DE69333067T2

DE69333067T2 - Enzym mit endoglukanase wirkung

Info

Publication number: DE69333067T2
Application number: DE69333067T
Authority: DE
Inventors: Henrik Dalboege; Nonboe Lene ANDERSEN; Venke Lene KOFOD; Sakari Markus KAUPPINEN; Stephan Christgau
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1992-12-23
Filing date: 1993-12-23
Publication date: 2004-05-13
Anticipated expiration: 2013-12-24
Also published as: EP0675951B1; WO1994014953A1; AU5809494A; EP0675951A1; ES2202320T3; DK0675951T3; IL108157A0; ATE243744T1; US6214598B1; DE69333067D1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Enzyme mit Endoglucanase-Aktivität, ein Verfahren zur Herstellung der Enzyme und ein ein erfindungsgemäßes Enzym enthaltendes Enzympräparat.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Endoglucanasen (EC Nr. 3.2.1.4) bilden eine Gruppe von Hydrolasen, die die Endo-Hydrolyse von 1,4-β-D-glykosidischen Bindungen in Cellulose, Cellulosederivaten (wie beispielsweise Carboxymethylcellulose und Hydroxyethylcellulose), Lichenin, β-1,4-Bindungen in gemischten β-1,3-Glucanen wie beispielsweise β-D-Glucanen in Getreide oder Xyloglucanen und anderem pflanzlichen Material, das celluloseartige Teile enthält. Der offizielle Name ist Endo-l,4-β-D-Glucan-4-Glucanohydrolase, doch wird in der vorliegenden Beschreibung die abgekürzte Bezeichnung Endoglucanase verwendet. Diesbezüglich kann verwiesen werden auf R. F. Gould, „Cellulases and their Application", Advances in Chemistry Series 55, American Chemical Society (1969), T. M. Wood, „Properties and Mode of Action of Cellulases", in Biotechnology and Bioengineering Symposium, Nr. 5, John Wiley, 111–137 (1975), Y. -H. Lee und L. T. Fan, „Properties and Mode of Action of Cellulose", Advances in Biochemical engineering 17, 101–129 (1980), J. Goksøyr and J. Eriksen, „Cellulases" in A. H. Rouse, Microbial Enzymes and Bioconversions, Academic Press, 283–330 (1980), T. -M. Enveri, „Microbial Cellulases" in W. M. Fogarty, Microbial Enzymes and Biotechnology, Applied Science Publishers, 183–224 (1983).
Es wurde gefunden, daß Endoglucanasen von verschiedenen Arten von Organismen wie Pflanzen und Mikroorganismen produziert werden, und Endoglucanasen mit einer breiten Vielfalt von Spezifitäten wurden identifiziert. Beispielsweise wurden xyloglucanspezifische Endoglucanasen in verschiedenen Pflanzen identifiziert, gemäß den Offenbarungen von Fry et al. (1992), Nishitani und Tominaga (1992), Hayashi et al. (1984), McDougall und Fry (1991) und WO 93/17101. Bei allen diesen Enzymen wurde Transferase-Aktivität festgestellt (wie beispielsweise von Fry et al., 1992 und Nishitani et al., 1992, definiert), und sie sind demgemäß nicht als echte Endoglucanase klassifiziert. Bislang wurden xyloglucanspezifische Endoglucanasen in Mikroorganismen nicht identifizert.
Mikrobielle Endoglucanasen wurden von Beldman et al., 1985 (Trichoderma viride) und in WO 93/20193 (Aspergillus aculeatus) beschrieben, wobei letztere Literaturstelle erst nach den Prioritätsdaten der vorliegenden Erfindung veröffentlicht wurde. Weiter beschreiben Sharma et al., 1991, Ooi, et al., 1990 und Gilkes et al. 1991 mikrobielle Endoglucanasen.
Endoglucanasen können vorteilhafterweise zum Abbau von Cellulosebestandteilen, die in Pflanzenzellwänden und bakteriellen Polysacchariden vorliegen, eingesetzt werden. Endoglucanasen mit einer hohen Aktivität bezüglich des Abbaus von Xyloglucan können von besonderem Nutzen beim Abbau von Zellwandmaterial mit hohem Xyloglucangehalt sein, beispielsweise in der Wein- und Fruchtindustrie, bei der Pektinextraktion und bei der Entfernung von Hemicellulose aus Textilfasern.
Die Aufgabe der Erfindung ist es, neue Endoglucanasen, die nützliche Substratspezifitäten aufweisen, und ein Verfahren zur Herstellung der Endoglucanasen mit besserer Ausbeute und höherer Reinheit als bislang möglich bereitzustellen. Eine weitere Aufgabe ist es, neue Produkte bereitzustellen, bei denen der Anteil an Endo-β-1,4-Glucanase relativ zum Anteil im ursprünglichen Produkt entweder vergrößert oder verkleinert wird. Die erfindungsgernäßen Endoglucanasen und neuen Produkte können allein oder in Kombination mit anderen Enzymen zum Abbau von Pflanzenzellwandgewebe verwendet werden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung in einem ersten Aspekt ein Enzym mit Endoglucanase-Aktivität, das durch eine DNA-Sequenz kodiert ist, die mindestens eine der folgenden Teilsequenzen umfaßt:
Vorliegend soll der Begriff „Endoglucanase-Aktivität" die Fähigkeit bezeichnen, 1,4-β-D-glykosidische Bindungen, die in jedem Cellulosematerial wie beispielsweise Cellulose, Cellulosederivaten, Lichenin, β-D-Glucan oder Xyloglucan vorhanden sind, zu hydrolisieren. Die Endoglucanase-Aktivität kann gemäß aus dem Stand der Technik bekannten Methoden bestimmt werden, von denen Beispiele in den Abschnitten „Materialien und Methoden" und „Beispiele" hierin beschrieben sind. Eine Einheit der Endoglucanase-Aktivität (z. B. CMCU, AVN, XGU oder BGU) ist definiert als Produktion von 1 μmol reduzierender Zucker/min aus einem Glucansubstrat, wobei das Glucansubstrat beispielsweise CMC (CMCU), säuregequollenes Avicell (AVIU), Xyloglucan (XGU) oder Getreide-β-Glucan (BGU) ist. Die reduzierenden Zucker werden bestimmt, wie es in dem Abschnitt „Materialien und Methoden" hierin beschrieben ist. Die spezifische Aktivität einer Endoglucanase gegenüber einem Substrat ist definiert als Einheiten/mg Protein.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Enzym, das Endoglucanase-Aktivität aufweist und

i) das durch eine DNA-Sequenz kodiert ist, die mindestens eine der folgenden Teilsequenzen aufweist, oder das in mindestens einer der folgenden Teilsequenzen enthalten ist:

oder durch eine dazu homologe Sequenz, die ein Polypeptid mit Endoglucanase-Aktivität kodiert,
ii) das immunologisch reaktiv ist mit einem Antikörper, der zur Erkennung einer hochreinen Endoglucanase hergestellt ist, die kodiert ist durch eine unter i) definierte DNA-Sequenz und sich ableitet von Aspergillus aculeatus, CBS 101.43, und/oder
iii) das spezifisch für Xyloglucan ist.

Vorliegend soll der Begriff „spezifisch für Xyloglucan" die Tatsache bezeichnen, daß das Enzym eine hohe Aktivität auf einem Xyloglucan-Substrat zeigt und eine, wenn überhaupt, nur niedrige Aktivität auf anderen Cellulose enthaltenden Substraten wie beispielsweise Carboxymethylcellulose, Cellulose oder anderen Glucanen.
Die Spezifität einer Endoglucanase gegenüber Xyloglucan kann definiert werden als relative Aktivität, bestimmt als die Freisetzung von reduzierenden Zuckern bei optimalen Bedingungen, die erhalten wird durch Inkubation des Enzyms mit Xyloglucan bzw. mit dem anderen zu testenden Substrat. Die Spezifität kann beispielsweise definiert werden als Xyloglucan-Aktivität zu β-Glucan-Aktivität (XGU/BGU) oder als Xyloglucan-Aktivität zu Carboxymethylcellulose-Aktivität (XGU/CMCU) oder als Xyloglucan-Aktivität zu säuregequollenes Avicell-Aktivität (XGU/AVIU).
In der folgenden Offenbarung wird das Enzym, das durch die obenstehenden Eigenschaften i) – iii) definiert ist, als Endoglucanase Typ II oder kurz Endoglucanase II oder EG II bezeichnet.
Vorliegend soll der Begriff „sich ableitet von " nicht nur eine Endoglucanase bezeichnen, die durch den Stamm CBS 101.43 hergestellt wurde, sondern auch eine Endoglucanase, die durch eine DNA-Sequenz kodiert ist, welche aus dem Stamm CBS 101.43 isoliert und in einem Wirtsorganismus mit genannter DNA-Sequenz transformiert wurde.
Vorliegend soll der Begriff „homolog" ein Polypeptid bezeichnen, das durch DNA kodiert wird, welche unter bestimmten spezifischen Bedingungen (wie beispielsweise Voreinweichen in SxSSC und Vorhybridisieren für 1 h bei ∼40°C in einer Lösung aus 5 × SSC, 5 × Denhardts Lösung, und 50 μg einer denaturierten, mit Ultraschall behandelten Kalbthymus-DNA, gefolgt von einer Hybridisierung für 18 h bei ∼40°C in der gleichen Lösung, ergänzt mit 50 μCi einer 32-P-dCTP markierten Sonde, und dreimaligem Waschen in 2 × SSC, 0,2% SDS, bei 40°C für 30 Minuten) mit der selben Sonde hybridisiert ist wie die DNA, die ein erfindungsgemäßes Endoglucanase-Enzym kodiert. Bevorzugt soll der Begriff eine DNA-Sequenz bezeichnen, die zu mindestens 70%, wie beispielsweise zu mindestens 75%, zu mindestens 80%, zu mindestens 85%, zu mindestens 90% oder sogar zu mindestens 95% zu irgend einer der oben genannten Sequenz homolog ist, welche eine erfindungsgemäße Endoglucanase kodiert. Der Begriff soll Modifikationen irgend einer der oben genannten DNA-Sequenzen einschließen, wie beispielsweise Nukleotid-Substitutionen, die nicht zu einer anderen Aminosäuresequenz des durch die Sequenz kodierten Polypeptids führen, die aber der Codon-Verwendung des Wirtsorgansimus entsprechen, in die das DNA-Konstrukt, umfassend irgend eine der DNA-Sequenzen, eingeführt wird, oder Nukleotidsubstitutionen, die zu einer unterschiedlichen Aminosäuresequenz und daher, möglicherweise, zu einer unterschiedlichen Proteinstruktur führen, die zu einer Endoglucanase-Mutante mit anderen Eigenschaften als das ursprüngliche Enzym führen könnte. Weitere Beispiele möglicher Modifikationen sind die Insertion eines oder mehrerer Nukleotide in die Sequenz, Addition eines oder mehrerer Nukleotide an einem der Sequenz-Enden oder die Deletion eines oder mehrerer Nukleotide von einem der Sequenz-Enden oder innerhalb der Sequenz.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung sowohl ein Enzympräparat zum Abbau von Bestandteilen von Pflanzenzellwänden, das an einem Enzym angereichert ist, welches eine wie oben beschriebene Endoglucanase-Aktivität zeigt, als auch verschiedene Verwendungen dieses Enzym-Präparates.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Hinsichtlich des Endoglucanase-Typs II der vorliegenden Erfindung wurde herausgefunden, daß dieser eine überraschend hohe Spezifität für Xyloglucan und eine sehr hohe spezifische Aktivität gegenüber diesem Substrat aufweisen.
