DE69530568T2

DE69530568T2 - Arabinoxylan abbauende enzymen

Info

Publication number: DE69530568T2
Application number: DE69530568T
Authority: DE
Inventors: Josina Monique VAN DER WOUW; Johannes Albert VAN OOIJEN; Matheus Marcus GIELKENS; Hendrik Leendert DE GRAAFF; Jacob Visser
Original assignee: DSM NV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 1994-08-26
Filing date: 1995-08-28
Publication date: 2004-03-25
Anticipated expiration: 2015-08-29
Also published as: EP0730653B1; HUT74960A; ES2204963T3; CN101525605A; WO1996006935A3; CZ120596A3; BG100548A; US5849559A; MX9601430A; FI961622A; BR9506332A; CN1134727A; CN100415889C; NO961663L; AU692595B2; SI9520013A; NZ292163A; DE69530568D1; NO961663D0; IS4338A

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Molekularbiologie. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Klonierung und Expression von Genen, die für Polypeptide kodieren, die eine Arabinoxylan abbauende Aktivität zeigen. Diese Enzyme eignen sich für gewerbliche Verfahren, z. B. zum Backen von Brot, für die Papier- und Zellstoffbearbeitung und bei der Herstellung von Futter- und Nahrungsmitteln (Additiven).
Hintergrund der Erfindung
Die Zusammensetzung einer Pflanzenzellwand ist komplex und variabel. Polysaccharide finden sich vorwiegend in Form von langen Ketten von Cellulose (Hauptstrukturkomponente der Pflanzenzellwand), Hämicellulose (mit einem Gehalt an verschiedenen β-Xylanketten) und Pektin. Das Auftreten, die Verteilung und strukturelle Merkmale der Pflanzenzellwand-Polysaccharide werden durch folgende Faktoren bestimmt: (1) Pflanzenspezies; (2) Varietät; (3) Gewebetyp; (4) Wachstumsbedingungen; (5) Alterung; und (6) Verarbeitung des Pflanzenmaterials vor der Fütterung.
Grundlegende Unterschiede bestehen zwischen Monokotyledonen (z. B. Cerealien und Gräser) und Dikotyledonen (z. B. Klee, Raps und Sojabohne) sowie zwischen den Samen und vegetativen Teilen der Pflanze (Chesson, 1987; Carré und Brillouet, 1986).
Monokotyledone sind durch die Anwesenheit eines Arabinoxylan-Komplexes als Haupt-Hämicellulosegerüst gekennzeichnet. Die Hauptstruktur von Hämicellulose in Dikotyledonen besteht aus einem Xyloglucan-Komplex. Außerdem treten höhere Pektinkonzentrationen in Dikotyledonen im Vergleich zu Monokotyledonen auf. Samen weisen im allgemeinen einen sehr hohen Pektingehalt, jedoch einen relativ niederen Cellulosegehalt auf.
In der Zellwand lassen sich drei mehr oder weniger in Wechselwirkung tretende Polysaccharidstrukturen unterscheiden:

(1) Die mittlere Lamelle bildet die äußere Zellwand. Sie dient auch als Haftstelle für die einzelnen Zellen aneinander innerhalb der Pflanzengewebematrix, wobei die mittlere Lamelle vorwiegend aus Calciumsalz von hochgradig veresterten Pektinen besteht.
(2) Die primäre Wand befindet sich unmittelbar innerhalb der mittleren Lamelle. Sie weist eine gut organisierte Struktur von Cellulose-Mikrofibrillen auf, die in eine amorphe Matrix aus Pektin, Hämicellulose, Phenolestern und Proteinen eingebettet sind.
(3) Die sekundäre Wand bildet sich beim Reifen der Pflanze. Während des Wachstums und der Alterungsphase der Pflanze werden Cellulose-Mikrofibrillen, Hämicellulose und Lignin abgeschieden.

Die primäre Zellwand von reifen, metabolisch aktiven Pflanzenzellen (z. B. Mesophyll und Epidermis) sind gegenüber einer enzymatischen Hydrolyse empfindlicher als die sekundäre Zellwand, die in diesem Stadium hochgradig verholzt ist.
In der Zellwand gibt es eine starke Wechselwirkung zwischen Cellulose, Hämicellulose und Pektin. Der enzymatische Abbau dieser relativ intensiv vernetzten Polysaccharidstrukturen stellt, keinen einfachen Vorgang dar. Beispielsweise sind mindestens fünf verschiedene Enzyme erforderlich, um ein Arabinoxylan vollständig abzubauen. Die Endospaltung wird durch Verwendung einer Endo-β(1→4)-D-xylanase bewirkt. Exo-(1→4)-D-xylanase setzt Xyloseeinheiten am nicht-reduzierenden Ende des Polysaccharids frei. Drei weitere Enzyme (α-Glucuronidase, α-L-Arabinofuranosidase und Acetylesterase) werden zum Angriff von Substituenten am Xylangerüst verwendet. Die Wahl der speziellen Enzyme ist selbstverständlich von der abzubauenden speziellen Hämicellulose abhängig (McCleary und Matheson, 1986).
Enzyme, die Seitenketten des Xylangerüstes angreifen, können von Interesse sein, da sie die Eigenschaften des Polymeren verändern und es für bestimmte Anwendungen geeigneter machen. Ferner können diese Enzyme synergistisch mit Endoxylanasen, die Hauptketten spalten, zusammenwirken (bezüglich einer ausführlichen Übersicht wird auf Kormelink, 1992, Doktorarbeit, Universität Wageningen, verwiesen).
Ein DNA-Fragment, das für eine Arabinoxylan abbauende Aktivität kodiert, ist bekannt. In EP-A-463 706 wird die Isolierung, Charakterisierung und Genklonierung einer Endoxylanase aus Aspergillus tubigensis beschrieben. Dieses Enzym ist nicht zum Angriff auf Seitenketten des Arabinoxylangerüstes befähigt.
Enzymatische Aktivitäten, die zum Angriff auf Seitenketten befähigt sind, sind auch aus Aspergillus niger bekannt (Kormelink, 1992, a. a. O., Kapitel 6 und 7). Ein Enzym mit der Bezeichnung Arabinofuranosidase A (ArafurA) ist durch die Fähigkeit charakterisiert, Arabinosereste aus Oligosaccharidstrukturen, die aus Arabinoxylanen erhalten worden sind, freizusetzen. Jedoch ist ArafurA nicht bei Substraten von hohem Molekulargewicht aktiv. Ferner bildet Aspergillus niger ein Enzym mit der Bezeichnung ArafurB, das auf Oligosaccharidstrukturen sowie auf hochmolekulare Arabinoxylanstrukturen einwirkt. Die enzymatische Wirkung von ArafurB ist auf die Freisetzung von Arabinoseresten aus terminalen, einfach substituierten Xyloseresten beschränkt. Bisher sind keine DNA-Fragmente bekannt.
Eine Aktivität, die zur Freisetzung von Arabinoseresten aus nicht-terminalen, einfach substituierten Xyloseresten sowohl in Oligosaccharidstrukturen als auch in hochmolekularen Arabinoxylanstrukturen befähigt ist, wurde aus Aspergillus awamori isoliert. Dieses Enzym weist die Bezeichnung Arabinoxylanarabinofuranose-hydrolase (AXH) auf. Bisher stehen keine DNA-Fragmente und/oder Sequenzdaten zur Verfügung. Es ist ersichtlich, dass bisher nicht alle Enzyme, die beim Abbau von Arabinoxylan beteiligt sind, nachgewiesen worden sind (Kormelink 1990). Beispielsweise wurden bisher keine Enzyme gefunden, die Xylosemoleküle, die 2-fach mit Arabinose substituiert sind, angreifen. Der Grund hierfür ist, dass diese Enzyme häufig in geringen Mengen sezerniert werden. Eine molekulare Klonierung und Überproduktion dieser Enzyme in einem geeigneten Wirt ist zwar nicht einfach, stellt aber einen Weg zu ausreichenden Mengen von reinen Enzymen dar, was es wiederum ermöglicht, die Bedeutung der Enzyme bei verschiedenen Anwendungsmöglichkeiten zu ermitteln.
Die vorliegende Erfindung strebt die Überwindung der vorerwähnten Unzulänglichkeiten des Stands der Technik an, indem eine rekombinante DNA bereitgestellt wird, die für ein Polypeptid mit Arabinoxylan-Abbauaktivität kodiert. Das Polypeptid weist (1,4)-β-D-Arabinoxylan-arabinofurano-hydrolase-Aktivität auf, besitzt eine Aktivität zur Freisetzung von Arabinose, zeigt keine α-Arabinofuranosidase-Aktivität und keine Endoxylanase-Aktivität und stellt keine Arabinase dar.
Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Erfindungsgemäß wird eine rekombinante DNA bereitgestellt, die folgendes umfasst: eine Nucleotidsequenz, die für ein Polypeptid, das (1,4)-β-D-Arabinoxylan-arabinofuranohydrolase-Aktivität aufweist, das aber keine Endoxylanase- und keine α-Arabinofuranosidase-Aktivität aufweist, oder für einen Polypeptid-Vorläufer davon kodiert, dadurch gekennzeichnet, dass die Nucleotidsequenz ausgewählt ist aus:

(a) einer Nucleotidsequenz, die für ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz gemäß den Aminosäuren 1 bis 306 oder einen Polypeptidvorläufer dieses Polypeptids gemäß den Aminosäuren –27 bis 306 in SEQ ID NO: 5 kodiert;
(b) einer Nucleotidsequenz, die für ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz gemäß den Aminosäuren 1 bis 306 oder einen Polypeptidvorläufer dieses Polypeptids gemäß den Aminosäuren –27 bis 306 in SEQ ID NO: 7 kodiert;
(c) einer Nucleotidsequenz gemäß den Nucleotiden 784 bis 1779 in SEQ ID NO: 5 oder gemäß den Nucleotiden 823 bis 1818 in SEQ ID NO: 7;
(d) einer Nucleotidsequenz, die für ein Polypeptid, das (1,4)-β-D-Arabinoxylan-arabinofuranohydrolase-Aktivität aufweist, aber keine Endoxylanase- und keine α-Arabinofuranosidase-Aktivität aufweist, kodiert, wobei die Nucleotidsequenz zur Hybridisierung mit einem DNA-Fragment gemäß den Nucleotiden 784 bis 1779 in SEQ ID NO: 5 oder gemäß den Nucleotiden 823 bis 1818 in SEQ ID NO: 7 unter Hybridisierungsbedingungen befähigt ist, die einen ersten Waschvorgang bei 65°C für 30 Minuten in 5 X SSC/0,1% SDS, einen anschließenden zweiten Waschvorgang bei 65°C für 30 Minuten in 0,1 X SSC/0,1% SDS, einen anschließenden dritten Waschvorgang bei 65°C für 30 Minuten in 0,1 X SSC/0,1% SDS und einen anschließenden vierten Waschvorgang bei 65°C für 30 Minuten in 0,1 X SSC umfassen.

Die erfindungsgemäße rekombinante DNA ist vorzugsweise aus einem filamentösen Pilz und insbesondere aus einer Aspergillus-Spezies erhältlich. Besonders bevorzugte rekombinante DNA-Sequenzen umfassen DNA-Fragmente, die für AXDA aus Aspergillus niger oder tubigensis kodieren.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfasst die erfindungsgemäße rekombinante DNA 5'- und 3'-regulatorische DNA-Sequenzen, die für die Expression des DNA-Fragments in einer prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszelle benötigt werden, wenn es in einer derartigen Zelle vorliegt. Die regulatorischen DNA-Sequenzen sind vorzugsweise in Bezug auf die Polypeptid-Kodierungssequenz dieses DNA-Fragments heterolog. Insbesondere werden diese regulatorischen DNA-Sequenzen so gewählt, dass sie die Expression des DNA-Fragments in einem Wirt verstärken, verglichen mit der Expression des DNA-Fragments in diesem Wirt bei Verknüpfung mit dessen homologen regulatorischen DNA-Sequenzen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform liegt diese rekombinante DNA in Form eines Vektors vor.
Die Erfindung betrifft ferner eine transformierte eukaryontische oder prokaryontische Wirtszelle, die die erfindungsgemäße rekombinante DNA umfasst, vorzugsweise der Gattung Aspergillus, sowie ein Verfahren zur Gewinnung einer Wirtszelle, die zu einer verstärkten Expression eines Arabinoxylan abbauenden Enzyms befähigt ist, indem man eine Wirtszelle unter transformierenden Bedingungen mit einer erfindungsgemäßen rekombinanten DNA behandelt und eine Selektion in Bezug auf die verstärkte Expression des Arabinoxylan abbauenden Enzyms vornimmt.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Gewinnung eines Arabinoxylan abbauenden Enzyms, das folgende Stufen umfasst: Züchten von Wirtszellen, die zur Erzeugung des Enzyms unter Bedingungen, die zu dessen Bildung führen, befähigt sind, und Gewinnen des Enzyms, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirtszellen oder deren Vorfahren mit einer erfindungsgemäßen rekombinanten DNA transformiert worden sind.
Ferner werden Verfahren zur Verwendung eines erfindungsgemäßen Polypeptids zur Unterstützung des Abbaus von Arabinoxylan als Futtermittel- oder Nahrungsmitteladditiv, bei der Papier- und Zellstoffverarbeitung und beim Backen von Brot bereitgestellt.
Ferner werden Futter- und Nahrungsmittel, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid enthalten, beansprucht.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird folgendes bereitgestellt: rekombinante DNA, die ein DNA-Fragment, das durch die Nucleotide 1 bis 783 von SEQ ID NO: 5 dargestellt ist oder ein Unterfragment davon, das zur regulierenden Expression einer damit verbundenen DNA-Sequenz befähigt ist, umfasst, sowie eine rekombinante DNA, die ein DNA-Fragment, das durch die Nucleotide 1 bis 822 von SEQ ID NO: 7 dargestellt ist, oder ein Unterfragment davon, das zur regulierenden Expression einer damit verbundenen DNA-Sequenz befähigt ist, umfasst.
Nachstehend wird die Erfindung unter Bezugnahme auf die Figuren beschrieben.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt ein Elutionsprofil (OD280) einer Arabinoxylan abbauenden Aktivität bei HPLC.
2 ist ein Diagramm zur Darstellung der Aktivität von AXDA auf die wasserunlösliche Feststofffraktion (WIS) von Mais als Funktion des pH-Wertes.
3 zeigt den prozentualen in vitro-Verdau von Mais-WIS als Funktion der Menge an rohem AXDA-Enzym.
4 zeigt eine Karte der Restriktionsstellen in pIM3001.
5 zeigt eine Karte der Restriktionsstellen in pIM3002.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt gereinigte und isolierte DNA-Moleküle bereit, die die Sequenz von Arabinoxylan abbauenden Enzymgenen und genetischen Varianten davon umfassen. Die DNA-Moleküle können die Region, die für das Arabinoxylan abbauende Enzym kodiert, sowie die benachbarten 5'- und 3'-regulatorischen Regionen umfassen. Genetische Varianten umfassen DNA-Moleküle, die für mutante Arabinoxylanproteine und degenerierte DNA-Moleküle kodieren, wobei die gewünschte Aktivität des daraus exprimierten Enzyms erhalten bleibt.
