DE69728863T2

DE69728863T2 - Enzym mit pektin-esterase-aktivität

Info

Publication number: DE69728863T2
Application number: DE69728863T
Authority: DE
Inventors: Nonboe Lene ANDERSEN; Sakari Markus KAUPPINEN; Gitte Budolfsen
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1996-02-21
Filing date: 1997-02-18
Publication date: 2004-09-02
Anticipated expiration: 2017-02-19
Also published as: JP2000504587A; US6069000A; EP0885295B1; ATE265527T1; DE69728863D1; EP0885295A1; WO1997031102A1; CN1229495C; ES2219752T3; AU1719497A; JP4243348B2; CN1212010A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Enzym mit Pektinesterase-Aktivität, ein DNA-Konstrukt, das das Enzym mit der Pektinesterase-Aktivität kodiert, ein Verfahren zur Herstellung des Enzyms, eine Enzymzusammensetzung, die das Enzym mit der Pektinesterase-Aktivität umfasst und die Verwendung des Enzyms und der Enzymzusammensetzung für eine Vielzahl von industriellen Anwendungen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Pektin-Polymere sind wichtige Bestandteile von primären Pflanzenzellwänden. Sie sind aus Ketten von 1,4-verbundenen α-D-Galacturonsäure und methylierten Derivaten davon zusammengesetzt. Die Verwendung von Pektin-degradierenden Enzymen, wie z. B. Polygalacturonase, Pektin-Methylesterase, Pektin-Lyase oder Pektat-Lyase, ist wichtig für die Nahrungsmittelindustrie, hauptsächlich bei der Frucht- und Gemüseverarbeitung, wie z. B. der Fruchtsaftproduktion oder der Weinherstellung, wo ihre Fähigkeit, die Degradierung des Rückgrats des Pektinpolymers zu katalysieren, ausgenutzt wird.
Für viele Zwecke würde es wünschenswert sein, jedes der Pektin-abbauenden Enzyme, die zum Beispiel in kommerziellen Zubereitungen, die eine Vielzahl von verschiedenen Pektin-abbauenden Enzymen enthalten (ein Beispiel einer solchen Zubereitung ist Pectinex Ultra SP^®, zubereitet aus Aspergillus aculeatus, erhältlich von Novo Nordisk A/S), in einer Form zur Verfügung zu stellen, die frei von anderen Bestandteilen ist. Auf diese Art und Weise würde es möglich sein, Enzymzubereitungen herzustellen, die für bestimmte Zwecke geeignet sind, solche Zubereitungen enthalten entweder ein einzelnes Pektin-abbauendes Enzym oder beliebige Kombinationen davon. Um das zu erreichen, ist es komfortabel, Einzel bestandteil-Pektin-degradierende Enzyme durch rekombinante DNA-Techniken zur Verfügung zu stellen. Pektin-Methylesterase (EC 3.1.1.11) katalysiert die Entfernung von Methanol aus Pektin, resultierend in der Bildung von Pektinsäure (Polygalacturonsäure).
Pektin-Methylesterasen werden von einer Vielzahl von Mikroorganismen hergestellt und sind auch in Blättern, Wurzeln, Stengeln und Früchten von vielen höheren Pflanzen gefunden worden. Mikrobielle Pektin-Methylesterasen sind von Khanh et al. (1990) kloniert worden "Nucleotide and derived amino acid sequence of a pectinesterase cDNA isolated from Aspergillus niger strain RH5344", Nucleic Acids Res. 18: 4262; Khanh et al. (1991) "Characterization and expression of a genomic pectin methyl esterase-encoding gene in Aspergillus niger", Gene 106: 71–77; Spok et al. (1991) "Molecular cloning and sequencing of a pectinesterase gene from Pseudomonas solanacearum", J. Gen. Microbiol. 137: 131–140; Plastow 81988) "Molecular cloning and nucleotide sequence of the pectin methyl esterase gene of Erwinia chrysanthemi B374", Mol. Microbiol. 2: 247–254; Laurent et al. (1993) "Characterization and overexpression of the pem gene encoding pectin methylesterase of Erwinia chrysanthemi strain 3937", Gene 131: 17–25; Tierny et al. (1994) "Molecular cloning and expression in Escherichia coli of genes encoding pectate lyase and pectin methylesterase activities from Bacteroides thetaiotaomicron", J. Appl. Bacteriol. 76: 592–602.
WO 94/25575 beschreibt die Klonierung einer Pektin-Methylesterase aus Aspergillus aculeatus.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Gemäß der vorliegenden Erfindung waren die Erfinder bei der Isolierung und Charakterisierung einer DNA-Sequenz aus einem Basidiomycota-Pilz, welcher ein Enzym kodiert, das Pektin-Methylesterase, auch bekannt als Pektinesterase- Aktivität, zeigt, nun erfolgreich, wodurch es möglich wurde, eine Mono-Bestandteil-Pektinesterase-Zusammensetzung herzustellen.
Demgemäß betrifft die Erfindung in einem ersten Aspekt ein DNA-Konstrukt, das eine DNA-Sequenz, die ein Enzym kodiert, welches Pektinesterase-Aktivität zeigt, umfasst, wobei die DNA-Sequenz umfasst

(a) den Pektinesterase-kodierenden Teil der DNA-Sequenz, kloniert in Plasmid pYES 2.0, vorliegend in E. coli DSM 10357, oder
(b) ein Analogon der in (a) definierten DNA-Sequenz, welche
(i) zu mindestens 60% homolog ist zu der in (a) definierten DNA-Sequenz oder
(ii) mit der in den Positionen 4–933 in SEQ ID NR: 1 gezeigten DNA-Sequenz bei niedriger Stringenz hybridisiert, oder
(iii) ein Polypeptid kodiert, welches zu mindestens 50% homolog ist zu dem Polypeptid, kodiert von einer DNA-Sequenz, welche die in (a) definierte DNA-Sequenz umfasst, oder
(iv) ein Polypeptid kodiert, welches immunologisch reaktiv ist mit einem Antikörper, der gegen die aufgereinigte Pektinesterase, kodiert von der in (a) definierten DNA-Sequenz, erzeugt wurde.

Die volle Länge cDNA-Sequenz, die eine Pektinesterase kodiert, wurde von einem Stamm des filamentösen Pilzes Meripilus giganteus abgeleitet und wurde in Plasmid pYES 2.0, vorliegend in dem Escherichia coli-Stamm DSM Nr. 10357, kloniert.
Von der Pektinesterase-kodierenden DNA-Sequenz, beherbergt in E. coli DSM 10357, wird angenommen, dass sie die gleiche DNA-Sequenz hat wie die in SEQ ID NR: 1 vorliegende. Dementsprechend, wann immer Bezug genommen wird auf den Pektinesterase-kodierenden Teil der DNA-Sequenz, kloniert in Plasmid pYES 2.0, vorliegend in DSM 10357, ist es auch beabsichtigt, dass solcher Bezug den Pektinesterase-kodierenden Teil der in SEQ ID NR: 1 vorliegenden DNA-Sequenz miteinschließt.
Demgemäß können die Ausdrücke "der Pektinesterase-kodierende Teil der DNA-Sequenz, kloniert in Plasmid pYES 2.0, vorliegend in DSM 10357" und "der Pektinesterase-kodierende Teil der DNA-Sequenz, vorliegend in SEQ ID NR: 1" untereinander austauschbar verwendet werden.
In weiteren Aspekten stellt die Erfindung einen Expressionsvektor zur Verfügung, der das DNA-Konstrukt der Erfindung beherbergt, eine Zelle, die das DNA-Konstrukt umfasst, oder den Expressionsvektor und ein Verfahren zur Herstellung eines Enzyms, das Pektinesterase-Aktivität zeigt, welches Verfahren das Kultivieren der Zelle unter Bedingungen, die die Herstellung des Enzyms und die Wiedergewinnung des Enzyms aus der Kultur erlauben, umfasst.
In noch einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Enzym zur Verfügung, das Pektinesterase-Aktivität zeigt, welches Enzym

(a) durch ein DNA-Konstrukt der Erfindung kodiert wird; oder
(b) durch das Verfahren der Erfindung hergestellt wird; und/oder
(c) immunologisch reaktiv ist mit einem Antikörper, der gegen eine aufgereinigte Pektinesterase, kodiert durch den Pektinesterase-kodierenden Teil der DNA-Sequenz, kloniert in Plasmid pYES 2.0, vorliegend in E. coli DSM 10357, erzeugt wurde. In einer bevorzugten Ausführungsform hat das Enzym die abgeleitete Aminosäuresequenz SEQ ID NR: 2.

In noch einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Enzymzusammensetzung zur Verfügung, die zur Degradierung oder Modifizierung von Pflanzenmaterial oder Bestandteilen davon nützlich ist, die Zusammensetzung wurde mit einem Enzym, das wie oben beschrieben Pektinesterase-Aktivität zeigt, angereichert.
In noch einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Enzyms oder einer Enzymzusammensetzung der Erfindung für verschiedene industrielle Anwendungen.
Schließlich bezieht sich die Erfindung auf eine isolierte, im Wesentlichen reine biologische Kultur des E. coli-Stammes DSM Nr. 10357, welcher eine Pektinesterase-kodierende DNA-Sequenz beherbergt (den Pektinesterase-kodierenden Teil der DNA-Sequenz, kloniert in Plasmid pYES 2.0, vorliegend in E. coli DSM 10357), abgeleitet von einem Stamm des filamentösen Pilzes Meripilus giganteus, oder jeglicher Mutante des E. coli-Stammes, der die Fähigkeit zur Kodierung der Pektinesterase beibehalten hat; und auf eine isolierte, im Wesentlichen reine biologische Kultur des filamentösen Pilzes Meripilus giganteus CBS Nr. 521.95, aus welcher die DNA-Sequenz, wie in SEQ ID NR: 1 vorliegend, abgeleitet worden ist.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
DNA-Konstrukte
Die vorliegende Erfindung stellt ein DNA-Konstrukt zur Verfügung, das eine DNA-Sequenz, welche ein Enzym, welches Pektinesterase-Aktivität zeigt, kodiert, umfasst, wobei die DNA-Sequenz umfasst

(a) den Pektinesterase-kodierenden Teil der DNA-Sequenz, kloniert in Plasmid pYES 2.0, vorliegend in E. coli DSM 10357, oder
(b) ein Analogon der in (a) definierten DNA-Sequenz, welches
(i) zu mindestens 60% homolog ist zu der in (a) definierten DNA-Sequenz, oder
(ii) mit der in den Positionen 4 – 933 in SEQ ID NR: 1 gezeigten DNA-Sequenz bei niedriger Stringenz hybridisiert, oder
(iii) welches ein Polypeptid kodiert, welches zu mindestens 50% homolog ist zu dem Polypeptid, das von einer DNA-Sequenz kodiert wird, welche die in (a) definierte DNA-Sequenz umfasst, oder
(iv) welches ein Polypeptid kodiert, welches immunologisch reaktiv ist mit einem Antikörper, der gegen die aufgereinigte Pektinesterase, kodiert von der in (a) definierte DNA-Sequenz, erzeugt wurde.

