ES2202320T3 - Enzima con actividad de endoglucanasa. - Google Patents
Enzima con actividad de endoglucanasa.Info
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Abstract
SE PRESENTA UNA ENZIMA QUE EXHIBE ACTIVIDAD DE ENDOGLUCANASA, DICHA ENZIMA SE CODIFICA MEDIANTE UNA SECUENCIA DE DNA QUE COMPRENDE ALGUNA DE LAS SIGUIENTES SECUENCIAS PARCIALES: (A) ATTCATTTGTG GACAGTGGAC, (B) GTTGATCGCA CATTGAACCA, (C) ACCCCAGCCG ACCGATTGTC, (D) CTTCCTTACC TCACCATCAT, (E) TTAACATCTT TTCACCATGA, (F) AGCTTTCCCT TCTCTCCCTT, (G) GCCACCCTGG CTTCCGCTGC CAGCCTCC, (H) GACAGTAGCA ATCCAGCATT, (I) AGCATCAGCC GCTTTGTACA, (J) CCATGAAGTT CACCGTATTG, (K) GCACTGCTTC TCTCCCAGGT, (L) GTGGGCGGCC CCTCAGGCAA, (M) ACGCTCCTCC AATTTTCTCT, (N) GGCTTGGTAG TAATGAGTCT, (O) GGCTCAGAGT TTGGCCAGGC, (P) CAACATCCCC GGTGTTCTGGG. LA ENZIMA PUEDE PRODUCIRSE MEDIANTE TECNICAS RECOMBINANTES DE DNA Y PUEDE UTILIZARSE PARA LA DEGRADACION DEL MATERIAL DE LA PARED DE CELULAS DE PLANTAS.
Description
Encima con actividad endoglucanasa.
La presente invención se refiere a enzimas con
actividad endoglucanasa, a un método de producción de las enzimas,
y a una preparación enzimática que contiene una enzima de la
invención.
Las endoglucanasas (EC no. 3.2.1.4) constituyen
un grupo de hidrolasas, las cuales catalizan la endohidrólisis de
los enlaces
1,4-\beta-D-glicosídicos
en celulosa, derivados de celulosa (como la carboximetilcelulosa y
la hidroxi etil celulosa) liquenina, enlaces
\beta-1,4 en glucanos \beta-1,3
mezclados como los
\beta-D-glucanos o xiloglucanos de
cereales y otras plantas que contienen partes celulósicas. El
nombre autorizado es
endo-1,4-\beta-D-glucano
4-glucano hidrolasa, aunque en la presente
descripción se usa el término abreviado endoglucanasa. Se puede
hacer referencia a R.F. Gould, "Cellulases and their
Application", Advances in Chemistry Series 55, American
Chemical Society (1969), T.M. Wood, "Properties and Mode of
Action of Cellulases", en el Biotechnology and Biengineering
Symosium, no. 5, John Wiley, 111-137 (1975),
Y.-H.Lee and L.T. Fan, "Properties and Mode of Action of
Cellulose", Advances in Biochemical engineering 17,
101-129 (1980), J. Goks\phiyr y J. Eriksen,
"Cellulases" en A.H. Rouse, Microbial Enzymes and
Bioconversions, Academic Press, 283-330 (1980),
T.-M. Enveri, "Microbial Cellulases" in W.M. Fogarty,
Microbial Enzymes and Biotechnology, Applied science
Publishers, 183-224 (1983).
Se han descubierto endoglucanasas producidas por
diferentes tipos de organismos, como plantas y microorganismos, y
se han identificado endoglucanasas con una amplia variedad de
especifidades. Por ejemplo, se han identificado endoglucanasas
específicas del xiloglucano en diferentes plantas, como se indica
en las descripciones de Fry et al. (1992), Nishitani y Tominaga
(1992), Hayashi et al. (1984), McDougall and Fry (1991), y en la
publicación WO 93/17101. Se ha descubierto que todas estas enzimas
tienen actividad transferasa (tal y como se define en, por ejemplo,
Fry et al., 1992 y Nishitani et al., 1992) y en consecuencia, no se
clasifican como endoglucanasas auténticas. Hasta ahora, no se han
identificado endoglucanasas específicas del xiloglucano en
microorganismos.
Las endoglucanasas microbianas han sido descritas
por Beldman et al., 1985 (Trichoderma viride) y en la
publicación WO 93/20193 (Aspergillus aculeatus), esta
última referencia siendo publicada sólo después de las fechas
prioritarias de la presente invención. Además, Sharma et al., 1991,
Ooi, et al., 1990, y Gilkes et al. 1991 también describen
endoglucanasas microbianas.
Las endoglucanasas se pueden utilizar de forma
apropiada para la degradación de componentes celulósicos presentes
en las paredes celulares vegetales y en los polisacáridos
bacterianos. Las endoglucanasas que poseen un alta actividad de
degradación del xiloglucano pueden tener un uso particular en la
degradación del material celular de las paredes con un alto
contenido en xiloglucano, por ejemplo en la industria del vino y de
la fruta, y para la eliminación de la pectina y las hemicelulosas
de las fibras textiles.
El objetivo de la invención es proporcionar
nuevas endoglucanasas que expongan especifidades de substratos
útiles y un método para producir las endoglucanasas con un mejor
rendimiento y una pureza superior a lo que era posible hasta ahora.
Otro de los objetivos es proporcionar nuevos productos, en los que
se aumenta o disminuye la proporción de
endo-\beta-1,4-glucanasa
en relación a la proporción presente en el producto original. Las
endoglucanasas y los nuevos productos de la invención, solos o en
combinación con otras enzimas, pueden emplearse en la degradación
del tejido de las paredes celulares vegetales.
En consecuencia, y en un primer aspecto, la
presente invención se refiere a una enzima que expone actividad
endoglucanasa, dicha enzima está codificada por una secuencia de
ADN que incluye al menos una de las siguientes secuencias
parciales:
(a) ATTCATTTGTG GACAGTGGAC (Secuencia ID N°:
1)
(b) GTTGATCGCA CATTGAACCA (Secuencia ID N°:
2)
(c) ACCCCAGCCG ACCGATTGTC (Secuencia ID N°:
3)
(d) CTTCCTTACC TCACCATCAT (Secuencia ID N°:
4)
(e) TTAACATCTT TTCACCATGA (Secuencia ID N°:
5)
(f) AGCTTTCCCT TCTCTCCCTT (Secuencia ID N°:
6)
(g) GCCACCCTGG CTTCCGCTGC CAGCCTCC (Secuencia ID
N°: 7)
\newpage
En el presente contexto, el término "actividad
endoglucanasa" indica la capacidad de hidrolizar los enlaces
1,4-\beta-D glicosídicos presentes
en cualquier material celulósico, como la celulosa, los derivados
de la celulosa, la liquenina, el
\beta-D-glucano, o el xiloglucano.
La actividad endoglucanasa puede ser determinada según métodos
conocidos en la técnica, algunos ejemplos de estos métodos se
describen en la sección Materiales y Métodos y en los Ejemplos de
este documento. Una unidad de actividad endoglucanasa (por ejemplo
CMCU, AVIU, XGU o BGU) se define como la producción de 1 \mumol de
azúcar reductor/m de un sustrato de glucano, el sustrato de glucano
puede ser, por ejemplo, CMC (CMCU), Avicell ácido hichado (AVIU),
xiloglucano (XGU) o \beta-glucano de cereales
(BGU). Los azúcares reductores se determinan de la manera descrita
aquí en la sección de Materiales y Métodos. La actividad específica
de una endoglucanasa hacia un sustrato se indica en unidades/mg de
proteína.
En otro aspecto, la invención se refiere a una
enzima que expone actividad endoglucanasa, dicha enzima
i) está codificada por una secuencia de ADN que
comprende o está incluida en al menos una de las siguientes
secuencias parciales:
AAAGATTCATTTGTGGACAGTGGACGTTGATCGCACATTGAACCAACCCCAGCCGACCGATTGTCCTTCC
TTACCTCACCATCATTTAACATCTTTTCACCATGAAGCTTTCCCTTCTCTCCCTTGCCACCCTGGCTTCCGC
TGCCAGCCTCCAGCGCCGCACACTTCTGCGGTCAGTGGGATACCGCCACCGCCGGTGACTTCACCCTGTA
CAACGACCTTTGGGGCGAGACGGCCGGCACCGGCTCCCAGTGCACTGGAGTCGACTCCTACAGCGGCGA
CACCATCGCTTGTCACACCAGCAGGTCCTGGTCGGAGTAGCAGCAGCGTCAAGAGCTATGCCAACG (Se-
cuencia ID N°: 17) o
TTACCTCACCATCATTTAACATCTTTTCACCATGAAGCTTTCCCTTCTCTCCCTTGCCACCCTGGCTTCCGC
TGCCAGCCTCCAGCGCCGCACACTTCTGCGGTCAGTGGGATACCGCCACCGCCGGTGACTTCACCCTGTA
CAACGACCTTTGGGGCGAGACGGCCGGCACCGGCTCCCAGTGCACTGGAGTCGACTCCTACAGCGGCGA
CACCATCGCTTGTCACACCAGCAGGTCCTGGTCGGAGTAGCAGCAGCGTCAAGAGCTATGCCAACG (Se-
cuencia ID N°: 17) o
CAGCATCTCCATTGAGTAATCACGTTGGTGTTCGGTGGCCCGCCGTGTTGCGTGGCGGAGGCTGCCGGGA
GACGGGTGGGGATGGTGGTGGGAGAGAATGTAGGGCGCCGTGTTTCAGTCCCTAGGCAGGATACCGGAA
AACCGTGTGGTAGGAGGTTTATAGGTTTCCAGGAGACGCTGTATAGGGGATAAATGAGATTGAATGGTGG
CCACACTCAAACCAACCAGGTCCTGTACATACAATGCATATACCAATTATACCTACCAAAAAAAAAAAAAA
AAAAAAAAAAAAAA (Secuencia ID N°: 18)
GACGGGTGGGGATGGTGGTGGGAGAGAATGTAGGGCGCCGTGTTTCAGTCCCTAGGCAGGATACCGGAA
AACCGTGTGGTAGGAGGTTTATAGGTTTCCAGGAGACGCTGTATAGGGGATAAATGAGATTGAATGGTGG
CCACACTCAAACCAACCAGGTCCTGTACATACAATGCATATACCAATTATACCTACCAAAAAAAAAAAAAA
AAAAAAAAAAAAAA (Secuencia ID N°: 18)
o una secuencia homóloga a las mismas que
codifica un polipéptido con actividad
endoglucanasa,
ii) es inmunológicamente reactiva con un
anticuerpo desarrollado contra una endoglucanasa altamente
purificada, codificada por la secuencia de ADN descrita en i) y
derivadado Aspergillus aculeatus, CBS 101.43, y/o
iii ) es específica para el xiloglucano.
En este contexto, el término "especifico para
el xiloglucano" sirve para indicar que la enzima expone una alta
actividad en un sustrato de xiloglucano y sólo una baja actividad,
o ninguna, en otros substratos que contienen celulosa, como
carboximetilcelulosa, celulosa, u otros glucanos.
