DE69233106T2

DE69233106T2 - Verfahren zur Herstellung von Einzelsträndigen "stem-loop" DNS

Info

Publication number: DE69233106T2
Application number: DE69233106T
Authority: DE
Inventors: Atsushi Ohshima; Sumiko Inouye; Masayori Inouye
Original assignee: University of Medicine and Dentistry of New Jersey; Rutgers State University of New Jersey
Current assignee: University of Medicine and Dentistry of New Jersey; Rutgers State University of New Jersey
Priority date: 1991-08-30
Filing date: 1992-08-28
Publication date: 2004-06-03
Anticipated expiration: 2012-08-29
Also published as: US5643762A; ES2202301T3; EP0530112B1; EP0530112A2; JP4041098B2; JP2004261191A; CA2073630A1; JP3580561B2; EP1251169A1; DE69233106D1; CA2073630C; JPH05308972A; EP0530112A3

Description

Die Erfindung betrifft das Fachgebiet der rekombinanten DNA. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Synthese einer neuen und brauchbaren einzelsträngigen DNA, die eine Stamm-Schleife ("stem loop")-Konfiguration aufweist (ss-sIDNA). Die Erfindung betrifft ein in vitro- und ein in vivo-Syntheseverfahren. Weiterhin betrifft die Erfindung das Replikationsvehikel, das eingesetzt wird, um diese ss-sIDNAs herzustellen. Ein Verfahren wird beschrieben, anhand dessen ss-sIDNAs mit Genen, die ein Zielprotein codieren, oder ohne solche Gene amplifiziert werden können.
Hintergrund
Es ist bekannt, dass eine Verdopplung eines Teils des Genoms über ein RNA-Zwischenprodukt erfolgt, das sodann durch die reverse Transkriptase zu der komplementären DNA (cDNA) revers transkribiert wird. Eine Übersicht findet sich in Weiner et al., Ann. Rev. Biochem. 55: 631 (1986). Der hieraus folgende reverse Fluss der genetischen Information soll bei der Ausbildung der Diversität der eukaryotischen Genome während der Evolution eine entscheidende Rolle gespielt haben. Aufgrund der kürzlich entdeckten bakteriellen Transkriptasen kann man davon ausgehen, dass ein ähnlicher Mechanismus sehr gut auch für die genomische Evolution in Procaryoten verantwortlich gewesen sein könnte. Vgl. Inouye und Inouye, TIBS 16: 18 (1991a), und Inouye und Inouye, Ann. Rev. Microbiol. 45: 163 (1991b). Die Verdopplung von Genen über die Synthese der cDNA durch die reverse Transkriptase soll bei der Ausbildung der Diversität der Genome während der Evolution eine wichtige Rolle gespielt haben.
Die Erfindung kam im Zusammenhang mit der Grundlagenforschung über die Evolution des Genoms zustande. Es wurde gezeigt, dass während der Replikation von Plasmid-DNA die Synthese einer einmaligen ss-sIDNA erfolgt. Man kann spekulieren, dass die Produktion der sIDNA sowohl während der prokaryotischen als auch während der eukaryotischen chromosomalen DNA-Replikation allgemein verbreitet ist. Möglicherweise werden die chromosomalen genetischen Elemente, auf welche IR-Strukturen folgen, immer einer Verdopplung zu einer sIDNA unterworfen, und zwar mit einer Häufigkeit, die von der Stabilität der IR-Struktur und der Eigenschaft der Polymerase(n) abhängt.
Es wurde gezeigt, dass es viele Strukturen mit umgekehrten Sequenzwiederholungen ("inverted repeat", IR) gibt (in E. coli etwa 1 000 Kopien), die als REPs für repetitive extragenetische Palindromsequenzen oder als PUs für Palindromeinheiten bezeichnet wurden (Higgins et al., Nature 298: 760 (1982); Gilson et al., EMBO J. 3: 1417 (1984); und Gilson et al., Nucl. Acids Res. 19: 1375 (1991)). Dabei wird deutlich, dass diese Strukturen mit spezifischen zellulären Komponenten assoziiert sind, einschließlich der DNA-Polymerase I, und dass sie in der Organisation von Chromosomen möglicherweise eine signifikante Rolle spielen (Gilson et al., Nucl. Acids Res. 18: 3941 (1990); und Gilson et al., EMBO J. 3: 1417 (1984)). Außerdem sollte angemerkt werden, dass etwa 6 % des menschlichen Genoms aus Elementen bestehen, die als als bezeichnet werden, wobei für deren transkriptionalen Produkte gezeigt wurde, dass sie wesentliche sekundäre Strukturen enthalten (Simmett et al., J. Biol. Chem. 266: 8675 (1991)).
Da für die Synthese von sIDNA im Gegensatz zu der Synthese von cDNA weder RNA-Zwischenprodukte noch die Aktivität einer reversen Transkriptase erforderlich ist, wird die sIDNA möglicherweise häufiger produziert als die cDNA. Somit könnten die sIDNAs in der Evolution der Genome von sowohl Prokaryoten als auch Eukaryoten eine entscheidende Rolle ähnlich wie die cDNA gespielt haben, indem sie genetische Elemente verdoppelten, die sodann innerhalb des Genoms verteilt oder neu arrangiert wurden.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde eine grundlegende Entdeckung gemacht. Es wurde gefunden, dass Teile des Genoms direkt aus dem Genom verdoppelt werden können. Dabei wurde gefunden, dass für diese Genverdopplung weder ein RNA-Zwischenprodukt noch eine reverse Transkriptase erforderlich ist und dass diese Genverdopplung während der DNA-Replikation abläuft.