Wie hierin definiert, ist eine DNA-Sequenz, die analog ist zu dem Pektinesterase-kodierenden Teil der DNA-Sequenz, kloniert in Plasmid pYES 2.0, vorliegend in E. coli DSM 10357, dazu bestimmt, jegliche DNA-Sequenz anzuzeigen, die ein Enzym kodiert, welches Pektinesterase-Aktivität zeigt, welches Enzym eine oder mehrere der unter (i)–(iv) oben zitierten Eigenschaften hat.
Die analoge DNA-Sequenz kann aus einem Stamm des filamentösen Pilzes Meripilus giganteus isoliert werden, der das Enzym mit Pektinesterase-Aktivität herstellt, oder einem anderen oder verwandtem Organismus, und so z. B. eine allele oder Artvariante des Pektinesterase-kodierenden Teils der DNA-Sequenz, kloniert in Plasmid pYES 2.0, vorliegend in E. coli DSM 10357, sein.
Alternativ kann die analoge Sequenz auf Grundlage der DNA-Sequenz, vorgelegt als der Pektinesterase-kodierende Teil von SEQ ID NR: 1, konstruiert werden, z. B. kann sie eine Untersequenz davon sein und/oder durch die Einführung von Nukleotidsubstitutionen, welche keine andere Aminosäuresequenz der von der DNA-Sequenz kodierten Pektinesterase zur Folge haben, aber welche dem Kodon-Gebrauch des Wirtsorganismus entsprechen, welche zur Herstellung des Enzyms bestimmt ist, oder durch Einführung von Nukleotid-Substitutionen, welche eine unterschiedliche Aminosäuresequenz zur Folge haben können.
Wenn Nukleotid-Substitutionen ausgeführt werden, sind Aminosäure-Veränderungen bevorzugt von kleinerer Natur, d. h. konservative Aminosäure-Substitutionen, die nicht signifikant die Faltung oder die Aktivität des Proteins betreffen, kleine Deletionen, typischerweise von einer bis ungefähr 30 Aminosäuren; kleine Amino- oder Carboxyl-terminale Extensionen, wie z. B. ein Amino-terminaler Methioninrest, ein kleines Linker-Peptid von bis zu ungefähr 20 bis 25 Resten, oder eine kleine Extension, welche die Aufreinigung erleichtert, wie z. B. ein Polyhistidinteil, ein antigenes Epitop oder eine Bindungsdomäne.
Beispiele von konservativen Substitutionen sind innerhalb der Gruppe der basischen Aminosäuren (wie z. B. Arginin, Lysin, Histidin), der sauren Aminosäuren (wie z. B. Glutaminsäure und Asparaginsäure), der polaren Aminosäuren (wie z. B. Glutamin und Asparagin), der hydrophoben Aminosäuren (wie z. B. Leucin, Isoleucin, Valin), der aromatischen Aminosäuren (wie z. B. Phenylalanin, Tryptophan, Tyrosin) und der kleinen Aminosäuren (wie z. B. Glycin, Alanin, Serin, Threonin, Methionin). Für eine allgemeine Beschreibung der Nukleotid-Substitution siehe z. B. Ford et al., (1991), Protein Expression and Purification 2, 95–107.
Es ist den Fachleuten klar, dass solche Substitutionen außerhalb von Regionen gemacht werden können, die kritisch sind für die Funktion des Moleküls, und immer noch in einem aktiven Polypeptid resultieren. Aminosäuren, die essentiell sind für die Aktivität des von dem DNA-Konstrukt der Erfindung kodierten Polypeptids, und deshalb bevorzugt nicht einer Substitution unterzogen werden, können gemäß Verfahren, die in der Technik bekannt sind, identifiziert werden, z. B. durch ortsspezifische Mutagenese oder Alanin-Scanning-Mutagenesis (vgl. Cunningham and Wells (1989), Science 244, 1081–1085). In der letzteren Technik werden Mutationen in jedem Rest des Moleküls eingeführt und das resultierende mutierte Molekül wird auf biologische Aktivität (z. B. Pektinesterase) getestet, um die Aminosäurereste zu identifizieren, die für die Aktivität des Moleküls kritisch sind. Stellen von Substrat-Enzym-Interaktion können auch durch Analyse der Kristallstruktur bestimmt werden, bestimmt durch solche Techniken wie Kernspinnresonanz, Kristallographie oder Fotoaffinitätsmarkierung (vgl. z. B. de Vos et al., (1992), Science 255, 306–312; Smith et al., (1992), J. Mol. Biol. 224, 899–904; Wlodaver et al., (1992), FEBS Lett. 309, 59–64).
Die Homologie, auf die in (i) oben Bezug genommen wird, wird bestimmt als das Mass der Identität zwischen den zwei Sequenzen, welcher eine Ableitung der ersten Sequenz von der zweiten anzeigt. Die Homologie kann geeigneterweise bestimmt werden mit Hilfe von Computerprogrammen, die in der Technik bekannt sind, wie z. B. GAP, zur Verfügung gestellt in dem GCG-Programmpaket (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (Needleman, S. B. and Wunsch, C. D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443–453). Verwendung von GAP mit den folgenden Einstellungen für den DNA-Sequenz-Vergleich: GAP Creation Penalty von 5.0 und GAP Extension Penalty von 0.3, die kodierende Region der DNA-Sequenz zeigt das Mass an Identität, vorzugsweise von mindestens 60%, mehr bevorzugt von mindestens 70%, mehr bevorzugt von mindestens 80%, mehr bevorzugt von mindestens 90%, mehr bevorzugt von mindestens 95%, und noch mehr bevorzugt bei mindestens 97% zu dem Pektinesterase-kodierenden Teil der in SEQ ID NR: 1 gezeigten DNA-Sequenz.
Die Hybridisierung, auf die in (ii) oben Bezug genommen wird, ist dazu bestimmt, anzuzeigen, dass die analoge DNA-Sequenz mit der gleichen Probe wie die DNA-Sequenz, die das Pektinesterase-Enzym kodiert, unter bestimmten spezifischen Bedingungen, welche im Detail im Material und Methodenteil nachfolgend beschrieben sind, hybridisiert. Die Oligonukleotidprobe, die verwendet werden muss, ist die DNA-Sequenz, die dem Pektinesterase-kodierenden Teil der SEQ ID NR: 1 gezeigten DNA-Sequenz entspricht.
Die Homologie, auf die in (iii) oben Bezug genommen wird, ist bestimmt als das Mass an Identität zwischen den zwei Sequenzen, anzeigend eine Ableitung der ersten Sequenz von der zweiten. Die Homologie kann geeigneterweise bestimmt werden mit Hilfe von Computerprogrammen, die in der Technik bekannt sind, wie z. B. GAP, zur Verfügung gestellt in dem GCG-Programmpaket (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Winsconsin, USA 53711) (Needleman, S. B. and Wunsch, C. D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443–453. Verwendung von GAP mit den folgenden Einstellungen zum Polypeptid-Sequenzvergleich: GAP Creation Penalty von 3.0 und GAP Extension Penalty von 0.1, das Polypeptid, kodiert durch eine analoge DNA-Sequenz, zeigt ein Mass an Identität bevorzugt von mindestens 50%, mehr bevorzugt von mindestens 60%, mehr bevorzugt von mindestens 70%, mehr bevorzugt von mindestens 80%, mehr bevorzugt von mindestens 90%, mehr bevorzugt von mindestens 95%, und speziell von mindestens 97% zu dem Enzym, das durch das DNA-Konstrukt, welches den Pektinesterase-kodierenden Teil der in SEQ ID NR: 1 gezeigten DNA-Sequenz umfasst, kodiert wird, zu der Aminosäuresequenz SEQ ID NR: 2.
Die vorliegende Erfindung gilt auch für Pektinesterase-Varianten, welche eine Aminosäuresequenz haben, welche sich durch nicht mehr als drei Aminosäuren von dem maturen Teil der in SEQ ID NR: 2 dargelegten Aminosäuresequenz unterscheidet, bevorzugt durch nicht mehr als zwei Aminosäuren und mehr bevorzugt durch nicht mehr als eine Aminosäure.
In Verbindung mit Eigenschaft (iv) kann die immunologische Reaktivität durch das im unteren Material und Methodenabschnitt beschriebene Verfahren bestimmt werden.
Die DNA-Sequenz, die eine Pektinesterase der Erfindung kodiert, kann aus dem Stamm Escherichia coli DSM 10357 unter Verwendung von Standardverfahren, z. B. wie beschrieben von Sambrook et al., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Lab.; Cold Spring Harbour, NY, isoliert werden.
Die DNA-Sequenz, die ein Enzym kodiert, welches Pektinesterase-Aktivität der Erfindung zeigt, kann auch durch ein allgemeines Verfahren isoliert werden, einschließend

– Klonieren einer cDNA-Bibliothek von jeglichem Organismus, von dein erwartet wird, interessierende Pektinesterase herzustellen, in geeignete Vektoren,
– Transformieren geeigneter Wirtshefezellen mit den Vektoren,
– Kultivieren der Wirtszellen unter geeigneten Bedingungen, um jegliches Enzym von Interesse, kodiert von einem Klon in der cDNA-Bibliothek, zu exprimieren,
– Screening nach positiven Klonen durch Bestimmen jeglicher Pektinesterase-Aktivität des von solchen Klonen hergestellten Enzyms, und
– Isolieren der Enzym-kodierenden DNA aus solchen Klonen.