Die vorliegende Erfindung stellt auch DNA-Konstrukte für die Expression von Arabinoxylan abbauenden Enzymen in einem gewünschten Expressionswirt bereit. Diese Expressionskonstrukte umfassen hybride DNA-Moleküle, die Kodierungsregionen für Arabinoxylan abbauende Enzyme in funktioneller Verknüpfung mit regulatorischen Regionen, wie Promotor-, Sekretions- und Terminationssignalen, die von homologen oder heterologen Organismen stammen, enthalten, wobei diese regulatorischen Regionen dazu befähigt sind, die verstärkte Expression des Enzyms in einem geeigneten Wirt zu dirigieren, d. h. des Enzyms, das durch das DNA-Molekül kodiert wird, das für das Arabinoxylan abbauende Enzym kodiert. Vorzugsweise ist das Expressionskonstrukt in das Genom des ausgewählten Expressionswirts integriert.
Erfindungsgemäß werden ferner Vektoren, vorzugsweise Plasmide, für die Klonierung und/oder Transformation von mikrobiellen Wirten durch Einführen der DNA-Konstrukte für die Expression der Arabinoxylan abbauenden Enzyme in den mikrobiellen Wirt bereitgestellt.
Ferner stellt die vorliegende Erfindung homologe oder heterologe Wirte bereit, die mit Vektoren transformiert sind, die die vorstehend beschriebenen DNA-Konstrukte enthalten. Heterologe Wirte können unter Bakterien, Hefen oder Pilzen ausgewählt sein.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist der Ausdruck "homolog" so zu verstehen, dass er alles, was für das DNA-Molekül, das für das Arabinoxylan abbauende Enzym von Interesse nativ ist, umfasst, einschließlich dessen regulatorische Regionen. Ein homologer Wirt ist als die Spezies definiert, aus der derartige DNA-Moleküle isoliert werden können.
Der Ausdruck "heterolog" bezeichnet somit alles, was für das DNA-Molekül, das für das Arabinoxylan abbauende Enzym von Interesse selbst kodiert, nicht nativ ist, einschließlich der regulatorischen Regionen. Ein "heterologer" Wirt ist als eine beliebige mikrobielle Spezies definiert, die sich von der Spezies unterscheidet, aus der die Gene, die für das Arabinoxylan abbauende Enzym kodieren, isoliert worden sind.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist der Ausdruck "verstärkte Expression des Arabinoxylan abbauenden Enzyms von Interesse" als die Expression des Arabinoxylan abbauenden Enzyms von Interesse in Konzentrationen zu verstehen, die oberhalb der Konzentrationen liegen, die üblicherweise im homologen Wildtyporganismus auftreten. Diesbezüglich bezeichnet die verstärkte Expression auch die Expression der Arabinoxylan abbauenden Enzyme von Interesse in einem heterologen Organismus, der normalerweise derartige, Arabinoxylan abbauende Enzyme nicht bildet, ausgenommen bei Einführung des DNA-Moleküls oder des Expressionskonstrukts, die für die Arabinoxylan abbauenden Enzyme von Interesse kodieren, in den heterologen Expressionswirt. Nachkommen dieser Expressionswirte fallen selbstverständlich ebenfalls unter die vorliegende Erfindung.
Die vorliegende Erfindung umfasst ferner DNA-Sequenzen, die mit den DNA-Sequenzen hybridisieren, die aus den vorstehend beschriebenen Pilzen erhältlich sind, die sich aber in der Kodierungssequenz aufgrund einer Degeneration eines genetischen Codes oder einer Überkreuz-Speziesvariation unterscheiden. Somit umfasst die Erfindung die DNA-Fragmente, die für Arabinoxylan abbauende Enzyme kodieren, die aus anderen Spezies als Aspergillus erhältlich sind. Typischerweise beinhalten Verfahren zur Gewinnung von ähnlichen DNA-Fragmenten das Screening von Bakterien- oder Bakteriophagen-Plaques, die mit rekombinanten Plasmiden mit einem Gehalt an DNA-Fragmenten aus einem Organismus, von dem die Erzeugung eines erfindungsgemäßen Arabinoxylan abbauenden Enzyms bekannt ist oder erwartet wird, transformiert sind.
Nach einer in situ-Replikation der DNA wird die DNA aus den Zellen oder Plaques freigesetzt und an Filtern (im allgemeinen Nitrocellulose) immobilisiert. Die Filter können sodann einem Screening auf komplementäre DNA-Fragmente unter Verwendung einer markierten Nucleinsäuresonde auf der Basis von beliebigen Sequenzen, die für die Aspergillus-axdA-Gene bestimmt worden sind, unterzogen werden. In Abhängigkeit davon, ob der dem Screening zu unterwerfende Organismus entfernt oder nahe verwandt ist, sollten die Hybridisierungs- und Waschbedingungen angepasst werden, um echte positive Organismen herauszugreifen und die Menge an falschen positiven Organismen zu verringern. Ein typisches Verfahren für die Hybridisierung von an Filter immobilisierter DNA wird in Kapitel 5, Tabelle 3, S. 120 und 121, in "Nucleic acid hybridisation - a practical approach, Hrsg. B. D. Hames & S. J. Higgins, (1985), IRL Press, Oxford) beschrieben. Obgleich die optimalen Bedingungen üblicherweise empirisch festgelegt werden, können einige wertvolle überschlägige Regeln für eng und weniger eng verwandte Sequenzen gegeben werden.
Um DNA-Fragmente zu identifizieren, die mit der Sonde eng verwandt sind, wird die Hybridisierung gemäß Tabelle 3 von Hames & Higgins (a. a. O.) (die wesentlichen Merkmale hiervon sind nachstehend angegeben) mit einer endgültigen Waschstufe von hoher Stringenz in 0,1 * SET-Puffer (20 × SET = 3 M NaCl, 20 mM EDTA, 0,4 M Tris-HCl, pH-Wert 7,8), 0,1% SDS) bei 68°C durchgeführt.
Um Sequenzen mit begrenzter Homologie zur Sonde zu identifizieren, geht man wie in Tabelle 3 von Hames & Higgins (a. a. O.) vor, wendet jedoch eine verringerte Hybridisierungs- und Waschtemperatur an. Ein endgültiger Waschvorgang mit 2 * SET-Puffer beispielsweise bei 50°C sollte die Identifizierung von Sequenzen mit einer Homologie von etwa 75% ermöglichen. Wie der Fachmann weiß, hängen die genaue Beziehung zwischen Homologie und Hybridisierungsbedingungen von der Länge der Sonde, der Basenzusammensetzung (% G + C) und der Verteilung der Fehlpaarungen ab. Eine willkürliche Verteilung bewirkt eine stärkere Verringerung von T_m als ein nicht-willkürliches oder clusterförmiges Muster von Fehlpaarungen.
Die vorstehenden Bedingungen gelten für Sonden mit einer Länge von mindestens 300 bp, vorzugsweise von mindestens 500 bp und insbesondere von etwa 1 kbp und einen GC-Gehalt der der Sondenbehandlung zu unterwerfenden DNA von etwa 50 ± 10%. Wenn der GC-Gehalt eines gegebenen Organismus bekannt ist, können die Bedingungen empirisch optimiert werden, indem man die folgende Gleichung berücksichtigt (bei 1 M NaCl innerhalb des Bereiches 35% s (% G + C) ≤ 75%): T_m = 81,5°C + 0,41 * (% G + C). Grob gesprochen, bedeutet dies, dass bei einem GC-Gehalt (% G + C) von 10% über dem Mittelwert (stringente) Hybridisierungsbedingungen eingestellt werden können, indem man die Hybridisierungs- und Waschtemperatur um etwa 4°C erhöht.
Für die vorliegende Beschreibung ist ein DNA-Fragment, das mit einem erfindungsgemäßen DNA-Fragment hybridisiert, so definiert, dass es ein positives Signal an immobilisierter DNA nach Hybridisierung mit einer Sonde von mindestens 300 bp, vorzugsweise 500 bp und insbesondere 1 kbp mindestens einer der in SEQ ID NO: 5 oder 7 dargestellten Sequenzen. ergibt, wobei der Waschvorgang dem Verfahren von Tabelle 3 in Kapitel 5 von Hames & Higgins (wie nachstehend im wesentlichen wiedergegeben) bei einer Temperatur von 50°C, 2 * SET-Puffer (d. h. 0,3 M NaCl), durchgeführt wird.
Nachstehend sind die wesentlichen Merkmale des in Tabelle 3, Kapitel 5, von Hames & Higgins beschriebenen Verfahrens wiedergegeben:

(1) Vorhybridisierung der Filter in Abwesenheit der Sonde.
(2) Hybridisierung bei einer Temperatur zwischen 50 und 68°C im Bereich von 0,1 bis 4 * SET-Puffer (abhängig von der Stringenz), 10 * Denhardt-Lösung (100 * Denhardt-Lösung enthält 2% Rinderserumalbumin, 2% Ficoll, 2% Polyvinylpyrrolidon), 0,1% SDS, 0,1% Natriumpyrophosphat, 50 μg/ml Lachssperma-DNA (aus einem Vorrat, der durch Lösen von 1 mg/ml Lachssperma-DNA, Ultraschallbehandlung auf eine Länge von 200 bis 500 bp, 20-minütiges Stehenlassen in einem Wasserbad und Verdünnung mit Wasser auf eine Endkonzentration von 1 mg/ml). Die Hybridisierungszeit ist nicht zu kritisch und kann im Bereich von 1 bis 24 Stunden liegen und vorzugsweise etwa 16 Stunden betragen (o/n). Die Sonde wird typischerweise durch Nick-Translation unter Verwendung von ³²P als radioaktiver Markierung in einer spezifischen Aktivität von 5 * 10⁷ bis 5 * 10⁸ cpm/μg markiert.
(3) (Wiederholtes) Waschen des Filters mit 3 * SET, 0,1% SDS, 0,1% Natriumpyrophosphat bei einer Temperatur von 50 bis 68°C (abhängig von der angestrebten Stringenz), wiederholtes Waschen unter Senken der SET-Konzentration auf 0,1%, 20-minütiges Waschen in 4 * SET bei Raumtemperatur, Trocknen der Filter auf 3MM-Papier, Auflegen der Filter auf Röntgenfilm in einer Kassette bei –70°C für 1 bis 96 Stunden (abhängig von der Signalstärke) und Entwickeln des Films.

Im allgemeinen sollten die Volumina der Vorhybridisierungs- und Hybridisierungsgemische auf einem Minimum gehalten werden. Sämtliche "nassen" Stufen können in kleinen verschlossenen Beuteln in einem vorerwärmten Wasserbad durchgeführt werden.
Das vorstehende Verfahren dient zur Definition der DNA-Fragmente, die erfindungsgemäß hybridisieren. Offensichtlich kann das Verfahren zahlreichen Modifikationen unterzogen werden, um erfindungsgemäße DNA-Fragmente zu identifizieren und zu isolieren. Es ist darauf hinzuweisen, dass die auf diese Weise erhaltenen DNA-Fragmente immer dann unter die Ansprüche fallen, wenn sie bei Einhaltung des vorstehenden Verfahrens nachgewiesen werden können, unabhängig davon, ob sie mit diesem Verfahren identifiziert und/oder isoliert worden sind.
Es wurden zahlreiche Verfahren, die in geeigneter Weise zur Identifizierung und Isolierung der erfindungsgemäßen DNA-Fragmente verwendet werden können, in der Literatur und in Handbüchern, einschließlich das vorerwähnte Werk von Hames & Higgins (a. a. O.), beschrieben.
Das vorstehende Verfahren gilt für Polynucleotidsonden. Bei Verwendung von Oligonucleotidsonden wird die Beziehung zwischen T_d (Temperatur, bei der ein perfekt passendes Hybrid zur Hälfte dissoziiert ist) entsprechend folgender Beziehung abgeschätzt: T_d = 4°C pro GC-Basenpaar + 2°C pro AT-Basenpaar. Auf der Basis vorhandener Verfahrensweisen und unter Anwendung dieser überschlagsmäßigen Regel können ferner Oligonucleotidsonden zur wirksamen Isolierung von DNA-Fragmenten, die für erfindungsgemäße Arabinoxylan abbauende Enzyme kodieren, aus verwandten und weiter entfernten Organismen konzipiert werden. Das Verfahren unter Verwendung von Oligonucleotiden eignet sich insbesondere, wenn ein Enzym aus einer unterschiedlichen Quelle gereinigt und ein Teil der Aminosäuresequenz bestimmt worden ist. Unter Verwendung dieser Sequenz kann ein Satz von degenerierten Sonden zum Screening einer DNA-Bibliothek oder zum Southern-Blot (im wesentlichen gemäß den vorstehenden Angaben) hergestellt werden.
Gut geeignete Screening-Kandidaten sind weitere filamentöse Pilze, wie Trichoderma, Penicillium, Dichotomitus, Squalus und Disporotrichum dimorphosporum, und Bakterien, wie Bacillus-Spezies und dergl. Wenn das anfängliche Screening zu Klonen führt, die anscheinend hybridisierende Fragmente enthalten, können derartige Fragmente isoliert und gegebenenfalls zur Bestimmung von Sequenzähnlichkeiten sequenziert werden.
Nachdem ein Arabinoxylan abbauendes Enzym von Interesse identifiziert worden ist, kann die DNA-Sequenz, die für ein derartiges Enzym kodiert, aus dem filamentösen Pilz, der natürlicherweise dieses Enzym bildet, erhalten werden, indem man den Pilz in einem Arabinoxylan enthaltenden Medium züchtet, das erwünschte Arabinoxylan abbauende Enzym unter Anwendung bekannter Verfahren, wie sie z. B. in Beispiel 1 aufgeführt sind, isoliert und mindestens einen Teil der Aminosäuresequenz des gereinigten Proteins bestimmt.
DNA-Sonden lassen sich anschließend erhalten, indem man Oligonucleotidsequenzen auf der Basis der abgeleiteten partiellen Aminosäuresequenz konstruiert. Aminosäuresequenzen können vom N-Terminus des vollständigen Proteins und/oder von den N-Termini von internen Peptidfragmenten, die durch proteolytischen oder chemischen Verdau des vollständigen Proteins erhalten worden sind, bestimmt werden. Die erhaltenen DNA-Sonden werden sodann zum Absuchen eines Genoms oder einer cDNA-Bibliothek verwendet.
Eine Genombibliothek lässt sich durch partiellen Verdau der fungalen chromosomalen DNA mit einem Restriktionsenzym, das eine DNA-Sequenz von vier aufeinanderfolgenden Nucleotiden erkennt, z. B. Sau3A, und Klonieren der erhaltenen Fragmente in ein geeignetes Plasmid oder λ-Phagenvektor, wie λ-GEM-11, herstellen.
Alternativ lässt sich eine cDNA-Bibliothek herstellen, indem man cDNA (synthetisiert aus mRNA, die aus Pilzzellen nach Induktion zur Synthese eines Arabinoxylan abbauenden Enzyms isoliert worden ist) in einen geeigneten Phagenvektor, z. B. λ-gt10 kloniert.
Anschließend nach Ausstreichen einer ausreichenden Anzahl an Kolonien oder Plaques kann die genomische oder cDNA-Bibliothek mit einer geeigneten DNA-Sonde abgesucht werden.
