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PATENTANSPRÜCHE
1. Das Wachstum von Bifidobakteria förderndes Mittel, enthaltend Oligosaccharide der Formel Gal-(Gal)Glk, in der Gal für einen Galaktoserest, Glk für einen Glukoserest und n für eine ganze Zahl von 1 bis 4 stehen.
2. Verfahren zur Herstellung eines Mittels gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Laktose oder ein Laktose enthaltendes Substrat mit ss-Galaktosidase aus Aspergillus oryzae behandelt wird.
Diese Erfindung betrifft ein das Wachstum von Bifidobakteria förderndes Mittel sowie ein Verfahren zu dessen Herstellung.
Es sind schon einige Substanzen vorgeschlagen worden, die das Wachstum von Bifidobakteria fördern. Im folgenden wird dieses Vermögen als Bifidusvermehrungsfaktor bezeichnet. Ebenso sind verschiedene Verfahren vorgeschlagen worden, um solche Substrate herzustellen. Einige dieser Substrate enthalten Milch in Pulverform. Beispiele solcher Substrate und/oder Verfahren sind in den folgenden veröffentlichten japanischen Patenten enthalten: Nr. 32 908/66, 6510/70, 6865/70, 21 606/70, 40 956/74 und 40 957/74. Die meisten dieser bekannten Bifidusvermehrungsfaktoren sind jedoch nur in Kulturen ausserhalb des lebenden Körpers nachgewiesen worden. Ihre Aktivität im lebenden Körper ist somit fraglich und zudem meistens ungenügend.
Bifidobakteria sind nützliche Bakterien, welche sich im menschlichen Darm aufhalten. Ihre physiologische Wichtigkeit ist bekannt. Es ist daher klar, dass versucht worden ist, den Anteil dieser Bakterien unter den anderen Bakterien des Darms zu erhöhen. Dies trifft speziell bei künstlich ernährten Kindern zu. Neben den Fällen, in denen der Bifidusvermehrungsfaktor ausserhalb des Körpers erhöht werden soll, wie zum Beispiel in Lebensmittel, ist es daher nützlich, den gleichen Faktor innerhalb des lebenden Körpers zu erhöhen. Es besteht daher die Nachfrage nach solchen Faktoren, die vor allem unter dem obengenannten Aspekt gegen über den bekannten Medien verbessert sind.
Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, Bifidusvermehrungsfaktoren zu beschaffen, die auch im lebenden Körper eine hohe Aktivität aufweisen und daher den obengenannten Ansprüchen gerecht werden.
Das Ziel wird durch das erfindungsgemässe, das Wachstum von Bifidobakteria fördernde Mittel gemäss dem vorausgehenden Patentanspruch 1 erreicht.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemässen Mittels.
Im folgenden wird kurz auf die beigelegten Figuren 1 bis 6 eingegangen.
Fig. 1 zeigt eine graphische Darstellung der Verhältnisse zwischen den Saccharidausbeuten und der Reaktionszeit bei der Behandlung von Laktose mit ss-Galaktosidase.
Fig. 2 zeigt das Resultat der Gelfiltrationuntersuchung durch Oligosaccharid.
Fig. 3 zeigt das Resultat der Untersuchung gemäss Beispiel 2.
Fig. 4 zeigt das Resultat der Untersuchung gemäss Beispiel 3.
Fig. 5 zeigt das Resultat der Untersuchung gemäss Beispiel 4.
Fig. 6 zeigt das Resultat der Untersuchung gemäss Beispiel 5.
Die meisten der obengenannten Oligosaccharide, welche die wirksamen Konstituenten des erfindungsgemässen Mittels bilden, wurden durch die Erfinder in Untersuchungen über Transferreaktionen mit Hydrolysereaktionen zwischen Laktose und ss-Galaktosidase entdeckt. Über diese Arbeiten ist viel veröffentlicht worden, seit Wallenfels in 1951 die erste der obengenannten Transferreaktionen beschrieben hat.
Die transferierten Oligosaccharide, die dadurch isoliert werden können, sind die folgenden Disaccharide: Gal-(ss-1,2)-Glc, Gal-(ss-1,3)-Glc, Gal-(ss-1,6)-Glc, Gal-(ss-1,3)-Gal und Gal (ss-1,6)-Gal; ebenso fallen darunter die folgenden Trisaccharide: Gal-(ss-1,6)-Gal-(ss-1,4)-Glc und Gal-(ss-1,6)-Gal- (p-1,6)-Glc. Die Arten der Galaktosidbindung ist in den obigen Formeln mit den Klammern angegeben. Die Anwesenheit von Tetrasacchariden in den Produkten der obigen Transferreaktionen wurde durch Huber et al bestätigt, hingegen ist die Struktur der genannten Verbindungen noch nicht abgeklärt. Auch die Produktion von Polysacchariden, die Pentasaccharide umfassen, ist nicht veröffentlicht worden.
