JP2007225547A - 標的物質の疎水部位の検出方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】タンパク質などの疎水部位を形成し得る標的物質の疎水部位を検出する方法であって、高い感度で、簡便な検出装置を用いて、蛍光を有する被験物質であっても測定可能な方法を提供すること。
【解決手段】疎水部位を形成し得る標的物質と化学発光物質とを接触させる工程、及び化学発光を測定する工程を含む、標的物質の疎水部位を検出する方法。
【選択図】なし
【解決手段】疎水部位を形成し得る標的物質と化学発光物質とを接触させる工程、及び化学発光を測定する工程を含む、標的物質の疎水部位を検出する方法。
【選択図】なし
Description
本発明は、タンパク質などの疎水部位を形成し得る標的物質の疎水部位を検出する方法に関する。より詳細には、本発明は、標的物質の疎水部位を化学発光を利用して検出する方法に関する。
現在、薬剤のスクリーニングは多種多様な方法で行われている。近年、ターゲットタンパク質を加温して凝集させ、タンパク質のあるエピトープに対する２種類の蛍光標識モノクローナル抗体を使用し、ＦＲＥＴ検出するAnadays PharmaceuticalsのATLASシステムがある。また、ターゲットタンパク質を加温して凝集させ、露出した疎水部分に特異的に結合する蛍光物質、アリルナフタレンスルフォン酸類を使用して蛍光測定する方法などが注目されている。上記の方法は何れも、ターゲットタンパク質に親和性の高い薬剤が結合すると、高温側シフトすることを利用し、薬剤のスクリーニングを行っている。上記の方法は何れも、検出法として蛍光検出のみを使用し、化学発光検出を行うことは知られていない。
しかしながら、上記したような蛍光検出には、感度が低かったり、検出装置が複雑であったり、被験物質が蛍光を有する場合には測定できない場合があるという問題があった。
本発明は上記した従来技術の問題を解消することを解決すべき課題とした。即ち本発明は、タンパク質などの疎水部位を形成し得る標的物質の疎水部位を検出する方法であって、高い感度で、簡便な検出装置を用いて、蛍光を有する被験物質であっても測定可能な方法を提供することを解決すべき課題とした。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、疎水部位を形成し得る標的物質と化学発光物質とを接触させ、これにより生成する化学発光を測定することによって標的物質の疎水部位を検出できることを見出し、本発明を完成した。
即ち、本発明によれば、疎水部位を形成し得る標的物質と化学発光物質とを接触させる工程、及び化学発光を測定する工程を含む、標的物質の疎水部位を検出する方法が提供される。
さらに本発明によれば、（１）疎水部位を形成し得る標的物質を被験物質の存在下において一定の温度でインキュベートする工程、（２）上記（１）の混合物と化学発光物質とを接触させる工程、及び（３）化学発光を測定する工程を含む、標的物質と被験物質との親和性の分析方法が提供される。
さらに本発明によれば、（１）疎水部位を形成し得る標的物質を、被験物質の存在下及び非存在下において一定の温度でインキュベートする工程、（２）上記（１）の混合物と化学発光物質とを接触させる工程、及び（３）被験物質の存在下の場合と被験物質の非存在下の場合のそれぞれについて化学発光を測定し、両者を比較する工程を含む、標的物質と被験物質との親和性の分析方法が提供される。
好ましくは、工程（１）において、疎水部位を形成し得る標的物質と被験物質との混合物を複数個用意し、各混合物を異なる温度でインキュベートする。
好ましくは、異なるインキュベーション温度のそれぞれに対して、測定された化学発光強度をプロットすることによって、熱展開曲線を作成する。
好ましくは、被験物質の存在下の場合に得られた熱展開曲線、及び被験物質の非存在下の場合に得られた熱展開曲線から中間点温度（Ｔｍ）をそれぞれ求めて、両者を比較する。
好ましくは、異なるインキュベーション温度のそれぞれに対して、測定された化学発光強度をプロットすることによって、熱展開曲線を作成する。