Wenn dieses Verfahren erfolglos ist, kann die genomische oder cDNA-Bibliothek einem differentiellen Screening mit cDNA-Sonden, die aus mRNA von nicht-induzierten und induzierten Zellen erhalten worden sind, unterzogen werden. Induzierte mRNA wird aus Zellen hergestellt, die auf Medien mit einem Gehalt an Arabinoxylan als Kohlenstoffquelle gezüchtet worden sind, während nicht-induzierte mRNA aus Zellen isoliert werden muss, die auf einer von Arabinoxylan abweichenden Kohlenstoffquelle, z. B. Glucose, gezüchtet worden sind. Unter den Klonen, die nur mit der induzierten cDNA-Sonde hybridisieren, kann ein Klon, der das gewünschte Gen, das für ein Arabinoxylan abbauendes Enzym kodiert, gewonnen werden. Alternativ kann ein Gen für ein Arabinoxylan abbauendes Enzym durch Kreuzhybridisierung mit einer verwandten Sequenz identifiziert werden. [0046] Vorzugsweise werden Oligonucleotidsonden aus der N-terminalen Aminosäuresequenz (vergl. Beispiel 1.5.1) eines Arabinoxylan abbauenden Enzyms mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 32 kDa, das aus einem Aspergillus niger-Kulturfiltrat und/oder aus der Aminosäuresequenz eines internen Peptidfragments (vergl. Beispiel 1.5.2) das durch Verdau des Enzyms mit CNBr gewonnen worden ist, erhalten.
Die entwickelten Oligonucleotidgemische können zur Hybridisierung sowohl mit genomischen als auch mit cDNA-Bibliotheken verwendet werden (alternativ und wie hier erläutert). Das gereinigte AXDA-Enzym wird zur Entwicklung von Antikörpern verwendet. Die Antikörper werden beim Immunoscreening von Expressionsbibliotheken eingesetzt. Somit werden AXDA-Expressionsklone identifiziert. Es ist darauf hinzuweisen, dass das Protein aus A. niger var. tubigensis isoliert wird und die cDNA aus A. niger N400 isoliert wird, was erläutert, dass verschiedene Aspergilli eine AXDA-Aktivität aufweisen.
Mit der Einführung neuer DNA-Amplifikationstechniken, z. B. einer direkten oder invertierten PCR, ist es ebenfalls möglich, DNA-Fragmente in vitro zu klonieren, nachdem die terminalen Sequenzen der Kodierungsregion bekannt sind.
Die Verfügbarkeit einer DNA-Sequenz, die für ein Arabinoxylan abbauendes Enzym kodiert, ermöglicht die Konstruktion von mutanten Enzymmolekülen durch positionsgerichtete Mutagenese. Wenn die tertiäre Struktur des Arabinoxylan abbauenden Enzyms bekannt ist und dessen katalytische und substratbindende Domänen lokalisiert worden sind, können Aminosäuren für die Mutagenese (beispielsweise unter Zuhilfenahme von Computermodellen) ausgewählt werden, von denen die größte Wahrscheinlichkeit besteht, dass sie katalytische und/oder substratbindende Funktionen beeinflussen. Wenn die Tertiärstruktur des Proteins nicht zur Verfügung steht, können willkürliche Mutanten entweder entlang der gesamten Kodierunssequenz erzeugt werden oder die Tertiärstruktur des Proteins kann durch Vergleich mit ähnlichen bekannten Enzymen, die aus einem anderen Mikroorganismus isoliert worden sind, vorhergesagt werden.
Um die Insertion des DNA-Fragments, das die AXDA-kodierende Sequenz enthält, in Expressionskonstrukte, die ein oder mehr heterologe regulatorische Regionen enthalten, zu erleichtern, kann die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) (PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, Hrsg. H. A. Ehrlich, Stockton Press, New York, (1989)) zur Einführung geeigneter Restriktionsenzymstellen in die 5'- und 3'-Enden der AXDA-Kodierungssequenzen verwendet werden. Die Wahl der Restriktionsstellen hängt von der DNA-Sequenz des Expressionsvektors ab, d. h. der Anwesenheit von anderen Restriktionsstellen innerhalb des DNA-Moleküls.
Um die verstärkte Expression der AXDA-Proteine in ursprünglichen (homologen) Produktionsspezies oder alternativ in einem heterologen Pilzstamm zu erreichen, werden die AXDA-kodierenden DNA-Regionen, einschließlich ihrer eigenen Kontrollregion, in den gewählten Expressionswirt eingeführt, um die Kopienzahl des Gens und infolgedessen die Proteinexpression zu erhöhen.
Wenn ein heterologer Expressionswirt bevorzugt wird und ein Hefe- oder Bakterienstamm gewählt wird, wird ein nicht-unterbrochenes (intronfreies) DNA-Molekül für die Konstruktion eines heterologen Expressionsvektors verwendet, um die Möglichkeit zu vermeiden, dass Spleißsignale, die auf dem genomischen Fragment sitzen, nicht vom heterologen Wirt erkannt werden. Dieses nicht-unterbrochene DNA-Molekül kann aus einer cDNA-Bibliothek erhalten werden, die aus mRNA konstruiert worden ist, die aus in Bezug auf die Synthese von AXDA induzierten Zellen isoliert worden ist. Diese Bibliothek kann mit einem Oligonucleotid oder einer cDNA-Sonde, die auf die vorstehend beschriebene Weise erhalten worden sind, abgesucht werden. Alternativ kann ein nicht-unterbrochenes DNA-Molekül unter Anwendung einer Polymerase-Kettenreaktion erhalten werden, wobei man geeignete 5'- und 3'-Oligonucleotide am ersten Strang der cDNA, die aus der RNA von Arabinoxylan induzierten Zellen erhalten worden sind, verwendet.
Eine verstärkte Expression des AXDA von Interesse kann auch erreicht werden, indem man heterologe regulatorische Regionen, z. B. Promotor-, Sekretionsleader- und Terminatorregionen, die zur Erhöhung der Expressionsgrade und gegebenenfalls der Sekretionsgrade des Proteins von Interesse aus dem gewählten Expressionswirt und/oder zur Bereitstellung der induzierbaren Kontrolle der Expression des AXDA von Interesse dienen, wählt.
Neben dem nativen Promotor des AXDA von Interesse können andere Promotoren zum Dirigieren von dessen Expression verwendet werden. Der Promotor kann aufgrund seiner Wirksamkeit beim Dirigieren der Expression des AXDA von Interesse im gewünschten Expressionswirt gewählt werden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann ein konstitutiver Promotor gewählt werden, um die Expression des gewünschten AXDA relativ frei von anderen Enzymen zu dirigieren. Ein derartiges Expressionskonstrukt erweist sich ferner als vorteilhaft, da es die Notwendigkeit zur Züchtung der Expressionswirte auf einem Medium mit einem Gehalt an Arabinoxylanen als induzierendem Substrat umgeht.
Zu Beispielen für starke konstitutive und/oder induzierbare Promotoren, die zur Verwendung in Pilzexpressionswirten bevorzugt sind, gehören folgende Promotoren: ATP-Synthetase, Untereinheit 9 (oliC), Triosephosphat-isomerase (tpi), Alkohol-dehydrogenase (adhA), α-Amylase (amy), Glucoamylase (gam), Acetamidase (amdS) und Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (gpd).
Beispiele für starke Hefepromotoren sind Promotoren von Alkohol-dehydrogenase, Lactase, 3-Phosphoglycerat-kinase und Triosephosphat-isomerase.
Beispiele für starke bakterielle Promotoren sind die α-Amylase- und Spo-2-Promotoren sowie Promotoren von extrazellulären Protease-Genen.
Hybride Promotoren können ebenfalls in vorteilhafter Weise zur Verbesserung der induzierbaren Regulierung des Expressionskonstrukts verwendet werden.
Häufig ist es wünschenswert, dass das AXDA von Interesse aus dem Expressionswirt in das Kulturmedium sezerniert wird.
Erfindungsgemäß kann die native Sekretionsleadersequenz des AXDA von Interesse zur Herbeiführung der Sekretion der exprimierten AXDA herangezogen werden.
Jedoch führt eine Erhöhung der Expression des Enzyms gelegentlich zur Bildung des Proteins in Konzentrationen, die die Fähigkeit des Expressionswirts zur Prozessierung und Sekretion übersteigen, was zu einem Flaschenhals insofern führt, als sich das Proteinprodukt in der Zelle anreichert. Demzufolge werden erfindungsgemäß ferner heterologe Leadersequenzen bereitgestellt, um eine besonders wirksame Sekretion des Enzyms aus dem gewählten Expressionswirt zu gewährleisten.
Erfindungsgemäß kann der Sekretionsleader auf der Grundlage des gewünschten Expressionswirts gewählt werden. Ein heterologer Sekretionsleader kann gewählt werden, der mit den übrigen regulatorischen Regionen des Expressionskonstrukts homolog ist. Beispielsweise kann der Leader des hochgradig sezernierten Glucoamylase-Proteins in Kombination mit dem Glucoamylase-Promotor selbst sowie in Kombination mit anderen Promotoren verwendet werden. Hybride Signalsequenzen können ebenfalls in vorteilhafter Weise erfindungsgemäß eingesetzt werden.
Zu Beispielen für bevorzugte heterologe Sekretionsleadersequenzen gehören Sequenzen, die aus dem Glucoamylase-Gen (Pilze), dem α-Faktor-Gen (Hefen) oder dem α-Amylase-Gen (Bacillus) stammen.
Im allgemeinen werden Terminatoren nicht als kritische Elemente für die verstärkte Expression von Genen angesehen. Gegebenenfalls kann ein Terminator unter den gleichen Genen wie die Promotoren ausgewählt werden oder alternativ kann ein homologer Terminator verwendet werden.
Zusätzlich zum vorerwähnten genomischen Fragment kann die transformierende DNA einen Selektionsmarker zu Unterscheidung von Zellen enthalten, denen das gewünschte Gen aus der Masse von untransformierten Zellen einverleibt ist. Dieser Selektionsmarker, der mit den entsprechenden 5'- und 3'-regulatorischen Sequenzen versehen ist, kann auf dem DNA-Molekül, das das gewünschte Gen enthält, sitzen oder in einem getrennten Molekül vorhanden sein. Im letztgenannten Fall muss eine Cotransformation durchgeführt werden. Das Verhältnis von Expressionsvektor/Selektionsvektor muss so eingestellt werden, dass ein hoher prozentualer Anteil der gewählten Transformanten ebenfalls den Vektor, der das Expressionskonstrukt des AXDA von Interesse enthält, eingebaut hat.
Bei besonders geeigneten Selektionssystemen für gewerbliche Mikroorganismen handelt es sich um solche, die durch die Gruppe von Selektionsmarkern gebildet werden, die keine Mutation im Wirtsorganismus erfordern. Zu Beispielen für fungale Selektionsmarker gehören die Gene für Acetamidase (amdS), ATP-Synthetase, Untereinheit 9 (oliC) und Benomyl-Resistenz (benA). Zu Beispielen für nicht-fungale Selektionsmarker gehören das bakterielle G918-Resistenzgen (das auch in Hefen, nicht jedoch in Pilzen verwendet werden kann), das Ampicillin-Resistenzgen (E. coli) und das Neomycin-Resistenzgen (Bacillus).
Nachdem das gewünschte Expressionskonstrukt aufgebaut worden ist, wird es in einen geeigneten Klonierungswirt, wie E. coli, transformiert, um das Konstrukt zu vermehren. Anschließend wird das Expressionskonstrukt in einen geeigneten Expressionswirt eingeführt, wo das Expressionskonstrukt vorzugsweise in das Genom integriert wird. Bestimmte Wirte, wie Bacillus-Spezies können sowohl als Klonierungs- als auch als Expressionswirte verwendet werden, wodurch eine zusätzliche Transformationsstufe vermieden wird.
Erfindungsgemäß kann eine Vielzahl von Organismen als Wirte zur Herstellung des AXDA von Interesse verwendet werden.
Gemäß einer Ausführungsform kann ein homologer Expressionswirt verwendet werden. Dies beinhaltet die Einführung des Expressionskonstrukts zurück in den Stamm, aus dem die für AXDA kodierenden DNA-Sequenzen isoliert worden sind, und zwar in einer erhöhten Anzahl von Genkopien und/oder unter der Kontrolle von heterologen regulatorischen Regionen gemäß den vorstehenden Ausführungen.
In einer weiteren Ausführungsform lässt sich ein AXDA von Interesse herstellen, indem man das DNA-Konstrukt, das für das Arabinoxylan abbauende Enzym von Interesse kodiert, unter der Kontrolle der entsprechenden regulatorischen Regionen in heterologe Wirte, wie Bakterien, Hefen oder Pilze, einführt und exprimiert. Zu diesem Zweck werden die DNA-Sequenzen, die für das AXDA von Interesse kodieren, vorzugsweise unter der Kontrolle von Promotor- und Terminatorsequenzen, die aus dem heterologen Wirt stammen, exprimiert. Ferner kann es erforderlich sein, die native Sekretionsleadersequenz durch eine Leadersequenz, die zum Expressionswirt homolog ist, zu ersetzen, um eine besonders wirksame Expression und Sekretion des Produkts zu erreichen.
Faktoren, wie Größe (Molekulargewicht), Notwendigkeit einer einwandfreien Glycosylierung oder eine erwünschte extrazelluläre Sekretion des AXDA von Interesse, spielen eine wichtige Rolle bei der Selektion des Expressionswirts.
Das gram-negative Bakterium E. coli wird in breitem Umfang als Wirt für die heterologe Genexpression verwendet. Jedoch besteht eine Tendenz zur Anreicherung von großen Mengen an heterologem Protein in der Zelle. Eine anschließende Reinigung des erwünschten Proteins aus der Masse der intrazellulären Proteine von E. coli kann sich gelegentlich als schwierig erweisen.
Im Gegensatz zu E, coli eignen sich Bakterien der Gattung Bacillus sehr gut als heterologe Wirte, und zwar aufgrund ihrer Fähigkeit zur Sekretion von Proteinen in das Kulturmedium.
Je nach der Natur des für AXDA kodierenden DNA-Moleküls selbst und/oder dem Wunsch nach einer weiteren Prozessierung des exprimierten Proteins werden eukaryontische Wirte, wie Hefen oder Pilze, bevorzugt. Im allgemeinen werden Hefezellen gegenüber Pilzzellen bevorzugt, da sie leichter handhabbar sind. Jedoch werden einige Proteine nur in geringem Umfang aus den Hefezellen sezerniert oder in einigen Fällen nicht einwandfrei prozessiert (z. B. Hyperglycosylierung in Hefe). Unter diesen Umständen sollte ein Pilzwirtsorganismus gewählt werden.
Ein heterologer Wirt kann auch gewählt werden, um AXDA von Interesse, das im wesentlichen frei von anderen, polysaccharidabbauenden Enzymen ist, zu exprimieren, wobei man einen Wirt wählt, der normalerweise derartige Enzyme nicht erzeugt, z. B. Kluyveromyces lactis.
Zu Beispielen für bevorzugte Expressionswirte im Rahmen der vorliegenden Erfindung gehören Pilze, wie Aspergillus-Spezies (beschrieben in EP-184 438 und EP-284 603) und Trichoderma-Spezies, Bakterien wie Bacillus-Spezies (beschrieben in EP-134 048), und Hefen, wie Kluyveromyces-Spezies (beschrieben in EP-96 430 und EP-301 670) und Saccharomyces-Spezies.
Besonders bevorzugte Expressionswirte können unter Aspergillus niger, Aspergillus niger var. awamori, Aspergillus aculeatis, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus emyloliquefaciens, Kluyveromyces lactis und Saccharomyces cerevisiae ausgewählt werden.
Die Expression des AXDA-Enzyms von Interesse wird durch Züchtung der Expressionswirte, die mit dem geeigneten Expressionskonstrukt transformiert worden sind, in einem herkömmlichen Nährfermentationsmedium durchgeführt.