Alle genannten Veröffentlichungen beziehen sich jedoch auf die Aufklärung des Transfermechanismus und auf Strukturstudien der erhaltenen Oligosaccharide. Keine Veröffentlichung beschäftigt sich mit dem Verhältnis zwischen den transferierten Oligosacchariden und dem Wachstum von Bifidobakteria.
Das Oligosaccharid, welches den erfindungsgemässen Bifidusvermehrungsfaktor darstellt, und die obengenannte Formel hat, wird im folgenden einfach als Oligosaccharid bezeichnet. Es wird erhalten durch Behandlung von Laktose mit ss-Galaktosidase aus Aspergillus oryzae. Nach dieser Behandlung enthält die Reaktionsmischung nicht reagierte Laktose, wie auch Galaktose und Glukose, die alle durch Hydrolyse entstanden sind. Um daher ein Produkt mit einem hohen Bifiduswachstumsfaktor zu erhalten, ist es nötig, die Oligosaccharidkonzentration zu erhöhen. Diese wird gemäss bekannten Verfahrensschritten erreicht. Dieselbe Konzentration kann jedoch schon optimal erhalten werden durch Auswahl günstiger Enzymbehandlungskonditionen oder durch Kombination der beiden Verfahren.
Zur Herstellung des erfindungsgemässen Bifiduswachstumsfaktor kann folgendermassen vorgegangen werden:
Kommerziell erhältliche Laktose kann so, wie sie ist, für die Behandlung mit ss-Galactosidase eingesetzt werden; es ist nicht nötig, den Ausgangsstoff speziell zu raffinieren. Auch ganze oder teilweise entrahmte Milch, die Laktose enthält, kann als Ausgangsmaterial eingesetzt werden.
Die Enzymbehandlung geschieht am besten mit einer Substratkonzentration von 10 bis 50%, bei einem pH von 3 bis 8, bei einer Enzymkonzentration von 1 bis 100 Einheiten und bei einer Temperatur von 20 bis 50 "C.
Die Reaktionszeit hat einen ausgeprägten Einfluss auf die Oligosaccharidausbeute. Wie die Fig. 1 zeigt, existiert zwischen der Reaktionszeit und der Menge der erhaltenen Produkte ein komplexer Zusammenhang. So nehmen die Mengen der erhaltenen Glukose, Galaktose und Oligosaccharide am Anfang der Reaktion ziemlich linear mit der Zeit zu. Anschliessend nimmt die Zunahme jedoch ab und die Kurven verflachen. Speziell bei Oligosaccharid nimmt jedoch die Anfangskonzentration nach einer gewissen Zeit wieder ab. Die Zeit, bei der die Oligosaccharidkonzentration am höchsten ist, kann von verschiedenen Faktoren abhängen. Am besten wird sie experimentell bestimmt. Zu dieser Zeit ist dann die Ausbeute an Oligosacchariden am höchsten.
Die in der Reaktionsmischung vorliegenden Oligosaccharide können nun zum Beispiel mit Dünnschichtchroma
tographie von den anderen Reaktionsprodukten abgetrennt werden und mittels der Anthron-Methode auf ihre Struktur hin untersucht werden.
Die Enzymreaktion kann dadurch abgebrochen werden, dass die Reaktionsmischung 5 bis 10 Minuten lang auf eine Temperatur von über 90 "C erhitzt wird.
Die nach der Enzymbehandlung erhaltene Reaktionsmischung kann entweder als solche als Bifiduswachstumsfaktor verwendet werden oder sie kann in verschiedenen anderen Zusammensetzungen, beispielsweise Milchprodukte, eingesetzt werden. Das Reaktionsprodukt kann auch in die verschiedenen einzelnen Produkte aufgetrennt werden, es kann konzentriert werden oder es kann in ein trockenes Pulver übergeführt werden.