Kurz gesagt stellt die Erfindung ein Verfahren (oder einen Prozess) zum Synthetisieren eines neuen und brauchbaren einzelsträngigen DNA-Moleküls (ssDNA-Moleküls) bereit. Das Verfahren umfasst die Verwendung einer umgekehrten Sequenzwiederholung (IR) einer DNA und die Bestandteile, die erforderlich sind, um eine einzelsträngige Struktur zu starten und zu synthetisieren. Außerdem stellt die Erfindung ein System bereit zum Synthetisieren einer solchen ssDNA aus und zusammen mit den erforderlichen Bestandteilen, umfassend eine umgekehrte DNA-Sequenzwiederholung. Weiterhin stellt die Erfindung wirksame Replikationsvehikel bereit, die alle Elemente umfassen, die für die Synthese der neuen ssDNA-Moleküle erforderlich sind. Die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erhaltene Struktur weist einen Stamm auf, der aus einer verdoppelten DNA von komplementären Basen besteht; dabei endet der Stamm an dem einen seiner Enden mit zwei Enden, bzw. mit einem 3'- und einem 5'-Ende, und an dem anderen Ende mit der ssDNA, die eine Schleife ausbildet.
Die Erfindung betrifft das Durchführen des Verfahrens und die Systeme in vitro.
Verschiedene Verwendungen der Moleküle werden beschrieben, umfassend ein Verfahren zur Bereitstellung zufälliger Mutationen in Genen mit dem Ziel, Proteine mit verbesserten oder neuen biologischen Eigenschaften herzustellen. Eine weitere interessante vorgesehene Verwendung besteht darin, die ssDNA-Moleküle der vorliegenden Erfindung in eine DNA einzubauen, um eine dreifache ("triplex") DNA mit einer erhöhten Stabilität herzustellen. Eine weitere Verwendung ist der Einsatz der Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung eines einzelnen Primers.
Die Erfindung und ihre verschiedenen Ausführungsformen werden nachstehend noch ausführlicher beschrieben.
Mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird ein ssDNA-Molekül hergestellt, dessen Struktur einen Stammteil mit einer verdoppelten DNA von anelierten komplementären Basen innerhalb der ssDNA umfasst, wobei der Stamm an dem einen seiner Enden das 5'- und das 3'-Ende des ssDNA-Moleküls und an dem anderen Ende eine Schleife ausbildet, die aus einem Einzelstrang von nicht anelierten Basen besteht, der die zwei Einzelstränge des Stamms verbindet. In einer spezifischen Ausführungsform ist der Strang, der mit dem 3'-Ende endet, länger als der andere Strang. Die sIDNAs können DNA-Segmente, die in der Lage sind, ein Protein zu codieren, insbesondere ein beliebiges Gen (beliebige Gene) enthalten. Das Gen liegt zwischen der Schleife und den Enden. Das Gen kann ein Gen sein, das eine Mutation (Mutationen) enthält.
Ein Mechanismus, der für die Synthese von sIDNAs postuliert wird, ist in den 5A und 5B dargestellt. Zusammenfassend nimmt man an, dass die Synthese den folgenden Ablauf umfasst: Die DNA wird am Replikationsursprung (OR) in Gang gesetzt, dann läuft die Replikation eines ersten Strangs (oder "des" oder "eines" Strangs) weiter, wobei einer der Stränge der doppelsträngigen DNA als Matrize dient (durch den gleichen Mechanismus wie bei der chromosomalen DNA-Replikation), vgl. Tomizawa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 1865 (1977)), wobei die Replikation durch die IR-Struktur hindurch weiter läuft, so dass es zur Replikation des gesamten Plasmidgenoms kommt, wenn ein Plasmid eingesetzt wird. Jedoch (wie nachstehend noch ausführlicher beschrieben wird) bildet ein Teil des ersten Strangs eine Schleifenstruktur aus, wenn die Synthese des ersten Strangs innerhalb der IR unterbrochen oder beendet wird (5, von Schritt 2 zu Schritt 3). Die Schleife erzeugt eine kurze verdoppelte Region, die als Primeranlagerungsstelle ("priming site") zur Fortsetzung der DNA-Synthese dient. Die Verlängerung der DNA-Kette beginnt wieder vom neu erzeugten 3'-Ende aus, wobei jetzt der zweite Strang (oder "der andere" Strang) erzeugt wird, indem der naszierende erste Strang als Matrize genutzt wird. Nachstehend wird noch ein postulierter alternativer (oder gleichzeitiger) Syntheseverlauf beschrieben. Hierbei wird die Richtung der DNA-Synthese umgekehrt, indem beim Verdoppeln des DNA-Fragments ein Umleiten auf die andere Matrize erfolgt (5, Schritte 1 bis 4). Das neu synthetisierte sIDNA-Molekül dissoziiert von selbst von den elterlichen Matrizensträngen, die eine weitere Replikationsrunde durchlaufen, wodurch eine weitere sIDNA erzeugt wird. Die sIDNA wird isoliert und gegebenenfalls gereinigt.