Das Fermentationsmedium besteht aus einem üblichen Kulturmedium mit einem Gehalt an einer Kohlenstoffquelle (z. B. Glucose, Maltose, Melassen und dergl.), einer Stickstoffquelle (z. B. Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumchlorid und dergl.), einer organischen Stickstoffquelle (z. B. Hefeextrakt, Malzextrakt, Pepton und dergl.) und anorganischen Nährstoffquellen (z. B. Phosphat, Magnesium, Kalium, Zink, Eisen und dergl.). Gegebenenfalls kann ein Induktor (Arabinoxylan) zugesetzt werden.
Die Auswahl eines entsprechenden Mediums kann auf der Grundlage der Wahl der Expressionswirte und/oder auf der Grundlage der regulatorischen Erfordernisse des Expressionskonstrukts erfolgen. Derartige Medien sind dem Fachmann geläufig. Das Medium kann gegebenenfalls zusätzliche Komponenten enthalten, die die transformierten Expressionswirte gegenüber anderen, möglicherweise als Verunreinigungen vorliegenden Mikroorganismen begünstigen.
Die Fermentation wird über eine Zeitspanne von 0,5 bis 20 Tagen in einem absatzweisen Verfahren oder in einem absatzweisen Verfahren unter Einspeisung bei einer Temperatur im Bereich von 0 bis 45°C und einem pH-Wert von 2 bis 10 durchgeführt. Bevorzugte Fermentationsbedingungen umfassen eine Temperatur von 20 bis 37 °C und einen pH-Wert von 3 bis 9. Die geeigneten Bedingungen werden auf der Basis der Wahl des Expressionswirts gewählt.
Nach der Fermentation werden die Zellen aus der Fermentationsbrühe durch Zentrifugation oder Filtration entfernt. Nach der Entfernung der Zellen kann das Enzym gewonnen und gegebenenfalls durch herkömmliche Maßnahmen gereinigt und isoliert werden.
Das Produkt wird in stabiler Weise entweder in flüssiger oder trockener Form zubereitet. Für bestimmte Anwendungen kann eine Immobilisierung des Enzyms an einer festen Matrix bevorzugt werden.
Erfindungsgemäß erzeugte Enzyme können entweder allein oder zusammen mit anderen ausgewählten Enzymen in einer Vielzahl von Verfahren, bei denen die Wirkung eines Arabinoxylan abbauenden Enzyms benötigt wird, eingesetzt werden.
Das erfindungsgemäße, Arabinoxylan abbauende Enzym wird bei der Behandlung oder Zubereitung von Nahrungsmitteln (z. B. Brot), Futtermitteln und Getränken (z. B. Bier und Fruchtsäfte) verwendet.
Das Arabinoxylan abbauende Enzym wird auch in vorteilhafter Weise zur Herstellung und Behandlung von Papier und Zellstoff insbesondere in Kombination mit Endoxylanasen verwendet.
Wie erfindungsgemäß erläutert, wird das Arabinoxylan abbauende Enzym Tierfuttermitteln, die reich an Arabinoxylanen sind, zugesetzt. Bei Zusatz zu Futtermitteln (einschließlich Silage) für monogastrische Tiere (z. B. Geflügel oder Schweine), die Cerealien, wie Gerste, Weizen, Mais, Roggen oder Hafer, oder Cerealien-Nebenprodukte, wie Weizenkleie oder Maiskleie, enthalten, verbessert das Enzym in erheblichem Maße den Abbau von Pflanzenzellwänden, was zu einer besseren Verwertung der Pflanzennährstoffe durch das Tier führt. Infolgedessen ergeben sich eine Verbesserung der Wachstumsgeschwindigkeit und/oder der Futterverwertung. Außerdem können Arabinoxylane abbauende Enzyme zur Verringerung der Viskosität von Arabinoxylan enthaltenden Futtermitteln verwendet werden.
Ein Arabinoxylan abbauendes Enzym kann vorher dem Futtermittel oder der Silage zugesetzt werden, wenn vorher aufgeweichte oder nasse Futtermittel bevorzugt werden. In besonders vorteilhafter Weise setzt das erfindungsgemäß erzeugte AXDA die Hydrolyse von Arabinoxylanen im Futtermittel in vivo fort.
Arabinoxylan abbauende Enzyme eignen sich auch zur Herstellung von Brot, wie in Beispiel 8 dargelegt wird.
Experimenteller Teil
Stämme
E.coli BB4 (Silvay et al., 1984):
el4 (mcrA) hsdR514, supE44, supF58, lacY1, oder Δ(lac1ZY)6, galK2, galT22, metBl, trpR55, Δ(argF-lac)U169 [F', proAB, lacI^qZ ΔM15, Tn10, (tetr)]
E. coli DH5a (Hanahan, 1983):
supE94, ΔlacU169, (ϕ801acZΔM15), hsdR17, recAl, endAl, gyrA96,thi-1, relAl
E.coli LE 392 (Murray 1977):
el4 (mcrA) hsdR514, supE44, supF58, lacY1, oder Δ(lac1ZY)6, galK2, galT22, metB1, trpR55
E.coli XL1-Blue MRF' (Jerpseth et al., 1992):
Δ(mcrA)183, Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173, endA1, supE44, thi-1, recAl, gyrA96, relA1, lac, [F', proAB, lacI^qZΔM15, Tn10, (tet^r)]
Aspergillus niger N400 (CBS 120.49)
Aspergillus niger N402 (cspA1) (Goosen et al, 1987)
Aspergillus niger NW219 (leuA1, nicA1, pyrA6)
Vektoren
pBluescript SK +/- (J. M. Short et al., 1988)
pUC19 (Yanish-Perron et al., 1985)
Die folgenden Lösungen wurden gemäß Sambrook et al. (198.9) hergestellt:
Puffer: TE, 50 * TAE, 20 * SSC, Hybridisierungspuffer, 100 * -Denhardt, SM, DNA-Aufsetzpuffer.
Medien: NZYCM-, LB- und Minimalmedium.
Die Visniac-Lösung wurde gemäß Visniac und Santer (1957) hergestellt.
Beispiele
Beispiel 1: Enzymisolierung
Beispiel 1.1
Reinigung und Charakterisierung von Arabinoxylan abbauender Aktivität A (AXDA) aus A.niger var. tubigensis
A. niger var. tubigensis DS 16813 wurde gemäß EP-A-0963706 ohne Hefeextrakt und mit 2% einer rohen Weizen-Arabinoxylanfraktion anstelle von Haferspelzenxylan gezüchtet. Die Zellen wurden durch Filtration entfernt. Der Überstand wurde durch Ultrafiltration getrocknet.
Zur Reinigung von AXDA wurden 5 g rohes Enzympräparat in 100 ml 10 mM Tris/HCl, pH-Wert 8,0, verdünnt. Die Enzymlösung wurde filtriert (Seitz/supro no 250 und Seitz/supro EKS) und auf eine endgültige Proteinkonzentration (Biorad-Proteintest) von 5,2 g/Liter verdünnt. Das rohe Enzym wurde durch HPLC (Waters Preparative 650 Advanced Protein Purification System) an einer DEAE-TSK 650 (M)-Anionenaustauschersäule (600 ml) fraktioniert (Geschwindigkeit 25 ml/min). Die Säule wurde mit 25 mM Tris/HCl (pH-Wert 8,0) äquilibriert. Die Probe (3 g Protein) wurde auf die Säule aufgesetzt und mit einem Gradienten des Äquilibrationspuffers mit einem Gehalt an 100 mM NaCl eluiert. Das AXDA-Enzym wurde bei einer NaCl-Konzentration von 53 mM eluiert, wie in 1 gezeigt ist.
Beispiel 1.2: pH-Optimum
Zur Bestimmung des pH-Optimums des rohen AXDA-Enzympräparats wurde die Polymerfraktion mit in Wasser unlöslichen Feststoffen (WIS) von Mais als Substrat verwendet. 1,6 mg rohes Enzympräparat wurden zu 0,5 g WIS gegeben und mit Puffer (100 mM NaAc) mit variierendem pH-Wert von 3,40 bis 7,65 auf 5 ml verdünnt. Die Proben wurden 60 Minuten bei 39°C inkubiert und 15 Minuten zentrifugiert (2800 g). Im Überstand wurden reduzierende Zucker unter Verwendung des Sumner-Reagenz gemessen.
Herstellung des Sumner-Reagenz: 10 g Phenol wurden zu 22 ml 10% NaOH gegeben. Das Volumen wurde sodann mit entmineralisiertem Wasser auf 100 ml eingestellt. 10 g NaHSO₃ wurden zugesetzt. 70 ml dieser Lösung wurden mit 300 ml 4,5% NaOH versetzt, wonach 255 g K/Na-Tartrat und 800 ml 1% 3,5-Dinitrosalicylsäure zugegeben wurden. Anschließend wurde das Gemisch bei Raumtemperatur gerührt, bis sich die Chemikalien gelöst hatten.
0,5 ml Sumner-Reagenz werden zu 200 μl Probe gegeben und einer 10-minütigen Siedebehandlung unterworfen. Nach Abkühlung werden 5 ml entmineralisiertes Wasser zugesetzt. Die Extinktion bei 515 nm wird gemessen. Der Gehalt der Proben an reduzierendem Zuckern wird unter Verwendung einer Eichkurve für Xylose berechnet.
Das pH-Optimum des Enzyms betrug 5,0, wie in 2 dargestellt ist.
Beispiel 1.3: Aminosäurezusammensetzung
Aus den AXDA-Fraktionen der DEAE-Säule wurde die Aminosäurezusammensetzung mit einer PICO-TAG 150 MM-Säule (Nachweis bei 254 nm) gemessen. Es wurde folgende Zusammensetzung gefunden:
Tabelle 1 Aminosäurezusammensetzung von AXDA, HPLC, Pumpe: CM4000; Nachweis M440, 254 nm; Injektion 4 μl, Gilson 232; Säule PICO-TAG 150 MM; Datensystem: Maxima.
Beispiel 1.4:
Biochemische Charakterisierung (IEP und Molekulargewicht)
Der IEP von AXDA wurde an Pharmacia-Minigel, pH-Wert 3–9, bestimmt. Das Protein wurde mit einer Pharmacia-Silberfärbelösung gefärbt. Der IEP des AXDA-Enzyms wurde zu 3,6 ermittelt.
Das Molekulargewicht von AXDA wurde an einem Pharmacia-Minigradienten-SDS-Gel (10–15%) bestimmt. Die Proteine wurden mit Silberfärbung (Pharmacia) nachgewiesen. Das Molekulargewicht von AXDA wurde zu 32 kDa bestimmt.
Beispiel 1.5:
Proteinsequenzierung von Arabinoxylan abbauender Aktivität A (AXDA) aus A. niger var tubigensis
Beispiel 1.5.1:
Aminosäuresequenzierung des N-Terminus von Arabinoxylan-Aktivität A (AXDA) von A. niger var tubigensis
Etwa 1 nmol (≈ 30 μg) AXDA wurde der Elektrophorese an einem 15% SDS-Polyacrylamidgel unterworfen, wonach sich ein Elektroblotting an einer Immobilon-P-Membran (Millipore) gemäß den Angaben von Matsudaira (1987) anschloss. Das Membranfragment, das die Hauptbande mit einem scheinbaren Molekulargewicht (SDS-PAGE) von 32 Kda enthielt, wurde der Sequenzanalyse durch Gasphasensequenzierung unterworfen (Amons, 1987) (SON-Anlage, Leiden). Es wurde die folgende Sequenz ermittelt:
Lys-?-Ala-Leu-Pro-Ser-Ser-Tyr SEQ ID NO: 1
Beispiel 1.5.2:
Aminosäuresequenzbestimmung eines CNBr-Peptids von Arabinoxylan abbauender Aktivität A (AXDA)
Etwa 2 nmol AXDA wurden einer chemischen Spaltung mit CNBr unterworfen. Etwa 2 nmol (≈ 60 μg) AXDA wurden gefriergetrocknet und in 60 μl 70% Ameisensäure mit einem Gehalt an 125 μg CNBr (2,5 mg/ml) resuspendiert. Dieses Reaktionsgemisch wurde 48 Stunden im Dunklen bei Raumtemperatur inkubiert. Die Flüssigkeit wurde in einem Speedvac-Gerät abgedampft. Nach Waschen mit sterilem bidestilliertem Wasser wurde eine erneute Abdampfung vorgenommen. Diese Waschstufe wurde 2-mal wiederholt. Sodann wurde das Reaktionsgemisch der Elektrophorese an einem 15% SDS-Polyacrylamidgel unterworfen, wonach sich ein Elektroblotting an einer Immobilon-P-Membran (Millipore) gemäß dem von Matsudaira (1987) beschriebenen Verfahren anschloss. Das die Hauptbande mit einem scheinbaren Molekulargewicht (SDS-PAGE) von etwa 9 kDa enthaltende Fragment wurde der Sequenzanalyse durch Gasphasensequenzierung (Amons, 1987)(SON-Anlage, Leiden) unterworfen. Die folgende Sequenz wurde bestimmt
CNBr-Peptid: Ile-Val-Glu-Ala-Ile-Gly-Ser-Thr-Gly-His-Arg-Tyr-Phe-(Arg/Asn)-(Ser)-(Phe)-(Thr) (SEQ ID NO: 2)
Zweifelhafte Aminosäuresequenzen sind in Klammern gesetzt.
Beispiel 2: Enzymatisches Profil von AXDA
Die α-Arabinofuranosidase-Aktivität wurde an einem p-Nitrophenyl-arabinofuranosid-Substrat (Sigma) gemessen. Zu 1 ml Substrat wurden 300 μl Enzymlösung gegeben. Nach 15-minütiger Inkubation bei 30°C wurde die Umsetzung mit 5 ml Na₂CO₃ (SM) gestoppt. Die Extinktion wurde bei 902 nm gemessen. Die α-Arabinofuranosidase-Aktivität wurde berechnet (Volumen * Extinktion)/(E * Zeit).
Das rohe Enzympräparat enthielt eine α-Arabinofuranosidase-Aktivität von 0,30 pNPAF-U/mg. Die Fraktionen der DEAE-Säule wurden auf ihre Aktivität getestet. Der Pool mit Arabinofuranosidase-Aktivität enthielt 3,0 pNPAF U/mg (vergl. 1). Weitere Fraktionen mit α-Furanosidase-Aktivität wurden nicht gefunden. Der Pool mit α-Arabinofuranosidase-Aktivität wurde später an einer in Wasser unlöslichen Polymerfraktion von Mais getestet. An diesem Substrat wurde keine Aktivität gemessen.
Dies zeigt, dass AXDA auf einem p-Nitrophenylsubstrat keine α-Arabinofuranosidase-Aktivität besitzt.
In einem weiteren Versuch zur Identifizierung der enzymatischen Aktivität von AXDA wurden Filtrate einer Aspergillus niger-Kultur, die mit dem Aspergillus tubigensis AXD A-Gen transformiert worden war, einem Screening auf Aktivität gegenüber einem Substrat, das aus Weizen-Arabinoxylan bestand, unterworfen. Das Tubigensis-Gen stand unter der Kontrolle des Pyruvat-kinase-Promotors (glykolytisch). Die Wachstumsbedingungen wurden so gewählt, dass die Expression des Transgens begünstigt wurde, wobei die Expression von endogenen, Arabinose abbauenden Enzymen vermieden wurde.