Die Reindarstellung der Oligosaccharide kann mittels verschiedenen Verfahren erreicht werden: Das Medium kann über Ionenaustauscherharz vorkonzentriert und dann über Aktivkohle gereinigt werden. An der Aktivkohle werden die Oligosaccharide adsorbiert und können dann mit einer Wasser/Alkohol-Mischung eluiert werden. Es ist auch möglich,
Reaktionsmischungen nach der Enzymreaktion mit Monound Disaccharid fermentierbaren Mikroorganismen zu inokulieren, um so dieselben zu konsumieren.
Dadurch wird die Isolierung von Oligosacchariden erleichtert.
Im folgenden wird eine analytische Untersuchung von Oligosacchariden beschrieben, welche in der erfindungsgemässen Zusammensetzung gemäss Beispiel 1 enthalten sind.
Die Analyse wird unter Standard-Bedingungen ausgeführt.
a) Molekulargewichtverteilung
Fig. 2 zeigt das Resultat einer Gel-Filtration an Bio-Gel P 2. Die Peaks A, B und C entsprechen Tri-, Tetra- und Pentasacchariden. Die Zusammensetzung der Reaktionsmischung in bezug auf Oligosacchariden wird gemäss der den Peaks entsprechenden Flächen berechnet. Sie beträgt ungefähr 55% Trisaccharide, ungefähr 32% Tetrasaccharide und ungefähr 13% Pentasaccharide und höhere Saccharide.
b) Zusammensetzung in bezug auf Saccharide
Laktose, Oligosaccharide (nicht aufgetrennt in einzelne Bestandteile) und Tri- bzw. Tetrasaccharide der Oligosaccharide wurden je 4 Stunden lang in einer 0,5 N HC1-Lösung bei100 Chydrolysiert.
Das gleiche Ausgangsprodukt wurde 4 Stunden lang mit ss-Galaktosidase bei 50 C hydrolysiert. Die Molverhältnisse der erhaltenen Saccharide für die beiden Fälle sind in der Tabelle 1 zusammengestellt. Die Daten der genannten Tabelle zeigen, dass die Molverhältnisse Glukose/Galaktose für Tri-, Tetra- und Pentasaccharide der Oligosaccharide je 1: 2, 1:3 und 1: 4 betragen.
Tabelle 1
Galaktose/Glukose
Säure Zersetzung durch hydrolyse Enzyme Laktose 0,98 0,98 Oligosaccharide 2,44 2,42 Trisaccharide 1,94 1,92 Tetrasaccharide 2,88 2,84 Pentasaccharide 3,82 3,80 c) Bindungsarten der Polisaccharide
Im Produkt, das aus der partiellen Säurehydrolyse der Hauptkomponenten von Trisacchariden erhalten wurde, wurde eindeutig die Anwesenheit von Laktose und von Gal (p-1,6)-Gal bestätigt. Daneben wurden auch Glukose und Galaktose nachgewiesen. Die Bestandteile waren übrigens mittels Aktivkohle-Chromatographie getrennt worden. Aus diesem Resultat und aus dem Verhältnis Glukose/Galaktose von 1: 2 wurde gefolgert, dass die Trisaccharid-Struktur Gal-(P-1,6)-Gal-(P- 1,4)-Glc war.
Aus ähnlichen Analysen der anderen Oligosaccharid Konstituenten konnte gefolgert werden, dass das Oligosaccharid die obige allgemeine Formel hat und dass die Galaktose/Galaktose-Bindung diejenige von ss-1,3, ss-1,4 oder ss-1,6 ist, wobei die ss-1,6-Bindung bevorzugt wird. Die entsprechende Galaktose/Glukose-Bindung ist diejenige von ss- 1,3, ss-1,4 oder ss-1,6, wobei die 13-1,4-Bindung bevorzugt ist.
Wie weiter oben dargelegt worden ist, stellen die einzelnen Oligosaccharide alleine schon Bifiduswachstumsfaktoren dar. Aber auch die Mischung der verschiedenen Oligosaccharide wirkt als ausgezeichnetes Medium für das Wachstum von Bifidobakteria.
Die speziellen Vorteile der erfindungsgemäss erhaltenen Oligosaccharide sind die, dass ihre Wirkung auch im lebenden Körper hoch effektiv ist.
Die Wachstums fördernde Wirkung für einzelne Bifidobakteriumspezies ist im erfindungsgemässen Medium nicht sehr unterschiedlich. Die verschiedenen, erfindungsgemässen Medien sind alle wirksam für die einzelnen Spezies, wie zum Beispiel Bifido-Bakterium breve, Bifidobakterium bifidum, Bifidobakterium infantis, Bifidobakterium adolescentis, usw. All diese Spezies von Bifidobakteria halten sich im menschlichen Darm auf.
