DE69631899T2

DE69631899T2 - Xylanasen, für diese kodierende gene und anwendungen derselben

Info

Publication number: DE69631899T2
Application number: DE69631899T
Authority: DE
Inventors: Marja Paloheimo; Satu Hakola; Arja MÄNTYLÄ; Jari VEHMAANPERÄ; Raija Lantto; Tarja Lahtinen; Richard FAGERSTRÖM; Pirkko Suominen
Original assignee: AB Enzymes Oy
Current assignee: AB Enzymes Oy
Priority date: 1995-12-18
Filing date: 1996-12-17
Publication date: 2004-11-04
Anticipated expiration: 2016-12-18
Also published as: ATE262034T1; AU1099697A; DE69631899D1; PT870015E; ES2217333T3; DK0870015T3; EP0870015B1; WO1997022692A1; EP0870015A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Gene, die neue Xylanasen codieren, und Zusammensetzungen, die die neuen Xylanasen enthalten. Diese Zusammensetzungen sind besonders nützlich in der Pulpen- und in der Papierindustrie und beim Modifizieren von Pflanzen-Biomasse, sowie Nahrungsmittelzusätzen, oder beim Backen.
Beschreibung des Standes der Technik
Pflanzen-Biomasse ist ein gemischtes Material, das vornehmlich aus einer Matrix aus Cellulose, Hemicellulose und Lignin besteht. Enzyme, die z. B. die Hemicellulose Xylan abbauen, Xylanasen, können z. B. in Tierfutterzusammensetzungen, welche reich an Arabinoxylanen und Glucoxylanen sind, beim Backen und bei Pulpen- und Papieranwendungen verwendet werden, z. B. um die Bleichbarkeit von Pulpen zu verbessern.
Daher verbessert ein hemicellulolytisches Enzym, wenn es zu Futtermitteln (z. B. für monogastrische Tiere, z. B. Geflügel oder Schweine) hinzugegeben wird, welches Cerealien (z. B. Gerste, Weizen, Mais, Roggen oder Hafer) oder Cerealien-Nebenprodukte enthält, den Abbau von Pflanzenzellwänden, was zu einer besseren Nutzbarkeit der Pflanzennährstoffe durch das Tier führt. Dies führt zu einer verbesserten Wachstumsrate und Futtermittelumsetzung. Außerdem kann die Viskosität der Futtermittel, die Xylan enthalten, reduziert werden.
Bei Backanwendungen verleihen kleine Mengen von Xylanasen, die zum Mehl hinzugegeben werden, dem Teig und dem Brot selbst vorteilhafte Eigenschaften. Solche Eigenschaften umfassen z. B. erhöhtes Brotvolumen und bessere Struktureigenschaften (Bruch- und Reissqualität und Krümelqualität).
In der Pulpen- und Papierindustrie werden Xylanasen und andere Hemicellulasen verwendet um z. B. die Bleichbarkeit der Pulpe zu verbessern.
Das Ziel des Kraftzellstoffbleichens ist es, restliches Lignin, das nach Kraftkochen in der Pulpe zurückbleibt, zu entfernen. Taditionell wurde dies unter Verwendung von Chlorenthaltenden Chemikalien durchgeführt. Aufgrund von Bedenken bezüglich der Umwelt und Verbraucherforderungen wurden alternative Bleichtechnologien gewünscht.
Die erste biotechnolgische Annäherung an dieses Problem war es, das Lignin direkt mit Lignin-abbauenden Enzymen anzugreifen. Die Chemie der enzymatischen Lignindegradierung scheint jedoch sehr kompliziert und schwierig zu kontrollieren zu sein.
Lignin kann degradiert werden, wenn der gesamte Mikroorganismus, der Ligninasen produziert, verwendet wird. Die Behandlungszeiten sind jedoch relativ lang. Z. B. können Behandlungszeiten Tage einnehmen, und der Mikroorganismus benötigt zusätzliche Nährstoffe um zu arbeiten. Es kann auch schwierig sein, das Wachstum anderer, nicht erwünschter Mikroben zu kontrollieren. Die Lignindegradierung unter Verwendung von Ligninasen oder durch Mikroor ganismen ist Gegenstand vieler Forschungsbemühungen (siehe z. B. Farrell, R. L. et al., Lignocellulosics 305–315 (1992); Jurasek, L., Lignocellulosics 317–325 (1992)).
Zusätzlich zu Cellulose und Lignin enthalten Holzpulpen Hemicellulose. Ein weiterer Ansatz der Ligninentfernung ist es, Hemicellulosen anzugreifen – die dritte Hauptkomponente von Holz. Die Hemicellulose in nativem Hartholz ist hauptsächlich Xylan, während die Hemicellulose in Weichholz hauptsächlich Glucomannan und ein wenig Xylan ist. Während des Kraftkochens wird ein Teil des Xylans in der Kochflüssigkeit gelöst. Wenn gegen Ende der Kochzeit die Alkalikonzentration abnimmt, präzipitiert ein Teil des gelösten und modifizierten Xylans zurück auf die Cellulosefaser.
1986 wurde erkannt, dass Xylanase-Vorbehandlung von ungebleichtern Kraftzellstoff zu einem verminderten Bedarf nach Chemikalien im Bleichprozess führt (Viikari, L. et al., Proceedings of the 3rd Int. Conf. on Biotechnology in the Pulp Paper Ind., Stockholm (1986), S. 67–69). Xylanase-Vorbehandlung von Kraftzellstoff hydrolysiert partiell das Xylan in Kraftzellstoff Das macht die Pulpenstruktur poröser und erlaubt eine effizientere Entfernung von Ligninfragmenten in nachfolgenden Bleich- und Extraktionsstufen. Später wurde in mehreren Laboratorien berichtet, dass die Xylanase-Vorbehandlung nützlich in Verbindung mit Bleichsequenzen ist, die aus Cl₂, ClO₂, H₂O₂, O₂ und O₃ bestehen. Siehe Übersichtsartikel in Viikari, L. et al., FEMS Microbiol. Rev. 13: 335–350 (1994); Viikari, L. et al., in: Saddler, J. N., Hrsg., Bioconversion of Forest and Agricultural Plant Residues, C-A-B International (1993), S. 131–182; Grant, R., Pulp and Paper Int. (Sept. 1993), S. 56–57; Senior & Hamilton, J. Pulp & Paper: 111–114 (Sept. 1992); Bajpai & Bajpai, Process Biochem. 27: 319–325 (1992); Onysko, A., Biotech. Adv. 11: 179–198 (1993); und Viikari, L. et al., J. Paper and Timber 73: 384–389 (1991).
Als direktes Ergebnis der besseren Bleichbarkeit der Pulpe nach solch einer Xylanase-Behandlung gibt es eine Verminderung des nachfolgenden Verbrauchs von Bleichchemikalien, was, wenn Chlor-enthaltende Chemikalien verwendet werden, zu einer verminderten Bildung von im Hinblick auf die Umwelt unerwünschten organischen Chlorverbindungen führt. Es ist als direktes Ergebnis der besseren Bleichbarkeit der Pulpe nach einer Xylanase-Behandlung auch möglich, ein Produkt mit einer Endhelligkeit herzustellen, wobei solch eine Helligkeit auf andere Weise schwer zu erreichen wäre (beispielsweise absolut Chlor-freies ("totally chlorine free", TCF) Bleichen unter Verwendung von Peroxid). Aufgrund der Substratspezifität des Xylanase-Enzyms werden Cellulosefasern nicht beeinträchtigt, und die Stärkeeigenschaften des Produktes liegen sehr wohl innerhalb annehmbarer Grenzen.
In vielen praktischen Anwendungen ist die Verwendung von Xylanasen jedoch nicht unkompliziert; die Xylanasen müssen bei den Temperatur- und pH-Bedingungen des Verfahrens, in welchem sie verwendet werden, aktiv sein. Die Formulierung von kommerziellen Nahrungsmitteln unter Verwendung von Pelletieren, Extrudieren oder Schäumen umfasst oft Schritte, die mit hohen Temperaturen einhergehen (70–180°C). Enzyme, die zu diesem Formulierungsprozess hinzugegeben werden, sollten diese Bedingungen überstehen. Andererseits ist die entsprechende Temperatur im Darm von Tieren ungefähr 40°C. Daher sollten ideale Xylanasen für Nahrungsmittelzusammensetzungen den oben genannten extremen Temperaturen widerstehen. Bei Bleichanwendungen ist die Xylanase-Anwendung nicht so einfach, als dass nur ein Xylanase-Behandlungsschritt hinzugefügt werden muss. Aufgrund des Bleichprozesses, und sogar die Reihenfolge der Schritte, die im Bleichprozess verwendet werden, unterscheidet sich bei unterschiedlichen Pulpenmühlen, besteht ein ständiger Bedarf, neue Xylanasen zu finden, die bei verschiedenen Temperaturen und pH-Bedingungen aktiv sind.
Die meisten kommerziellen Xylanasen, die für Nahrungsmittelanwendungen und zur Pulpenbleichung ausgelegt wurden, sind nicht sehr thermotolerant, insbesondere wenn neutrale oder alkalische pH-Bedingungen verwendet werden. In der Praxis sind Xylanasen im Allgemeinen bei Temperaturen höher als 60°C ineffizient oder inaktiv, und oft arbeiten diese Enzyme unter sauren Bedingungen. Im Allgemeinen bestehen Unterschiede bei den physikalischen Eigenschaften von Xylanasen von Pilzen und Bakterien (für einen Übersichtsartikel siehe Wong et al., Microbiol. Rev. 52: 305–317 (1988)). Typischerweise haben Pilz-Xylanasen ein Temperaturoptimum von ungefähr 50°C und ein niedrigeres pH-Optimum als jene bakteriellen Ursprungs. Xylanasen bakteriellen Ursprungs haben im Allgemeinen ein Temperaturoptimum im Bereich von 50 bis 70°C.
PCT/LTS90/05933 (WO 91/05908) schlägt die Verwendung von Xylanasen beim Pulpenbleichen zusammen mit Chlor oder Chlorverbindungen vor. Chaetomium wird als Xylanase-Quelle vorgeschlagen. Es ist das Durchmustern von Streptomyces- und Chainia-Stämmen beschrieben. Bleichexperimente wurden unter Verwendung von Xylanase-Zusammensetzungen aus Chainia sp.-Kulturmedium durchgeführt.
EP-A 0 406 617 schlägt die Verwendung von Xylanase in einem enzymatischen delignifizierenden Prozess aus lignocellulosischem Material vor, insbesondere nach einem ligninolytischen Enzym. Die Xylanase kann aus verschiedenen Quellen abgeleitet sein, z. B. aus Chaetomium. Die Verwendung von Xylanase von Chainia sp.-Kulturmedium ist beispielhaft dargestellt.
Gandhi, J. P. et al., J. Chem. Tech. Biotechnol. 60: 55–60 (1994), berichteten von Untersuchungen bezüglich der Thermostabilität und pH-Stabilität von rohen Xylanase-Zusammensetzungen von Chaetomium globosum. Man fand heraus, dass die Optimumstemperatur der Xylanase im Bereich von 50 bis 60°C lag, während man herausfand, dass der Optimums-pH pH 5,0 war. Es wurde berichtet, dass das Enzym im Bereich von 40 bis 60°C über einen Zeitraum von 10 min nichts von der ursprünglichen Aktivität verlor und mehr als 70% der ursprünglichen Aktivität im Bereich von 70 bis 100°C über 10 min behielt. Die pH-Stabilität-Untersuchungen zeigten an, dass das Enzym seine vollständige Aktivität zwischen pH 5 und 6 und mehr als 70% der ursprünglichen Aktivität über einen breiten Bereich alkalischer pH-Werte (7–10) behielt. Es wurde vorgeschlagen, die Kultufiltrate zur Behandlung von Cellulosepulpen ohne weitere Aufreinigung zu verwenden.
Die Xylanase von Chaetomium cellulolyticum und Chaetomium trilaterale wurden ebenfalls untersucht (Dubeau, H. et al., Biotechnol. Lett. 9: 275–280 (1987); und Kawaminami, T. und Iitzuka, H., J. Ferment. Technol. 48: 161–168 (1970). Jedoch wurde weder über die Thermostabilität, noch über das pH-Profil der Enzyme berichtet. Es wurde vorgeschlagen, dass die Xylanasen beim Klären von Fruchtsäften von Nutzen sind. Die Verwendung dieser Enzyme beim Pulpenbleichen oder als Nahrungsmittelzusatz wurde nicht vorgeschlagen.
Ganju, R. K. et al., Can. J. Microbiol. 35: 836–842 (1989) berichteten von der Reinigung und Charakterisierung von zwei Xylanasen aus Chaetomium thermophile var. coprophile. Zwei Xylanasen (I und II) von mehreren extrazellulären Xylanasen, die von C. thermophile var. coprophile hergestellt wurden, wurden bis zur Homogenität gereinigt. Diese Enzyme hatten Molekulargewichte von 26.000 Dalton (Xylanase I) und 7.000 Dalton (Xylanase II). Die Temperaturoptima für Xylanase I und II waren 70 beziehungsweise 60°C, und sie waren optimal aktiv bei pH 4,8–6,4 beziehungsweise 5,4–6,9. Die Verwendung dieser Xylanasen bei der Pulpenbleichung oder als Nahrungsmittelzusatz wurde nicht vorgeschlagen.
