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Gebiet der Erfindung
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Diese
Erfindung ist auf Verfahren zur Herstellung von 2'-O-Alkylguanosin
und 2'-O-Alkylguanosinanaloga,
von Phosphoramiditen dieser Verbindungen und Verfahren zu ihrer
Verwendung gerichtet.
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Hintergrund der Erfindung
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Eine
Anzahl von Oligonucleotidanaloga sind hergestellt worden. Eine Klasse
von Oligonucleotiden, die synthetisiert worden sind, sind die 2'-O-substituierten
Oligonucleotide. Diese Oligonucleotide weisen bestimmte einmalige
und nützliche
Eigenschaften auf. In der US-Patentanmeldung Nr. 814,961, erteilt
am 24. Dezember, 1991, mit dem Titel Gapped 2' Modified Phosphorothioate Oligonucleotides, übertragen
an denselben Rechtsnachfolger wie diese Anmeldung, europäisches Äquivalent
veröffentlicht
als
EP061895A ,
werden 2'-substituierte
Nucleotide in ein Oligonucleotid eingeführt, um erhöhtes Binden des Oligonucleotids
an einen komplementären
Zielstrang zu induzieren, während
die Expression der RNase-H-Aktivität ermöglicht wird, um den Zielstrang
zu zerstören.
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In
einem jüngsten
Artikel, Sproat, B. S., Beijer, B. und Iribarren, A., Nucleic Acids
Research, 1990, 18: 41, beachteten die Autoren außerdem die Verwendung
von 2'-O-Methyl-substituierten
Oligonucleotiden als „wertvolle
Antisenseproben zur Untersuchung des Vor-mRNA-Splicens und der Struktur von
Spliceosomen".
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2'-O-Methyl- und -ethylnucleotide
und Verfahren zu ihrer Herstellung sind von einer Vielzahl von Autoren
berichtet worden.
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Robins,
M. J., Naik, S. R. und Lee, A. S. K., J. Org. Chem., 39: 1891 (1974)
berichteten von einer Synthese mit geringer Ausbeute von 2'-O- und 3'-O-Methylguanosin über eine
Zinn(II)-chlorid-katalysierte Monomethylierung durch Diazomethan.
Wie später
von Robins, M. J., Hansske, F. und Bernier, S. E., Can. J. Chem.,
59: 3360 (1981) berichtet wurde, „sind geeignete und Hochleistungsverfahren
für die Synthese
der 2'-O- und 3'-O-Methylether von
Adenosin, Cytidin und Uridin erfunden worden... Jedoch stellte Guanosin
signifikante Schwierigkeiten dar".
In dem vorhergehenden Dokument berichteten die Autoren über eine
verbesserte Synthese von 2'-O-
und 3'-O-Methylguanosin. Die
Synthese wurde durch Ausführen
der Zinn(II)-chloridkatalysierten Diazomethanmethylierung von 2,6-Diamino-9-(β-D-ribofuranosyl)purin(2-aminoadenosin)
anstelle von Guanosin verbessert. Die Diaminopurineinheit wurde
dann zu der entsprechenden Guanineinheit mit Adenosindeaminase reduziert.
Es wurde berichtet, daß in
einer weiteren Diazotierungsreaktion, beschrieben von Singer und
Kusmierek, Biochemistry 15: 5052 (1976), ein Gemisch aus 2'- und 3'-O-Ethylguanosin aus
der Behandlung von Guanosin mit Diazoethan resultiert. Die Alkylierung
führte
ebenso zur Alkylierung der heterocyclischen Base. Das alkylierte
Produkt wurde mit einer Base behandelt, um die Ethylgruppe von der
heterocyclischen Base zu entfernen. Das resultierende Produkt wurde
aufgrund desselben UV-Spektrums
wie das von Guanosin, bei dem sich aber Rf von dem Rf von Guanosin
unterschied, identifiziert.
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Eine
weitere Verbesserung in der Synthese von 2'-O-Methylnucleosiden wurde von Inoue,
H., Hayase, Y. Imura, A., Iwai, S., Miura, K. und Ohtsuka, E., Nucleic
Acids Research, 15: 6131 (1987) berichtet. Dieses Syntheseverfahren
wurde unter Verwendung von CH3I in Gegenwart
von Ag2O ausgeführt. Dieses Verfahren erwies
sich für
alle der bekannten Nucleotide mit Ausnahme von Guanosin als nüztlich. Wie
durch diese Autoren berichtet, erwies sich Guanosin für dieses
Syntheseverfahren als widerstandsfähig. Daher müssen die
Autoren erneut die 2'-O-Methylierung
von Guanosin mit Diazomethan ausführen. Um die Methylierung der
Aminofunktionalität
der Guanin-Grundeinheit zu vermeiden, wurde die Guanin-Grundeinheit
mit einer Isobutyrylgruppe blockiert. Um außerdem die Methylveresterung
der 3'-O-Funktionalität der Zuckereinheit
zu vermeiden wurde eine TIPDS- Blockiergruppe
(Tetraisopropyldisiloxan-Blockiergruppe) verwendet, um sowohl 3'- als auch die 5'-Hydroxyle der Zuckereinheit zu blockieren.
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Sproat
et al., supra und Sproat, B. S., Iribarren, A. M., Garcia, R. G.
and Beijer, B., Nucleic Acids Research, 19: 733 (1991) sprachen
die Synthese von 2'-O-Methylguanosin (und
2'-O-Allylguanosin)
an. In beiden von diesen Veröffentlichungen
von Sproat et al. stellen die Forscher einen weiteren synthetischen Weg
für 2'-O-Methylguanosin
und 2'-O-Allylguanosin dar.
Sie charakterisierten den weiteren Weg in bezug auf die vorher bekannten
Syntheseverfahren als „Vermeidungen...
der Verwendung des stark toxischen und möglicherweise explosiven Reagens
Diazomethan" und
sind „weit
besser als die Verwendung von Silberoxid/Methyliodid". Dasselbe Syntheseverfahren
von Sproat und anderen Forschern wurde ebenso in B. S. Sproat und
A. I. Lamond, „2'-O-Methyloligoribonucleotides:
synthesis and applications", Oligonucleotides
and Analogues, Hrsg. F. Eckstein, (IRL Press, 1991), die die Synthesen
von 2'-O-Methylribonucleosid-3'-O-phosphoramiditen
beschreiben, veröffentlicht.
Die hierin beschriebene Uridinphosphoramiditsynthese erfordert sowohl
Basen- als auch Zuckerschutz des Ausgangsnucleosids vor der Alkylierung.
Nachdem die Basen- und Zuckerschutzgruppen an dem Uridin an der
entsprechenden Stelle sind, wird es alkyliert. Nach der Alkylierung
wird die Basenschutzgruppe entfernt, gefolgt von 5'-O-Dimethoxytritylierung
und Phosphitylierung. Die Cytidinphosphoramiditsynthese, beschrieben
von Sproat and Lamond, nutzt (und erfordert daher) das Basen- und
Zucker-blockierte 2'-O-Methyluridinanalogon. Dieses
Analogon wird dann zu einem blockierten Cytidinanalogon umgewandelt,
die Blockiergruppe wird von dem Zucker entfernt, das Analogon wird
dimethoxytrityliert und schließlich
phosphityliert. Die Guanosinphosphoramiditsynthese, gelehrt von
Sproat and Lamond, geht von einem 2-Amino-6-chlornucleosid mit blockierten
3'- und 5'-Zuckerhydroxygruppen aus. Dieses Nucleosid
wird zu einem 2,6-Dichlorderivat umgewandelt. Die Dichlorverbindung
wird dann 2'-O-alkyliert.
Nach der O-Alkylierung wird die Dichlorverbindung zu einem Diazidozwischenprodukt umgewandelt.
Das Diazidozwischenprodukt wird wiederum zu einem Diaminozwischenprodukt
umgewandelt. Das Diaminozwischenprodukt wird dann zu dem Guanosinanalogon
deaminiert. Die 2-Aminogruppe des Guanosinanalogons wird nach der
Dimethoxytritylie rung und schließlich Phosphitylierung blockiert.
Diese Guanosinverfahrensweise wird ebenso in Sproat, et. al., Nucleic
Acids Research, 1991 19: 733 veröffentlicht.
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Die
obigen Syntheseverfahren umfassen mehrere Schritte und zahlreiche
Reagensbehandlungen – 9
unterschiedliche Reagensbehandlungen für Uridin, 10 für Cytidin
und 12 für
Guanosin. Für
die Cytidin- und Guanosinverbindungen ist mindestens eines der Reagenzien,
das erforderlich ist, nicht ohne weiteres verfügbar und ist daher ein sehr
teures Reagens.
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Andere
Gruppen lehrten die Herstellung von anderen 2'-O-alkylierten Nucleosiden. 2'-O-Methylthiomethylguanosin
wurde von Hansske, F., Madej, D. und Robins, M. J., Tetrahedron,
40: 125 (1984) berichtet. Es wurde als ein Nebenprodukt eines Oxidationsschrittes
während
der Umwandlung von Guanosin zu 9-β-D-arabinofuranosylguanin,
d. h. das Arabinoanalogon von Guanosin, hergestellt. Die Zugabe
der 2'-O-Methylthiomethyleinheit
ist ein Artefakt aus dem DMSO-Lösungsmittel,
das während des
Oxidationsverfahrens verwendet wird. Das 2'-O-Methylthiomethylderivat von 2,6-Diaminopurinribosid
wurde ebenso in der Veröffentlichung
von Hansske et al. berichtet. Es wurde ebenso als ein Artefakt aus
dem DSMO-Lösungsmittel
erhalten.
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Außerdem offenbaren
Gladkaya, et al., Khim. Prir. Soedin., 1989, 4, 568 N1-Methyl-2'-O-(tetrahydropyran-2-yl) und 2'-O-Methylguanosin.
Sproat, et al., Nucleic Acids Research, 1991, 19, 733 lehren die
Herstellung von 2'-O-Allylguanosin.
Die Allylierung von Guanosin erfordert einen weiteren Syntheseweg.
Iribarren, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1990, 87, 7747 untersuchten
ebenso 2'-O-Allyloligoribonucleotide.
Iribarren, et al. führten
2'-O-Methyl-, 2'-O-Allyl- und 2'-O-Dimethylallyl-substituierte
Nucleotide in Oligoribonucleotide ein, um die Wirkung dieser RNA-Analoga
auf die Antisenseanalyse zu untersuchen. Iribarren fand heraus,
daß 2'-O-Allyl-enthaltende
Oligoribonucleotide gegen die Digestion durch entweder RNA- oder
DNA-spezifische Nukleasen resistent sind und etwas resistenter gegen
Nukleasen mit doppelter RNA/DNA-Spezifizität als 2'-O-Methyloligoribonucleotide sind. Jedoch
fand Iribarren heraus, daß 2'-O-Dimethylallyl-enthaltende
Oligoribonucleotide verringerte Hybridisierung an komplementäre RNA-Sequenzen
im Vergleich zu 2'-O-Methyloligoribo nucleotiden
aufweisen. Daher schlug Iribarren vor, daß weitere Versuche, alkylierte
RNA-Proben herzustellen, insbesondere die, die besser als 2'-Allylcytidinenthaltende
Oligoribonucleotide sind, auf 2'-O-Alkylgruppen,
die weniger als fünf
Kohlenstoffatome enthalten, eingeschränkt werden sollten.
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Bestimmte
Oligonucleotide, die 2'-O-Alkyl-substituierte
Nucleotide enthalten, sind vielversprechende Kandidaten zur Verwendung
als humane Pharmazeutika. Die mit langkettigen Alkylgruppen (d. h.
vier oder mehreren Kohlenstoffatomen) sind besonders nützlich.
Beispielsweise können
langkettige Alkylgruppen funktionelle Gruppen in entsprechende Orientierung
mit dem gegenüberliegenden
Strang bei der Stranghybridisierung bringen. Daher sind langkettige
2'-O-Alkylnucleotide,
wie langkettige 2'-O-Alkylguanosinnucleotide,
in einigen Fällen
stark wünschenswert.
Zur Verwendung bei therapeutischen Tests im großen Umfang und eventuell zur
humanen pharmazeutischen Verwendung müssen große Mengen von diesen Oligonucleotiden
synthetisiert werden. Die großen
Mengen an Oligonucleotiden erfordern wiederum große Mengen
an 2'-O-Alkylnucleosidphosphoramiditen,
die beim Synthetisieren der Oligonucleotide verwendet werden. Daher
müssen sowohl
die Kosten als auch die Reinheit der Ausgangsphosphoramidite, die
bei der Synthese von diesen Oligonucleotiden verwendet werden, berücksichtigt
werden. Als allgemeiner Grundsatz gilt, wenn sich die Anzahl an
Syntheseschritten erhöht,
erhöhen sich
die Herstellungskosten. Wenn sich außerdem die Anzahl an Schritten
erhöht,
steigen die Qualitätsprobleme.
Im Hinblick darauf ist es offensichtlich, daß ein großer Bedarf an neuen und verbesserten
Verfahren zur Herstellung von Nucleosiden und Nucleosidphosphoramiditen
besteht.
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Gegenstände der
Erfindung
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Es
ist ein Gegenstand dieser Erfindung, Verfahren zur Synthese von
2'-O-alkyliertem
Guanosin und Guanosinanaloga bereitzustellen.
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Es
ist ein Gegenstand dieser Erfindung, neue und verbesserte Synthesen
von 2'-O-Alkylguanosinphosphoramiditen
bereitzustellen.
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Diese
und andere Gegenstände
werden dem Fachmann aus einer Prüfung
der vorliegenden Beschreibung und der anhängenden Ansprüche offensichtlich.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Diese
Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von 2'-O-alkyliertem Guanosin-3'-O-phosphoramidit,
umfassend die Schritte:
das Alkylieren eines 2,6-Diamino-9-(ribofuranosyl)purins
in Gegenwart eines Metallhydrids unter Bildung eines 2,6-Diamino-9-(2'-O-alkylierten Ribofuranosyl)purins
das
Deaminieren des 2,6-Diamino-9-(2'-O-alkylierten Ribofuranosyl)purins
unter Bildung eines 2'-O-alkylierten
Guanosins;
das Blockieren der 5'-Hydroxyleinheit des 2'-O-alkylierten Guanosins;
und
das Phosphitylieren der 3'-Position des 5'-blockierten 2'-O-alkylierten Guanosins.