La especificidad de la endoglucanasa en el
xiloglucano puede ser definida como la actividad relativa
determinada como la liberación de azúcares reductores en
condiciones óptimas obtenidos por la incubación de la enzima con el
xiloglucano y el otro sustrato sometido a la prueba,
respectivamente. Por ejemplo, la especificidad puede ser definida
como la actividad del xiloglucano respecto al
\beta-glucano (XGU/BGU) o la actividad del
xiloglucano respecto a la carboximetilcelulosa (XGU/CMCU) o la
actividad del xiloglucano respecto al Avicell ácido hinchado
(XGU/AVIU).
En la siguiente descripción, la enzima definida
por las propiedades i) -iii) anteriores es denominada corno
endoglucanasa de tipo II o (para abreviar Endoglucanasa II o EG
II).
En el presente contexto, el término "derivado
de" no sólo indica una endoglucanasa producida por la cepa CBS
101.43, sino también una endoglucanasa codificada por una secuencia
de ADN aislada de la cepa CBS 101.43 y producida en un organismo
huésped transformado con dicha secuencia de ADN.
En este contexto, el término "homólogo"
sirve para indicar un polipéptido codificado por ADN que híbrida en
la misma sonda que el ADN codificador de una enzima endoglucanasa
de la invención bajo ciertas condiciones específicas (como remojo
en una solución de 5xSSC y prehibridación durante 1 h a \sim40°C
en una solución de 5xSSC, solución de 5xDenhardt y 50 \mug de ADN
de timo de ternero desnaturalizado sometido a baño ultrasónico,
seguido de una hibridación en la misma solución completada por 50
\muCi de una sonda marcada con
32-P-dCTP durante 18 h a \sim40°C
y lavada tres veces en 2xSSC, 0.2% SDS a 40°C durante 30 minutos).
De manera más específica, el término se refiere a una secuencia de
ADN que presenta una homología de al menos el 70% con cualquiera de
las secuencias indicadas previamente codificadoras de una
endoglucanasa de la invención, o al menos un 75%, 80%, 85%, 90% o
incluso un 95% de homología con cualquiera de las secuencias
mostradas más arriba. El término incluye modificaciones de
cualquiera de las secuencias de ADN mostradas anteriormente, como
sustituciones del nucleótido que no producen otra secuencia de
aminoácidos del polipéptido codificado por la secuencia, sino que
se corresponde con el uso del codón del organismo huésped en el que
se introduce una construcción de ADN que comprende cualquiera de
las secuencias de ADN, o sustituciones del nucleótido que producen
una secuencia de aminoácidos diferente, y en consecuencia,
probablemente una estructura proteínica diferente que puede originar
una endoglucanasa mutante con propiedades diferentes a las de la
enzima original. Otros ejemplos de posibles modificaciones son la
inserción de uno o más nucleótidos en la secuencia, la adición de
uno o más nucleótidos en cualquier extremo de la secuencia, o la
eliminación de uno o más nucleótidos en cualquier extremo o en el
interior de la secuencia.
En otros aspectos, la presente invención se
refiere a una preparación enzimática útil para la degradación de
componentes de las paredes celulares vegetales, estando dicha
preparación enriquecida con una enzima que expone actividad
endoglucanasa según el modo descrito anteriormente, además de a los
diferentes usos de dicha preparación enzimática.
Se ha comprobado que la endoglucanasa de tipo II
de la presente invención posee una especificidad al xiloglucano
sorprendentemente alta, y una actividad específica muy alta hacia
este sustrato.
La endoglucanasa de tipo II de la presente
invención posee preferiblemente una proporción XGU/BGU, XGU/CMU y/o
XGU/AVIU (tal y como se ha definido antes) superior a 50, por
ejemplo de 75, 90 o 100.
Además, la endoglucanasa de tipo II está
preferiblemente desprovista sustancialmente de actividad hacia el
\beta-glucano, y/o expone como mucho una
actividad de un 3%, un 2% o alrededor de un 1% hacia la
carboximetilcelulosa, y/o el Avicell, mientras que la actividad
hacia el xiloglucano es del 100%. Además, la endoglucanasa de tipo
II de la invención está preferiblemente desprovista sustancialmente
de actividad transferasa, una actividad que ha sido observada en la
mayoría de las endoglucanasas específicas del xiloglucano de origen
vegetal.
Como se apreciará claramente en los ejemplos
posteriores, se puede obtener una endoglucanasa de tipo II de la
presente invención a partir de la especie micótica A.
aculeatus. No se ha descrito anteriormente ninguna endoglucanasa
microbiana con la especificidad de la endoglucanasa de tipo II. Se
han descrito endoglucanasas vegetales específicas del xiloglucano,
pero estas enzimas tienen actividad transferasa, y en consecuencia,
deben ser consideradas inferiores a las endoglucanasas específicas
del xiloglucano microbianas en lo que se refiere a una degradación
importante del xiloglucano. Una ventaja adicional de la enzima
microbiana es que se puede producir, en general, en mayores
cantidades con un huésped microbiano que las enzimas de otros
orígenes.
Se puede aislar una enzima de la invención
siguiendo un procedimiento general que implica:
- la clonación, en vectores adecuados, de una
biblioteca de ADN de Aspergillus spp.,
- la transformación de las células huésped de
levadura apropiadas con dichos vectores,
- el cultivo de las células huésped en las
condiciones apropiadas para expresar cualquier enzima de interés
codificada por un clon en la biblioteca de ADN, y
- la selección de los clones positivos mediante
la identificación de cualquier actividad endoglucanasa de la enzima
producida por estos clones.
Una descripción más detallada de este método de
selección se indica posteriormente en el Ejemplo 1.
La secuencia de ADN que codifica la enzima puede,
por ejemplo, ser aislada mediante la selección de una biblioteca de
ADNc de Aspergillus aculeatus, por ejemplo de la cepa CBS
101.43, disponible al público en Centraalbureau voor
Schimmelcultures, y la selección de los clones que expresan la
actividad enzimática apropiada (es decir, la actividad
endoglucanasa, definida como la capacidad de la enzima de
hidrolizar los enlaces \beta-1,3 y/o
(\beta-1,4 entre dos moléculas de glucosa en
polímeros que contienen glucosa (por ejemplo la celulosa, los
\beta-glucanos o xiloglucanos de cereales)). De
esta manera, se puede aislar la secuencia de ADN apropiada del
clon, mediante procedimientos estándares, por ejemplo, los que se
describen en el Ejemplo 1. Se supone que puede derivarse una
secuencia de ADN codificadora de una enzima homóloga mediante un
proceso similar de selección de una biblioteca de ADNc de otro
microorganismo, en particular de un hongo, como una cepa de
Aspergillus, en particular de A. aculeatus o A.
Niger, una cepa de Trichoderma, en particular T.
harzianum, T. reesie, una cepa de Fusarium, en
particular F. oxysporum o una cepa de Humicola.
De forma alternativa, el ADN codificador de la
endoglucanasa de la invención puede, según procedimientos
conocidos, ser aislado adecuadamente de cualquiera de los
organismos mencionados anteriormente, mediante la utilización de
sondas oligonucleótidas, como sondas 20mer, preparadas basándose en
una secuencia de ADN descrita en la presente invención. Por
ejemplo, una sonda oligonucleótida adecuada puede, por ejemplo, ser
preparada basándose en cualquiera de las secuencias nucleótidas
parciales a) -p) que aparecen en el listado anterior.
La secuencia de ADN puede ser posteriormente
insertada en un vector de expresión recombinante. Este puede ser
cualquier vector que, de forma apropiada, pueda ser sometido a
procedimientos recombinantes de ADN, y la elección del vector a
menudo dependerá de la célula huésped en la que vaya a ser
introducido. Así, el vector puede ser un vector de replicación
autónomo, es decir un vector que se define como una entidad
extracromosomal, cuya replicación es independiente de la
replicación cromosómica, por ejemplo un plásmido. De forma
alternativa, el vector puede ser uno que, al ser introducido en una
célula huésped, se integra en el genoma de la célula huésped y se
replica junto con el cromosoma(s) en el que se ha
integrado.
En el vector, la secuencia de ADN codificadora de
la endoglucanasa debería estar conectada de manera operativa a una
secuencia promotora y de terminación adecuadas. El promotor puede
ser cualquier secuencia de ADN que exponga una actividad de
transcripción de la célula huésped elegida, y puede derivar de
proteínas codificadoras de genes o bien ser homóloga o heteróloga
de la célula huésped. Los procedimientos utilizados para enlazar las
secuencias de ADN codificadoras de la endoglucanasa, y para
insertarlas en los vectores adecuados son conocidos por los
expertos en la técnica (ver por ejemplo, Sambrook et al.,
Molecular Cloninq. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor,
NY, 1989).
La célula huésped transformada por la secuencia
de ADN codificadora de la enzima según la invención es
preferiblemente una célula eucariótica, en particular una célula
micótica como una levadura o una célula micótica filamentosa. En
particular, la célula puede pertenecer a una especie de
Aspergillus, preferiblemente Aspergillus oryzae o
Aspergillus niger. Las células micóticas pueden ser
transformadas mediante un proceso que implica la formación de
protoplastos y la transformación de los protoplastos, seguido de
una regeneración de la membrana celular según un método conocido
per se. El uso de Aspergillus como microorganismo
huésped se describe en la patente EP 238 023 (de Novo Nordisk NS),
cuyo contenido se indica en la presente como referencia. La célula
huésped también puede ser una célula de levadura, por ejemplo una
cepa de Sacaromices, en particular de Sacaromices
cerevisiae.
En otro aspecto más, la presente invención se
refiere a un método de producción de enzimas según la invención, en
el que una célula huésped adecuada, transformada por una secuencia
de ADN codificadora de la enzima, es cultivada en unas condiciones
que permiten la producción de la enzima, y la enzima obtenida
durante el cultivo es recuperada.
El método de cultivo de las células huésped
transformadas puede ser cualquier método convencional adecuado para
el crecimiento de las células huésped en cuestión. En una forma
adecuada, la endoglucanasa expresada puede ser segregada en un
medio de cultivo del que se puede recuperar mediante procedimientos
conocidos que incluyen la separación de las células del medio
mediante centrifugado o filtración, la precipitación de los
componentes proteínicos del medio mediante sales, como el sulfato
amónico, seguido de procedimientos cromatográficos como la
cromatografía de intercambio fónico, la cromatografía de afinidad,
o similares.
La endoglucanasa purificada de esta manera se
puede utilizar para la inmunización de animales para producir
anticuerpos. Más específicamente, se puede desarrollar un antisuero
contra la endoglucanasa para la inmunización de conejos (u otros
roedores) según el procedimiento descrito por N. Axelsen et
al. en: A Manual of Quantitative Inmunoelectrophoresis,
Blackwell Scientific Publications, 1973, Capítulo 23, o por A.
Johnstone y R. Thorpe, Immunochemistry in Practice,
Blackwell Scientific Publications, 1982 (más específicamente p.
27-31). Se pueden obtener inmunoglobulinas
purificadas a partir del antisuero, por ejemplo por precipitación
de la sal ((NH_{4})_{2}SO_{4}), seguido de diálisis y
cromatografía de intercambio fónico, por ejemplo con
DEAE-Sephadex. Se puede obtener una caracterización
inmunoquimica de proteínas por medio del análisis de doble difusión
de Outcherlony (O. Ouchterlony en: Handbook of Experimental
Immunology (D.M. Weir, Ed.), Blackwell Scientific Publications,
1967, p. 655-706), por inmunoelectroforesis cruzada
(N. Axelsen et al., supra, Capítulos 3 y 4), o por
inmunoelectroforesis en cohete (N. Axelsen et al., Capítulo
2).