好ましくは、被験物質の存在下の場合に得られた熱展開曲線、及び被験物質の非存在下の場合に得られた熱展開曲線から中間点温度（Ｔｍ）をそれぞれ求めて、両者を比較する。
好ましくは、疎水部位を形成し得る標的物質はタンパク質である。
好ましくは、化学発光物質はアダマンタン化合物である。
好ましくは、化学発光物質は、2-クロロ5-(4-メトキシスピロ[1,2-ジオキセタン-3,2’-(5’-クロロ)トリシクロ[3,3,1,1]デカン]-4-イル)フェニルホスフェート二ナトリウムである。
好ましくは、化学発光物質はアダマンタン化合物である。
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本発明によるタンパク質などの疎水部位を形成し得る標的物質の疎水部位を検出する方法によれば、高い感度で、簡便な検出装置を用いて、被験物質が蛍光を有する場合であっても測定を行うことが可能である。
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明は、タンパク質などの疎水部位（変性したタンパク質）を、化学発光を利用して検出する方法に関する。本発明の方法の一例においては、マイクロチューブ等に微量の標的タンパク質と、該標的タンパク質の阻害剤を加えて、各チューブを任意の温度でインキュベーションし、それぞれの温度におけるタンパク質の熱の変性度を測定するために化学発光物質を添加する。熱により変性したタンパク質は疎水部位を露出し、化学発光物質はその疎水部位に結合して化学発光をする。各温度に対する化学発光強度をプロットすることで曲線（即ち、熱展開曲線）が得られる。この操作を、タンパク質のみの場合と、タンパク質とその阻害剤を添加した場合とで比較することにより、曲線の中間温度点の変化を検出することができ、その変化の度合いにより、該標的タンパク質に対する該阻害剤の親和性のランク付けを行うことが可能になる。
本発明は、タンパク質などの疎水部位（変性したタンパク質）を、化学発光を利用して検出する方法に関する。本発明の方法の一例においては、マイクロチューブ等に微量の標的タンパク質と、該標的タンパク質の阻害剤を加えて、各チューブを任意の温度でインキュベーションし、それぞれの温度におけるタンパク質の熱の変性度を測定するために化学発光物質を添加する。熱により変性したタンパク質は疎水部位を露出し、化学発光物質はその疎水部位に結合して化学発光をする。各温度に対する化学発光強度をプロットすることで曲線（即ち、熱展開曲線）が得られる。この操作を、タンパク質のみの場合と、タンパク質とその阻害剤を添加した場合とで比較することにより、曲線の中間温度点の変化を検出することができ、その変化の度合いにより、該標的タンパク質に対する該阻害剤の親和性のランク付けを行うことが可能になる。
本発明では、化学発光物質を使用して、該化学発光物質が疎水部位に結合して発生する化学発光を測定する。化学発光は、化学反応によって励起された分子が基底状態に戻る際、エネルギーを光として放出する現象である。この中で分子単独が励起状態を形成するものを直接発光と呼び、系内に存在する蛍光剤等へエネルギー移動し、蛍光剤の発光が観測されるものを間接化学発光と呼ぶ。また生物発光も酵素反応を利用した化学発光の一種である。
本発明において使用できる化学発光物質の具体例としては、ルミノール系化合物やジオキセタン系化合物などが挙げられる。ルミノール系化合物は、ルミノールが、血液中の鉄分により触媒されて発光することは古くから知られており、種々の研究が行われてきた。ルミノールは、過酸化水素の存在下で中間体を経て分解し、光を放出する。またこの反応は、ペルオキシダーゼに触媒されて強く発光することが知られている。1985年にKrickaらは、ルミノールの化学発光がエンハンサーであるヨードフェノール化合物を加えることことによって、約1000倍にも増強され、発光時間が延長されることを発見し、この方法をEnhanced Chemi1uminescenceと呼んでいる。ルミノールの構造式と反応式を以下に示す。