Demgemäß wurde festgestellt, dass AXDA eine Arabinose freisetzende Aktivität an hochmolekularen Arabinoxylan-Substraten aufwies. Der Proteingehalt wurde unter Anwendung des Sedmak-Verfahrens bestimmt. Die Aktivität von AXDA wurde durch Zugabe von 100 μl verschiedener Verdünnungen (in 10 mM Na-acetatpuffer, pH-Wert 5,0) der Kulturfiltrate zu 150 μl 50 mM Na-acetat (pH-Wert 5,0) und 250 μl 0,4% Weizen-Arabinoxylan (Megazyme) und 1-stündige Inkubation bei 90°C bestimmt. Die Umsetzung wurde durch 10-minütiges Erwärmen der Gemische auf 100°C gestoppt. Arabinoxylan-Abbauprodukte wurden durch HPAEC (Hochleistungs-Anionenaustauschchromatographie) unter Verwendung der wärmeinaktivierten Inkubationsgemische als Proben überwacht. Es wurden folgende Ergebnisse erzielt: Tabelle 0 Aktivität von Aspergillus tubigensis-AXDA gegenüber Weizen-Arabinoxylan
Es wurde die Schlussfolgerung getroffen, dass das AXDA-Enzym von Aspergillus tubigensis eine Arabinofuranohydrolase (AXH)-Aktivität besitzt.
Die Arabinase-Aktivität wurde mit einer Arabinase-Testpackung der Fa. Megazyme unter Einhaltung der Gebrauchsanweisung gemessen. Bei diesem Versuch zeigte der AXDA-Pool der DEAE-Säule keine Aktivität gegenüber linearem Arabinan.
Dies zeigte, dass AXDA keine Arabinase darstellt.
Die Endoxylanase-Aktivität wurde an Haferspelzen-Xylan gemessen. 10 ml 5% Xylan-Suspension (100 mM NaAc, pH-Wert 3,5) wurden einer 10-minütigen Siedebehandlung unterworfen. Nach Abkühlen wurde die Suspension 10 Minuten bei 39°C inkubiert. Sodann wurde die Umsetzung durch Zugabe von 0,5 ml Enzymlösung gestartet. Nach mehreren Inkubationszeiten (5, 10, 15, 20 und 25 Minuten) wurden 1,5 ml Probe aus dem bei 39°C inkubierten Gemisch zu 1,5 ml entmineralisiertem Wasser gegeben und einer 10-minütigen Siedebehandlung unterworfen. Die Proben wurden 15 Minuten zentrifugiert (2800 g). Im Überstand wurden reduzierende Zucker mit dem Sumner-Reagenz nachgewiesen (vergl. Beispiel 1.2).
Im AXDA-Fraktionspool wurde eine Endoxylanase-Aktivität von 399,0 U/mg gefunden. Endoxylanase und AXDA wurden später in einem in vitro-Verdauungssystem getestet (vergl. Beispiel 6).
Hieraus wurde der Schluss gezogen, dass die Endoxylanase-Aktivität im AXDA-Fraktionspool eine Aktivität darstellte, die mit einer unterschiedlichen Polypeptid-Aktivität assoziiert war. Ein weiterer Hinweis, dass ein Polypeptid mit endo-Xylanase gemeinsam mit einem Enzym mit Ähnlichkeit zu AXDA eluiert wird, findet sich bei Kormelink (1992, Doktorarbeit, Kapitel 6, S. 107, die letzten beiden Absätze und S. 108). Es wurde der Schluss gezogen, dass AXDA selbst keine endo-Xylanase-Aktivität besitzt.
Beispiel 3
Konstruktion der cDNA-Expressionsbibliothek
Beispiel 3.1: Induktion und Isolierung von mRNA
Eine A. niger N400-Kultur wurde 69 bzw. 81 Stunden gemäß EP-A-0 463 706 ohne Hefeextrakt und mit 2% einer rohen Weizen-Arabinoxylan-Fraktion anstelle von Haferspelzen-Xylan gezüchtet, wonach das Myzel durch Filtration geerntet und sodann mit steriler Kochsalzlösung gewaschen wurde. Anschließend wurde das Myzel in flüssigem Stickstoff eingefroren und sodann unter Verwendung eines Microdismembrator-Geräts (Braun) pulverisiert. Die gesamte RNA wurde aus dem Myzelpulver gemäß dem von Sambrook et al. (1989) beschriebenen Guanidiumthiocyanat/CsCl-Verfahren isoliert, mit der Ausnahme, dass die RNA 2-mal unter Verwendung eines CsCl-Gradienten zentrifugiert wurde. Poly A + mRNA wurde aus 5 mg gesamter RNA durch oligo(dT)-Cellulose-Chromatographie (Aviv und Leder, 1972; Sambrook et al., 1989) mit den folgenden Modifikationen isoliert: SDS wurde aus sämtlichen Lösungen weggelassen und der Aufsetzpuffer wurde mit 9% (Vol./Vol.) Dimethylsulfoxid ergänzt.
Beispiel 3.2: Konstruktion der cDNA-Bibliothek
cDNA wurde aus 7 μg poly A + mRNA synthetisiert und einer Ligation in den Bakteriophagen lambdaλ Uni-ZAP-XR unter Verwendung des ZAPR-cDNA-Synthesekits (Stratagene) gemäß den Anweisungen des Herstellers unterworfen. Nach Ligation der cDNA in Uni-ZAP XR-Vektorarme wurde die Phagen-DNA unter Verwendung von Packagene^R-Extrakten (Promega) gemäß den Anweisungen des Herstellers gepackt. Eine Ligation von 120 ng cDNA in 1,2 μg Vektorarme und ein anschließendes Packen des Reaktionsgemisches ergab eine primäre Bibliothek aus 3,5 * 10⁴ rekombinanten Phagen. Diese primäre Bibliothek wurde unter Verwendung von E. coli XL1-Blue MRF' amplifiziert, titriert und bei 9°C gelagert.
Beispiel 4
Screening der A. niger N400-eDNA-Bibliothek auf (axdA) mit Antikörpern gegen AXDA und Isolierung von cDNA-Klonen
Beispiel 4.1
Erzeugung von Antikörpern in AXDA in einem Kaninchen
500 μg AXDA wurden gegen 1 mM Phosphatpuffer, pH-Wert 7,0 dialysiert und gefriergetrocknet. Das Protein wurde in 1 ml sterilem PBS (0,136 M NaCl; 2,7 mM KCl; 8 mM Na₂HPO₄, 1,75 mM KH₂PO₄, pH-Wert 7,4) suspendiert. Dieses Proteingemisch wurde mit 1 ml komplettem Freund-Adjuvans versetzt und 30 Minuten aufgewirbelt, wodurch man eine stabile Emulsion erhielt. Das Gemisch wurde sodann subkutan dem Kaninchen injiziert. In der 6. Woche wurde eine Auffrischung durch Injektion von 250 μg AXDA in 0,5 ml sterilem PBS, dem 0,5 ml inkomplettes Freund-Adjuvans zugesetzt waren, vorgenommen. In der 7. Woche wurde dem Kaninchen Blut entnommen. Das Serum wurde getestet. In der 13. Woche erhielt das Kaninchen eine zweite Auffrischung mit 250 μg, wonach sich eine Blutentnahme in der 14. Woche anschloss. Diese Vorgehensweise von Auffrischungsinjektionen im Abstand von 6 Wochen unter anschließender Blutentnahme kann mehrmals wiederholt werden.
Das gewonnene Blut wurde 30 Minuten bei 37°C inkubiert und anschließend 16 Stunden bei 4°C gelagert. Nach Zentrifugation mit 5 000 U/min in einer Sorvall-Hochgeschwindigkeitszentrifuge wurde das Serum gewonnen.
Beispiel 4.2: Immunoscreening der A. niger N400-cDNA-Bibliothek mit Antikörpern gegen AXDA_TUB
Zum Screening der A. niger N400-cDNA-Bibliothek, die gemäß Beispiel 3.2 konstruiert worden war, auf axdA wurden cDNA-Klone mit 5 * 10³ pfu pro Platte in NZYCM-Topagarose mit einem Gehalt an 0,7% Agarose auf einen Durchmesser von 85 mm aufweisenden NZYCM-Platten (1,5% Agar) gemäß den Angaben von Maniatis (Maniatis et al., (1982), S. 69) unter Verwendung von E. coli BB4 als auszustreichende Bakterien ausgestrichen.
Zwei Replikatplattierungen von jeder Platte wurden auf Nitrocellulosefiltern (Schleicher und Schüll BA85) gemäß den Angaben von Sambrook et al. (1989, S. 12.16–12.17) vorgenommen. AXDA_NIG wurde unter Verwendung von Antikörpern gegen gereinigtes AXD_TUB (Beispiel 4.1) nach Immunofärbung gemäß den Angaben in EP-A-0 463 706-Al) (Az.: 91205944.5) sichtbar gemacht. Immunogefärbte Plaques, die doppelt auf den Replikafiltern auftraten, wurden identifiziert. Es wurden 8 positive Plaques ausgewählt. Jeder positive Plaque wurde von der Platte unter Verwendung einer Pasteur-Pipette abgehoben. Die Phagen wurden aus dem Agarpfropfen in 1 ml SM-Puffer mit einem Gehalt an 20 μl Chloroform gemäß den Angaben von Maniatis et al. (1982), S. 64) eluiert. Die erhaltenen Phagen wurden durch Wiederholen des vorstehenden Vorgangs unter Verwendung von Filter-Replikaplattierungen von Platten mit einem Gehalt an 50–100 Plaques der isolierten Phagen gereinigt.
Nach Reinigung wurden die Phagen durch Ausstreichen von 5 × 10³ Phagen auf NZYCM-Medium vermehrt. Nach Inkubation über Nacht bei 37°C wurden konfluente Platten erhalten, aus denen die Phagen durch Zugabe von 5 ml SM-Puffer und 2-stündiges Lagern der Platte bei 4°C unter intermittierendem Schütteln erhalten wurden. Nach Gewinnen des Überstands mit einer Pipette wurden die Bakterien aus der Lösung durch 10-minütige Zentrifugation mit 4 000 × g bei 4°C entfernt. Der Überstand wurde mit 0,3% Chloroform versetzt. Die Anzahl an pfu wurde bestimmt. Diese Phagen-Vorratsprodukte enthalten etwa 10¹⁰ pfu/ml.
Beispiel 4.3
Restriktionsanalyse von axdA-eDNA-Klonen
Die rekombinanten Uni-ZAP XR-Klone mit einem Gehalt an axdA-cDNA wurden in Bluescript-Phagemide umgewandelt, wobei man sich der Superinfektion mit dem filamentösen Helferphagen ExAssist^R, der im ZAP^R-cDNA-Synthesekit der Fa. Stratagene enthalten ist, gemäß den Anweisungen des Herstellers bediente.
Die Phagemid-DNA wurde anschließend gemäß den Angaben von Sambrook et al. (1989, S. 1.25–1.28) isoliert.
Die isolierte DNA der 8 axdA-cDNA-Klone wurde der Restriktionsanalyse unter Verwendung der folgenden Restriktionsenzyme unterzogen: EcoRI und XhoI. Die DNA wurde 2 Stunden bei 37°C in einem Reaktionsgemisch, das aus den folgenden Lösungen zusammengesetzt war, verdaut: 2 μl (≈ 1 μg) DNA-Lösung; 2 μl des entsprechenden 10 * Reaktionspuffers (BRL); 10 U des jeweiligen Restriktionsenzyms (BRL) und steriles destilliertes Wasser bis zu einem Endvolumen von 20 μl. Nach Zugabe von 9 μl DNA-Aufsetzpuffer wurden die Proben auf 0,7% TAE-Agarosegel aufgesetzt. Die DNA-Fragmente wurden durch 1,5-stündige Elektrophorese mit 80 V getrennt.
Die Restriktionsanalyse ergab, dass die axdA-cDNA-Klone eine Molekülgröße von etwa 1,2 kb aufwiesen.
Beispiel 4.4: Sequenzanalyse von A. niger axdA-cDNA-Klonen
Die Primärstruktur der cDNA-Klone wurde durch Sequenzanalyse bei kombinierter Verwendung von speziellen Oligonucleotiden als Primern bei den Sequenzierungsreaktionen bestimmt.
Die Nucleotidsequenzen wurden durch das Didesoxynucleotid-Kettenterminationsverfahren (Sanger et al., 1977) unter Verwendung des Pharmacia T7-DNA-Polymerase-Sequenzierungskits bestimmt. Eine Computeranalyse wurde unter Verwendung des PC/GENE-Programms durchgeführt.
Beispiel 4.5: ³²P-Markierung von Fragmenten
Das A. niger axdA-cDNA-Klonfragment wurde gemäß EP-0 463 706 Al (Az.: 91205944.5, Beispiele 2.2 und 7.1) isoliert und markiert.
Beispiel 4.6: Screening der A. niger var niger-Genombibliothek auf das-axdA-Gen und Isolierung des Gens
Für das Screening der A. niger var niger-Genombibliothek, die gemäß den Angaben von Harmsen et al. (1990) konstruiert worden war, in bezug auf das-axdA-Gen wurden 3 × 10³ pfu pro Platte in NZYCM-Top-agarose mit einem Gehalt an 0,7% Agarose auf fünf einen Durchmesser von 85 mm aufweisenden NZYCM-Platten (1,55% Agar) gemäß den Angaben von Maniatis (Maniatis et al., 1982, S. 64) unter Verwendung von E. coli LE392 als Ausstreichbakterien ausgestrichen.
Nach Inkubation der Platten über Nacht bei 37 °C wurden von jeder Platte zwei Replikaplattierungen an Hybond N-Filtern (Amersham) gemäß den Angaben von Maniatis et al. (1982, S. 320–321) durchgeführt.
Nach Benetzen der Filter in 3 × SSC wurden die Filter 60 Minuten bei Raumtemperatur in 3 × SSC gewaschen. Anschließend wurden die Filter 2 Stunden bei 65°C im Vorhybridisierungspuffer mit einem Gehalt an folgenden Bestandteilen vorhybridisiert: 6 × SSC, 0,5% SDS, 10 × Denhardt-Lösung, 0,01 M EDTA und 100 μg/ml wärmedenaturierte Heringsperma-DNA (Boerhinger Mannheim). Nach 2-stündiger Vorhybridisierung wurde der Vorhybridisierungspuffer durch Hybridisierungspuffer ersetzt, der identisch mit dem Vorhybridisierungspuffer war, jedoch ein ³²P-markiertes 1,2 kb-Fragment mit einem Gehalt an dem A. niger axdA-cDNA-Klon (vergl. Beispiel 4.3), das gemäß Beispiel 9.5 hergestellt worden war, enthielt. Die Filter wurden 18 Stunden bei einer Temperatur von 65°C hybridisiert.
Nach der Hybridisierung wurden die Filter zunächst 30 Minuten bei 65°C in 5 * SSC/0,1% SDS und anschließend 30 Minuten bei 65°C in 2 * SSC/0,1% SDS gewaschen. Sodann wurden die Filter 30 Minuten bei 65°C mit 0,1 * SSC/0,1% SDS gewaschen, wonach sich ein letzter Waschvorgang von 30 Minuten bei 65°C in 0,1 * SSC anschloss. Die an der Luft getrockneten Filter wurden auf ein Blatt Whatman 3MM-Papier gelegt, wobei Schlüsselmarkierungen mit radioaktiver Tinte aufgebracht wurden. Das Whatman-Papier und die Filter wurden mit Saran Wrap-Material bedeckt. Hybridisierende Plaques wurden nach 72-stündigem Auflegen eines Kodak XAR-Röntgenfilms bei –70°C unter Verwendung eines Verstärkungsfilters identifiziert.
10 positiv hybridisierende Plaques, die doppelt auf den Replikafiltern auftraten, wurden festgestellt. 4 positive Plaques wurden von der Platte unter Verwendung einer Pasteur-Pipette abgehoben. Die Phagen wurden aus dem Agarpfropfen in 1 ml SM-Puffer mit einem Gehalt an 20 μl Chloroform eluiert (vergl. Maniatis et al., 1982, S. 64). Die erhaltenen Phagen wurden durch Wiederholung des vorstehend beschriebenen Vorgangs unter Verwendung von Filter-Replikaplattierungen von Platten mit einem Gehalt an 50–100 Plaques der isolierten Phagen gereinigt.