In einer anderen Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung wird ein selbst-replizierendes DNA-Vehikel bereitgestellt, z.B. ein Plasmid, in welches ein DNA-Fragment eingefügt wurde, das eine Struktur einer umgekehrten Sequenzwiederholung (IR), das DNA-Fragment, das als Matrize für die Synthese der ssDNA dienen soll, und eine geeignete Primeranlagerungsstelle enthält, z.B. einen Replikationsursprung (OR), wie den Replikationsursprung von E. coli (ColE1). Die IR liegt stromabwärts des OR. Das selbst-replizierende Vehikel wird in einem geeigneten Wirt repliziert, z.B. in einem E. coli. Der Wirt enthält mindestens eine DNA-Polymerase, um die ssDNA an der Matrize zu synthetisieren. In dieser spezifischen Ausführungsform wird angenommen, dass zwei Polymerasen vorliegen, eine erste DNA-Polymerase, die an der Verlängerung eines Teils der ssDNA vom 0R aus zur IR hin, d.h. des ersten Strangs beteiligt ist, und eine zweite DNA-Polymerase, die den Balance- oder zweiten Strang des ssDNA-Strangs synthetisiert. Wenn die Synthese des ersten Strangs endet, anelieren komplementäre Basen, wodurch eine einzelsträngige, nicht anelierte Schleife ausgebildet wird. Anschließend findet die Synthese des zweiten Strangs statt. Eine neue DNA-Struktur wird synthetisiert, die aus einem verdoppelten DNA-Stamm und einer einzelsträngigen Schleifenstruktur am entgegengesetzten Ende besteht. Für diese neue DNA-Struktur wurde der Begriff "Stamm-Schleife" ("stem-loop") oder "sIDNA" geprägt.
Eine weitere spezifische Ausführungsform stellt ein Replikationsvehikel bereit, in dem ein Promotor, insbesondere der lac-Promotor-Operator, deletiert wurde. Trotzdem wurde eine sIDNA hergestellt, wodurch das vorgeschlagene Synthesemodell weiter bestätigt wird, wie hier noch ausführlicher beschrieben wird.
Das Plasmid kann so konstruiert werden, dass es eine beliebige ausgewählte DNA-Sequenz, die in der Lage ist, ein Protein zu codieren, zwischen der Primeranlagerungsstelle und der IR enthält, in diesem Fall wird die synthetisierte sIDNA dann die DNA-Sequenz oder eine Mutation davon enthalten.
Die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellten erfindungsgemäßen sIDNAs müssen nicht durch ein selbst-replizierendes Vehikel synthetisiert werden, vielmehr können sie auch in einem geeigneten in vitro-System synthetisiert werden, das aus einem beliebigen, linearen oder nicht linearen DNA-Segment besteht, das eine beliebige IR und die erforderlichen Elemente enthält, um die ssDNA zu synthetisieren. Ein solches System wird nachstehend beschrieben.
Kurze Beschreibung der Figuren
1(A) zeigt ein Plasmid der vorliegenden Erfindung, pUCK106.
1(B) (SEQ ID NO: 1) zeigt die DNA-Sequenz von 215 bp, die an der XbaI-Stelle von pUCK19 eingefügt ist.
2 zeigt eine Färbung mit Ethidiumbromid eines Polyacrylamid-Gels bei der Produktion einer sIDNA aus pUCK106 und ihre Eigenschaften.
3 zeigt ein Autoradiogramm eines getrockneten Polyacrylamid-Gels bei der Dimer-Erzeugung der sIDNA aus pUCK106.
4 erläutert die Bestimmung der DNA-Sequenz der sIDNA aus pUCK106.
(A) zeigt ein Autoradiogramm eines getrockneten Polyacrylamid-Gels bei der Bestimmung der DNA-Sequenz der 5'-Endregion der sIDNA.
(B) zeigt ein Autoradiogramm eines getrockneten Polyacrylamid-Gels bei der Sequenzierung des 5'-Endes der Schleifenregion der sIDNA.
(C) zeigt ein Autoradiogramm eines getrockneten Polyacrylamid-Gels bei der Sequenzierung des 3'-Endes der Schleifenregion der sIDNA.
(D) zeigt ein Autoradiogramm eines getrockneten Polyacrylamid-Gels der DNA-Sequenz der 3'-Endregion der sIDNA.
(E) zeigt die Struktur der sIDNA aus pUCK106.
5 erläutert zwei mögliche Modelle der Synthese von sIDNA.
6, Bahn 1, zeigt die Produkte einer HaeIII-Spaltung von pBR322 als Größenmarker. Bahn 2 zeigt die sIDNA bei der Herstellung aus pUC7.
7 zeigt das Gen für β-Galactosidase in einem transformierten Vektor.
Hinterlegung des genetischen Materials
Das Plasmid pUCK106 wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC) unter der Hinterlegungsnummer 68679 hinterlegt.
Das Plasmid pUCK106Δlac^PO wurde bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer 68680 hinterlegt.
Beispiele
Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung und sollen in keiner Weise die Erfindung einschränken. In diesen Beispielen beziehen sich alle Prozentangaben auf das Gewicht, wenn sie Feststoffe betreffen, und auf das Volumen, wenn sie Flüssigkeiten betreffen, außerdem sind alle Temperaturen in Grad Celsius angegeben, sofern nichts anderes angemerkt ist.
Die Beispiele beziehen sich der Einfachheit halber und zum besseren Verständnis auf die Figuren und stellen auch eine ausführliche Beschreibung davon bereit.