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Diese
Erfindung stellt ebenso ein Verfahren zur Herstellung von 2'-O-substituiertem
Guanosin bereit, umfassend:
das Behandeln von 2,6-Diaminopurinribosid
mit einer Base mit einem pKb ≥ pKb von NaH und mit einer Verbindung mit der
Formel R-L, wobei R eine aliphatische oder alicyclische Gruppe ist
und L eine Abgangsgruppe ist, unter Bildung von 2'-O-substituiertem 2,6-Diaminopurinribosid
und 3'-O-substituiertem 2,6-Diaminopurinribosid,
wobei der Substituent die aliphatische oder alicyclische Gruppe
ist;
das Deaminieren des 2'-O-substituierten
2,6-Diaminopurinribosids, um das 2'-O-substituierte Guanosin zu ergeben;
und
das Rückgewinnen
des 2'-O-substituierten
Guanosins.
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Diese
Erfindung stellt außerdem
ein Verfahren zur Herstellung von 2'-O-Alkylguanosin bereit, umfassend:
das
Behandeln von 2,6-Diaminopurinribosid mit einer Base mit einem pKb ≥ pKb von NaH und einer Verbindung der Formel
R-L, wobei R die Alkylgruppe ist und L eine Abgangsgruppe ist, unter
Bildung von 2'-O-Alkyl-2,6-diaminopurinribosid;
das
Behandeln des 2'-O-Alkyl-2,6-diaminopurinribosids
mit Adenosindeaminase; und
das Rückgewinnen des 2'-O-Alkylguanosins.
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Diese
Erfindung stellt ebenso ein Verfahren zur Herstellung eines 3'-O-Phosphoramidits
von 2'-O-Alkylguanosin
bereit, umfassend:
das Behandeln von 2,6-Diaminopurinribosid
mit einer Base mit einem pKb ≥ pKb von NaH und einer Verbindung der Formel
R-L, wobei R die Alkylgruppe ist und L eine Abgangsgruppe ist, unter
Bildung von 2'-O-Alkyl-2,6-diaminopurinribosid;
das
Behandeln des 2'-O-Alkyl-2,6-diaminopurinribosids
mit Adenosindeaminase unter Bildung von 2'-O-Alkyl-guanosin;
das Schützen der
2-NH2-Einheit des 2'-O-Alkyl-guanosins mit einer Schutzgruppe;
das
Schützen
der 5'-OH-Einheit
des 2'-O-Alkyl-guanosins
mit einer weiteren Schutzgruppe;
das Phosphitylieren der 3'-OH-Einheit des geschützten 2'-O-Alkyl-guanosins;
und
das Rückgewinnen
des 3'-O-Phosphoramidits
von 2'-O-Alkylguanosin.
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Abgesehen
von der Herstellung mit Diazomethan hat sich die direkte Alkylierung
von Guanosin bisher als schwierig erwiesen. Die vorliegende Erfindung
stellt die direkte 2'-
und 3'-O-Alkylierung
von 2,6-Diamino-9-(-β-D-ribofuranosyl)purin,
d. h. 2,6-Diaminopurinribosid oder 2-Aminoadenosin, bereit, die mit
anschließender
Deaminierung des 2'-O-alkylierten
2,6-Diaminopurinribosids zu dem entsprechenden 2'-O-alkylierten
Guanosin ausgeführt
werden kann. Diese Alkylierung kann, wenn gewünscht, ohne Verwendung von
Blockiergruppen an weder dem Heterocyclus noch den Zuckereinheiten
des Nucleosids praktiziert werden. Außerdem ist im Gegensatz zur
Verwendung von Diazomethan, das nur das Methylalkylierungsprodukt
ergeben wird, die Alkylierung, wie in dieser Erfindung praktiziert,
nicht nur auf die direkte Methylalkylierung beschränkt, sondern wird
verwendet, um eine Fülle
von Alkylsubstituierten Guanosin- und 2,4-Diaminopurinribosidverbindungen
zu erhalten. Diese in der Erfindung verwendeten notwendigen Verbindungen
mit der Formel R-L, wobei R eine Alkylgruppe ist und L eine Abgangsgruppe ist,
sind entweder kommer ziell erhältlich,
in der Literatur bekannt oder können
durch Verfahrensweisen analog zu den bekannten Literaturverbindungen
hergestellt werden.
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Die
erfindungsgemäßen Zweischritt-Alkylierungsverfahren
unterscheiden sich außerdem
von dem Sechsschritt-Verfahren der Sproat et al. Forscher. Siehe
die oben genannten Veröffentlichungen Nucleic
Acids Research, 18: 41 (1990) und Nucleic Acids Research, 19: 733
(1991). Bei diesen Verfahrensweisen muß 2-Amino-6-chlorpurinribosid zunächst an
sowohl den 3'- als
auch 5'-Positionen
blockiert, zu dem 2,6-Dichlorderivat umgewandelt, an der 6-Purinposition
blockiert, zu dem 2'-O-Methyl- oder
2'-O-Allylderivat
derivatisiert, zu dem 2,6-Diaminoderivat umgewandelt, an den 3'- und 5'-Positionen entblockiert
und schließlich
zu dem 2'-O-Methyl-
oder 2'-O-Allylguanosinprodukt
deaminiert werden.
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Gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren wird
die Alkylierung direkt an 2,6-Diamino-9-(β-D-ribofuranosyl)purin mit einer
geeigneten Verbindung mit der Formel R-L, wobei R eine Alkylgruppe
ist und L eine Abgangsgruppe ist, in Gegenwart einer Base mit einem
pKb ≥ pKb von NaH durchgeführt. Die Alkylierung kann auf
die Monoalkylierung durch Einschränken der Menge von entweder
der R-L-Gruppe oder der Base auf eine stöchiometrische (oder äquivalente)
Menge begrenzt werden. Alternativ kann die Dialkylierung (an sowohl
den 2'- als auch
3'-Positionen) durch
die Verwendung einer überschüssigen R-L-Gruppe
und Base praktiziert werden, um gleichzeitig sowohl die 2'- als auch die 3'-Positionen zu alkylieren.
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Während man
nicht an eine Theorie gebunden sein möchte, ist beobachtet worden,
daß die
Alkylierung an der 2'-Position
im Vergleich zu der 3'-Position
vorherrscht. Im allgemeinen wird ein Verhältnis von etwa 7:3 bis etwa
8:2 der 2'- bis
3'-Alkylierungsprodukte
erhalten (wie durch DC bestimmt). Für sowohl DC als auch die präparative
Chromatographie weißt
das 2'-Produkt im
allgemeinen eine schnellere Rf als das 3'-Produkt auf. Der Vorteil dieses Rf-Unterschiedes
kann genutzt werden, um die 2'-O-
und 3'-O-Produkte
voneinander oder von 2'-O-,
3'-O-dialkylierten
Produkten zu trennen. Daher können
die 2'- und 3'-Alkylierungsprodukte
durch Verfahren, wie Kieselgelchromatographie, wenn gewünscht, getrennt
werden.
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Für die Alkylgruppen,
die im allgemeinen größer als
Propyl sind, kann die Deaminierungsrate des 2'-Produktes gegen das 3'-Produkt zur Trennung der
2'-O- und 3'-O-Produkte genutzt
werden. Daher werden die Gemische aus 2'-O- und 3'-O-alkylierten 2,6-Diamino-9-(β-D-ribofuranosyl)purin
der Deaminierung mit Adenosindeaminase unterzogen werden. Die enzymatische
Deaminierung des 2'-O-Produktes ist
leichter als die Deaminierung des 3'-O-Produktes. Dieser Unterschied in
der Deaminierungsrate ermöglicht
die Trennung des deaminierten 2'-Produktes,
d. h. dem 2'-O-alkylierten
Guanosins, von dem langsameren oder nicht-deaminierten 3'-Produktes, d. h. dem
2,6-Diamino-9-(3'-O-alkylierten-β-D-ribofuranosyl)purins.
Außerdem
sind Verfahren wie die Kristallisation genutzt worden, um weiterhin
ein 2'-Produkt von dem entsprechenden
3'-Produkt durch
Trennen des 2'-O-alkylierten
Diaminopurinribosidproduktes von dem entsprechenden 3'-O-alkylierten Diaminopurinribosidproduktes
zu trennen.
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Eine
bevorzugte Base, die zur Alkylierung genutzt wird, ist Natriumhydrid.
Andere geeignete Basen können
ebenso genutzt werden, jedoch müssen
diese Basen ausreichend Basenstärke
aufweisen, um das Proton von der 2'- (oder 3'-) Hydroxyleinheit des 2,6-Diaminopurinribosidausgangsmaterials zu
entfernen. Während
nicht gewünscht
wird, an eine Theorie gebunden zu sein, kann irgendeine Base mit einem
pKa von etwa 10 pKa-Einheiten
größer als
der pKa des Protons der 2'-Hydroxyleinheit
des 2,6-Diaminopurinribosidausgangsmaterials verwendet werden. Spezieller
können
Basen mit einem pKb größer als pKb von
Natriumhydrid günstig
ausgewählt
werden. Diese Basen können
aus der Zusammenstellung von Basen, wie der, die in Tabelle 1, Seite
220 von March, J. Advanced Organic Chemistry, Wiley-Interscience,
John Wiley & Sons,
New York, 1985 angegeben werden, ausgewählt werden.
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Die
erfindungsgemäßen Alkylierungsreaktionen
werden typischerweise in DMF als das Lösungsmittel durchgeführt. Andere
geeignete Lösungsmittel umfassen
DMSO, N-Methylpyrolidon und Sulfolon.
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Vorzugsweise
wird die Deaminierung durch die Verwendung von Deaminaseenzymen
durchgeführt.
Besonders bevorzugt ist Adenosindeaminase. Besonderes geeignet zur
Verwendung ist Adenosin Deaminase Typ II erhältlich von Sigma Chemical Company,
St. Louis, MO. Andere Deaminierungsreagenzien können ebenso eingesetzt werden.
Die erfindungsgemäßen Deaminierungsreaktionen
werden typischerweise in einem Gemischlösungsmittel, das ein organisches
Lösungsmittel
und einen wässerigen Puffer
enthält,
durchgeführt.
Geeignet zur Verwendung als das organische Lösungsmittel sind DMSO, N-Methylpyrolidon
und Sulfolon. In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden
Erfindung wird die Deaminierung unter Verwendung von DMSO als organisches
Lösungsmittel
erreicht. Geeignet zur Verwendung als wässeriger Puffer sind Puffer
mit einem pH, der zu dem pH-Bereich der Verwendung des Deaminaseenzyms
kompatibel ist. Bevorzugt sind Phosphatpuffer, wie Natriumphosphat
und Trispuffer.
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Um
das 2'-Produkt gegen
3'-Produkt durch Beseitigung
irgendeines 3'-Produktes
anzureichern, wird eine TIPDS-Schutzgruppe (Tetraisopropylsiloxan-Schutzgruppe)
verwendet, um die 3'-
und 5'-Hydroxyleinheiten
der Zuckeranteile des 2,6-Diaminopurinribosids zu schützen. In
derselben Weise würde das
ausschließliche
3'-Produkt durch
die Verwendung einer basenstabilen, nicht-wandernden 2'-O-Schutzgruppe erhältlich sein.
Diese basenstabilen, nicht-wandernden Schutzgruppen umfassen Tetrahydropyranyl
(THP), 4-Methoxytetrahydropyran-4-yl (Mthp), 1-[(2-Chlor-4-methyl)phenyl-4-methoxypiperidin-4-yl
(Ctmp), Triphenylmethyl (trityl), Mono-, Di- und Tri-methoxytrityl und andere ähnliche Schutzgruppen,
sind aber nicht darauf beschränkt.
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Gemäß dieser
Erfindung werden ebenso verbesserte Verfahren zur Herstellung von
2'-O-alkylierten
Guanosinphosphoramiditen bereitgestellt.
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Gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren kann
die Herstellung eines 2'-O-alkylierten Guanosin-3'-O-phosphoramidits
die Schritte des Alkylierens eines 2,6-Diamino-9-(ribofuranosyl)purins
unter Bildung eines 2,6-Diamino-9-(2'-O-alkylierten Ribofuranosyl)purins;
des Deaminierens des 2,6-Diamino-9-(2'-O-alkylierten Ribofuranosyl)purins
unter Bildung eines 2'-O-alkylierten
Guanosins; des Blockierens der 5'-Hydroxyleinheit
des 2'-O-alkylierten
Guanosins; und des Phosphitylierens der 3'-Position
des 5'-blockierten
2'-O-alkylierten
Guanosins umfassen.
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Das
3'-O-Phosphoramidit
von 2'-O-Alkylguanosin
und 2,6-Diamino-9-(2'-O-alkyl-β-D-ribofuranosyl)purin
kann in einigen Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung durch die Umsetzung von 2-NH2,
5'-OH-geschütztem 2'-O-Alkylguanosin
oder 2=NH2, 6-NH2 und
5'-OH-geschütztem 2,6-Diamino-9-(2'-O-alkyl-β-D-ribofuranosyl)purin
mit kommerziell erhältlichen
Reagenzien, die dem Fachmann bekannt sind, wie 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylaminochlorphosphin
bereitgestellt werden.
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2'-O-Alkylguanosin
und 2'-O-Alkyl-2,6-diaminopurinribosid
kann an dem 3'-OH
phosphityliert werden, um Phosphoramidite durch in der Technik bekannte
Verfahren, wie durch den Schutz der NH2-Einheiten
(2- oder 2- bzw. 6-NH2) und 5'-OH-Einheit, gefolgt
von der Reaktion mit Cyanoethyl-N,N-diisopropylaminochlorphosphin
bereitzustellen.
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Die
erfindungsgemäßen Verbindungen,
wie hierin bereitgestellt, können
in Oligomere durch dem Fachmann bekannte Verfahren eingeführt werden.
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Im
Rahmen dieser Erfindung bezieht sich der Ausdruck „Nucleosid" auf einen Zucker
und eine Base, die normalerweise über einen „anomeren" Kohlenstoff an dem Zucker miteinander
verbunden sind. Sowohl α-
als auch β-Zucker
sind in die vorliegende Erfindung einbezogen. In bevorzugten Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung ist der Nucleosidzucker ein Pentofuranosylzucker,
jedoch können
andere Zucker ebenso verwendet werden, wie carbocyclische oder 4'-Deoxy-4'-thiozuckeranaloga.