Die erfindungsgemässe Zusammensetzung kann das Produkt von folgenden Ausgangsstoffen sein:
Hochreine Oligosaccharide, Mischungen, die Oligosaccharide wie Laktose enthalten, laktosehaltige Materialien mit ss-Galaktosidase, pulverförmige oder fermentierte Milch oder ähnliche Nahrungsmittel, Medikamente aus Sekundärprodukten solcher Reaktionen oder spezielle Nahrungsmittel oder Medikamente, denen gereinigte Oligosaccharide zugesetzt worden sind.
Die vorliegende Erfindung wird nun anhand von einigen Beispielen näher erläutert. Das Bifidobakterium wird darin immer mit B bezeichnet.
Beispiel 1
3,6 kg Laktose wurden in ungefähr 61 warmem Wasser aufgelöst. Zur Lösung wurden 50 ml einer 1 M-Essigsäure Pufferlösung bei pH 4,6 gegeben. Die angesäuerte Lösung wurde mit 100 000 Einheiten ss-Galaktosidase versetzt und dann mit Wasser auf 10 Liter verdünnt. Die Reaktion wurde 5 Stunden lang bei 37 "C gefahren. Die Reaktionslösung wurde anschliessend erhitzt, um die Enzyme zu zerstören.
Das ausgeschiedene Protein wurde abfiltriert und die Lösung vorerst über eine Kolonne mit Anionentauscher und dann über eine Kolonne mit Kationentauscher gegeben. Das Filtrat wurde über Nacht in eine 30 x 30 cm Kolonne mit Aktivkohle gegeben. Die beladene Aktivkohle wurde anschliessend mit 60 1 entionisiertem Wasser gewaschen, wodurch die Monosaccharide eluiert wurden. Die gleiche Kohle wurde anschliessend mit 601 einer 5%gen Äthanol und 601 einer 50%igen Äthanol-Lösung in Wasser behandelt. Das Eluat mit 50% Äthanol wurde auf ungefähr 7 1 eingedickt, durch eine keimfreie Membrane filtriert (Porengrösse 0,2 pLm) und nochmals über lonentauscherkolonne gegeben.
Erhalten wurde eine durchscheinende Saccharid-Lösung.
Die Lösung wurde im Vakuum bis zu einer hohen Viskosität eingedampft. Erhalten wurden 2,5 I. Lösung, welche noch einmal durch das Membranfilter gegeben wurden. Das Filtrat wurde gefriergetrocknet und man erhielt so das weisse Oligosaccharidpulver. Dies wird im folgenden mit TOS bezeichnet.
Beispiel 2
6 erwachsenen, keimfreien weiblichen Fischer-Ratten wurden 10 verschiedene Bakteria, inkl. Bifidobakterium breve, aus Humanfaeces eingegeben. Die Bakterien wurden im Darm der Tiere fixiert. Nun wurden den Tieren nacheinander die folgenden verschiedenen Lösungen eingegeben: a) eine 3%ige, wässrige Lösung von Lakturose, b) eine 3%ige, wässrige Lösung von TOS aus dem Beispiel 1 und c) eine 3%ige, wässrige Lösung von Laktose.
Diese Lösungen wurden jeweils eine Woche lang verabreicht und zwar wurde täglich 0,6 g Feststoff pro Tag eingegeben. Zwischen den verschiedenen Lösungen wurde jeweils eine Woche lang nur Wasser verabreicht. In diesen Intervallen wurden in den Faeces der Tiere die Anzahl der lebenden Bifidobakterium breve Bakterien bestimmt. Die Resultate sind in der Fig. 3 zusammengestellt.
Aus den Angaben in Fig. 3 folgt, dass die Anzahl der Bifidobakterium breve durch die Eingabe von TOS ungefähr um den Faktor 10 erhöht wird. Durch Eingabe von Laktose steigt diese Zahl nur geringfügig an. Keine Änderung wird erhalten, wenn Lakturose verfüttert wird.
Beispiel 3
Das folgende Experiment wurde mit 6 erwachsenen, männlichen Fischer-Ratten durchgeführt. Die verwendeten Bifidobakteria waren Bifidobakterium breve oder Bifodobakterium infantis. Diese Bakterien wurden erhalten, indem entsprechende Bakterien aus einer 48 Stunden-Kultur in VL-G Medium nach Zentrifugieren in eine Milchkulturmedium gegeben wurden. Verabreicht wurde das zuletztgenannte Medium. Es wurden täglich 2 x 108 Bakterien verabreicht und 20 ml einer 5%gen, wässrigen Lösung von TOS.