Ein allgemeines Isolierungsverfahren ist in WO 93/11249 oder WO 94/14953 offenbart worden, die Inhalte davon sind hiermit durch Bezugnahme aufgenommen sind. Eine detailliertere Beschreibung des Screening-Verfahrens ist in Beispiel 1 unten gegeben.
Alternativ kann die DNA, die eine Pektinesterase-Aktivität kodiert, in Übereinstimmung mit wohl bekannten Prozeduren, in geeigneter An und Weise aus einer geeigneten Quelle isoliert werden, wie z. B. irgendeiner der unten genannten Organismen, unter Verwendung von synthetischen Oligonukleotidproben, die auf der Grundlage der hier offenbarten DNA-Sequenzen hergestellt wurden. Zum Beispiel kann eine geeignete Oligonukleotidprobe auf der Grundlage des Pektinesterase-kodierenden Teils der als SEQ ID NR: 1 präsentierten Nukleotid-Sequenzen oder jeder geeigneten Untersequenz davon, oder auf der Grundlage der Aminosäure-Sequenz SEQ ID NR: 2 hergestellt werden.
Mikrobielle Quellen
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die DNA-Sequenz, die die Pektinesterase kodiert, von einem Stamm abgeleitet, der zu der Polyporaceae-Familie gehört, welche gemäß dem Entrez-Browser NCBI Taxonomie-Version 3,3 (aktualisiert 95.12.13) eine Familie innerhalb der Ordnung Aphyllophorales ist, welche zu der Klasse der Hymenomyceten unter den Basidiomycota gehört.
Im Moment wird es in Erwägung gezogen, dass eine DNA-Sequenz, die ein Enzym kodiert, das homolog zu dem Enzym der Erfindung ist, z. B. eine analoge DNA-Sequenz, aus anderen Mikroorganismen erhalten werden kann. Zum Beispiel kann die DNA-Sequenz durch ein auf gleiche Art und Weise erfolgtes Screenen einer cDNA-Bibliothek eines anderen Mikroorganismus erhalten werden, wie z. B. eines Stammes von Aspergillus, Saccharomyces, Bacteroides, Erwinia, Pseudomonas oder Clostridium.
Ein Isolat eines Stammes von Meripilus giganteus, aus welchem eine Pektinesterase der Erfindung abgeleitet werden kann, ist von den Erfindern gemäß dem Budapester Übereinkommen über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zwecke des Patentverfahrens beim Centraalbureau voor Schimmelcultures, P.O. Box 273, 3740 AG Baarn, Niederlande (CBS) abgelegt worden.

Ablagedatum: 04.07.95

Ref. des Ablegers: NN006040

CBS-Bezeichnung: Meripilus giganteus CBS Nr. 521.95
Das Expressionsplasmid pYES 2.0, das die volle Länge cDNa-Sequenz enthält, die die Pektinesterase der Erfindung kodiert, wurde in einen Stamm von E. coli transformiert, welcher von den Erfindern gemäß dem Budapester Übereinkommen über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zwecke des Patentverfahrens bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 2b, D-38124 Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland, (DSM) abgelegt wurde.