Endoglucanase-Typ II der vorliegenden Erfindung weist bevorzugt ein XGUBGU-, XGU/CMU- und/oder XGU/AVIU-Verhältnis (wie oben definiert) von mehr als 50, wie beispielsweise 75, 90 oder 100, auf.
Weiterhin weist der Endoglucanase-Typ II bevorzugt im wesentlichen keine Aktivität gegenüber β-Glucan und/oder höchstens 3%, wie beispielsweise höchstens 2% oder ungefähr 1% Aktivität gegenüber Carboxymethylcellulose und/oder Avicell auf, wenn die Aktivität gegenüber Xyloglucan 100% beträgt. Daneben weist der erfindungsgemäße Endoglucanase-Typ II bevorzugt im wesentlichen keine Transferase-Aktivität auf, eine Aktivität, die bei den meisten Xyloglucan-spezifischen Endoglucanasen pflanzlichen Ursprungs beobachtet wurde.
Wie aus den folgenden Beispielen ersichtlich wird, kann die Endoglucanase vom Typ II der vorliegenden Erfindung aus der Pilzspezies A. aculeatus erhalten werden. Microbielle Endoglucanasen mit einer Spezifität vom Endoglucanase II-Typ wurden bisher noch nicht beschrieben. Xyloglucan-spezifische Endoglucanasen aus Pflanzen wurden beschrieben, doch weisen diese Enzyme Transferase-Aktivität auf und müssen daher den microbiellen Xyloglucan-spezifischen Endoglucanasen als immer dann unterlegen angesehen werden, wenn extensiver Abbau von Xyloglucan erwünscht ist. Ein weiterer Vorteil eines mikrobiellen Enzyms ist im allgemeinen, daß es in einem mikrobiellen Wirt in größeren Mengen hergestellt werden kann als Enzyme anderen Ursprungs.
Ein erfindungsgemäßes Enzym kann mittels eines allgemeinen Verfahrens isoliert werden, das

– Klonen einer DNA-Bank aus Aspergillus spp. in geeigneten Vektoren,
– Transformieren geeigneter Hefewirtszellen mit diesen Vektoren,
– Kultivieren der Wirtszellen unter geeigneten Bedingungen, um ein beliebiges interessierendes Enzym durch einen Klon in der DNA-Bank zu exprimieren,
– Screening nach positiven Klonen durch Bestimmung jeglicher Endoglucanase-Aktivität des durch solche Klone hergestellen Enzyms beinhaltet.

Eine detailliertere Beschreibung dieser Screening-Methode ist weiter unten in Beispiel 1 angegeben.
Die DNA-Sequenzkodierung des Enzyms kann beispielsweise durch Screening einer cDNA-Bank von Aspergillus aculeatus, z. B. eines CBS 101.43-Stamms, im Handel erhältlich vom Centraalbureau voor Schimmelcultures, und durch Selektieren nach Klonen, die die geeignete Enzymaktivität exprimieren (d. h. Endoglucanase-Aktivität, definiert über die Fähigkeit des Enzyms, β-1,3- und/oder β-1,4-Bindungen zwischen zwei Glucosemolekülen in Glucose enthaltenden Polymeren (z. B. Cellulose, Getreide-β-Glucane oder Xyloglucane) zu hydrolisieren) isoliert werden. Die geeignete DNA-Sequenz kann dann aus dem Klon über Standardverfahren, wie beispielsweise in Beispiel 1 beschrieben, isoliert werden. Es wird erwartet, daß eine DNA-Sequenzkodierung eines homologen Enzyms durch in ähnlicher Weise erfolgendes Screening einer cDNA-Bank eines anderen Mikroorganismus, insbesondere eines Pilzes wie beispielsweise eines Stammes von Aspergillus, insbesondere A. aculeatus oder A. niger, eines Stammes von Trichoderma, insbesondere T. harzianum, T. reesie, eines Stammes von Fusarium, insbesondere F. oxysporum oder eines Stammes von Humicola abgeleitet werden kann.
Alternativ kann die DNA-Kodierung einer erfindungsgemäßen Endoglucanase gemäß bekannter Verfahren in herkömmlicher Weise aus DNA von irgend einem der oben genannten Organismen isoliert werden, indem Oligonucleotid-Sonden wie beispielsweise 20mer-Sonden verwendet werden, die auf der Basis einer hierin offenbarten DNA-Sequenz hergestellt wurden. Eine geeignete Oligonucleotid-Sonde kann beispielsweise auf der Basis irgend einer der oben aufgeführten Teilnukleotidsequenzen a)–p) hergestellt werden.
Die DNA-Sequenz kann nachfolgend in einem rekombinanten Expressionsvektor eingebaut werden. Dieser kann jeder Vektor sein, der in herkömmlicher Weise rekombinanter DNA-Verfahren unterworfen werden kann, und die Auswahl des Vektors wird oftmals von der Wirtszelle abhängen, in die er eingeführt werden soll. Demgemäß kann der Vektor ein autonom replizierender Vektor sein, d. h. ein Vektor, der als extrachromosomale Einheit exisitert, deren Replikation unabhängig von der chromosomalen Replikation ist, z. B. ein Plasmid. Alternativ kann es ein Vektor sein, der, wenn er in eine Wirtszelle eingeführt wird, in das Wirtszellengenom integriert und zusammen mit dem Chromosom/den Chromosomen repliziert wird, in das/die er eingebaut wurde.
In dem Vektor sollte die DNA-Sequenzkodierung funktional mit einer geeigneten Promotorund einer Terminatorsequenz verbunden sein. Der Promotor kann jede DNA-Sequenz sein, die in der gewählten Wirtszelle Transskriptionsaktivität zeigt, und kann von Genen abgeleitet sein, die Proteine kodieren, die zur Wirtszelle entweder homolog oder heterolog sind. Die zur Ligation der DNA-Sequenzkodierung der Endoglucanase, des Promotors beziehungsweise des Terminators, und zu deren Insertion in geeignete Vektoren verwendeten Verfahren sind dem Fachmann bekannt (siehe beispielsweise Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
Die Wirtszelle, die mit der DNA-Sequenz transformiert wird, die das erfindungsgemäße Enzym kodiert, ist bevorzugt eine eukaryotische Zelle, insbesondere eine Pilzzelle wie beispielsweise eine Hefezelle oder eine filamentöse Pilzzelle. Insbesondere kann die Zelle zur Spezies von Aspergillus, besonders bevorzugt von Aspergillus oryzae oder Aspergillus niger gehören. Pilzzellen können mittels eines Verfahrens transformiert werden, das Protoplastenbildung und Transformation der Protoplasten, gefolgt von Regeneration der Zellwand in einer per se bekannten Art und Weise beinhaltet. Die Verwendung von Aspergillus als Wirtsorganismus ist in EP 238 023 (Novo Nordisk A/S) beschrieben, deren Inhalt durch Bezugnahme hierin einbezogen wird. Die Wirtszelle kann auch eine Hefezelle, z. B. ein Stamm von Saccharomyces, insbesondere Saccharomyces cerevisiae sein.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Enzyms, in dem eine geeignete Wirtszelle, die mit einer das Enzym kodierenden DNA-Sequenz transformiert wurde, unter Bedingungen, die die Herstellung des Enzyms gestatten, kultiviert wird und das resultierende Enzym aus der Kultur gewonnen wird.
Das zur Kultivierung der transformierten Wirtszellen verwendete Medium kann irgend ein herkömmliches Medium sein, daß zum Wachstum der fraglichen Wirtszellen geeignet ist. Die exprimierte Endoglucanase kann in herkömmlicher Weise in das Kulturmedium sezerniert werden und daraus über bekannte Verfahren gewonnen werden, die die Separation der Zellen vom Medium durch Zentrifugieren oder Filtrieren, Ausfällen von Proteinkomponenten des Mediums durch ein Salz wie beispielsweise Ammoniumsulfat, gefolgt von chromatographischen Verfahren wie beispielsweise Ionenaustausch-Chromatographie, Affinitätschromatographie oder ähnliche beinhalten.
Die derart gereinigte Endoglucanase kann bei der Immunisierung von Tieren zur Herstellung von Antikörpern eingesetzt werden. Insbesondere kann Antiserum zur Erkennung der Endoglucanase durch Immunisierung von Kaninchen (oder anderen Nagern) gemäß dem von N. Axelsen et al. in: A Manual of Quantitatve Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, Kapitel 23, oder von A. Johnstone und R. Thorpe, Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific Publications, 1982 (insbesondere S. 27–31) beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Gereinigte Immunoglobuline können aus den Antiseren beispielsweise durch Salzfällung ((NH₄)₂SO₄), gefolgt von Dialyse und Ionenaustauschchromatographie, z. B. auf DEAE-Sephadex, erhalten werden. Immunochemische Charakterisierung der Proteine kann entweder mittels Outcherlony-Doppeldiffusionsanalyse (O. Outcherlony in: Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir, Hrsg.), Blackwell Scientific Publications, 1967, S. 655–706), mittels Crossed-Immunoelektrophorese (N. Axelsen et al., supra, Kapitel 3 und 4) oder mittels Rocket-Immunoelektrophorese (N. Axelsen et al., Kapitel 2) erfolgen.
Die erfindungsgemäßen Endoglucanasen können im wesentlichen frei von anderen pflanzenzellwandabbauenden Enzymen hergestellt werden. Dadurch wird es ermöglicht, die Enzyme allein oder zusammen mit anderen Enzymen wie beispielsweise Galactanasen und Xylanasen zu verwenden, um die optimale Kombination von Enzymen für eine bestimmte Anwendung bereitzustellen. Hierbei ist es möglich, Enzymkombinationen zu designen, die nur bestimmte Teile der Pflanzenzelle abbauen. Vordem war es nicht möglich, diesen spezifischen Abbau mit kommerziell erhältlichen Cellulase-, Hemicellulase- und/oder Pektinase-Präparaten zu erhalten.