Die verschiedenen Untersuchungen waren die folgenden: a) Den Ratten wurde nur Bakterienlösung verabreicht und zwar nur einen Tag lang.
b) Den Ratten wurden täglich und zwar jeden Tag in der zweiten Woche nur Bakterienlösung verabreicht.
c) Bakterienlösung und TOS wurden täglich und zwar nur in der dritten Woche verabreicht.
d) In der vierten Woche wurde dann nur TOS verabreicht.
In den Faeces der Tiere wurden wiederum die Anzahl lebender Bakterien und zwar der verabreichten Art der Bakterien - bestimmt. Die Fig. 4 zeigt die Resultate der genannten Bestimmungen.
Aus den Angaben in der genannten Figur folgt, dass die Anzahl der Bifidusbakteriaim Darm durch die parallele Verabreichung von bakterieller Lösung und TOS erhöht wird. Ebenso folgt aus den genannten Angaben, dass die Anzahl der Bakterien ungefähr gleich gehalten werden kann, nach Unterbrechung der Verabreichung von bakterieller Lösung.
Beispiel 4
Das folgende Experiment wurde mit 5 gesunden erwachsenen Männern durchgeführt. Die verabreichte Lösung von Bakterien enthielt Bifidobakterium breve. Diese Bakterien wurden auf die gleiche Art und Weise erhalten, wie dies im Beispiel 3 beschrieben ist.
Ablauf des Experimentes: Erste Woche
Verabreichung nur der Lösung mit Bakterien Zweite Woche
Verabreichung von Bakterienlösung und TOS (3 g pro
Tag) Dritte Woche
Verabreichung von Bakterienlösung und TOS (10 g pro
Tag) Anzahl der täglich verabreichten Bakterien:
109
Das TOS wurde in lauwarmem Wasser aufgelöst verabreicht; es wurde nach den Mahlzeiten eingenommen.
Gemessen wurden die Anzahl der Bifidobakterium breve-Bakterien in den Exkrementen der Männer, immer an den dritten, fünften und siebten Tagen der angegebenen Wochen. Aus den Werten wurden jeweils Wochenmittelwerte berechnet.
Die Resultate der Untersuchungen sind in der Fig. 5 zusammengestellt. Auch aus diesen Angaben folgt, dass die Anzahl der Bifidobakterien durch die Verabreichung von TOS auffallend erhöht wird.
Beispiel 5
Das folgende Experiment wurde mit 5 gesunden, erwachsenen Männern durchgeführt: Experimentfolge: Erste Woche keine TOS-Verabreichung Zweite Woche Verabreichung von 3 g TOS pro Tag Dritte Woche Verabreichung von 10 g TOS pro Tag
Verabreichungsart der TOS: gleich wie im Beispiel 4.
Gemessen wurde die Gesamtzahl an Bifidobakteria in den Exkrementen der Männer. Die Resultate sind in der Fig. 6 zusammengestellt. Aus den Angaben der genannten Figur folgt, dass die Anzahl der Bifidobakteria, die im menschlichem Darm fixiert ist, durch die Verabreichung von TOS erhöht wird.
Beispiel 6
Zu 1000 1 teilentrahmter Milch wurden 10 Millionen Einheiten ss-Galaktosidase von Aspergillus Oryzae gegeben. Die Mischung wurde nun 2 Stunden lang auf 40 "C gehalten und dann zur Inaktivierung der Enzyme und zur Sterilisation erhitzt. Das erhaltene Produkt wurde in einen Kultivierungstank gegeben und mit Bifidobakteria inokuliert. Kultiviert wurde 24 Stunden lang bei 37 "C. Zur Mischung wurden nun Süssstoffe gegeben. Die Mischung wurde dann homogenisiert und man erhielt so eine fermentierte Milch, die sowohl Oligosaccharide wie auch Bifidobakteria enthielt.
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PATENT CLAIMS
1. The growth of Bifidobacteria agent, containing oligosaccharides of the formula Gal- (Gal) Glk, in which Gal stands for a galactose residue, Glk for a glucose residue and n for an integer from 1 to 4.
2. A process for the preparation of an agent according to claim 1, characterized in that lactose or a substrate containing lactose is treated with ss-galactosidase from Aspergillus oryzae.
This invention relates to an agent promoting the growth of bifidobacteria and to a method for the production thereof.