Beispiel 1
1A erläutert pUCK106 (ringförmige Karte), ein spezifisches Plasmid, das wie nachstehend angegeben hergestellt wurde. Der leere Balken in der ringförmigen Karte stellt das Kanamycin-Resistenz-Gen dar (von Tn 5). Der an der oberen rechten Seiten dargestellte gerade leere Balken stellt ein 215 by großes DNA-Fragment dar, das an der XbaI-Stelle eingefügt ist und das 35 by Sequenzen der umgekehrten Sequenzwiederholung (IR) enthält. Die ausgefüllten Pfeile zeigen die IR-Struktur. Der ausgefüllte Kreis stellt den Replikationsursprung (Ori) dar. Der längere leere Pfeil zeigt die Richtung der DNA-Replikation vom OR aus an. Der kürzere leere Pfeil zeigt die Position des lac-Promotor-Operators (lac ^PO).
1B zeigt die DNA-Sequenz von 215 bp, die an der XbaI-Stelle von pUCK19 eingefügt ist. Dieses Plasmid wird hier als pUCK106 bezeichnet. Die leeren Pfeile zeigen die IR-Sequenzen. Die HindIII-Stelle (AAGCTT) zeigt das Zentrum der IR.
Fehlgepaarte Positionen in der IR sind durch zwei offene Zwischenräume in den Pfeilen dargestellt, wobei die fehlgepaarten Basen C und T in den Zwischenräumen eingefügt sind.
Das vorstehend beschriebene DNA-Fragment (das die IR enthält) besitzt die folgende Sequenz (SEQ ID NO: 1):
Beispiel 2
Dieses Beispiel erläutert die Herstellung einer sIDNA aus pUCK106 und ihre Eigenschaften.
(A) E. coli CL83 wurde entweder mit pUCK19, mit pUCK106 oder mit pUCK106Δlac ^PO transformiert, sodann wurde eine Plasmid-DNA-Fraktion hergestellt. Ein DNA-Präparat (nach der Behandlung mit Ribonuclease A) wurde auf ein 5 Acrylamid-Gel aufgetragen und eine Elektrophorese durchgeführt. Das Gel wurde mit Ethidiumbromid gefärbt. Bahn 1 zeigt die Produkte der HaeIII-Spaltung von pBR322 als Größenmarker; Bahn 2 zeigt das DNA-Präparat aus Zellen, die pUCK19 enthalten; Bahn 3, pUCK106; und Bahn 4, pUCK106Δlac^PO.
pUCK19 ist eine Kanamycin-Variante von pUC19.
(B) Die sIDNA aus pUCK106 wurde durch Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese gereinigt, worauf verschiedene Restriktionsenzym-Spaltungen folgten. Die Spaltprodukte wurden durch eine Elektrophorese auf einem 5 Polyacrylamid-Gel analysiert, wobei das Gel durch Ethidiumbromid gefärbt wurde. Mit Bezug auf 2 zeigt Bahn 1 die Produkte der HaeIII-Spaltung von pBR322 als Größenmarker; Bahn 2, die sIDNA ohne Spaltung; Bahn 3, die sIDNA, gespalten mit XbaI; Bahn 4, mit HindIII; und Bahn 5, mit Pvull.
(C) Hitzedenaturierung der sIDNA aus pUCK106. Die gereinigte sIDNA (wie vorstehend beschrieben) wurde in 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) und 1 mM EDTA gelöst. Die sIDNA-Lösung wurde drei Minuten in einem kochenden Wasserbad inkubiert und sodann in einem Eisbad schnell abgeschreckt. Die Proben wurden wie in (A) beschrieben analysiert. Mit Bezug auf 2 zeigt Bahn 1 die Produkte der HaeIII-Spaltung von pBR322 als Größenmarker; Bahn 2, die sIDNA ohne Hitzebehandlung; und Bahn 3, die sIDNA, hitzedenaturiert und anschließend rasch abgekühlt.
Beispiel 3
Dieses Beispiel erläutert die Dimer-Erzeugung der sIDNA aus pUCK106.
(A) Die gereinigte sIDNA aus pUCK106, wie in 2 dargestellt, wurde in 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl und 10 mM MgCl₂ gelöst. Die sIDNA-Lösung wurde drei Minuten in einem kochenden Wasserbad inkubiert und anschließend allmählich abgekühlt. Die renaturierte sIDNA wurde mit XbaI gespalten, und die auf diese Weise erzeugten DNA-Fragmente wurden an ihren 5'-Enden mit [γ-³²P]-ATP und T4-Polynucleotid-Kinase markiert. Diese Produkte wurden auf ein 5 Polyacrylamid-Gel aufgetragen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel getrocknet und einer Autoradiographie unterworfen.
Mit Bezug auf 3 zeigt Bahn 1 die Produkte der HaeIII-Spaltung von pBR322 als Größenmarker; Bahn 2, die Produkte der EcoRI- und HindIII-Spaltung der λ-DNA als Größenmarker; Bahn 3, die sIDNA aus pUCK106 ohne Behandlung; Bahn 4, die Produkte der XbaI-Spaltung der unbehandelten sIDNA; Bahn 5, die sIDNA nach der Hitzedenaturierung und dem anschließenden allmählichen Abkühlen; und Bahn 6, die Produkte der XbaI-Spaltung der sIDNA von Bahn 5. Die Banden sind an der rechten Seite mit "a" bis "e" bezeichnet.