Irie et al., Hakko Kogaku Kaishi 70(2): 109–114 (1992), berichteten von der Reinigung einer Xylanase aus einer Chaetomium gracile-Mutante. Es wurde berichtet, dass das Molekulargewicht 19.000 Dalton betrug, und die Xylanase enthielt zwei Untereinheiten: eine mit einem Molekulargewicht von 14.400 Dalton, und die andere mit einem Molekulargewicht von 4.800 Dalton. Der pI war 8,35. Die maximale Xylobiose-bildende Aktivität fand man bei pH 5,0 und bei 50°C. Wie berichtet, war der pH-Bereich pH 4,0–pH 7,0. Yoshino et al., Curr. Genet. 29: 73–80 (1995) berichteten von der Isolierung und Sequenzierung von zwei Xylanasegenen von Chaetomium gracile Wildtyp- und Mutanten-Stämmen und deren Expression in Aspergillus nidulans. Die reifen CgXA- und CgXB-Xylanasen enthalten 189 beziehungsweise 211 Aminosäuren und weisen eine Homologie von 68,5% auf. Die cgxA- und cgxB-Gene wurden in Aspergillus nidulans eingeführt, und es wurde berichtet, dass sie von ihren eigenen Promotoren exprimiert wurden. Die Verwendung dieser C. gracile-Xylanasen beim Pulpenbleichen oder als Nahrungsmittelzusatz wurde nicht vorgeschlagen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfinder haben die Wichtigkeit der Entwicklung eines in Bezug auf die Umwelt sicheren und ökonomischen Verfahrens der Modifizierung von Pflanzen-Biomasse erkannt und haben nach neuen Enzymen gesucht, die in solchen Prozessen nützlich sein können.
Die Erfindung ist auf DNA-Sequenzen gerichtet, die Gene umfassen, die für neue Xylanasen codieren, auf die neuen Xylanasen, die von solch einer DNA codiert werden, auf Expressionsvektoren, die solche DNA enthalten, Wirte, die mit solcher DNA transformiert sind und jegliche Enzymzusammensetzungen aus der Kultivierung solcher Wirte, die die exprimierten Xylanasen enthalten, und die Verwendung solcher Enzymzusammensetzungen. Solche Verwendungen umfassen das Enzym-gestützte Bleichen von Holzpulpen und Verfahren zur Modifizierung von Pflanzen-Biomasse, wie Verwendungen als Nahrungsmittelzusatz oder beim Backen.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt die Plasmidkarte von Plasmid pALK475 (8,4 kb), das das Xylanase 2 (xln2)-Gen von Trichoderma reesei trägt.
2 zeigt die DNA- und die abgeleitete Aminosäuresequenz des CBS-730.95 (ALKO4265)-xlnA-Gens von Chaetomium thermophilum. Die mutmaßliche Signalpeptidase-Schnittstelle ist durch einen Pfeil angezeigt. Das Stopkodon ist durch einen Asterisk angegeben.
3 zeigt die DNA- und die abgeleitete Aminosäuresequenz des CBS-730.95 (ALKO4265)-xlnB-Gens von Chaetomium thermophilum. Die mutmaßliche Signalpeptidase-Schnittstelle ist durch einen Pfeil angezeigt. Das Stopkodon ist durch einen Asterisk angegeben.
4 zeigt die DNA- und die abgeleitete Aminosäuresequenz des CBS-730.95 (ALKO4265)-xlnC-Gens von Chaetomium thermophilum. Die mutmaßliche Signalpeptidase-Schnittstelle ist durch einen Pfeil angezeigt. Das Stopkodon ist durch einen Asterisk angegeben.
5 zeigt die Karte von Plasmid pALK1108.
6 zeigt die Karte von Plasmid pALK1111.
7 zeigt die Karte von Plasmid pALK1113.
8 (A, B und C) zeigt die pH-Abhängigkeiten der Xylanaseaktivitäten von T. reesei-Transformanden, die C. thermophilum CBS 730.95-Xylanase A (8A), Xylanase B (8B) und Xylanase C (8C) produzieren. Enzymaktivität wurde nach 5 min Inkubation gemessen.
9 (A, B und C) zeigt die Temperaturabhängigkeiten der Xylanaseaktivitäten von T. reesei-Transformanden, die C. thermophilum CBS 730.95-Xylanase A (9A) und Xylanase B (9B) und Xylanase C (9C) produzieren. Enzymaktivität wurde nach 5 min Inkubation gemessen.
10 zeigt die SDS-PAGE-Analyse der Kulturfiltrate der T. reesei-Transformanden, die C. thermophilum CBS 730.95-Xylanasen XLNA, XLNB und XLNC produzieren. Der T. reesei-Wirtsstamm ALKO4468 und die rekombinanten Stämme ALKO4468/xlnA (ALKO4468/1108/7) und ALKO4468/xlnB (ALKO4468/1111/44) wurden in einem Laborfermenter kultiviert. Der XLNC-Produktionsstamm ALKO4468/xlnC (ALKO4468/1113/34) wurde in einer Schüttelflasche gezogen. Die Massen der Molekulargewichtsmarker (in kDa) sind rechts angegeben. Die Positionen von XLNA, XLNB und XLNC sind angegeben.
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Hinterlegungen
ALKO4265, von der International Mycological Institute/Biosystem Services als Chaetomium thermophilum La Touche identifiziert, wurde am B. November 1995 beim Centralbureau Voor Schimmelcultures in der Osterstraat 1, 3742 SK BAARN, Niederlande, hinterlegt, und ihm wurde die Hinterlegungs-Nr. CBS 730.95 zugewiesen.
Plasmide pALK475 (das das Gen für Trichoderma reesei-Xylanase 2 (xln2) enthält) und pALK1026, pALK1028 und pALK1049 (die die Gene für Chaetomium thermophilum-Xylanasen A (xlnA), B (xlnB) und C (xlnC) enthalten, wurden bei der Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Deutschland, am 21. Juni 1996 hinterlegt, und ihnen wurden die Hinterlegungs-Nrn. DSM 11020, DSM 11021, DSM 11022 beziehungsweise DSM 11023 zugewiesen.
Definitionen
Um ein klareres und beständiges Verständnis der Erfindung und der Ansprüche zu bieten, einschließlich des Umfangs, der solchen Begriffen zugewiesen werden soll, werden die folgenden Definitionen gegeben.
Enzym-gestütztes Bleichen. Mit "Enzym-gestütztes Bleichen" ist die Extraktion von Lignin aus Cellulosepulpe nach der Einwirkung von Hemicellulose-abbauenden Enzymen, mit oder ohne Lignin-abbauende Enzyme, gemeint. Das Entfernen des Lignins kann durch Hemicellulosen entweder physikalisch (durch Repräzipitieren auf die Faseroberfläche während des Kochens) oder chemisch (durch Lignin-Kohlenhydrat-Komplexe) eingeschränkt sein. Die Hemicellulaseaktivität baut die Hemicellulose partiell ab, was die Extrahierbarkeit von Ligninen durch konventionelle Bleichchemikalien (wie Chlor, Chlordioxid, Peroxid, etc.) erhöht (Viikari et al., "Bleaching with Enzymes" in Biotechnology in the Pulp and Paper Industry, Proc. 3rd Int. Conf., Stockholm, S. 67-69 (1986); Viikari et al., "Applications of Enyzmes in Bleaching", in Proc. 4th Int. Symp. Wood und Pulping Chemistry, Paris, Bd. 1, S. 151–154 (1987), Kantelinen et al., "Hemicellulases and their Potential Role in Bleaching" in International Pulp Bleaching Conference, Tappi Proceedings, S. 1–9 (1988)). Der Vorteil dieser verbesserten Bleichbarkeit ist ein geringerer Verbrauch von Bleichchemikalien und geringere Umweltbelastungen oder höhere Werte der finalen Helligkeit.
Enzymzusammensetzung. Mit "Enzymzusammensetzung" ist eine Zusammensetzung gemeint, die Enzyme enthält. Bevorzugt wurden die Enzyme (entweder partiell oder vollständig gereinigt) aus einer Mikrobe oder dem Medium, das verwendet wurde, um solch eine Mikrobe zu ziehen, extrahiert.
"Extrahiert aus" bedeutet, dass die gewünschten Enzyme von der Zellmasse getrennt wurden. Dies kann mittels jedes Verfahrens durchgeführt werden, das diese Aufgabe erfüllt, einschließlich des Aufbrechens von Zellen und auch einfach des Entnehmens des Kulturmediums von ausgebeuteten Zellen. Daher umfasst der Begriff "Enzymzusammensetzung" Zusammensetzungen, die Medium enthalten, das zuvor verwendet wurde um (eine) gewünschte Mikrobe(n) zu kultivieren, und jegliche Enzyme, die aus den mikrobiellen Zellen in ein solches Medium während der Kultur ausgeschüttet wurden, oder nachfolgende Verarbeitungsstufen.
Mit einem Wirt, der "im Wesentlichen unfähig" ist, eines oder mehrere Enzyme zu synthetisieren, ist ein Wirt gemeint, bei dem die Aktivität von einem oder mehreren der aufgezählten Enzyme herabgesetzt, gestört oder nicht vorhanden ist, im Vergleich mit dem Wildtyp.
Xylanase. Wie hier verwendet, ist Xylanase eine Hemicellulase, die die β-1,4-Bindungen innerhalb der xylosidischen Kette von Xylan trennt (Xylan ist ein Polymer aus D-Xylose-Resten, die über β-1,4-Bindungen verknüpft sind). Xylanaseaktivität ist zu xylanolytischer Aktivität synonym. Mit einer Aminosäuresequenz, die zu einer spezifischen Aminosäuresequenz äquivalent ist, ist eine Aminosäuresequenz gemeint, die mit der spezifischen Aminosäuresequenz nicht identisch ist, sondern zumindest einige Aminosäureaustausche (Deletionen, Substitutionen, Inversionen, Insertionen, etc.) enthält, die die biologische Aktivität des Proteins, verglichen mit einer ähnlichen Aktivität der spezifischen Aminosäuresequenz, nicht wesentlich beeinflussen, wenn sie für einen gewünschten Zweck verwendet wird. Die biologische Aktivität einer Xylanase ist ihre enzymatische Aktivität, katalytische Aktivität und/oder ihre Fähigkeit, an Hemicellulosematerial zu binden. Die biologische Aktivität der XLNA-, XLNB- und XLNC-Xylanasen umfasst außerdem ihre Fähigkeit, synergistisch mit anderen Hemicellulasen zu wirken. Bevorzugt enthält eine "äquivalente" Aminosäuresequenz mindestens 80%–99% Identität auf Aminosäureebene zur spezifischen Aminosäuresequenz, bevorzugt mindestens 90%, und in einer besonders stark bevorzugten Ausführungsform mindestens 95% Identität auf Aminosäureebene.
Thermotolerant. Ein Enzym ist thermotolerant, wenn es mehr als 50% seiner Aktivität behält, wenn es, wie beschrieben in Beispiel 5, untersucht wird (auch höhere pH- und Temperaturwerte können verwendet werden), wenn der Aktivitätswert von 60 min Inkubationszeit mit dem Aktivitätswert von 5 min Inkubationszeit (unter entsprechenden Bedingungen) verglichen wird, und wenn die Bedingungen wie folgt sind: pH ≥ 6 und bei einer Temperatur ≥ 60°C.
Klonierungsvehikel (Klonierungshilfsmittel). Ein Klonierungsvehikel ist eine Plasmid- oder Phagen-DNA oder eine andere DNA-Sequenz (wie beispielsweise eine lineare DNA), die eine geeignete Nucleinsäure-Transportumgebung für den Transfer eines interessierenden Gens in eine Wirtszelle bietet. Die erfindungsgemäßen Klonierungsvehikel können so konstruiert werden, dass sie autonom in prokaryontischen und eukaryontischen Wirten replizieren. In Pilz-Wirten, wie Trichoderma, replizieren die Klonierungsvehikel im Allgemeinen nicht autonom und bieten stattdessen lediglich ein Vehikel für den Transport des interessierenden Gens in den Trichoderma-Wirt für die nachfolgende Insertion in das Trichoderma-Genom. Das Klonierungsvehikel kann sich weiterhin durch eine oder eine kleine Anzahl von Endonuclease-Erkennungsstellen auszeichnen, an denen solche DNA-Sequenzen auf vorherbestimmbare Weise ohne Verlust einer essentiellen biologischen Funktion des Vehikels geschnitten werden können und in die DNA eingefügt werden kann um Replikation und Klonierung solch einer DNA zu bewirken. Das Klonierungsvehikel kann außerdem einen Marker enthalten, der zur Verwendung bei der Identifikation von Zellen, die mit dem Klonierungsvehikel transformiert sind, geeignet ist. Marker sind z. B. antibiotische Resistenzgene. Alternativ dazu können solche Marker auf einem Klonierungsvehikel zur Verfügung gestellt werden, welcher von dem, der das interessierende Gen beisteuert, getrennt ist. Das Wort "Vektor" wird manchmal für "Klonierungsvehikel" verwendet.
Expressionshilfsmittel/Expressionsvehikel. Ein Expressionsvehikel ist ein Klonierungsvehikel oder -vektor, ähnlich einem Klonierungsvehikel, der aber dazu in der Lage ist, ein interessierendes Gen zu exprimieren, und zwar nach der Transformation in einen erwünschten Wirt. Wenn ein Pilz-Wirt verwendet wird, wird das interessierende Gen einem Pilz-Wirt bevorzugt als Teil eines Klonierungs- oder Expressionsvehikels zur Verfügung gestellt, das in das Pilzchromosom integriert, oder es dem interessierenden Gen ermöglicht, in das Wirtschromosom zu integrieren. Sequenzen, die Teil des Klonierungsvehikels oder Expressionsvehikels sind, können zusammen mit dem interessierenden Gen während des Integrationsprozesses integrieren. In T. reesei umfassen Integrationsstellen, zu denen das interessierende Gen geleitet werden kann, die cbh- und/oder egl-Loci. Insbesondere kann das interessierende Gen darauf ausgelegt werden, ein Gen zu ersetzen, das eine unerwünschte Eigenschaft des Wirts codiert.