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Der
Ausdruck „Oligonucleotid" oder „Oligomer", wie hierin verwendet,
bezieht sich auf ein Polynucleotid, das aus natürlich vorkommenden Basen und
Furanosylgruppen gebildet wird, die durch native Phosphodiesterbindungen
verbunden sind. Oligonucleotide werden natürlich mindestens ein 2'-O-Alkylguanosin
oder Derivat davon umfassen. Daher bezieht sich dieser Ausdruck
effektiv auf natürlich
vorkommende Spezies oder synthetische Spezies, die aus natürlich vorkommenden
Untereinheiten oder ihren engen Homologa gebildet werden. Der Ausdruck „Oligonucleotid" oder „Oligomer" kann sich ebenso auf
Einheiten beziehen, die Anteile ähnlich
zu natürlich
vorkommenden Oligonucleotiden aufweisen, die aber nicht-natürlich vorkommende Anteile
aufweisen. Daher können
Oligonucleotide veränderte
Zucker, veränderte
Baseneinheiten oder veränderte
Interzuckerverknüpfungen
aufweisen. Beispiele von diesen sind das Phosphorthioat und andere
Schwefel-enthaltende Spezies, die zur Verwendung in der Technik bekannt
sind.
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Außerdem bezieht
sich, wie in dieser Erfindung verwendet, der Ausdruck „Alkylieren" auf die Addition
einer Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinyleinheit, vorzugsweise eine Alkyleinheit,
zu den Präkursorn
der Nucleosidphosphoramidite der Erfindung. Die Alkylierung der
2'-Position des
Nucleosidzuckers verknüpft
die Alkylierungseinheit der 2'-Position des Zuckers über eine
Etherverknüpfung.
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Bevorzugte
Alkyleinheiten umfassen unsubstituiertes und substituiertes geradkettigetes C1-C20-Alkyl und unsubstituiertes
und substituiertes verzweigtkettiges C1-C20-Alkyl.
Bevorzugte Alkenylgruppen umfassen unsubstituiertes und substituiertes
geradkettiges C2-C20-Alkenyl
und unsubstituiertes und substituiertes geradkettiges C2-C20-Alkenyl. Bevorzugte Alkinylgruppen umfassen
unsubstituiertes und substituiertes geradkettiges C2-C20-Alkinyl und unsubstituiertes und substituiertes
geradkettiges C2-C20-Alkinyl.
Daher umfassen bevorzugte Alkylierungsgruppen gerad- oder verzweigtkettiges C1-C20-Niederalkyl
oder substituiertes Niederalkyl, gerad- oder verzweigtkettiges C2-C20-Niederalkenyl oder
substituiertes Niederalkenyl, gerad- oder verzweigtkettiges C2-C20-Niederalkinyl oder substituiertes Niederalkinyl,
sind aber nicht darauf beschränkt.
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Die
erfindungsgemäßen Alkylgruppen
umfassen gerad- und verzweigtkettige C1-C20-Alkyle, wie
Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Pentyl, Hexyl, Heptyl, Octyl, Nonyl,
Decyl, Undecyl, Dodecyl, Tridecyl, Tetradecyl, Pentadecyl, Hexadecyl,
Octadecyl, Nonadecyl und Eicosyl, Isopropyl, 2-Butyl, Isobutyl,
2-Methylbutyl, Isopentyl, 2-Methyl-pentyl, 3-Methylpentyl, 2-Ethylhexyl
und 2-Propylpentyl, sind aber nicht darauf beschränkt. Alkenylgruppen
umfassen ungesättigte
Einheiten, die aus den obigen Alkylgruppen stammen, sind aber nicht
darauf beschränkt,
einschließlich
Vinyl, Allyl und Crotyl, sind aber nicht darauf beschränkt. Alkinylgruppen
umfassen ungesättigte
Einheiten mit mindestens einer Dreifachbindung, die aus den obigen
Alkylgruppen stammen, einschließlich
Ethinyl und Propargyl, sind aber nicht darauf beschränkt.
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Substituentengruppen
für obige
umfassen Halogen-(Cl, Br, F), Hydroxyl-(OH), Thiol-(SH), Keto-(C=O),
Carboxyl-(COOH), Nitrat-(ONO2), Nitro-(NO2), Nitroso-(NO), Nitril-(CN), Trifluormethyl-(CF3), Trifluormethoxy-(OCF3),
O-Alkyl-, S-Alkyl-, NH-Alkyl-,
N-Dialkyl-, O-Aralkyl-, S-Aralkyl-, NH-Aralkyl-, Amino-(NH2), Azido-(N3), Hydrazino-(NHNH2), Hydroxylamino-(ONH2),
Isocyanato-(OCN), Sulfoxid-(SO), Sulfon-(SO2),
Sulfid-(S-), Disulfid-(S-S), Silyl-, heterocyclische, alicyclische,
carbocyclische, Interkalator-, Reportermolekül-, Konjugat-, Polyamin-, Polyamid-,
Polyethylenglykol-, Polyether-Gruppen, die die pharmakodynamischen
Eigenschaften von Oligonucleotide verbessern, und Gruppen, die die pharmakokinetischen
Eigenschaften von Oligonucleotiden verbessern, sind aber nicht darauf
beschränkt. Diese
Verbindungen umfassen 3-Penten-2-on, 3-Methyl-2-butanol, 2-Cyanooctyl,
3-Methoxy-4-heptanal, 3-Nitrobutyl,
4-Isopropoxydodecyl, 4-Azido-2-nitrodecyl, 5-Mercaptononyl, 4-Amino-1-pentenyl sowie andere
substituierte Gruppen. Diese substituierten Gruppen können in
einer blockierten oder geschützten
Form und später
entblockiert in die substituierte Stammverbindung eingeführt werden.
Beispielsweise wird die Verwendung der Phthalimidogruppe als blockierte
Form einer Aminosubstitution nachstehend dargestellt.
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Andere
geeignete Substituentengruppen umfassen Interkalatoren, Reportergruppen,
Reporterenzyme und Konjugate, einschließlich Cholesterole, Phospholipide,
Biotin, Phenanthrolin, Phenazin, Phenanthridin, Anthrachinon, Acridone,
Pyrene, Stilbene, Oxazolo-pyridocarbazole, Anthrachinone, Phenanthridine,
Phenazine, Azidobenzole, Psoralene, Porphyrine, Cholsäuren, Folsäure, Fluoreszeine, Rhodamine,
Coumarine und Farbstoffe; Steroide, lipophile Moleküle, Peptide,
Protein, Vitamine, RNA-Spaltungskomplexe,
Metallchelatbildner, Alkylatoren und Vernetzungsmittel.
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Eine
besonders bevorzugte Substituentengruppe ist CF3.
Weitere besonders bevorzugte Substituentengruppen sind Phthalimido
und Imidazol. Wie angemerkt, ermöglicht
die Verwendung der Phthalimidogruppe die Einführung einer blockierten Aminofunktionalität an der
Alkylgruppe. Unter Verwendung der Guanosinanaloga, die gemäß dieser Erfindung
als Zwischenprodukte in der Oligonucleotidsynthese hergestellt wurden,
wird, nachdem die Oligonucleotidsynthese beendet ist, die Phthalimi dogruppe
entfernt, was eine Aminofunktionalität ergibt, die an ein Guanosinnucleotid
innerhalb der Oligonucleotidsequenz gebunden wird. Die Verwendung
einer Imidazoleinheit als Substituentengruppe an der Alkylfunktionalität führt die
vorgeschlagene Nucleinsäurespaltungs-Funktionalität, Imidazol,
an dem Guanosinnucleotid innerhalb einer Oligonucleotidsequenz ein.
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Arylgruppen
umfassen Phenyl, Tolyl, Benzyl, Naphthyl, Anthracyl, Phenanthryl,
Pyrenyl und Xylyl, sind aber nicht darauf beschränkt. Halogene umfassen Fluor,
Chlor und Brom. Geeignete heterocyclische Gruppen umfassen Imidazol,
Tetrazol, Triazol, Pyrrolidin, Piperidin, Piperazin und Morpholin,
sind aber nicht darauf beschränkt.
Amine umfassen Amine von allen der obigen Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-
und Arylgruppen, einschließlich
primäre
und sekundäre Amine
und „maskierte
Amine", wie Phthalimid.
Amine sollen ebenso Polyalkylaminoverbindungen und Aminoalkylamine,
wie Aminopropylamin und weitere Heterocyclo-alkylamine, wie Imidazol-1,
2- oder 4-yl-propylamin umfassen. RNA-Spaltungskomplexe können beispielsweise
Interkalatoren oder Gruppen sein, die in der kleinen Furche von
RNA binden. Interkalatoren sind Moleküle, die sich selbst zwischen
benachbarte Basen eines Oligonucleotids schieben. Reportermoleküle sind
Moleküle,
die die Identifikation eines Moleküls entweder optisch oder anderweitig unterstützen. Vernetzungsmittel
verbinden effektiv zwei Gruppen.
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Geeignete
Abgangsgruppen der vorliegenden Erfindung umfassen Halogenide, wie
Chlorid, Bromid und Iodid, Sulfonate, wie Tosyl, Brosyl, Nosyl, Mesyl
und Trifyl, und Oxoniumionen. In bevorzugten Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung ist die Abgangsgruppe ein Halogenid.
Noch andere geeignete Abgangsgruppen sind dem Fachmann allgemein
bekannt.
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Gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren wird
die Alkylierung vorzugsweise in Gegenwart einer Base, vorzugsweise
eines Metallhydrids, wie Natriumhydrid, durchgeführt. Die Alkylierung des 2',3'-O-Dialkylstannylenderivats
von Uridin wird vorzugsweise in Gegenwart eines Salzes, wie ein
Metallhalogenid, durchgeführt.
Cäsiumflourid
und Natriumiodid sind in einigen Ausführungsformen der vorliegenden
Erfindung bevorzugt. Außerdem
ist die 5'-Hydroxylblockiergruppe
vorzugsweise eine Di methoxytrityleinheit. Das Phosphitylierungsreagens
ist vorzugsweise Bis-N,N-diisopropylaminocyanoethylphosphit und
die Phosphitylierungsreaktion wird vorzugsweise in Gegenwart von
N,N-Diisopropylamino-hydrotetrazolid durchgeführt.
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Bei
der Ausführung
der Alkylierung von Guanosin wird 2',6-Diaminopurin beispielsweise durch Verfahren,
die in Attorney Docket No. ISIS-710, eingereicht am 27. Oktober
1992 beschrieben werden, alkyliert. Die verwandte europäische Anmeldung
wird als
EP0651759 veröffentlicht.
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Die
Aminoeinheit der erfindungsgemäßen Phosphoramidite
kann aus verschiedenen Aminen, die derzeit für diese Phosphoramidite verwendet
werden, ausgewählt
werden. Diese Amine umfassen sowohl aliphatische als auch Heteroarylamine,
wie in verschiedenen US-Patenten beschrieben, prinzipiell die von
M. Caruthers und Kollegen. Diese umfassen US-Patente 4,668,777,
erteilt am 26. Mai 1987; 4,458,066, erteilt am 3. Juli 1984; 4,415,732,
erteilt am 15. November 1983; und 4,500,707, erteilt am 19. Februar
1985. Eine bevorzugte Aminogruppe ist Diisopropylamino.
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Zusätzlich zu
der Aminoeinheit des Phosphoramidits wird für Phosphodiester- und Phosphorthioatverknüpfungen
eine zusätzliche
Phosphorblockiergruppe verwendet. Eine bevorzugte Blockiergruppe
ist die Cyanoethylgruppe. Andere Phosphorblockiergruppen umfassen
Methoxy und 2-(Methylsulfonyl)ethyl. Außerdem wird ein Aktivierungsmittel normalerweise
für die
Phosphoramiditverknüpfungschemie
verwendet. Ein bevorzugtes Aktivierungsmittel ist N,N-Diisopropylaminohydrotetrazolid.
Andere geeignete Einheiten für
diese Funktionen werden ebenso in den obengenannten Patenten sowie
in dem US-Patent 4,725,677, erteilt am 16. Feb. 1988, und Berner,
S., Muhlegger, K., und Seliger, N., Nucleic Acids Research 1989,
17: 853; Dahl, B. H., Nielsen, J. und Dahl, O., Nucleic Acids Research
1987, 15: 1729; und Nielson, J. Marugg, J. E., Van Boom, J. H.,
Honnens, J., Taagaard, M. und Dahl, O., J. Chem. Research 1986,
26 offenbart.
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Zur
Verwendung in Phosphorthioatverknüpfung wird das Beaucage-Reagens
in Beaucage, S. L. und Caruthers, M. H., Tetrahedron Letters 1981,
22: 1859 sowie in Zon, G. and Stec, J., Phosphorothioate oligonucleotides:
Oligonucleotides and Ana logs A Practical Approach; Eckstein, F.
Ed.; IRL Press, Oxford, 1991, beschrieben, die ebenso die Schwefelbehandlung
durch elementaren Schwefel beschreiben.
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Beispiele
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Die
folgenden Beispiele stellen die Erfindung dar, sollen sie jedoch
nicht einschränken.
In verschiedenen Beispielen werden die Nomenklatur 4,4'-Dimethoxytriphenylmethyl
und Dimethoxytrityl gegenseitig austauschbar in bezug auf die DMT-Blockiergruppe, die
an der 5'-Hydroxyleinheit
der verschiedenen Nucleoside und Nucleotide der Erfindung positioniert
ist, verwendet.
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NMR-Spektren
wurden mit den folgenden Vorrichtungen erhalten: 1H-NMR:
Varian Gemini-200 (199,975 MHz), 13C-NMR:
Varian Gemini-200 (50,289 MHz). NMR-Spektren wurden unter Verwendung von
entweder Deuteriochloroform (Tetramethylsilan als interner Standard)
oder Dimethylsulfoxid-d6 als Lösungsmittel
aufgezeichnet. Die folgenden Abkürzungen
wurden verwendet, um die Multiplizität der einzelnen Signale zu
bezeichnen: s = Singulett, d = Dublett, t = Triplett, q = Quartett,
ABq = ab-Quartett, m = Multiplett, dd = Dublett von Dubletts, br
s = breites Singulett. Massenspektren wurden auf einer VG 70-SEQ
Vorrichtung (VG Analytical (Fisons)) unter Verwendung von Fast-Atom-Bombardment-Ionisierung
(7 kV Xe Atome) erreicht. Lösungsmittelverhältnisse
für die
Säulenchromatographie
werden als Volumen/Volumen angegeben. Die Eindampfungen von Lösungsmitteln
wurden im Vakuum (60 Torr) bei 30°C durchgeführt, wenn
nicht anders angegeben. Die Schmelzpunkte werden als unkorrigiert
angegeben.
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Beispiel 1
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2,6-Diamino-9-(β-D-ribofuranosyl)purin
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Gemäß den Modifikationen
der Verfahrenweisen, die in Robins, M. J., Hanske, F. und Beriner, S.