Ablagedatum: 06.12.95

Ref. des Ablegers: NN049144

CBS-Bezeichnung: Escherichia coli DSM 10357
Expressionsvektoren
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung einen rekombinanten Expressionsvektor zur Verfügung, der das DNA-Konstrukt der Erfindung umfasst. Der Expressionsvektor der Erfindung kann jeglicher Expressionsvektor sein, der in geeigneter Art und Weise rekombinanten DNA-Verfahren unterworfen werden kann, und die Wahl des Vektors wird oft von der Wirtszelle abhängen, in welche er eingeführt werden muss. Folglich kann der Vektor ein autonom replizierender Vektor sein, z. B. ein Vektor, welcher als eine extrachromosomale Einheit existiert, die Replikation von diesem ist unabhängig von der chromosomalen Replikation, z. B. ein Plasmid. Alternativ kann der Vektor einer sein, der, wenn in eine Wirtszelle eingeführt, in das Wirtszellgenom integriert und zusammen mit dem Chromosom/mit den Chromosomen repliziert, in welche er integriert wurde.
In dem Expressionsvektor sollte die DNA-Sequenz, die Pektinesterase kodiert, funktionsfähig mit einer geeigneten Promotor- und Terminator-Sequenz verbunden sein. Der Promotor kann jegliche DNA-Sequenz sein, welche transkriptionelle Aktivität in der Wirtszelle der Wahl zeigt und kann von Genen abgeleitet sein, welche Proteine kodieren, welche entweder homolog oder heterolog zu der Wirtszelle sind. Die verwendeten Verfahren, um die DNA-Sequenzen, die die Pektinesterase kodieren und den Promotor bzw. den Terminator zu ligieren, sind Facharbeitern wohl bekannt (vgl. z. B. Sambrook et al., (1989), Molecular Cloning, A. Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY).
Beispiele von geeigneten Promotoren zur Verwendung in filamentösen Pilz-Wirtszellen sind z. B. der ADH3-Promotor (McKnight et al., THE EMBO J. 4 (1985), 2093–2099) oder der tpiA-Promotor. Beispiele anderer nützlicher Promotoren sind solche, die von dem Gen abgeleitet sind, das Aspergillus oryzae TAKA-Amylase kodiert, Rhizomucor miehei Asparagin-Proteinase, Aspergillus niger neutrale α-Amylase, Aspergillus niger säurestabile α-Amylase, Aspergillus niger oder Aspergillus awamori Glucoamylase (gluA), Rhizomucor miehei Lipase, Aspergillus oryzae alkaline Protease, Aspergillus oryzae Triose-Phosphatisomerase oder Aspergillus nidulans Acetamidase.
Wirtszellen
In noch einem anderen Aspekt stellt die Erfindung eine Wirtszelle zur Verfügung, welche das DNA-Konstrukt der Erfindung umfasst, und/oder den rekombinanten Expressionsvektor der Erfindung.
Bevorzugt ist die Wirtszelle der Erfindung eine eukaryotische Zelle, insbesondere eine fungöse Zelle, wie z. B. eine Hefe- oder filamentöse fungöse Zelle. Insbesondere kann die Zelle zu einer Art von Trichoderma gehören, bevorzugt Trichoderma harzianum oder Trichoderma reesei, oder eine Art von Aspergillus, am meisten bevorzugt Aspergillus oryzae oder Aspergillus niger oder eine Art von Fusarium, insbesondere eines Stammes von Fusarium graminearum, Fusarium cerealis. Fungöse Zellen können durch ein Verfahren transformiert werden, welches Protoplast-Bildung und Transformation des Protoplasten beinhaltet, gefolgt durch Regenerierung der Zellwand in einer per se bekannten Weise. Die Verwendung von Aspergillus als ein Wirtsorganismus ist in EP 238 023 (Novo Nordisk A/S) beschrieben, die Inhalte davon sind hiermit durch Referenz inkorporiert. Die Wirtszelle kann auch eine Hefezelle sein, z. B. ein Stamm von Saccharomyces, insbesondere Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri oder Saccharomyces uvarum, ein Stamm von Schizosaccharomyces pombe, wie z. B. Schizosaccharomyces pombe, ein Stamm von Hansenula sp., Pichia sp., Yarrowia sp., wie z. B. Yarrowia lipolytica, oder Kluyveromyces sp., wie z. B. Kluyveromyces lactis.
Verfahren zur Herstellung von Pektinesterase
In noch einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Enzyms gemäß der Erfindung zur Verfügung, worin eine geeignete Wirtszelle, welche mit einer DNA-Sequenz transformiert worden ist, welche das Enzym kodiert, unter Bedingungen kultiviert wird, welche die Herstellung des Enzyms erlaubt, und das resultierende Enzym aus der Kultur wiedergewonnen wird.
Das für die Kultivierung der transformierten Wirtszellen verwendete Medium kann jedes konventionelle Medium sein, das geeignet für das Wachstum der besagten Wirtszellen ist. Die exprimierte Pektinesterase kann in geeigneter Weise in das Kulturmedium abgesondert werden und kann daraus durch bekannte Verfahren wiedergewonnen werden, einschließlich Abtrennen der Zellen von dem Medium durch Zentrifugieren oder Filtrieren, Präzipitieren von proteinösen Komponenten des Mediums mithilfe eines Salzes, wie z. B. Ammoniumsulfat, gefolgt von chromatographischen Verfahren, wie z. B. Ionenaustausch-Chromatographie, Affinitätschromatographie, oder Ähnliches.
Enzymzusammensetzungen
In noch einem anderen Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine Enzymzusammensetzung, die geeignet ist für die Modifizierung oder Degradierung von Pflanzenzellwand-Bestandteilen, wobei die Zusammensetzung in einem Enzym, das Pektinesterase-Aktivität zeigt, wie oben beschrieben angereichert wird.
Die Enzymzusammensetzung, die mit einem Enzym der Erfindung angereichert worden ist, kann z. B. eine Enzymzusammensetzung sein, die vielfache enzymatische Aktivitäten umfasst, insbesondere eine Enzymzusammensetzung, welche vielfache Pflanzenzellwand-abbauende Enzyme umfasst, wie z. B. Viscozym^®, Pectinex^® oder Pectinex ultra SP^® (alle erhältlich von Novo Nordisk A/S). Auf diese Weise kann eine Verstärkung der Fähigkeit der Enzymzusammensetzung, eine Zellwand abzubauen, erhalten werden.
In dem vorliegenden Kontext ist der Ausdruck "angereichert" dazu bestimmt, anzuzeigen, dass die Pektinesterase-Aktivität der Enzymzusammensetzung erhöht worden ist, z. B. mit einem Anreicherungsfaktor von 1,1, zweckmäßig gemäß einer Zugabe eines Enzyms der Erfindung, zubereitet durch das oben beschriebene Verfahren.
Alternativ kann die Enzymzusammensetzung, angereichert in einem Enzym, das Pektinesterase-Aktivität zeigt, eine sein, welche ein Enzym der Erfindung als den hauptenzymatischen Bestandteil umfasst, z. B. eine Monokomponenten-Enzymzusammensetzung.
Die Enzymzusammensetzung kann in Übereinstimmung mit den in der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden und kann in der Form einer flüssigen oder trockenen Zusammensetzung sein. Zum Beispiel kann die Enzymzusammensetzung in der Form eines Granulates oder eines Mikrogranulates sein. Das Enzym, das in die Zusammensetzung eingefügt werden muss, kann gemäß Verfahren, die in der Technik bekannt sind, stabilisiert werden.
Unten sind Beispiele von bevorzugten Verwendungen der Enzymzusammensetzung der Erfindung gegeben. Die Dosierung der Enzymzusammensetzung der Erfindung und andere Bedingungen, unter welchen die Zusammensetzung verwendet wird, kann auf Grundlage von Verfahren, die in der Technik bekannt sind, bestimmt werden.
Die Enzymzusammensetzung gemäß der Erfindung kann für mindestens einen der folgenden Zwecke nützlich sein.
Abbau oder Modfizierung von Pflanzenmaterial:
Die Enzymzusammensetzung kann vorteilhafterweise zur Behandlung von Pektin-enthaltendem Pflanzenmaterial verwendet werden, z. B. von Gemüse oder Früchten abstammend, wie z. B. aus Sojabohnen erhaltenem Material, Zuckerrüben oder Äpfeln, um die Viskosität zu reduzieren und so die Verarbeitung oder Erscheinung des besagten Pflanzenmaterials zu verbessern. Die Viskositätsreduktion kann durch Behandeln des Pektin-enthaltenden Pflanzenmaterials mit einer Enzymzubereitung der Erfindung unter geeigneten Bedingungen zur kompletten oder teilweisen Degradierung des Pektin-enthaltenden Materials erhalten werden.
Die Enzymzusammensetzung kann für die Depektinisierung und Viskositätsreduzierung in Gemüse oder Fruchtsaft, besonders in Apfel- oder Birnensaft, verwendet werden.
Die Enzymzubereitung kann bei der Behandlung von Brei von Früchten und Gemüsen, z. B. bei der Breibehandlung von Äpfeln und Birnen zur Saftherstellung, und bei der Breibehandlung von Trauben zur Weinherstellung verwendet werden.
Die Enzymzusammensetzung kann bei der Herstellung von Zitrusfrüchtesaft, z. B. zur teilweisen oder vollständigen Degradierung des Fruchtfleisches, das nach dem Pressen im Saft vorhanden ist, verwendet werden.
Für die obigen Verwendungen ist es bevorzugt, dass die Enzymzusammensetzung zusätzlich zu Pektinesterase eine Polygalactoronase-enthaltende Enzymzubereitung umfasst.
Durch die Verwendung einer Enzymzubereitung der Erfindung ist es möglich, die Konsistenz und Erscheinung von verarbeiteter Frucht oder von verarbeiteten Gemüsen zu regulieren. So wurde entdeckt, dass die Konsistenz und Erscheinung ein Produkt der gegenwärtigen Kombination der für das Verarbeiten verwendeten Enzyme ist, z. B. der Natur der Enzyme (besonders der Pektin-degradierenden Enzyme (des Pektin-degradierenden Enzyms)), mit welcher die Pektinmethylesterase der Erfindung kombiniert wird.
Beispiele von Produkten mit bestimmten Eigenschaften, welche durch die Verwendung einer Enzymzubereitung der Erfindung hergestellt werden können, schließen klaren Saft von Äpfeln, Birnen oder Beeren, trüben dunklen Saft von Äpfeln, Birnen, Beeren, Zitrusfrüchten oder Tomaten, und Pürees von Karotten und Tomaten mit ein.
Aus der vorhergehenden Offenbarung wird es offensichtlich sein, dass die Pektinesterase der Erfindung als eine Einzelkomponente, die im Wesentlichen frei von anderen Enzym-Aktivitäten ist, wie z. B. Polygalctoronase- und/oder Pektinlyase-Aktivität, welche normal in kommerziell erhältlicher Pektinesterase, die pektinolytische Zubereitungen enthält, anwesend ist, produziert werden kann.
Auf dieser Grundlage ist die Verwendung der Pektinesterase der Erfindung besonders vorteilhaft für Zwecke, in welchen die Aktivität von solchen anderen Aktivitäten unerwünscht ist.
Beispiele von solchen Zwecken schließen die Verwendung der Pektinmethylesterase für komplette oder teilweise Demethylierung von Pektin in verarbeiteten oder nicht-verarbeiteten Früchten und Gemüsen mit ein.
Die teilweise Demethylierung ist z. B. wichtig, wenn eine verbesserte Festigkeit der Früchte oder Gemüse wünschenswert ist. So wird die Festigkeit während der Verarbeitung (z. B. Konservenfabrikation und Pasteurisierung) oft reduziert. Durch Verwendung einer kontrollierten Menge an Pektinesterase der Erfindung kann eine teilweise Demethylierung von Pektinesterase, die in den Früchten und Gemüsen vorhanden ist, erhalten werden, und das resultierende teilweise demethylierte Pektin kann mit z. B. zweiwertigen Ionen, wie z. B. Calcium, vernetzen, wodurch festere Früchte oder Gemüse geformt werden können. Demgemäß kann die Pektinesterase der Erfindung zur Verbesserung der Festigkeit von z. B. roter und grüner Paprika, Bohnen, Birnen und geschnittenen Früchten wie z. B. Birnen und Äpfel, verwendet werden.
Die Infusion des Enzyms kann z. B. nicht unterstützt von Immersion oder unterstützt durch Vakuumbehandlung durchgeführt werden.
Ein anderes Beispiel des Zweckes ist die Methylierung von Pektin, z. B. von Zitrusfrüchten, Apfel, Sonnenblume und/oder Zuckerrübe.
Darüber hinaus kann die Pektinesterase verwendet werden, um einen Viskositätsanstieg in situ zu erhalten oder in verschiedenen auf Gemüse oder Frucht basierenden Produkten Gelbildung zu erhöhen.
Die Pektinesterase der Erfindung kann alleine oder zusammen mit anderen Enzymen verwendet werden, um die Verdaubarkeit von Pektin-enthaltendem Tierfutter zu verbessern, z. B. Futter zubereitet aus Sojabohnen, Zuckerrüben oder Rapssaat. Zu diesem Zwecke wird eine Enzymzusammensetzung der Erfindung zu dem Futter hinzugefügt.
Die Pektinesterase-Aktivität kann zusammen mit anderen Enzymen verwendet werden, um Monogalacturonsäure oder Galacturonsäure, die Oligosaccharide aus Pektin-enthaltendem Material, wie z. B. Zuckerrübenfruchtfleisch enthalten, in Übereinstimmung mit bekannten Verfahren herzustellen. Monogalacturonsäure kann zur Herstellung von Galactarsäure oder zur Herstellung von Fettsäure und Fettalkoholester und/oder Ether von Galacturonsäure verwendet werden. Galacturon-enthaltende Oligosaccharide können als Zusatzstoffe für Essen für Menschen oder Tierfutter verwendet werden.
Darüber hinaus kann die Pektinesterase in Kombination mit anderen Enzymen für die Entfernung von pektischen Stoffen aus Pflanzenfasern verwendet werden, deren Entfernung, z. B. bei der Herstellung von Textilfasern oder anderen Zellulose-haltigen Materialien essentiell ist. Zu diesem Zweck wird Pflanzenfasermaterial mit einer geeigneten Menge der Pektinesterase der Erfindung unter geeigneten Bedingungen zum Erhalt von kompletter oder teilweiser Degradierung der pektischen Substanzen, die mit dem Pflanzenfasermaterial verbunden sind, behandelt.
Art und Weise der Aktivität-Blockweise gegen zufällige Spaltung:
Die Verteilung der Carboxylgruppen in Pektin ist wichtig für die funktionellen Eigenschaften des Pektins.
Einige Verfahren zur Bestimmung der Verteilung der freien Carboxylgruppen in Pektin sind beschrieben worden (Grasdalen, H. et al., Carbohydrate Res., 289, 105 (1995)). Mit dem Ziel der Charakterisierung der Art und Weise der Aktivität einer Pektinesterase wird die Verteilung der Säuregruppen durch ein von Mort et al. (Mort, A. J. et al., Carbohyd. Res., 247, 21 (1993)) beschriebenes Verfahren bestimmt. Die veresterten Galacturonsäuren werden durch Reduzierung mit Natriumborohydrid zu Galactose konvertiert. Anschließend werden die glycosidischen Verbindungen der resultierenden Galactosereste selektiv durch HF-Solvolyse gespalten. Das führt zu der Herstellung der Oligomere: (Gal A)_n-Gal. Diese Oligomere repräsentieren die zusammenhängenden Streifen von Gal-A-Resten zwischen Methyl-veresterten Resten in dem Pektin. Die klonierte Esterase der Erfindung wurde mit einer orangen Esterase und alkalischer Behandlung verglichen. Durch Hochleistungs-Anionenaustausch-Chromatographie wurden Oligomere von sechs Galacturonsäureresten abgetrennt und quantifiziert. Von der Verteilung dieser Oligomere kann festgestellt werden, ob die Säuregruppen in dem Pektin zufällig oder blockweise verteilt sind.
Grasdalen et al., 1995, beschreibt NMR-Spektroskopie als ein nützliches Verfahren, um quantitative Information über die Zusammensetzung und die sequentielle Struktur von Pektin zu erhalten. Im Gegensatz zu dem von Mort et al. 1993 beschriebenen Verfahren repräsentiert NMR-Spektroskopie einen direkten Ansatz, um die sequentielle Struktur zu verifizieren, und nur ein moderates Ausmaß an Polymerdegradierung ist nötig.
Ohne an irgendwelche Theorie gebunden zu sein, wird gegenwärtig angenommen, dass die verbesserte Aktivität der Pektinesterase der Erfindung für eine Vielzahl von industriellen Anwendungen, wie z. B. der Gelatinisierung von Marmelade (siehe Beispiel 4 hierin) auf der Art und Weise der Aktion des Enzyms der Erfindung beruht, vorzugsweise eine blockweise Verteilung der Säuregruppen in Pektin zur Verfügung stellen.
Die Erfindung wird in weiterem Detail in den folgenden Beispielen beschrieben, welche nicht in irgendeiner Art und Weise dazu gedacht sind, den Geltungsbereich der Erfindung wie beansprucht einzuschränken.
MATERIAL UND METHODEN
Abgelegte Organismen:
Meripilus giganteus CBS 521.95 umfasst die Pektinesterase-kodierende DNA-Sequenz der Erfindung.
Escherichia coli DSM 10357, enthaltend das Plasmid, umfassend die volle Länge cDNA-Sequenz, die die Pektinesterase der Erfindung kodiert, in dem Shuttle-Vektor pYES 2.0.
Andere Stämme:

Hefestamm: Der verwendete Saccharomyces cerevisia-Stamm war W3124 (MATα; ura 3–52; leu 2–3; 112; his 3-D200; pep 4–1127; prc1::HIS3; prb1:: LEU2; cir+).
E. coli-Stamm: DH10B (Life Technologies)

Plasmide:
Der Aspergillus-Expressionsvektor pHD414 ist ein Abkömmling von dem Plasmid p775 (beschrieben in EP 238 023 ). Die Konstruktion von pHD414 ist ferner beschrieben in WO 93/11249.
PYES 2.0 (Invitrogen)
PA2PE18 (siehe Beispiel 1)
Extraktion von Gesamt-RNA wird durchgeführt mit Guanidinthiocyanat, gefolgt durch Ultrazentrifugation durch einen 5,7-M-CsCl-Puffer und Isolierung von Poly(A)⁺RNA wird ausgeführt durch Oligo(dT)-Zellulose-Affinitätschromatographie unter Verwendung der in WO 94/14953 beschriebenen Verfahren.
cDNA-Synthese: Doppelsträngige cDNA wird aus 5 μg Poly(A)⁺RNA durch das RNase H-Verfahren (Gubler and Hoffman (1983) Gene 25: 263–269 Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY) unter Verwendung der Haarnadel-Modifizierung, entwickelt von F. S. Hagen (pers. Komm.), synthetisiert. Die Poly(A)+RNA (5 μg in 5 μl DEPC-behandeltem Wasser) wird auf 70°C für 8 min in einem vorsilikonisierten RNase-freien Eppendorf-Reaktionsgefäß erhitzt, auf Eis abgeschreckt und in einem finalen Volumen von 50 μl mit reservem Transkriptasepuffer (50 mM Tris-Cl, pH 8,3, 75 mM KCl, 3 mM MgCl₂, 10 mM DTT, Bethesda Research Laboratories) vereint, enthaltend 1 mM dATP, dGTP und dTTP und 0,5 mM 5-Methyl-dCTP (Pharmacia), 40 Einheiten an humanem plazentalem Ribonuklease-Inhibitor (RNasin, Promega), 1,45 μg Oligo(dT)₁₈-Not I-Primer (Pharmacia) und 1000 Einheiten SuperScript II RNase H-reverse Transkriptase (Bethesda Research Laboratories). Erster-Strang-cDNA wird durch Inkubation des Reaktionsgemisches bei 45°C für 1 Stunde synthetisiert. Nach der Synthese wird die mRNA : cDNA- Hybridmischung durch eine MicroSpin S-400 HR (Pharmacia) spin column gemäß den Herstellerangaben gelfiltriert.
Nach der Gelfiltration werden die Hybride in 250 μl zweiter-Strangpuffer (20 mM Tris-Cl, pH 7,4, 90 mM KCl, 4,6 mM MgCl₂, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 0,16 mM βNAD+) verdünnt, enthaltend 200 μM von jedem dNTP, 60 Einheiten E. coli DNA-Polymerase I (Pharmacia), 5,25 Einheiten Rnase H (Promega) und 15 Einheiten E. coli DNA-Ligase (Boehringer Mannheim). Zweiter-Strang-cDNA-Synthese wird durch Inkubieren des Reaktionsgefäßes bei 16°C für 2 Stunden und zusätzlich 15 Minuten bei 25°C durchgeführt. Die Reaktion wird durch Hinzufügen von EDTA zu einer finalen Konzentration von 20 mM, gestoppt, gefolgt durch Phenol- und Chloroform-Extraktionen.
Mungobohnen-Nukleasebehandlung: Die doppelsträngige cDNA wird bei –20°C für 12 Stunden durch Hinzufügen von 2 vol 96%-ig EtOH, 0,2 vol 10 M NH₄Ac präzipitiert, durch Zentrifugation wiedergewonnen, gewaschen in 70% EtOH, getrocknet und resuspendiert in 30 μl Mungobohnen-Nukleasepuffer (30 mM NaAc, pH 4,6, 300 mM NaCl, 1 mM ZnSO₄, 0,35 mM DTT, 2% Glycerol), enthaltend 25 Einheiten Mungobohnen-Nuklease (Pharmacia). Die einzelsträngige Haarnadel-DNA wird durch Inkubation der Reaktion bei 30°C für 30 Min. abgeschnitten, gefolgt von Zugabe von 70 μl 10 mM Tris-Cl, pH 7,5, 1 mM EDTA, Phenolextraktion und Präzipitation mit 2 vol 96% EtOH und 0,1 vol 3 M NaAc, pH 5,2, auf Eis für 30 min.
Herstellen von stumpfen Enden mit T4-DNA-Polymerase:
Die doppelsträngigen cDNAs werden durch Zentrifugieren wiedergewonnen und stumpfe Enden werden in 30 μl T4-DNA-Polymerase-Puffer (20 mM Tris-Acetat, pH 7,9, 10 mM MgAc, 50 mM Kac, 1 mM DTT), enthaltend 0,5 mM von jedem dNTP und 5 Einheiten T4-DNA-Polymerase (New England Biolabs) durch Inkubieren der Reaktionsmischung bei 16°C für 1 Stunde hergestellt. Die Reaktion wird durch Hinzufügen von EDTA zu einer finalen Konzentration von 20 mM gestoppt, gefolgt von Phenol- und Chloroform-Extraktionen und Präzipitation für 12 Stunden bei –20°C unter Hinzufügen von 2 vol 96% EtOH und 0,1 vol 3 M NaAc pH 5,2.
Adaptorligation, Not-I-Verdau und Größenselektion:
Nach der Auffüllreaktion werden die cDNAs durch Zentrifugieren wiedergewonnen, in 70% EtOH gewaschen und getrocknet. Das cDNA-Pellet wird in 25 μl Ligationspuffer (30 mM Tris-Cl, pH 7,8, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP), enthaltend 2,5 μg nicht-palindromische BstXI-Adaptoren (Invitrogen) und 30 Einheiten T4-Ligase (Promega) resuspendiert und bei 16°C für 12 Stunden inkubiert. Die Reaktion wird durch Erhitzen bei 65°C für 20 min gestoppt und dann auf Eis für 5 min gekühlt. Die adaptierte cDNA wird mit Not-I-Restriktionsenzym unter Hinzufügen von 20 μl Wasser, 5 μl 10 × Not-I-Restriktionsenzympuffer (New England Biolabs) und 50 Einheiten Not-I (New England Biolabs) verdaut, gefolgt durch Inkubation für 2,5 Stunden bei 37°C. Die Reaktion wird durch Erhitzen bei 65°C für 10 min gestoppt. Die cDNAs werden durch Gelelektrophorese auf einem 0,8% SeaPlaque GTG-niedrigem Schmelztemperatur-Agarosegel (FMC) in 1 × TBE größenfraktioniert, um unligierte Adaptoren und kleine cDNAs abzutrennen. Die cDNA wird mit einem Cut-off bei 0,7 kb größenselektioniert und aus dem Gel unter Verwendung von β-Agarose (New England Biolabs) gemäß den Herstellerangaben wiedergewonnen und für 12 Stunden bei –20°C unter Hinzufügen von 2 vol 96% EtOH und 0,1 vol 3 M NaAc pH 5,2 präzipitiert.
Konstruktion der Bibliotheken: Die gerichtete, größenselektionierte cDNA wird durch Zentrifugation wiedergewonnen, in 70% EtOH gewaschen, getrocknet und in 30 μl 10 mM Tris-Cl, pH 7,5, 1 mM EDTA resuspendiert. Die cDNAs werden durch Gelfiltration durch einen MicroSpin S-300 HR (Pharmacia) Spin-Column gemäß den Herstellerangaben entsalzt. Drei Testligationen werden in 10 μl Ligationspuffer (30 mM Tris-Cl, pH 7,8, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP) ausgeführt, enthaltend 5 μl doppelsträngige cDNA (Reaktionsgefäße #1 und #2), 15 Einheiten T4-Ligase (Promega) und 30 ng (Gefäß #1), 40 ng (Gefäß #2) und 40 ng (Gefäß #3, die Vektorhintergrundkontrolle) BstXI-Not-I-geschnittenen pYES 2,0 Vektor. Die Ligationsreaktionen werden durch Inkubieren bei 16°C für 12 Stunden, Erhitzen auf 70°C für 20 min und Hinzufügen von 10 μl Wasser zu jedem Gefäß ausgeführt. 1 μl jeder Ligationsmischung wird in 40 μl elektrokomponente E. coli DH10B-Zellen (Bethesda Research Laboratories) wie beschrieben (Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY) elektroporiert. Unter Verwendung der optimalen Bedingungen wird eine Bibliothek in E. coli etabliert, bestehend aus Pools. Jeder Pool wird durch das Ausbreiten von transformierten E. coli auf LB + Ampicillin-Agarplatten unter Zugabe von 15.000 bis 30.000 Kolonien/Platten nach Inkubation bei 37°C für 24 Stunden hergestellt. 20 ml LB + Ampicillin wird zu der Platte hinzugefügt und die Zellen werden darin suspendiert. Die Zellsuspension wird in einem 50-ml-Gefäß für 1 Stunde bei 37°C geschüttelt. Plasmid-DNA wird aus den Zellen gemäß den Herstellerangaben unter Verwendung eines QIAGEN-Plasmid-Kits isoliert und bei –20°C gelagert.
1 μl Aliquots von aufgereinigter Plasmid-DNA (100 ng/μl) aus einzelnen Pools werden in S. cerevisiae W3124 durch Elektroporation transformiert (Becker und Guarante (1991) Methods Enzymol. 194: 182–187) und die Transformanten werden auf SC-Agar enthaltend 2% Glukose ausplattiert und bei 30°C inkubiert.
Identifizierung von positiven Klonen:
Nach 3–5 Tagen Inkubation werden die SC-Agar-Platten auf ein Set von SC + Galaktose-Agarplatten Replika-plattiert. Diese Platten werden für 2 bis 4 Tage bei 30°C inkubiert und mit einem Pektin-Überlagegel überlagert, enthaltend 1% Apfelpektin DE 75%, 1% HSB-Agarose in einem geeigneten Puffer, zur Detektion von pektinolytischer Aktivität. Nach Inkubation bei 30°C über Nacht wurden 10–15 ml einer 1%-Lösung MTAB (gemischte Alkyltrimethylammoniumbromid) auf die Überlage gegossen und nach 1 Stunde entfernt. Pektinmethyle sterase-positive Kolonien wurden als Kolonien, umgeben von einem weißen Hof, identifiziert.
Charakterisierung von positiven Klonen:
Die positiven Klone werden als Einzelkolonien erhalten, die cDNA-Inserts wurden direkt aus der Hefekolonie unter Verwendung von biotinylierten Polylinker-Primern amplifiziert, durch ein System aus magnetischen Kügelchen (Dynabead M-280, Dynal) aufgereinigt und durch Sequenzieren des 5'-Endes eines jeden cDNA-Klons unter Verwendung der Kettenabbruchmethode (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74: 5463–5467) und des Sequenase-Systems (United States Biochemical) einzeln charakterisiert.
Isolierung eines cDNA-Gens zur Expression in Aspergillus:
Eine Pektinesterase-produzierende Hefekolonie wird in 20 ml YPD-Kulturbrühe in ein 50-ml-Glastestreaktionsgefäß eingeimpft. Das Reaktionsgefäß wird für 2 Tage bei 30°C geschüttelt. Die Zellen werden durch Zentrifugieren für 10 min. bei 3.000 Upm geerntet.
Die DNA wird gemäß WO 94/14953 isoliert und in 50 μl Wasser gelöst. Die DNA wird in E. coli durch Standardverfahren transformiert. Plasmid-DNA wird aus E. coli unter Verwendung von Standardverfahren isoliert, und durch Restriktionsenzymanalyse analysiert. Das cDNA-Insert wird unter Verwendung geeigneter Restriktionsenzyme ausgeschnitten und in einen Aspergillus-Expressionsvektor ligiert.