ジオキセタン系化合物としては、1989年にBronsteinらが発表したアルカリ性フォスファターゼの基質（AMPPD）は、高感度な化学発光基質として注目を集めた。AMPPD自身は水溶液中で安定であるが、アルカリ性フォスファターゼで加水分解されると不安定な中間体を経て発光する。近年、ジオキセタン系の基質は、分子生物学分野のサザンハイブリダイゼーションの検出に使われるようになった。AMPPD、CSPDよりもさらに発光が強い、CDP−Starが開発され、急速に普及している。ジオキセタン系化合物の具体例の構造式とCDP-Starの反応を以下に示す。AMPPD,CSPD,CDP-StarはTropix社の、登録商標もしくは商標である。
本発明で用いる化学発光物質としては、上記したAMPPD,CSPD,及びCDP-Starなどのアダマンタン化合物を使用することが好ましい。
本発明で用いる化学発光物質としては、上記したAMPPD,CSPD,及びCDP-Starなどのアダマンタン化合物を使用することが好ましい。
ルミノール系化合物は、和光純薬工業社から市販されているImmuno Star Kitを使用することができる。また、ジオキセタン系化合物は、第一化学薬品社から市販されているPhototope−Star Western Blot Detection kitなどを使用することができる。PhototopeはNew England Biolabs社の商標である。
上記したような化学発光物質が発する化学発光は、市販のルミノ・イメージアナライザー（例えば、富士写真フイルム株式会社のLASシリーズなど）を用いて測定することができる。
本発明における標的物質は、疎水部位を形成し得る物質であれば特に限定されず、任意の物質を使用することができる。疎水部位を形成し得る標的物質の具体例としては、ペプチド、タンパク質、核酸、糖、脂質などを挙げることができ、さらにリポソーム、ミセル、ポリマー、油滴などでもよい。タンパク質とは、立体構造を有するポリペプチドを意味し、一般的にはアミノ酸数は２０個程度以上である。本発明で言うタンパク質としては、受容体、酵素、抗体、その他の任意のタンパク質が含まれる。また、タンパク質は、単量体タンパク質でも多量体タンパク質でもよく、水溶性タンパク質又は非水溶性タンパク質の何れでもよいが、好ましくは水溶性タンパク質である。また、核酸は、一本鎖核酸、二本鎖核酸、又は三重鎖核酸の何れでもよい。疎水部位を形成し得る標的物質は、折り畳み、コイル化、又はねじれによって二次構造、三次構造、又は四次構造をとることのできるタンパク質であることが好ましい。
本発明における被験物質は、標的物質に対する親和性に関して試験される物質を意味する。被験物質の種類は特に限定されず、任意の化学物質を使用することができ、例えば、低分子有機化合物、ＤＮＡ及びＲＮＡなどの核酸、並びにペプチドなどを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。被験物質としては、化合物ライブラリー又はコンビナトリアルライブラリー中の化合物を使用することもできる。
疎水部位を形成し得る標的物質を、被験物質の存在下においてインキュベートする際には、被験物質を含む溶液と標的物質を含む溶液とを混合して、インキュベートすればよい。混合及びインキュベートは適当な容器内で行うことができる。容器としては、試験管、マイクロチューブ、バイアル、キュベット、マルチウェルマイクロプレート（例えば、（96または384ウェルマイクロプレートなど）中の穴、又はマイクロタイタープレート中の穴などを使用することができる。
本発明においては、被験物質の存在下の場合と被験物質の非存在下の場合のそれぞれについて熱展開曲線を取得することが好ましい。本発明においては、このようにして得られた熱展開曲線の移動を評価することによって、標的物質と被験物質との親和性を分析することができる（以下、熱シフトアッセイとも言う）。
熱シフトアッセイは、タンパク質または核酸のような標的物質の熱展開曲線のリガンド依存性変化に基づくものである。ある範囲の温度を超えて加熱される場合、標的物質は変性する。変性の程度を温度の関数としてプロットすることにより、標的物質についての熱展開曲線が得られる。