Die vorliegende Erfindung stellt Endoglucanasen mit einem breiten Spezifitätsbereich zur Verfügung. Demgemäß wurde gefunden, daß die erfindungsgemäße Endoglucanase vom Typ II hochspezifisch für Xyloglucan ist.
Dies macht die Endoglucanasen (entweder allein oder in Kombination) für Anwendungen nützlich, bei denen die Modifikation oder der volle oder teilweise Abbau von Cellulose, Xyloglucanen oder Derivaten dieser Substrate erwünscht ist.
Die Aktivität von erfindungsgemäßen Endoglucanase Typ II-Enzymen gegenüber Xyloglucanen und die Aktivität von Endoglucanase Typ N-Enzymen gegenüber Cellulose sind nützlich zur Behandlung von Obst und Gemüse. Die Endoglucanasen können beispielsweise bei der Behandlung von z. B. Apfel- und Birnenbrei bei der Saftherstellung mit hohen Ausbeuten verwendet werden. Die Säfte können in Abhängigkeit von der eingesetzten Enzymkombination in klarer oder trüber Form hergestellt werden. Die Endoglucanasen können bei der Behandlung von Traubenmaische zur Erzielung von höheren Ausbeuten und besserem Aroma und besserer Farbe von Wein verwendet werden. Die Endoglucanasen können zur Vereinfachung der Pektinextraktion aus z. B. Zitrusschalen, Äpfeln oder Zuckerrüben und zur Reinigung anderer industrieller Gummi wie beispielsweise Guargummi und Johannisbrotgummi verwendet werden, weil die rekombinanten Enzyme den Vorteil aufweisen, frei von pekinolytischen Enzymen oder Gummi abbauenden Enzymen wie beispielsweise Endomannanasen hergestellt werden zu können.
Die Hemicellulose wie Xyloglucan muß aus Pflanzenfasern wie Baumwolle, Flachs, Hanf und Jute entfernt werden, bevor diese für Textilien verwendet werden können. Hierfür bietet Endoglucanase vom Typ II den Vorteil, daß sie das Xyloglucan ohne Beeinträchtigung der Cellulose spezifisch entfernt. Diese Endoglucanase kann allein oder zusammen mit anderen, gegenüber Pektinsubstanzen auf den Fasern aktiven Enzymen (z. B. Pektinasen) verwendet werden.
Weiterhin können erfindungsgemäße Endoglucanasen oder Analoga davon eingesetzt werden, um Cellulosefasern oder an Cellulosefasern reiches Material zu behandeln. Die Endoglucanasen können z. B. in der Papierindustrie zur Verbesserung der Entwässerung von Pulpe und zur Behandlung von Geweben wie beispielsweise Baumwollgeweben zum Erhalt eines weicheren Gewebes verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Endoglucanasen können auch verwendet werden, um Oligosaccharide aus z. B. pflanzlichem Material mit gemischtem β-1,3-1,4-Glucan und Xyloglucan herzustellen. Die erhaltenen Oligosaccharide können als Füllstoffe in beispielsweise Nahrungsmitteln verwendet werden.
Gemäß obigem ist ein bevorzugter Typ von erfindungsgemäßem Enzympräparat ein Enzympräparat, das an erfindungsgemäßer Endoglucanase, z. B. Endoglucanase vom Typ II angereichert ist, vorzugsweise mit einem Anreicherungsfaktor von mindestens 1,1. Dadurch kann eine Steigerung der Fähigkeit des Enzympräparats, Pflanzenzellwände abzubauen, erreicht werden.
Das Enzympräparat, das an erfindungsgemäßem Enzym angereichert wurde, kann z. B. ein Enzympräparat, das mehrfache enzymatische Aktivitäten umfaßt, und insbesondere ein Enzympräparat sein, das mehrfache pflanzenzellwandabbauende Enzyme wie beispielsweise Pectinex®, Pectinex Ultra SP®, Celluclast oder Celluzyme (alle von Novo Nordisk A/S erhältlich) umfaßt. Vorliegend soll der Begriff „angereichert" bedeuten, daß die Endoglucanase-Aktivität des Enzympräparats in herkömmlicher Weise mittels Zugabe eines erfindungsgemäßen, über die oben beschriebene Methode hergestellten Enzyms erhöht wurde, wie z. B. mit einem Anreicherungsfaktor von 1,1.
Alternativ kann das an einem Endoglucanase-Aktivität aufweisendem Enzym angereicherte Enzympräparat ein Präparat sein, das ein erfindungsgemäßes Enzym als enzymatischen Hauptbestandteil umfaßt, wie z. B. ein Einkomponenten-Enzympräparat.
Das Enzympräparat kann nach im Stand der Technik bekannten Methoden hergestellt werden und kann in Form eines flüssigen oder trockenen Präparats vorliegen. Beispielsweise kann das Enzympräparat in Form eines Granulats oder eines Mikrogranulats vorliegen. Das Enzym, das in dem Präparat enthalten sein soll, kann gemäß im Stand der Technik bekannter Methoden stabilisiert werden.
Das erfindungsgemäße Präparat kann zusätzlich zu einer erfindungsgemäßen Endoglucanase ein oder mehrere andere pflanzenzellwandabbauende Enzyme, beispielsweise jene mit cellulytischen, xylanolytischen oder pektinolytischen Aktivitäten wie beispielsweise Xylanase, Arabinanase, Rhamnogalacturonase, Pektinacetylesterase, Galactanase, Polygalacturonase, Pektinlyase, Pektatlyase, Endoglucanase oder Pektinmethylesterase, enthalten. Das zusätzliche Enzym bzw. die zusätzlichen Enzyme kann/können mittels Mikroorganismen, die zu der An Aspergillus, vorzugsweise Aspergillus niger, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori oder Aspergillus oryzae gehören, herstellbar sein. Solch ein Präparat ist in der Lage, eine außergewöhnliche gute Gesamtverflüssigungskraft und damit einen deutlichen Viskositätsabfall von Apfelbrei oder ähnlichem biologischem Material bereitzustellen.
Selbstverständlich kann das Enzympräparat für die oben genannten Zwecke eingesetzt werden. In diesem Zusammenhang können die Dosierung des erfindungsgemäßen Enzympräparats und weitere Bedingungen, unter denen das Präparat eingesetzt wird, auf der Basis von im Stand der Technik bekannten Methoden bestimmt werden.
Die Gesamtverflüssigungskraft des Enzympräparats wird als Abfall der Gesamtviskosität (= eine Funktion der Serums- + Struktur-Viskosität) in einem fein gemahlenen Apfelbrei durch kontinuierliche Aufzeichnung über 2 Stunden mittels eines Rotationsviskosimeters bestimmt.
Die Erfindung wird weiterhin in den beiliegenden Zeichnungen beschrieben, bei denen
1 eine Restriktionskarte des Plasmids pYHD 17 ist,
2 eine Restriktionskarte des Plasmids pHD 414 ist,
3 die pH-Optima für EG II, EG III und EG IV beschreibt, die in Citrat/Phosphat-Puffern gemessen wurden. Die optimale Aktivität für jedes Enzym wird als 100% definiert,
4 die pH-Stabilität für EG II und EG III zeigt, die als Restaktivität nach 1 Stunde bei unterschiedlichen pH-Werten, verglichen mit der Aktivität des frischen Enzyms, gemessen wurden,
5 das Temperaturoptimum für EG II und EG III zeigt. Die optimale Temperatur für jedes Enzym wird als 100% definiert, und
6 die Temperaturstabilität von EG II und EG III zeigt, die als Restaktivität nach Vorinkubation in Wasser für 1 Stunde bei verschiedenen Temperaturen, verglichen mit der Aktivität von frischem Enzym (100%), gemessen wurde.
Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen genauer beschrieben, die in keiner Weise den Umfang der beanspruchten Erfindung beschränken sollen.
MATERIALIEN UND METHODEN
Donor-Organismus: mRNA wurde aus Aspergillus aculeatus, CBS 101.43, isoliert und unter Rühren, um ausreichende Luftzufuhr zu gewährleisten, in einem Soja enthaltenden Fennentationsmedium wachsen gelassen. Mycelien wurden nach 3-5-tägigem Wachstum geerntet, in flüssigem Stickstoff sofort tiefgefroren und bei –80°C gelagert.
Hefestämme: Der verwendete Saccharomyces cerevisiae-Stamm war yNG231 (MAT alpha, leu2, ura3-52, his4-539, pep4-delta 1, cir+) oder JG169 (MATα; ura 3-52; leu 2-3, 112; his 3-D200; pep4-113; prcl::HIS3; prbl:: LEU2; cir+).
Aufbau eines Ezpressionsplasmids: Das kommerziell erhältliche Plasmid pYES II (Invitrogen) wurde mit Spel verdaut, mit Klenow DNA-Polymerase + dNTP aufgefüllt und mit ClaI verdaut. Die DNA wurde auf Agarosegel der Größe nach aufgetrennt, und ein Bruchstück von etwa 2000 bp wurde mittels Elektroelution gereinigt. Das selbe Plasmid wurde mit ClaI/PvuII verdaut, und ein Fragment von etwa 3400 bp wurde mittels Elektroelution gereinigt. Die beiden Fragmente wurden an ein SphI/EcoRI-Fragment mit glatten Enden, das den Hefepromotor enthielt, ligiert. Diese Fragment wurde aus einem Plasmid isoliert, in dem der TPI-Promotor aus S. cerevisiae (siehe T. Albers und G. Kawasaki, J. Mol. Appl. Genet. 1, 1982, S. 419–434) geringfügig modifiziert wurde: eine interne SphI-Schnittstelle wurde durch Entfernen der vier bp, die den Kern dieser Schnittstelle bildeten, entfernt. Weiterhin wurden redundante Sequenzen oberhalb des Promotors durch Ball-Exonuclease-Behandlung entfernt, gefolgt von Addition eines SphI-Linkers. Zuletzt wurde ein EcoRI-Linker an der Position –10 addiert. Nach diesen Modifikationen wurde der Promotor in ein SphI-EcoRI-Fragment eingebaut. Seine Wirksamkeit scheint im Vergleich mit dem Originalpromotor durch die Modifikation nicht beeinträchtigt zu sein. Das erhaltene Plasmid pYHD 17 ist in 1 gezeigt.