(B) Charakterisierung von Fragment "d" in 3A. Das Fragment "d", das aus dem Gel gereinigt worden war; Bahn 3, die Produkte der HindIII-Spaltung des gereinigten Fragments "d"; und Bahn 4, das gereinigte Fragment "d" wurde hitzedenaturiert und rasch abgeschreckt, wie mit Bezug auf 2 beschrieben.
(C) Schematische Darstellung der in A und B gezeigten Banden "a" bis "e". X und H stellen die XbaI- bzw. die HindIII-Stelle dar. In Fragment "a" liegen zwei weitere HindIII-Stellen sehr nahe bei den XbaI-Stellen vor (innerhalb des Fragments "c"). Diese HindIII-Stellen sind nicht dargestellt.
Beispiel 4
In diesem Beispiel wird die Bestimmung der DNA-Sequenz der sIDNA aus pUCK106 erläutert.
(A) Bestimmung der DNA-Sequenz der 5'-Endregion der sIDNA. 0,2 μg der isolierten und gereinigten sIDNA wurden für die Sequenzierung durch das Kettenabbruchverfahren verwendet. Der Primer "a" (5'-GGTTATCCACAGAATCAG-3') (SEQ ID NO: 2), welcher der Sequenz 96 by stromabwärts vom Ursprung entspricht (vgl. 4B), wurde als Primer eingesetzt.
(B) Sequenzierung des 5'-Endes der Schleifenregion der sIDNA. 0,5 μg der sIDNA wurden mit SacII gespalten, anschließend wurden die auf diese Weise erzeugten DNA-Fragmente am 5'-Ende mit [γ-³²P]-ATP und T4-Polynucleotid-Kinase markiert. Das DNA-Fragment, das auf eine Höhe von etwa 40 by gewandert war, wurde isoliert und durch das Maxam-Gilbert-Verfahren sequenziert.
(C) Sequenzierung des 3'-Endes der Schleifenregion der sIDNA. Das Produkt der SacII-Spaltung der sIDNA wurde am 3'-Ende mit [γ-³²P]-Didesoxy-ATP markiert, wobei die terminale Desoxynucleotidyl-Transferase eingesetzt wurde. Das DNA-Fragment, das die Schleifenregion enthielt, wurde isoliert und durch das Maxam-Gilbert-Verfahren sequenziert.
(D) DNA-Sequenz der 3'-Endregion der sIDNA. Die sIDNA wurde mit AfIIII gespalten (vgl. 4E). Die 5'-Enden wurde mit [γ-³²P]-ATP und T4-Polynucleotid-Kinase markiert Die markierten Produkte wurden durch ein Sequenzierungsgel aufgetrennt. Die einzelsträngige DNA, die auf eine Höhe von 76 Basen wanderte, wurde isoliert und durch das Maxam-Gilbert-Verfahren sequenziert. Mit Bezug auf 4D stellen die Zahlen die Nummern der Reste vom Ursprung von pUCK19 aus dar.
(E) Struktur der sIDNA aus pUCK106. Die sIDNA besteht aus einer einzelsträngigen DNA von 1137 bis 1139 Basen. Es zeigt sich, dass das 5'-Ende der sIDNA heterogen ist; einige beginnen von +1 aus, während andere von –1, +2 und +3 aus beginnen. Die Position +1 entspricht dem Ursprung der ColE1-DNA-Replikation. Somit weisen verschiedene sIDNAs am 5'-Ende unterschiedlich lange Stränge auf. Am 3'-Ende ist eine Sequenz von 16 Basen über die Position +1 des 5'-Endes hinaus verlängert. Man geht davon aus, dass die Schleife mit der aus vier Basen bestehenden Sequenz (AGCT) erzeugt wird, die der Sequenz im Zentrum der IR-Struktur entspricht, wo der Entwurf eine Plazierung einer HindIII-Stelle (AAGCTT) vorsieht. Das Basenpaar, das der Fehlpaarung in der IR-Struktur in pUCK106 entspricht, wurde von C·T (in pUCK106) zu C·G (in der sIDNA) umgewandelt und ist zwischen der SacII- und der PstI-Stelle dargestellt. Die Position des Primers "a", der für die DNA-Sequenzierung in 4A eingesetzt wurde, ist durch einen Pfeil bezeichnet.
Die Trennung und Reinigung der sIDNAs wurden gemäß Standardverfahren durchgeführt, etwa durch die Verfahren, die in "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Sambrook et al., 2. Aufl., (Abschnitte 1.121 bis 1.40), ("Sambrook") beschrieben sind.
Beispiel 5
Dieses Beispiel erläutert zwei mögliche Modelle der sIDNA-Synthese. Oben ist die doppelsträngige DNA im Bereich des Ursprungs der ColE1-DNA-Replikation dargestellt. Der schraffierte Kreis stellt den DNA-Replikationskomplex dar, der die DNA-Replikation vom Ursprung aus in Gang setzt. Die leeren Pfeile auf dem DNA-Strang zeigen die Position der 35 by großen Struktur der umgekehrten Sequenzwiederholung (IR) (vgl. 1B) in der DNA-Sequenz. Das fehlgepaarte Basenpaar (C·T) in der IR-Struktur ist auch innerhalb der Pfeile angegeben.