Transformation von Aspergillus oryzae oder Aspergillus niger
Protoplasten können wie in WO 95/02043, S. 16, Zeile 21 bis Seite 17, Zeile 12, zubereitet werden, was hierin durch Referenz inkorporiert ist.
100 μl der Protoplasten-Suspension wird mit 5–25 μg der geeigneten DNA in 10 μl STC (1,2 M Sorbitol, 10 mM Tris-HCl, pH = 7,5, 10 mM CaCl₂) gemischt.
Protoplasten werden mit p3SR2 (ein A. nidulans amdS Gen-tragendes Plasmid) gemischt. Die Mischung wird bei Raumtemperatur für 25 min. stehengelassen. 0,2 ml 60% PEG 4000 (BDH 29576), 10 mM CaCl₂ und 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, werden hinzugegeben und vorsichtig gemischt (2 ×) und final werden 0,85 ml der gleichen Lösung hinzugefügt und vorsichtig gemischt. Die Mischung wird bei Raumtemperatur für 25 min. stehengelassen, bei 2.500 g für 15 Minuten heruntergespinnt und das Pellet wird in 2 ml 1,2 M Sorbitol resuspendiert. Nach einer weiteren Sedimentation werden die Protoplasten auf Minimalplatten ausgebreitet (Cove, Biochem. Biophys. Acta 113 (1966) 51–56), enthaltend 1,0 M Sucrose, pH 7,0, 10 mM Acetamid als Stickstoffquelle und 20 mM CsCl, um Hintergrundwachstum zu inhibieren. Nach Inkubation für 4 bis 7 Tage bei 37°C werden die Sporen gepickt und für Signalkolonien ausgebreitet. Dieses Verfahren wird wiederholt und Sporen einer Einzelkolonie nach der zweiten Reisolation werden als definierter Transformant gelagert.
Test der A. oryzae-Transformanten
Jede der Transformanten werden in 10 ml YPM (vgl. unten) angeimpft und vermehrt. Nach 2 bis 5 Tagen Inkubation bei 30°C wird der Überstand entfernt. Die Pektinesterase-Aktivität wird durch Applizieren von 10 μl Überstand auf 4 mm Durchmesser-Löcher, die aus einem Agarosegel, das 1% Apfelpektin DE 75% enthält, identifiziert, Inkubation über Nacht bei 30°C und Präzipitation mit MTAB wie oben beschrieben. Pektinesterase-Aktivität wird dann identifiziert durch einen weißen Hof.
Fed-Batch-Fermentation
Fermentationen wurden als Fed-Batch-Verfahren mit Maltodextrin als Kohlenstoffquelle, Harnstoff als Stickstoffquelle und Hefeextrakt durchgeführt. Der pH wurde bei 7,0 gehalten, und die Temperatur wurde bei 34°C während des gesamten Verfahrens gehalten. Nach der Fermentation wurde die Pektinesterase durch Zentrifugieren und Keimfiltration wiedergewonnen.
Aufreinigung des Enzyms
Die rekombinante Pektinesterase aus A. oryzae wurde wie folgt aufgereinigt: Kulturüberstand wurde nach 5 Tagen von der Kultur geerntet und zentrifugiert, keimfiltriert und auf einer 3-kDa-Cut-off-Filtrationskassette (Minisette) auf ein Minimalvolumen ultrafiltriert. 25 ml des Ultrafiltrats wurden mit 50 mM H₃BO₃. 5 mM DMG, 1 mM CaCl₂, pH 7,0 dialysiert, und auf eine 40 ml Q-Sepharose-FF-Säule (Pharmacie, Schweden), in dem gleichen Puffer equilibriert, appliziert. Nach dem Waschen der Säule wurde gebundenes Protein mit einem linearen NaCl-Gradienten (von 0 bis 0,5 M NaCl) eluiert. Fraktionen der Säule wurden auf Pektinesterase-Aktivität hin durch den wie oben beschriebenen Apfelpektin-Assay analysiert. Das meiste der Pektinesterase-Aktivität wurde im Durchfluss gesehen, wohingegen das meiste des Proteins an die Säule gebunden war.
Der pH des Durchflusses wurde auf pH 4,5 mit CH₃COOH eingestellt und auf eine 50 ml S-Sepharose HP-Säule (Pharmacia, Schweden), equilibriert in 25 mM CH₃COOH/NaOH, pH 4,5, aufgetragen. Nach Waschen der Säule wurde gebundenes Protein mit einem linearen NaCl-Gradienten (von 0 bis 0,25 M NaCl) eluiert. Fraktionen der Säule wurden auf Pektinesterase-Aktivität hin analysiert. Der Hauptteil der Pektinesterase-Aktivität wurde in einer Spitze (Engl.: peak) eluiert, die Spitzen (Engl.: peak)-Fraktionen wurden gepoolt.
Ammoniumsulfat (AMS) wurde zu dem Pool zu einer finalen AMS-Konzentration von 1,6 M hinzugefügt und das Enzym wurde zu einer 40 ml Phenyl-Toyopearl-Säule, equilibriert in 100 mM H₃BO₃, 10 mM DMG, 2 mM CaCl₂, 1,6 M AMS, pH 7,0, hinzugefügt. Nach Waschen der Säule wurde gebundenes Protein mit einem linearen AMS-Gradienten (von 1,6 bis 0 M AMS) eluiert. Der Puffer der Pektinesterase-Spitze (Engl.: peak) wurde für 25 mM CH₃COOH/NaOH, pH 4,5, durch einen Durchlauf auf einer 1,4-L-G25-Sephadex-Säule, equilibriert in 25 mM CH₃COOH/NaOH, pH 4,5, ausgetauscht.
Das Pektinesterase-Enzym wurde auf eine 50-ml-S-Sepharose-HP-Säule, equilibriert in 25 mM CH₃COOH/NaOH, pH 4,5, appliziert. Nach Waschen der Säule wurde gebundenes Protein mit einem linearen NaCl-Gradienten (von 0 bis 0,1 M NaCl) eluiert. Fraktionen mit Pektinesterase-Aktivität wurden durch SDS-PAGE analysiert. Die Fraktionen enthielten nur eine Bande.
Elektrophorese
SDS-PAGE-Elektrophorese wurde in einer Mini-Leak-4-Elektrophorese-Einheit (Kem-En-Tec, Dänemark) als eine modifizierte Version des Laemmli-Verfahrens (Laemmli (1970) Nature 227: 680–685) durchgeführt. Die Gele wurden gemäß den Herstellerangaben Coomassie-gefärbt.
Isolierung der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten DNA-Sequenz:
Der Pektinesterase-kodierende Teil der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten DNA-Sequenz, kodierend eine Pektinesterase der Erfindung, kann aus dem abgelegten Organismus Escherichia coli DSM 10357 durch Extraktion der Plasmid-DNA durch Verfahren, die in der Technik bekannt sind (Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor NY) erhalten werden.
Hybridisierung
Geeignete Hybridisierungsbedingungen, um die Hybridisierung zwischen einer Nukleotidprobe und einer "analogen" DNA-Sequenz der Erfindung zu bestimmen, können wie unten beschrieben definiert werden. Die zu verwendende Oligonukleotidprobe ist die DNA-Sequenz, die dem Pektinesterase-kodierenden Teil der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten DNA-Sequenz entspricht, z. B. Nukleotide 4–933 in SEQ ID NR. 1.
Hybridisierungsbedingungen
Die hierin bezeichneten Hybridisierungsbedingungen, um eine analoge DNA-Sequenz wie in Teil b) des ersten Aspekts der Erfindung zu definieren, welche mit dem Pektinesterase-kodierenden Teil der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten DNA-Sequenz, z. B. Nukleotide 4–933, unter mindestens niedrig-stringenten Bedingungen, aber mehr bevorzugt bei mittleren oder höheren Strigenzbedingungen hybridisiert, zu bezeichnen, sind im Detail unten beschrieben.
Geeignete experimentelle Bedingungen, um Hybridisierung bei niedriger, mittlerer oder hoher Stringenz zwischen einer Nukleotidprobe und einer homologen DNA- oder RNA-Sequenz zu bestimmen, beinhaltet das Einweichen des Filters, der die zu hybridisierenden DNA-Fragmente oder RNA enthält, in 5 × SSC (Natriumchlorid/Natriumcitrat, Sambrook et al. 1989) für 10 min. und Vorhybridisierung des Filters in einer Lösung von 5 × SSC, 5 × Denhardt's-Lösung (Sambrook et al., 1989), 0,5% SDS und 100 μg/ml denaturierter sonifizierter Lachssperma-DNA (Sambrook et al., 1989), gefolgt durch Hybridisierung in der gleichen Lösung, enthaltend eine Konzentration von 10 ng/ml zufällig geprimter (Feinberg, A. P. und Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132: 6 – 13), ³²P-dCTP-markierter (spezifische Aktivität > 1 × 10⁹ cpm/μg) Probe für 12 Stunden bei ca. 45°C. Der Filter wird dann 2 × SSC, 0,5% SDS bei mindestens 55°C (niedrige Stringenz) gewaschen, mehr bevorzugt bei mindestens 60°C (mittlere Stringenz), noch mehr bevorzugt bei mindestens 65°C (mittlere/hohe Stringenz), noch mehr bevorzugt bei mindestens 70°C (hohe Stringenz) und sogar noch mehr bevorzugt bei mindestens 75°C (sehr hohe Stringenz).
Moleküle, mit welchen die Oligonukleotidprobe unter diesen Bedingungen hybridisiert, werden unter Verwendung eines Röntgenfilms detektiert.
Immunologische Kreuzreaktivität: Antikörper, die zum Bestimmen immunologischer Kreuzreaktivität verwendet werden müssen, können durch die Verwendung einer aufgereinigten Pektinesterase zubereitet werden. Mehr spezifisch kann Antiserum gegen die Pektinesterase der Erfindung durch Immunisierung von Hasen (oder anderen Nagetieren) gemäß dem von N. Axelsen et al. In: A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, Kapitel 23, oder A. Johnstone und R. Thorpe, Immunochemistray in Practice, Blackwell Scientific Publications, 1982 (genauer S. 27–31) beschriebenem Verfahren hochgezogen werden. Aufgereinigte Immunoglobuline können aus den Antisera z. B. durch Salzfällung ((NH₄)₂SO₄), erhalten werden, gefolgt von Dialyse und Ionenaustauschchromatographie, z. B. auf DEAE-Sephadex. Immunochemische Charakterisierung von Proteinen kann entweder durch Outcherlony-Doppeldiffusionsanalyse (O. Ouchterlony in: Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir, Ed.), Blackwell Scientific Publications, 1967, pp. 655–706), durch gekreuzte Immunoelektrophorese (N. Axelsen et al., oben, Kapitel 3 und 4), oder durch Raketenimmunoelektrophorese (Engl.: rocket immunoelectrophoresis) (N. Axelsen et al., Kapitel 2) durchgeführt werden.
Medien