Das interessierende Gen wird außerdem bevorzugt unter die Kontrolle von bestimmten Kontrollsequenzen gestellt (d. h., funktionell damit verbunden), wie beispielsweise Promotorsequenzen, die vom Vektor bereitgestellt werden (welche zusammen mit dem interessierenden Gen integrieren). Alternativ dazu können die Kontrollsequenzen jene an der Insertionsstelle sein.
Die Expressionskontrollsequenzen eines Expressionsvektors variieren in Abhängigkeit davon, ob der Vektor so ausgestaltet ist, dass er ein bestimmtes Gen in einem prokaryontischen oder aber in einem eukaryontischen Wirt exprimiert (z. B. kann ein Shuttlevektor ein Gen zur Selektion in bakteriellen Wirten bereitstellen). Expressionskontrollsequenzen können transkriptionelle regulatorische Elemente enthalten, wie Promotoren, Enhancer-Elemente, und transkriptionelle Terminationssequenzen und/oder translationale regulatorische Elemente, wie z. B. Translations-Initiations- und -Terminationsstellen.
Wie hierin beschrieben, wird ALKO4265, Chaetomium thermophilum La Touche, hinterlegt als CBS 730.95, als Beispiel eines Donors von Xylanasegenen, die nützlich bei mehreren Anwendungen sind (z. B. beim Bleichen oder als Nahrungsmittelzusatz), verwendet. Solche Xylanasen können auch von anderen Stämmen derselben Spezies oder von abweichenden Organismen abgeleitet sein.
1. Klonierung und Expression der Xylanase-codierenden Gene
Das Verfahren zur gentechnischen Veränderung der Wirte dieser Erfindung wird durch die Klonierung von genetischen Sequenzen, die für die gewünschte Xylanaseaktivität codieren, und durch die Expression solcher genetischer Sequenzen vereinfacht. Wie hier verwendet, soll sich der Begriff "genetische Sequenzen" auf ein Nucleinsäuremolekül beziehen (bevorzugt eine DNA). Genetische Sequenzen, die für die gewünschte Xylanase codieren, sind von einer Vielzahl von Quellen abgeleitet. Diese Quellen umfassen genomische DNA, cDNA, synthetische DNA und Kombinationen davon. Es können Vektorsysteme verwendet werden um Wirte für die Produktion der erfindungsgemäßen Enzymzusammensetzungen zu produzieren. Solch eine Vektorkonstruktion (a) kann außerdem eine getrennte Vektorkonstruktion bereitstellen, (b) welche mindestens ein gewünschtes Gen trägt, das in das Genom des Wirts zu integrieren ist, und (c) einen selektierbaren Marker, der mit (a) oder (b) verbunden ist. Alternativ dazu kann ein getrennter Vektor für den Marker verwendet werden.
Von einem Nucleinsäuremolekül, wie einer DNA, sagt man, dass es bezüglich eines Polypeptids "zur Expression befähigt ist", wenn es Expressionskontrollsequenzen enthält, welche Informationen zur transkriptionellen Regulation enthalten, und wenn solche Sequenzen mit der Nucleotidsequenz, welche für das Polypeptid codiert, "funktionell verknüpft" sind.
Eine funktionelle Verknüpfung ist eine Verknüpfung, bei der eine Sequenz mit einer regulatorischen Sequenz (oder Sequenzen) auf solch eine Weise verbunden ist, dass die Expression der Sequenz unter den Einfluss oder die Kontrolle der regulatorischen Sequenz gestellt wird. Von zwei DNA-Sequenzen (wie einer Protein-codierenden Sequenz und einer Promotorregionsequenz, die mit dem 5'-Ende der codierenden Sequenz verbunden ist) sagt man, dass sie funktionell miteinander verknüpft sind, wenn die Induktion der Promotorfunktion zur Transkription der mRNA der Protein-codierenden Sequenz führt, und wenn die Natur der Verknüpfung zwischen den zwei DNA-Sequenzen nicht (1) zur Einführung einer Leserahmenmutation führt, (2) nicht mit der Fähigkeit der Expressionsregulationssequenzen interferriert, die Expression der mRNA, antisense-RNA oder des Proteins zu steuern, oder (3) nicht die Fähigkeit der Matrize stört, von der Promotorregionsequenz transkribiert zu werden. Somit wäre eine Promotorregion mit einer DNA-Sequenz funktionell verknüpft, wenn der Promotor in der Lage wäre, die Transkription der DNA-Sequenz zu bewirken.
Die genaue Natur der regulatorischen Regionen, die für die Genexpression benötigt werden, kann bei Spezies oder Zellarten variieren, aber sie sollte im Allgemeinen notwendigerweise 5'-nicht-transkribierende und 5'-nicht-translatierende (nicht-codierende) Sequenzen umfassen, die in die Initiation der Transkription beziehungsweise Translation eingebunden sind.
Die Expression des Proteins in transformierten Wirten erfordert die Verwendung von regulatorischen Regionen, die in solchen Wirten funktionell sind. Eine breite Vielfalt von transkriptionellen und translationellen regulatorischen Sequenzen kann verwendet werden. In Eukaryonten, wo die Transkription nicht mit der Translation verknüpft ist, können solche Kontrollregionen ein Initiator-Methionin (AUG)-Kodon bereitstellen oder aber auch nicht, abhängig davon, ob die klonierte Sequenz solch ein Methionin enthält. Solche Regionen umfassen im Allgemeinen eine Promotorregion, die ausreicht um die Initiation der RNA-Synthese in der Wirtszelle zu steuern.
Wie allgemein bekannt ist, wird die Translation eukaryontischer mRNA an dem Kodon initiiert, welches das erste Methionin codiert. Aus diesem Grund ist es bevorzugt, sicherzustellen, dass die Verknüpfung zwischen einem eukaryontischen Promotor und einer DNA-Sequenz, welche das Protein codiert, oder ein funktionelles Derivat davon, keine störenden Kodons enthält, welche in der Lage sind, ein Methionin zu codieren. Die Anwesenheit solcher Kodons führt entweder zur Bildung eines Fusionsproteins (wenn das AUG-Kodon im selben Leserahmen wie die Protein-codierende DNA-Sequenz liegt) oder zu einer Leserahmenmutation (wenn das AUG-Kodon nicht im selben Leserahmen wie die Protein-codierende Sequenz liegt).
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein gewünschtes Protein aufgrund der Anwesenheit einer Sekretions-Signalsequenz in das umgebende Medium sezerniert. Wenn ein gewünschtes Protein nicht seine eigene Signalsequenz besitzt oder wenn solch eine Signalsequenz im Wirt nicht gut funktioniert, kann die codierende Sequenz des Proteins mit einer Signalsequenz, die bezüglich des Wirts homolog oder heterolog ist, funktionell verknüpft werden. Die gewünschte codierende Sequenz kann mit jeder Signalsequenz verknüpft werden, welche die Sekretion des Proteins aus dem Wirt ermöglicht. Solche Signalsequenzen können mit oder ohne spezifische Protease-Schnittstellen ausgestaltet werden, so dass die Signalpeptidsequenz für nachfolgendes Entfernen empfänglich ist. Alternativ dazu kann ein Wirt verwendet werden, der das Protein in das Medium durchlässt, beispielsweise ein Wirt mit einer Mutation in seiner Membran.
Wenn es erwünscht ist, kann man die nicht-transkribierten und/oder nicht-translatierten Regionen 3'-gelegen von der Sequenz, die für ein Protein codiert, mittels der oben beschriebenen Klonierungsverfahren erhalten. Die 3'-nicht-transkribierte Region kann aufgrund ihrer transkriptionellen Terminations-Regulations-Sequenzelemente beibehalten werden; die 3'-nicht-translatierte Region kann aufgrund ihrer translationalen Terminations-Regulations-Sequenzelemente beibehalten werden, oder aufgrund der Elemente, die die Polyadenylierung in eukaryontischen Zellen steuern.
Die erfindungsgemäßen Vektoren können außerdem andere funktionell verknüpfte regulatorische Elemente, wie Enhancer-Sequenzen, umfassen.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden genetisch stabile Transformanden konstruiert, wobei die DNA eines gewünschten Proteins in das Wirtschromosom integriert wird. Die codierende Sequenz für das gewünschte Protein kann aus jeder Quelle stammen. Solch eine Integration kann de novo innerhalb der Zelle auftreten oder, in einer besonders bevorzugten Ausführungsform, durch die Transformation mit einem Vektor unterstützt werden, der sich selbst funktionell in das Wirtschromosom integriert, beispielsweise einem Vektor, der DNA-Elemente enthält, die die Integration von DNA-Sequenzen in Chromosomen fördern.
Zellen, die die eingefügte DNA in ihre Chromosomen stabil integriert haben, werden selektiert, indem außerdem einer oder mehrere Marker eingeführt werden, die die Selektion von Wirtszellen ermöglichen, die den Expressionsvektor im Chromosom enthalten, der Marker kann z. B. Biocid-Resistenz verleihen, z. B. Resistenz gegen Antibiotika oder Schwermetalle, wie beispielsweise Kupfer, oder ähnliches. Das selektierbare Markergen kann entweder direkt mit den zu exprimierenden DNA-Gensequenzen verbunden sein, oder mittels Co-Transformation in dieselbe Zelle eingeführt werden.
Wichtige Faktoren bei der Auswahl eines bestimmten Plasmid- oder viralen Vektors umfassen: die Einfachheit, mit der Rezipientenzellen, die den Vektor enthalten, erkannt und von jenen Rezipientenzellen selektiert werden können, die den Vektor nicht enthalten; die Kopienzahl des Vektors, die in einem gewünschten Wirt vorliegt; und ob es wünschenswert ist, in der Lage zu sein, den Vektor zwischen Wirtszellen verschiedener Spezies hin- und herzutransferrieren ("shuttle").
Ist einmal der Vektor oder die DNA-Sequenz, der/die das/die Konstrukt(e) enthält, für die Expression präpariert, wird/werden das/die DNA-Konstrukte) mittels irgendeines einer Vielzahl von geeigneten Mitteln in eine geeignete Wirtszelle eingeführt, einschließlich der Transformation, wie oben beschrieben. Nach dem Einführen des Vektors werden die Zellen in einem selektiven Medium gezogen, welches auf das Wachstum von transformierten Zellen hin selektiert. Die Expression der clonierten Gensequenzen) führt zur Produktion des gewünschten Proteins oder zur Produktion eines Fragments dieses Proteins. Diese Expression kann auf kontinuierliche Weise in den tranformierten Zellen stattfinden oder auf kontrollierte Art und Weise.
Dementsprechend können die Xylanase-codierenden Sequenzen mit jedem gewünschten Vektor funktionell verbunden werden und in einen ausgewählten Wirt transformiert werden, damit sie für die Expression solcher Proteine in diesem Wirt sorgen.
Der Gegenstand der Erfindung sind auch Nucleinsäuremoleküle, die für Proteine codieren, die die biologische Aktivität einer Xylanase besitzen und die mit irgendeiner der oben beschriebenen oder im Folgenden definierten Nucleinsäuremoleküle hybridisieren: Ein Nucleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid codiert, das die enzymatische Aktivität einer Xylanase besitzt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

(a) Nucleinsäuremolekülen, die für ein Polypeptid codieren, das die Aminosäuresequenz, wie sie in 2 dargestellt ist, umfasst;
(b) Nucleinsäuremolekülen, die die codierende Sequenz der Nucleotidsequenz, wie sie in 2 dargestellt ist, umfassen;
(c) Nucleinsäuremolekülen, die für ein Polypeptid codieren, das die Aminosäuresequenz umfasst, die von dem DNA-Insert, das in DSM 11021 enthalten ist, codiert wird;
(d) Nucleinsäuremolekülen, die die codierende Sequenz des DNA-Inserts umfassen, das in DSM 11021 enthalten ist;
(e) Nucleinsäuremolekülen, deren codierende Sequenz sich von der codierenden Sequenz eines Nucleinsäuremoleküls aus (a) bis (d) aufgrund der Degeneration des genetischen Codes unterscheidet;
(f) Nucleinsäuremolekülen, die mit einem Molekül nach einem der Abschnitte (a)–

2

Der Begriff "Hybridisierung" in diesem Kontext meint Hybridisierung unter konventionellen Hybridisierungsbedingungen, bevorzugt unter stringenten Bedingungen, wie z. B. bei Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) beschrieben. Diese Nucleinsäuremoleküle, die mit den erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen hybridisieren, können im Prinzip von jedem Organismus abgeleitet sein, der solche Nucleinsäuremoleküle enthält. Bevorzugt sind sie von Pilzen abgeleitet, nämlich von jenen der Gattung Chaetomium. Nucleinsäuremoleküle, die mit den erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen hybridisieren, können z. B. aus genomischen Bibliotheken oder cDNA-Bibliotheken verschiedener Organismen, nämlich Pilzen, isoliert werden.
Solche Nucleinsäuremoleküle können identifiziert und isoliert werden, indem die Nucleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung oder Fragmente dieser Moleküle oder die reversen komplementären Sequenzen dieser Moleküle verwendet werden, z. B. mittels Hybridisierung entsprechend Standardtechniken (siehe Sambrook et al. (1989)).
Als Hybridisierungsprobe können z. B. Nucleinsäuremoleküle verwendet werden, die exakt oder im Wesentlichen dieselbe Nucleotidsequenz haben, die in 2 gezeigt ist, oder Fragmente der Sequenz. Die als Hybridisierungs-Sonden verwendeten Fragmente können auch synthetische Fragmente sein, die mittels konventioneller Synthesetechniken erhalten wurden und deren Sequenz im Wesentlichen identisch zu der der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle ist. Wurden erst Gene, die mit den erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen hybridisieren, identifiziert und isoliert, ist es notwendig, die Sequenz zu bestimmen und die Eigenschaften des Proteins, das von der Sequenz codiert wird, zu untersuchen.