In Schritt 1 läuft die DNA-Replikationsgabel vom Ursprung (Position +1) aus zu der Position, die mit dem schraffierten Kreis bezeichnet ist. Der neu synthetisierte erste Strang ist dargestellt, der sich vom Ursprung aus (einem gefüllten Kreis) zu der Replikationsgabel hin erstreckt. Der DNA-Replikationskomplex reicht bis unmittelbar vor dem fehlgepaarten Rest T in der IR-Struktur, die durch ausgefüllt Pfeile dargestellt ist. Im Schritt 2 löst sich das 3'-Ende des naszierenden Strangs vom DNA-Replikationskomplex, und eine sekundäre Struktur wird durch die IR-Struktur erzeugt. Im Schritt 3 beginnt die DNA-Synthese wieder neu vom 3'-Ende der Stamm-Schleife-Struktur aus, wobei entweder der naszierende Strang (Modell A) oder der obere elterliche Strang (Modell B) als Matrize verwendet wird. Im Schritt 4 läuft die DNA-Synthese noch um 16 Basen über den Ursprung hinaus.
Im Modell A kann die Primer-RNA, die am 5'-Ende der DNA befestigt verbleibt, als die Primere-RNA verwendet werden. Anschließend kann die RNA entfernt werden, dies führt dann zur Ausbildung der sIDNA. Im Modell B endet die DNA-Synthese an der terH-Stelle durch einen ähnlichen Mechanismus, wie er für die Beendigung der Synthese des zweiten DNA-Strangs bekannt ist.
Mit beiden Modellen A und B lässt sich die Synthese erklären, wobei die Synthese auch, mindestens zeitweise, durch beide Routen gleichzeitig ablaufen kann. Somit wird für den zweiten Strang eine geeignete Matrize eingesetzt, die eine andere ist als derjenige Strang, der die Matrize für den ersten Strang war.
Beispiel 6
Konstruktion von pUCK106Δlac^PO
Wenn das 199 by große Pvull-HincII-Fragment, das den lac-Promotor-Operator enthält, aus dem pUCK106 deletiert wurde (vgl. 1A), erzeugte das resultierende pUCK106Δlac ^PO eine neue sIDNA, die schneller wanderte als die sIDNA aus pUCK106, wie an Position (b) in Bahn 4 von 2A gezeigt wird. Diese neue sIDNA hatte eine Länge von 360 bp, sie ist somit kürzer als die pUCK106sIDNA, und zwar um eine Strecke, die mit der Größe der Deletion in pUCK106Δlac ^PO annähernd identisch ist.
In 2A zeigt die Bahn 3 die sIDNA aus dem DNA-Präparat der Zellen, die pUCK106Δlac ^PO enthalten.
Dieses Experiment spricht für das vorstehend vorgeschlagene Modell für die Synthese der sIDNA und zeigt außerdem, dass der lac-Promotor-Operator für die Synthese der sIDNA nicht essentiell ist. Diese Aussage wurde weiterhin dadurch bekräftigt, dass die Zugabe von Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid, eines Induktors von lac, die Produktion der sIDNA aus pUCK106 nicht beeinträchtigte. Jedoch ist bisher der Grund für die Reduktion der sIDNA-Synthese aus pUCK106Δlac ^PO noch nicht bekannt.
Beispiel 7
Die Synthese der sIDNA war nicht von der Primärsequenz der IR-Struktur abhängig, die für pUCK106 eingesetzt wurde. Interessanterweise ist auch der Vektor pUC7 selbst, der eine IR-Struktur an der Polylinkerstelle aufweist, in der Lage, eine sIDNA zu produzieren, die dem DNA-Fragment vom Ursprung bis zum Zentrum der Polylinkerstelle entspricht.
Die isolierte und gereinigte sIDNA, die aus pUC7 hergestellt wurde, wies eine Länge von 252 by auf. Eine Plasmidfraktion wurde wie in Beispiel 2 hergestellt und behandelt, anschließend wurde sie einer Acrylamid-Gel-Elektrophorese unterworfen (und gefärbt).
In 6 zeigt die Bahn 1 das Produkt der HaeIII-Spaltung von pBR322 als Größenmarker. Die Bahn 2 zeigt die sIDNA bei der Herstellung aus pUC7.
Die sIDNA von pUC7 wurde durch PCR amplifiziert (die hier noch genauer beschrieben wird).
Beispiel 8
Bestätigung der sIDNA-Struktur
Die sIDNA-Struktur und der Mechanismus wie vorstehend beschrieben (in 5 erläutert) wurden wie folgt bestätigt.
Das DNA-Fragment, das synthetisch konstruiert wurde, wurde gezielt mit den fehlgepaarten Basen CT anstelle von CG versehen. Vgl. 1B in den offenen Zwischenräumen der IR. Nach der Synthese der sIDNA (wobei der zweite Strang über den ersten Strang zurück schnappte) war die Fehlpaarung wieder repariert. In 4E liegt nun CG vor. Wenn die Struktur jedoch keine zurück schnappende Struktur gewesen wäre, dann hätte die Polymerase direkt über die IR abgelesen, folglich hätte sie das T gelesen und ein A eingefügt; der neue Strang hätte dann noch immer die Fehlpaarung aufgewiesen. Um das fehlgepaarte T zu ersetzen, ist es also erforderlich, dass dieser IR-Teil auf den ersten Strang zurück schnappt, so dass die Polymerase in die Lage versetzt wird, den ersten synthetisierten Strang als Matrize zu verwenden, um den zweiten Strang zu synthetisieren, und während sie ihn synthetisiert, die komplementäre Base G anstelle der fehlgepaarten Base T einzufügen. Hierdurch werden der Synthesemechanismus und die Struktur der sIDNAs der vorliegenden Erfindung eindeutig bestätigt.