Herstellung von RNase-freien Glas, Spitzen und Lösungen: Jegliches bei den RNA-Isolierungen verwendete Glas wurde bei 220°C für mindestens 12 h erhitzt. Eppendorf-Reaktionsgefäße, Pipettenspitzen und Plastiksäulen wurden in 0,1% Diethylpyrocarbonat (DEPC) in EtOH für 12 h behandelt und autoklaviert. Alle Puffer und das Wasser (bis auf Tris enthaltende Puffer) wurde in 0,1% DEPC für 12 h bei 37°C behandelt und autoklaviert.
Extraktion der Gesamt-RNA: Die Gesamt-RNA wurde durch Extraktion mit Guanidinthiocyanat, gefolgt von Ultrazentrifugation durch eine 5,7 M CsCl-Säule (Chirgwin et al., 1979) mit folgenden Modifikationen hergestellt. Die tiefgefrorenen Mycelien wurden in flüssigem N₂ mit einem Mörser und einem Pistill zu einem feinen Pulver gemahlen, im folgenden in einer vorgekühlten Kaffeemühle gemahlen und unmittelbar anschließend in 5 Volumenteilen eines RNA-Extraktionspuffers (4 M GuSCN, 0,5% Na-Laurylsarcosin, 25 mM Na-Citrat, pH 7,0, 0,1 M β-Mercaptoethanol) suspendiert. Die Mischung wurde 30 min bei RT° gerührt und zentrifugiert (30 min, 5000 U/min, RT°, Heraeus Megafuge 1.0 R), um die Zelltrümmer zu sedimentieren. Der Überstand wurde gesammelt, vorsichtig auf eine 5,7 M CsCl-Säule (5,7 M CsCl, 0,1 M EDTA, pH 7,5, 0,1% DEPC; vor Verwendung autoklaviert) geschichtet, wobei 26,5 ml Überstand pro 12,0 ml CsCl-Säule verwendet wurden, und zentrifugiert, um die Gesamt-RNA zu erhalten (Beckmann, SW 28 Rotor, 25000 U/min, RT°, 24 h). Nach dem Zentrifugieren wurde der Überstand vorsichtig entfernt und der Boden des Reaktionsgefäßes, der das RNA-Pellet enthielt, wurde abgeschnitten und mit 70% EtOH gespült. Das Gesamt-RNA-Pellet wurde in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt, in 500 μl TE, pH 7,6 suspendiert (falls Schwierigkeiten auftreten, gelegentlich für 5 min auf 65°C erwärmen), mit Phenol extrahiert und für 12 h bei –20°C ethanolgefällt (2,5 Volumenteile EtOH, 0,1 Volumenteile 3M NaAc, pH 5,2). Die RNA wurde durch Zentrifugieren gesammelt, in 70% EtOH gewaschen und in einem Minimalvolumen an DEPC-DIW resuspendiert. Die RNA-Konzentration wurde über Messung von OD_260/280 bestimmt.
Isolierung von Poly(A)⁺RNA: Die Poly(A)⁺RNAs wurden mittels Oligo(dT)-Cellulose-Affinitätschromatographie (Aviv & Leder, 1972) isoliert. Typischerweise wurden 0,2 g Oligo(dT)-Cellulose (Boehringer Mannheim) in 10 ml eines 1 × Säulenbeladungspuffers (20 mM Tris-Cl, pH 7,6, 0,5 M NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% SDS) vorgequollen, auf eine DEPCbehandelte, zugestöpselte Plastiksäule (Poly Prep Chromatography Column, Bio Rad) geladen und mit 20 ml 1 × Beladungspuffers equilibriert. Die Gesamt-RNA wurde für 8 min bei 65°C erwärmt, für 5 min auf Eis gequencht und nach Zugabe von 1 Volumenteil 2 × Säulenbeladungs-Puffer zur RNA-Probe auf die Säule geladen. Das Eluat wurde gesammelt und 2–3 mal wieder auf die Säule geladen, wobei die Probe vor jedem Laden wie oben erwärmt und auf Eis gequencht wurde. Die Oligo(dT)-Säule wurde mit 10 Volumenteilen eines 1 × Beladungs-Puffers gewaschen, dann mit 3 Volumenteilen eines Mittelsalzpuffers (20 mM Tris-Cl, pH 7,6, 0,1 M NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% SDS) gewaschen, gefolgt von der Eluierung der Poly(A)⁺RNA mit 3 Volumenteilen eines Eluierungspuffers (10 mM Tris-Cl, pH 7,6, 1 mM EDTA, 0,05% SDS), der auf 65 vorgewärmt war, wobei 500 μl-Fraktionen gesammelt wurden. Der OD₂₆₀ wurde für jede der gesammelten Fraktionen abgelesen, und die die mRNA enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und bei –20°C für 12 h ethanolgefällt. Die Poly(A)⁺RNA wurde durch Zentrifugation gesammelt, in DEPC-DIW resuspendiert und bei –80°C in 5–10 μg Aliquots gelagert.
Northern Blot-Analyse: Die Poly(A)⁺RNAs (5 μm/Probe) aus verschiedenen Mycelien wurde in 1,2 Agarose-2,2 M Formaldehyd-Gelen (Sambrook et al., 1989) elektrophoresiert und mit 10 × SSC (Sambrok et al., 1989) als Transferpuffer auf Nylonmembranen (Hybond-N, Amersham) geblottet. Drei randomgeprimete (Feinberg & Vogelstein, 1983) ³²P-markierte cDNA-Sonden wurden bei individuellen Hybridisierungen verwendet: 1) ein 1,3 kb Not I-Spe I-Fragment für Polygalacturonase I aus A. aculeatus (beschrieben in der dänischen Patentanmeldung DK 1545/92), 2) ein 1,3 kb Not I-Spe I-Fragment aus A. aculeatus (wie in DK 0419/92 beschrieben), das Endoglucanase I kodiert, und 3) ein 1,2 kb Eag I-Fragment für Galactanase I aus A. aculeatus (beschrieben in WO 92/13945). Northern-Hybridisierungen wurden in 5 × SSC (Sambrook et al., 1989), 5 × Denhardts Lösung (Sambrook et al., 1989), 0,5% SDS (w/v) und 100 μg/ml denaturierte Lachs-Sperma-DNA mit einer Sonden-Konzentration von ca. 2 ng/ml für 16 h bei 65°C durchgeführt, gefolgt von Waschvorgängen in 5 × SSC bei 65°C (2 × 15 min), 2 × SSC, 0,5% SDS (1 × 30 min), 0,2 × SSC, 0,5% SDS 9 (1 × 30 min), und 5 × SSC (2 × 15 min). Nach Autoradiographie bei –80°C für 12 h wurde die Sonde #1 gemäß den Herstellerangaben aus dem Filter entfernt und mit Sonde #2 und schließlich mit Sonde #3 rehybridisiert. Die RNA-Leiter von Bethesda Research Laboratories wurde als Größen-Marker verwendet.
cDNA-Synthese
Erststrang-Synthese: Doppelstrang-cDNA wurde aus 5 μg von A. aculeatus Poly(A)+RNA mittels der RNase H-Methode (Gubler & Hoffinann 1983, Sambrook et al., 1989) unter Verwendung der Hairpin-Modifikation synthetisiert. Die Poly(A)⁺RNA (5 μg in 5 μl DEPC-behandelten Wassers) wurde bei 70°C für 8 min erwärmt, auf Eis gequencht und auf ein Endvolumen von 50 μl mit reverser Transskriptase-Puffer (50 mM Tris-Cl, pH 8,3, 75 mM KCl, 3 mM MgCl₂, 10 mM DTT, Bethesda Research Laboratories), der jeweils 1 mM dNTP (Pharmacia), 40 Einheiten menschlichen Placenta-Ribonuclease-Inhibitors (RNasin, Promega), 10 μg Oligo(dT)_12-18-Primer (Pharmacia) und 1000 Einheiten SuperScript II RNase H-Revers-Transskriptase (Bethesda Research Laboratories) enthält, gemischt. ErststrangcDNA wurde durch Inkubation der Reaktionsmischung bei 45°C für 1 h synthetisiert.
Zweitstrang-Synthese: Nach der Synthese wurden 30 μl 10 mM Tris-Cl, pH, 7,5, und 1 mM EDTA zugegeben, und die mRNA:cDNA-Hybride wurden mit Ethanol für 12 h bei –20°C durch Zugabe von 40 μg Glykogen-Canier (Boehringer Mannheim), 0,2 Volumenteilen 10 M NH₄Ac und 2,5 Volumenteilen 96% EtOH gefällt. Die Hybride wurden durch Zentrifugation gewonnen, in 70% EtOH gewaschen, an der Luft getrocknet und in 250 μl eines Zweitstrang-Puffers (20 mM Tris-Cl, pH 7,4, 90 mM KCl, 4,6 mM MgCl₂, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 10 μM βNAD⁺), der jeweils 100 μM dNTP, 44 Einheiten E. coli-DNA-Polymerase I (Amersham), 6,25 Einheiten RNase H (Bethesda Research Laboratories) und 10,5 Einheiten E. coli-DNA-Ligase (New England Biolabs) enthielt, resuspendiert.
Zweitstrang-cDNA-Synthese wurde durch Inkubation des Reaktionsgefäßes bei 16°C für 3 h durchgeführt, und die Reaktion wurde durch Zusatz von EDTA auf 20 mM Endkonzentration gestoppt, gefolgt von einer Phenolextraktion.
Mungbohnen-Nuclease-Behandlung: Die Doppelstrang (ds)-cDNA wurde mit Ethanol bei –20°C für 12 h durch Zusatz von 2 Volumenteilen 96% EtOH, 0,1 Volumenteilen 3 M NaAc, pH 5,2 gefällt, durch Zentrifugation gewonnen, in 70% EtOH gewaschen, getrocknet (SpeedVac) und in 30 μl Mungbohnen-Nuclease-Puffer (30 mM NaAc, pH 4,6, 300 mM NaCl, 1 mM ZnSO₄, 0,35 mM DTT, 2% Glycerin), der 36 Einheiten Mungbohnen-Nuclease (Bethesda Research Laboratories) enthielt, resuspendiert. Die Einzelstrang-Hair pin-DNA wurde durch Inkubation der Reaktion bei 30°C für 30 min geschnitten, gefolgt vom Zusatz von 70 μl 10 mM Tris-Cl, pH 7,5, 1 mM EDTA, Phenolextraktion, und Ethanolfällung mit 2 Volumenteilen 96% EtOH und 0,1 Volumenteilen 3 M NaAc, pH 5,2, bei –20°C für 12 h.