Die Bezeichnung "hybridisierende DNA-Moleküle" umfasst Fragmente, Derivate und allelische Varianten der oben beschriebenen Nucleinsäuremoleküle, die für das oben beschriebene Protein oder ein biologisch aktives Fragment davon codieren. Fragmente sind als Teile von Nucleinsäuremolekülen zu verstehen, die lang genug sind um für das beschriebene Protein oder ein biologisch aktives Fragment davon zu codieren. Der Begriff "Derivat" meint in diesem Kontext, dass die Nucleotidsequenzen dieser Moleküle sich von den Sequenzen der oben beschriebenen Nucleinsäuremoleküle in einer oder mehreren Positionen unterscheiden und zu der Sequenz stark homolog sind. Homologie versteht sich als Sequenzidentität von mindestens 40%, insbesondere eine Identität von mindestens 60%, bevorzugt mehr als 80%, und noch bevorzugter mehr als 90%. Die Abweichungen von den oben beschriebenen Nucleinsäuremolekülen können ein Ergebnis von Deletion, Substitution, Insertion, Addition oder Kombination sein.
Homologie bedeutet weiterhin, dass die entsprechenden Nucleotidsequenzen oder codierten Proteine funktionell und/oder strukturell äquivalent sind. Die Nucleinsäuremoleküle, die zu den oben beschriebenen Nucleinsäuremolekülen homolog sind und die Derivate der Nucleinsäuremoleküle sind, sind regelmäßig Variationen der Moleküle, welche Modifikationen repräsentieren, die dieselbe biologische Funktion besitzen. Es können natürlich vorkommende Variationen sein, wie beispielsweise Sequenzen von anderen Organismen oder Mutationen. Diese Mutationen können natürlich vorkommen oder durch spezifische Mutagenese erreicht werden. Außerdem können diese Variationen synthetisch hergestellte Sequenzen sein. Die allelischen Varianten können natürlich vorkommende Varianten sowie synthetisch hergestellte oder gentechnologisch erzeugte Varianten sein.
Die Proteine, die von den verschiedenen Varianten der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle codiert werden, teilen spezifische gemeinsame Eigenschaften, wie enzymatische Aktivität, Molekulargewicht, immunologische Reaktivität, Konformation, etc., sowie physikalische Eigenschaften, wie elektrophoretische Mobilität, Chromatographieverhalten, Sedimentationskoeffizienten, Löslichkeit, spektroskopische Eigenschaften, Stabilität, pH-Optimum, Temperaturoptimum, etc. Enzymatische Aktivität der Xylanase kann z. B. wie in Beispiel 5 beschrieben detektiert werden.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich weiterhin auf Nucleinsäuremoleküle, deren Sequenzen sich von den oben identifizierten Molekülen aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes unterscheiden und welche für ein Protein codieren, das die biologische Aktivität einer Xylanase besitzt.
Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle sind bevorzugt RNA- oder DNA-Moleküle, insbesondere genomische DNA oder cDNA.
Die Xylanase-codierenden Sequenzen, die hierin beschrieben sind, können im Leserahmen mit anderen Sequenzen fusioniert werden um DNA, die für ein Fusionsprotein codiert, zu konstruieren. Z. B. kann ein rekombinanter Vektor, der für ein Xylanasegen codiert, wie oben präpariert werden, mit der Ausnahme, dass die Xylanase-codierende Sequenz mit einer "carrier"-Sequenz einer Trichoderma-Cellulase oder -Hemicellulase fusioniert wird, oder zumindest mit einer funktionellen Domäne der Cellulase oder Hemicellulase, wie in US 5 298 405 , WO 93/24622 und im GenBank-Eintrag L25310 beschrieben. Insbesondere ist die Cellulase oder Hemicellulase ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus CBHI, CBHII, EGI, EGII, XYLI, XYLII und MANI, oder einer Domäne davon, wie der Sekretionssignal- oder der Kernsequenz. Mannanase besitzt dieselbe Domänenstruktur wie die der Cellulasen: eine Kerndomäne, die die aktive Stelle enthält, eine Gelenkdomäne, die eine Serin-Threonin-reiche Region enthält, und einen Schwanz, der die Bindungsdomäne enthält.
Es können Fusionspeptide konstruiert werden, die eine Mannanase- oder Cellobiohydrolase- oder Endoglucanase- oder Xylanase-Kerndomäne oder die Kern- und die Gelenkdomänen derselben enthalten, fusioniert mit der erfindungsgemäßen Xylanasesequenz. Das Ergebnis ist ein Protein, das eine Mannanase- oder Cellobiohydrolase- oder Endoglucanase- oder Xylanase-Kern- oder -Kern- und -Gelenkregionen enthält, und eine erfindungsgemäße Xylanase. Das Fusionsprotein enthält sowohl die Mannanase- oder Cellobiohydrolase- oder Endoglucanase-, als auch Xylanaseaktivitäten der verschiedenen Domänen, wie sie vom Fusionskonstrukt bereitgestellt werden. Das Carrier-/Träger-Polypeptid braucht keine enzymatische Aktivität zu besitzen oder seine Aktivität kann inaktiviert sein.
Fusionsproteine können auch so konstruiert sein, dass der Mannanase- oder Cellobiohydrolase- oder Endoglucanase- oder Xylanaseschwanz oder ein gewünschtes Fragment davon umfasst ist, der vor der Xylanasesequenz plaziert ist, insbesondere so, dass er die Verwendung einer nicht-spezifischen Proteasestelle im Schwanz als Proteasestelle für die Wiedergewinnung der Xylanase aus dem exprimierten Fusionsprotein ermöglicht.
Alternativ dazu können Fusionsproteine konstruiert werden, die eine Proteasestelle in einem Linker bereitstellen, der vor der Xylanasesequenz plaziert ist, mit oder ohne Schwanzsequenzen.
Xylanasesequenzen oder ein Teil davon können auch als N-terminaler Teil des Fusionspeptids verwendet werden, wie oben beschrieben, zur Herstellung von anderen Proteinen. In diesem Fall kann unter Verwendung der oben beschriebenen Strategie die Linkerregion konstruiert werden.
Neue Eigenschaften für die Xylanasen können erzeugt werden, indem Domänen, wie beispielsweise Cellulose-Binde-Domäne (CBD), bevorzugt mit ihrem Linker, mit der erfindungsgemäßen Xylanase fusioniert werden. Bevorzugt sind solche CBDs und Linker, die entsprechenden CBD- und Linker-Domänen einer Trichoderma-Cellulase oder -Mannanase, und insbesondere die von einer Trichoderma reesei-Cellulase oder -Mannanase.
2. Die erfindungsgemäßen Enzymzusammensetzungen
Es wurden neue Xylanasen von Chaetomium thermophilum charakterisiert. Man hat herausgefunden, dass Stämme von Chaetomium, und insbesondere Chaetomium thermophilum, Xylanasen exprimieren und sezernieren, die für die Pulpen- und Papierindustrie besonders nützlich sind. Diese Xylanasen sind auch in unreinen Formen nützlich, wie Enzymzusammensetzungen, die das ausgebeutete Kulturmedium vom Wachstum der Organismen enthalten oder im Wesentlichen sind (US-Anmeldung 60/008 746).
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die in den erfindungsgemäßen Enzymzusammensetzungen vorhandenen und in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Xylanasen bevorzugt jene von Chaetomium, und insbesondere Chaetomium thermophilum (CBS 730.95), und in einer besonders bevorzugten Ausführungsform von dem Xylanasegen der Erfindung, xlnA, codiert.
Die Erfindung stellt Verfahren zum Herstellen einer Enzymzusammensetzung zur Verfügung. Diese Zusammensetzung kann bezüglich der cellulolytischen Aktivität (d. h., bezüglich der Fähigkeit, Cellulose vollständig zu Glucose abzubauen), teilweise oder vollständig defizient sein und bezüglich einer oder mehrerer Xylanasen, die für die Pulpen- und Papierverarbeitung wünschenswert sind, angereichert sein. Mit "defizient bezüglich der cellulolytischen Aktivität" ist eine reduzierte, verminderte oder unterdrückte Kapazität, Cellulose zu Mucose abzubauen, gemeint. Solche bezüglich der cellulolytischen Aktivität defizienten Zusammensetzungen und die Herstellung derselben mittels rekombinanter DNA-Verfahren sind in US 5 298 405 beschrieben. Verbrauchtes Medium vom Wachstum rekombinanter Wirte oder Enzyme, die daraus gereinigt wurden, können als Quelle der erfindungsgemäßen Enzymzusammensetzungen in der gewünschten Anwendung verwendet werden. Außerdem können, wenn die gewünschten Aktivitäten in mehr als einem rekombinanten Wirt vorhanden sind, solche Zusammensetzungen von den geeig neten Wirten isoliert werden und vor der Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren kombiniert werden.
Um die erfindungsgemäßen Enzymzusammensetzungen zu erhalten, werden die oben beschriebenen rekombinanten Wirte, die die gewünschten Eigenschaften besitzen (d. h., Wirte, die in der Lage sind, ökonomisch geeignete Mengen der gewünschten Xylanaseenzyme zu exprimieren und wahlweise jene, welche im Wesentlichen unfähig sind, ein oder mehrere Cellulaseenzyme zu exprimieren), unter geeigneten Bedingungen kultiviert, die gewünschten Enzyme werden aus den Wirten in das Kulturmedium sezerniert, und die Enzymzusammensetzung wird von dem Kulturmedium mittels Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, gewonnen. Die erfindungsgemäßen Enzymzusammensetzungen können hergestellt werden, indem die rekombinanten Stämme in einem Fermenter in einem geeigneten Wachstumsmedium kultiviert werden (wie beispielsweise in Beispiel 5 gezeigt).
Die Enzymzusammensetzung kann das ausgebeutete Kulturmedium mit oder ohne die transformierten Wirtszellen sein, oder es kann eine Xylanase-enthaltende Zusammensetzung sein, die von demselben unter Anwendung von Verfahren, die im Stand der Technik wohlbekannt sind, gewonnen wurde. Da jedoch die Xylanaseenzyme in das Kulturmedium sezerniert werden und Aktivität in den Umgebungsbedingungen der hemicellulolytischen Flüssigkeit aufweisen, ist es ein Vorteil der Erfindung, dass die erfindungsgemäßen Enzymzusammensetzungen direkt ohne weitere Reinigung vom Kulturmedium verwendet werden können. Wenn es erwünscht ist, können solche Zusammensetzungen gefiltert oder lyophilisiert werden, oder aber die enzymatische Aktivität anders konzentriert und/oder zur Lagerung stabilisiert werden. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen sind sehr preisgünstig bereitzustellen und zu verwenden, da (1) die Enzyme in roher Form verwendet werden können; Isolierung eines spezifischen Enzyms aus der Kulturflüssigkeit ist unnötig, und (2) da die Enzyme in das Kulturmedium sezerniert werden, nur das Kulturmedium gewonnen werden muss um die gewünschte Enzymzusammensetzung zu erhalten; es besteht keine Notwendigkeit, ein Enzym aus den Wirten zu extrahieren. Bevorzugt ist der Wirt für eine solche Herstellung Trichoderma, und insbesondere T. reesei.
Die erfindungsgemäßen Enzymzusammensetzungen können als Flüssigkeit oder als Feststoff bereitgestellt werden, beispielsweise als trockenes Puder oder in granulärer oder flüssiger Form, insbesondere nicht-staubende Granula, oder als stabilisierte Flüssigkeit, oder die Enzymzusammensetzung kann auf andere Weise konzentriert oder zur Lagerung oder Verwendung stabilisiert werden.
Die erfindungsgemäßen Enzymzusammensetzungen können so eingestellt werden, dass sie die Erfordernisse spezifischer Bedürfnisse in verschiedenen industriellen Anwendungen erfüllen. Es wird in Betracht gezogen, dass Enzymzusammensetzungen, die eine oder mehrere der erfindungsgemäßen Xylanasen enthalten, weiter angereichtert werden können oder im Hinblick auf spezifische enzymatische Aktivitäten teilweise oder vollständig defizient gemacht werden können um die Erfordernisse einer spezifischen Verwendbarkeit bei verschiedenen Anwendun gen, z. B. in der Pulpen- und Papierindustrie, zu befriedigen. Ein Gemisch aus Enzymaktivitäten, die von einem Wirt, und insbesondere einem Pilz, sezerniert werden, kann ausgewählt werden, damit es in einer besonderen industriellen Anwendung vorteilhaft ist, beispielsweise beim Bleichen.
Es können Mischungen mit anderen Makromolekülen hergestellt werden, die nicht alle von demselben Wirt sezerniert werden (beispielsweise anderen Enzymen, wie Endoglucanasen, Cellobiohydrolasen, Proteasen, Lipasen, Peroxidasen, Oxidasen oder Amylasen), oder mit Chemikalien, die die Wirksamkeit, Stabilität oder das Puffern der gewünschten Enzymzusammensetzung verbessern. Nicht-staubende Granula können ummantelt werden. Flüssige Enzymzusammensetzungen können durch Zugabe eines Polyols stabilisiert werden, beispielsweise Propylenglykol, einem Zucker oder Zuckeralkohol, Milchsäure oder Borsäure, entsprechend etablierter Verfahren.
Wenn es erwünscht ist, kann ein exprimiertes Protein entsprechend konventionellen Bedingungen weiter aufgereinigt werden, wie Extraktion, Präzipitation, Chromatographie, Affinitätschromatographie, Elektrophorese, oder ähnlichem.