Genaue Beschreibung von verschiedenen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung
Die Erfinder haben die grundlegende Entdeckung gemacht, dass ein Teil des Genoms direkt aus dem Genom verdoppelt wird. Der entdeckte Mechanismus benötigt weder ein RNA-Zwischenprodukt noch eine reverse Transkriptase (RT), wie bekannt ist (vgl. Weiner et al., Ann. Rev. Biochem. 55: 631 (1986); Kornberg, in: "DNA Replication" (W. N. Freeman and Company, San Francisco, CA, 1980), S. 101–166). Brauchbare DNA-Strukturen wurden entdeckt, die mit Stamm-Schleife-DNAs (sIDNA) bezeichnet wurden.
Die Erfindung stellt verschiedene Ausführungsformen in Form einer Einführung bereit. Eine Ausführungsform stellt ein Verfahren (oder einen Prozess) zum Synthetisieren eines neuen und brauchbaren ssDNA-Moleküls (oder Struktur) dar. Ein Aspekt dieser Ausführungsform stellt ein in vitro-System dar, das zum Synthetisieren eines solchen Moleküls eingesetzt wird, wobei das Molekül ein DNA-Fragment umfasst, das eine geeignete Primeranlagerungsstelle, eine umgekehrte Sequenzwiederholung (IR) und andere Komponenten enthält, die für die Synthese der sIDNAs erforderlich sind.
In dem System zum Synthetisieren solcher Moleküle werden ein kompetentes selbst-replizierendes Vehikel und andere Komponenten des Systems eingesetzt. Das selbst-replizierende Vehikel enthält vorteilhafterweise eine umgekehrte Sequenzwiederholung, eine DNA, die für die Replikation eines ersten Strangs der sIDNA als Matrize dient, eine geeignete Primeranlagerungsstelle für die Matrize, um die DNA-Synthese in der entgegengesetzten Richtung zu starten, und gegebenenfalls den zweiten Strang der elterlichen DNA und andere Komponenten, die noch beschrieben werden.
Die Erfindung stellt ein Verfahren zum Synthetisieren eines einzelsträngigen DNA-Moleküls (ssDNA) bereit. Das Molekül umfasst eine Stamm-Schleife-Struktur (sIDNA), wobei der Stamm aus einer verdoppelten DNA von anelierten komplementären Basen innerhalb der ssDNA besteht, wobei der Stamm an dem einen Ende die 5'- und 3'-Enden des ssDNA-Moleküls und an dem anderen Ende eine einzelsträngige Schleife aus DNA ausbildet, die die entgegengesetzten Enden der verdoppelten DNA verbindet. Das Verfahren wird in einem System durchgeführt, das die herkömmlichen Bestandteile für eine DNA-Synthese sowie die folgenden Bestandteile enthält:

(a) eine Matrizen-DNA, die eine geeignete Primeranlagerungsstelle und eine umgekehrte Sequenzwiederholung (IR) stromabwärts dieser Primeranlagerungsstelle enthält,
(b) einen Primer für die Matrize, um den Start der DNA-Polymerisation zu ermöglichen, und
(c) eine DNA-Polymerase, um die sIDNA aus der Matrize zu replizieren. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte: (1) Primeranlagerung an die DNA-Matrize, um den Start der DNA-Polymerisation zu ermöglichen, (2) Synthetisieren der ssDNA vom Primer aus unter Verwendung eines der Doppelstränge der DNA als Matrize, wodurch der eine Strang erzeugt wird, Fortsetzen der DNA-Synthese des Strangs in die IR-Sequenz hinein und Zulassen des Abbruchs der Synthese innerhalb der IR-Sequenz, (3) Zulassen, dass sich komplementäre Basen innerhalb des neu synthetisierten Strangs an der IR-Sequenz anelieren, wodurch an dem einen Ende eine Schleife aus einer nicht verdoppelten Region und eine verdoppelte Region ausgebildet werden, wobei die verdoppelte Region als eine Primeranlagerungsstelle für die weitere DNA-Synthese fungiert, (4) Fortfahren mit der DNA-Synthese, wobei als Matrize der neu synthetisierte Strang und/oder der andere Strang der DNA verwendet werden bzw. wird, (5) Erzeugen der sIDNA, und (6) Abtrennen und Isolieren der sIDNA.

Das Verfahren wird in einem System durchgeführt, das alle erforderlichen herkömmlichen Bestandteile für eine DNA-Synthese enthält. Diese Bestandteile können von Natur aus vorliegen, wenn das Verfahren in vivo durchgeführt wird; normalerweise werden sie jedoch zu dem System zugefügt, wenn das Verfahren in vitro durchgeführt wird.