Las endoglucanasas según la invención, se pueden
producir esencialmente sin otras enzimas que degraden la pared
celular vegetal. Eso hace posible el uso de las enzimas solas o
junto con otras enzimas, como las galactanasas y las xilanasas, de
manera que se puede proporcionar una combinación óptima de enzimas
para aplicaciones particulares. De este modo es posible diseñar
combinaciones de enzimas que degraden únicamente algunas partes
específicas de la célula vegetal. Anteriormente, no se podía obtener
tal degradación específica con las preparaciones de celulosa,
hemicelulasa y/o pectinasa comercialmente disponibles.
La presente invención provee endoglucanasas con
un amplio margen de especificidad. De esta forma, se ha observado
una endoglucanasa de tipo II de la invención con una alta
especificidad al xiloglucano.
Esto hace que las endoglucanasas sean útiles
(solas y combinadas) en aplicaciones en las que se requiere una
modificación o una degradación completa o parcial de la celulosa,
los xiloglucanos o los derivados de estos sustratos.
La actividad de la enzimas endoglucanasa tipo II
de la invención hacia el xiloglucano, así como la actividad de la
enzimas endoglucanasa tipo IV hacia la celulosa, es útil en el
tratamiento de frutas y verduras. Se pueden utilizar las
endoglucanasas en tratamientos, por ejemplo, de trituración de
manzanas y peras para obtener una mayor cantidad de zumo. Los zumos
pueden tener un aspecto claro o turbio dependiendo de la combinación
de enzimas utilizada. Se pueden utilizar endoglucanasas en
tratamientos de trituración de uvas para obtener un mayor
rendimiento y un mejor aroma y color del vino. Se pueden utilizar
endoglucanasas para facilitar la extracción de la pectina, por
ejemplo, de la cáscara de los cítricos, de las manzanas, o de la
remolacha azucarera, y para la purificación de otras gomas
industriales como la goma guar y la goma de algarroba, debido a que
las enzimas recombinantes tienen la ventaja de ser producidas sin
las enzimas pectinoliticas o las enzimas de degradación de la goma
como la endomananasa.
La hemicelulosa, como el xiloglucano, debe ser
eliminada de las fibras vegetales como el algodón, el lino, el
cáñamo y el yute, antes de poder utilizar estos materiales como
textiles. Por esta razón la endoglucanasa de tipo II posee la
ventaja de eliminar el xiloglucano específicamente, sin estropear la
celulosa. Se puede utilizar esta endoglucanasa sola o con otras
enzimas (por ejemplo con pectinasas) que actúan sobre las
sustancias pécticas de las fibras. Además, se pueden utilizar las
endoglucanasas de la invención y otras análogas, en el tratamiento
de las fibras de celulosa u otros materiales celulósicos ricos en
fibra Se pueden utilizar las endoglucanasas, por ejemplo, en la
industria papelera para mejorar el drenaje de la pasta de papel, o
en el tratamiento de tejidos como los tejidos algodón para obtener
una tela más suave.
También se pueden utilizar las endoglucanasas de
la invención para la producción de oligosacáridos a partir de, por
ejemplo, material vegetal con glucano y xiloglucano
\beta-1,3-1,4 mezclados. Se pueden
utilizar los oligosacáridos resultantes como agentes
estabilizantes, por ejemplo en la alimentación.
Según se ha mencionado anteriormente, el tipo
preferido de preparación enzimática de la invención es una
preparación enzimática enriquecida con la endoglucanasa de la
invención, por ejemplo con una endoglucanasa de tipo II,
preferiblemente con un factor de enriquecimiento de al menos 1.1. De
esta manera, se puede favorecer la habilidad de degradación de la
pared celular de la preparación enzimática. La preparación
enzimática enriquecida con una enzima de la invención puede ser por
ejemplo una preparación enzimática que incluye actividades
enzimáticas múltiples, en particular una preparación enzimática
compuesta por enzimas que degradan las paredes celulares de
distintas plantas, como Pectinex®, Pectinex Ultra SP®, Celluclast o
Celluzyme (todas disponibles por Novo Nordisk A/S). En este
contexto, el término "enriquecido" indica un aumento de la
actividad endoglucanasa en la preparación enzimática, por ejemplo
con un factor de enriquecimiento de 1.1, gracias a la adecuada
adición de una enzima de la invención preparada según el método
descrito anteriormente.
De forma alternativa, la preparación enzimática
enriquecida con una enzima que expone actividad endoglucanasa puede
incluir una enzima de la invención como principal componente
enzimático, por ejemplo una preparación enzimática
monocomponente.
La preparación enzimática puede prepararse según
métodos conocidos en la técnica, y puede presentarse en forma de
líquido o preparación seca. Por ejemplo, la preparación enzimática
puede tener forma granulada o microgranulada. La enzima que se va a
incluir en la preparación puede ser estabilizada con los métodos
conocidos en la técnica.
La preparación enzimática de la invención puede
incluir, además de la endoglucanasa de la invención, una o más
enzimas que degradan la pared celular vegetal, como aquellas que
tienen actividades celulíticas, xilanolíticas o pectinolíticas
como xilanasa, arabinanasa, ramnogalacturonasa, pectina
acetilesterasa, galactanasa, poligalacturonasa, pectina liasa,
pectato liasa, endoglucanasa o pectina metilesterasa. La/s enzima/s
adicionales se pueden producir mediante un microorganismo
perteneciente al género Aspergillus, preferiblemente
Aspergillus Niger, Aspergillus aculeatus, Aspergillus
awamori o Aspergillus oryzae. Este tipo de preparación
puede proporcionar un poder de licuefacción total increíblemente
bueno, y en consecuencia una disminución relevante de la viscosidad
de los materiales de trituración de manzanas y de productos
biológicos similares.
Se entenderá que se puede utilizar una
preparación enzimática para alcanzar los objetivos mencionados
anteriormente. En este aspecto, la dosificación de la preparación
enzimática de la invención y otras condiciones con las que se
realiza la preparación, se pueden determinar basándose en métodos
conocidos en la técnica.
El poder de licuefacción total de la preparación
enzimática se determina como la reducción de la viscosidad total (=
en función del suero + la viscosidad estructural) en una pasta de
manzana finamente triturada controlada de manera continua durante
más de 2 horas por medio de un viscosimetro giratorio.
La invención se describe a continuación en
referencia a los dibujo anexos, en los que:
La Figura 1 es un mapa de restricción del
plásmido pYHD17,
La Figura 2 es un mapa de restricción del
plásmido pHD 414,
La Figura 3 ilustra el pH óptimo de EG II, EG III
y EG IV, medido con tampones de citrato/fosfato. La actividad
óptima de cada enzima se determina como el 100%,
La figura 4 representa la estabilidad del pH para
la EG II y la EG III, medida como la actividad que queda después de
1 h, con diferentes valores de pH, en comparación con la actividad
de la enzima fresca (100%),
La Figura 5 representa la temperatura óptima de
la EG II y la EG III. La temperatura óptima para cada enzima se
determina como el 100%, y
La Figura 6 representa la estabilidad de la
temperatura de la EG II y la EG III, medida como la actividad que
queda después de una preincubación en agua durante 1 h con
diferentes temperaturas en comparación con la actividad de la
enzima fresca (100%).
La invención se describe con más detalle en los
ejemplos siguientes, los cuales no deben ser considerados de
ninguna manera como limitativos del objetivo de la invención
reivindicada.
Se aisló el ARNm de Aspergillus aculeatus,
CBS 101.43, se desarrolló en un medio de fermentación con un
contenido de soja, fue sometido a agitación para asegurar una
aireación suficiente. Se recogieron los micelios después de 3 a 5
días de crecimiento y se congelaron inmediatamente en nitrógeno
líquido y se almacenaron a -80°C.
La cepa de Saccharomyces cerevisiae usada
fue yNG231 (Mat alpha, leu2, ura3-52,
his4-539, pep4-delta 1, cir+) o
JG169 (MAT\alpha; ura 3-52; Ieu
2-3, 112; his 3-D200; pep
4-113; prcl::HIS3; prbl:: LEU2; cir+).
El plásmido comercialmente disponible pYES II
(Invitrogen) fue cortado con Spe I, rellenado con ADN de polimerasa
Klenow + dNTP y cortado con Clal. Se fraccionó el ADN en fragmentos
en un gel de agarosa, y se purificó un fragmento de aproximadamente
2000 bp mediante electroelución. Dicho plásmido fue cortado con
Clal/Pvull, y se purificó un fragmento de aproximadamente 3400 bp
mediante electroelución. Los dos fragmentos fueron ligados a un
fragmento Sph I/EcoR I de extremos romos que contiene el promotor
de levadura TPI. Se aisló dicho fragmento de un plásmido en el que
el promotor TPI de S. cerevisiae (ver T. Albers y G.
Kawasaki, J. Mol. Appl. Genet. 1, 1982, p. 419-434)
estaba ligeramente modificado: se eliminó un sitio interno Sph I
anulando los cuatro bp que constituyen el núcleo de dicho sitio.
Además, se eliminaron las secuencias redundantes anteriores al
promotor por medio de un tratamiento de exonucleasa Bal I seguido
de la adición de un enlace Sph I. Finalmente, se añadió un enlace
EcoR I en la posición -10. Después de estas modificaciones, se
incluye el promotor en un fragmento Sph I-EcoR I. Su
eficacia, comparada con la del promotor original, no parece verse
alterada por las modificaciones. El plásmido obtenido pYHD17 se
ilustra en la Figura 1.
Todo los recipientes de cristal usados durante
los aislamientos del ARN fueron horneados a 220°C durante 12 h como
mínimo. Los tubos de Eppendorf, las pipetas de vidrio y las
columnas de plástico se trataron con soluciones de
dietilpirocarbonato (DEPC) al 0.1% durante 12 h en EtOH, y fueron
sometidos a autoclave posteriormente. Se trataron todos los
tampones y el agua (excepto los tampones que contenían Tris) con
DEPC al 0.1% durante 12 h a 37°C, y fueron posteriormente sometidos
a autoclave.