3. Anwendungen
Allgemein sind die vorliegenden Enzymzusammensetzungen nützlich für die Degradierung von Xylan-enthaltenden Substraten. Insbesondere sind die Enzymzusammensetzungen dieser Erfindung nützlich in der Pulpen- und Papierindustrie, bevorzugt beim Bleichen von Pulpe. Die Zusammensetzungen können auch bevorzugt zur Herstellung von Tierfuttermitteln, in Mehlzusammensetzungen und in Teig für die Herstellung von Broten verwendet werden.
Daher umfasst die vorliegende Erfindung in einer bevorzugten Ausführungsform ein Verfahren zur enzymatischen Behandlung von Pflanzen-Biomasse unter Hochtemperaturbedingungen (50–80°C) und bei pH 5–8 für eine gewünschte Zeit, wie z. B. eine Stunde.
Pflanzen-Biomasse ist ein gemischtes Material, das vornehmlich aus einer Matrix aus Cellulose, Hemicellulose und Lignin besteht. Das Entfernen der Lignin-Komponente während der Herstellung von Papierpulpe ist wegen seiner braunen Farbe und Tendenz, die Stärke des Papierproduktes zu reduzieren, wünschenswert. Es wurden viele Verfahren für das Entfernen von Lignin entwickelt. Typischerweise wird die Holzpulpe mit auf Chlor basierenden oder anderen toxischen oder umweltschädlichen Chemikalien behandelt um die Lignin-Komponente zu entfernen und für eine gebleichte Pulpe zu sorgen. Die unerwünschten Nebenprodukte dieser chemischen Behandlung greifen jedoch die Gesundheit und Stabilität der Umwelt an, in die sie entlassen werden. Entsprechend besteht ein großer Bedarf nach der Entwicklung alternativer, weniger umweltschädlicher Techniken um das Bleichen von Pulpe zu erreichen.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird bevorzugt in vitro in der Hemicelluloseenthaltenden Pulpe durchgeführt. Das Verfahren umfasst das In-Kontakt-Bringen der Enzymzusammensetzung, des ausgebeuteten Kulturmediums oder des konzentrierten Xylanaseenthaltenden Gemisches mit der Holzpulpe. Routineberechnungen ermöglichen es dem Fach mann, die optimalen Behandlungsbedingungen, wie Zeit, Enzymdosierung, Konsistenz der Pulpe, pH und Temperatur, und andere Variablen, zu bestimmen.
Wenn die erfindungsgemäßen Enzymzusammensetzungen verwendet werden um Pflanzenpulpe zu behandeln, können sie zusammen mit irgendeinem oder allen üblichen Bleichchemikalien, wie Chlor, Chlordioxid, Wasserstoffperoxid, Ozon, Sauerstoff, Natriumyhdroxid, etc., verwendet werden.
Dosierung, pH, Temperatur und Zeit der Enzymbehandlung können alle einfach variiert werden um eine maximale Effizienz der Behandlung sicherzustellen. Der pH kann z. B. von ungefähr pH 5 bis ungefähr pH 8, die Temperatur von ungefähr 50°C bis ungefähr 80°C, die Behandlungszeit mit der Enzymzusammensetzung von ungefähr 0,5 Stunden bis ungefähr 24 Stunden, und die Dosierung von ungefähr 20 bis ungefähr 200 nkat/g Pulpentrockenmaterial reichen. Die Enzymbehandlung kann zu veschiedenen Bleichprozessen, die Sequenzen aufeinanderfolgender chemischer Behandlungsstufen sind, hinzugefügt werden. Typische Bleichprozesse sind:

1) elementares Chlor-enthaltende Sequenzen, die z. B. durch eine Sequenz X(C/D)EDED dargestellt werden können, wobei X eine Behandlung mit einem Enzym, beispielsweise einem Enzym der Erfindung, anzeigt, C/D kombinierte Behandlung mit elementarem Chlor (C) und Chlordioxid (D) anzeigt, E eine alkalische Extraktion anzeigt und D Chlordioxidbehandlung anzeigt;
2) elementares Chlor-freie (ECF) Sequenzen, die z. B. mit einer Sequenz XDEDED dargestellt werden können;
3) vollständig Chlor-freie (DCF) Sequenzen, die z. B. von einer Sequenz XQPPP dargestellt werden können, wobei Q für Chelieren steht, d. h., eine Metallentfernungsstufe, und P eine Wasserstoffperoxidbehandlung anzeigt (PPP zeigt drei aufeinanderfolgende Peroxidstufen an). Typischerweise umfassen TCF-Sequenzen auch verschiedene andere Stufen, wie unterschiedliche Extraktionsstufen (E, EO, EOP), Ozon (Z), Sauerstoff (O), Druck-Peroxidstufen (OP), etc.

Die erfindungsgemäßen Enzymzusammensetzungen befriedigen die Anforderungen spezifischer Bedürfnisse in verschiedenen Anwendungen in der Pulpen- und Papierindustrie, einschließlich dem Entrinden von Stämmen und der Verfeinerung von Holz um Energieverbauch in der mechanischen Pulpenproduktion zu reduzieren. Beim Zerfasern der Pulpe können die erfindungsgemäßen Enzymzusammensetzungen verwendet werden um externe Faserung zu erhöhen und das Quellen der Pulpenfasern zu verbessern oder zu erleichtern, und daher die Papierherstellungseigenschaften der Fasern verbessern. Die Xylanasen, die in der erfindungsgemäßen Enzymzusammensetzung vorhanden sind, können auch verwendet werden um die Entwässerungsfähigkeit der Pulpe zu verbessern und/oder den Rückhalt von Wasser zu vermindern.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen Enzymzusammensetzungen als Nahrungsmittelzusätze verwendet und verbessern so die Wachstumsrate von Tieren und den Umsatz des Futters. In einer dritten bevorzugten Ausführungsform wird die vorliegende Enzymzusammensetzung beim Backen verwendet, wobei eine Verbesserung des Teigs und der Broteigenschaften erreicht werden können.
Die Erfindung ist detaillierter in den folgenden Beispielen beschrieben. Diese Beispiele zeigen nur wenige konkrete Anwendungen der Erfindung. Daher sollen die Beispiele nicht so interpretiert werden, dass sie den Umfang der Erfindung einengen, sondern dass sie die Verwendung der Erfindung klarmachen.
BEISPIELE
Beispiel 1
Isolierung der chromosomalen DNA und Konstruktion der genomischen Bibliothek
Chaetomium thermophilum CBS 730.95 (ALKO4265) wurde in 2 × 250 ml Medium (bestehend aus 0,6% Solka Floc cellulose SW 200, 0,6% Getreideschlempe, 0,3% Haferspelzen-Xylan, 0,2% CaCO₃, 0,15% Sojabohnenmehl (fettarm), 0,15% (NH₄)₂HPO₄, 0,1% Gerstenkleie, 0,05% KH₂PO₄, 0,05% MgSO₄ × 7H₂O, 0,05% NaCl, 0,05% Spurenelementlösung-1, 0,05% Spurenelementlösung-2, 0,03% KNO₃), pH 6,5, in Schüttelflaschen für 3 Tage bei 40–45°C unter Schütteln mit 250 UpM kultiviert. Spurenelementlösung-1 enthält 1,60 g MnSO₄, 3,45 g ZnSO₄ × 7H₂O, 2,00 g CoCl₂ × 6H₂O pro Liter. Spurenelementlösung-2 enthält 5,00 g FeSO₄ × 7H₂O und 2 Tropfen konzentriertes H₂SO₄ pro Liter.
Die chromosomale DNA wurde nach Raeder und Broda, Lett. Appl. Microbiol. 1: 17–20 (1985), isoliert. Kurz, das Mycel wurde mit 20 mM EDTA gewaschen und in Extraktionspuffer (200 mM Tris-HCl (pH 8,5), 250 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0,5% SDS) lysiert. Die DNA wurde mit Phenol und einem Gemisch aus Chloroform : Isoamylalkohol (24 : 1 V/V) extrahiert. RNA wurde mit RNase verdaut.
Die chromosomale DNA wurde mit Sau3A (Boehringer Mannheim, Deutschland) partiell verdaut und mit Kälbermagen-alkalischer-Phosphatase behandelt. Die DNA wurde auf einem Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen. DNA von ungefähr 20 kb wurde aus dem Gel unter Verwendung von β-Agarase (Boehringer Mannheim, Deutschland) isoliert und verwendet um die genomische Chaetomium-Bibliothek zu konstruieren.
Der vorverdaute Lambda DASH^® II BamHI-Vektor-Kit (Stratagene, USA) wurde verwendet um die Bibliothek zu konstruieren, und die Anweisungen des Herstellers wurden in allen nachfolgenden Schritten befolgt. Kurz, ungefähr 200 ng größenfraktionierte DNA wurde in 1 μg der DASH^® II-präparierten Arme ligiert und unter Verwendung des Gigapack II-Verpackungsextraktes (Stratagene, USA) verpackt. Der Titer der Bibliothek wurde bestimmt, indem E. coli XL1-Blue MRA (P2)-Zellen mit seriellen Verdünnungen der verpackten Phagen infiziert wurden und auf NZY-Platten plattiert wurden. Die Bibiliothek wurde zum Durchmustern ohne Vermehrung verwendet.
Beispiel 2
Isolierung der Gene, die für Xylanasen codieren, auf Basis der Hybridisierung mit dem T. reesei xln2-Gen
E. coli XL1-Blue MRA (P2)-Zellen (Stratagene, USA) wurden in LB + 0,2% Maltose + 10 mM MgSO₄ gezogen und auf OD₆₀₀ = 0,5 verdünnt. Die Zellen wurden für 15 min bei 37°C mit der rekombinanten Bibliothek infiziert und mit NZY-Topagar auf die NZY-Platten ausplattiert. Die Platten wurden bei 37°C über Nacht inkubiert. Die Plaques wurden entsprechend den Anweisungen von Stratagene auf einen Nylonfilter (Hybond, Amersham, UK) übertragen. Die genomische Bibliothek von Chaetomium thermophilum CBS 730.95-DNA im Lambda DASH^® II-Vektor wurde mit einem Digoxigenin-markierten 2,4 kb großen HindIII-Fragment aus pALK475, das das T. reesei Xylanase 2 (xln2)-Gen enthält (1), durchgemustert, entsprechend Boehringer, DIG-DNA-Markierung und nicht-radioaktive Detektion, Anwender-Bedienungsanleitung. Die Hybridisierung wurde bei 68°C durchgeführt. Die positiven Klone wurden in SM-Puffer/Chloroform abgeimpft und mit einer zweiten Runde der Durchmusterung gereinigt.
Unter diesen Bedingungen wurden 11 positive Klone gefunden. Die Isolierung von Bakteriophagen-Lambda-DNA im großen Maßstab wurde entsprechend Sambrook et al., 1989, durchgeführt. In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Die Phagen-DNAs wurden mittels Verdau der DNA mit mehreren Restriktionsenzymen untersucht. Basierend auf der Hybridisierungsanalyse (unter Verwendung des DIG-markierten 2,4 kb großen T. reesei xln2-Fragments als Sonde) wurden diese Phagen drei Klassen zugeordnet: Acht der analysierten Phagen wurden Klasse A zugeordnet (Phagen 1, 2, 3, 5, 6, 9, 10, 11), drei Klasse B (Phagen 4, 8) und Phage 7 in Klasse C (Tabelle 1). Phage 7-Fragmente ergaben eine sehr schwache Hybridisierung mit dem T. reesei xln2-Gen.
Tabelle 1: Größe der Lambda-Klonfragmente (in kb), die unter Verwendung des 2,4 kb Trichoderma reesei xln2-Genfragments als Sonde hybridisierten.
Auf der Grundlage der Hybridisierungsmuster wurden die folgenden drei Fragmente zur weiteren Untersuchung in den pUC19-Plasmidvektor (Yanish-Perron et al., Gene 33, 103–119 (1985)) ligiert:

1. Das 4,6 kb große EcoRI-Fragment aus Phage 2 (Klasse A) wurde isoliert und in EcoRI-verdauten und dephosphorylierten pUC19-Vektor ligiert, was zum Plasmid pALK1026 führte;
2. Das 6,0 kb große EcoRI-Fragment aus Phage 4 (Klasse B) wurde isoliert und in EcoRI-verdauten und dephosphorylierten pUC19-Vektor ligiert, was zum Plasmid pALK1028 führte; und
3. Das 7,0 kb große XbaI-Fragment aus Phage 7 (Klasse C) wurde isoliert und in XbaI-verdauten und dephosphorylierten pUC19-Vektor ligiert, was zu dem Plasmid pALK1049 führte.

Plasmide pALK1026, pALK1028 und pALK1049 wurden bei der Deutsche Sammlung für Mikroorganismen (DSMZ) am 21. Juni 1996 hinterlegt, und ihnen wurden die Bezeichnungen DSM 11021, DSM 11022 beziehungsweise DSM 11023 gegeben.
Beispiel 3
Sequenzierung der Xylanasegene aus Klasse A, B und C
Die Plasmide pALK1026, pALK1028 und pALK1049 wurden einer weiteren Restriktionsanalyse unterzogen. Die Sequenzen der drei Chaetomium thermophilum 730.95-Xylanasegene wurden bestimmt, indem Fragmente aus pALK1026, pALK1028 und pALK1049 in pUC19-Vektor subkloniert wurden.
DNA wurde unter Verwendung des ABI-Kits (Applied Biosystems, USA), basierend auf Fluoreszenz-markierten M13- und M13rev-Primern, oder von Sequenz-spezifischen Primern mit Fluoreszenz-markierten Didesoxynucleotiden mittels des Taq-Farbstoff-Primer-Zyklus-Sequenzierungsprotokolls, entsprechend den Anweisungen des Herstellers, sequenziert. Sequenzierungsreaktionen wurden bei einer Anlagerungstemperatur von 50°C durchgeführt. Sequenzierungsreaktionen wurden auf einem ABI-373A-Sequenzierer analysiert, und die erhaltenen Sequenzen wurden unter Verwendung des Sequenzanalyse-Softwarepakets der Genetics Computer Group, Version 7.2, charakterisiert.