Nach der Reinigung wurden die Phagen durch Ausstreichen von 5 × 10³ Phagen auf NZYCM-Medium vermehrt. Nach Inkubation über Nacht bei 37°C wurden konfluente Platten erhalten, aus denen die Phagen durch Zugabe von 5 ml SM-Puffer und 2-stündiges Aufbewahren der Platte bei 4°C unter intermittierendem Schütteln eluiert wurden. Nach Gewinnen des Überstands unter Verwendung einer Pipette wurden die Bakterien aus der Lösung durch 10-minütige Zentrifugation mit 4 000 × g bei 9°C entfernt. Der Überstand wurde mit 0,3% Chloroform versetzt. Die Anzahl an pfu wurde bestimmt. Diese Phagen-Vorratsmaterialien enthielten etwa 10⁷ pfu/ml.
Beispiel 4.7: Isolierung von DNA aus lambda-Bakteriophagen
Die einzelnen isolierten Phagen wurden durch Vereinigen von 5 * 10⁹ E. coli LE392-Bakterien in 300 μl SM-Puffer mit 2 * 10⁶ Phagen und 15-minütige Inkubation bei 37°C vermehrt. Nach der Inkubation wurden die infizierten Bakterien zur Inokulation von 100 ml vorerwärmtem (37°C) NZYCM-Medium verwendet und anschließend 9 bis 12 Stunden bei 37°C in einem New Brunswick-Rotationsschüttler mit 250 U/min inkubiert. Sodann wurden die Bakterien lysiert. Die bakteriellen Bruchstücke wurden durch 10-minütige Zentrifugation mit 10 000 U/min bei 4°C in einer Sorvall- Hochgeschwindigkeitszentrifuge entfernt. Die Phagen wurden aus dem erhaltenen Überstand (100 ml) durch Zugabe von 10 g Polyethylenglykol 6000 und 11,7 g NaCl und Lagern der Lösung über Nacht bei 4°C ausgefällt. Die ausgefällten Phagen wurden durch 20-minütige Zentrifugation mit 14 000 × g bei 4°C gewonnen. Der Überstand wurde abgesaugt, wobei die letzten Spurenmengen der Flüssigkeit unter Verwendung eines Papierhandtuchs entfernt wurden. Die Phagen wurden vorsichtig in 4 ml SM-Puffer resuspendiert und 1-mal mit einem gleichen Volumen an Chloroform extrahiert.
Vor der Extraktion der DNA aus den Phagenteilchen wurden DNA und RNA, die von den lysierten Bakterien stammten, durch Inkubation der Phagensuspension mit DNase I und RNase A (jeweils 100 μg/ml) für 30 Minuten bei 37°C entfernt. Die Phagen-DNA wurde anschließend aus den Phagen durch Zugabe von EDTA in einer Endkonzentration von 20 mM freigesetzt, wobei das Protein aus der Lösung durch 2-malige Extraktion mit einem gleichen Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25 : 24 : 1) entfernt wurde. Nach Trennung der Phasen durch Zentrifugation unter Verwendung einer Sorvall-Zentrifuge (14 000 × g, 10 Minuten) wurde die wässrige Phase 1-mal mit einem gleichen Volumen Chloroform/Isoamylalkohol (24 : 1) extrahiert. Die Phasen wurden durch Zentrifugation getrennt, wonach die DNA aus der wässrigen Phase durch Zugabe von 0,1 Vol. 5 M Natriumperchlorat und 0,1 Vol. Isopropanol und 30-minütige Inkubation auf Eis ausgefällt wurde. Die DNA wurde durch 10-minütige Zentrifugation bei 4°C (14 000 × g) gewonnen. Der Überstand wurde durch Absaugen entfernt, wonach die DNA in 400 μl TE-Puffer resuspendiert wurde. Die DNA wurde erneut aus dieser Lösung durch Zugabe von 0,1 Vol. 3 M Natriumacetat und 2 Vol. Ethanol gefällt. Die DNA wurde durch 10-minütige Zentrifugation bei 4°C (14 000 × g) gewonnen. Der Überstand wurde abgesaugt. Das verbleibende Pellet wurde kurz unter Vakuum getrocknet, wonach die DNA in 125 μl TE-Puffer mit einem Gehalt an 0,1 μg/ml RNase A resuspendiert wurde. Dieser Reinigungsvorgang führte zur Isolierung von etwa 50–100 μg DNA von jeder Phage.
Beispiel 4.8: Southern-Analyse von A. niger var niger axdA-DNA enthaltenden Phagen
Die isolierte DNA der Phagen λ_nigaxd1 bis λ_nigaxd4 wurden durch Southern-Analyse unter Verwendung der folgenden Restriktionsenzyme analysiert: KpnI; SalI; SstI; XbaI; und XhoI sowie Kombinationen von KpnI + XbaI, KpnI + SstI und KpnI + XhoI. Es wurde eine 5-stündige Inkubation bei 37°C in einem Reaktionsgemisch, das aus den folgenden Lösungen bestand, durchgeführt: 5 μl (≈ 1 μg) DNA-Lösung, 2 μl des entsprechenden 10 × Reaktionspuffers (BRL), 10 U Restriktionsenzym (BRL) und steriles destilliertes Wasser bis zu einem Endvolumen von 20 μl. Nach der Verdauung wurde die DNA durch Zugabe von 0,1 Vol. 3 M NaAc und 2 Vol. Ethanol gefällt. Die DNA wurde durch 10-minütige Zentrifugation bei Raumtemperatur (14 000 × g) gewonnen. Der Überstand wurde abgesaugt. Das verbleibende Pellet wurde kurz unter Vakuum getrocknet und in sterilem destilliertem Wasser resuspendiert. Nach Zugabe von 4 μl DNA-Aufsetzpuffer wurden die Proben 10 Minuten bei 65°C inkubiert und sodann rasch auf Eis gekühlt, bevor sie auf ein 0,6% Agarosegel in TAE-Puffer aufgesetzt wurden. Die DNA-Fragmente wurden durch 15- bis 18-stündige Elektrophorese bei 25 V getrennt.
Nach der Elektrophorese wurde die DNA durch alkalisches Vakuumblotting (VacuGene XL, Pharmacia LKB) auf eine Nylonmembran (Hybond N, Amersham) gemäß der Bedienungsanleitung [S. 25–26) übertragen und denaturiert sowie anschließend unter Verwendung des markierten A. niger axdA-cDNA-Klons gemäß Beispiel 4.6 unter den Hybridisierungsbedingungen von Beispiel 3.3 vorhybridisiert und hybridisiert. Das Hybridisierungsmuster wurde durch 18-stündiges Auflegen eines Kodak XAR-5-Röntgenfilms bei –70°C unter Verwendung eines Verstärkungsfilters erhalten.
Aus den erhaltenen Ergebnissen wurde geschlossen, dass die DNA sämtlicher vier isolierten Klone mit A. niger axdA-cDNA hybridisierte. In sämtlichen vier Klonen wurden Fragmente, die aus der gleichen Genomregion stammten, gefunden.
Beispiel 4.9: Subklonierung des A. niger var niger-axdA-Gens
Das 3,7 kb-xhoI-Fragment von λ_nigaxd1 wurde aus 0,7% Agarosegel durch das Einfrier-Ausdruck-Verfahren isoliert. Nach der Elektrophorese wurde die entsprechende Bande ausgeschnitten und vorsichtig 30 Minuten in 1 ml FSl-Lösung (0,3 M NaAc pH-Wert 7,0, 1 mM EDTA) geschüttelt. Die Agarosescheibe wurde in ein 0,5 ml fassendes Eppendorf-Röhrchen, das einen kleinen Pfropfen von mit Siliciumdioxid behandelter Glaswolle und ein Loch im Boden aufwies, übertragen und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Das 0,5 ml-Röhrchen wurde sodann in ein 1,5 ml-Eppendorf-Röhrchen übertragen und anschließend 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde mit 1/50 Volumenteilen einer FS2-Lösung (0,5 M MgCl₂, 5% Essigsäure) und 2,5 Volumenteilen 100% Ethanol versetzt. Nach 20-minütiger Inkubation bei –70°C wurde die DNA durch 15-minütige Zentrifugation mit 14 000 × g bei 4°C gewonnen. Nach Entfernung des Überstands wurde die DNA unter Verwendung einer Savant Speedvac-Vakuumzentrifuge getrocknet. Sodann wurde die DNA in 10 μl TE-Puffer gelöst. Die Konzentration wurde durch Agarose-Elektrophorese unter Verwendung von λ-DNA mit bekannter Konzentration als Standard und Ethidiumbromid-Färbung zum Nachweis der DNA bestimmt.
Der Vektor pBluescript SK^–, der mit XhoI verdaut und mit alkalischer Phosphatase dephosphoryliert war, wurde folgendermaßen vorbereitet: 1 μl (1 μg/μl) pBluescript wurde mit 2 μl 10 * React 2 (BRL), 1 μl (1 U/μl) XhoI und 16 μl sterilem destilliertem Wasser vermischt. Die DNA wurde 2 Stunden bei 37 °C verdaut, wonach 0,5 μl alkalische Phosphatase (1 U/μl) (Pharmacia) zugegeben wurden und weitere 30 Minuten bei 37°C inkubiert wurde. Der linearisierte Vektor wurde auf die vorstehend angegebene Weise aus einem 0,7%-Agarosegel isoliert.
Das 3,7 kb-XhoI-Fragment wurde nach folgendem Verfahren der Ligation in den mit XhoI verdauten, dephosphorylierten pBluescript SK^–-Vektor unterzogen: 40 ng pBluescript-Fragment wurden mit 300 ng 3,7 kb-XhoI-Fragment und 4 μl 5 * Ligationspuffer (500 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,6, 100 mM MgCl₂, 10 mM ATP, 10 mM Dithiothreit, 25% PEG-6000) vermischt. Das Gemisch wurde mit 1 μl (1 U/μl) T4-DNA-Ligase (BRL) versetzt, was ein Endvolumen von 20 μl ergab. Das erhaltene Plasmid erhielt die Bezeichnung pIM3002. Nach 16-stündiger Inkubation bei 16 °C wurde das Gemisch mit Ca-HEPES-Puffer, pH-Wert 7,0, auf 100 μl verdünnt. 10 μl des verdünnten Gemisches wurden zur Transformation von kompetenten E. coli DHSα-Zellen auf folgende Weise verwendet: 200 μl einer über Nacht vorgezüchteten Kultur von E. coli DH5a in LB-Medium (LB-Medium pro 1 000 ml: 10 g Trypticase-Pepton (BBL), 5 g Hefeextrakt (BBL), 10 g NaCl, 0,5 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5). Diese Kultur wurde in einem Orbitalschüttler bei 37°C bis zu einer Dichte entsprechend einem OD₆₀₀-Wert von 0,15–0,2 inkubiert. Sodann wurden die Bakterien durch Zentrifugation mit 5000 U/min bei 4°C gewonnen. Nach Verwerfen des Überstands wurden die Zellen ständig auf Eis gehalten. Das bakterielle Pellet wurde in 100 ml 100 mM MgCl₂, 5 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,4, durch Resuspendieren der Zellen und anschließende Zentrifugation auf die vorstehend angegebene Weise gewaschen. Dieser Vorgang wurde mit 100 ml 100 mM CaCl₂, 5 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,4, wiederholt. Schließlich wurden die Zellen in 2 ml 100 mM CaCl₂, 5 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,4, 14% Glycerin, resuspendiert. Aliquotanteile (50 μl) wurden entweder sofort zur Transformation verwendet oder auf –70°C eingefroren.
Kompetente E. coli DH5α-Zellen wurden in Transformationsversuchen verwendet, indem man 50 μl der Zellsuspension mit 9,5 μl des Ligationsgemisches vereinigte. Nach einer Inkubationszeit von 30 Minuten auf Eis wurden die Zellen 2 Minuten bei 42°C inkubiert. Sodann wurde 1 ml LB-Medium zugegeben. Die Zellen wurden 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Bakterien durch eine Zentrifugation von 30 Sekunden mit 14 000 g gewonnen. Nach Verwerfen des Überstands wurden die Zellen in 200 μl LB-Medium resuspendiert. Die erhaltene bakterielle Suspension wurde auf LB-Medium mit einem Gehalt an 100 μg/ml Ampicillin, 50 μg/ml X-gal und 60 μg/ml IPTG ausgestrichen.
Eine Auswahl von 12 der erhaltenen Kolonien wurde über Nacht in LB-Medium mit einem Gehalt an 100 μg/ml Ampicillin gezüchtet. Aus den Kulturen wurde Plasmid-DNA durch das alkalische Lysisverfahren gemäß Maniatis et al. (1982, S. 368–369) isoliert. Diese DNA wurde bei der Restriktionsanalyse gemäß Beispiel 4.3 verwendet, um einen Klon auszuwählen, der das gewünschte Plasmid beinhaltet. Plasmid-DNA wurde im Großmaßstab aus 250 ml-Kulturen von E. coli DH5a mit einem Gehalt an dem Plasmid pIM3002 nach Züchtung in LB-Medium mit einem Gehalt an 100 μg/ml Ampicillin unter Verwendung des Nucleobond PC-500-Kits (Nagel) gemäß den Anweisungen des Herstellers isoliert. Das Plasmid pIM3002 wurde ferner durch Restriktionsenzyme analysiert, wobei man die in 4 dargestellte Restriktionskarte erhielt. Eine Probe von E. coli DH5a mit einem Gehalt an pIM3002 wurde am 28. August 1995 bei der CBS, Baarn, Niederlande, unter der Hinterlegungsnummer CBS 637.95 hinterlegt.
Beispiel 4.10: Überexpression des klonierten Gens in A. niger NW219
Beispiel 4.10.1: Einführung von A. niger var niger-axdA in A. niger NW219 durch Cotransformation
Das in Beispiel 4.9 erhaltene Plasmid pIM3002 wurde in A. niger durch Cotransformation von A. niger NW219 unter Verwendung von A. niger pyrA als selektivem Marker am Plasmid pGW635 (Goosen et al., 1987) und des Plasmids pIM3002 als cotransformierendem Plasmid eingeführt. Eine Probe von A. niger NW219 wurde am 25. August 1995 bei CBS, Baarn, Niederlande, unter der Hinterlegungsnummer CBS 635.95 hinterlegt.
Protoplasten wurden aus Myzel hergestellt, indem man A. niger NW219 18 Stunden bei 30°C auf Minimalmedium züchtete, das mit 0,5% Hefeextrakt, 0,2% Casaminsäuren, 50 mM Glucose, 10 mM Nicotinamid und 10 mM Uridin ergänzt war. Die Präparation von Protoplasten A. niger NW219 und das Transformationsverfahren entsprachen den Angaben von Goosen et al., 1987. Die erhaltenen PYR⁺-Transformanten wurden auf die Expression des A. niger var niger-axdA-Gens durch Western-Blot-Analyse analysiert.