Se preparó el ARN total por extracción con
tiocianato de guanidinio seguido de un ultracentrifugado a través
de un amortiguador CsCI 5.7 M (Chirgwin et al., 1979)
utilizando las modificaciones siguientes. Los micelios congelados
y cultivados en N_{2} líquido fueron reducidos a un polvo fino
con un mortero y un mazo, seguido de trituración en un molino para
café preenfriado, e inmediatamente suspendido en 5 volúmenes de
tampón de extracción del ARN (GuSCN 4 M,
Na-laurilsarcosina al 0.5%, Nacitrato 25 mM, pH
7.0, \beta-mercaploetanol 0.1 M). La mezcla fue
agitada durante 30 minutos a temperatura ambiente y centrifugada
(30 minutos, 5000 r.p.m., temperatura ambiente, Heraeus
Megafuge 1.0 R) para transformar los fragmentos de célula en un
granulado. Se recogió el sobrenadante y se estratificó
cuidadosamente con un amortiguador de CsCI 5.7 M (CsCI 5.7 M, EDTA
0.1 M, pH 7.5, DEPC al 0.1%; sometido a autoclave antes de ser
utilizado) con 26.5 ml de sobrenadante por 12.0 ml de amortiguador
de CsCI, y se centrifugó para obtener el ARN total (rotor Beckman,
SW 28, 25 000 rpm, temperatura ambiente, 24h). Después del
centrifugado se eliminó cuidadosamente el sobrenadante y se cortó
el fondo del tubo que contenía el ARN granulado y se enjuagó con
EtOH al 70%. Se transfirió el ARN total granulado a un tubo de
Eppendorf, se suspendió en 500 \mul de TE, pH 7.6 (en caso de
dificultad, calentar ocasionalmente durante 5 minutos a 65°C), el
fenol fue extraído y precipitado con etanol durante 12 h a -20°C
(2.5 volúmenes de EtOH, 0.1 volumen de NaAc 3M, pH 5.2). Se recogió
el ARN por centrifugado, se lavó en EtOH al 70%, y se volvió a
suspender en un volumen mínimo de DEPC-DIW. Se
determinó la concentración de ARN midiendo OD 260/280.
Se aislaron los ARN poli(A)^{+}
por cromatografía de afinidad de celulosa oligo(dT) (Aviv
& Leder, 1972). Típicamente, se inflan previamente 2 g de
celulosa olligo(dT) (Boehringer Mannheim) en 10 ml del
tampón de carga en 1 x columna (Tris-Cl 20 mM, pH
7.6, NaCl 0.5 M, EDTA 1 mM, SDS al 0.1%), cargados en una columna
tapada de plástico tratada con DEPC, (Poly Prep chromatography
Column, Bio Rad), y equilibrada con 20 ml de tampón de carga. Se
calentó la cantidad de ARN total a 65°C durante 8 minutos, se
enfrió con hielo durante 5 minutos, y se añadió posteriormente 1
Volumen de tampón de carga en 2 x columna a la muestra de ARN
cargada en la columna. Se recogió el eluido y se volvió a cargar de
2 a 3 veces calentando la muestra como se ha indicado
anteriormente, se enfrío rápidamente con hielo antes de cada carga.
La columna de oligo(dT) fue lavada con 10 volúmenes de 1 x
tampón de carga, después con 3 volúmenes de tampón en medio salino
(Tris-Cl 20 mM, pH 7.6, NaCl 0.1 M, EDTA 1 mM, SDS
al 0.1%), seguido de elución del ARN poli(A)^{+}
con 3 volúmenes de tampón de elución (Tris-Cl 10
mM, pH 7.6, EDTA 1 mM, SDS al 0.05%) precalentada a 65°C, recogiendo
las fracciones de 500 pl. Se deterrninó OD_{260} para cada
fracción recogida, se agruparon las fracciones que contienen ARNm,
y se precipitó el etanol a -20°C durante
\hbox{12 h}. Se
recogió el ARN poli(A)^{+} por centrifugado, se
resuspendió en DEPC-DIW y se almacenó en alícuotas
de 5-10 \mug a -80°C.
Los ARN poli(A)^{+} (5
\mug/muestra) de diferentes micelios fueron sometidos a
electroforesis en geles de formaldehído 1.2 -
agarosa-2.2 M (Sambrook et al., 1989), y
transferidos a membranas de nilón (Hybond-N,
Amersham) con 10 x SSC como tampón de transferencia (Sambrook et
al., 1989). Se utilizaron tres sondas de ADNc marcadas con ^{32}p
cebadas al azar (Feinberg & Vogelstein, 1983) en hibridaciones
individuales: 1) un fragmento Not I-Spe I de 1.3 kb
de poligalacturonasa de A. aculeatus (descrito en la
Solicitud de patente Danesa DK 1545/92), 2) un fragmento Not I -Spe
I de 1.3 kb codificador de la endoglucanasa de A. aculeatus
(descrito en la publicación DK 0419/92) y 3) un fragmento Eag I de
1.2 kb de galactanasa de A. aculeatus (descrito en la
publicación WO 92/13945). Se realizaron hibridaciones de
"Nothern" en una solución 5 x SSC (Sambrook et al., 1989),
solución 5 x Denhardt (Sambrook et al., 1989), SDS al 0.5% (p/v) y
100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado con una
concentración de la sonda de aproximadamente 2 \mug/ml durante 16
h a 65°C, seguido después con lavados en 5 x SSC a 65°C (2 cada 15
minutos), en 2 x SSC, SDS al 0.5% (1 cada 30 minutos), en 0.2 x
SSC, SDS al 0.5% (1 cada 30 minutos), y en 5 x SSC (2 cada 15
minutos). Después de una autorradiografía a -80°C durante 12h, se
eliminó la sonda # 1 del filtro según las instrucciones del
fabricante, y ésta fue rehibridizada con la sonda #2, y finalmente
con la sonda #3. Se utilizó la escalera de ARN "RNA Ladder" de
los Laboratorios Bethesda Research Laboratories como
marcador del tamaño.
Se sintetizó ADNc bicatenario a partir de 5
\mug del ARN poli(A)^{+} de A. aculeatus,
usando el método de la ARNasa H (Gubler & Hoffman 1983,
Sambrook et al., 1989) con la modificación de la esructura en
horquilla. Se calentó el ARN poli(A)^{+} (5 \mug
en 5 \mul de agua tratada con DEPC) a 70 °C durante 8 minutos,
se enfrió con hielo y se combinó con tampones de transcriptasa
inversa en un volumen final de 50 \mul (Tris-Cl 50
mM, pH 8.3, KCI 75 mM, MgCl2 3 mM, DTT 10 mM, Bethesda Research
Laboratories) conteniendo 1 mM cada dNTP (Pharmacia), 40
unidades del inhibidor de la ribonucleasa de placenta humana
(RNasin, Promega), 10 \mug del cebador
oligo(dT)_{12-18} (Pharmacia) y 1000
unidades de transcriptasa inversa - Ribonucleasa H Superscript II
(Bethesda Research Laboratories). Se sintetizó la primera
cadena de ADNc incubando la mezcla reactiva a 45°C durante 1 h.
Después de la síntesis, se añadieron 30 \mul de
Tris-Cl 10 mM, pH 7.5, EDTA 1 mM, y los híbridos
ARNm:ADNc fueron precipitados con etanol durante 12 h a -20°C
mediante la adición de 40 g de un soporte de glicógeno (Boehringer
Mannheim), 0.2 volúmenes de NH_{4}Ac 10 M y 2.5 volúmenes de EtOH
al 96%. Se recuperaron los híbridos por centrifugado, se lavaron en
EtOH al 70%, se secaron con aire y fueron resuspendidos en un
tampón de segunda cadena con 250 \mul (Tris-Cl 20
mM, pH 7.4, KCI 90 mM, MgCl2 4.6 mM,
(NH_{4})_{2}SO_{4} 10 mM, 16 \muM de
\betaNAD^{+}) conteniendo 100 \muM cada dNTP, 44 unidades de
ADN polimerasa I de E. col/ (Amersham), 6.25 unidades de
Ribonucleasa H (Bethesda Research Laboratories) y 10.5
unidades de ADN ligasa de E. coli (New England
Biolabs). Se realizó una segunda síntesis de la cadena de ADNc
incubando el tubo de la reacción a 16°C y durante 3 h, y se detuvo
la reacción mediante la adición de EDTA hasta una concentración
final de 20 mM seguido de extracción del fenol.
El ADNc bicatenario fue precipitado en etanol a
-20 °C durante 12 h mediante la adición de 2 volúmenes de EtOH al
96%, 0.1 volúmenes de NaAc 3 M, pH 5.2, recuperado por
centrifugado, lavado en EtOH al 70%, secado (SpeedVac), y
resuspendido en 30 \mul del tampón de nucleasa de la judía Mung
(NaAc 30 mM, pH 4.6, NaCl 300 mM, ZnSO_{4} 1 mM, 0.35 mM DTT,
glicerol al 2%) que contiene 36 unidades de nucleasa judía Mung
(Bethesda Research Laboratories). Se cortó el ADN
monocatenario de estructura en horquilla por incubación de la
reacción a 30°C durante 30 minutos, seguido de adición de 70 \mul
de Tris-Cl 10 mM, pH 7.5, EDTA 1 mM, extracción del
fenol y precipitación del etanol a -20°C durante 12h, con 2
volúmenes de EtOH al 96% y 0.1 volumen de NaAc 3M, pH 5.2.
Se obtuvo un ADNc bicatenario de extremos romos
mediante ADN polimerasa T4 en 50 \mul de tampón de ADN
polimerasa T4 (Tris-acetato 20 mM, pH 7.9, MgAc 10
mM, KAc 50 mM, DTT 1 mM) con un contenido de 0.5 mM cada dNTP y 7.5
unidades de ADN polimerasa T4 (Invitrogen), incubando la mezcla
reactiva a 37°C durante 15 minutos. Se detuvo la reacción mediante
la adición de EDTA hasta una concentración final de 20 mM, y se
procedió a la extracción de fenol y la precipitación de etanol.
\newpage
Después de la reacción de relleno, se procedió a
ligar el ADNc de los adaptadores BstX I no palindrómicos (1
\mug/\mul, Invitrogen) con 30 \mul de un tampón de ligación
(Tris-Cl 50 mM, pH 7.8, MgCl2 10 mM, DTT 10 mM,
ATP 1 mM, 25 \mug/ml de albúmina de suero bovino) que contiene
600 pmol de adaptadores BstX I y 5 unidades de ligasa T4
(Invitrogen) mediante la incubación de una mezcla de reacción a 16°C
durante 12h. La reacción se detuvo con un calentamiento a 70°C
durante 5 minutos, y el ADNc adaptado se fraccionó en tamaño
mediante electroforesis en gel de agarosa (agarosa HSB 0.8%, FMC )
con el fin de separar los adaptadores no ligados y los ADNc más
pequeños. El ADNc fue seleccionado según el tamaño con el punto de
corte en 0.7 kb, y dicho ADNc se electropurificó con gel de agarosa
en Tris-Cl 10 mM, pH 7.5, EDTA 1 mM durante 1 h a
100 voltios, se extrajo el fenol y se precipitó el etanol a -20°C
durante 12 h como se ha mencionado más arriba.
El ADNc bicatenario adaptado fue recuperado por
centrifugado, se lavó en EtOH al 70% y se volvió a suspender en 25
ml de DIW. Antes de la ligación de la biblioteca a gran escala, se
realizaron cuatro ligaciones de prueba en
\hbox{10
\mu l} de tampón de ligación (igual que el anterior), cada
uno conteniendo 1 \mul de ADNc bicatenario (tubos de reacción #1
- #4), 2 unidades de ligasa T4 (Invitrogen) y 50 ng (tubo #1), 100
ng (tubo #2) y 200 ng (tubos #3 y #4) de vectores de expresión de
levadura Bst XI disociados, ya sea pYES 2.0 Invitrogen o yHD13).
Las reacciones de ligación se llevaron a cabo por incubación a
+16°C durante 12 h, calentamiento a 70°C durante 5 minutos, y 1
\mul de cada ligación se electroporó (200 K2, 2.5 kV, 25 \muF)
en 40 \mul de células competentes de E. coli 1061 (OD600 =
0.9 en 1 litro de caldo LB, lavado dos veces en DIW frío, una vez
en 20 ml de glicerol 10%, resuspendido en 2 ml de glicerol 10%).