Some substances have been proposed that promote the growth of bifidobacteria. In the following, this property is referred to as the bifid propagation factor. Various methods have also been proposed to produce such substrates. Some of these substrates contain milk in powder form. Examples of such substrates and / or processes are contained in the following published Japanese patents: Nos. 32 908/66, 6510/70, 6865/70, 21 606/70, 40 956/74 and 40 957/74. However, most of these known bifid propagation factors have only been detected in cultures outside the living body. Their activity in the living body is therefore questionable and also mostly inadequate.
Bifidobacteria are useful bacteria that reside in the human gut. Its physiological importance is well known. It is therefore clear that attempts have been made to increase the proportion of these bacteria among the other bacteria in the intestine. This is especially true for artificially fed children. In addition to the cases in which the bifidus multiplication factor is to be increased outside the body, for example in foods, it is therefore useful to increase the same factor within the living body. There is therefore a demand for such factors, which are above all improved from the known media compared to the known media.
The aim of the present invention is to provide bifid propagation factors which are also highly active in the living body and therefore meet the above-mentioned claims.
The aim is achieved by the agent according to the invention which promotes the growth of bifidobacteria according to the preceding patent claim 1.
The present invention also relates to a method for producing an agent according to the invention.
The attached Figures 1 to 6 are briefly discussed below.
1 shows a graphical representation of the relationships between the saccharide yields and the reaction time in the treatment of lactose with ss-galactosidase.
Fig. 2 shows the result of the gel filtration test by oligosaccharide.
3 shows the result of the investigation according to Example 2.
4 shows the result of the investigation according to Example 3.
5 shows the result of the investigation according to Example 4.
6 shows the result of the investigation according to Example 5.
Most of the above-mentioned oligosaccharides, which form the active constituents of the agent according to the invention, were discovered by the inventors in studies of transfer reactions with hydrolysis reactions between lactose and ss-galactosidase. Much has been published about this work since Wallenfels described the first of the above transfer reactions in 1951.
The transferred oligosaccharides that can be isolated by this are the following disaccharides: Gal- (ss-1,2) -Glc, Gal- (ss-1,3) -Glc, Gal- (ss-1,6) -Glc , Gal- (ss-1,3) -Gal and Gal (ss-1,6) -Gal; the following trisaccharides are also included: Gal- (ss-1,6) -Gal- (ss-1,4) -Glc and Gal- (ss-1,6) -Gal- (p-1,6) -Glc . The types of galactoside bond are indicated in parentheses in the above formulas. The presence of tetrasaccharides in the products of the above transfer reactions was confirmed by Huber et al. However, the structure of the compounds mentioned has not yet been clarified. The production of polysaccharides comprising pentasaccharides has also not been published.
However, all of the publications mentioned relate to the elucidation of the transfer mechanism and to structural studies of the oligosaccharides obtained. No publication deals with the relationship between the transferred oligosaccharides and the growth of bifidobacteria.
The oligosaccharide which represents the bifidus multiplication factor according to the invention and has the above-mentioned formula is simply referred to below as oligosaccharide. It is obtained by treating lactose with ss-galactosidase from Aspergillus oryzae. After this treatment, the reaction mixture contains unreacted lactose, as well as galactose and glucose, all of which are formed by hydrolysis. Therefore, in order to obtain a product with a high bifidus growth factor, it is necessary to increase the oligosaccharide concentration. This is achieved according to known process steps. However, the same concentration can be optimally obtained by selecting favorable enzyme treatment conditions or by combining the two methods.
The following procedure can be used to produce the bifidus growth factor according to the invention:
Commercially available lactose can be used as it is for treatment with ss-galactosidase; there is no need to specifically refine the raw material. Whole or partially skimmed milk containing lactose can also be used as a raw material.
The enzyme treatment is best done with a substrate concentration of 10 to 50%, at a pH of 3 to 8, at an enzyme concentration of 1 to 100 units and at a temperature of 20 to 50 "C.
The reaction time has a pronounced influence on the oligosaccharide yield. As shown in FIG. 1, there is a complex relationship between the reaction time and the amount of products obtained. Thus the amounts of glucose, galactose and oligosaccharides obtained increase fairly linearly with time at the beginning of the reaction. However, the increase then decreases and the curves flatten out. In the case of oligosaccharide in particular, however, the initial concentration decreases again after a certain time. The time at which the oligosaccharide concentration is highest can depend on various factors. It is best determined experimentally. The yield of oligosaccharides is then highest at this time.
