier aufgeführten Ausführungen unter Voraussetzung von Fachkenntnissen auf diesem Gebiet ohne weiteres möglich und erfordert keine Durchführung besonderer Versuche. Derartige Kombinationen sind in die Zielsetzung dieser Erfindung eingeschlossen und beabsichtigt, mit Ausnahme derer, die im Folgenden ausdrücklich unter Erhebung von Ansprüchen begrenzt oder ausgeschlossen sind.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit oder der Menge einer Substanz in einer biologischen Probe, wobei das Verfahren die Stufen umfasst:

a) Komplexierung eines Enzyms oder Enzymkonjugats mit der Substanz aus der Probe;

b) Zugabe eines hydrophoben fluorometrischen Substrats und eines 1,2-Dioxetans der folgenden Formel (I) zu dem gebundenen Enzymkomplex:

worin Z = H, Cl, andere Halogene, Alkyl-, Carboxy- oder Alkoxygruppen bedeutet;

R¹ C&sub1;-C&sub2;&sub0;-Alkyl oder C&sub1;&submin;&sub1;&sub2;-Aryl oder Aralkyl bedeutet;

Y Phenyl oder Naphthyl, unsubstituiert oder substituiert mit einer Elektronen-liefernden oder Elektronen abziehenden Gruppe, bedeutet;

R² meta-substituiert oder nicht-konjugiert an Y, bezogen auf das Dioxetan, ist und OX ist, worin

X eine durch Enzym spaltbare Gruppierung bedeutet, wobei das Dioxetan, wenn X abgespalten ist, hydrophob ist;

c) das Enzym der Enzym-komplexierten Substanz eine Enzym-abspaltbare Gruppierung von jedem des hydrophoben fluorometrischen Substrats und Dioxetans abspaltet, wobei sich das Dioxetan unter Bildung eines Donors in angeregtem Zustand zersetzt, so dass eine Energieübertragung von dem Emitter in angeregtem Zustand zu dem fluorometrischen Substrat als Akzeptor stattfindet, wodurch der Akzeptor emittiert;

d) die Anwesenheit oder Menge des Substrats als Funktion der Menge der Emission bestimmt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei weiter zu dem Enzym oder Enzymkonjugat, komplexiert mit der Substanz, ein oder mehrere polymere Verstärkungsalze, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus polymeren Ammonium-, Phosphonium- und Sulfoniumsalzen, zugegeben wird/werden.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die polymeren Salze ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus Poly(vinylbenzyltrimethylammoniumchlorid) (TMQ), Poly(vinylbenzyltributylammoniumchlorid) (TBQ) und Polyvinylbenzyldimethylbenzylammoniumchlorid (BDMQ).

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Substanz ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus RNA, DNA, Proteinen und Hapteas.

5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das hydrophobe fluorometrische Substrat zu dem Enzym oder Enzymkonjugat, komplettiert mit der Substanz, zugegeben wird und das 1,2- Dioxetan danach nach einer Zeit zugegeben wird, die ausreicht, dass das Enzym die Enzym spaltbare Gruppe von dem fluorometrischen Substrat abspalten kann.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Zeit 25 bis 30 Minuten beträgt.

7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das 1,2-Dioxetan in Konzentrationen von 0,25 bis 1,0 mM vorhanden ist.

8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das fluorometrische Substrat AttoPhosTM ist und in Form eines 2,40 M Diethanolamins (DEA) in Wasserpuffer in Konzentrationen von 10 bis 100 Vol.-% vorhanden ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei Poly(vinylbenzyldimethylbenzylammoniumchlorid) (BDMQ) in der Stufe (b) in einer Menge von 1 bis 2 mg/ml zusätzlich zu AttoPhosTM und 1,2-Dioxetan zugegeben wird.

10. Verfahren nach Anspruch 1, wobei vor der Stufe (b) eine Hybridisierung oder eine Immunokomplexierungsstufe durchgeführt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das komplexierte Enzym an die Membran oder Perlen gebunden ist.

12. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das hydrophobe fluorometrische Substrat AttoPhoszTM ist.

13. Kit zur Durchführung eines Bioassays für die Anwesenheit oder Konzentration einer Substanz in einer biologischen Probe nach dem Verfahren von Anspruch 1, umfassend:

a) ein Enzym oder Enzymkonjugat, welches mit einer biologischen Substanz beim Mischen damit einen Komplex bildet;

b) ein 1,2-Dioxetan der folgenden Formel (I)

worin Z = H, Cl, andere Halogene, Alkyl-, Carboxy- oder Alkoxygruppen bedeutet;

Y Phenyl oder Naphthyl, unsubstituiert oder substituiert mit einer Elektronen-liefernden oder Elektronen abziehenden Gruppe bedeutet;

X eine durch Enzym spaltbare Gruppierung bedeutet, wobei das Dioxetan, wenn X abgespalten ist, hydrophob ist; und

c) ein hydrophobes fluorometrisches Substrat.

14. Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit oder Menge eines Enzyms in einer biologischen Probe, umfassend:

a) Zugabe zu der Probe ein hydrophobes fluorometrisches Substrat und ein Dioxetan der Formel I:

worin Z = H, Cl, andere Halogene, Alkyl-, Carboxy- oder Alkoxygruppen bedeutet;

b) Nachweis der Anwesenheit oder Menge der Emission aus dem hydrophoben fluoreszierenden Substrat nach dem Zumischen, wobei das Enzym eine Enzym spaltbare Gruppierung aus dem hydrophoben fluoreszierenden Substrat und dem Dioxetan abspaltet, so dass eine Energieübertragung von dem angeregten Zustand des Zersetzungsproduktes des Dioxetans zu dem hydrophoben fluoreszierenden Substrat erfolgt.