Después de añadir 1 ml de SOC en cada mezcla de transformación, las
células crecieron a 37°C durante 1 h, 50 \mul fueron
distribuidas en placas de ampicilina LB + (100 \mug/ml) para su
crecimiento a 37°C durante 12h.
En condiciones óptimas, se realizó una ligación a
gran escala con 40 \mul de tampón de ligación que contenía 9
unidades de ligasa T4 y se incubó la reacción a 16°C durante 12h. La
reacción de ligación se detuvo por calentamiento a 70°C durante 5
minutos, el etanol precipitó a -20°C durante 12 h, se recuperó por
centrifugado y se volvió a suspender en 10 \mul de DIW. Se
transformó 1 \mul de partes alícuotas en células
electrocompetentes de E. coli 1061, usando las mismas
condiciones de electroporación que antes, las células transformadas
se concentraron y la biblioteca fue distribuida en placas de
ampicilina LB + con 5000-7000 c.f.u.(cepa
bacteriana)/placa. Se añadieron 3 ml de medio en cada placa. Se
sacaron las bacterias, se añadió 1 ml de glicerol y se almacenaron
a -80°C en grupos. Se utilizaron los 2 ml restantes para aislar el
ADN. Si la cantidad de ADN resulta insuficiente para proporcionar el
número requerido de transformantes de levadura, se puede preparar
ADN a gran escala a partir de 500 ml del medio (TB) inoculado con
50 \mul de caldo bacteriano a -80°C propagado durante la
noche.
Con el fin de asegurar que todos los clones
bacterianos son evaluados en levadura, se estableció como límite
una cantidad de transformantes de levadura 5 veces superior al
número de clones bacterianos presentes en los grupos
originales.
Un \mul de alícuotas de ADN de plásmido
purificado (100 ng/\mul) de los grupos individuales fue sometido
a electroporación (200 \Omega, 1.5 kV, 25 \muF) en 40 \mul
de células competentes de S. cerevisiae JG 169 (OD600 = 1.5
en 500 ml de YPD, lavadas dos veces en una solución de DIW fría,
una vez en una solución de sorbitol frío 1 M, resuspendidas en 0.5
ml de sorbitol 1 M, Becker & Guarante, 1991). Después de la
adición de 1 ml de sorbitol frío 1M, 80 \mul de partes alícuotas
fueron distribuidas en placas con SC + glucosa - uracilo con el fin
de proporcionar de 250 a 400 c.f.u./placa, y fueron incubadas a
30°C de 3 a 5 días.
El vector pHD414 es un derivado del plásmido
p775 (descrito en la publicación EP 238 023). A diferencia de este
plásmido, el pHD 414 presenta una serie de sitios de restricción
únicos entre el promotor y el terminador. El plásmido se construyó
mediante la extracción de un fragmento de aproximadamente 200 bp de
longitud (con sitios RE indeseables) en el extremo 3' del
terminador, y la posterior extracción de un fragmento de
aproximadamente 250 bp de longitud en el extremo 5' del promotor,
el cual también contiene sitios indeseables. La región de 200 bp fue
eliminada por disociación con Nar I (situada en el vector pUC ) y
Xba I (justo en 3' del terminador), posterior rellenado de los
extremos formados con ADN polimerasa Klenow +dNTP, purificación del
fragmento del vector en gel y religación del fragmento del vector.
Este plásmido fue denominado pHD413. El pHD413 fue cortado con Stu
I (situado en la extremidad 5' del promotor) y IFvu II (en el
vector pUC), fraccionado en gel y ligado otra vez. El plásmido pHD
414 se muestra en la Figura 2, que es un mapa del plásmido pHD414,
en el que "Terminador AMG" se refiere al terminador de
glucoamilasa A. Niger, y "Promotor TAKA" indica el
promotor TAKA amilasa de A. oryzae.
Se inoculan 100 ml de YPD (Sherman et al.,
Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1981) con
esporas de A. oryzae o A. Niger y se incuban bajo
agitación a 37°C durante unos 2 días. Se recoge el micelio por
filtración a través de un Miracloth, y se lava con 200 ml de
MgSO_{4} 0.6 M. Se suspende el micelio en 15 ml de MgSO_{4}1.2
M. NaH_{2}PO_{4} 10 mM, pH = 5.8. La suspensión es enfriada
con hielo y se añade 1 ml de un tampón que contiene 120 mg de
Novozym® 234, lote 1687. Después de 5 minutos se añade 1 ml de 12
mg/ml BSA (Sigma tipo H25) y se incuba con una ligera agitación de
forma continua durante 1.5 a 2.5 horas a 37°C hasta que se pueda
distinguir en una muestra con un microscopio un gran número de
protoplastos.
La suspensión se filtra con un Miracloth, se
transfiere el filtrado a un tubo estéril y se recubre con 5 ml de
sorbitol 0.6 M, Tris-Cl 100 mM, pH = 7.0. Se realiza
un centrifugado durante 15 minutos a 100 g y los protoplastos se
recogen desde la parte superior del amortiguador MgSO_{4}. Se
añaden 2 volúmenes de STC (sorbitol 1.2 M, Tris-Cl
10 mM, pH = 7.5. CaCl_{2} 10 mM) a la suspensión de protoplastos
y la mezcla es centrifugada a 1000 g durante 5 minutos. Se
resuspende el granulado de protoplastos en 3 ml de STC para
regranularlo posteriormente. Se repite dicha operación. Finalmente
se vuelven a suspender los protoplastos en 0.2-1 ml
de STC.
Se mezcla 100 \mul de suspensión de
protoplastos con 5-25 \mug del ADN apropiado en
10 \mul de STC. Los protoplastos se mezclan con p3SR2 (un
plásmido portador del gen amdS de A. nidulans). Se deja
reposar la mezcla a temperatura ambiente durante 25 minutos. Se
añaden 0.2 ml de PEG 4000 al 60% (BDH 29576). CaCl_{2} 10 mM y
Tris-Cl 10 mM, pH = 7.5, y se mezcla cuidadosamente
(dos veces) y finalmente se añaden 0.85 ml de la misma solución y
se mezcla cuidadosamente. Se deja reposar la mezcla a temperatura
ambiente durante 25 minutos, se centrifugan 2500 g durante 15
minutos y se resuspende el granulado en 2 ml de sorbitol 1.2 M. Tras
otra sedimentación los protoplastos se extienden en las placas
apropiadas. Los protoplastos se extienden en un número mínimo de
placas (Cove Biochem.Biophys.Acta 113 (1966)
51-56), que contienen sucrosa 1.0 M, pH=7.0,
acetamida 10 mM como fuente de nitrógeno y CsCI 20 mM para inhibir
el crecimiento secundario. Tras una incubación durante 4 a 7 días a
37°C, se recogen las esporas y se extienden en colonias
individuales. Se repite este procedimiento y las esporas una
colonia individual después del segundo reaislamiento son
almacenadas como transformante definido.
YPD: 10 g de extracto de levadura, 20 g de
peptona, H_{2}O hasta 810 ml. Sometido a autoclave, se añaden 90
ml de glucosa 20% (filtrado estéril).
YPG-agar: 25 g/l de Bactoagar, 15
g/l de glucosa, 5 g/l de K_{2}PO_{4}, 0.5 g/l de
MgSO_{4}-7H_{2}O, pH ajustado en 5.0. Sometido a
autoclave.
10 x Sal basal: 66.8 g de base nitrogenada de
levadura, 100 g de ácido sucínico, 60 g de NaOH, H_{2}O hasta
1000 ml, filtrado estéril.
SC-URA: 90 ml de 10 x de Sal
basal, 22.5 ml de ácidos de casamino 20%, 9 ml de triptófano 1%,
H_{2}O hasta 806 ml. Sometido a autoclave, se añadieron 3.6 ml
de treonina al 5% y 90 ml de glucosa al 20%.
SC-H agar: 7.5 g/l de base
nitrogenada de levadura sin aminoácidos, 11.3 g/l de ácido
sucínico, 6.8 g/l de NaOH, 5.6 g/l de ácidos de casamino sin
vitaminas, 0.1 g/l de triptófano y 20 g/l de agar (Bacto). Sometido
a autoclave durante 20 minutos a 121°C. Después del autoclave, se
añadieron 55 ml de una solución de galactosa al 22% y 1.8 ml de una
solución de treonina 5% por 450 ml de agar.
YNB-1 agar: 3.3 g/l de
KH_{2}PO_{4}, 16.7 g/l de agar, pH ajustado en 7. Sometido a
autoclave durante 20 minutos a 121°C. Después del autoclave, se
añadieron 25 ml de una base nitrogenada de levadura al 13.6% sin
aminoácidos, 25 ml de una solución de glucosa al 40%, 1.5 ml de una
solución de L-leucina al 1%, y 1.5 ml de una
solución de histidiina al 1% por cada 450 ml de agar.
Caldo YNB-1: Composición corno el
YNB-1 agar, pero sin agar.
FG-4 agar: 35 g/l de agar, 30 g/l
de harina de soja, 15 g/l de maltodextrina (Glucidex 6), 5 g/l de
Bactopeptona, pH 7. Sometido a autoclave durante 40 minutos a
121°C
Medio FG-4: 30 g/l de harina de
soja, 15 g/l de maltodextrina (Glucidex 6), 5 g/l de Bactopeptona.
Sometido a autoclave durante 40 minutos a 121°C.
Xiloglucano AZCL: disponible por Megazyme,
Australia.
Celulosa AZCL-E: disponible por
Megazyme, Australia.
Se realizó la electroforesis
SDS-PAGE en una unidad de electroforesis
Mini-Leak 4
(Kem-En-Tec, Copenhage) como una
versión modificada del procedimiento Laemli (Laemmli, 1970;
Christgau, 1991). En resumen, el gel de separación fue vertido en
acrilamida 12%; Acrilamida BIS 0.2%; SDS 0.1%; Tris 0.375 M, pH
8.8; APS 0.04% (amonio-persulfato) y TEMED 0.04%.
Después de 6 a 15 horas de polimerización el gel apilado fue
vertido en Acrilamida p/p al 4.5%; BIS Acrilamida 0.075%; SDS 0.1%;
Tris 66.5 mM, pH 6.8; APS p/p 0.4% (amonio persulfato) y TEMED
0.4%. Se llenaron las cámaras de electrodos con un tampón de
corrimiento compuesto por: una base de Tris 25 mM; glicina 0.192 M
y SDS al 0.05%, en el que posteriormente se cargaron las muestras
que contenían el tampón de muestra, y el gel fue corrido a
2-4 mA/gel durante la noche y a
10-30 mA/gel en un corrimiento rápido.
Posteriormente se eliminó el gel y fue coloreado, bien en azul
commassie o en color plata.
El isoelectroenfoque se realiza en placas PAG
Amfolina con un pH comprendido entre 3.5 y 9.5 (Pharmacia, Upsala)
con una unidad de electroforesis Multiphor, de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. Después de la electroforesis, el gel
tiene un color azul commassie o plata.