E., Can. J. Chem., 59: 3360 (1981) beschrieben werden, wurden Guanosinhydrat
(49 g, Aldrich Chemical Co.), Toluol (200 ml), Hexamethyldisilazan
(160 ml, 4,3 val) und Trifluormethansulfonsäure (3,7 ml) in eine Edelstahl-Parr-Bombe geladen. Die
Bombe wurde verschlossen und ungefähr 1/3 eingetaucht in ein Ölbad bei
170°C für 5 Tage
erhitzt. Die Bombe wurde in einem Trockeneisacetonbad abgekühlt und
geöffnet.
Die Inhalte wurden zu einem 2-Liter-Rundhalskolben unter Verwendung
von Methanol (MeOH) überführt und
das Lösungsmittel
auf einem Buchii-Verdampfer eingedampft. 1:1 H2O/MeOH
(600 ml) wurde zu dem Rest zugegeben und die resultierende braune
Suspension wurde 4 bis 5 h unter Rückfluß erhitzt. Die resultierende
Suspension wurde auf dem Buchii-Verdampfer eingedampft, um Methanol
(≈ 1/2 Volumen)
zu entfernen. Außerdem
wurde H2O (≈ 300 ml) zugegeben und das Gemisch
wurde erhitzt, mit Holzkohle behandelt und durch ein Celite-Filterpad
filtriert. Beim Abkühlen
bildete sich ein kristalliner Feststoff. Der Feststoff wurde durch
Filtration isoliert, mit H2O gewaschen und
unter hohem Vakuum bei 90°C
getrocknet, wodurch das Produkt (43,7 g, 89% Ausbeute) als gelbbrauner
Feststoff erhalten wurde. UV- und NMR-Spektren dieser Verbindung
wurden mit Literaturwerten verglichen.
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Die
Variation der Verfahrensweisen von Robins et al supra beseitigten
die Notwendigkeit, flüssiges
Ammoniak in dem Reaktionsgemisch zu verwenden, da das Ammoniakmolekül in situ
aus dem Silazanreagens und dem Hydratwasser des Guanosinhydratausgangsmaterials
erzeugt wird. Außerdem
war die Verwendung von Chlortrimethylsilan nicht notwendig, noch
war es notwendig, die Reaktion unter wasserfreien Bedingungen durchzuführen, eine
Vorverdampfung durchzuführen
oder die Parr-Bombe unter einer trockenen Stickstoffatmosphäre zu öffnen und
erneut zu verschließen.
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Beispiel 2
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2,6-Diamino-9-(2'-O-propyl-β-D-ribofuranosyl)purin & 2,6-Diamino-9-(3'-O-propyl-β-D-ribofuranosyl)purin
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Natriumhydrid
(NaH) (2,1 g) wurde zu 2,6-Diamino-9-(β-D-ribofuranosyl)purin (10,5
g) in trockenem Dimethylformamid (DMF) (150 ml) zugegeben. Nach
dem Rühren
für 10
min wurde Iodpropan (6 ml) zugegeben. Die Lösung wurde für 45 min
bei Raumtemperatur gerührt,
gefolgt von der Zugabe eines weiteren aliquoten Teils von NaH (600
mg). Das Reaktionsgemisch wurde über
Nacht gerührt
und dann durch die Zugabe von Ethanol (EtOH) (5 ml) gequencht. Das
Reaktionsgemisch wurde im Vakuum eingedampft, der Rest in 10% MeOH/CH2Cl2 suspendiert
und durch Kieselgelchromatographie (300 g) unter Verwendung von
5 → 10%
MeOH/CH2Cl2 als Elutionsmittel
gereinigt. Das 2',3'-Di-O-propyl-Produkt
eluierte zunächst,
gefolgt von dem 2'-O-Propyl-Produkt
und dann dem 3'-O-Propyl-Produkt.
Die 2'-O-Propyl-Produkt-enthaltenden
Fraktionen wurden gesammelt und das Lösungsmittel abgestreift, wodurch
ein roher Schaum erhalten wurde. Der Schaum wurde aus H2O
(40 ml) kristallisiert, mit kaltem H2O gewaschen
und getrocknet, wodurch 2,9 g der 2'-O-Propylverbindung erhalten wurden.
Die Mutterlauge wurde eingedampft, wieder chromatographiert und
kristallisiert, wodurch zusätzliche
2,4 g der 2'-O-Propylverbindung
erhalten wurden. Die zweite Mutterlauge wurde eingedampft, wodurch
4 g eines Gemisches aus 2'-
und 3'-O-Propylverbindungen
als Öl
erhalten wurden. Fraktionen, die das 3'-O-Propylprodukt als Hauptprodukt enthalten,
wurden eingedampft und der Rest aus Wasser kristallisiert. (Siehe Beispiel
17 nachstehend für
die Isolation und Charakterisierung der 2',3'-Di-O-propylverbindung).
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2,6-Diamino-9-(2'-O-Propyl-β-D-ribofuranosyl)purin
-
- 1H NMR (DMSO-d 6) δ 0,76 (t,
3, CH 3),
1,4 (tq, 2, CH 2), 3,3
(m, 1, H-5'' +
HDO), 3,65–3,45
(m, 3, H-5', O-CH 2), 3,9 (m, 1), 4,25 (br m, 1), 4,38 (dd,
1), 5,1 (br d, 1 3'-OH), 5,45 (br t, 1, 5'-OH), 5,75 (br s,
2, 6-NH 2), 5,83
(d, 1, H-1'), 6,77 (br s, 2, 2-NH 2) und 7,95 (s,
1, H-8), Anal. Berechnung für C13H20N6O4·½H2O: C, 46,91; H, 6,2; N, 25,25. Gefunden:
C, 47,09; H, 6,37; N, 25,33.
-
2,6-Diamino-9-(3'-O-propyl-β-D-ribofuranosyl]purin
-
- 1H NMR (DMSO-d 6) δ 0,75 (t,
3, CH 3),
1,4 (tq, 2, CH 2), 3,27–3,5 (ABX
2, O-CH 2-),
3,5 und 3,6 (ABX, 2, H-5'), 3,9 (m, 1), 4,22
(m, 1), 4,35 (m, 1), 5,1 (br d, 1, 2'-OH),
5,45 (br t, 1, 5'-OH), 5,75 (br s, 2, 6-NH 2),
5,8 (d, 1, H-1'), 6,8 (br s, 2CH 2,
2-H 2)
und 7,95 (s, 1, H-8).
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Beispiel 3
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2'-O-Propylguanosin
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Ein
Gemisch aus 2,6-Diamino-9-(2'-O-propyl-β-D-ribofuranosyl)purin
und 2,6-Diamino-9-(3'-O-propyl-β-D-ribofuranosyl)purin
(4,6 g) und Adenosindeaminase (200 mg, Sigma Chemicals Type II)
wurden bei Raumtemperatur über
Nacht in 0,1 M Trispuffer (150 ml, pH 7,4), DMSO (100 ml) und 0,1
M Natriumphosphatpuffer (10 ml) gerührt. Ein weiterer aliquoter
Teil von Adenosindeaminase (140 mg) in 0,1 M Phosphatpuffer (30
ml) und DMSO (20 ml) wurde zugegeben und die Reaktion weitere 24
h gerührt.
Das Lösungsmittel
wurde im Vakuum eingedampft und der Rest auf Kieselgel unter Verwendung von
5 → 20%
MeOH/CH2Cl2 flashchromatographiert. Die
Produkt-enthaltenden Fraktionen wurden im Vakuum eingedampft und
der Rest aus H2O kristallisiert, wodurch
2,6 g des Produktes erhalten wurden. Smp. zers. > 270°C. 1H NMR (DMSO-d 6) δ 0,75
(t, 3, CH 3), 1,42
(tq, 2, CH 2),
3,3–3,6
(m, 4, H-5', O-CH 2), 3,85 (m, 1), 4,2 (m, 1), 4,23 (m, 1),
5,10 (t, 1, 5'-OH), 5,13 (d, 1, 3'-OH), 5,75 (d, 1, H-1'),
6,45 (br s, 2, NH 2),
7,95 (s, 1, H-8) und 10,67
(br s, 1, NH), Anal. Berechnung
für C13H19N5O5: C, 47,99; H, 5,89; N, 21,53, Gefunden: C,
47,90, H, 5,85; N, 21,44.
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Beispiel 4
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N2-Isobutyryl-2'-O-propylguanosin
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2'-O-Propylguanosin
(3,6 g) in Pyridin (50 ml) wurde in einem Eisbad abgekühlt und
Trimethylsilylchlorid (8,4 ml, 6 val) wurde zugegeben. Das Reaktionsgemisch
wurde für
30 min gerührt
und Isobutyrylchlorid (5,8 ml, 5 val) wurde zugegeben. Die Lösung wurde
für 4 Stunden
gerührt,
während
sie sich auf Raumtemperatur erwärmen
konnte. Die Lösung
wurde abgekühlt,
H2O zugegeben (10 ml) und die Lösung wurde
für weitere
30 min gerührt.
Konzentriertes NH4OH (10 ml) wurde zugegeben
und die Lösung im
Vakuum eingedampft. Der Rest wurde durch Kieselgelchromatographie
unter Verwendung von 10% MeOH/CH2Cl2 unter Elution des Produktes gereinigt. Die
Produkt-enthaltenden Fraktionen wurden eingedampft, wodurch 2,5
g des Produktes als Schaum erhalten wurden. Eine analytische Probe
wurde erneut auf Silici umdioxid chromatographiert und mit CH2Cl2 → 6% MeOH/CH2Cl2 eluiert. 1H NMR (DMSO-d 6) δ 0,75
(t, 3, CH 3),
1,13 [d, 6, CH(CH 3)2], 1,4 (m, 2, CH2), 2,75
[m, 1, CH(CH3)2], 3,52 (m, 6, OCH 2), 3,36 und 3,6
(ABX, 2, H-5'), 3,95 (m, 1), 4,26
(m, 1), 4,33 (m, 1), 5,07 (t, 1, 5'-OH),
5,18 (d, 1, 3'-OH), 5,9 (d, 1, H-1'),
8,25 (s, 1, H-8), 11,65 (br
s, 1, NH) und 12,1 (br s, 1,
NH), Anal. Berechnung für C17H25N5O6·1/2
H2O: C, 50,49; H, 6,48; N, 17,32, Gefunden:
C, 50,81; H, 6,62; N, 17,04.
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Beispiel 5
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N2-Isobutyryl-5'-dimethoxytrityl-2'-O-propylguanosin
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N2-Isobutyryl-2'-O-propylguanosin
(2,64 g) wurde mit Pyridin co-eingedampft und dann in Pyridin (180
ml) löslich
gemacht. Dimethoxytritylchlorid (2,4 g, 1,1 val) und Dimethylaminopyridin
(50 mg) wurden unter Rühren
bei Raumtemperatur zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht
gerührt
und im Vakuum eingedampft. Der Rest wurde zwischen CH2Cl2/2 × verd.
Na2CO3 partioniert.
Die organische Phase wurde getrocknet (MgSO4)
und verdampft. Der Rest wurde durch Kieselgelchromatographie gereinigt
(1:1 EtOAc/Hex → 5%
MeOH/EtOAc, 1% TEA), wodurch 4,1 g des Produktes erhalten wurden. 1H NMR (DMSO-d 6) δ 0,78
(t, 3, CH 3),
1,12 [d, 6, CH(CH 3)2], 1,46 (m, 2, CH 2), 2,75 [m, 1, CH(CH3)2], 3,35 und 3,55
(ABX, 2, H-5'), 3,73 (s, 6, OCH 2),
4,0 (m, 1), 4,3 (m, 1), 4,4 (m, 1), 5,18 (d, 1, 3'-OH), 5,93 (d, 1, H-1'), 6,8, 7,2, 7,36
(m, 13, DMTr), 8,13 (s, 1, H-8),
11,63 (br s, 1, NH) und 12,1
(br s, 1, NH), Anal. Berechnung
für C38H42N5O8·H2O: C, 63,83; H, 6,20; N, 9,80, Gefunden:
C, 64,22; H, 6,35; N, 9,55.
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Beispiel 6
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N2-Isobutyryl-5'-dimethoxytrityl-2'-O-propylguanosin-3'-β-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit
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Eine
CH2Cl2-Lösung aus
N2-Isobutyryl-5'-dimethoxytrityl-2'-O-propylguanosin
(4,1 g), Bis-(N,N-diisopropylamino)-2-cyanoethylphosphit (3,7 ml,
2 val) und N,N-Diisopropylammoniumtetrazolid (0,5 g, 0,5 val) wurde
bei Raumtemperatur über Nacht
gerührt.
Die Lösung
wurde erneut zwischen verd. Na2CO3 und dann verd.
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Na2CO3/NaCl partitioniert
und über
MgSO4 getrocknet. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum
eingedampft und der Rest wurde durch Kieselgelchromatographie gereinigt
(120 g, 1% TEA in EtOAc), wodurch 5,2 g des Produktes als Schaum
erhalten wurden. 31P NMR (CDCl3) δ 150,5, 150,8.
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Beispiel 7
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2,6-Diamino-9-(2'-O-pentyl-β-D-ribofuranosyl)purin & 2,6-Diamino-9-(3'-O-pentyl-β-D-ribofuranosyl)purin
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2,6-Diamino-9-(β-D-ribofuranosyl)purin
(10 g) wurde mit Natriumhydrid (1,7 g, 1,2 val) und Brompentan (5,3
ml, 1,2 val) in DMF (90 ml) wie für die Verfahrensweise von Beispiel
2 behandelt. Kieselgelchromatographie ergab drei Komponenten. Die
erste eluierte Komponente (nicht charakterisiert, aber es wird angenommen,
daß es
die 2,3-Di-(O-pentyl)-Verbindung ist) wurde als ein Öl (700 mg)
isoliert. Die nächste
Komponente, isoliert als ein Schaum (3,3 g) wurde aus MeOH kristallisiert,
wodurch 2,8 g 2,6-Diamino-9-(2'-O-pentyl-β-D-ribofuranosyl)purin
erhalten wurde. Die dritte Komponente, isoliert als ein Feststoff
(200 mg), wurde aus MeOH kristallisiert, wodurch 80 mg 2,6-Diamino-9-(3'-O-pentyl-β-D-ribofuranosyl)purin
erhalten wurde. Die Fraktionen, die Gemische aus der ersten und
zweiten Komponente enthalten, wurden eingedampft und der Rest aus MeOH
kristallisiert, wodurch weitere 900 mg der 2-O-Pentylverbindung
erhalten wurden. Eine weitere Fraktion ergab 1,2 g eines Gemisches
aus 2'-O-Pentyl
und 3'-O-Pentylverbindungen.