Versehen mit glatten Enden mittels T4 DNA-Polymerase: Die ds-cDNA wurde mittels T4 DNA-Polymerase in 50 μl T4 DNA-Polymerase-Puffer (20 mM Tris-Acetat, pH 7,9, 10 mM MgAc, 50 mM KAc, 1 mM DTT), der jeweils 0,5 mM dNTP und 7,5 Einheiten T4 DNA-Polymerase (Invitrogen) enthielt, mit glatten Enden versehen, indem die Reaktionsmischung bei 37°C für 15 min inkubiert wurde. Die Reaktion wurde durch Zugabe von EDTA auf eine Endkonzentration von 20 mM gestoppt, gefolgt von Phenolextraktion und Ethanolfällung.
Adaptor-Ligation und Größenselektion: Nach der Auffüll-Reaktion wurde die cDNA in 30 μl Ligationspuffer (50 mM Tris-Cl, pH 7,8, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 1 mM ATP, 25 μg/ml Rinderserum-Albumin), der 600 pmol BstX I-Adaptoren und 5 Einheiten T4-Ligase (Invitrogen) enthielt, an nicht-palindromische BstX I-Adaptoren (1 μg/μl, Invitrogen) ligiert, indem die Reaktionsmischung bei 16°C für 12 h inkubiert wurde. Die Reaktion wurde durch Erwärmen auf 70°C für 5 min gestoppt, und die adaptierte cDNA wurde durch Agarosegel-Elektrophorese (0,8% HSB-Agarose, FMC) der Größe nach aufgetrennt, um nicht ligierte Adaptoren und kleine cDNAs abzutrennen. Die cDNA wurde mittels Cut-Off bei 0,7 kb größenselektiert, und die cDNA aus dem Agarosegel in 10 mM Tris-Cl, pH 7,5, 1 mM EDTA für 1 h bei 100 Volt elektroeluiert, phenolextrahiert und bei –20°C für 12 h wie oben ethanolgefällt.
Aufbau von cDNA-Bänken: Die adaptierte ds-cDNA wurde durch Zentrigugation gewonnen, in 70% EtOH gewaschen und in 25 ml DIW resuspendiert. Vor der Bank-Ligation in großem Maßstab wurden vier Test-Ligationen in 10 μl Ligations-Puffer (wie oben) durchgeführt, wobei jeder 1 μl ds-cDNA (Reaktionsgefäße #1–#4), 2 Einheiten T4-Ligase (Invitrogen) und 50 ng (Gefäß #1), 100 ng (Gefäß #2) und 200 ng (Gefäße #3 und #4) Bst XI-verdauten Hefeexpressionsvektor (entweder pYES 2,0-Vektor Invotrogen oder yHDl3) enthielt. Die Ligationsreaktionen wurden durch Inkubation bei +16°C für 12 h durchgeführt, für 5 min bei 70°C erwärmt, und 1 μl jeder Ligation wurde electroporiert (200 Ω, 2,5 kV, 25 μF) auf 40 μl kompetente E. coli 1061-Zellen (OD600 = 0,9 in 1 Liter LB-Brühe, zweimal in kaltem DIW, einmal in 20 ml 10% Glycerin gewaschen, in 2 ml 10% Glycerin resuspendiert). Nach Zugabe von 1 ml SOC zu jeder Transformationsmischung wurden die Zellen bei 37°C für 1 h wachsen gelassen, 50 μl auf LB + Ampicillin-Platten (100 μg/ml) ausplattiert und bei 37°C für 12 h wachsen gelassen.
Bei optimalen Bedingungen wurde die Ligation in großem Maßstab in 40 μl Ligationspuffer vorbereitet, der 9 Einheiten T4-Ligase enthielt, und die Reaktion wurde bei 16°C für 12 h inkubiert. Die Ligationsreaktion wurde durch Erwärmen für 5 min auf 70°C gestoppt, bei –20 °C für 12 h ethanolgefällt, durch Zentrifugation gewonnen und in 10 μl DIW resuspendiert. 1 μl-Aliquots wurden unter Verwendung der gleichen Elektroporationsbedingungen wie oben in elektrokompente E. coli 1061-Zellen transformiert, und die transformierten Zellen wurden titriert und die Bank auf LB + Amicillin-Patten mit 5000–7000 c. f. u./Platte ausplattiert. Zu jeder Platte wurden 3 ml Medium gegeben. Die Bakterien wurden abgeschabt, 1 ml Glycerin wurde zugegeben und bei –80 C vereinigt und aufbewahrt. Die übrigen 2 ml wurden zur DNA-Isolierung verwendet. Im Falle, daß die DNA-Menge nicht ausreichte, um die erforderliche Anzahl an Hefe-Transformanten zu erhalten, wurde Großmaßstabs-DNA aus 500 ml Medium (TB) hergestellt, das bei –80°C mit 50 μl Bakterienstamm, der über Nacht wachsen gelassen wurde, geimpft wurde.
Aufbau von Hefe-Bänken: Um sicherzustellen, daß alle Bakterienklone in Hefe getestet wurden, wurde eine Anzahl an Hefe-Transformanten als Limit gesetzt, die fünfmal so groß war wie die Anzahl an Bakterienklonen in den ursprünglichen Pools.
1 μl-Aliquots gereinigter Plasmid-DNA (100 ng/μl) aus individuellen Pools wurden in 40 μl kompetenter S. cerevisiae JG 169-Zellen (OD600 = 1,5 in 500 ml YPD, zweimal in kaltem DIW, einmal in kaltem 1 M Sorbitol gewaschen, resuspendiert in 0,5 ml 1 M Sorbitol, Becker & Guarante, 1991) elektroporiert (200 Ω, 1,5 kV, 25 μF). Nach Zugabe von 1 ml 1 M kaltem Sorbitol wurden 80 μl-Aliquots auf SC + Glucose – Uracil ausplattiert, wobei 250–400 c. f. u. /Platte erhalten wurden, und für 3–5 Tage bei 30°C inkubiert.
Aufbau eines Aspergillus-Expressionsvektors: Der Vektor pHD414 ist ein Abkömmling des Plasmids p775 (beschrieben in EP 238 023 ). Im Gegensatz zu diesem Plasmid weist pHD 414 eine Reihe an je einmalig auftretenden Restriktionsstellen zwischen dem Promotor und dem Terninator auf. Das Plasmid wurde durch Entfernung eines ungefähr 200 bp langen Fragments (die unerwünschten RE-Stellen enthaltend) am 3'-Ende des Terminators und anschließender Entfernung eines ungefähr 250 bp langen Fragments am 5'-Ende des Promotors, ebenfalls unerwünschte Stellen enthaltend, aufgebaut. Der 200 bp-Bereich wurde durch Verdauen mit NarI (im pUC-Vektor positioniert) und Xbal (genau 3' zum Terminator), anschließendem Auffüllen der erzeugten Enden mit Iüenow DNA-Polymerase +dNTP, Reinigung des Vektorfragments auf Gel und Religation des Vektorfragments entfernt. Dieses Plasmid wurde pHD413 genannt. pHD413 wurde mit Stul (am 5'-Ende des Promotors positioniert) und PvuII (im pUC-Vektor) verdaut, auf Gel fraktioniert und religiert. Das Plasmid pHD 414 wird in 2 gezeigt, die eine Karte des Plamids pHD414 darstellt, wobei „AMG Terminator" den A. niger-Glucoamylase-Terminator bezeichnet und „TAKA Promoter" den A. oryzae-TAKA-Amylase-Promoter bezeichnet.
Transformation von Aspergillus oryzea oder Aspergillus niger (allgemeines Verfahren) 100 ml YPD (Sherman et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1981) wird mit Sporen von A. oryzea oder A. niger geimpft und unter Schütteln bei 37°C für ungefähr 2 Tage inkubiert. Das Mycel wird über Filtrieren durch Mira-Tuch geerntet und mit 200 ml 0,6 M MgSO₄ gewaschen. Das Mycel wird in 15 ml 1,2 M MgSO₄·10 mM NaH₂PO₄, pH 5,8 suspendiert. Die Suspension wird auf Eis gekühlt, und 1 ml Puffer, der 120 mg Novozym® 234, Batch 1687 enthält, wird zugegeben. Nach 5 Minuten wird 1 ml 12 mg/ml BSA (Sigma Typ H25) zugegeben, und die Inkubation wird unter sachtem Rühren für 1,5–2,5 Stunden bei 37°C fortgesetzt, bis eine große Anzahl an Protoplasten in einer unter dem Mikroskop untersuchten Probe sichtbar ist.
Die Suspension wird durch Mira-Tuch gefiltert, das Filtrat in ein steriles Gefäß überführt und mit 5 ml 0,6 M Sorbitol, 100 mM Tris-HCl, pH 7,0 überschichtet. Es wird 15 Minuten bei 100 g zentrifugiert, und die Protoplasten werden von der Spitze der MgSO₄-Säule gesammelt. 2 Volumenteile STC (1,2 M Sorbitol, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM CaCl₂) werden zur Protoplasten-Suspension zugegeben, und die Mischung wird für 5 Minuten bei 1000 g zentrifugiert. Das Protoplasten-Pellet wird in 3 ml STC resuspendiert und repelletiert. Dieser Vorgang wird wiederholt. Schließlich werden die Protoplasten in 0,2–1 ml STC resuspendiert.
100 μl Protoplasten-Suspension werden mit 5–25 μg der geeigneten DNA in 10 μl STC gemischt. Die Protoplasten werden mit p3SR2 (ein A. nidulans amdS-Gen tragendes Plasmid) gemischt. Die Mischung wird für 25 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. 0,2 ml 60 % PEG 4000 (BDH 29576), 10 mM CaCl₂ und 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 werden zugegeben und vorsichtig (zweimal) gemischt, und schließlich werden 0,85 ml derselben Lösung zugegeben und vorsichtig gemischt. Die Mischung wird bei Raumtemperatur für 25 Minuten stehengelassen, bei 2500 g für 15 Minuten rotiert, und das Pellet wird in 2 ml 1,2 M Sorbitol resuspendiert. Nach einer weiteren Sedimentation werden die Protoplasten auf die geeigneten Platten ausgebreitet. Protoplasten werden auf Minimalplatten ausgebreitet (Cove Biochem. Biophys. Acta 113 (1966) 51–56), die 1,0 M Sucrose, pH = 7,0, 10 mM Acetamid als Stickstoffquelle und 20 mM CsCl zur Inhibierung von Hintergrundwachstum enthalten. Nach Inkubation bei 37°C für 4–7 Tage werden die Sporen gepickt und für einzelne Kolonien ausgebreitet. Dieser Vorgang wird wiederholt, und die Sporen einer einzelnen Kolonie werden nach der zweiten Re-Isolierung als eine definierte Transformante gelagert.