被験物質が標的物質に結合すると、その標的物質は安定化することが一般に知られている。被験物質による標的物質の安定化の結果として、より多くのエネルギー（即ち、熱）が、標的物質の変性のために必要とされる。従って、標的物質への被験物質の結合は、熱展開曲線を高温側にシフトさせることになる。この特性を利用して、標的物質に対する被験物質の親和性の程度を決定することができる。熱展開曲線の移動（シフト）（即ち、Ｔｍのシフト）は、被験物質が標的物質に結合することを示している。
本発明においては、被験物質の存在下の場合に得られた熱展開曲線、及び被験物質の非存在下の場合に得られた熱展開曲線から中間点温度（Ｔｍ）をそれぞれ求めて、両者を比較することが好ましい。中間点温度（Ｔｍ）において標的物質は半分が変性されることになる。中間点温度（Ｔｍ）は、当業者に周知の方法で容易に決定することができる。
あるいは、熱展開曲線の全体を、コンピュータ分析などの手段を使用することによって、他の熱展開曲線の全体と比較することもできる。
滑らかな熱展開曲線を作成するためには、サンプルは、１〜２０℃、より好ましくは１〜１０℃、さらに好ましくは１〜５℃の間隔で加熱することが好ましい。サンプルが加熱される温度範囲は、好ましくは２５〜１００℃である。
本発明において、複数のサンプルは同時に加熱することができる。サンプルを不連続な温度間隔にて加熱する場合、化学発光の強度の測定は、各加熱工程後に行うことができる。あるいは、各加熱工程の後、化学発光の強度を測定する前に、サンプルをより低温に冷却してもよい。あるいは、サンプルを連続的に加熱して、加熱中に化学発光強度を測定してもよい。
本発明の方法を利用して、リード化合物を同定することができる。化合物または化合物コンビナトリアルライブラリーを本発明の方法によりスクリーニングした後、標的物質に高い親和性を有すると同定された化合物を化学的に修飾して、化合物の第２のライブラリーを作製する。次いで、この第２のライブラリーを、本発明の方法によりスクリーニングすることができる。このスクリーニング工程および新しいライブラリーの作製する工程を、例えば、10-4〜10-5MのＫｄ値に相当する親和性を有する被験物質が得られるまで続けることができる。
化学発光の読み取りは各サンプルについて連続的かつ同時に行うこともできる。低温では全てのサンプルが低レベルの化学発光を表示する。温度が上昇するにつれて、各サンプルの化学発光が増大する。標的物質に対して高い親和性を有する被験物質を含むウェルは、熱展開曲線が高温度側にシフトする。その結果、標的物質に対して高い親和性を有する被験物質を含むウェルは、被験物質の非存在における標的分子のＴｍより高い温度において被験物質を含まないウェルよりも化学発光が弱くなる。
また、本発明の方法では、標的物質に対して二種以上の被験物質を同時に用いて分析を行うこともできる。熱展開曲線は、標的物質のみの場合（被験物質なしの場合）、および２種以上の被験物質の組合せの存在下における被験物質の場合に対して作成することができる。次いで、中間点温度（Ｔｍ）を各曲線について決定し、各Ｔｍを他の曲線の他のＴｍと比較するか、あるいは各熱展開曲線全体を他の熱展開曲線と比較することができる。これにより、２以上の被験物質の組み合わせによる標的物質の安定性に対する寄与を評価することができる。
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１：ＣＡ(Carbonic Anhydrase Isozyme II from bovine erythrocytes、Sigma 、以下ＣＡと記す)とAcetazolamide（Sigma）の反応
（１）試薬の調製
ＣＡ溶液（1mg/ml）は、トリスバッファー（100mM トリスヒドロキシアミノメタン、150mM 塩化ナトリウム、pH9.5）を用いて調製し、氷上においた。
化学発光物質（Disodium 2-Chloro 5-(4-methoxyspiro[1,2-dioxetane-3,2´-(5´-Chloro)tricyclo[3,3,1,1]decan]-4-yl)phenyl phosphate、Roche製）は市販品(CDP-Star,ready to use)を使用した。