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2,6-Diamino-9-(2'-O-pentyl-β-D-ribofuranosyl)purin
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- 1H NMR (DMSO-d 6) δ 0,75 (t,
3, CH 3),
1,16 (m, 4, CH 2),
1,39 (m, 2, CH 2),
3,53 (m, 2, CH 2),
3,3 und 3,6 (ABX, 2, H-5'), 3,93 (br s, 1),
4,23 (m, 1), 4,38 (m, 1), 5,1 (d, 1 3'-OH),
5,5 (t, 1, 5'-OH), 5,75 (br s, 2, 6-NH 2), 5,82
(d, 1, H-1'), 6,8 (br s, 2, 2-NH 2) und 7,93 (s,
1, H-8).
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2,6-Diamino-9-(3'-O-pentyl-β-D-ribofuranosyl)purin
-
- 1H NMR (DMSO-d 6) δ 0,87 (t,
3, CH 3),
1,3 (m, 4, CH 2), 1,55
(m, 2, CH 2),
3,5 (m, 2, O-CH 2-),
3,6 (m, 2, H-5'), 3,86 (m, 1), 3,95
(m, 1), 4,6 (m, 1), 5,32 (br d, 1 2'-OH), 5,46
(br t, 1, 5'-OH), 5,70 (d, 1, H-1'),
5,75 (br s, 2, 6-NH 2), 6,76 (br s, 2, 2-NH 2) und 7,93 (s,
1, H-8).
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Beispiel 8
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2'-O-Pentylguanosin
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2,6-Diamino-9-(2'-O-pentyl-β-D-ribofuranosyl)purin
(1,9 g) in 0,1 M Natriumphosphatpuffer (50 ml, pH 6,0) und DMSO
(25 ml) wurde mit Adenosindeaminase (zugegeben in zwei aliquoten
Teilen – erster
aliquoter Teil 50 mg, zweiter aliquoter Teil 80 mg) bei 35°C wie für die Verfahrensweise
von Beispiel 3 behandelt, wodurch 1,4 g des Produktes erhalten wurden. 1H NMR (DMSO-d 6) δ 0,8
(t, 3, CH 3), 1,16
(m, 4, 2 × CH 2),
1,4 (m, 2, CH 2),
3,38, 3,6 (m, 4, OCH 2, H-5'), 3,93 (s, 1, H-4'), 4,28 (m, 2, H-2', H-3'), 5,17 (br, 2,5', 3'-OH), 5,8 (d, 1, H-1'),
6,53 (br s, 2, NH 2),
8,0 (s, 1, H-8) und 10,68 (br,
1, NH).
-
Beispiel 9
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N2-Isobutyryl-2'-O-pentylguanosin
-
2'-O-Pentylguanosin
(2,3 g) in Pyridin (35 ml) wurde mit Trimethylsilylchlorid (4,15
ml, 5 val) und Isobutyrylchlorid (3,4 ml, 5 val) wie für die Verfahrensweise
von Beispiel 4 behandelt, wodurch das Produkt als Schaum (2,3 g)
erhalten wurde. Eine analytische Probe wurde aus EtOAc/Hex kristallisiert. Smp.
178–180°C. 1H NMR (DMSO-d 6) δ 0,75
(t, 3, CH 3),
1,1 [m, 10, 2 × CH 2,
CH(CH 3)2], 1,4 (m, 2, CH 2), 2,74 [m, 1, CH(CH3)2], 3,56 (m, 4,
OCH 2, H-5'), 3,93 (m, 1, H-4'),
4,25 (m, 1), 4,34 (m, 1), 5,05 (t, 1, 5'-OH), 5,17
(d, 1, 3'-OH), 5,88 (d, 1, H-1'),
8,27 (s, 1, H-8), 11,65 (br
s, 1, NH) und 12,05 (br s,
1, NH), Anal. Berechnung für C19H29N5O6: C, 53,89; H, 6,90; N, 16,54, Gefunden:
53,75; H, 6,92; N, 16,40
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Beispiel 10
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N2-Isobutyryl-5'-dimethoxytrityl-2'-O-pentylguanosin
-
N2-Isobutyryl-2'-O-pentylguanosin
(2,3 g) wurde mit Dimethoxytritylchlorid (1,7 g, 1,1 val) und Dimethylaminopyridin
(100 mg als Katalysator) in Pyridin (50 ml) wie für die Verfahrensweise
von Beispiel 5 behandelt, wodurch das Produkt als Schaum erhalten
wurde (2,9 g). 1H NMR (DMSO-d 6) δ 0,83 (t,
3, CH 3),
1,2 [m, 10, 2 × CH 2,
CH(CH 3)2], 1,48 (m, 2, CH 2), 2,78 [m, 1, CH(CH3)2], 3,4, 3,6 (m,
4, OCH 2, H-5'), 3,75 (s, 6, OCH 3), 4,07 (m, 1),
4,27 (m, 1), 4,42 (m, 1), 5,2 (br d, 1, 3'-OH),
5,95 (d, 1, H-1'), 6,85, 7,25, 7,38
(m, 13, DMTr), 8,15 (s, 1, H-8),
11,67 (br s, 1, NH) und 12,1
(br s, 1, NH), Anal. Berechnung
für C40H47N5O8·1/2H2O: C, 65,38; H, 6,58; N, 9,53, Gefunden:
C, 65,37; H, 6,59; N, 9,39.
-
Beispiel 11
-
N2-Isobutyryl-5'-dimethoxytrityl-2'-O-pentylguanosin-3'-β-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit
-
N2-Isobutyryl-5'-dimethoxytrityl-2'-O-pentyl-guanosin
(1,7 g) wurde mit Bis-(N,N-diisopropylamino)-2-cyanoethyl-phosphit
(1,48 g) und N,N-Diisopropylammoniumtetrazolid (200 mg) wie für die Verfahrensweise
von Beispiel 6 behandelt, wodurch das Produkt erhalten wurde (1,4
g). 31P NMR (CDCl3) δ 150,5, 150,85.
-
Beispiel 12
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2,6-Diamino-9-(2'-O-nonyl-β-D-ribofuranosyl)purin
-
2,6-Diamino-9-(β-D-ribofuranosyl)purin
(50 g, 180 mmol) wurde mit Natriumhydrid (8,8 g, 220 mmol) und Bromnonan
(59 g, 54,4 ml, 285 mmol) in DMF (700 ml) wie für die Verfahrensweise von Beispiel
2 behandelt (die Diaminoverbindung in DMF wurde in einem Eisbad
während
der Zugabe von NaH abgekühlt),
wodurch 83 g des Rohproduktes erhalten wurden. 50 g des Rohproduktes
wurden durch Kieselgelchromatographie gereinigt. Die Fraktionen,
die 2'-O-Nonyl-
und 3'-O-Nonylprodukt
enthalten, wurden vereinigt, wodurch ein 77:23-Gemisch (29 g) des 2'- und 3'-Produktes er halten
wurde. Reines 2'-O-Nonylprodukt
wurde durch Chromatographie erhalten.
1H
NMR (DMSO-d 6) δ 0,95 (t,
3, CH 3);
1,17 [m, 12, O-CH2-CH2-(CH 2)6]; 1,42 [m, 2, O-CH2CH 2(CH2)6]; 3,27–3,70 (m,
2, H-5'); 3,50–3,70 [m, 2, O-CH 2(CH2)7]; 3,95 (m, 1, H-4'), 4,24 (m, 1, H-3'); 4,40 (m, 1, H-2');
5,10 (d, 1, 3'-OH, J = 5 Hz); 5,50 (t, 1,
5'-OH, J = 6 Hz); 5,76 (s, 2, 2-NH 2); 5,83 (d, 1, H-1', J = 6,0 Hz); 6,81 (s, 2, 6-NH 2);
und 7,96 (s, 1, 8-H).
-
Beispiel 13
-
2'-O-Nonylguanosin
-
Ein
Gemisch aus 2,6-Diamino-9-(2'-O-nonyl-β-D-ribofuranosyl)purin
und 2,6-Diamino-9-(3'-O-nonyl-β-D-ribofuranosyl)purin
(≈ 80:20-Gemisch,
29 g) in 0,1 M Natriumphosphatpuffer (50 ml, pH 7,4), 0,1 M Trispuffer
(1800 ml, pH 7,4) und DMSO (1080 ml) wurde mit Adenosindeaminase (1,6
g) wie für
die Verfahrensweise von Beispiel 3 behandelt, wodurch 60 g des Produktes
als Öl
erhalten wurden. Ein analytisches Produkt wurde durch Kieselgelchromatographie
gereinigt und aus EtOAc umkristallisiert. Smp. 258–259°C. 1H NMR (DMSO-d 6) δ 0,96
(t, 3, CH 3,
J = 7 Hz); 1,17 [m, 12, O-CH2-CH2-(CH 2)6]; 1,42 [m, 2,
O-CH2CH 2(CH2)6]; 3,27–3,61 (m,
4, H-5', O-CH 2(CH2)7];
3,95 (m, 1, H-4'), 4,10–4,13 (m,
2, H-2', H-3'); 5,13–6,06 (m,
2, 3'-OH5'-OH); 5,80 (d, 1, H-1',
J = 6,4 Hz); 6,47 (s, 2, 2-NH 2); 7,98 (s, 1, 8-H) und 10,64 (s, 1, N1 Amid), Anal.
Berechnung für
C19H31N5O5: C, 55,73; H, 7,63; N, 17,10, Gefunden:
C, 55,67; H, 7,66; N, 17,02.
-
Beispiel 14
-
N2-Isobutyryl-2'-O-nonylguanosin
-
2'-O-Nonylguanosin
(14,7 g) in Pyridin (360 ml) wurde mit Trimethylsilylchlorid (23,4
ml) und Isobutyrylchlorid (30,6 ml) wie für die Verfahrensweise von Beispiel
4 behandelt, wodurch das Rohprodukt erhalten wurde (37 g). Das Rohmaterial
wurde durch Kieselgelchromatographie gereinigt (unter Elution mit 90/10
CHCl3/MeOH), wodurch 14,6 g des Produktes erhalten
wurde, das aus EtOAc umkristallsiert wurde. Smp. 168–169°C. 1H NMR (DMSO-d 6) δ 0,85
[t, 3, CH 3(nonyl)],
1,14 [m, 18, O-CH2CH2(CH 2)6, CH(CH 3)2], 1,40 [m, 2,
O-CH2CH 2(CH2)6],
2,79 [m, 1, CH(CH3)2], 3,31–3,63
(m, 4, H-5', O-CH 2(CH2)7];
3,96 (m, 1, H-4'), 4,27–4,37 (m,
2, H-2', H-3'); 5,10 (t, 1, 5'-OH, J = 5 Hz), 5,18 (d, 1, 3'-OH, J = 4 Hz), 5,91 (d, 1, H-1',
J = 6,6 Hz), 8,31 (s, 1, 8-H),
11,73 (s, 1, C2-Amid) und 12,11 (s, 1, N1-Amid). Anal. Berechnung für C23H37N5O6: C, 57,60; H, 7,78; N, 14,60, Gefunden:
C, 57,63; H, 7,92; N, 14,62.
-
Beispiel 15
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N2-Isobutyryl-5'-dimethoxytrityl-2'-O-nonylguanosin
-
N2-Isobutyryl-2'-O-nonylguanosin
(14,6 g, 30,4 mmol) wurde mit Dimethoxytritylchlorid (12,1 g, 34
mmol) in Pyridin (200 ml) wie für
die Verfahrensweise von Beispiel 5 behandelt, wodurch 16 g des purpurnen
Schaums vor der Chromatographie und 11,5 g nach der Chromatographiereinigung
erhalten wurden. 1H NMR (DMSO-d 6) δ 0,84 [t,
3, CH 3 (nonyl), J
= 7 Hz], 1,16 [m, 18, O-CH2CH2(CH 2)6, CH(CH3)2], 1,43 [m, 2, O-CH2CH 2(CH2)6], 2,77 [m, 1,
CH(CH3)2], 3,18–3,63
(m, 4, H-5', O-CH 2(CH2)7];
3,74 (s, 6, DMTr O-CH 3) 4,06 (m, 1, H-4'), 4,27 (m, 1, H-3'); 4,42 (m, 1, H-2');
5,19 (d, 1, 3'-OH, J = 5 Hz), 5,94 (d, 1, H-1', J = 5,7 Hz), 6,83–7,38 (m, 13, DMTr aromatisch),
8,14 (s, 1, 8-H), 11,65 (s,
1, C2-Amid) und 12,11 (s, 1, N1-Amid).
Anal. Berechnung für
C44H55N5O8: C, 67,59; H, 7,27; N, 8,96, Gefunden:
C, 67,59; H, 7,11; N, 8,80.
-
Beispiel 16
-
N2-Isobutyryl-5'-dimethoxytrityl-2'-O-nonylguanosin-3'-β-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit
-
N2-Isobutyryl-5'-dimethoxytrityl-2'-O-nonylguanosin
(2,1 g) wurde mit Bis-(N,N-diisopropylamino)-2-cyanoethyl-phosphit
(1,5 g) und N,N-Diisopropylammoniumtetrazolid (0,2 g) wie für die Verfahrensweise
von Beispiel 6 behandelt, wodurch das Produkt (2,0 g) erhalten wurde. 31P NMR (CDCl3) δ 150,7 und
150,4 (Diastereomere).
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Beispiel 17
-
2,6-Diamino-9-(2',3'-di-O-propyl-β-D-ribofuranosyl)purin
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Die
Verfahrensweise von Beispiel 2 wurde unter Verwendung von 2,6-Diamino-9-(β-D-ribofuranosyl)purin
(10 g), NaH (3 g) und 1-Brompropan (10 ml) in DMF wiederholt. Nach
der Verdampfung des Reaktionslösungsmittels
wurden die Reaktionsprodukte durch Kieselgelchromatographie gereinigt.
Die sich langsamer bewegende Komponente ergab 4,3 g des 2'-O-Propylproduktes
als Schaum. Dieser Schaum wurde aus Wasser kristallisiert, wodurch
3,6 g des Produktes erhalten wurden. Die sich schneller bewegende
Komponente, die als Öl
isoliert wurde, bildete Kristalle beim Stehenlassen. EtOH wurde
zu den Kristallen zugegeben, sie wurden filtriert und 1 × EtOH gewaschen,
wodurch 1,1 g 2',3'-Di-O-propylprodukt
erhalten wurden. Smp. 165–167°C. 1H NMR (DMSO-d 6) δ 0,80
und 0,92 (t, 6, CH 3),
1,6 und 1,45 (m, 4, CH 2), 3,7–3,45
(br m, 6), 4,07 (m, 2), 4,5 (dd, 1), 5,55 (br t, 1, 5'-OH), 5,8 (br s, 2, 6-NH 2), 5,85 (d, 1, H-1'), 6,84 (br s, 2, 2-NH 2) und 8,0 (s,
1, H-8). Anal. Berechnung für C16H26N6O4: C, 52,45; H, 7,15; N, 22,94. Gefunden:
C, 52,18; H, 7,19; N, 22,75.