Medien
YPD: 10 g Hefeextrakt, 20 g Pepton, H₂O auf 810 ml. Autoklaviert, 90 ml 20% Glucose (steril gefiltert) zugegeben.
YPG-Agar: 25 g/l Bactogar, 15 g/l Glucose, 5 g/l K₂PO₄, 0,5 g/l MgSO₄-7H₂O, pH auf den Wert 5,0 eingestellt. Autoklaviert.
10 × Basal-Salz: 66,8 g Hefe-Stickstoff-Base, 100 g Succinsäure, 60 g NaOH, H₂O auf 1000 ml, steril gefiltert.
SC-URA: 90 ml 10 × Basal-Salz, 22,5 ml 20% Casaminosäuren, 9 ml 1% Tryptophan, H₂O auf 806 ml, autoklaviert, 3,6 ml 5% Threonin und 90 ml 20% Glucose zugegeben.
SC-H-Agar: 7,5 g/l Hefe-Stickstoff-Base ohne Aminosäuren, 11,3 g/l Succinsäure, 6,8 g/l NaOH, 5,6 g/l Casaminosäuren ohne Vitamine, 0,1 g/l Tryptophan und 20 g/l Agar (Bacto). Für 20 min bei 121°C autoklaviert. Nach Autoklavieren wurden 55 ml 22% Galactose-Lösung und 1,8 ml einer 5% Threonin-Lösung pro 450 ml Agar zugegeben.
YNB-1-Agar: 3,3 g/l KH₂PO₄, 16,7 g/l Agar, pH-Wert auf 7 eingestellt. Für 20 min bei 121°C autoklaviert. Nach Autoklavieren wurden pro 450 ml Agar 25 ml einer 13,6% Hefe-Stickstoff-Base ohne Aminosäuren, 25 ml einer 40% Glucose-Lösung, 1,5 ml einer 1% L-Leucin-Lösung und 1,5 ml einer 1% Histidin-Lösung zugegeben.
YNB-1-Brühe: Zusammensetzung wie YNB-1-Agar, aber ohne Agar.
FG-4-Agar: 35 g/l Altar, 30 g/l Sojabohnenmehl, 15 g/l Maltodextrin (Glucidex 6), 5 g/l Bacto-Pepton, pH 7. Für 40 min bei 121°C autoklaviert.
FG-4-Medium: 30 g/l Sojabohnenmehl, 15 g/l Maltodextrin (Glucidex 6), 5 g/l Bacto-Pepton. Für 40 min bei 121°C autoklaviert.
AZCL-Xyloglucan: erhältlich von Megazyme, Australien.
AZCL-HE-Cellulose: erhältlich von Megazyme, Australien.
Charakterisierung eines erfindungsgemäßen Enzyms
SDS-PAGE-Elektrophorese: SDS-PAGE-Elektrophorese wurde in einer Mini-Leak 4-Elektrophorese-Einheit (Kem-En-Tec, Kopenhagen) als modifizierte Version des Laemli-Verfahrens (Laemmli, 1970; Christgau, 1991) durchgeführt. Kurz zusammengefaßt: das Separationsgel wurde mit 12% Acrylamid; 0,2% BIS-Acrylamid; 0,1% SDS; 0,375 M Tris pH 8,8; 0,04% APS (Ammoniumpersulfat) & 0,04 TEMED gegossen. Nach 6–15 Stunden Polymerisation wurde das Stapelgel mit 4,5% w/w Acrylamid; 0,075 BIS-Acrylamid; 0,1% SDS; 66,5 mM Tris pH 6,8; 0,4% w/w APS (Ammoniumpersulfat) & 0,4% TEMED gegossen. Die Elektrodenkammern wurden mit Laufpuffer gefüllt: 25 mM Tris-Base; 0,192 M Glycin & 0,05% SDS, woraufhin die Proben, die Probenpuffer enthielten, geladen wurden und das Gel bei 2–4 mA/Gel für das Laufen über Nacht und bei 10-30 mA/Gel für schnelles Laufen laufen gelassen wurden. Daraufhin wurde das Gel entfernt and entweder dwch Comassie- oder Silberfärben angefärbt.
Isoelektrische Fokussierung: Isoelektrische Fokussierung wurde auf Ampholin-PAG-Platten, pH 3,5–9,5 (Pharmacia, Upsala) auf einer Multiphor Elektrophoreseeinheit gemäß der Bedienungsanleitung durchgeführt. Nach der Elektrophorese wird das Gel entweder comassieoder silbergefärbt.
Comassie- und Silberfärben: Das Gel wird vorsichtig von den Glasplatten entfernt und auf einem langsam rotierenden Schütteltisch in ungefähr 100 ml der folgenden Lösungen inkubiert.
Coomassiefärben:

1) 30 min in 40% v/v Ethanol; 5% v/v Essigsäure
2) 30 min in 40% v/v Ethanol; 5% v/v Essigsäure + 0,1% Coomassie R250
3) Entfärben für 30 min in 40% v/v Ethanol; 5% v/v Essigsäure, bis der Hintergrund ausreichend reduziert ist.
4) Schließlich wird das Gel in Aufbewahrungslösung inkubiert: 5% v/v Essigsäure; 10 % v/v Ethanol; 5% Glycerin und zwischen zwei Lagen einer Cellophan-Membran luftgetrocknet.

Silberfärben:

1) 30 min in 40% v/v Ethanol; 5% v/v Essigsäure
2) 20 min in 10% v/v Ethanol; 5% v/v Essigsäure
3) 20 min in 0,0057% w/v APS (0,25 mM)
4) 60 min in 0,1% w/v AgNO₃
5) Zur Entwicklung wird das Gel in Entwickler getaucht: 0,015% Formaldehyd; 2% w/v Na₂CO₃ für 30–60 sec. Dann wir das Gel in einer zweiten Runde Entwickler inkubiert, bis zufriedenstellende Färbung des Proteins erreicht worden ist (5–15 min). Schließlich wird das Gel in Aufbewahrungslösung inkubiert: 5% v/v Essigsäure; 10 % v/v Ethanol; 5% v/v Glycerin und zwischen zwei Lagen einer Cellophanmembran luftgetrocknet.

Standard-Inkubationen: Zur Charakterisierung der Enzyme werden die Inkubationen in Eppendorf-Reaktionsgefäßen, enthaltend 1 ml Substrat (AZCL-Subtrate oder reine Polysaccharide von MegaZyme) durchgeführt. 0,5 ml 0,4% AZCL-Subtratsuspension wird mit 0,5 ml 0,1 M Citrat/Phosphat-Puffer mit optimalem pH gemischt und 10 μl einer geeignet verdünnten Enzymlösung zugegeben. Inkubationen werden in Eppendorf-Thermomischern für 15 min bei 30°C (falls nicht anders angegeben) vor Hitze-Inaktivierung für 20 min bei 95 °C durchgeführt. Enzyminkubationen werden dreifach durchgeführt. Eine Blindprobe wird hergestellt, wobei Enzym zugegeben, aber sofort inaktiviert wird. Nach Zentrifugieren wird die Absorption des Überstandes in Mikrotiterplatten bei 620 nm gemessen und der Blindwert substrahiert.
Die Aktivitäten der Enzyme werden auf verschiedenen reinen Polysacchariden gemessen:
Xyloglucan und β-Glucan von MegaZyme, CMC (Blanose von Aqualon) und Avicell (mikrokristalline Cellulose von Merck). Vor Verwendung wird Avicell in 85% Orthophosphorsäure für 1 Stunde bei Raumtemperatur gequollen und mit Aceton und Wasser gewaschen. 0,5% Lösungen/Suspensionen der verschiedenen Substrate werden in 0,1 M Acetatpuffer (falls nicht anders angegeben) mit optimalem pH zubereitet, 10 μl Enzymlösungen werden zu 1 ml Substrat gegeben, und Inkubationen werden bei 30°C für 15 min vor Hitzeinaktivierung wie oben durchgeführt. Reduzierende Zucker werden in Mikrotiterplatten über Reaktion mit PHBAH-Reagenz, umfassend 0,15 g Parahydroxybenzoesäurehydrazid (Sigma H-9882), 0,50 g Kalium-Natrium-Tartrat (Merck 8087) und 2% NaOH-Lösung bis zu 10,0 ml, durchgeführt. Ergebnisse von Blindproben werden subtrahiert. Glucose wird als Standard verwendet.
Das pH-Optimum wird auf Substraten von MegaZyme bestimmt (EG II auf AZCL-Xyloglucan, EG III auf reinem β-Glucan, und EG IV auf AZCL-β-Glucan). 0,5 ml 0,4% Substrat werden mit 0,5 ml 0,1 M Citrat/Phosphat-Puffer mit variierendem pH gemischt und 10 μl einer geeignet verdünnten Enzymlösung werden zugegeben. Inkubationen werden wie oben beschrieben durchgeführt.
Die Spezifität der verschiedenen Endoglucanasen auf den verschiedenen AZCL-Substraten wird wie oben beschrieben bei optimalem pH in 0,1 M Acetat-Puffer getestet.
Die pH-Stabilität wird dadurch gemessen, daß das Enzym für 1 Stunde in 0,1 M Zitronensäure/Trinatriumphosphatpuffern mit variierendem pH belassen wird, bevor das Enzym für die Inkubation von AZCL-β-Glucan bei optimalem pH verwendet wird.
Das Temperatur-Optimum wird durch Inkubation des Enzyms mit AZCL-β-Glucansubstrat bei variierenden Temperaturen für 15 Minuten bei optimalem pH gemessen.
Die Temperatur-Stabilität wird dadurch gemessen, daß das in Wasser verdünnte Enzym vor Inkubation bei 30°C mit dem relevanten Substrat bei variierenden Temperaturen für 1 Stunde belassen wird.
Km und spezifische Aktivität werden dadurch gemessen, daß Inkubationen bei Substratkonzentrationen (S) im Bereich von 0,025 bis 1,5% (Xyloglucan für EG II und β-Glucan für EG IV) durchgeführt werden, die Reaktionsgeschwindigkeit (v) gemessen wird, S/v als Funktion von S aufgetragen wird, lineare Regressionsanalyse durchgeführt wird, die Steigung (= 1/Vmax) und der Schnittpunkt (Km/Vmax) bestimmt werden und Km und die spezifische Aktivität (= Vmax/E) berechnet werden, wobei E die Menge des zugegebenen Enzyms ist.