The oligosaccharides present in the reaction mixture can now, for example, have a thin-layer chroma
topography can be separated from the other reaction products and examined for their structure using the Anthron method.
The enzyme reaction can be stopped by heating the reaction mixture to a temperature of over 90 ° C. for 5 to 10 minutes.
The reaction mixture obtained after the enzyme treatment can either be used as such as a bifidus growth factor or it can be used in various other compositions, for example milk products. The reaction product can also be separated into the various individual products, it can be concentrated or it can be converted into a dry powder.
The purification of the oligosaccharides can be achieved using various methods: The medium can be pre-concentrated using ion exchange resin and then cleaned using activated carbon. The oligosaccharides are adsorbed on the activated carbon and can then be eluted with a water / alcohol mixture. It is also possible,
Inoculate reaction mixtures after the enzyme reaction with mono and disaccharide fermentable microorganisms so as to consume them.
This facilitates the isolation of oligosaccharides.
An analytical investigation of oligosaccharides which are contained in the composition according to the invention according to Example 1 is described below.
The analysis is carried out under standard conditions.
a) Molecular weight distribution
Fig. 2 shows the result of gel filtration on Bio-Gel P 2. The peaks A, B and C correspond to tri-, tetra- and pentasaccharides. The composition of the reaction mixture with respect to oligosaccharides is calculated according to the areas corresponding to the peaks. It is approximately 55% trisaccharides, approximately 32% tetrasaccharides and approximately 13% pentasaccharides and higher saccharides.
b) Saccharide composition
Lactose, oligosaccharides (not separated into individual components) and tri- or tetrasaccharides of the oligosaccharides were each 4 hours in a 0.5 N HC1 solution at 100 chydrolysed.
The same starting product was hydrolyzed with ss-galactosidase at 50 C for 4 hours. The molar ratios of the saccharides obtained for the two cases are summarized in Table 1. The data in the table mentioned show that the molar ratios of glucose / galactose for tri-, tetra- and pentasaccharides of the oligosaccharides are 1: 2, 1: 3 and 1: 4, respectively.
Table 1
Galactose / glucose
Acid decomposition by hydrolysis enzymes Lactose 0.98 0.98 Oligosaccharide 2.44 2.42 Trisaccharide 1.94 1.92 Tetrasaccharide 2.88 2.84 Pentasaccharide 3.82 3.80 c) Types of binding of the polisaccharides
The presence of lactose and Gal (p-1,6) -Gal was clearly confirmed in the product obtained from the partial acid hydrolysis of the main components of trisaccharides. Glucose and galactose were also detected. Incidentally, the components were separated by means of activated carbon chromatography. From this result and from the glucose / galactose ratio of 1: 2, it was concluded that the trisaccharide structure was Gal- (P-1,6) -Gal- (P-1,4) -Glc.
From similar analyzes of the other oligosaccharide constituents, it could be concluded that the oligosaccharide has the general formula above and that the galactose / galactose bond is that of ss-1,3, ss-1,4 or ss-1,6, the ss-1,6 bond is preferred. The corresponding galactose / glucose bond is that of ss-1,3, ss-1,4 or ss-1,6, with the 13-1,4 bond being preferred.
As explained above, the individual oligosaccharides alone are bifid growth factors. But the mixture of the different oligosaccharides also acts as an excellent medium for the growth of bifidobacteria.
The special advantages of the oligosaccharides obtained according to the invention are that their action is highly effective even in the living body.
The growth-promoting effect for individual bifidobacterium species is not very different in the medium according to the invention. The various media according to the invention are all effective for the individual species, such as, for example, bifido bacterium breve, bifidobacterium bifidum, bifidobacterium infantis, bifidobacterium adolescentis, etc. All of these species of bifidobacteria reside in the human intestine.
The composition according to the invention can be the product of the following starting materials:
High-purity oligosaccharides, mixtures containing oligosaccharides such as lactose, lactose-containing materials with ss-galactosidase, powdered or fermented milk or similar foods, drugs from secondary products of such reactions or special foods or drugs to which purified oligosaccharides have been added.
The present invention will now be explained in more detail with the aid of a few examples. The bifidobacterium is always referred to as B.
example 1
3.6 kg of lactose was dissolved in approximately 61 warm water. 50 ml of a 1 M acetic acid buffer solution at pH 4.6 were added to the solution. The acidified solution was mixed with 100,000 units of ss-galactosidase and then diluted to 10 liters with water. The reaction was run for 5 hours at 37 ° C. The reaction solution was then heated in order to destroy the enzymes.