-
Beispiel 18
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N2,N6-Diisobutyryl-2,6-diamino-9-(2'-O-propyl-β-D-ribofuranosyl)purin
-
2,6-Diamino-9-(2'-O-propyl-β-D-ribofuranosyl)purin
(2,0 g) in Pyridin (35 ml) wurde mit Trimethylsilylchlorid (3,9
ml, 5 val) und Isobutyrylchlorid (3,2 ml, 5 val) wie für die Verfahrensweise
von Beispiel 4 behandelt, wodurch ein Schaum nach der Kieselgelchromatographie
erhalten wurde. Der Schaum wurde aus EtOAc/Hex kristallisiert, wodurch
2,2 g des Produktes erhalten wurden. Smp. 140–142°C. 1H NMR
(DMSO-d 6) δ 0,77 (t,
3, CH 3),
1,07, 1,16 [d, 12, 2 × CH(CH 3)2], 1,5 (m, 2, CH 2), 2,9, 3,03 [m, 2, 2 × CH(CH3)2], 3,4 (m, 1, H-5''),
3,58 (m, 3, OCH 2, H-5'), 3,95 (m, 1, H-4'),
4,3 (m, 1), 4,5 (m, 1), 5,02 (t, 1, 5'-OH),
5,2 (d, 1, 3'-OH), 6,03 (d, 1, H-1'),
8,58 (s, 1, H-8), 10,39 (br
s, 1, NH) und 10,57 (br s,
1, NH).
-
Beispiel 19
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N2,N6-Diisobutyryl-2,6-diamino-9-(5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-propyl-β-D-ribofuranosyl)purin
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N2,N6-Diisobutyryl-2,6-diamino-9-(2'-O-propyl-β-D-ribo-furanosyl)purin
(1,9 g) wurde mit Dimethoxytritylchlorid (1,5 g, 1,1 val) und Dimethylaminopyridin
(20 mg als Katalysator) in Pyridin (50 ml) wie für die Verfahrensweise von Beispiel
5 behandelt, wodurch das Produkt als Schaum erhalten wurde (2,8
g). 1H NMR (DMSO-d 6) δ 0,79 (t,
3, CH 3),
1,07, 1,16 [d, 12, 2 × CH(CH 3)2], 1,5 (m, 2, CH 2), 2,9, 3,03 [m, 2, 2 × CH(CH3)2], 3,58 (m, 3,
OCH 2, H-5'), 4,15 (m, 1, H-4'),
4,4 (m, 1), 4,6 (m, 1), 5,15 (d, 1,3'-OH), 6,15
(d, 1, H-1'), 6,8–7,35 (m, 13, DMTr), 8,5 (s,
1, H-8), 10,3 (br s, 1, NH)
und 10,57 (br s, 1, NH).
-
Beispiel 20
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N2,N6-Diisobutyryl-2,6-diamino-9-(5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-propyl-β-D-ribofuranosyl/purin-3'-β-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit
-
N2,N6-Diisobutyryl-2,6-diamino-9-(5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-propyl-β-D-ribofuranosyl)purin
(2,6 g) wurde mit Bis-(N,N-diisopropylamino)-2-cyanoethylphosphit
(1,7 g) und N,N-Diisopropylammoniumtetrazolid (300 mg) über Nacht
bei Raumtemperatur behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde erneut
verd. Na2CO3/CHCl2 und dann Na2CO3/NaCl partitioniert und über MgSO4 getrocknet.
Die organische Schicht wurde zu einem Schaum eingedampft. Der Schaum wurde
in CH2Cl2 (≈ 8 ml) gelöst und langsam
zu Hexanen (500 ml) zugegeben. Der Feststoff wurde filtriert und
getrocknet, wodurch das Produkt als Pulver erhalten wurde (3,1 g). 31P NMR (CDCl3) δ 150,8 und 151,3.
-
Beispiel 21
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2,6-Diamino-9-[2'-O-[(N-phthalimido)prop-3-yl]-β-D-ribofuranosyl]purin & 2,6-Diamino-9-[3'-O-[(N-phthalimido)prop-3-yl]-β-D-ribo-furanosyl]purin
-
2,6-Diamino-9-(β-D-ribofuranosyl)purin (14,2
g) wurde mit Natriumhydrid (3 g, 1,5 val) und N-(3-Brompropyl)phthalimid
(5,3 ml, 1,5 val) in DMF (20 g) bei 70°C über Nacht behandelt. Das Reaktionsgemisch
wurde zwischen H2O und Hexanen (1×) aufgeteilt
und die wässerige
Schicht dann 4 × CH2Cl2 extrahiert.
Die organische Schicht wurde über MgSO4 getrocknet und zu einem Rest eingedampft. Der
Rest wurde durch Kieselgelchromatographie unter Elution mit MeOH/CH2Cl2 gereinigt. Das 2'-O-(N-Phthalimido)propylprodukt
eluierte zuerst, gefolgt von gemischten Fraktionen und dann das 3'-O-(N-Phthalimido)produkt.
Die Verdampfungen der Fraktionen ergab 3,4 g des 2'-O-(N-Phthalimido)propylproduktes,
3,0 g gemischte 2'-
und 3'-Produkte
und 1,4 g des 3'-O-(N-Phthalimido)propylproduktes
alle als Schäume.
Das 3'-O-(N-Phthalimido)propylprodukt
wurde aus EtOAc/MeOH kristallisiert, wodurch 270 mg Feststoff erhalten
wurden.
-
2,6-Diamino-9-[2'-O-[(N-phthalimido)prop-3-yl]-β-D-ribofuranosyl]purin
-
- 1H NMR (DMSO-d 6) δ 1,8 (tq,
2, -CH 2-),
3,4–3,58
(m, 6, 2 × CH 2, H-5'), 3,9 (m, 1), 4,26 (m, 1), 4,37 (m,
1), 5,05 (br d, 1, 3'-OH), 5,4 (br t, 1, 5'-OH), 5,72 (br s, 2, NH 2), 5,8 (br d,
1, H-1'), 6,75 (br s, 2, NH 2), 7,8 (br s, 4,
Ar) und 8,93 (s, 1, H-8).
-
2,6-Diamino-9-[3'-O-[(N-phthalimido)prop-3-yl]-β-D-ribofuranosyl]purin
-
- Smp. 220–222°C, 1H NMR (DMSO-d 6) δ 1,85
(tq, 2, -CH-N), 3,6–3,67 (m,
4, -O-CH 2, H-5'), 3,85 (m, 1), 3,92 (m, 1), 4,6 (m,
1), 5,33 (d, 1, 2'-OH), 5,45 (br t, 1, 5'-OH), 5,65 (d, 1, H-1'),
5,73 (br s, 2, NH 2),
6,75 (br d, 2, NH 2),
7,8–7,85
(m, 4, Ar) und 7,85 (s, 1, H-8). Anal. Berechnung für C21H23N7O6: C, 53,73; H, 4,94; N, 20,88, Gefunden:
C, 53,59; H, 4,89; N, 20,63.
-
Beispiel 22
-
2'-O-[(N-Phthalimido)prop-3-yl]guanosin
-
2,6-Diamino-9-[2'-O-[(N-phthalimido)prop-3-yl]-β-D-ribofuranosyl]purin
(3,1 g) in 0,1 M Natriumphosphatpuffer (3 ml, pH 7,4), 0,05 M Trispuffer
(65 ml, pH 7,4) und DMSO (45 ml) wurde mit Adenosindeaminase (200
mg) bei Raumtemperatur für
5 Tage wie für
die Verfahrensweise von Beispiel 3 behandelt. Die Produktenthaltenden
Fraktionen aus der Kieselgelchromatographie wurden eingedampft und bildeten
bei der Konzentration weiße
Kristalle. Die Kristalle wurden filtriert und mit MeOH gewaschen, wodurch
1,1 g des Produktes erhalten wurden. Eine analytische Probe wurde
aus MeOH umkristallisiert. Smp. 192–194°C. 1H
NMR (DMSO-d 6) δ 1,82 (m,
2, CH 2),
3,45–3,67
(m, 6, H-5', OCH 2, NCH 2), 3,9 (m, 1), 4,3 (m, 2, H-2', H-3'), 5,1 (m, 2,5' und 3'-OH),
5,8 (d, 1, H-1'), 6,5 (br s, 2,
NH 2),
7,83 (s, 4, Phthal), 7,98 (s, 1, H-8)
und 10,5 (br s, 1, NH). Anal.
Berechnung für C21H22N6O7·1/2H2O: C, 52,61; H, 4,83; N, 17,53. Gefunden:
C, 52,52; H, 4,78; N, 17,38.
-
Beispiel 23
-
N2-Isobutyryl-2'-O-[(N-phthalimido)prop-3-yl]guanosin
-
2'-O-[(N-phthalimido)prop-3-yl]guanosin
(7,2 g, roh) in Pyridin (35 ml) wurde mit Trimethylsilylchlorid
(11,6 ml, 5 val) und Isobutyrylchlorid (8 ml, 5 val) wie für die Verfahrensweise
von Beispiel 4 behandelt, wodurch das Produkt als roher Schaum erhalten
wurde (6,5 g). Eine analytische Probe wurde durch Kristallisation
aus EtOAc erhalten. Smp. 166–168°C. 1H NMR (DMSO-d 6) δ 1,15
[d, 6, -CH(CH 3)2], 1,85 (m, 2, CH 2), 2,8 [m, 1, CH(CH3)2], 3,45–3,7 (m,
6, H-5', OCH 2,
NCH 2),
3,95 (m, 1), 4,34 (m, 1), 4,4 (m, 1), 5,12 (t, 1, 5'-OH), 5,18 (d, 1, 3'-OH),
5,9 (d, 1, H-1'), 7,83 (s, 4, Phthal),
8,3 (s, 1, H-8), 11,65 (br
s, 1, NH) und 12,1 (br s, 1,
NH). Anal. Berechnung für C25H28N6O8·1/2H2O: C, 54,64; H, 5,32; N, 15,29. Gefunden:
C, 54,46; H, 5,39; N, 14,98.
-
Beispiel 24
-
N2-Isobutyryl-5'-dimethoxytrityl-2'-O-[(N-phthalimido)prop-3-yl]guanosin
-
N2-Isobutyryl-2'-O-[(N-phthalimido)prop-3-yl]guanosin
(1,2 g) wurde mit Dimethoxytritylchlorid (820 mg, 1,1 val) und Dimethylaminopyridin
(20 mg als Katalysator) in Pyridin (50 ml) wie für die Verfahrensweise von Beispiel
5 unter Verwendung von 1:1 Hex/EtOAc, dann EtOAc dann 5% MeOH/EtOAc
mit 1% TEA als Elutionsmittel behandelt. Die Produkt-enthaltenden
Fraktionen wurden eingedampft, wodurch das Produkt als Schaum erhalten wurde
(1,7 g). 1H NMR (DMSO-d 6) δ 1,1 [d,
6, -CH(CH 3)2], 1,85 (m, 2, CH 2), 2,75 [m, 1, CH(CH3)2], 3,45–3,7 (m,
6, H-5', OCH 2,
NCH 2),
3,75 (s, 6, OCH 3), 4,0
(m, 1), 4,32 (m, 1), 4,4 (m, 1), 5,2 (d, 1, 3'-OH), 5,93
(d, 1, H-1'), 6,83, 7,2, 7,35 (m, 13, DMTr), 7,78 (s,
4, Phthal), 8,15 (s, 1, H-8),
11,6 (br s, 1, NH) und 12,05
(br s, 1, NH). Anal. Berechnung
für C46H46N6O10·H2O: C, 64,18; H, 5,62; N, 9,76. Gefunden:
C, 64,42; H, 5,78; N, 9,53.
-
Beispiel 25
-
N2-Isobutyryl-5'-dimethoxytrityl-2'-O-[(N-phthalimido)prop-3-yl]guanosin-3'-β-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit
-
N2-Isobutyryl-5'-dimethoxytrityl-2'-O-[(N-phthalimido)prop-3-yl]guanosin
(1,6 g) wurde mit Bis-(N,N-diisopropylamino)-2-cyanoethylphosphit
(1,48 g) und N,N-Diisopropylammoniumtetrazolid (200 mg) wie für die Verfahrensweise
von Beispiel 6 behandelt, wodurch das Produkt erhalten wurde (2,0
g). 31P NMR (CDCl3) δ 150,9.
-
Beispiel 26
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N2-Dimethylaminomethyliden-5'-dimethoxytrityl-2'-O-[(N-phthalimido)prop-3-yl]guanosin
-
2'-O-[(N-phthalimido)prop-3-yl]guanosin (900
mg) in DMF (20 ml) wurde mit N,N-Dimethylformamiddimethylacetal
(2 ml) behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde für 2 h gerührt und unter hohem Vakuum
bei 52°C
eingedampft. Der Rest wurde 1 × mit
Pyridin co-eingedampft und in Lösung
in Pyridin aufgenommen. Dimethoxytritylchlo rid (713 mg, 1,1 val)
und Dimethylaminopyridin (20 mg als Katalysator) wurden zugegeben.
Das Reaktionsgemisch wurde über
nacht gerührt,
zwischen Na2CO3/CH2Cl2 partitioniert, über MgSO4 getrocknet und durch Kieselgelchromatographie
wie für
die Verfahrensweise von Beispiel 5 gereinigt, wodurch 1,7 g des
Produktes als gebrochen weißer
Feststoff erhalten wurden. 1H NMR (DMSO-d 6) δ 1,88 (m,
2, CH 2),
3,1 [d, 6, N=CHN(CH 3)2], 3,3 (m, 2, H-5'), 3,67 (m, 4, OCH 2, NC2),
3,78 (s, 6, 2 × OCH 3),
4,0 (m, 1, H-4'), 4,35 (m, 2, H-2', H-3'), 5,2 (d, 1,3'-OH), 5,95 (d, 1, H-1'),
6,85, 7,25, 7,39 (m, 13, DMTr), 7,85 (s, 4, Phthal), 7,95 [s, 1, H-8), 8,5 (s, 1, N=CHN(CH3)2] und 11,39 (s, 1, NH 2). Anal. Berechnung
für C45H45N7O9·1/2H2O: C, 64,58; H, 5,54; N, 11,71. Gefunden:
C, 64,10; H, 5,65; N, 11,47.