YPD: 10 g Hefeextrakt, 20 g Pepton, mit H₂O auf 900 ml auffüllen. Autoklaviert, 100 ml 20% Glukose (steril filtriert) hinzugefügt.
YPM: 10 g Hefeextrakt, 20 g Pepton, mit Wasser auf 900 ml aufgefüllt. Autoklaviert, 100 ml 20% Maltodextrin (steril filtriert) hinzugefügt.
10 × Basalsalz: 75 g Hefe-Stickstoff-Base, 113 g Bernsteinsäure, 68 g NaOH, mit H₂O auf 1000 ml aufgefüllt, steril filtriert.
SC-URA: 100 ml 10 × Basalsalz, 28 ml 20% Casaminosäuren ohne Vitamine, 10 ml 1% Tryptophan, mit Wasser auf 900 ml aufgefüllt, autoklaviert, 3,6 ml 5% Threonin und 100 ml 20% Glukose oder 20% Galactose hinzugefügt.
SC-Agar: SC-URA, 20 g/l Agar hinzugefügt.
PEG 4000 (Polyethylenglykol, Molekulargewicht = 4000) (BDH, England)
1% Apfelpektin DE 75% (Herbstreith, Deutschland)
1% HSB-Agarose (FMC Litex A/S, Dänemark)
MTAB (gemischtes Alkyltrimethylammoniumbromid) (Sigma)

BEISPIELE
BEISPIEL 1
Klonierung und Expression einer Pektinesterase aus Meripilus giganteus CBS 521.95
mRNA wurde aus Meripilus giganteus, CBS Nr. 521.95, gewachsen in Zellulose- enthaltendem Fermentationsmedium unter Rühren, um ausreichende Belüftung sicherzustellen, isoliert. Mycelien wurden nach 3 bis 5 Tagen Wachstum geerntet, sofort in flüssigem Stickstoff gefroren und bei –80°C gelagert. Eine Bibliothek von M. giganteus, CBS Nr. 521.95, bestehend aus ungefähr 10⁶ individuellen Klonen wurde in E. coli wie beschrieben mit einem Vektorhintergrund von 1 konstruiert. Plasmid-DNA von einigen der Pools wurde in Hefe transformiert, und 50 bis 100 Platten, enthaltend 250 bis 400 Hefekolonien, wurden aus jedem Pool erhalten.
Pektinesterase-positive Kolonien wurden identifiziert und auf SC-Agar-Platten mit dem Apfelpektin-Assay isoliert. cDNA-Inserts wurden direkt aus den Hefekolonien amplifiziert und wie in dem Material- und Methodenteil oben beschrieben charakterisiert. Die DNA-Sequenz der cDNA, die die Pektinesterase kodiert, ist in SEQ ID Nr. 1 gezeigt, und die entsprechende Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NR. 2 gezeigt. In SEQ ID NR. 1 definieren DNA-Nukleotide von Nr. 4 bis Nr. 933 die Pektinesterase-kodierende Region.
Die cDNA kann aus dem Plasmid in DSM 10357 erhalten werden.
Gesamt-DNA wurde aus einer Hefekolonie isoliert, und Plasmid-DNA wurde durch Transformation von E. coli wie oben beschrieben wiedergewonnen. Um die Pektinesterase in Aspergillus zu exprimieren, wurde die DNA mit geeigneten Restriktionsenzymen verdaut, der Größe nach auf Gel aufgetrennt, und ein Fragment, entsprechend dem Pektinesterase-Gen, wurde aufgereinigt. Das Gen wurde anschließend mit pHD414 ligiert, mit geeigneten Restriktionsenzymen verdaut, resultierend in dem Plasmid pA2PE18.
Nach der Amplifikation der DNA in E. coli wurde das Plasmid in Aspergillus oryzae wie oben beschrieben transformiert.
Test der oryzae-Transformanten
Jede der Transformanten wurde auf Enzymaktivität hin wie oben beschrieben getestet. Einige der Transformanten hatten Pektinesterase-Aktivität, welche signifikant höher war als der Aspergillus oryzae-Hintergrund. Dies zeigt effiziente Expression der Pektinesterase in Aspergillus oryzae.
BEISPIEL 2
Homologie zu publizierten Pektinesterasen
Eine Homologie-Suche mit der Pektinesterase der Erfindung gegen eine Nukleotid- und Protein-Datenbank wurde durchgeführt. Die Homologie-Suche zeigte, dass die am meisten verwandten Pektinesterasen eine Pektinesterase aus Aspergillus aculeatus und eine Pektinesterase aus Aspergillus tubigensis (von der gesagt wurde, dass sie aus A. niger stammt) sind.
Gemäß dem in "DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG" beschriebenen Verfahren wurde die DNA-Homologie der Pektinesterase der Erfindung gegen die Pektinesterasen des Stands der Technik unter Verwendung des Computerprogramms GAP bestimmt. Die Pektinesterase der Erfindung zeigte nur 54% DNA-Homologie zu der Pektinesterase aus Aspergillus aculeatus (WO 94/25575) und die Pektinesterase der Erfindung hat nur 56% DNA-Homologie zu der Pektinesterase aus Aspergillus tubigensis (Khanh et al. (1990) "Nucleotide and derived amino acid sequence of a pectinesterase c DNA isolated from Aspergillus niger strain RH5344", Nucleic Acids Res. 18: 4262; Khanh et al. (1991) "Characterization and expression of a genomic pectin methyl esterase-encoding gene in Aspergillus niger", Gene 106: 71–77).
Gemäß des in der "DETAILLIERTEN BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG" beschriebenen Verfahrens wurde die Polypeptid-Homologie der Pektinesterase der Erfindung gegen die Pektinesterasen des Stands der Technik unter Verwendung des Computerprogramms GAP bestimmt. Die Pektinesterase der Erfindung hat nur 47% Polypeptid-Homologie zu der Pektinesterase aus Aspergillus aculeatus und die Pektinesterase der Erfindung hat nur 44% Polypeptid-Homologie zu der Pektinesterase aus Aspergillus tubigensis.
Dies zeigt, dass die Pektinesterase der Erfindung in der Tat von irgendwelchen bekannten Pektinesterasen verschieden ist.
BEISPIEL 3
Aufreinigung und Charakterisierung der rekombinanten Pektinesterase der Erfindung
Die Pektinesterase wurde durch Fed-Batch-Fermentation von A. oryzae, welches das Enzym, wie in Material und Methoden oben beschrieben exprimiert, hergestellt.
Die rekombinante Pektinesterase wurde aufgereinigt und durch die in den Material- und Methodenteil oben beschriebenen Verfahren charakterisiert. Das Molekulargewicht des Enzyms wurde durch SDS-PAGE auf 37 kDa bestimmt.
BEISPIEL 4
In-situ-Gelierung von Erdbeermarmelade
Freies Methanol als ein Indikator der Gel-bildenden Eigenschaften
Material und Methoden:

Pektinesterase-Charge PPJ 4300, 423 PEU/g
Pektinesterase: Meripilus giganteus, 2,4 PEU/g
Erdbeeren, gefroren, Sorte: Senga sengana