El gel se elimina de las placas de vidrio
cuidadosamente y se incuba en una tabla que gira lentamente con
agitación en aproximadamente 100 ml de las soluciones
siguientes:
1) 30 minutos en etanol 40% v/v; ácido acético 5%
v/v
2) 30 minutos en etanol 40% v/v; ácido acético 5%
v/v + Commassie R250 0.1%
3) Decoloración durante 30 minutos en etanol 40%
v/v; ácido acético 5% v/v hasta que el color base esté
suficientemente reducido.
4) Finalmente el gel es incubado en una solución
de conservación: ácido acético 5% v/v; etanol 10% v/v; glicerol 5%
v/v, y secado con aire entre dos hojas de membrana de celofán.
1) 30 minutos en etanol 40% v/v; ácido acético 5%
v/v
2) 20 minutos en etanol 10% v/v; ácido acético 5%
v/v
3) 20 minutos en APS 0.0057% p/v (0.25 mM)
4) 60 minutos en AgNO_{3} 0.1% p/v
5) Para su desarrollo, el gel se sumerge en un
revelador: formaldehído 0.015%; Na_{2}CO_{3} 2% p/v durante 30
a 60 segundos. Después el gel se incuba por segunda vez con el
revelador hasta obtener una coloración satisfactoria de las
proteínas (de 5 a 15 minutos). Finalmente el gel se incuba en una
solución de conservación: ácido acético 5%, v/v; etanol 10% v/v;
glicerol 5% v/v y se seca con aire entre dos hojas de membrana de
celofán.
Para la caracterización de las enzimas, las
incubaciones se realizan en tubos Eppendorf que comprenden 1 ml de
sustrato (sustratos AZCL o polisacáridos puros de MegaZyme). Una
suspensión de 0.5ml de sustrato AZCL al 0.4% se mezcla con 0.5m1 de
tampón citrato/fosfato 0.1M de pH óptimo y se añaden 10 \mul de
una solución enzimática diluida de manera apropiada. Las
incubaciones se realizan con termomezcladores de Eppendorf durante
15 minutos a 30°C (si no se especifica de otra manera) antes de la
desactivación por calentamiento durante 20 minutos a 95°C. Las
incubaciones enzimáticas se realizan por triplicado. Se produce una
muestra en blanco en la se añade la enzima pero que es desactivada
inmediatamente. Después del centrifugado la absorbancia del
sobrenadante se mide con placas de microvaloración a 620nm y se
sustrae la muestra en blanco.
Las actividades de las enzimas son
evaluadas en diferentes polisacáridos puros: xiloglucano y
\beta-glucano de MegaZyme, CMC (Blanosa de
Aqualon) y Avicell (celulosa microcristalina de Merck). Antes del
uso se hincha la celulosa Avicell en ácido ortofosfórico al 85%
durante 1 hora a temperatura ambiente y se lava con acetona y agua.
Se hacen soluciones/suspensiones al 0.5% de los diferentes
sustratos en un tampón de acetato 0.1 M (si no se especifica de otra
manera) de pH óptimo, se añaden 10\mul de las soluciones
enzimáticas por lml de sustrato, se realizan las incubaciones a
30°C durante 15 minutos antes de desactivarlas por calentamiento,
como se ha mencionado más arriba. Se determinan los azúcares
reductores a través de una reacción, en placas de microvaloración,
con un agente reactivo PHBAH que comprende 0.15 g de hidracida del
ácido parahidroxi benzoico (Sigma H-9882), 0.50 g de
tartrato de potasio-sodio (Merck 8087) y una
solución de NaOH al 2% hasta 10.0 ml. Se sustraen los resultados de
las pruebas en blanco. Se usa la glucosa como estándar.
Se mide el pH óptimo en los sustratos de
MegaZyme (EG II en AZCL-Xiloglucano, EG III en
\beta-glucano puro, y EG IV en
AZCL-\beta- glucano). Se mezclan 0.5ml de
sustrato al 0.4% con 0.5m1 de tampón citrato/fosfato 0.1 M, de pH
variable, y se añaden 10 \mul de una solución enzimática diluida
de forma apropiada. Las incubaciones se realizan según el modo
descrito anteriormente.
La especificidad de las diferentes
endoglucanasas se evalúa en los diferentes sustratos AZCL como se
ha mencionado antes, con un pH óptimo en un tampón de acetato
0.1M.
La estabilidad del Ph se determina dejando
la enzima durante 1 hora en una solución con tampones de ácido
cítrico 0.1 M / fosfato tri sodio, con un pH variable, antes de usar
la enzima para la incubación de
AZCL-\beta-glucano con el pH
óptimo.
La temperatura óptima se determina
incubando la enzima con el sustrato de
AZCL-\beta-glucano a temperaturas
variables durante 15 minutos con el pH óptimo.
La estabilidad de la temperatura se
determina dejando la enzima, diluida en agua, a diferentes
temperaturas durante 1 hora antes de la incubación a 30°C con el
sustrato adecuado.
La constante Km y la actividad específica
se determinan realizando incubaciones en concentraciones del
sustrato (S) en una gama del 0.025 al 1.5% (xiloglucano para la EG
II y \beta-glucano para la EG IV), se mide el
nivel de reacción (v), se representa S/v como una función de S, se
realiza un análisis de regresión lineal, determinando la
inclinación (=1/Vmax) y la ordenada en el origen (Km/Vmax) y
calculando la constante km y la actividad específica (=Vmax/E),
donde E representa la cantidad de enzima añadida.
Para la cromatografía por filtración en
gel se realizaron soluciones/suspensiones al 1% de los
polisacáridos puros mencionados anteriormente. Se añade una
cantidad adecuada de enzimas y se realizan las incubaciones durante
0, 1, 2, 4 y 24 horas antes de proceder a la desactivación por
calentamiento. Se inyectan 25\mul de muestra en tres columnas TSK
dispuestas en fila (PW G4000, PW G3000, PW G2500) y los sacáridos
son eluidos con un tampón acetato 0.4M de pH 3.0 a 0.8ml/min. Se
determinan los sacáridos de elución por medio de un detector
Shimadzu RI, y los datos son recogidos y procesados por medio de un
software Dionex. Se utilizan las dextranas (de Sersa) como
estándares del peso molecular.
Se construyó una biblioteca de Aspergillus
aculeatus, CBS 101.43, en E. coli, consistente en
aproximadamente
\hbox{1.5 x 10 ^{6} } clones individuales
en 50 grupos, tal y como se ha descrito anteriormente.
Se aisló el ADN de 20 clones individuales de la
biblioteca y fue sometido a análisis para la inserción del ADNc. Se
determinó una frecuencia de inserción inferior al 90% y un tamaño
medio de inserción de aproximadamente 1400bp.
El ADN de algunos grupos fue transformado en
levadura, y se obtuvieron de 50 a 100 placas que contenían de 200 a
500 colonias de levadura a partir de cada grupo. Se extrajeron las
colonias y se almacenaron en glicerol a -80°C.
Las células de levadura de la biblioteca se
extendieron sobre el YNB agar hasta un total de 250,000 colonias
aproximadamente. El número de colonias por placa varió de 250 a
500. Después de 3 a 5 días de crecimiento, las placas de agar
fueron distribuidas en placas de replicación en diferentes conjuntos
de placas de SC-H agar y se identificaron tres
endoglucanasas diferentes:
Un grupo de las placas de replicación contenía
AZCL-xiloglucano al 0.1% (Megazyme). Estas placas
se incubaron durante 2 a 4 días a 30°C. Se identificaron las
colonias positiivas de Endoglucanasa II y Endoglucanasa III como
las colonias rodeadas por un halo azul.
Otro grupo de placas de replicación contenía
celulosa AZCL-HE al 0.1%. Se incubaron estas placas
durante 2 a 4 días a 30°C. Se indentificaron las colonias positivas
de Endoglucanasa Ill y Endoglucanasa IV como las colonias rodeadas
por un halo azul.
Las células de las colonias de enzimas positivas
se extendieron en agar para un aislamiento individual de la
colonia, y se identificó y seleccionó una colonia individual
productora de enzima según los métodos descritos anteriormente.
Los clones positivos se obtuvieron como colonias
individuales, los insertos de ADNc fueron amplificados directamente
en la colonia de levadura utilizando cebadores poliligadores
biotinilados, purificados por un sistema de perlas magnéticas
(Dynabead M- 280, Dynal), y caracterizados individualmente mediante
una secuenciación de la extremidad 5' de cada clon de ADNc,
utilizando el método de terminación de la cadena (Sanger et al.,
1977) y el sistema Sequenasa (United States Biochemical). La
secuencia parcial de ADN del gen de la enzima obtenida tras la
selección con el AZCL-xiloglucano se muestra en la
reivindicación 2, y la secuencia parcial de ADN del gen de la
enzima obtenida por selección con AZCL-HE celulosa
se muestra en la reivindicación 6. Se obtuvo una secuencia parcial
de ADN para la Endoglucanasa III. Se descubrió que esta secuencia
expone una homología sustancial con la secuencia descrita por Ooi et
al. 1990. La Endoglucanasa III se incluye en los ejemplos que se
dan a continuación, con el objetivo de ilustrar la diferencia que
existe entre las endoglucanasas de la presente invención y las
endoglucanasa de la técnica precedente.
Se aisló el ADN en dos aislados diferentes según
el siguiente procedimiento general:
El aislado fue inoculado en 20 ml de caldo
YNB-1 en un tubo de ensayo de vidrio de 50 ml. El
tubo fue agitado durante 2 días a 30°C. Se recogieron las células
por centrifugación durante 10 minutos a 3000 rpm.
Se volvieron a suspender las células en 1 ml de
sorbitol 0.9 M, EDTA 0.1 M, pH 7.5. Se transfirió el granulado a un
tubo de Eppendorf, donde se centrifugó durante 30 segundos a gran
velocidad. Se resuspendieron las células en 0.4 ml de sorbitol 0.9
M, EDTA 0.1 M, \beta-mercaptoetanol 14 mM. Se
añadieron 100 \mul de 2 mg/ml de Zimolasa, se incubó la
suspensión a 37°C durante 30 minutos y se centrifugó durante 30
segundos. Se volvieron a suspender los granulados (esferoplastos)
en 0.4 ml de TE. Se añadieron 90 \mul de (1.5 ml de EDTA 0.5 M,
pH 8.0, 0.6 ml de Tris-Cl
\hbox{2 M}, pH
8.0, 0.6 ml de SDS al 10%), y se incubó la suspensión a 65°C
durante 30 minutos. Se añadieron 80 \mul de KOAc 5 M, se incubó
la suspensión en hielo durante al menos 60 minutos y se centrifugó
durante 15 minutos a velocidad máxima. Se transfirió el sobrenadante
a un tubo fresco que fue llenado de EtOH (a temperatura ambiente),
después se agitó exhaustivamente pero con cuidado, y se centrifugó
durante 30 segundos. El granulado fue lavado con EtOH frío al 70%,
centrifugado durante 30 segundos y secado a temperatura ambiente.
Se resuspendió el granulado en 50 \mul de TE
(Tris-EDTA) y se centrifugó durante 15 minutos. Se
transfirió el sobrenadante a un tubo fresco. Se añadieron
\hbox{2.5 \mu l} de 10 mg/ml de RNasa, después se
procedió a la incubación a 37°C durante 30 minutos y se añadieron
500 \mul de isopropanol mezclados suavemente. Se centrifugó la
mezcla durante 30 segundos y el sobrenadante fue eliminado. Se
enjuagó el granulado con EtOH frío al 96% y se secó a temperatura
ambiente. El ADN fue disuelto en 50 \mul de agua para obtener una
concentración final de aproximadamente 100\mul/ml.