-
Beispiel 27
-
N2-Dimethylaminomethyliden-5'-dimethoxytrityl-2'-O-[(N-phthalimido)prop-3-yl]guanosin-3'-β-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit
-
N2-Dimethylaminomethyliden-5'-dimethoxytrityl-2'-O-[(N-phthalimido)prop-3-yl]guanosin (1,7
g), Bis-(N,N-diisopropylamino)-2-cyanoethylphosphit (1,4 ml) und
N,N-Diisopropylammoniumtetrazolid (170 mg) wurden über Nacht
bei Raumtemperatur gerührt.
Das Reaktionsgemisch wurde zwischen CH2Cl2 und Na2CO3 (2 ×)
partitioniert. Die organische Phase wurde über MgSO4 getrocknet
und zu einem Öl
eingedampft. Das Öl
wurde in einem Minimum von CH2Cl2 gelöst
und tropfenweise zu 900 ml Hexanen zugegeben, um das Produkt auszufällen. Der
Feststoff wurde isoliert und getrocknet, wodurch 2,1 g des Produktes
erhalten wurden. 1P NMR (CDCl3) δ 150,4, 150,6.
-
Beispiel 28
-
2,6-Diamino-9-[2'-O-(N-phthalimido)pent-5-yl]-β-D-ribofuranosyl]purin
-
2,6-Diamino-(9-β-D-ribofuranosyl)purin
(6,7 g) wurde mit Natriumhydrid (1,3 g) und N-(5-Brompentyl)phthalimid
(7,8 g, 1,1 val) in DMF (60 ml) bei Raumtemperatur für drei Tage
behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde zwischen H2O
und CH2Cl2 partitioniert
und 4 × CH2Cl2 extrahiert.
Die vereinigten organischen Schichten wurden über MgSO4 getrocknet und
eingedampft. Der Rest wurde durch Kieselgelchromatographie unter
Elution mit 5 → 10%
MeOH/CH2Cl2 gereinigt.
Die 2'-O-(N-Phthalimido)pentyl-enthaltenden
Fraktionen wurden gesammelt und zu einem gelben Schaum eingedampft,
wodurch 2,2 g des Produktes erhalten wurden. Eine analytische Probe
wurde aus EtOH kristallisiert. Smp. 173–175°C. 1H
NMR (DMSO-d 6) δ 1,2 (m,
2, -CH 2-), 1,47
(m, 4, 2 × CH 2),
3,55, 3,65 (m, 6, O-CH 2, H-5', NCH 2), 3,95 (m, 1),
4,28 (m, 1), 4,4 (m, 1), 5,13 (d, 1, 3'-OH),
5,5 (t, 1, 5'-OH), 5,77 (br s, 2, 6-NH 2),
5,84 (br d, 1, H-1'), 6,8 (br s, 2,
2-NH 2),
7,86 (M, 4, Phthal) und 7,95 (s, 1, H-8).
Anal. Berechnung für
C23H27N7O6: C, 55,50; H, 5,47; N, 19,71. Gefunden:
C, 55,44; H, 5,51; N, 19,30.
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Beispiel 29
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2'-O-[(N-Phthalimido)pent-5-yl]guanosin
-
Ein
Gemisch aus den 2,6-Diamino-9-[2'-O-[(N-phthalimido)pent-5-yl]-β-D-ribofuranosyl]purin-
und 2,6-Diamino-9-[3'-O-[(N-phthalimido)pent-5-yl]-β-D-ribofuranosyl]purinisomeren
(2,2 g) in 0,1 M Trispuffer (60 ml, pH 7,4), 0,1 M NaPO4 Puffer
(2 ml, pH 7,4) und DMSO (40 ml) wurde mit Adenosindeaminase (60
mg) bei Raumtemperatur für
5 Tage wie für
die Verfahrensweise von Beispiel 3 behandelt. Die Produkt-enthaltenden
Fraktionen aus der Kieselgelchromatographie wurden eingedampft, wodurch
das Produkt (1,0 g) als roher weißer Feststoff erhalten wurde.
Eine analytische Probe wurde durch die Addition von MeOH zur Bildung
von Kristallen hergestellt. Smp. 178–180°C. 1H
NMR (DMSO-d 6) δ 1,24 (m,
2, CH 2),
1,5 (m, 4, 2 × CH 2),
3,5–3,6 (m,
6, H-5', OCH 2, NCH 2), 3,87 (m, 1, H-4'), 4,25 (m, 2, H-2', H-3'), 5,1 (m, 2, 5'- und 3'-OH), 5,78 (d, 1, H-1'),
6,5 (br s, 2, NH 2),
7,84 (M, 4, Phthal), 7,98 (s, 1, H-8)
und 10,67 (br s, 1, NH). Anal.
Berechnung für C23N26N6O7·1/2H2O: C, 54,43; H, 5,36; N, 16,56. Gefunden:
C, 54,79; H, 5,24; N, 16,61.
-
Beispiel 30
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N2-Isobutyryl-2'-O-[(N-phthalimido)pent-5-yl]guanosin
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2'-O-[(N-phthalimido)pent-5-yl]guanosin
(1,6 g, roh) in Pyridin (35 ml) wurde mit Trimethylsilylchlorid
(2,0 ml, 5 val) und Isobutyrylchlorid (1,68 ml, 5 val) wie für die Verfahrensweise
von Beispiel 4 behandelt, wodurch das Produkt als Schaum erhalten
wurde. Dieser Schaum wurde 2 × mit
EtOAc co-eingedampft, gefolgt von der Zugabe von EtOAc und Erhitzen,
wodurch weiße
Kristalle (950 mg) erhalten wurden. Smp. 202–204°C. 1H
NMR (DMSO-d 6) δ 1,1 [d, 6,
-CH(CH 3)2], 1,17 (m, 2, CH 2), 1,43 (m, 4, 2 × CH 2), 2,74 [m, 1, CH(CH3)2], 3,45–3,55 (m,
6, H-5', OCH 2, NCH 2), 3,9 (m, 1), 4,25 (m, 1), 4,3 (m, 1),
5,07 (t, 1, 5'-OH), 5,15 (d, 1, 3'-OH), 5,87 (d, 1, H-1'),
7,8 (s, 4, Phthal), 8,27 (s, 1, H-8),
11,67 (br s, 1, NH) und 12,06 (br
s, 1, NH). Anal. Berechnung
für C27H32N6O8·1/2H2O: C, 56,14; H, 5,76; N, 14,55. Gefunden:
C, 56,45; H, 5,74; N, 14,41.
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Beispiel 31
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N2-Isobutyryl-5'-dimethoxytrityl-2'-O-[(N-phthalimido)pent-5-yl]guanosin
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N2-Isobutyryl-2'-O-[(N-phthalimido)pent-5-yl]guanosin
(0,95 g) wurde mit Dimethoxytritylchlorid (620 mg, 1,1 val) und
Dimethylaminopyridin (20 mg als Katalysator) in Pyridin (50 ml)
wie für die
Verfahrensweise von Beispiel 5 unter Verwendung von EtOAc 1% TEA
und dann 5% MeOH EtOAc/CH2Cl2 mit
1% TEA als Elutionsmittel behandelt. Die Produkt-enthaltenden Fraktionen
wurden eingedampft, wodurch das Produkt als Schaum erhalten wurde
(1,4 g). 1H NMR (DMSO-d 6) δ 1,14 [d,
6, -CH(CH 3)2], 1,25 (m, 2, CH 2), 1,53 (m, 4, 2 × CH 2), 2,77 [m, 1, CH(CH3)2], 3,3–3,6 (m,
6, H-5', OCH 2, NCH 2),
3,75 (s, 6, OCH 3),
4,07 (m, 1), 4,33 (m, 1), 4,4 (m, 1), 5,18 (d, 1, 3'-OH), 5,94 (d, 1, H-1'),
6,83, 7,2, 7,53 (m, 13, DMTr), 7,8 (s, 4, Phthal), 8,15 (s, 1, H-8), 11,6 (br s, 1, NH) und 12,1 (br s, 1, NH). Anal. Berechnung für C48H50N6O10·1/2H2O: C, 65,52; H, 5,84; N, 9,55. Gefunden:
C, 65,55; H, 5,94; N, 9,20.
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Beispiel 32
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2,6-Diamino-9-[3',5'-O-(tetraisopropyldisiloxan-1,3-diyl)-β-D-ribofuranosyl]purin
-
Zu
einer Suspension aus 2,6-Diamino-9-(β-D-ribofuranosyl)purin (10,5
g) in Pyridin (100 ml) wurde 1,3-Dichlortetraisopropyldisiloxan
(TIPDS, 12,6 g) zugegeben. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur
für 4 Stunden
durchgeführt
und weitere 1,3 g 1,3-Dichlortetraisopropyldisiloxan wurden zugegeben,
gefolgt von Rühren über Nacht.
Das Reaktionsgemisch wurde in Eiswasser gegossen und das nicht-lösliche Produkt
(11,6 g) durch Filtration gesammelt. Eine analytische Probe wurde
aus EtO-Ac/Hexanen
umkristallisiert. Smp. 170–172°C. Anal.
Berechnung für
C22H40N6O5Si2 1/2H2O: C, 49.5; H, 7.74; N, 15.7. Gefunden:
49.57; H, 7.82; N, 15.59.
-
Beispiel 33
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2,6-Diamino-9-[3',5'-O-(tetraisopropyldisiloxan-1,3-diyl)-2-O-methyl-β-D-ribofuranosyl]purin
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Ein
Gemisch aus 2,6-Diamino-9-[3,5-O-(tetraisopropyldisiloxan-1,3-diyl)-β-D-ribofuranosyl]purin
(8,8 g) in DMF (120 ml) und Methyliodid (3 ml, 3 val) wurde in einem
Eisbad abgekühlt
und NaH (60% in Öl,
1,0 g, 1,5 val) zugegeben. Nach 20 min wurde die Reaktion mit MeOH
gequencht und zwischen ges. NH4Cl und CH2Cl2 partitioniert.
Die organische Phase wurde mit 1 × NH4Cl
gewaschen, über
MgSO4 getrocknet und eingedampft. Der Rest
wurde aus heißem
EtOH/H2O kristallisiert, wodurch das Produkt (8,5
g) als Kristalle erhalten wurde. Smp. 87–89°C.
1H
NMR (DMSO-d 6) δ 1,05 (m,
28, TIPDS), 3,57 (s, 3, OCH 3), 3,98 (m, 1, H-4'), 3,92 und 4,07
(ABX, 2, H-5'), 4,13 (d, 1), 4,6
(dd, 1, H-3'), 5,76 (br s, 2, NH 2), 5,8 (s, 1, H-1'), 6,77 (br s, 2, NH 2) und 7,77 (s,
1 H-8).
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Beispiel 34
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2,6-Diamino-9-(2'-O-methyl-β-D-ribofuranosyl)purin
-
Zu
einer Lösung
aus 2,6-Diamino-9-[3',5'-O-(tetraisopropyldisiloxan-1,3-diyl)-2'-O-methyl-β-D-ribofuranosyl]purin (8,5
g) in THF (50 ml) wurde 1 M Tetrabutylammoni umfluorid in THF (Aldrich,
20 ml) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde für 2 h gerührt und filtriert. Der Filterkuchen
wurde mit 2 × EtOAc
gewaschen und getrocknet, wodurch 4,0 g des Rohproduktes erhalten
wurden. Eine analytische Probe wurde aus heißem MeOH kristallisiert. Smp.
133–135°C. 1H NMR (DMSO-d 6) δ 3,3
(s, 3, OCH 3),
3,58 (m, 2, H-5'), 3,98 (m, 1, H-4'), 4,28 (m, 2, H-2', H-3'), 5,23 (br s, 1, 3'-OH),
5,48 (br t, 1, 5'-OH), 5,77 (br s, 2, NH 2),
5,82 (d, 1, H-1'), 6,83 (br s, 2,
NH 2)
und 7,95 (s, 1, H-8). Anal.
Berechnung für
C11H16N6O4·1/2H2O: C, 43,28; H, 5,61; N, 27,52. Gefunden:
C, 43,51; H, 5,62; N, 27,26.
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Beispiel 35
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2'-O-Methylguanosin
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2,6-Diamino-9-(2'-O-methyl-β-D-ribofuranosyl)purin
(9,5 g) in 0,1 M Natriumphosphatpuffer (200 ml, pH 7,4) und DMSO
(25 ml) wurde mit Adenosindeaminase (Typ II Sigma) bei RT für 4 Tage
behandelt. Die resultierende Suspension wurde abgekühlt und
filtriert, und der resultierende Filterkuchen mit H2O
gewaschen und zu einem weißen
Feststoff getrocknet (4,0 g). Der Feststoff wurde aus heißem H2O umkristallisiert, wodurch 2,9 g des Produktes
erhalten wurden. Smp. 236–238°C. 1H NMR (DMSO-d 6) δ 3,3
(s, 3, OCH 3),
3,53 und 3,6 (ABX, 2, H-5'), 3,87 (m, 1, H-4'), 4,15 (m, 1, H-2'),
4,25 (m, 1, H-3'), 5,13 (t, 1, 5'-OH), 5,23 (d, 1, 3'-OH),
5,8 (d, 1, H-1'), 6,48 (br s, 2,
NH 2),
7,96 (s, 1, H-8) und 10,68
(br s, 1, NH). Anal. Berechnung
für C11H15N5O5·1/2H2O: C, 43,14; H, 5,26; N, 22,86. Gefunden:
C, 43,59; H, 5,34; N, 23,04.
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Beispiel 36
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N2-Isobutyryl-2'-O-methylguanosin
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2'-O-Methylguanosin
(3,5 g) in Pyridin (100 ml) wurde mit Trimethylsilylchlorid (9 ml,
6 val) und Isobutyrylchlorid (6,2 ml) bei RT für 4 h behandelt. Das Reaktionsgemisch
wurde in einem Eisbad abgekühlt,
H2O (20 ml) wurde zugegeben und das Rühren für weitere
20 min fortgesetzt. NH4OH (20 ml) wurde zugegeben
und nach dem Rühren
für 30
min wurde das Reaktionsgemisch eingedampft. Der Rest wurde mit H2O ver rieben, filtriert und das Filtrat eingedampft und
durch Kieselgelchromatographie wie für die Verfahrensweise von Beispiel
4 gereinigt, wodurch das Produkt als gebrochen weißer Feststoff
erhalten wurde (1,5 g). 1H NMR (DMSO-d 6) δ 1,1 [d,
6, CH(CH 3)2], 2,77 [m, 1, CH(CH3)2], 3,33–3,6 (m,
5, OCH 3,
H-5'), 3,93 (m,
1, H-4'), 4,22 (m, 1), 4,3 (m, 1), 5,1 (t,
1, 5'-OH), 5,28 (d, 1, 3'-OH),
5,9 (d, 1, H-1'), 8,28 (s, 1, H-8) und 11,9 (br s, 1, NH).