Die DNA-Sequenzen der Xylanasegene der Klassen A, B und C von pALK1026, pALK1028 beziehungsweise pALK1049 sind in den 2–4 gezeigt. Die Sequenzierung des Xylanasegens, das von dem Plasmid getragen wurde, das die Klasse A-Xylanasesequenz trug, zeigte eine Sequenz von 1281 bp (in 2 gezeigt) und einen ORF ("open reading frame", offenen Leserahmen) von 842 bp. Der strukturelle Teil ist 783 bp lang und ist von einem einzelnen Intron von 59 bp Länge unterbrochen. Das von der Sequenz abgeleitete Polypeptid ist 261 Aminosäuren lang. Eine mutmaßliche Signalpeptidase-Prozessierungsstelle findet sich nach Ala19, und das vorhergesagte reife Protein besitzt ein errechnetes Molekulargewicht von unge fähr 26 kDa. Die Sequenz zeigt eine starke Homologie mit Xylanasen von unterschiedlichen Organismen. Auf Aminosäureebene zeigt die Aminosäuresequenz, die von diesem Gen codiert wird, 77,2% Identität in einer 237 Aminosäuren langen Überlappung mit dem Chaetomium gracile-Xylanase B-Gen, CgXB (EMBL/GenBank-Datenbanken/DDBJ; Zugangsnummer D49851).
Die Sequenzierung des Xylanasegens, das von dem Plasmid getragen wurde, das die Klasse B-Xylanasesequenz trug, zeigte eine Sequenz von 1174 bp (in 3 gezeigt) und einen ORF von 754 bp Länge. Der Strukturteil ist 690 bp lang und ist von einem einzelnen Intron von 64 bp Länge unterbrochen. Das von der Sequenz abgeleitete Polypeptid ist 230 Aminosäuren lang. Eine mutmaßliche Signalpeptidase-Prozessierungsstelle befindet sich nach Ala16, und das vorhergesagte reife Protein besitzt ein errechnetes Molekulargewicht von ungefähr 23 kDa. Auf Aminosäureebene zeigt die von diesem Gen codierte Aminosäuresequenz 70,0% Identität in einer Überlappung von 227 Aminosäuren mit dem Chaetomium gracile-Xylanase A-Gen, CgXA (EMBL/GenBank-Datenbanken/DDBJ; Zugangsnummer D49850).
Die Sequenzierung des Xylanasegens, das von dem Plasmid getragen wurde, das die Klasse C-Xylanasesequenz trug, zeigte eine Sequenz von 1142 bp Länge (in 4 gezeigt) und einen ORF von 746 bp Länge. Der Strukturteil ist 672 bp lang und ist von einem einzelnen Intron von 74 bp Länge unterbrochen. Das von der Sequenz abgeleitete Polypeptid ist 224 Aminosäuren lang. Eine mutmaßliche Signalpeptidase-Prozessierungsstelle befindet sich nach Thr18, und das vorhergesagte reife Protein besitzt ein errechnetes Molekulargewicht von ungefähr 23 kDa. Auf Aminosäureebene zeigt die von diesem Gen codierte Aminosäuresequenz 51,7% Identität in einer Überlappung von 180 Aminosäuren mit dem Aspergillus nidulans-Xylanasegen (EMBL/GenBank-Datenbanken/DDBJ; Zugangsnummer Z49892).
Auf Aminosäureebene zeigt die Klasse A-Sequenz 67,4% Identität in einer 190 Aminosäurenüberlappung mit der Klasse B-Sequenz, und eine 42,2% Identität in einer 211 Aminosäurenüberlappung mit der Klasse C-Sequenz. Die Identität zwischen den Klasse B- und den Klasse C-Sequenzen beträgt 50,6% in einer Überlappung von 172 Aminosäuren. Daher unterscheiden sich die drei Xylanasen der Erfindung und wurden xlnA., xlnB beziehungsweise xlnC genannt.
Auf Aminosäureebene zeigen die von xlnA-, xlnB- und xlnC-codierten Xylanasen entsprechend der Klassifizierung von Gilkes et al., Microbiol. Rev. 55: 303–315 (1991), große Homologie mit Familie G-Xylanasen.
Beispiel 4
Herstellung von Chaetomium thermophilum-Xylanasen A, B und C in T. reesei
Trichoderma reesei-Stämme wurden für die Chaetomium thermophilum CBS 730.95-Xylanaseproduktion konstruiert. Die Stämme überproduzieren Chaetomium-Xylanase vor einem Cellulase-defizienten Hintergrund. Solche bezüglich der cellulolytischen Aktivität defizienten Zusammensetzungen und die Herstellung derselben mittels rekombinanter DNA-Methoden sind in US 5 298 405 oder Suominen et al., Mol. Gen. Genet. 241: 523–530 (1993), beschrieben. Für die Überproduktion von Chaetomium-Xylanase wurden xlnA-, xlnB- und xlnC-Gene vom starken T. reesei cbh1-Promotor exprimiert.
Die Plasmide pALK1108, pALK1111 und pALK1113 (5–7), die bei der Konstruktion der Chaetomium-Xylanase-überproduzierenden Stämme verwendet wurden, sind ansonsten identisch, mit der Ausnahme, dass die Chaetomium-Sequenzen sich unterscheiden.
Die Plasmide pALK1108, pALK1111 und pALK1113 enthalten:

– cbh1 (Cellobiohydrolase 1)-Promotor: Der Promotor stammt von Trichoderma reesei VTT-D-80133 (Teert et al., Bio/Technology 1: 696–699 (1983)). Das 2,2 kb-EcoRI-SacII-Fragment (Karhunen et al., Mol. Gen. Genet. 241: 515–522 (1993)) wird in den Konstrukten verwendet. Die Sequenz, die dem ATG vorangeht, wurde von Shoemaker et al., Bio/Technology 1: 691–696 (1983), publiziert. Im T. reesei-Stamm VTT-D-80133 ist die Sequenz, die dem ATG vorangeht, CCGCGGACTGCGCATC (die SacII-Schnittstelle ist unterstrichen, ein zusätzliches Cytosin in der DNA-Sequenz, verglichen mit der Sequenz von Schoemaker et al., ist fett gedruckt). Um eine exakte Fusion herzustellen, wurden die 10 Nucleotide des Promotors, von der SacII-Schnittstelle bis zum ATG, und das 5'-Ende von xlnA oder xlnB (bis zu den internen XhoI-Schnittstellen, siehe 5 und 6) unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) synthetisiert. Die exakte Fusion von xlnC mit dem Promotor wurde ebenfalls mittels PCR durchgeführt, in diesem Fall wurde das gesamte xlnC-Gen synthetisiert.
– xlnA-, xlnB- und xlnC-Gene: Die Nucleotidsequenzen und abgeleiteten Aminosäuresequenzen der Xylanasegene von C. thermophilum sind in 2–4 gezeigt. Die Gene wurden von einer genomischen Bibliothek von C. thermophilum CBS 730.95 aufgrund der Hybridisierung mit dem T. reesei xln2-Gen kloniert. Ein 1084 bp-Fragment vom ATG-Startkodon bis zur StuI-Schnittstelle 239 bp nach dem Ende des xlnA-Gens, wurde bei der Konstruktion des Plasmids pALK1108 verwendet. Ein 965 bp-Fragment vom ATG bis zur XhoI-Schnittstelle 209 bp nach dem Ende des xlnB-Gens, wurde bei der Konstruktion von Plasmid pALK1111 verwendet. Ein 977 bp-Fragment vom ATG bis 225 bp nach dem Ende des xlnC-Gens wurde bei der Konstruktion des pALK1113-Plasmids verwendet. Die xlnA- und xlnB-Genfragmente (von der internen XhoI-Schnittstelle, siehe oben) sind genomische DNAs, die aus den pALK1026- und pALK1028-Plasmiden isoliert wurden. Das xlnC wurde mittels PCR unter Verwendung von pALK1049 als Matrize synthetisiert.
– cbh1-Terminator: Das 739 bp AvaII-Fragment (Karhunen et al., Mol. Gen. Genet. 241: 515–522 (1993)), beginnend 113 bp vor dem STOP des cbh1-Gens, wurde nach den xlnA-, xlnB- und xlnC-Genen eingefügt um die Termination der Transkription sicherzustellen.
– amdS-Gen: Das Gen wurde von Aspergillus nidulans VH1-TRSX6 isoliert. Es codiert für Acetamidase (Hypes et al., Mol. Cell. Biol. 3: 1430–1439 (1983)). Acetamidase erlaubt dem Stamm, unter Verwendung von Acetamid als einzige Stickstoffquelle zu wachsen, und diese Eigenschaften wurden verwendet um Transformanden zu selektieren. Das 3,1 kb-Fragment (SpeI- XbaI) vom Plasmid p3SR2 (Kelly J. und Hynes M., EMBO J. 4: 475–479 (1985)) wurde in den Plasmiden verwendet. Das Fragment enthält 1007 bp des Promotorbereichs, 1897 bp der codierenden Region (Introns eingeschlossen) und den 183 bp-Terminatorbereich des amdS-Gens.
– cbh1 3'-Fragment: Das Fragment wurde von T. reesei ALKO2466 unter Verwendung von "Plasmid Rescue" isoliert (1,7 kb, BamHI-EcoRI, beginnend 1,4 kb nach dem STOP des Gens, Suominen et al., Mol. Gen. Genet. 241: 523–530). Stamm ALKO2466 leitet sich von dem Stamm ALKO233 ab (Harkki et al., Enzyme Microb. Technol. 13: 227–233 (1991)).

Das cbh1 3'-Fragment wurde zusammen mit dem cbh1-Promotor verwendet um die xlnA-, xlnB- und xlnC-Expressionskassetten mittels homologer Rekombination, gerichtet am cbh1-Locus, einzubauen.
Die Expressionskassetten für die C. thermophilum-Xylanasegene xlnA, xlnB und xlnC wurden mittels EcoRI-Verdau der pALK1108-, pALK1111- beziehungsweise pALK1113-Plasmide isoliert.
Der Stamm T. reesei ALKO4468 (EGI- und EGII-defizient) wurde mit den isolierten Expressionskassetten transformiert: 8,8 kb-EcoRI-Fragment aus pALK1108, 8,7 kb-EcoRI-Fragment aus pALK1111 und 8,7 kb-EcoRI-Fragment aus pALK1113. Die Transformation wurde durchgeführt, wie von Penttilä et al., Gene 61: 155–164 (1987), beschrieben, mit den Modifikationen, die bei Karhunen et al., Mol. Gen. Genet. 241: 515–522 (1993), beschrieben sind. Die T. reesei-Transformanden wurden auf ein selektives Medium transferriert und über Conidien gereinigt.
Im Wirtsstamm ALKO4468 wurde das Endoglucanase 2 (egl2)-Gen durch das 3,3 kb-BglII-XbaI-Fragment aus dem Plasmid pAN8-1 ersetzt (Mattern et al., Fungal Genet. Newlett. 35: 25 (1989)). Dieses Fragment enthält ein Transformations-Markergen, ble aus Streptoalloteichus hindustanus (Drocourt et al., Nucl. Acids Res. 18: 4009 (1990)). Das ble-Gen überträgt Resistenz gegenüber mehreren Antibiotika, z. B. Phleomycin, und es wird in dem Konstrukt von gpdA (Glyseraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase)-Promotor aus Aspergillus nidulans exprimiert, der A. nidulans trpC-Terminator wird benutzt um die Transkription zu terminieren. Das Ersetzen des Gens wurde unter Verwendung der rekombinanten DNA-Techniken durchgeführt, die in US 5 298 405 beschrieben sind. Zusätzlich wurde das Endoglucanase 1 (egl1)-Gen durch das 1,7 kb große NotI-NsiI-Fragment aus pRLM_ex30 (Mach et al., Curr. Genet. 25: 567–570 (1994)) ersetzt, das den 0,7 kb langen Pyruvatkinase (pki)-Promotor aus Aspergillus nidulans und das 1,0 kb große Hygromycin B-Phosphotransferase (hph)-Gen, isoliert aus Escherichia coli, enthält. Das hph-Gen überträgt Resistenz gegenüber Hygromycin.
Die Standard-DNA-Verfahren, die von Sambrook et al. (1989), in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, beschrieben sind, wurden bei der Konstruktion der Vektoren verwendet. Die Restriktionsenzyme, T4-DNA-Ligase, das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I, T4-DNA-Polymerase, Polynucleotidkinase und Taq-Polymerase waren von Boehringer (Mannheim, Deutschland) und New England Biolabs (USA). Jedes Enzym wurde entsprechend den Anweisungen des Herstellers verwendet. Plasmid-DNA wurde unter Verwendung von Qiagen-Säulen (Qiagen GmbH, Deutschland) oder Promega Magic Minipreps (Promega, USA) entsprechend den Protokollen des Herstellers isoliert. Die in den PCR-Reaktionen und bei Sequenzreaktionen verwendeten Oligonucleotide wurden mit einer ABI-381A-DNA-Synthesemaschine (Applied Biosystems, USA) synthetisiert. Die DNA-Sequenzierung wurde unter Verwendung von ABI-Kits, basierend auf Fluoreszenz-markierten Primern, durchgeführt, oder, wenn Sequenz-spezifische Primer verwendet werden, basierend auf Fluoreszenz-markierten Didesoxynucleotiden mittels des Taq-Zyklus-Sequenzierungsverfahrens entsprechend den Anweisungen des Herstellers. Sequenzreaktionen wurden auf einem ABI-373A-Sequenzierer analysiert.