Die Aktivität der Pektinesterase ist in Pektinesterase-Einheiten (PEU) angegeben, definiert als die Menge an Enzym, welche unter standardisierten Bedingungen 1 mmol Carboxylgruppen pro Minute freisetzt (Novo Nordisk-Assay ABT-SM-0005.02.1, erhältlich auf Anfrage von Novo Nordisk A/S).
Marmeladenzubereitung
Die Zubereitung der Marmelade wird gemäß dem Standardverfahren für Marmeladenherstellung ausgeführt (Novo Nordisk Standard Operation Procedure, ABF-SP-4002.02/01, erhältlich auf Anfrage von Novo Nordisk A/S).
Eine Portion Marmelade von 300 g wurde zubereitet. Das Verhältnis von Erdbeere zu Zucker war: 180 g Beeren + 120 g Zucker. Nach einem initialen VorKochen der Frucht wurde der dünne Brei in 2 × 3 – 50-g-Portionen geteilt, die Proben wurden auf 40°C abgekühlt und Enzym wurde wie folgt zugegeben:

(1) Kontrolle mit keinem hinzugefügten Enzym
(2) PE, PPJ 4300, 10 PEU/kg Frucht
(3) PE, Meripilus giganteus, 10 PEU/kg Frucht

Die Proben wurden versiegelt und für 1 Stunde stehengelassen, dann wurden die Proben für 3 Minuten bei 90°C hitzebehandelt, um das Enzym zu inaktivieren.
In den vorliegenden Versuchen wurde die Quantifizierung von freiem Methanol in Alfred Jørgensens Lab. A/S, Kopenhagen, durchgeführt. Die Proben wurden initial destilliert, dann unter Verwendung eines Kapillar-Gaschromatographen in Kombination mit massenspektrometrischer Detektion analysiert.
Ergebnisse und Diskussion
Die Resultate sind aus Tabelle 1 unten ersichtlich:
Tabelle 1, Methanolbildung
Es ist klar gezeigt, dass Pektinesterase aus Meripilus giganteus, resultierend in 340 ppm freiem Methanol, der mehr traditionelleren aus Aspergillus abgeleiteten PE überlegen ist, resultierend in einer freien Methanolbildung von 200 ppm.
Falls der Pektingehalt der Erdbeeren auf 0,6% geschätzt wird und das Maß der Esterifizierung (DE) auf 70% geschätzt wird, kann errechnet werden, dass das finale DE des traditionellen PE-Produkts in einer DE von 52 resultiert, wohingegen Meripilus giganteus – PE in einer DE von 38 resultiert.
Das Ausmaß an Esterifizierung ist für die strukturellen Eigenschaften von in situ gelierter Marmelade und auch für andere DE-modifizierte Gemüseprodukte von Wichtigkeit. Das Ausmaß an Esterifizierung bestimmt die Anzahl der Ca- Brücken, die gebildet werden können, und ist so bezogen auf die Gelstärke oder die Viskosität eines bestimmten Produkts.
Folglich ist es offensichtlich, dass das Meripilus giganteus-abgeleitete Enzym ein nützliches Werkzeug bei der Erschaffung von starken und nützlichen Gels ist. Das Enzym ist wahrscheinlich auch eine noch stärkere Alternative zu der chemischen Modifizierung von extrahierten Pektinen als das traditionelle Aspergillus-abgeleitete PE-Produkt.
LISTE DER SEQUENZEN
SEQ ID Nr. 1 zeigt die DNA-Sequenz der vollen Länge cDNA-Sequenz, zusammengefasst in dem in das abgelegte Escherichia coli DSM 10357 transformierte DNA-Konstrukt.
AUFLISTUNG DER SEQUENZ
ANGABEN, DIE SICH AUF EINEN ABGELEGTEN MIKROORGANISMUS BEZIEHEN (PCT-Richtlinie 13bis)
ANGABEN, DIE SICH AUF EINEN ABGELEGTEN MIKROORGANISMUS BEZIEHEN (PCT-Richtlinie 13bis)

Claims

DNA-Konstrukt, umfassend eine DNA-Sequenz, welche ein Enzym kodiert, das Pektin-Esterase-Aktivität zeigt, wobei die DNA-Sequenz umfasst: (a) den Pektin-Esterase-kodierenden Teil der DNA-Sequenz, die in Plasmid pYES 2,0 kloniert ist, welches in E. coli-DSM 10357 vorliegt, oder den Pektin-Esterase-kodierenden Teil der DNA-Sequenz, welche in SEQ ID NR: 1 vorliegt; oder (b) ein Analogon der in (a) definierten DNA-Sequenzen, welches (i) zu mindestens 70% homolog zu der in (a) definierten DNA-Sequenz ist, oder (ii) mit der in den Positionen 4–933 in SEQ ID NR: 1 gezeigten DNA-Sequenz bei mittlerer Stringenz hybridisiert, oder (iii) ein Polypeptid kodiert, welches zu mindestens 60% homolog zu dem Polypeptid ist, das durch eine DNA-Sequenz kodiert wird, welche die in (a) definierte DNA-Sequenz umfasst.
DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 1, in welchem die DNA-Sequenz, die ein Enzym kodiert, welches Pektin-Esterase-Aktivität zeigt, aus einem Mikroorganismus erhalten werden kann, bevorzugt einem filamentösen Pilz, einer Hefe oder einem Bakterium.
DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 2, in welchem die DNA-Sequenz von einem Stamm der Basidiomycota erhältlich ist, bevorzugt einem Stamm der Klasse der Hymenomyceten, stärker bevorzugt einem Stamm der Ordnung Aphyllo phorales, stärker bevorzugt einem Stamm der Polyporaceae-Familie, wie z. B. die Gattungen Miripilus, insbesondere einem Stamm von Meripilus giganteus.
DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 3, in welchem die DNA-Sequenz isoliert wird aus oder produziert wird auf der Basis von einer DNA-Bibliothek des Stames Meripilus giganteus CBS 521.95.
DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 2, in welchem die DNA-Sequenz aus einem Stamm von Aspergillus, Saccharomyces, Bacteroides, Erwinia, Pseudomonas oder Clostridium erhältlich ist.
DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 1, in welchem die DNA-Sequenz aus Escherichia coli DSM 10357 isoliert wird.
Rekombinanter Expressionsvektor, der ein DNA-Konstrukt gemäß einem der Ansprüche 1–6 umfasst.
Zelle, die ein DNA-Konstrukt gemäß einem der Ansprüche 1–6 umfasst oder einen rekombinanten Expressionsvektor gemäß Anspruch 7.
Zelle gemäß Anspruch 8, welche eine eukaryotische Zelle ist, insbesondere eine Pilzzelle, wie z. B. eine Hefezelle oder eine filamentöse Pilzzelle.
Zelle gemäß Anspruch 9, welche ein Stamm von Fusarium oder Aspergillus oder Trichoderma ist, insbesondere ein Stamm von Fusarium graminearum, Fusarium cerealis, Aspergillus niger, Aspergillus Oryzae, Trichoderma harzianum oder Trichoderma reesei.
Zelle gemäß Anspruch 9, welche ein Stamm von Meripilus sp. ist, insbesondere Meripilus giganteus.
Zelle gemäß Anspruch 11, welche der Stamm Meripilus giganteus CBS Nr. 521.95 ist.
Zelle gemäß Anspruch 9, welche ein Stamm von Saccaromyces ist, insbesondere ein Stamm von Saccharomyces cerevisiae.
Verfahren zur Herstellung eines Enzyms, das Pektin-Esterase-Aktivität zeigt, das Verfahren umfasst das Züchten einer Zelle gemäß einem der Ansprüche 8 –13 unter Bedingungen, die die Herstellung des Enzyms und die Gewinnung des Enzyms aus der Kultur erlauben.
Enzym, welches Pektin-Esterase-Aktivität zeigt, wobei das Enzym (a) von einem DNA-Konstrukt gemäß einem der Ansprüche 1–6 kodiert wird, oder der rekombinante Expressionsvektor gemäß Anspruch 7 oder (b) eine Aminosäuresequenz umfasst, welche zu mindestens 60% homolog zu SEQ ID NR: 2 ist.
Enzym gemäß Anspruch 15, welches die Aminosäuresequenz SEQ ID NR: 2 hat.
Zusammensetzung, welche das Enzym gemäß Anspruch 15 oder 16 umfasst.
Enzym-Zusammensetzung, welche in einem Enzym angereichert ist, welches Pektin-Esterase-Aktivität gemäß Anspruch 15 oder 16 zeigt.
Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 17 bis 18, welche zusätzlich eine α-Arabinosidase, β-Galaktosidase, α-Glucoronisidase, β-Xylo-sidase, Xylan-Acetylesterase, Xylanase, Arabinanase, Rhamnogalacturonase, Rhamnogalacturonan-Acetylesterase, Pektin-Acetylesterase, Galactanase, Polygalacturonase, Pektin-Lyase, Pektat-Lyase, oder Pektin-Methylesterase umfasst.
Verwendung eines Enzyms gemäß Anspruch 15 oder 16 oder einer Enzymzusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 17 bis 19 zur Verbesserung der Stabilität eines Pektin-enthaltenden Materials.
Verwendung eines Enzyms gemäß Anspruch 15 oder 16 oder einer Enzymzusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 17 bis 19 zur Erhöhung der Viskosität eines Pektin-enthaltenden Materials.
Verwendung gemäß Anspruch 20 und 21, in welchem das Pektin-enthaltende Material Frucht- oder Gemüsematerial ist.
Verwendung eines Enzyms gemäß Anspruch 15 oder 16 oder einer Enzymzusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 17 bis 19 zur Demethylierung von Pektin.
Verwendung eines Enzyms gemäß Anspruch 15 oder 16 oder einer Enzymzusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 17 bis 19 bei der Zubereitung von Futter.
Verwendung eines Enzyms gemäß Anspruch 15 oder 16 in Kombination mit einer Polygalacturonase, welche Enzymzubereitung zur Reduzierung der Viskosität eines von einer Pflanzenzellwand abgeleiteten Materials enthält.
Verwendung eines Enzyms gemäß einem der Ansprüche 15 oder 16 oder einer Enzymzusammensetzung gemäß irgendeinem der Ansprüche 17 bis 19 bei der Herstellung von Wein oder Saft.
Escherichia coli DSM 10357.
Meripilus giganteus CBS 521.95.