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Beispiel 37
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N2-Isobutyryl-5'-dimethoxytrityl-2'-O-methylguanosin
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N2-Isobutyryl-2'-O-methylguanosin
(1,5 g) wurde mit Dimethoxytritylchlorid (1,5 g, 1,1 val) und Dimethylaminopyridin
(100 mg als Katalysator) in Pyridin (50 ml) wie für die Verfahrensweise
von Beispiel 5 behandelt, wodurch das Produkt als Schaum erhalten
wurde (2,6 g). 1H NMR (DMSO-d 6) δ 1,14 (d,
6, CH(CH 3)2], 2,75 [m, 1, CH(CH3)2], 3,5 (m, 2, H-5'), 3,74 (s, 6, OCH 3), 4,05 (m, 1),
4,33 (m, 1), 5,26 (d, 1, 3'-OH), 5,95 (d, 1, H-1'),
6,83, 7,2, 7,35 (m, 13, DMTr), 8,15 (s, 1, H-8), 11,6 (br s, 1, NH) und 12,1 (br s, 1, NH).
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Beispiel 38
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N2-Isobutyryl-5'-dimethoxytrityl-2'-O-methylguanosin-3'-β-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit
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N2-Isobutyryl-5'-dimethoxytrityl-2'-O-methylguanosin
(20 g) wurde mit Bis-(N,N-diisopropylamino)-2-cyanoethylphosphit
(10,8 g) und N,N-Diisopropylammoniumtetrazolid (1,6 g) wie für die Verfahrensweise
von Beispiel 6 behandelt, wodurch das Produkt erhalten wurde (15,7
g). 31P NMR (CDCl3) δ 148,97 und
147,96.
-
Beispiel 39
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N2,N6-Diisobutyryl-2,6-diamino-9-(2'-O-methyl-β-D-ribofuranosyl)purin
-
2,6-Diamino-9-(2'-O-methyl-β-D-ribofuranosyl)purin
(700 mg) in Pyridin (20 ml) wurde mit Trimethylsilylchlorid (2,1
ml, 7 val) und Isobutyrylchlorid (1,25 ml, 5 val) wie für die Verfahrensweise
von Beispiel 4 behandelt, wodurch das Produkt als Schaum (900 mg)
nach der Kieselgelchromatographie erhalten wurde.
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Beispiel 40
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N2,N6-Diisobutyryl-2,6-diamino-9-(5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-methyl-β-D-ribofuranosyl)purin
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N2,N6-Diisobutyryl-2,6-diamino-9-(2'-O-methyl-β-D-ribofuranosyl)purin
(900 mg) wurde mit Dimethoxytritylchlorid (1,0 g) und Dimethylaminopyridin (20
mg als Katalysator) in Pyridin (30 ml) wie für die Verfahrensweise von Beispiel
5 behandelt, wodurch das Produkt als Schaum erhalten wurde (700
mg). 1H NMR (DMSO-d 6) δ 0,96 –1,16 [m,
12, 2 × CH(CH3)2], 2,9 und 3,05
[M, 2, 2 × CH(CH3)2], 3,18 und 3,37 (ABX, 2, H-5'),
3,38 (s, 3, OCH 3),
3,7 (s, 6, OCH 3), 4,05
(m, 1, H-4'), 4,44 (m, 2, H-2', H-3'), 5,24 (d, 1, 3'-OH),
6,06 (d, 1, H-1'), 6,78, 7,2, 7,33
(m, 13, Ar), 8,22 (s, 1, H-8),
10,3 (br s, 1, NH) und 10,57
(br s, 1, NH).
-
Beispiel 41
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N2,N6-Diisobutyryl-2,6-diamino-9-(5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-methyl-β-D-ribofuranosyl)purin-3'-β-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit
-
N2,N6-Diisobutyryl-2,6-diamino-9-(5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-methyl-β-D-ribofuranosyl)purin
(600 mg) wurde mit Bis-(N,N-diisopropylamino)-2-cyanoethylphosphit
(500 μl)
und N,N-Diisopropylammoniumtetrazolid (80 mg) über Nacht bei RT behandelt.
Das Reaktionsgemisch wurde erneut zwischen verd. Na2CO3/CHCl2 und dann
Na2CO3/NaCl partitioniert und über MgSO4 getrocknet. Die organische Schicht wurde
zu einem Schaum (500 mg) eingedampft. 31P NMR
(CDCl3) δ 151,1
(Dublett).
-
Beispiel 42
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2,6-Diamino-9-(2'-O-octadecyl-b-D-ribofuranosyl)purin
-
2,6-Diamino-9-(β-D-ribofuranosyl)purin
(50 g, 180 mmol) und Natriumhydrid (7 g) in DMF (1 l) wurden zum
Sieden für
2 h erhitzt. Iodoctadecan (100 g) wurde bei 150°C zugegeben und das Reaktionsgemisch
konnte sich auf RT abkühlen.
Das Reaktionsgemisch wurde für
11 Tage bei RT gerührt.
Das Lösungsmittel
wurde eingedampft und der Rest durch Kieselgelchromatographie gereinigt.
Das Produkt wurde mit 5% MeOH/CH2Cl2 eluiert. Die Produkt-enthaltende Fraktion
wurde eingedampft, wodurch das Produkt (11 g) erhalten wurde. 1H NMR (DMSO-d 6) δ 0,84
(t, 3, CH 2);
1,22 [m, 32, O-CH2-CH2-(CH 2)16-]; 1,86 (m, 2, O-CH2CH 2-);
3,25 (m, 2, O-CH2-); 3,93 (d, 1, 4'H), 4,25 (m, 1, 3'H;
4,38 (t, 1, 2'H); 5,08 (d, 1,3'-OH); 5,48 (t, 1,5'-OH);
5,75 (s, 2,6-NH 2);
5,84 (d, 1, 1'-H; 6,8 (s, 2, 2-NH 2); und 7,95 (s,
1, 8-H).
-
Beispiel 43
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2'-O-Octadecylguanosin
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2,6-Diamino-9-(2'-O-octadecyl-β-D-ribofuranosyl)purin
(10 g) in 0,1 M Natriumphosphatpuffer (50 ml, pH 7,4), 0,1 M Trispuffer
(1000 ml, pH 7,4) und DMSO (1000 ml) wurde mit Adenosindeaminase (1,5
g) wie für
die Verfahrensweise von Beispiel 3 behandelt. An Tag 3, Tag 5 und
Tag 7 wurde ein zusätzlicher
aliquoter Teil (500 mg, 880 mg bzw. 200 mg) Adenosindeaminase zugegeben.
Die Reaktion wurde für
insgesamt 9 Tage gerührt
und ergab nach der Reinigung durch Kieselgelchromatographie das
Produkt (2 g). Eine analytische Probe wurde aus MeOH umkristallisiert.
1H NMR (DMSO-d 6) δ 0,84
(t, 3, CH 3),
1,22 [s, 32, O-CH2-CH2-(CH 2)16], 5,07 (m, 2, 3'-OH 5'-OH); 5,78 (d, 1,1'-H);
6,43 (s, 2, NH 2),
7,97 (s, 1,8-H) und 10,64 (s,
1, NH 2).
Anal. Berechnung für
C28H49N5O5: C, 62,80; H, 9,16; N, 12,95. Gefunden:
C, 62,54; H, 9,18; N, 12,95.
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Beispiel 44
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N2-Isobutyryl-2'-O-octadecylguanosin
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2'-O-Octadecylguanosin
(1,9 g) in Pyridin (150 ml) wurde mit Trimethylsilylchlorid (2 g,
5 val) und Isobutyrylchlorid (2 g, 5 val) wie für die Verfahrensweise von Beispiel
4 behandelt. Das Produkt wurde durch Kieselgelchromatographie gereinigt (eluiert
mit 3% MeOH/EtOAc), wodurch 1,2 g des Produktes erhalten wurden. 1H NMR (DMSO-d 6) δ 0,85
[t, 3, CH 3],
1,15 [m, 38, O-CH2CH2(CH 2)16, CH(CH 3)2], 2,77 [m, 1,
CH(CH3)2], 4,25 (m, 2, 2'H, 3'H); 5,08 (t, 1, 5'-OH),
5,12 (d, 1, 3'-OH), 5,87 (d, 1, 1'-H), 8,27 (s, 1, 8-H), 11,68 (s, 1, NH 2) und 12,08 (s, 1,
NH 2).
Anal. Berechnung für
C32H55N5O6: C, 63,47; H, 9,09; N, 11,57. Gefunden:
C, 63,53; H, 9,20; N, 11,52.
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Beispiel 45
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2,6-Diamino-9-[2'-O-(imidazol-1-yl)butyl-β-D-ribofuranosyl]purin
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2,6-Diamino-(9-β-D-ribofuranosyl)purin
(5,0 g) in DMF (400 ml) wurde mit Natriumhydrid (0,78 g) behandelt.
Nach dem Rühren
von weiteren 30 min wurde eine weitere Portion von Natriumhydrid
(2,6 g) unmittelbar zugegeben, gefolgt von Brombutylimidazol (9,9
g) in DMF (25 ml). Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht gerührt und
mit H2O gequencht. Das Reaktionsgemisch
wurde durch Celite filtriert und eingedampft, wodurch ein öliges Produkt
erhalten wurde. DC zeigte ein Gemisch aus Isomeren.
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Beispiel 46
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2'-O-(imidazol-1-yl)butylguanosin
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Ein
Gemisch aus den 2,6-Diamino-9-[2'-O-(imidazol-1-yl)butyl-β-D-ribofuranosyl]purin-
und 2,6-Diamino-9-[3'-O-(imidazol-1-yl)butyl-β-D-ribofuranosyl]purinisomeren
in 0,1 M Trispuffer (pH 7,4), 0,1 M Na2SO4-Puffer (pH 7,4) und DMSO wurde mit Adenosindeaminase
bei RT für
5 Tage wie für
die Verfahrensweise von Beispiel 3 gerührt. Die Produkt-enthaltenden
Fraktionen wurden durch Kieselgelchromatographie gereinigt und die
Produkt-enthaltende Fraktion eingedampft, wodurch das Produkt erhalten
wurde.
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Beispiel 47
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N2-Isobutyryl-2'-O-(imidazol-1-yl)butylguanosin
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2'-O-(imidazol-1-yl)butylguanosin
in Pyridin wird mit Trimethylsilylchlorid (5 val) und Isobutyrylchlorid
(5 val) wie für
die Verfahrensweise von Beispiel 4 behandelt, wodurch das Produkt
erhalten wird.
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Beispiel 48
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N2-Isobutyryl-5'-dimethoxytrityl-2'-O-(imidazol-1-yl)butylguanosin
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N2-Isobutyryl-2'-O-(imidazol-1-yl)butylguanosin
wird mit Dimethoxytritylchlorid (1,1 val) und Dimethylaminopyridin
(als Katalysator) in Pyridin wie für die Verfahrensweise von Beispiel
5 behandelt. Nach der Chromatographiereinigung werden die Produkt-enthaltenden
Fraktionen eingedampft, wodurch das Produkt erhalten wird.
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Beispiel 86
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N2,N6-Diisobutyrylamino-9-(2'-O-methyl-β-D-ribofuranosyl)purin
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N2,N6-Diamino-9-(2'-O-methyl-β-D-ribofuranosyl)purin
(1,6 g, 5,39 mmol, siehe Beispiel 34) wurde mit Pyridin (25 ml)
co-eingedampft. Eine Suspension des Rests in Pyridin (40 ml) wurde
in einem Eisbad abgekühlt
und Trimethylsilylchlorid (4,8 ml) wurde zugegeben. Das Reaktionsgemisch
wurde für
30 min gerührt,
gefolgt von der Addition von Butyrylchlorid (2,8 ml, 5 val). Das
resultierende Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 4 Stunden
gerührt.
H2O (10 ml) und konz. NH4OH
(10 ml) wurden unter Rühren
zugegeben, um das Reaktionsgemisch zu quenchen. Nach 30 min wurde
das Reaktionsgemisch eingedampft und der Rest auf einer Kieselgelsäule unter
Verwendung von CH2Cl2 → 10% MeOH/CH2Cl2 unter Elution
des Produktes gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen wurden eingedampft, wodurch
das Produkt als ein Öl
erhalten wurde (2,4 g).
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Beispiel 87
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N2,N6-Diisobutyrylamino-9-(5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-methyl-β-D-ribofuranosyl)purin
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N2,N6-Diisobutyrylamino-9-(2'-O-methyl-β-D-ribofuranosyl)purin
(2,4 g) wurde mit Pyridin co-eingedampft und in Pyridin wieder gelöst. Dimethoxytritylchlorid
(1,8 g, 1 val) und Dimethylaminopyridin (5 mg) wurden zugegeben
und die resultierende Lösung
wurde über
Nacht bei Raumtemperatur gerührt.
Das Lösungsmittel
wurde teilweise eingedampft und der Rest zwischen CH2Cl2 – verd.
Na2CO3 partitioniert.
Die organische Phase wurde mit verd. Na2CO3 gewaschen, mit MgSO4 getrocknet
und eingedampft. Der Rest wurde auf einer Kieselgelsäule unter
Elution mit Hexanen/EtOAc (1:1), enthaltend 1% Triethylamin, gereinigt.
Die Fraktion, die das Produkt enthält, wurde eingedampft, wodurch
das Produkt als Schaum erhalten wurde (2,4 g).
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Beispiel 88
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N2,N6-Diisobutyrylamino-9-[5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-methyl-3'-O-(β-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramid)-β-D-ribofuranosyl]purin
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N2,N6-Diisobutyrylamino-9-(5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-methyl-β-D-ribofuranosyl)purin
(1,7 g, 0,0023 Mol) wurde mit Bis-N,N-diisopropylaminocyanoethylphosphit
(1,48 ml, 2 val) und N,N-Diisopropylaminohydrotetrazolid (200 mg)
bei Raumtemperatur über
Nacht behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde zwischen verd. Na2CO3/CH2Cl2 aufgeteilt, die organische Phase wurde über MgSO4 getrocknet und eingedampft. Der Rest wurde
auf eine Kieselgelsäule geladen
und mit Hexanen/EtOAc (3:1 → 1:1
mit 1% Triethylamin) eluiert, wodurch das Produkt als fester Schaum
erhalten wurde (1,73 g). 31P-NMR (CD3CN, H3PO4 std.) zeigt die Diastereomere.