Beispiel 4.10.2
Screening von Transformanten auf die Expression des A. niger var niger-axdA-Gens
Die in Beispiel 4.10.1 erhaltenen Transformanten wurden auf die Bildung des A. niger var niger-axdA-Genprodukts, des AXDANIG-Proteins, analysiert. 19 dieser Transformanten wurden in einem Züchtungsversuch verwendet, um die AXDANIG-Expression zu analysieren. Der Stamm A. niger N402 wurde als Wildtypkontrolle verwendet. Die Transformanten wurden gemäß den Angaben in Beispiel 3.1 24, 40, 48 und 68 Stunden gezüchtet. Nach der Züchtung wurde das Myzel durch Filtration entfernt. Das Kulturfiltrat wurde durch Western-Blotting unter Verwendung von Antikörpern, die gegen AXDATUB in einem Kaninchen gebildet worden waren (Beispiel 4.1), analysiert. 8 der 19 analysierten Transformanten zeigten eine Überproduktion des AXDANIG-Proteins, wie durch dieses Verfahren nachgewiesen wurde.
Beispiel 4.11: Sequenzanalyse und Beschreibung des A. niger var niger-axdA-Gens
Die Sequenz des A. niger var niger-axdA-Gens, von dessen Promotor/Regulationsregion, des strukturellen Teils des Gens und der Terminationsregion wurde durch Subklonierung von Fragmenten aus pIM3002 in pBluescript SK- und pUC19 in Kombination mit der Verwendung von speziellen Oligonucleotiden als Primer bei den Sequenzierungsreaktionen bestimmt. Die Nucleotidsequenz wurde gemäß den Angaben in Beispiel 4.4 bestimmt (SEQ ID NO: 5).
Die erhaltene Sequenz umfasst 2101 bp, davon 783 bp in der 5'-nicht-kodierenden Region und 322 bp in der 3'-nicht-kodierenden Region. In der 5'-nicht-kodierenden Region findet sich eine TATA-Box in den Positionen 665–670. Der kodierende Teil des A. niger-axdA-Gens weist eine Länge von 996 bp auf und wird nicht durch Introns unterbrochen. Das Gen kodiert für ein Protein mit einer Größe von 332 Aminosäuren. Der N-terminalen Sequenz (bestimmt gemäß Beispiel 1.5.1 auf der Basis des A. niger var tubigensis AXDA-Proteins) geht ein Peptid mit einer Länge von 26 Aminosäuren voraus. Das reife Protein weist eine Größe von 306 Aminosäuren auf und besitzt ein vorhergesagtes Molekulargewicht von 33 101 kDa und einen theoretischen isoelektrischen Punkt von 4,07.
Beispiel 5.1: Klonierung eines cDNA-Fragments mit einem Gehalt an den erhaltenen A. niger var. tubigensis-axdA-Sequenzen durch PCR
Beispiel 5.1.1: Erzeugung von cDNA-Fragmenten durch PCR
Die partielle Aminosäuresequenz des internen CNBr-Fragments (SEQ ID NO: 2) gemäß Bestimmung für AXDATUB wurde zum Aufbau eines Oligonucleotidgemisches verwendet. Es wurde das folgende Gemisch erhalten:
5'-ATG ATK GTI GAR GCI ATK GG-3' (20-mer) SEQ ID NO: 3, wobei I Inosin bedeutet, K die Bedeutung A, T oder C hat und R die Bedeutung A oder G hat. Dieses Oligonucleotid war von der internen Aminosäuresequenz von AXDATUB, gemäß vorstehendem Beispiel 1.4.2, von der Aminosäure 1 (I) bis zu Aminosäure 6 (G) abgeleitet. Das ATG war von Methionin abgeleitet, von dem bekannt ist, dass es am N-terminalen Ende des Peptidfragments aufgrund des CNBr-Spaltungsmechanismus vorhanden ist.
Das Oligonucleotidgemisch wurde bei der PCR (Saiki et al., 1988) in Kombination mit dem Oligonucleotid T7 (Stratagene) 5'-AAT ACG ACT CAC TAT AG-3' (17-mer) (SEQ ID NO: 4) unter Verwendung von cDNA, die gemäß Beispiel 4.7 isoliert worden war, verwendet.
Für eine PCR wurden 2 μl der erhaltenen λ-cDNA mit 5 μl 10 * Reaktionspuffer (100 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl₂, 0,01% Gelatine), 4,0 μl 1,25 mM der einzelnen vier Desoxynucleotidtriphosphate und 0,5 μg der Oligonucleotide in einem Endvolumen von 50 μl vereinigt. Nach dem Vermischen wurde das Reaktionsgemisch mit 0,5 μl TAQ-Polymerase (5 U/μl) (HT Biotechnology, Cambridge, UK) versetzt. Die DNA wurde durch 3-minütige Inkubation bei 95°C einer Wärmedenaturierung unterzogen, wonach sich 25 Zyklen von 1 Minute bei 95°C, 1 Minute bei 42°C und 1 Minute bei 72°C anschlossen. Nach diesen 25 Zyklen wurde das Gemisch 5 Minuten bei 72°C inkubiert. Eine Analyse der Reaktionsprodukte ergab zwei einzelne Produkte von etwa 500 bp und 600 bp. Auf der Grundlage des scheinbaren Molekulargewichts von 32 kDa für AXDA und eines scheinbaren Molekulargewichts von 9 kDa für das CNBr-Peptid bewegte sich das Fragment in den erwarteten Grenzen.
Beispiel 5.1.2 Klonierung und Analyse der 500 bp- und 600 bp-PCR-Fragmente
Beispiel 5.1.2.1: Klonierung der 500 bp- und 600 bp-PCR-Fragmente
Die 500 bp- und 600 bp-PCR-Fragmente wurden der Ligation in einen pGEMR-T-Vektor (Promega) gemäß den Anweisungen des Herstellers unterworfen. Nach 16-stündiger Inkubation bei 14°C wurden 4,5 μl des Ligationsgemisches zur Transformation von kompetenten E. coli DHSα-Zellen verwendet. Eine Auswahl von sechs der erhaltenen Kolonien einer jeder Ligation wurde über Nacht in LB-Medium mit einem Gehalt an 100 μg/ml Ampicillin gezüchtet. Aus den Kulturen wurde Plasmid-DNA durch ein alkalisches Lysisverfahren gemäß den Angaben von Maniatis et al., (1982, S. 368–369) isoliert.
Beispiel 5.1.2.2: Sequenzanalyse der 500 bp- und 600 bp-PCR-Fragmente
Die Primärstrukturen sowohl des 500 bp- als auch des 600 bp-PCR-Fragments wurden durch Sequenzierung der Fragmente gemäß den Angaben in Beispiel 4.4 bestimmt.
Eine Computeranalyse der Nucleotidsequenzen beider PCR-Fragmente ergab, dass das 600 bp-PCR-Fragment keinerlei Ähnlichkeit mit bekannten Genen für Arabinoxylan abbauende Enzyme aufwies und daher als ein PCR-Artefakt angesehen wurde. Die Nucleotidsequenz des 500 bp-PCR-Fragments wies eine hohe Ähnlichkeit mit der Nucleotidsequenz des in 4 dargestellten cDNA-Klons von Nucleotid 706 bis 1204 auf.
Beispiel 5.2: ³²P-Markierung des 500 bp-PCR-Fragments
Das durch PCR erhaltene 500 bp-Fragment wurde gemäß den Angaben in EP-A-0 463 706 A1 (Az.: 91205944.5, Beispiele 2.2 und 7.1) isoliert und markiert.
Beispiel 5.3: Screening der A. niger var tubigensis-Genombibliothek auf das-axdA-Gen
Zum Screening der A. niger var tubigensis-Genombibliothek, die gemäß EP-A-0 463 706 Al (Az.: 91205944.5, Beispiel 2) konstruiert worden war, auf das-axdA-Gen wurden 3 × 10³ pfu pro Platte gemäß Beispiel 4.6 mit dem gemäß Beispiel 5.1.1. als Sonde hergestellten, mit ³²P markierten 500 bp-PCR-Fragment ausgestrichen.
Drei der Hybridisierungsplaques, die doppelt auf den Replikafiltern auftraten, wurden identifiziert und als λ_tubaxh1 bis λ_tubaxh3 bezeichnet. Die Phagen wurden gemäß Beispiel 4.6 isoliert und vermehrt.
Beispiel 5.4: Southern-Analyse von A. niger var tubigensis axdA-DNA enthaltenden Phagen
DNA wurde gemäß Beispiel 4.7 aus lambda-Bakteriophagen isoliert. Die isolierte DNA der Phagen λ_tubaxd1 bis λ_tubaxd3 wurde durch Southern-Analyse unter Verwendung der folgenden Restriktionsenzyme analysiert: BamHI, EcoRI, HindIII, KpnI, SalI, SstI und XhoI. Die Southern-Analyse wurde gemäß Beispiel 4.8 durchgeführt.
Aus den erhaltenen Ergebnissen wurde geschlossen, dass die DNA sämtlicher drei isolierten Klone mit der A. niger var tubigensis axdA-cDNA hybridisierte. In sämtlichen drei Klonen wurden Fragmente gefunden, die aus der gleichen Genomregion stammten.
Beispiel 5.5: Subklonierung des A. niger var tubigensis axdA-DNA-Gens
Das 5,5 kb SstI-Fragment von λ_tubaxd3 wurde isoliert und in den Vektor pBluescript SK-SstI, der gemäß Beispiel 4.9 verdaut und dephosphoryliert worden war, ligiert, wodurch man ein Plasmid mit der Bezeichnung pIM3001 erhielt. Das Plasmid pIM3001 wurde ferner durch Restriktionsenzyme analysiert, wodurch man die in 6 dargestellte Restriktionskarte erhielt. Eine Probe von E. coli DH5a, die pIM3001 enthielt, wurde am 28. August 1995 bei CBS, Baarn, Niederlande, unter der Hinterlegungsnummer CBS 636.95 hinterlegt.
Beispiel 5.6: Expression des klonierten A. niger var tubigensisaxdA-Gen in A. niger NW219
Beispiel 5.6.1: Einführung des A. niger var tubigensis-axdA-Gens in A. niger NW219 durch Cotransformation
Das Plasmid pIM3001, das in Beispiel 5.5 erhalten worden war, wurde durch Cotransformation von A. niger NW219, das in Beispiel 9.10.1 beschrieben worden war, in A. niger eingeführt. Die erhaltenen PYR⁺ Transformanten wurden sodann auf die Expression von A. niger var tubigensis-axdA-Gen durch Western-Blot-Analyse analysiert.
Beispiel 5.6.2: Screening von Transformanten auf die Expression des A. niger var tubigensis-axdA-Gens
Die in Beispiel 5.6.1 erhaltenen Transformanten wurden auf die Bildung des A. niger var tubigensis-axdA-Genprodukts, das AXDA_TUB-Protein, analysiert. 19 dieser Transformanten wurden in einem Züchtungsversuch zur Analyse der AXDATUB-Expression verwendet. Der Stamm A. niger N402 wurde als Wildtypkontrolle verwendet. Die Transformanten wurden gemäß Beispiel 3.1 20, 41, 60 und 86 Stunden gezüchtet. Nach der Züchtung wurde das Myzel durch Filtration entfernt. Das Kulturfiltrat wurde durch Western-Blotting unter Verwendung von in einem Kaninchen erzeugten Antikörpern gegen AXDATUB (Beispiel 4.1) analysiert. 12 der 19 analysierten Transformanten erzeugten das AXDA_TUB-Protein, das durch dieses Verfahren nachgewiesen wurde.
Beispiel 5.7: Sequenzanalyse und Beschreibung des A. niger var tubigensis-axdA-Gens
Die Sequenz des A. niger var tubigensis-axdA-Gens, von dessen Promotor/Regulationsregion, des strukturellen Teils des Gens und der Terminationsregion wurde durch Subklonierung von Fragmenten aus pIM3001 in pBluescript SK^– und pUC19 in Kombination mit der Verwendung von spezifischen Oligonucleotiden als Primer bei den Sequenzierungsreaktionen bestimmt. Die Nucleotidsequenz wurde gemäß Beispiel 4.4 bestimmt (vergl. SEQ ID NO: 7).
Die erhaltene Sequenz umfasst 2859 bp, und zwar 823 bp in der 5'-nicht-kodierenden Region und 1041 bp in der 3'-nicht-kodierenden Region. In der 5'-nicht-kodierenden Region findet sich eine CAAT-Box an den Positionen 651–655 und eine TATA-Box in den Positionen 713–720. Der kodierende Teil des A. niger var tubigensis-axdA-Gens weist eine Länge von 996 bp auf und ist nicht durch Introns unterbrochen. Das Gen kodiert für ein Protein mit einer Größe von 332 Aminosäuren. Der N-terminalen Sequenz gemäß Bestimmung in Beispiel 1.5.1 geht ein Vorpeptid mit einer Länge von 26 Aminosäuren voraus. Das reife Protein weist eine Größe von 306 Aminosäuren auf und besitzt ein vorhergesagtes Molekulargewicht von 33 250 kDa und einen theoretischen isoelektrischen Punkt von 4,20.
Beispiel 6: In vitro-Verdau von Mais mit AXDA
Beispiel 6.1
Isolierung von in Wasser unlöslichen Feststoffen (WIS)
Für das in vitro-Verdauungssystem wurde die unlösliche Polymerfraktion von Mais isoliert. Mais wurde in einer Retsch-Mühle gemahlen (3 mm) und 6 Stunden mit Hexan entfettet (Soxhlet-Konstruktion für die Destillation). Nach der Entfettung wurde der Mais bei 105°C getrocknet und erneut gemahlen (1 mm, Retsch-Mühle). 400 g des entfetteten Maises wurden mit 1,5 Liter 1,5% SDS/0,05% β-Mercaptoethanol versetzt und 1 Stunde bei Raumtemperatur (zum Aufbrechen der Proteine) gerührt, wonach sich eine 15-minütige Zentrifugation mit 24 000 g anschloss. Nach der Denaturierung des Proteins wurde das Pellet 3-mal mit 1 Liter SDS/β-Mercaptoethanol und 2-mal mit 1 Liter entmineralisiertem Wasser gewaschen. Das Pellet wurde in 4 Liter entmineralisiertem Wasser resuspendiert und durch ein 32 μm-Sieb gesiebt.
Der Waschvorgang und das Sieben wurden wiederholt. Das Pellet aus der rohen WIS-Fraktion (größer als 32 μm) wurde in 1 Liter Maleatpuffer (pH-Wert 6,5) gelöst und 50 Minuten bei 90°C inkubiert. 2 mg α-Amylase (Maxamyl^R, Gist-brocades) wurden zugesetzt und 16 Stunden bei 30°C inkubiert. Anschließend wurde 15 Minuten zentrifugiert (24 000 g). Die enzymatische Verdauung wurde wiederholt, wonach das Pellet 3-mal mit entmineralisiertem Wasser von 65°C gewaschen wurde. Sodann wurde das Pellet (WIS) gefriergetrocknet. Die WIS enthielten 30% Xylose, 29% Arabinose, 23% Glucose und 7% Galactose. Bei der Glucose wurde festgestellt, dass es sich nicht um Stärke handelte (Boehringer Mannheim, Stärke-Testpackung).
Beispiel 6.2
In vitro-Geflügel-Verdauungssystem
Der Trockenmassegehalt von WIS wurde durch Bestimmung des WIS-Gewichts vor und nach Trocknen bei 120°C zu 95,73% bestimmt.