DNA-Fragmente zur Klonierung oder für Transformationen wurden unter Verwendung des Qiaex II-Gelextraktions-Kits (Qiagen GmbH, Deutschland) entsprechend den Anweisungen des Herstellers aus Agarosegelen isoliert.
Beispiel 5
Eigenschaften der Xylanase-produzierenden Chaetomium-Transformanden
Um auf Produktion von rekombinantem XLNA, XLNB und XLNC durchzumustern, wurden T. reesei-Transformanden in Schüttelflaschen in einem Medium mit 4% Molke, 1,5% komplexer Stickstoffquelle aus Getreide, 1,5% KH₂PO₄ und 0,5% (NH₄)₂SO₄ kultiviert. Die Kulturen wurden für 7 Tage bei 30°C und 250 UpM gehalten.
Die Xylanaseaktivität von Transformanden wurde entsprechend Bailey et al., J. Biotechnol. 23: 257–270 (1992), bestimmt, mit der Ausnahme, dass der Assay bei pH 6,5, 60°C mit einer Inkubationszeit von 60 min in 50 mM McIlvain's-Puffer durchgeführt wurde. 1% (G/V) Birkenholz-Xylan (Roth 7500) wurde als Substrat verwendet. Eine Xylanase-Einheit (1 nkat) ist als die Enzymmenge definiert, die in einer Sekunde unter den gewünschten Assaybedingungen aus Birkenholz-Xylan reduzierende Kohlenhydrate herstellt, die ein Reduktionspotential besitzen, das einem nmol Xylose entspricht.
Der CBHI-Phänotyp der Transformanden wurde mittels Punktautoradiogramm untersucht. Die Kulturüberstände von Schüttelflaschenkultivierungen wurden mittels eines Punktautoradiographie-Apparates auf Nitrocellulosefilter übertragen. CBHI wurde mittels Immunfärbung unter Verwendung eines spezifischen monoklonalen CBHI-Antikörpers CI-258 (Aho et al., Eur. J. Biochem. 200: 643–649 (1991)) und des ProtoBlot-Westernblot-AP-Systems (Promega, USA) entsprechend den Empfehlungen der Hersteller detektiert. CBHI-defiziente Transformanden wurden weiter charakterisiert.
Die Integration und Kopienzahl der Transformationskassetten wurde in Southern-Hybridisierungen bestätigt. Bei den untersuchten ALKO4468-Transformanden wurde das cbh1-Gen durch das amdS-Markergen und das xlnA-, xlnB- oder xlnC-Konstrukt aus der pALK1108-, pALK1111- beziehungsweise der pALK1113-Expressionskassette ersetzt. Dem Transformations-Wirtsstamm ALKO4468 fehlen die egl2- und egl1-Gene (siehe Beispiel 4), und nach dem Einsetzen der Expressionskassette in den cbh1-Locus produzieren die charakterisierten ALKO4468-Transformanden keine der Cellulase-Komponenten von Trichoderma EGII, EGI und CBHI.
Die CBHI-negativen Transformanden mit den höchsten Xylanaseaktivitäten wurden für Kultivierungen in 1 Liter-Laborfermentern (Braun Biostat^® M, Deutschland) ausgewählt. XLNA- und XLNB-produzierende Transformanden wurden in Laborfermentern bei pH 4,4 ± 0,4, XLNC-produzierende Transformanden bei pH 5,2 ± 0,4 kultiviert.
Die Xylanaseaktivitäten wurden entsprechend Bailey et al., J. Biotechnol. 23: 257–270 (1992), bestimmt, mit der Ausnahme, dass die Assays entweder bei pH 5,3, 50°C, 5 min in 50 mM Natriumcitratpuffer, oder bei pH 6, 60°C oder pH 7, 70°C mit einer Inkubationszeit von 5 min oder 60 min in 50 mM McIlvains's-Puffer durchgeführt wurden. Es wurde 1% (G/V) Birkenholz-Xylan (Roth 7500) als Substrat verwendet. Die Transformanden mit der höchsten Xylanase XLNA-, XLNB- und XLNC-Produktion sind in Tabelle 2 gezeigt.
Die Xylanaseaktivität des Wirtsstammes T. reesei ALKO4468 bei pH 7, 70°C, 60 min, wurde künstlich auf einen nkat-Wert von 1 gesetzt. Die anderen Werte sind relative Aktivitäten, verglichen mit diesem künstlichen Wert.
Die höchste Xylanaseaktivität des T. reesei-Wirtsstammes wurde bei pH 5,3, 50°C, erhalten. Unter diesen Bedingungen waren die Xylanaseaktivitäten der C. thermophilum CBS 730.95-Xylanasen XLNA-, XLNB- oder XLNC-produzierenden Transformanden 4–7 Mal höher (590, 489) und 351 XE) als die des Wirtsstammes ALKO4468 (86 XE).
Beträchtlich höhere Xylanaseaktivitäten für XLNA und XLNB erhielt man, wenn die Aktivität bei pH 6, 60°C, 5 min (820 und 755 XE) oder bei pH 7, 70°C, 5 min (1188 und 841 XE) gemessen wurde. Bei pH 7, 70°C, 5 min, waren die Aktivitäten 84 Mal und 120 Mal höher als die des ALKO4468-Wirtsstammes; verglichen mit dem xlnA- und xlnB-Donorstamm ALKO4265 waren die Aktivitäten 100 Mal und 150 Mal höher.
XLNA und XLNB scheinen thermotolerant zu sein. XLNA behielt 88% (721 XE) seiner Aktivität bei pH 6, 60°C, und 62% (740 XE) seiner Aktivität bei pH 7, 70°C, wenn die Inkubationszeit von 5 auf 60 min erhöht wurde. Unter denselben Bedingungen behielt XLNB 65% (491 XE) und 17% (143 XE) ihrer Aktivität.
XLNC unterschied sich von XLNA und XLNB. Es besaß eine höhere Aktivität bei pH 5,3, 50°C, 5 min., verglichen mit pH 7, 70°C, 5 min.
Tabelle 2. Die relativen Xylanaseaktivitäten der T. reesei-Transformanden ALKO4468/xlnA (ALKO4468/1108/7), ALKO4468/xlnB (ALKO4468/1111/44) und ALKO4468/xlnC (ALKO4468/1113/34), die C. thermophilum CBS 730.95-Xylanasen XLNA, XLNB bzw. XLNC produzieren. ALKO4468 ist der T. reesei-Wirtsstamm, und ALKO4265 ist der Gendonor, C. thermophilum CBS 730.95. Die Xylanaseaktivität des Wirtsstamms T. reesei ALKO4468 bei pH 7, 70°C, 60 min., wurde künstlich auf den Wert 1 gesetzt. Die anderen Werte sind relative Aktivitäten, verglichen mit diesem künstlichen Wert.

XE: = relative Xylanase-Einheiten
nd: = nicht bestimmt ("not determined")

Es wurden die pH- und die thermalen Abhängigkeiten von C. thermophilum CBS 730.95 XLNA, XLNB und XLNC, die von T. reesei hergestellt wurden, bestimmt. Die Proben von den Kulturüberständen wurden in 50 mM McIlvain's-Puffer mit einem entsprechenden pH in einem Bereich von pH 4,2–8,0 bestimmt. Die thermalen Abhängigkeiten wurden in einem Bereich von 40–80°C gemessen. Die Aktivitäten wurden nach 5 min Inkubation bestimmt. Die pH-Profile sind in 8 gezeigt und die Temperaturprofile in 9.
Rekombinantes XLNA war thermophiler als XLNB. Bei ungefähr pH 5–6 zeigte XLNA maximale Aktivität bei 70–80°C; bei ungefähr pH 7 wurde die Maximalaktivität bei 70°C beobachtet; beachtliche Aktivität wurde bei pH 8, 70°C, beobachtet. Rekombinantes XLNB zeigte maximale Aktivität bei ungefähr pH 5–7, 50–70°C. Weder XLNA, noch XLNB zeigte beachtenswerte Aktivität bei pH 4.
Somit können die vorliegenden Enzyme, wie von den obigen Daten bewiesen, insbesondere im neutralen pH-Bereich, und sogar bei moderat alkalischen pH-Werten, verwendet werden. Diese Eigenschaft macht die Enzyme besonders nützlich in modernen ECF- und TCF-Bleichsequenzen. Insbesondere können Enzymbehandlungen mit den vorliegenden Xylanasen mit alkalischen Extraktions-/Waschschritten (E, E_P, E_O) und Peroxid (P)-Behandlungsschritten kombiniert werden. Die Eigenschaft ist außerdem recht unerwartet, weil die bekannten Pilz-Xylanasen allgemein bei niedrigerem pH aktiv sind.
XLNC war weniger thermophil als XLNA und XLNB. XLNC hatte sein Optimum bei 60°C, bei pH 4–6.
Die Expression der von T. reesei ALKO4468 produzierten C. thermophilum CBS 730.95-Xylanasen XLNA, XLNB und XLNC wurde mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Analyse (PAGE) verifiziert (10). Proben, die 30 μg sezerniertes Gesamtprotein enthielten, ließ man in einem 12%igen Gel laufen, und sie wurden mit Coomassie Brilliant-Blue-Färbung sichtbar gemacht. Alle drei C. thermophilum CBS 730.95-Xylanasen wurden in beachtlichen Mengen in T. reesei ALKO4468 exprimiert.
Beispiel 6
Fusionsproteine
Ein rekombinanter Vektor, der für ein Xylanasegen codiert, wird präpariert, indem die Xylanase-codierende Sequenz mit der Sequenz einer Trichoderma-Cellulase oder -Hemicellulase oder mindestens einer funktionellen Domäne der Cellulase oder Hemicellulase fusioniert wird, wie beschrieben in US 5 298 405 , WO 93/24621 und im GenBank-Eintrag L25310. Insbesondere ist das Enzym ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus CBHI, CBHII, EGI, EGII, XYLI, XYLII und MANI, oder einer Domäne davon, wie dem Sekretionssignal oder der Kernsequenz.
Fusionsproteine können konstruiert werden, die eine N-terminale Mannanase- oder Cellobiohydrolase- oder Endoglucanase-Kerndomäne oder die Kern- und die Gelenkdomänen derselben enthalten, fusioniert mit der Chaetomium-Xylanasesequenz. Das Ergebnis ist ein Protein, das N-terminale Mannanase- oder Cellobiohydrolase- oder Endoglucanase-Kern- oder Kern- und Gelenkregionen und eine C-terminale Chaetomium-Xylanase enthält. Das Fusionsprotein enthält sowohl die Mannanase- oder Cellobiohydrolase- oder Endoglucanase-, als auch Xylanaseaktivitäten der verschiedenen Domänen, wie sie vom Fusionskonstrukt bereitgestellt werden. Das Trägerpolypeptid braucht keine enzymatische Aktivität zu besitzen oder seine Aktivität kann inaktiviert sein.
Fusionsproteine können auch so konstruiert sein, dass der Mannanase- oder Cellobiohydrolase- oder Endoglucanaseschwanz oder ein gewünschtes Fragment davon umfasst ist, und zwar plaziert vor der Chaetomium-Xylanasesequenz, insbesondere so, dass dies die Verwendung einer nicht-spezifischen Proteasestelle im Schwanz als Proteasestelle für die Gewinnung der Xylanasesequenz von dem exprimierten Fusionsprotein erlaubt. Alternativ dazu können Fusionsproteine konstruiert werden, die eine Proteasestelle in einem Linker bereitstellen, der vor den Chaetomium-Xylanase-Sequenzen, mit oder ohne Schwanz, plaziert wird.
Chaetomium-Xylanasen können auch als N-terminaler Teil des Fusionsproteins, wie oben beschrieben, zur Produktion jedes gewollten Proteins verwendet werden. In diesem Fall kann eine Linkerregion unter Verwendung der oben beschriebenen Strategie konstruiert werden.
Es können neue Eigenschaften für die Xylanasen gebildet werden, indem Domänen, wie z. B. Cellulose-Bindedomäne (CBD), bevorzugt mit ihrem Linker, mit den erfindungsgemäßen Xylanasen fusioniert werden. Bevorzugt sind solche CBDs und Linker, die entsprechenden CBD- und Linkerdomänen einer Trichoderma-Cellulase oder -Mannanase, und insbesondere die einer Trichoderma reesei-Cellulase oder -Mannanase.
Beispiel 7
Wirte
Das rekombinante Konstrukt, das für die gewünschten Proteine oder Fusionsproteine codiert, wird wie oben beschrieben präpariert und in einen filamentösen Pilz, wie Aspergillus spp. oder Trichoderma spp., bevorzugt T. reesei, transformiert.
Beispiel 8
TCF-Bleichen von Weichholz-Pulpe unter Verwendung von Chaetomium thermophilum CBS 730.95-Xylanasen XLNA und XLNB, sezerniert von Trichoderma
Es wurde ein Bleichexperiment durchgeführt um die Nützlichkeit von Trichodermasezernierten Xylanasen XLNA und XLNB von Chaetomium thermophilum CBS 730.95 bei einem TCF (vollständig Chlor-freien; "totally chlorine free")-Bleichen von Kraftzellstoff zu untersuchen.