Für die Gelfiltrationschromatographie werden 1% Lösungen/Suspensionen der oben genannten reinen Polysaccharide hergestellt. Eine geeignete Menge Enzym wird zugegeben und die Inkubationen für 0, 1, 2, 4 und 24 Stunden vor Hitze-Inaktivierung durchgeführt. 25 μl der Probe werden in drei TSK-Säulen in einer Reihe (PW G4000, PW G3000, PW G2500) eingespritzt, und die Saccharide werden mit 0,4 M Acetatpuffer, pH 3,0 bei 0,8 ml/min eluiert. Eluierte Saccharide werden über einen Shimadzu RI-Detektor bestimmt, und die Daten werden gesammelt und von Dionex-Software ausgewertet. Dextrane (von Sersa) werden als Molekulargewicht-Standards verwendet.
BEISPIELE
BEISPIEL 1
Eine Bank von Aspergillus aculeatus CBS 101.43, bestehend aus ungefähr 1,5 × 10⁶ individuellen Klonen in 50 Pools wurde in E. coli wie oben beschrieben hergestellt.
Aus 20 individuellen Klonen der Bank wurde DNA isoliert und einer Analyse hinsichtlich cDNA-Insertion unterzogen. Die Insertionshäufigkeit war > 90%, und die durchschnittliche Insertionsgröße betrug ungefähr 1400 bp.
Die DNA aus einigen der Pools wurde in Hefe transformiert, und 50–100 Platten, enthaltend 200–500 Hefekolonien, wurden aus jedem einzelnen Pool erhalten. Die Kolonien wurden abgeschabt und in Glycerin bei –80°C aufbewahrt.
Hefezellen aus der Bank wurden auf YNB-Agar in etwa 250.000 Kolonien ausgebreitet. Die Anzahl der Kolonien pro Platte variierte von 250 bis 500. Nach 3–5 Tagen Wachstum wurden die Platten auf einige Sätze von SC-H Agar-Platten replik-plattiert, und drei verschiedene Endoglucanasen wurden identifiziert:
Ein Satz der Replika-Platten enthielt 0,1% AZCL Xyloglucan (Megazyme). Diese Platten wurden für 2–4 Tage bei 30°C inkubiert. Endoglucanase II- und Endoglucanase III-positive Kolonien wurden identifiziert als Kolonien, die von einem blauen Hof umgeben waren.
Ein anderer Satz von Replika-Platten enthielt 0,1% AZCL-HE-Cellulose. Diese Platten wurden für 2–4 Tage bei 30°C inkubiert. Endoglucanase III und Endoglucanase IV-positive Kolonien wurden identifiziert als Kolonien, die von einem blauen Hof umgeben waren.
Zellen von enzympositiven Kolonien wurden zur Isolierung einzelner Kolonien auf Agar ausgebreitet, und eine enzymproduzierende Einzelkolonie wurde mittels der oben beschriebenen Methoden identifiziert und selektiert.
Charakterisierung positiver Klone: Die positiven Klone wurden als Einzelkolonien erhalten, die cDNA-Inserts wurden aus der Hefekolonie unter Verwendung von biotinylierten Polylinker-Primern, die mittels eines magnetischen Kügelchen-Systems (Dynabead M-280, Dynal) direkt amplifiziert und individuell über Sequenzierung des 5'-Endes jedes cDNA-Klons über die Kettenterminationsmethode (Sanger et al., 1977) und das Sequenase-System (United States Biochemical) charakterisiert. Die DNA-Teilsequenz des Enzymgens, das durch Screening mit AZCL Xyloglucan erhalten wurde, ist in Anspruch 2 und die DNA-Teilsequenz des Enzymgens, das durch Screening mit AZCL-HE Cellulose erhalten wurde, ist in Anspruch 6 gezeigt. Eine DNA-Teilsequenz wurde für Endoglucanase III erhalten. Es wurde gefunden, daß diese Sequenz eine substantielle Homologie mit der Sequenz zeigt, die von Ooi et al. 1990 offenbart wurde. Endoglucanase III ist in die folgenden Beispiele aufgenommen, um den existierenden Unterschied zwischen den erfindungsgemäßen Endoglucanaen und den Endoglucanasen des Standes der Technik zu zeigen.
BEISPIEL 2
DNA-Isolierung
DNA wurde aus zwei verschiedenen Isolaten mit der folgenden allgemeinen Vorgehensweise isoliert:
Das Isolat wurde in 20 ml YNB-1-Brühe in einem 50 ml Glasteströhrchen eingeimpft. Das Röhrchen wurde für 2 Tage bei 30°C geschüttelt. Die Zellen wurden durch zehnminütige Zentrifugation bei 3000 U/min geerntet.
Die Zellen wurden in 1 ml 0,9 M Sorbitol, 0,1 M EDTA, pH 7,5 resuspendiert. Das Pellet wurde in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt und für 30 Sekunden bei höchster Geschwindigkeit rotiert. Die Zellen wurden in 0,4 ml 0,9 M Sorbitol, 0,1 M EDTA, 14 mM β-Mercaptoethanol resuspendiert. 100 μl 2 mg/ml Zymolase wurden zugegeben und die Suspension wurde bei 37°C für 30 Minuten inkubiert und für 30 Sekunden rotiert. Das Pellet (Sphäroplasten) wurde in 0,4 ml TE resuspendiert. 90 μl von (1,5 ml 0,5 M EDTA pH 8,0, 0,6 ml 2 M Tris-Cl pH 8,0, 0,6 ml 10% SDS) wurden zugegeben, und die Suspension wurde bei 65°C für 30 Minuten inkubiert. 80 μl 5 M KOAc wurden zugegeben, und die Suspension wurde auf Eis für mindestens 60 Minuten inkubiert und für 15 Minuten bei höchster Geschwindigkeit rotiert. Der Überstand wurde in ein frisches Reaktionsgefäß überführt, das mit EtOH (Raumtemp.) gefüllt war, gefolgt von sorgfältigem aber vorsichtigem Mischen und Rotieren für 30 Sekunden. Das Pellet wurde mit kaltem 70% EtOH gewaschen, für 30 Sekunden rotiert und bei Raumtemperatur getrocknet. Das Pellet wurde in 50 μl TE (Tris-EDTA) resuspendiert und für 15 Minuten rotiert. Der Überstand wurde in ein frisches Reaktionsgefäß überführt. 2,5 μl 10 mg/ml RNase wurden zugegeben, gefolgt von Inkubation bei 37°C für 30 Minuten und Zugabe von 500 μl Isopropanol unter vorsichtigem Mischen. Die Mischung wurde für 30 Sekunden rotiert und der Überstand entfernt. Das Pellet wurde mit kaltem 96% EtOH gespült und bei Raumtemperatur getrocknet. Die DNA wurde in 50 μl Wasser auf eine Endkonzentration von ungefähr 100 μl/ml gelöst.
Die DNA wurde mittels Standardverfahren in E. coli transfomiert. Zwei E. coli-Kolonien wurden isoliert und mit den Restriktionsenzymen HindIII und Xbal analysiert, die das DNA-Insert ausschnitten.
Die DNA-Sequenzen einiger positiver Klone wurden bestimmt. Eine DNA-Teilsequenz des Gens, das erfindungsgemäße Endoglucanase II kodiert, ist in Anspruch 2 gezeigt, und eine DNA-Teilsequenz des Gens, das erfindungsgemäße Endoglucanase IV kodiert, ist in Anspruch 6 gezeigt.
BEISPIEL 3
Endoglucanase-Expression
Um eine erfindungsgemäße Endoglucanase zu exprimieren, wird die DNA, die die Endoglucanase kodiert, mit HindIII/XbaI verdaut, der Größe nach auf Gel aufgetrennt, und ein Fragment, das dem Endoglucanase-Gen entspricht, wird gereinigt. Das Gen wird unmittelbar darauf an von HindIII/XbaI verdautes pHD414 ligiert, woraus die Plasmide pAEG II und pAEG IV resultieren.
Nach Amplifikation der DNA in E. coli werden die Plasmide pAEG II und pAEG IV in Aspergillus oryzae wie oben beschrieben transformiert.
Jede der Transformanten wurde in FG-Agar im Zentrum einer Petrischale eingeimpft. Nach 4 Tagen Inkubation bei 30°C wurden Stöpsel mit 4 mm Durchmesser mittels eines Korkenziehers entfernt.
Ein Satz von Stöpseln wurde in ein Xyloglucan-Overlayer-Gel eingebettet, das 0,1% AZCL Xyloglucan und 1% Agarose in einem Puffer mit einem geeigneten pH enthielt, und über Nacht bei 30°C inkubiert. Die Endoglucanase II- beziehungweise die Endoglucanase III-Aktivität wurden wie oben beschrieben bestimmt. Die beste Transformante hatte einen Hof mit einem Durchmesser, der bedeutend größer war als der A. oryzae-Hintergrund. Dies zeigt die effiziente Expression von Endoglucanase II in A. oryzae.
Ein anderer Satz an Stöpseln wurde in ein HE-Cellulose-Overlayer-Gel eingebettet, das 0,1% AZCL-HE Cellulose und 1% Agarose in einem Puffer mit einem geeigneten pH enthielt, und über Nacht bei 30°C inkubiert. Die Endoglucanase III- beziehungweise die Endoglucanase IV-Aktivität wurden wie oben beschrieben bestimmt. Die beste Transformante hatte einen Hof mit einem Durchmesser, der bedeutend größer war als der A. oryzae-Hintergrund. Dies zeigt die effiziente Expression von Endoglucanase IVin A. oryzae.
Fed Batch-Fermentation
Daraufhin wurden EG II, EG III beziehungsweise EG IV über Fed Batch-Fermentation von A. oryzae unter Exprimierung der Enzyme hergestellt. Das zur Fermentation verwendete Medium enthielt Maltodextrin als Kohlenstoffquelle, Harnstoff ais Stickstoffquelle und Hefeextrakt.
Die Fed Batch-Fermentation wurde durch Einimpfen einer Schüttelflaschenkultur der fraglichen A. oryzae-Wirtszellen in ein Medium, das 3,5% der Kohlenstoffquelle und 0,5% der Stickstoffquelle enthielt, hergestellt. Nach 24 Stunden Kultivierung bei pH 5,0 und 34°C wurde die kontinuierliche Zuführung von zusätzlicher Kohlenstoff- und Stickstoff-Quelle initiiert. Die Kohlenstoffquelle wurde als limitierende Größe beibehalten, und es wurde sichergestellt, daß Sauerstoff im Überschuß vorhanden war. Die Fed Batch-Kultivierung wurde für 4 Tage fortgeführt, woraufhin die Enzyme gewonnen werden konnten.