Acetazoleamide(0.02mM)溶液は、1％DMSO, トリスバッファーを用いて調製した。
（１）試薬の調製
ＣＡ溶液（1mg/ml）は、トリスバッファー（100mM トリスヒドロキシアミノメタン、150mM 塩化ナトリウム、pH9.5）を用いて調製し、氷上においた。
化学発光物質（Disodium 2-Chloro 5-(4-methoxyspiro[1,2-dioxetane-3,2´-(5´-Chloro)tricyclo[3,3,1,1]decan]-4-yl)phenyl phosphate、Roche製）は市販品(CDP-Star,ready to use)を使用した。
Acetazoleamide(0.02mM)溶液は、1％DMSO, トリスバッファーを用いて調製した。
（２）反応
PCR用マイクロチューブに3.3μM CA溶液30μLとトリスバッファー30μLをマイクロピペットで移した。このような試料を各温度（30,46,62,66,68,70,72,78,82,94℃）に対して作製した。別に、PCR用マイクロチューブに3.3μM CA溶液30μLと0.02mM Acetazoleamide溶液30μLをマイクロピペットで移した。このような試料を各温度（30,46,62,66,68,70,72,78,82,94℃）に対して作製した。次に、サーマルサイクラー（TaKaRa PCR Thermal Cycler PERSONAL）を用いて、対応する温度30℃で３分間加熱後、25℃に１分間保持した。その後、CDP-Star,ready to use 30μL添加し、室温で15分間ゆっくり攪拌した。0.36μg/mlアルカリフォスフォターゼ（ORIENTAL YEAST CO.,LTD）30μLを更に添加し、室温で10分間反応させた。このような反応操作を次に示す温度（46,62,66,68,70,72,78,82,94℃）についても行った。
PCR用マイクロチューブに3.3μM CA溶液30μLとトリスバッファー30μLをマイクロピペットで移した。このような試料を各温度（30,46,62,66,68,70,72,78,82,94℃）に対して作製した。別に、PCR用マイクロチューブに3.3μM CA溶液30μLと0.02mM Acetazoleamide溶液30μLをマイクロピペットで移した。このような試料を各温度（30,46,62,66,68,70,72,78,82,94℃）に対して作製した。次に、サーマルサイクラー（TaKaRa PCR Thermal Cycler PERSONAL）を用いて、対応する温度30℃で３分間加熱後、25℃に１分間保持した。その後、CDP-Star,ready to use 30μL添加し、室温で15分間ゆっくり攪拌した。0.36μg/mlアルカリフォスフォターゼ（ORIENTAL YEAST CO.,LTD）30μLを更に添加し、室温で10分間反応させた。このような反応操作を次に示す温度（46,62,66,68,70,72,78,82,94℃）についても行った。
（３）検出
一連の操作が済んだら、各マイクロチューブ内の試料を、nunc 245393 F96 Black plate（ポリスチレン製タイタープレート）に移し、LAS-1000pro（富士フィルム（株）製）を使用し、化学発光強度を測定した。
一連の操作が済んだら、各マイクロチューブ内の試料を、nunc 245393 F96 Black plate（ポリスチレン製タイタープレート）に移し、LAS-1000pro（富士フィルム（株）製）を使用し、化学発光強度を測定した。
（４）結果
結果を図１に示す。なお、図１のグラフの縦軸は、各温度の化学発光強度値から30℃の化学発光強度値を差し引いて表示した。control（タンパク質単独）の温度曲線からの中間温度は66.3℃で、0.02mM Acetazolamideの温度曲線からの中間温度が66.９℃の結果を得た。タンパク質単独の温度曲線の中間温度点と阻害化合物が存在する温度曲線の中間温度点に差異を生じ高温側に中間温度点が移動することが判った。