Se transformó el ADN en E.coli mediante
procedimientos estándares. Se aislaron dos colonias de E.
coli y se analizaron con las enzimas de restricción Hind Ill y
Xbal las cuales realizaron el corte de los insertos de ADN.
Se determinaron las secuencias de ADN de varios
de los clones positivos. Una secuencia parcial de ADN del gen que
codifica la endoglucanasa II de la invención se muestra en la
reivindicación 2, y una secuencia parcial de ADN del gen que
codifica la endoglucanasa IV de la invención se muestra en la
reivindicación 6.
Con el objetivo de expresar una endoglucanasa
según la invención, el ADN que codifica la endoglucanasa es
digerido con Hindlll/Xbal y fraccionado en partes en gel, un
fragmento correspondiente al gen de endoglucanasa es purificado.
Posteriormente, el gen se liga al pHD414 digerido por HindIII/Xbal
obteniendo los plásmidos pAEG II y pAEG IV.
Después de la amplificación del ADN en E.
coli, los plásmidos pAEG II y pAEG IV se transforman en
Aspergillus oryzae según el método descrito
anteriormente.
Cada transformante es inoculado con FG agar en el
centro de una placa de Petri. Después de 4 días de incubación a
30°C, se sacaron los tubos de 4 mm de diámetro con la ayuda de un
sacacorchos.
Se empapó un conjunto de tubos con un gel de
sobrecapa de xiloglucano con un contenido de
AZCL-xiloglucano al 0.1% y agarosa al 1% en un
tampón con un pH apropiado, y se dejo incubar toda la noche a 30°C.
Se determinó la actividad de la endoglucanasa II y la endoglucanasa
III, respectivamente, de acuerdo con el método descrito
anteriormente. El mejor transformante presentó un halo con un
diámetro significativamente mayor que la base de A. oryzae.
Lo que demuestra la expresión eficaz de la endoglucanasa II con
A. oryzae.
Otro conjunto de tubos se empaparon en un gel de
sobrecapa de HE-celulosa que contiene
AZCL-HE al 0.1% y agarosa al 1% en un tampón de pH
apropiado, y se dejo incubar toda la noche a 30°C. Se determinó la
actividad endoglucanasa III y Endoglucanasa IV, respectivamente,
según el modo descrito anteriormente. El mejor transformante
presentaba un halo de diámetro significativamente mayor que la base
de A. oryzae. Lo que demuestra la expresión eficaz de la
endoglucanasa IV con A. oryzae.
\newpage
Posteriormente, se produjeron EG II, EG III y EG
IV, respectivamente, por medio de la fermentación alimentada del
A. oryzae que expresa las enzimas. El medio usado para la
fermentación incluye maltodextrina como fuente de carbono, urea
como fuente de nitrógeno y extracto de levadura.
Se realizó la fermentación alimentada mediante la
inoculación de el cultivo en un frasco agitado de dichas células
huésped de A. oryzae en un medio que incluye un 3.5% de la
fuente de carbono y un 0.5% de la fuente de nitrógeno.
Después de 24 horas de cultivo con un pH 5.0 y a
34°C, se inició el suministro de forma continuo de las fuentes de
nitrógeno y de carbono adicionales. mantuvo la fuente de carbono
como factor de limitación, y se aseguró oxígeno en exceso. El
cultivo alimentado se mantuvo durante 4 días, después de los cuales
se recuperaron las enzimas.
El sobrenadante del cultivo procedente de la
fermentación del Aspergillus oryzae que expresa la enzima
recombinante fue centrifugado a 5000 xg y filtrado a través de un
filtro de 0.2 \mum para eliminar los micelios. Del sobrenadante
filtrado, entre 35 y 50 ml fueron ultrafiltrados con un Filtron
Ultracette o con un dispositivo de ultrafiltración de Amicon con una
membrana de 10 kDa, con el fin de conseguir una concentración 10
veces superior. Este concentrado se diluyó 100 veces en Tris 20 mM,
pH 7.0, en dos ciclos de ultrafiltración sucesivos con el mismo
dispositivo. Dicha muestra ultrafiltrada se cargó a 2ml/min en un
intercambiador aniónico de flujo rápido Q Sepharose HR16/10
de Pharmacia equilibrado en Tris 20 mM, pH 7.0. Después de haber
aplicado la muestra, la columna fue lavada con dos volúmenes de
columna Tris 20 mM, pH 7.0, y las proteínas enlazadas fueron
eluidas con un gradiente lineal en aumento de NaCl entre NaCl 0 y
0.4 M en Tris 20 mM, pH 7.0.
La proteína es eluida con aproximadamente NaCl 50
mM. El peso molecular de la enzima se determinó aproximadamente en
35 kDa por SDS-PAGE y el punto isoeléctrico en 3.4
por IEF (isoelectroenfoque).
El sobrenadante del cultivo de la fermentación
del Aspergillus oryzae que expresa la enzima recombinante
(el nivel de expresión debería ser como mínimo de 0.5 mg de enzima
/ml de sobrenadante) fue centrifugado a
\hbox{5,000 xg}
durante 20 minutos y se filtró a través de un filtro de 0.2 \mum
para eliminar los micelios. Se ultrafiltraron entre 35 y 50 ml del
sobrenadante con un dispositivo de ultrafiltración Amicon YM03 con
una membrana de 3 kDa para obtener una concentración 10 veces
superior. Dicho concentrado fue diluido 100 veces en Tris 20 mM, pH
8.0, durante dos ciclos sucesivos de ultrafiltración con el mismo
dispositivo. Se cargó dicha muestra ultrafiltrada a 1.5 ml/min en un
intercambiador aniónico de flujo rápido Q Sepharose HR16/10 de
Pharmacia equilibrado en Tris 20 mM pH 8.0. Después de haber
aplicado la muestra, la Endoglucanasa Ill fue lavada en la columna,
mientras que las impurezas contaminadoras permanecen ligadas a la
columna. La Endoglucanasa III en este fragmento presenta una pureza
de más del 95%.
El peso molecular de la enzima se determinó en
aproximadamente 26 kDa, por SDS-PAGE, y el punto
isoeléctrico en 5.5 por IEF.
La enzima purificada se utiliza para la
caracterización. Para la EG IV se utiliza el sobrenadante de la
fermentación para la caracterización.
En la Figura 3 se pueden ver los pH óptimos de
las diferentes enzimas. La EG II tiene un pH óptimo en 3.0
aproximadamente, la EG IV en 3.5 aproximadamente.
Con respecto al pH óptimo la EG II y la EG IV,
ambas son endoglucanasas ácidas que muestran tener una actividad
óptima con un pH de 2.5 a 4.0, mientras que la EG Ill tiene un
actividad óptima con un pH de 4.0 a 6.0.
En la siguiente tabla se indica la actividad
relativa, definida como la liberación de azúcar de reducción de
las diferentes enzimas de los distintos polisacáridos comparada con
el sustrato óptimo (100%).
\newpage
| Enzima | EG II | EG III | EG IV |
| Avicell | 1% | 0% | 3% |
| CMC | 1% | 2% | 11% |
| \beta-glucano | 0% | 100% | 100% |
| xiloglucano | 100% | 31% | 0% |
A partir de estos resultados se pueden calcular
las especifidades de las diferentes endoglucanasas:
| Enzima | EG II | EG III | EG IV |
| XGU/BGU | \infty | 0.31 | 0 |
| XGU/CMC | 104 | 18 | 0 |
| XGU/AVIU | 114 | \infty | 0 |
| BGU/XGU | 0 | 3.2 | \infty |
| BGU/CMC | 0 | 58 | 9.4 |
| BGU/AVIU | 0 | \infty | 25 |
Los resultados de la especificidad de los
sustratos determinados con los sustratos AZCL se indican en la
tabla siguiente:
| Enzima | EG II | EG III | EG IV |
| HE-celulosa | 1% | 100% | 100% |
| \beta-glucano | 0% | 36% | 56% |
| Xiloglucano | 100% | 33% | 1% |
| Curdlan | 0% | 2% | 4% |
A partir de los resultados de la especificidad se
puede ver que en comparación con EG III y EG IV, la EG II resulta
extremadamente específica para el xiloglucano. La EG III es activa
hacia todo tipo de sustratos mientras que la EG IV no puede
degradar el xiloglucano y es muy específica para los
\beta-glucanos. (Existen algunas diferencias en
cuanto a los resultados obtenidos con azúcares reductores y con
sustratos AZCL. Una explicación para esto es que algunos sustratos
AZCL son más sensibles que otros. En este caso la
AZCL-HE-celulosa parece ser más
sensible que el
AZCL-\beta-glucano).
La constante Km y la actividad específica
de EG II y EG III se determinaron como se ha descrito en la sección
anterior de Materiales y Métodos. Las desviaciones estándares en
l/Vmax y Km/Vmax obtenidas por el análisis de regresión lineal
fueron utilizadas para el calculo de los intervalos de las enzimas,
como se indica claramente en la siguiente tabla:
| Enzima | Sustrato | Km | Actividad | r^2 |
| % de sustrato | específica | |||
| Unidades /mg | ||||
| EG II | xiloglucano | 0.242-0.306 | 106-119 | 0.98 |
| EG III | \beta-glucano | 0.136-0.207 | 165-186 | 0.98 |
La EG II y la EG III presentan temperaturas
óptimas similares (actividad óptima entre 30°C y 60°C), y
estabilidad de la temperatura (estable durante 1h hasta 60°C) pero
la EG III es más estable con un pH alto que la EG II.
Los cuales verifican las especifidades del
sustrato, muestran que la EG II degrada totalmente el xiloglucano en
oligomeros de aproximadamente 7 a 9 residuos, que son las conocidas
subunidades de repetición de los xiloglucanos (Fry, 1989). La EG
Ill degrada mucho menos el xiloglucano y la EG IV no lo degrada
nada. La EG Ill degrada el \beta-glucano en gran
medida en DP 3-4 y oligomeros superiores. Esto se
corresponde con el hecho de que los \beta-glucanos
se componen de unidades de glucosa 3-4
\beta-1,4 enlazadas dispuestas en fila,
interrumpidas por enlaces individuales \beta-1,3.
Estos resultados muestran que, sin tener en cuenta la homología
parcial de la secuencia de ADN, existen diferencias destacables
entre las tres endoglucanasas con respecto a la especificidad del
sustrato, así como al pH óptimo y a la estabilidad.
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Microbiological Reviews, 1991, Vol. 55, N°. 2:
303-315.