The excreted protein was filtered off and the solution was first passed through a column with an anion exchanger and then through a column with a cation exchanger. The filtrate was placed in a 30 x 30 cm column with activated carbon overnight. The loaded activated carbon was then washed with 60 l of deionized water, whereby the monosaccharides were eluted. The same coal was then treated with 601 of a 5% ethanol and 601 of a 50% ethanol solution in water. The eluate with 50% ethanol was thickened to approximately 7 l, filtered through a germ-free membrane (pore size 0.2 pLm) and again passed through an ion exchange column.
A translucent saccharide solution was obtained.
The solution was evaporated in vacuo to a high viscosity. 2.5 I. solution were obtained, which were passed through the membrane filter again. The filtrate was freeze-dried to give the white oligosaccharide powder. This is referred to below as TOS.
Example 2
6 different, germ-free female Fischer rats were given 10 different bacteria, including Bifidobacterium breve, from human faeces. The bacteria were fixed in the intestine of the animals. The animals were then given the following different solutions one after the other: a) a 3% aqueous solution of lactose, b) a 3% aqueous solution of TOS from Example 1 and c) a 3% aqueous solution of lactose .
These solutions were administered for one week at a time, 0.6 g of solid per day being entered. Only water was administered between the different solutions for a week at a time. At these intervals, the number of living Bifidobacterium breve bacteria was determined in the faeces of the animals. The results are summarized in FIG. 3.
It follows from the information in FIG. 3 that the number of Bifidobacterium breve is increased by a factor of approximately 10 by entering TOS. Entering lactose increases this number only slightly. No change is obtained when lactose is fed.
Example 3
The following experiment was carried out on 6 adult male Fischer rats. The Bifidobacteria used were Bifidobacterium breve or Bifodobacterium infantis. These bacteria were obtained by placing corresponding bacteria from a 48 hour culture in VL-G medium after centrifugation into a milk culture medium. The latter medium was administered. 2 x 108 bacteria were administered daily and 20 ml of a 5% aqueous solution of TOS.
The various studies were as follows: a) The rats were given only bacterial solution and only for one day.
b) The rats were given only bacterial solution daily, every day for the second week.
c) Bacterial solution and TOS were administered daily only in the third week.
d) In the fourth week only TOS was administered.
In the faeces of the animals, the number of living bacteria, namely the type of bacteria administered, was again determined. 4 shows the results of the determinations mentioned.
It follows from the information in the figure mentioned that the number of bifidus bacteria in the intestine is increased by the parallel administration of bacterial solution and TOS. It also follows from the information given that the number of bacteria can be kept approximately the same after the administration of bacterial solution has been interrupted.
Example 4
The following experiment was carried out on 5 healthy adult males. The solution of bacteria administered contained Bifidobacterium breve. These bacteria were obtained in the same manner as described in Example 3.
Course of the experiment: First week
Administration of the solution with bacteria only Second week
Administration of bacterial solution and TOS (3 g per
Day) Third week
Administration of bacterial solution and TOS (10 g per
Day) Number of bacteria administered daily:
109
The TOS was administered dissolved in lukewarm water; it was taken after meals.
The number of Bifidobacterium breve bacteria in the male excrement was measured, always on the third, fifth and seventh days of the specified weeks. Weekly mean values were calculated from the values.
The results of the investigations are summarized in FIG. 5. It also follows from this information that the number of bifidobacteria is remarkably increased by the administration of TOS.
Example 5
The following experiment was carried out with 5 healthy adult males: Sequence of experiments: First week no TOS administration Second week administration of 3 g TOS per day Third week administration of 10 g TOS per day
Method of administration of TOS: same as in example 4.
The total number of bifidobacteria in male excrement was measured. The results are summarized in FIG. 6. From the information in the figure mentioned it follows that the number of bifidobacteria fixed in the human intestine is increased by the administration of TOS.
Example 6
10 million units of Aspergillus Oryzae ss-galactosidase were added to 1000 liters of partially skimmed milk. The mixture was then kept at 40 ° C. for 2 hours and then heated to inactivate the enzymes and sterilize it. The product obtained was placed in a cultivation tank and inoculated with bifidobacteria. Cultivation was carried out at 37 ° C. for 24 hours. Sweeteners were now added to the mixture. The mixture was then homogenized to give a fermented milk containing both oligosaccharides and bifidobacteria.