結果を図１に示す。なお、図１のグラフの縦軸は、各温度の化学発光強度値から30℃の化学発光強度値を差し引いて表示した。control（タンパク質単独）の温度曲線からの中間温度は66.3℃で、0.02mM Acetazolamideの温度曲線からの中間温度が66.９℃の結果を得た。タンパク質単独の温度曲線の中間温度点と阻害化合物が存在する温度曲線の中間温度点に差異を生じ高温側に中間温度点が移動することが判った。
実施例２：
実施例１で用いたマイクロタイタープレートの代わりにポリスチレン製タイタープレート（住友ベークライト社製 SUMILON F Clear）を用いて、実施例１と同様の実験を行った結果、実施例１と同様の結果が得られた。
実施例１で用いたマイクロタイタープレートの代わりにポリスチレン製タイタープレート（住友ベークライト社製 SUMILON F Clear）を用いて、実施例１と同様の実験を行った結果、実施例１と同様の結果が得られた。
比較例１：
蛍光検出を利用するThermal Shift Assay（ALDRICHの8-Anilino-1-naphthalen-sulfonic acid, ammonium salt hydrate (FW 316.38)を使用した）をポリスチレン製タイタープレートで行ったところ、バックグラウンドノイズが大きく測定できなかった。
蛍光検出を利用するThermal Shift Assay（ALDRICHの8-Anilino-1-naphthalen-sulfonic acid, ammonium salt hydrate (FW 316.38)を使用した）をポリスチレン製タイタープレートで行ったところ、バックグラウンドノイズが大きく測定できなかった。
Claims (12)
- 疎水部位を形成し得る標的物質と化学発光物質とを接触させる工程、及び化学発光を測定する工程を含む、標的物質の疎水部位を検出する方法。
- 疎水部位を形成し得る標的物質がタンパク質である、請求項１に記載の方法。
- 化学発光物質がアダマンタン化合物である、請求項１又は２に記載の方法。
- 化学発光物質が、2-クロロ5-(4-メトキシスピロ[1,2-ジオキセタン-3,2’-(5’-クロロ)トリシクロ[3,3,1,1]デカン]-4-イル)フェニルホスフェート二ナトリウムである、請求項１から３の何れかに記載の方法。
- （１）疎水部位を形成し得る標的物質を被験物質の存在下において一定の温度でインキュベートする工程、（２）上記（１）の混合物と化学発光物質とを接触させる工程、及び（３）化学発光を測定する工程を含む、標的物質と被験物質との親和性の分析方法。
- （１）疎水部位を形成し得る標的物質を、被験物質の存在下及び非存在下において一定の温度でインキュベートする工程、（２）上記（１）の混合物と化学発光物質とを接触させる工程、及び（３）被験物質の存在下の場合と被験物質の非存在下の場合のそれぞれについて化学発光を測定し、両者を比較する工程を含む、標的物質と被験物質との親和性の分析方法。
- 工程（１）において、疎水部位を形成し得る標的物質と被験物質との混合物を複数個用意し、各混合物を異なる温度でインキュベートする、請求項５又は６に記載の方法。
- 異なるインキュベーション温度のそれぞれに対して、測定された化学発光強度をプロットすることによって、熱展開曲線を作成する、請求項５から７の何れかに記載の方法。
- 被験物質の存在下の場合に得られた熱展開曲線、及び被験物質の非存在下の場合に得られた熱展開曲線から中間点温度（Ｔｍ）をそれぞれ求めて、両者を比較する、請求項８に記載の方法。
- 疎水部位を形成し得る標的物質がタンパク質である、請求項５から９の何れかに記載の方法。
- 化学発光物質がアダマンタン化合物である、請求項５から１０の何れかに記載の方法。
- 化学発光物質が、2-クロロ5-(4-メトキシスピロ[1,2-ジオキセタン-3,2’-(5’-クロロ)トリシクロ[3,3,1,1]デカン]-4-イル)フェニルホスフェート二ナトリウムである、請求項５から１１の何れかに記載の方法。
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