(1) INFORMACION GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Novo Nordisk A/S
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Novo Alle
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Bagsvaerd
\vskip0.333000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Dinamarca
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- CODIGO POSTAL (ZIP): DK-2880
\vskip0.333000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: +45 44448888
\vskip0.333000\baselineskip
- (H)
- FAX: +45 4449 3256
\vskip0.333000\baselineskip
- (I)
- TELEX: 37304
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TITULO DE LA INVENCION: Endoglucanasa de A. aculeatus
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 19
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- FORMA DE LECTURA INFORMÁTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Versión #1.25 (EPO)
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA ID N°: 1:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- AISLAMIENTO: individual
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Apergillus aculeatus
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: CBS 101.43
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Secuencia ID N°: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipATTCATTTGT GGACAGTGGA C
\hfill21
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA ID N°: 2:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Secuencia ID N°: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGTTGATCGCA CATTGAACCA
\hfill20
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA ID N°: 3:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Secuencia ID N°: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipACCCCAGCCG ACCGATTGTC
\hfill20
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA ID N°: 4:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Secuencia ID N°: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCTTCCTTACC TCACCATCAT
\hfill20
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA ID N°: 5:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: Secuencia ID N°: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipTTAACATCTT TTCACCATGA
\hfill20
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA ID N°: 6:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- AISLAMIENTO: individual
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Secuencia ID N°: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipAGCTTTCCCT TCTCTCCCTT
\hfill20
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA ID N°: 7:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Secuencia ID N°: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGCCACCCTGG CTTCCGCTGC CAGCCTCC
\hfill28
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA ID N°: 8:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Secuencia ID N°: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGACAGTAGCA ATCCAGCATT
\hfill20
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA ID N°: 9:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Secuencia ID N°: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipAGCATCAGCC GCTTTGTACA
\hfill20
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA ID N°: 10:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LASECUENCIA: Secuencia ID N°: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCCATGAAGTT CACCGTATTG
\hfill20
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA ID N°: 11:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Secuencia ID N°: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGCACTGCTTC TCTCCCAGGT
\hfill20
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA ID N°: 12:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Secuencia ID N°: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGTGGGCGGCC CCTCAGGCAA
\hfill20
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA ID N°: 13:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICO: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Secuencia ID N°: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipACGCTCCTCC AATTTTCTCT
\hfill20
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA ID N°: 14:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Secuencia ID N°: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGGCTTGGTAG TAATGAGTCT
\hfill20
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA ID N°: 15:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Secuencia ID N°: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGGCGCAGAGT TTGGCCAGGC
\hfill20
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA ID N°: 16:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Secuencia ID N°: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCAACATCCCC GGTGTTCTGG G
\hfill21
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA ID N°: 17:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 347 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Secuencia ID N°: 17:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA ID N°: 18:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 294 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Secuencia ID N°: 18:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA ID N°: 19:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 181 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: No
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Secuencia ID N°: 19:
Claims (20)
1. Enzima que expone actividad endoglucanasa,
dicha enzima siendo codificada por
(i) una secuencia de ADN que comprende al menos
una de las secuencias parciales siguientes:
AAAGATTCATTTGTGGACAGTGGACGTTGATCGCACATTGAACCAACC
CCAGCCGACCGATTGTCCTT
CCTTACCTCACCATCATTTAACATCTTTT CACCATGAAGCTTTCCCTTCTCTCCCTTGCCACCCTGGCTTCC
GCTGC CAGCCTCCAGCGCCGCACACTTCTGCGGTCAGTGGGATACCGCCACC GCCGGTGACTTCACCCT
GTACAACGACCTTTGGGGCGAGACGGCCGG CACCGGCTCCCAGTGCACTGGAGTCGACTCCTACAGCGG
CGACACCA TCGCTTGTCACACCAGCAGGTCCTGGTCGGAGTAGCAGCAGCGTCAA GAGCTATGCCAACG (Secuencia ID N°: 17), o
CCTTACCTCACCATCATTTAACATCTTTT CACCATGAAGCTTTCCCTTCTCTCCCTTGCCACCCTGGCTTCC
GCTGC CAGCCTCCAGCGCCGCACACTTCTGCGGTCAGTGGGATACCGCCACC GCCGGTGACTTCACCCT
GTACAACGACCTTTGGGGCGAGACGGCCGG CACCGGCTCCCAGTGCACTGGAGTCGACTCCTACAGCGG
CGACACCA TCGCTTGTCACACCAGCAGGTCCTGGTCGGAGTAGCAGCAGCGTCAA GAGCTATGCCAACG (Secuencia ID N°: 17), o
CAGCATCTCCATTGAGTAATCACGTTGGTGTTCGGTGGCCCGCCGTGT
TGCGTGGCGGAGGCTGCCG
GGAGACGGGTGGGGATGGTGGTGGGA GAGAATGTAGGGCGCCGTGTTTCAGTCCCTAGGCAGGATACC
GGAAAACCGTGTGGTAGGAGGTTTATAGGTTTCCAGGAGACGCTGTATAGGG GATAAATGAGATTGAATG
GTGGCCACACTCAAACCAACCAGGTCCTGT ACATACAATGCATATACCAATTATACCTACCAAAAAAAAA
AAAAAAAAAA AAAAAAAAA (Secuencia ID N°: 18); o
GGAGACGGGTGGGGATGGTGGTGGGA GAGAATGTAGGGCGCCGTGTTTCAGTCCCTAGGCAGGATACC
GGAAAACCGTGTGGTAGGAGGTTTATAGGTTTCCAGGAGACGCTGTATAGGG GATAAATGAGATTGAATG
GTGGCCACACTCAAACCAACCAGGTCCTGT ACATACAATGCATATACCAATTATACCTACCAAAAAAAAA
AAAAAAAAAA AAAAAAAAA (Secuencia ID N°: 18); o
(ii) una secuencia de ADN que presenta una
homología de al menos el 70% con la secuencia ID N°: 17 o con la
secuencia ID N°: 18.
2. Enzima según la reivindicación 1 codificada
por una secuencia de ADN que presenta una homología de al menos el
75%, 80%, 85%, 90%, o al menos de 95% con la secuencia ID N°: 17 o
la secuencia ID N°: 18.
3. Enzima según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 2, que tiene una actividad hacia el
xiloglucano al menos 50 veces superior a la actividad hacia la
carboximetilcelulosa, el \beta-glucano o el
Avicell, determinada basándose en la liberación de azúcares
reductores obtenidos durante la incubación de la enzima con el
sustrato en cuestión.
4. Enzima según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, que está sustancialmente desprovista de
actividad hacia el \beta-glucano y/o
sustancialmente desprovista de actividad transferasa.
5. Enzima según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, que expone una actividad de como mucho el 3%
hacia la carboximetilcelulosa y/o el Avicell.
6. Construcción de ADN que codifica una enzima
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
7. Construcción de ADN que codifica una enzima
que expone actividad endoglucanasa, dicha construcción de ADN
comprende
(i) una secuencia de ADN que comprende al menos
de una de las secuencias parciales siguientes:
AAAGATTCATTTGTGGACAGTGGACGTTGATCGCACATTGAACCAACC
CCAGCCGACCGATTGTCCTT
CCTTACCTCACCATCATTTAACATCTTTT CACCATGAAGCTTTCCCTTCTCTCCCTTGCCACCCTGGCTTCC
GCTGC CAGCCTCCAGCGCCGCACACTTCTGCGGTCAGTGGGATACCGCCACC GCCGGTGACTTCACCCT
GTACAACGACCTTTGGGGCGAGACGGCCGG CACCGGCTCCCAGTGCACTGGAGTCGACTCCTACAGCGG
CGACACCA TCGCTTGTCACACCAGCAGGTCCTGGTCGGAGTAGCAGCAGCGTCAA GAGCTATGCCAACG (Secuencia ID N°: 17), o
CCTTACCTCACCATCATTTAACATCTTTT CACCATGAAGCTTTCCCTTCTCTCCCTTGCCACCCTGGCTTCC
GCTGC CAGCCTCCAGCGCCGCACACTTCTGCGGTCAGTGGGATACCGCCACC GCCGGTGACTTCACCCT
GTACAACGACCTTTGGGGCGAGACGGCCGG CACCGGCTCCCAGTGCACTGGAGTCGACTCCTACAGCGG
CGACACCA TCGCTTGTCACACCAGCAGGTCCTGGTCGGAGTAGCAGCAGCGTCAA GAGCTATGCCAACG (Secuencia ID N°: 17), o
CAGCATCTCCATTGAGTAATCACGTTGGTGTTCGGTGGCCCGCCGTGT
TGCGTGGCGGAGGCTGCCG
GGAGACGGGTGGGGATGGTGGTGGGA GAGAATGTAGGGCGCCGTGTTTCAGTCCCTAGGCAGGATACCG
GAAA ACCGTGTGGTAGGAGGTTTATAGGTTTCCAGGAGACGCTGTATAGGG GATAAATGAGATTGAATGG
TGGCCACACTCAAACCAACCAGGTCCTGT ACATACAATGCATATACCAATTATACCTACCAAAAAAAAAA
AAAAAAAAA AAAAAAAAA (Secuencia ID N°: 18); o
GGAGACGGGTGGGGATGGTGGTGGGA GAGAATGTAGGGCGCCGTGTTTCAGTCCCTAGGCAGGATACCG
GAAA ACCGTGTGGTAGGAGGTTTATAGGTTTCCAGGAGACGCTGTATAGGG GATAAATGAGATTGAATGG
TGGCCACACTCAAACCAACCAGGTCCTGT ACATACAATGCATATACCAATTATACCTACCAAAAAAAAAA
AAAAAAAAA AAAAAAAAA (Secuencia ID N°: 18); o
(ii) una secuencia de ADN que presenta una
homología de al menos el 70% con la secuencia ID N°: 17 o la
secuencia ID N°: 18.
8. Construcción de ADN según la reivindicación 7
que codifica una enzima que expone actividad endoglucanasa, dicha
construcción de ADN consta de una secuencia de ADN que es homologa
en al menos el 75%, 80%, 85%, 90%, o al menos el 95% con la
secuencia ID N°: 17, o la secuencia ID N°: 18.
9. Vector de expresión recombinante que comprende
una construcción de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 6
a 8.
\newpage
10. Célula que incluye un vector de expresión
recombinante según la reivindicación 9.
11. Método de producción de una enzima que expone
actividad endoglucanasa, el método incluye el cultivo de una célula
según la reivindicación 10 en condiciones que permiten la
producción de la enzima, y la recuperación de la enzima a partir de
este cultivo.
12. Preparación enzimática útil para la
degradación de componentes de la pared celular vegetal, dicha
preparación estando enriquecida con una enzima que expone actividad
endoglucanasa según cualquiera de las reivindicaciones 1
\hbox{a 5.} 13. Preparación según la reivindicación 12, que
incluye adicionalmente una galactanasa, xilanasa, arabinanasa,
pectina acetilesterasa, poligalacturonasa, ramnogalacturonasa,
pectina liasa, pectato liasa, endoglucanasa o pectina
metilesterasa.
14. Uso de la enzima según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, o de una preparación enzimática según
cualquiera de las reivindicaciones 12 a 13, como agente de
degradación o modificación de celulosas.
15. Uso según la reivindicación 14 como agente de
degradación o de modificación de las paredes celulares
vegetales.
16. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
14 o 15, para la preparación de vinos o zumos, para la purificación
de la pectina, para procesos de fabricación o de preparación de
alimentos.
17. Uso según la reivindicación 14 en
textiles.
18. Uso según la reivindicación 17 como agente
para la eliminación del xiloglucano en las fibras vegetales, o como
agente para el tratamiento o la suavización de los tejidos.
19. Uso según la reivindicación 14 en la
industria papelera.
20. Uso según la reivindicación 19 para mejorar
del drenaje de la pulpa de papel.
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