BEISPIEL 4
Charakterisierung von Endoglucanase II und IV
Reinigung von EG II
Die von der Fermentation von Aspergillus oryzae überstehende Kultur, die das rekombinante Enzym exprimiert, wurde bei 5000 xg zentrifugiert und durch einen 0,2 μm-Filter gefiltert, um die Mycelien zu entfernen. 35–50 ml des filtrierten Überstandes wurden in einer Filtron Ultracette oder einer Amicon Ultratfiltrationsapparatur mit einer 10 kDa-Membran ultrafiltriert, um 10fache Konzentration zu erreichen. Dieses Konzentrat wurde 100mal in 20 mM Tris pH 7,0 in zwei aufeinander folgenden Runden Ultrafiltration in derselben Apparatur verdünnt. Diese ultrafiltrierte Probe wurde bei 2 ml/min auf einen Pharmacia HR16/10 Fast Flow Q Sepharose-Anionenaustauscher geladen, der in 20 mM Tris pH 7,0 equilibriert war. Nachdem die Probe aufgebracht war, wurde die Säule mit zwei Säulenvolumina 20 mM Tris pH 7,0 gewaschen, und gebundene Proteine wurden mit einem linear wachsendem NaCl-Gradienten von 0 bis 0,4 M NaCl in 20 mM Tris pH 7,0 eluiert.
Das Protein eluiert bei ungefähr 50 mM NaCl. Das Molekulargewicht des Enzyms wurde zu ungefähr 35 kDa mittels SDS-PAGE und der isoelektrische Punkt zu 3,4 mittels IEF bestimmt.
Das gereinigte Enzym wird zur Charakterisierung verwendet.
Reinigung von Endoglucanase III
Die von der Fermentation von Aspergillus oryzae überstehende Kultur, die das rekombinante Enzym exprimiert (der Expressionslevel sollte mindestens 0,5 mg Enzym/ml Überstand betragen), wurde für 20 min bei 5.000 xg zentrifugiert und durch einen 0,2 μm-Filter gefiltert, um die Mycelien zu entfernen. 35–50 ml des filtrierten Überstandes wurden in einer Amicon YM03 Ultratfiltrationsapparatur mit einer 3 kDa-Membran ultrafiltriert, um 10fache Konzentration zu erreichen. Dieses Konzentrat wird 100mal in 20 mM Tris pH 8,0 in zwei aufeinander folgenden Runden Ultrafiltration in derselben Apparatur verdünnt. Diese ultrafiltrierte Probe wurde bei 1,5 ml/min auf einen Pharmacia HR16/10 Fast Flow Q Sepharose Anionenaustauscher geladen, der in 20 mM Tris pH 8,0 equilibriert ist. Nachdem die Probe aufgebracht ist, wird die Endoglucanase III durch die Säule gewaschen, wobei die kontaminierenden Verunreinigungen an der Säule gebunden bleiben. Die Endoglucanase in dieser Fraktion weist einen Reinheitsgrad von mehr als 95% auf.
Das Molekulargewicht des Enzyms wurde zu ungefähr 26 kDa mittels SDS-PAGE und der isoelektrische Punkt zu 5,5 mittels IEF bestimmt.
Das gereinigte Enzym wurde zur Charakterisierung verwendet. Hinsichtlich EG IV wurde der Fermentationsüberstand zur Charakterisierung verwendet.
pH-Optimum
Die pH-Optima der verschiedenen Enzye sind in 3 zu sehen. Die EG II besitzt ein pH-Optimum von ungefähr 3,0, EG IV von ungefähr 3,5. Bezüglich des pH-Optimums sind EG II und EG IV beide sauere Endoglucanasen, die eine optimale Aktivität von pH 2,5 bis 4,0 zeigen, wohingegen EG III von pH 4,0 bis 6,0 optimal ist.
Substratspezifität
Die relative Aktivität, die als die Freisetzung von reduzierenden Zuckern aus unterschiedlichen Polysacchariden durch die verschiedenen Enzyme, verglichen mit dem optimalen Substrat (100%), bestimmt wurde, ist aus untenstehender Tabelle ersichtlich.
Aus diesen Ergebnissen können die Spezifitäten der verschiedenen Endoglucanasen errechnet werden:
Die Ergebnisse für die Substratspezifität, bestimmt auf AZCL-Substraten, ist aus folgender Tabelle ersichtlich:
Aus den Ergebnissen zu den Spezifitäten wird klar, daß EG II, verglichen mit EG III und EG IV, extrem spezifisch für Xyloglucan ist. EG III ist gegenüber allen Substrattypen aktiv, wohingegen EG IV Xyloglucan nicht abbauen kann und für β-Glucane sehr spezifisch ist. (Es gibt einige Unterschiede bei den erhaltenen Ergebnissen mit reduzierenden Zuckern und AZCL-Substraten. Eine Erklärung dafür ist, daß einige AZCL-Substrate höher auflösend als andere sind. In diesem Fall scheint AZCL-HE-Cellulose höher auflösend als AZCL-β-Glucan zu sein).
Der Km und die spezifische Aktivität für EG II und EG III wurden gemäß dem obigem Abschnitt Materialien und Methoden bestimmt. Die Standardabweichungen von 1/Vmax und Km/Vmax, die durch lineare Regressionsanalyse erhalten wurden, wurden verwendet, um die Intervalle für die Enzyme gemäß folgender Tabelle zu berechnen:
Temperaturoptimum und Temperatur-/pH-Stabilität
EG II und EG III weisen ähnliche Temperatur-Optima (optimale Aktivität zwischen 30°C und 60°C) und Temperaturstabilität auf (stabil für 1 h bis zu 60°C), doch ist EG III bei hohem pH stabiler als EG II.
Die Gelfiltrationschromatogramme, die die Substratspezifitäten verifizieren, zeigen, daß EG II Xyloglucan vollständig zu Oligomeren mit ungefähr 7–9 Resten abbaut, die bekannte sich wiederholende Subunits von Xyloglucan sind (Fry, 1989). EG III baut Xyloglucan in weit geringerem Ausmaß ab, und EG IV baut Xyloglucan überhaupt nicht ab. EG III baut β-Glucan in hohem Maße zu DP 3–4 und höheren Oligomeren ab. Dies stimmt überein mit β-Glucanen, die zusammengesetzt sind aus 3–4 in einer Reihe β-1,4-verbundenen Glucoseeinheiten, unterbrochen von einzelnen β-1,3-Bindungen. Diese Ergebnisse zeigen, daß unabhängig von der Partialhomologie in der DNA-Sequenz beträchtliche Unterschiede zwischen den drei Endoglucanasen hinsichtlich sowohl Substratspezifität als auch pH-Optimum und pH-Stabilität bestehen.
LITERATUR
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Claims

Endoglucanase-Aktivität aufweisendes Enzym, kodiert durch (i) eine DNA-Sequenz, umfassend mindestens eine der folgenden Teilsequenzen
(ii) eine DNA-Sequenz, die zu mindestens 70% mit der SEQ ID Nr. 17 oder der SEQ ID Nr. 18 homolog ist.
Enzym nach Anspruch 1, das durch eine DNA-Sequenz kodiert ist, die zu mindestens 75%, 80%, 85%, 90% oder mindestens 95% mit der SEQ ID Nr. 17 oder der SEQ ID Nr. 18 homolog ist.
Enzym nach einem der Ansprüche 1 bis 2, gegenüber Xyloglucan eine Aktivität aufweisend, die mindestens 50 mal höher ist als die Aktivität gegenüber Carboxymethycellulose, β-Glucan oder Avicell, bestimmt auf der Basis der Freisetzung reduzierender Zucker, erhalten während der Inkubation des Enzyms mit dem jeweiligen Substrat.
Enzym nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das gegenüber β-Glucan im wesentlichen keine Aktivität und/oder im wesentlichen keine Transferase-Aktivität aufweist.
Enzym nach einem der Ansprüche 1 bis 4, das gegenüber Carboxymethylcellulose und/oder Avicell eine Aktivität von höchstens 3% aufweist.
DNA-Konstrukt, das ein Enzym gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 kodiert.
DNA-Konstrukt, das ein Enzym kodiert, welches Endoglucanase-Aktivität aufweist, umfassend (i) eine DNA-Sequenz, umfassend mindestens eine der folgenden Teilsequenzen
(ii) eine DNA-Sequenz, die zu mindestens 70% mit der SEQ ID Nr. 17 oder der SEQ ID Nr. 18 homolog ist.
DNA-Konstrukt nach Anspruch 7, das ein Enzym kodiert, welches Endoglucanase-Aktivität aufweist, umfassend eine DNA-Sequenz, die zu min destens 75%, 80%, 85%, 90% oder mindestens 95% mit der SEQ ID Nr. 17 oder der SEQ ID Nr. 18 homolog ist.
Rekombinanter Expressionsvektor, umfassend ein DNA-Konstrukt gemäß einem Ansprüche 6 bis 8.
Zelle, umfassend einen rekombinanten Expressionsvektor gemäß Anspruch 9.
Verfahren zur Herstellung eines Endoglucanase-Aktivität aufweisenden Enzyms, umfassend die Kultivierung einer Zelle gemäß Anspruch 10 unter Bedingungen, die die Herstellung des Enzyms gestatten, und Gewinnung des Enzyms aus der Kultur.
Enzympräparat zum Abbau von Bestandteilen von Pflanzenzellwänden, das an einem Enzym angereichert ist, welches Endoglucanase-Aktivität gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 aufweist.
Präparat nach Anspruch 12, zusätzlich umfassend eine Galactanase, Xylanase, Arabinanase, Pektinacetylesterase, Polygalacturonase, Rhamnogalacturonase, Pektinlyase, Pektatlyase, Endoglucanase oder Pektinmethylesterase.
Verwendung des Enzyms gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 oder eines Enzympräparates gemäß einem der Ansprüche 12 bis 13 als Mittel zum Abbau oder zur Modifikation von Cellulosen.
Verwendung nach Anspruch 14 als Mittel zum Abbau oder zur Modifikation von Pflanzenzellwänden.
Verwendung nach einem der Ansprüche 14 bis 15 bei der Herstellung von Wein oder Saft, bei der Pektinreinigung, beim Brauprozeß oder bei der Herstellung von Futtermittel.
Verwendung nach Anspruch 14 für Textilien.
Verwendung nach Anspruch 17 als Mittel zur Entfernung von Xyloglucan aus Pflanzenfasern oder als Mittel zur Behandlung oder zum Weichmachen von Gewebe.
Verwendung nach Anspruch 14 in der Papierindustrie.
Verwendung nach Anspruch 19 zur Verbesserung der Entwässerung von Pulpe.