In einem in vitro-Geflügel-Verdauungssystem wurde 1 g WIS mit 200 μg NaN₃ (Merck) und 1 ml internem Standard (Sorbit, 35 mg/ml, Sigma) versetzt. Für die enzymatische Getreideverdauung (mit (200 μg Protein) oder ohne Enzym) wurde die Probe mit Puffer (NaAc, pH-Wert 5,5) auf 15 ml aufgefüllt und 1 Stunde bei 39°C inkubiert. Für die Magenverdauung wurden 5 ml Pepsin (5,28 g/Liter, pH-Wert 3,0, Merck) zugegeben und 1,5 Stunden bei 39°C inkubiert. Für die Darmverdauung wurden 2,5 ml Pancreatin/Gallensalze (16 g bzw. 0,1 g/Liter, Merck) zugegeben und 1,5 Stunden bei 39°C inkubiert. Die Probe wurde 15 Minuten zentrifugiert (2800 g). Der Überstand wurde zur Messung der Monozucker verwendet (HPLC, Spectra Physics, HPX-87P-Säule, Biorad), die während der enzymatischen Verdauung freigesetzt worden waren. Das Pellet wurde bei 120°C getrocknet. Das Gewicht wurde bestimmt. Der prozentuale Trockenmasseanteil wurde berechnet.
Als Kontrolle wurde im in vitro-System eine Dosis-Wirkungs-Kurve des rohen Enzympräparats aufgestellt (die Ergebnisse sind in 3 dargestellt). Das AXDA-Enzym (200 μg AXDA-Protein wurden zugegeben) zeigte im Vergleich zum Leerwert einen erheblichen Anstieg der Trockenmasse-Verdauung.
Der prozentuale Anteil der Trockenmasse-Verdauung von 15,8% bei der Mais-WIS-Fraktion stellte einen Anstieg von 4,1% gegenüber dem Leerwert-Mais-WIS dar.
Beispiel 7: In vitro-Verdauungsversuch mit Mais-WIS
Beispiel 7.1
Isolierung von Mais-WIS
Die Isolierung von Mais-WIS wurde gemäß Beispiel 6 mit einigen Modifikationen durchgeführt, und zwar aufgrund der SDS/Mercaptoethanol-Inkubation, die auf Tierfutter nicht angewendet werden kann. Das Isolierungsverfahren wurde mit 1 kg entfettetem Mais durchgeführt. 1 kg entfetteter Mais wurde mit 4 g Papain (Gistbrocades)/100 g Maisprotein versetzt und 2 Stunden bei 30°C suspendiert. Anschließend wurde die Suspension mit Maxamyl^R (Gist-brocades) (2 ml/Liter) bei 100°C verdaut und zentrifugiert (15 Minuten bei 24 000 g). Der Überstand wurde verworfen. Das enzymatische Verdauungsverfahren wurde am Pellet wiederholt. Die Suspension wurde erneut zentrifugiert und 3-mal mit entmineralisiertem Wasser (1 Liter) gewaschen. Nach dem Waschen wurde das Pellet (wasserunlösliche Feststoffe) gefriergetrocknet.
Der Gehalt an Mono/Oligosacchariden in Mais-WIS wurde durch Analyse mit Trifluoressigsäure (TFA) bestimmt. 0,3 g WIS wurden mit 1 ml 35 mg/ml-Sorbitlösung (interner Standard), 2 ml entmineralisiertem Wasser und 450 μl TFA versetzt, wonach sich eine 1-stündige Hydrolyse bei 120°C anschloss. Nach Abkühlen wurden 20 ml entmineralisiertes Wasser zugegeben. Der Hydrolysevorgang wurde 1 Stunde bei 120°C fortgesetzt. Nach Abkühlen wurden die Proben gefriergetrocknet und in 3 ml entmineralisiertem Wasser resuspendiert. Die Monosaccharide wurden an einer HPX-87P-Säule (Biorad) in einem HLPC-System (Spectra Physics) entfernt. Die WIS-Polymerfraktion von Mais enthielt folgende Bestandteile: 124,8 mg/g Xylose, 96,6 mg/g Arabinose, 28,2 mg/g Galactose und 156,0 mg/g Glucose. Aufgrund des hohen Glucosegehalts wurde die WIS-Fraktion auf Stärke (Stärke-Testpackung, Boehringer Mannheim) analysiert. Es wurde festgestellt, dass die WIS-Fraktion keine Stärke enthielt.
Beispiel 7.2: Verdauungsversuch mit Broilern
Ein Versuch wurde durchgeführt, um den Einfluss des Enzyms AXDA auf den echten metabolisierbaren Energiegehalt einer Nahrung, die mit 20% WIS aus Mais versetzt war, zu bestimmen. Beim eingesetzten Verfahren handelte es sich um einen modifizierten "Sibbald-Test".
Männliche Broiler (Alter 3 Wochen) wurden einzeln in Käfigen in einem in Bezug auf die Umgebungsbedingungen kontrollierten Raum gehalten. Die Tiere wurden 48 Stunden ohne Nahrung gehalten. Sodann wurden sie mit Hilfe eines Schlauches mit einer genau bestimmten Futtermenge gefüttert. Zur Korrektur auf den Verlust von endogenen, energiehaltigen Komponenten wurde beim Versuch eine Kontrollgruppe mitgeführt. Diese Tiere erhielten 10 g D-Glucose, während die übrigen Tiere 10 g Futter erhielten. Jedes Futter wurde an 6 Tiere verabreicht. Die Glucose-Kontrollgruppe bestand aus 5 Tieren.
Die Tiere wurden weitere 48 Stunden ohne Nahrung gehalten. Während dieser Zeitspanne wurden die Exkrete quantitativ gesammelt. Die Exkrete wurden bis zur Durchführung der Analyse bei –20°C gelagert. Während dieser Periode stand den Tieren 1-mal Wasser zur Verfügung, wobei sie ein weiteres Mal Wasser mit einem Schlauch erhielten.
Die gesammelten Verdauungsprodukte wurden gefriergetrocknet und nach Äquilibration an der Luft gewogen. In den Futterproben und in den Proben der Verdauungsprodukte wurde eine Analyse auf Trockenmasse, Stickstoff und Energiegehalt durchgeführt.
Die Ergebnisse der Kontrolltiere wurden zur Korrektur der Ergebnisse der mit der Versuchsnahrung gefütterten Tiere verwendet. Bei dem Verfahren handelte es sich um eine Adaptation der von McNab und Blair, 1988) beschriebenen Experimente. In diesem Artikel findet sich eine Beschreibung der Analysen- und Berechnungsverfahren.
Ferner wurden Messungen der in vitro-Trockenmasse-Verdaubarkeit gemäß dem in Beispiel 6.2 beschriebenen Verfahren durchgeführt.
Folgende experimentellen Behandlungen wurden vorgenommen:
I: Mais-Grundfutter (Tabelle 2)
II: Mais-Grundfutter + 10% Mais WIS
III: Mais-Grundfutter + 20% Mais WIS
IV: Mais-Grundfutter + 20% Mais WIS + 100 mg/kg AXDA
V: Mais-Grundfutter + 20% Mais WIS + 95 mg/kg rohes Enzym
VI: Mais-Grundfutter + 20% Mais WIS + 90 mg/kg rohes Enzym
VII: Mais-Grundfutter + 20% Mais WIS + 200 mg/kg Endoxylanase
In Tabelle 2 ist die Zusammensetzung der Grunddiät angegeben.
Tabelle 2 Zusammensetzung der beim Versuch verwendeten Grunddiät
Die Ergebnisse (auf Stickstoff korrigierte echte metabolisierbare Energie (TMEn) und die Ergebnisse des in vitro-Tests) sind in Tabelle 3 aufgeführt.
Tabelle 3 Echte metabolisierbare Energie (auf Stickstoff korrigiert: (TMEn) und in vitro-Trockenmasse-Verdaubarkeit
Das TMEn-Niveau nahm bei zunehmender Mais-WIS-Zugabe signifikant ab. Sämtliche Enzympräparate führten zu einer Verbesserung der TMEn-Werte, diese waren jedoch nur bei Endoxylanase (+7%) und bei AXDA (+10,7%) signifikant. Gemäß den Mittelwerten verbesserte AXDA den Energiewert auf das Niveau des mit 10% Mais-WIS ergänzten Grundfutters.
Im in vitro-Modell (unter Simulation des Verdauungsvorgangs bei Hühnern) verbesserte AXDA die Trockenmasse-Verdauung erheblich (+24,5%). Endoxylanase und das rohe Enzympräparat waren bei diesem Modell nicht so wirksam wie AXDA.
Beispiel 8: AXDA beim Brotbacken
AXDA wurde in einem Brotlaib-("puploaf")-Backtest unter Verwendung von Dosenbrot getestet. Laibe wurden aus Teigstücken von 150 g, die durch Vermischen von 200 g Mehl (Robijn^R/Columbus^R 80/20), 104 ml Wasser, 1,4 g Bäcker-Trockenhefe (Fermipan^R), 4 g Salz, 3 g Zucker, 400 mg CaCl₂·2H₂O, 3 mg (15 ppm) Ascorbinsäure und 5 mg (25 ppm) Pilz-alpha-Amylase (Fermizyme^R P200) und 25 μg gereinigtem AXDA erhalten worden waren. Nach 6-minütigem Vermischen und einer Behandlung von 15 Sekunden mit 52 U/min in einem Stiftmischer wurde der Teig aufgeteilt, 45 Minuten bei 30°C gehen gelassen, geschlagen, weitere 25 Minuten gehen gelassen, geformt und in Formen gegeben. Nach einer weiteren Gehzeit von 70 Minuten bei 30°C wurde der Teig 20 Minuten bei 225°C gebacken. Das Laibvolumen wurde durch das Rapssamen-Verdrängungsverfahren bestimmt. Das Laibvolumen nahm von 490 ml (Kontrolle) auf 535 ml für Laibe mit einem Gehalt an AXDA zu, d. h. es ergab sich eine Zunahme von 9%.
Literatur
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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

DNA-Fragment, umfassend eine Nucleotidsequenz, die für ein Polypeptid, das (1,4)-β-D-Arabinoxylan-arabinofuranohydrolase-Aktivität aufweist, das aber keine Endoxylanase- und keine α-Arabinofuranosidase-Aktivität aufweist, oder für einen Polypeptid-Vorläufer davon kodiert, dadurch gekennzeichnet, dass die Nucleotidsequenz ausgewählt ist aus: (a) einer Nucleotidsequenz, die für ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz gemäß den Aminosäuren 1 bis 306 oder einen Polypeptidvorläufer dieses Polypeptids gemäß den Aminosäuren –27 bis 306 in SEQ ID NO: 5 kodiert; (b) einer Nucleotidsequenz, die für ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz gemäß den Aminosäuren 1 bis 306 oder einen Polypeptidvorläufer dieses Polypeptids gemäß den Aminosäuren –27 bis 306 in SEQ ID NO: 7 kodiert; (c) einer Nucleotidsequenz gemäß den Nucleotiden 784 bis 1779 in SEQ ID NO: 5 oder gemäß den Nucleotiden 823 bis 1818 in SEQ ID NO: 7; (d) einer Nucleotidsequenz, die für ein Polypeptid, das (1,4)-β-D-Arabinoxylan-arabinofuranohydrolase-Aktivität aufweist, aber keine Endoxylanase- und keine α-Arabinofuranosidase-Aktivität aufweist, kodiert, wobei die Nucleotidsequenz zur Hybridisierung mit einem DNA-Fragment gemäß den Nucleotiden 784 bis 1779 in SEQ ID NO: 5 oder gemäß den Nucleotiden 823 bis 1818 in SEQ ID NO: 7 unter Hybridisierungsbedingungen befähigt ist, die einen ersten Waschvorgang bei 65°C für 30 Minuten in 5 X SSC/0,1% SDS, einen anschließenden zweiten Waschvorgang bei 65°C für 30 Minuten in 2 X SSC/0,1% SDS, einen anschließenden dritten Waschvorgang bei 65°C für 30 Minuten in 0,1 X SSC/0,1% SDS und einen anschließenden vierten Waschvorgang bei 65°C für 30 Minuten in 0,1 X SSC umfassen.
DNA-Fragment nach Anspruch 1, wobei die Nucleotidsequenz, die für ein Polypeptid mit (1,4)-β-D-Arabinoxylanarabinofuranohydrolase-Aktivität kodiert, aus einem filamentösen Pilz erhältlich ist.
DNA-Fragment nach Anspruch 2, wobei es sich bei dem filamentösen Pilz um eine Aspergillus-Spezies handelt.
DNA-Fragment nach Anspruch 3, wobei es sich bei der Aspergillus-Spezies um Aspergillus niger oder tubigensis handelt.
DNA-Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Nucleotidsequenz, die für ein Polypeptid mit (1,4)-β-D-Arabinoxylan-arabinofuranohydrolase-Aktivität kodiert, funktionell mit den regulatorischen DNA-Sequenzen verknüpft ist, die für die Expression des DNA-Fragments in einer prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszelle erforderlich sind.
DNA-Fragment nach Anspruch 5, wobei die regulatorischen DNA-Sequenzen heterolog zu der Nucleotidsequenz sind, die für das Polypeptid mit (1,4)-β-D-Arabinoxylan-arabinofuranohydrolase-Aktivität kodiert.
DNA-Fragment nach Anspruch 6, wobei die heterologen regulatorischen DNA-Sequenzen so ausgewählt sind, dass sie die Expression des DNA-Fragments in einem Wirt verstärken, verglichen mit der Expression des DNA-Fragments in diesem Wirt bei Verknüpfung mit dessen homologen regulatorischen DNA-Sequenzen.
DNA-Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 7, das in Form eines Vektors vorliegt.
Eukaryontische oder prokaryontische Wirtszelle, transformiert mit einem DNA-Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Wirtszelle zu einer verstärkten Expression eines Polypeptids mit (1,4)-β-D-Arabinoxylanarabinofuranohydrolase-Aktivität im Vergleich mit der untransformierten Wirtszelle befähigt ist.
Transformierte Wirtszelle nach Anspruch 9, wobei der Wirt zur Gattung Aspergillus gehört.
Verfahren zur Gewinnung einer Wirtszelle, die zu einer verstärkten Expression eines Polypeptids mit (1,4)-β-D-Arabinoxylan-arabinofuranohydrolase-Aktivität befähigt ist, indem man eine Wirtszelle unter transformierenden Bedingungen mit einem rekombinanten DNA-Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 8 behandelt und eine Selektion in bezug auf die verstärkte Expression des Polypeptids mit (1,4)-β-D-Arabinoxylan-arabinofuranohydrolase-Aktivität vornimmt.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei es sich bei der Wirtszelle um eine Wirtszelle einer Aspergillus-Spezies handelt.
Verfahren zur Gewinnung eines Polypeptids mit (1,4)-β-D-Arabinoxylan-arabinofuranohydrolase-Aktivität, umfassend folgende Stufen: Züchten von transformierten Wirtszellen, die zur Erzeugung des Polypeptids unter Bedingungen, die zu dessen Bildung führen, befähigt sind, und Gewinnen des Polypeptids, dadurch gekennzeichnet, dass die transformierten Wirtszellen mit einem DNA-Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 8 transformiert worden sind.
Futtermittel- oder Nahrungsmittelzusammensetzung, enthaltend ein immobilisiertes Polypeptid mit (1,4)-β-D-Arabinoxylan-arabinofuranohydrolase-Aktivität, jedoch ohne Endoxylanase- und ohne α-Arabinofuranosidase-Aktivität, wobei das Polypeptid nach dem Verfahren von Anspruch 13 erhältlich ist.
Verwendung eines Polypeptids mit (1,4)-β-D-Arabinoxylanarabinofuranohydrolase-Aktivität, aber ohne Endoxylanase- und ohne α-Arabinofuranosidase-Aktivität als Futtermittel- oder Nahrungsmittelzusatz, wobei das Polypeptid nach dem Verfahren von Anspruch 13 herstellbar ist.
Verwendung eines Polypeptids nach Anspruch 15 beim Backen von Brot.