Ausgebeutetes/verbrauchtes Medium von Kulturen der Trichoderma-Wirtszellen, die XLNA- oder XLNB-Xylanasen sezernieren (Beispiel 5), wurden zu skandinavischem Sauerstoff delignifiziertem Weichholz-Kraftzellstoff (kappa-Nr. 20, Helligkeit 34%) in der Menge 100 nkat/g Pulpentrockenmasse hinzugegeben. Die exprimierte Xylanaseaktivität wurde entsprechend Bailey et al., J. Biotechnol. 23: 257–270 (1992); unter Verwendung von Roth (Nr. 7500)-Birkenholz-Xylan als Substrat bei 70°C, pH 7,0, mit einer 5-minütigen Inkubationszeit in nkat gemessen. Die Enzymbehandlungen wurden bei pH 7 und 70°C über eine Stunde durchgeführt. Referenz-Pulpe wurde auf dieselbe Weise ohne Enzymzugabe behandelt. Das Bleichen wurde mit einer QP-Sequenz durchgeführt um die Reaktion der Enzymbehandlung bei Peroxidbasiertem Bleichen zu testen (Q bezeichnet die Chelierungs-Stufe und P die Peroxid-Stufe). Die Bleichsequenzen können typischerweise auch mehr als eine Peroxid (P)-Stufe umfassen, sowie verschiedene Extraktions-Stufen (wie E, EO, EOP, Ozon-Stufen (Z), Druck-Peroxid-Stufen (OP), etc.; E bezeichnet eine alkalische Extraktion, O Sauerstoff). Die Chelier-Stufe (Q) und die Wasserstoffperoxid-Stufe (P) wurden unter den in Tabelle 3 genannten Bedingungen durchgeführt. Bleichchemikalien in der P-Stufe waren die folgenden: 3% H₂O₂, 3% NaOH, 0,2% Diethylen-Triamin-Pentaessigsäure (DTPA) und 0,5% MgSO₄. Die Ergebnisse des Bleichexperiments sind in Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3
Wie man in Tabelle 3 sehen kann, besaßen die Pulpen am Ende nach Behandlung mit ausgebeutetem Trichoderma-Kulturmedium, das Chaetomium thermophilum CBS 730.95-Xylanasen XLNA und XLNB enthielt, 1,0 bis 0,5 Einheiten höhere Helligkeitswerte als das Bezugsbeispiel. Die Bedingungen bei der Enzym-Vorbehandlung waren für XLNB nicht optimal (siehe Tabelle 2), und daher erhielt man, verglichen mit XLNA, niedrigere Helligkeitswerte. Unter den verwendeten Bedingungen waren T. reesei-Xylanasen nicht aktiv (Tabelle 2) und hatten keine Auswirkung auf die erhaltene Helligkeit.
Die verbrauchte Peroxidmenge war nicht erhöht. Enzymbehandlungen beeinflussten die Viskosität der Pulpen aufgrund einer niedrigen Cellulase-degradierenden Aktivität nicht.
Beispiel 9
TCF-Bleichen von Hartholz-Pulpe unter Verwendung von Trichodermasezerniertem Chaetomium thermophilum CBS 730.95-Xylanasen XLNA und XLNB sowie Xylanaseaktivität-enthaltendem, ausgebeutetem Kulturmedium von C. thermophilum CBS 730.95
Es wurde ein Bleichexperiment durchgeführt um die Nützlichkeit von Xylanasen XLNA und XLNB von Chaetomium thermophilum CBS 730.95, die von Trichoderma sezerniert wur den, und die Xylanaseaktivitäten des ausgebeuteten Kulturmediums von Chaetomium thermophilum CBS 730.95 beim TCF-Bleichen von Hartholz-Kraftzellstoff zu untersuchen.
Ausgebeutetes Kulturmedium von Kulturen der Trichoderma-Wirtszellen, die XLNA- und XLNB-Xylanasen sezernierten (Beispiel 5), sowie von C. thermophilum CBS 730.95, wurde in der Menge 100 nkat/g Pulpentrockenmasse zu skandinavischem, gewaschenem ("millwashed") Hartholz-Kraftzellstoff (kappa-Nr. 8.9) gegeben. Die Xylanaseaktivität, ausgedrückt als nkat, wurde entsprechend Bailey et al., J. Biotechnol. 23: 257–270 (1992), unter Verwendung von Roth (Nr. 7500)-Birkenholz-Xylan als Substrat bei 70°C, pH 7,0, mit einer 5-minütigen Inkubationszeit gemessen. Die Enzymbehandlungen wurden bei pH 7 und 70°C über eine Stunde durchgeführt. Referenz-Pulpe wurde auf dieselbe Weise, aber ohne Enzymzugabe, behandelt. Das Bleichen wurde mit einer QP-Sequenz durchgeführt. Die Chelier-Stufe (Q) und die Wasserstoffperoxid-Stufe (P) wurden unter den in Tabelle 4 genannten Bedingungen durchgeführt. Bleichchemikalien in der P-Stufe waren die folgenden: 3% H₂O₂, 3% NaOH, 0,2% Diethylen-Triamin-Pentaessigsäure (DTPA) und 0,5% MgSO₄. Die Ergebnisse des Bleichexperiments sind in Tabelle 4 gezeigt.
Tabelle 4
Es wurden bessere Helligkeitswerte erhalten, wenn Chaetomium thermophilum CBS 730.95-Xylanasen XLNA und XLNB, die von den rekombinanten T. reesei-Stämmen sezerniert wurden, verwendet wurden, verglichen mit dem ausgebeuteten Kulturmedium von Chaetomium thermophilum CBS 730.95. Wie man in Tabelle 4 sehen kann, besaßen die Pulpen am Ende nach der Vorbehandlung mit verbrauchtem Trichoderma-Kulturmedium, das XLNA und XLNB enthielt, 1,4 bis 0,5 Einheiten höhere Helligkeitswerte als das Bezugsbeispiel. Das ausgebeutete Kulturmedium von C. thermophilum CBS 730.95, das mehrere Xylanaseaktivitäten enthielt; hatte bei der verwendeten Xylanaseaktivitäts-Menge (0,3 Einheiten) nur eine geringe Auswirkung auf die Helligkeit.
Die verbrauchte Peroxidmenge war nicht erhöht. Enzymbehandlungen mit XLNA und XLNB beeinflussten die Viskosität der Pulpen aufgrund der niedrigen Cellulase-degradierenden Aktivität nicht.
XLNA- und XLNB-Xylanasen, die getrennt in einem T. reesei-Wirtsstamm produziert wurden, ergaben höhere Helligkeit als C. thermophilum CBS 730.95-Kulturmedium. C. thermophilum CBS 730.95-Kulturmedium enthält mehrere Xylanasen, die alle nicht so effektiv bei der Anwendung zu sein scheinen.
Beispiel 10
Bleichexperiment unter Verwendung von Chaetomium thermophilum-Xylanasen, die von Trichoderma sezerniert wurden, und Chlorchemikalien
Es kann ein Bleichexperiment durchgeführt werden um die Nützlichkeit von Chaetomium thermophilum CBS 730.95-Xylanasen, die von Trichoderma sezerniert werden, bei von elementarem Chlor-freiem (ECF) oder Chlor-enthaltendem Bleichen von Pulpe zu untersuchen.
Ausgebeutete Medien von Kulturen des Trichoderma-Wirts, der Chaetomium thermophilum CBS 730.95-Xylanasen sezerniert, werden in einer Menge von 20–200 nkat/g Pulpentrockenmasse zu Weichholz- oder Hartholz-Pulpe hinzugegeben. Die Enzymbehandlungen werden bei pH 5–8 und bei 50–80°C über eine bis drei Stunden durchgeführt. Referenzpulpe wird unter denselben Bedingungen ohne Enzymzugabe gehalten. Nach den Enzymbehandlungen wird das Bleichen z. B. mit einer C/DEDED- oder DEDED-Sequenz durchgeführt, wobei C für elementares Chlor, D für eine Chlordioxidbehandlung steht und E für alkalische Extraktion steht.
Nachdem die Erfindung nun vollständig beschrieben wurde, wird der Fachmann verstehen, dass die Erfindung innerhalb eines breiten und äquivalenten Bereichs von Bedingungen, Parametern und ähnlichen, durchgeführt werden kann, ohne den Geist oder den Bereich der Erfindung oder irgendeiner Ausführungsform davon zu beeinflussen. Auf alle hierin zitierten Referenzen wird hierin expressis verbis Bezug genommen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Nucleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid codiert, das die enzymatische Aktivität einer Xylanase besitzt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) Nucleinsäuremolekülen, die für ein Polypeptid codieren, das die Aminosäuresequenz, wie sie in 2 dargestellt ist, umfasst; (b) Nucleinsäuremolekülen, die die codierende Sequenz der Nukleotidsequenz, wie sie in 2 dargestellt ist, umfassen; (c) Nucleinsäuremolekülen, die für ein Polypeptid codieren, das die Aminosäuresequenz umfasst, die von dem DNA-Insert, das in DSM 11021 enthalten ist, codiert wird; (d) Nucleinsäuremolekülen, die die codierende Sequenz des DNA-Inserts umfassen, das in DSM 11021 enthalten ist; (e) Nucleinsäuremolekülen, deren codierende Sequenz sich von der codierenden Sequenz eines Nucleinsäuremoleküls aus (a) bis (d) aufgrund der Degeneration des genetischen Codes unterscheidet; (f) Nucleinsäuremolekülen, die ein Polypeptid codieren, das Xylanaseaktivität besitzt und eine Aminosäuresequenz hat, welche mindestens 80% Identität mit einer Sequenz, wie sie in 2 dargestellt ist, aufweist.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, das ein Polypeptid codiert, das ein Temperaturoptimum von über 50°C besitzt.
Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 und 2, das für ein Polypeptid codiert, das ein Temperaturoptimum von über 50°C bei pH 4 bis 6 besitzt.
Nucleinsäuremolekül nach Ansprüchen 1 bis 3, das für ein Polypeptid codiert, das ein Temperaturoptimum von über 50°C bei pH 5 bis 7 besitzt.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, welches eine RNA ist.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, welches eine DNA ist.
DNA nach Anspruch 4, welche genomische DNA oder cDNA ist.
Vektor, der ein Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 7 enthält.
Vektor nach Anspruch 8, bei dem das Nucleinsäuremolekül funktionell mit Expressionskontrollsequenzen verbunden ist, was die Expression in prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszellen erlaubt.
Wirtszelle, die mit einem Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder mit einem Vektor nach Anspruch 8 oder 9 transformiert ist.
Wirtszelle nach Anspruch 10, welche zu den Fadenpilzen gehört.
Wirtszelle nach Ansprüchen 10 bis 11, welche der Gattung Trichoderma oder Aspergillus angehört.
Wirtszelle nach Anspruch 12, welche Trichoderma reesei ist.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, das Xylanaseaktivität besitzt, umfassend die Schritte der Kultivierung der Wirtszelle nach einem der Ansprüche 10 bis 13 und des Gewinnens des Polypeptids aus dem Kulturmedium.
Polypeptid mit Xylanaseaktivität, das von einem Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 7, einem Vektor nach Anspruch 8 oder 9 codiert wird, und durch das Verfahren nach Anspruch 14 erhältlich ist.
Verfahren zur Herstellung einer Enzymzusammensetzung umfassend ein Polypeptid nach Anspruch 15, das die Schritte der Kultivierung einer Wirtszelle nach einem der Ansprüche 10 bis 13 und entweder das Gewinnen des Polypeptids aus den Zellen oder das Abtrennen der Zellen vom Kulturmedium und das Gewinnen des Überstandes umfasst.
Enzymzusammensetzung erhältlich durch das Verfahren nach Anspruch 16.
Enzymzusammensetzung nach Anspruch 17, welche flüssig ist.
Enzymzusammensetzung nach Anspruch 17, welche trocken ist.
Enzymzusammensetzung nach Anspruch 17, wobei der Überstand konzentriert wurde.
Verfahren zur Behandlung von Holzpulpen oder -fasern, das den Schritt der Zugabe einer Enzymzusammensetzung nach einem der Ansprüche 17 bis 20 zu mechanischen oder chemischen Holzpulpen oder -sekundärfasern umfasst.
Verfahren zum Bleichen von Pulpen, das den Schritt des Inkontaktbringens der Pulpe mit einer Enzymzusammensetzung nach einem der Ansprüche 17 bis 20 umfasst.
Verfahren zur Verbesserung der Qualität von Tierfutter, welches die Behandlung von Pflanzenmaterial mit einer Enzymzusammensetzung nach einem der Ansprüche 17 bis 20 umfasst.
Verfahren zum Backen, welches die Zugabe einer Enzymzusammensetzung nach einem der Ansprüche 17 bis 20 zu Mehl, das bei der Herstellung von Teig verwendet wird, umfasst.
Verwendung einer Enzymzusammensetzung nach einem der Ansprüche 17 bis 20 beim Abbau von Xylan-enthaltendem Substrat.
Verwendung einer Enzymzusammensetzung nach einem der Ansprüche 17 bis 20 bei der Herstellung von Tierfuttermitteln.
Tierfuttermittelzusammensetzung umfassend eine Enzymzusammensetzung nach einem der Ansprüche 17 bis 20.
Verwendung einer Enzymzusammensetzung nach einem der Ansprüche 17 bis 20 in einem Teig für die Herstellung von Broten.
Mehlzusammensetzung umfassend eine Enzymzusammensetzung nach einem der Ansprüche 17 bis 20.
Teigzusammensetzung umfassend eine Enzymzusammensetzung nach einem der Ansprüche 17 bis 20 als Brot-verbessernde Komponente.
Verwendung einer Enzymzusammensetzung nach einem der Ansprüche 17 bis 20 bei der Herstellung von Holzpulpe.
Verwendung einer Enzymzusammensetzung nach einem der Ansprüche 17 bis 20 beim Bleichen von Holzpulpe.
Verwendung einer Enzymzusammensetzung nach einem der Ansprüche 17 bis 20 und nach Anspruch 29 beim Bleichen von chemischer oder mechanischer Holzpulpe.
Verwendung einer Enzymzusammensetzung nach einem der Ansprüche 17 bis 20 zur Behandlung von Holzpulpe.
Verwendung einer Enzymzusammensetzung nach einem der Ansprüche 17 bis 20 und nach Anspruch 31 zur Behandlung von chemischen, mechanischen oder sekundärer Fasern.