Für das Verfahren ist das Vorliegen einer DNA erforderlich, die eine geeignete Primeranlagerungsstelle und eine umgekehrte Sequenzwiederholung stromabwärts der Primeranlagerungsstelle aufweist. Die DNA dient als Matrize zur Steuerung der DNA-Replikation. Der Primer kann ein beliebiges Oligonucleotid sein (das natürlich vorkommen kann oder das synthetisch hergestellt werden kann), das so wirken kann, dass es die Synthese eines Primer-Verlängerungsproduktes in Gang setzt, welches zu einem Nucleinsäurestrang komplementär ist. Das Verfahren zum Initiieren von DNA-Strängen ist natürlich bekannt (vgl. Watson, "Molecular Biology of the Gene, 3 Aufl., W. A. Benjamin, Inc.; "DNA Synthese: Present and Future", Molineux und Kohiyama, Hrsg., (1977), Teil V, "G4 and ST-1 DNA Synthesis In Vitro" von Wickner; Teil VII, "DNA Synthesis in Permeable Cell Systems from Saccharomyces cerevisiae", von Oertel und Goulian). Zur Synthese des zweiten Strangs können andere Polymerasen beitragen als diejenigen, die an der Synthese des ersten Strangs beteiligt sind. Der Primer kann ein DNA- oder ein RNA-Primer sein. Die Synthese wird in Gegenwart von Nucleotiden und eines Polymerisationsmittels, wie einer DNA-Polymerase, bei einer geeigneten Temperatur und einem geeigneten pH-Wert induziert.
Bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird ein Polymerisationsmittel eingesetzt, etwa ein Enzym, das die Synthese des Strangs an der Matrize entlang katalysiert. Enzyme, die für diese Zweck geeignet sind, umfassen z.B. eine beliebige DNA-Polymerase, wie die E. coli DNA-Polymerase I oder III, das Klenow-Fragment der E. coli DNA-Polymerase I, die T4-DNA-Polymerase, die T7-DNA-Polymerase, die reverse Transkriptase (RT), virale Polymerasen, umfassend hitzestabile Enzyme. Jede beliebige Polymerase ist geeignet, die ihre Initiationsstelle für die DNA-Replikation erkennen kann. Wenn das Verfahren in vivo durchgeführt wird, liegen diese genetischen Elemente im Allgemeinen bereits vor; wenn dies jedoch nicht der Fall ist oder wenn das Verfahren in vitro durchgeführt wird, werden sie zu dem System zugegeben.
Jede beliebige Polymerase, welche die Initiationsstelle erkennt, kann die Polymerisation bewirken oder dazu beitragen. Obwohl sich die Erfinder zurzeit auf keine bestimmte Theorie festlegen wollen, kann nicht ausgeschlossen werden, dass diejenige Polymerase, die an der Synthese des ersten Strangs beteiligt war, auch zur Synthese des anderen oder zweiten DNA-Strangs beiträgt. In diesem Verfahren wird somit die Synthese des zweiten Strangs so lange fortgesetzt, bis sie am Ende 3' hinter dem 5'-Ende des zuerst gebildeten Strangs endet. Auf diese Weise wird hierdurch der verdoppelte Stamm der sIDNA ausgebildet.
Informationen über DNA-Polymerasen sind verfügbar. Vgl. z.B. Kornberg, in: "DNA Replication" (W. H. Freeman and Company, San Francisco, CA, 1980), S. 101–166, Kapitel 4, "DNA Polymerase I of E. coli", Kapitel 5, "Other Procaryotic Polymerases", Kapitel 6, "Eucaryotic DNA Polymerases", und Kapitel 7.
Auch andere Polymerasen können in Betracht gezogen werden, wie diejenigen, die zur Synthese des zweiten Strangs bei der cDNA eingesetzt werden können.
In einer spezifischen, vorstehend beschriebenen Erläuterung wird postuliert, dass die Polymerasen die zwei folgenden sind: die DNA-Polymerase III und die Polymerase I.
Wenn eine gewünschte oder eine Ziel-Nucleinsäuresequenz repliziert werden soll, die in der Lage ist, ein Protein zu codieren, z.B. ein Gen als Teil der synthetisierten sIDNAs, dann wird die Sequenz stromaufwärts der IR plaziert. Wenn die Replikation z.B. in einem Replikationsvehikel stattfindet, wie einem Vektor, z.B. pUCK106, der einen Replikationsursprung (OR) besitzt, ist die Ziel-Nucleinsäuesequenz zwischen der IR und dem OR positioniert.
In dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird ein doppelsträngiges DNA-Fragment eingesetzt, das wie beschrieben eine Primeranlagerungsstelle und außerdem eine umgekehrte Sequenzwiederholung (IR) aufweist, d.h. zwei Kopien einer identischen Sequenz, die in der umgekehrten Orientierung vorliegen. Die IR kann als eine Sequenz oder als ein "Palindrom" vorliegen.
Wie nachstehend noch beschrieben wird, sind bestimmte Enzyme gegenüber anderen Enzymen bevorzugt, wie z.B. die RT, wenn zufällige Punktmutationen in eine Nucleinsäuresequenz eingeführt werden sollen.
Die Synthese des ersten Strangs läuft entlang der dsDNA-Matrize durch die IR hindurch in fortlaufender Art und Weise ab, wodurch es zur Replikation des gesamten Plasmidgenoms kommt. Mit einer bestimmten Häufigkeit wird die Synthese des DNA-Strangs innerhalb der IR abgebrochen, so dass eine kurze Region einer Sequenz erzeugt wird, die zu sich selbst komplementär ist, die eine Schleife bildet und sich an der IR-Sequenz mit sich selbst aneliert. Diese doppelsträngige Region innerhalb des neu synthetisierten Strangs wird als Primeranlagerungsstelle für den zweiten oder anderen DNA-Strang erkannt. Die Synthese des zweiten Strangs startet, indem der erste erzeugte Strang und/oder der andere elterliche Strang der DNA als Matrize verwendet wird. Somit kann man davon ausgehen, dass eine Matrizen-Umleitung erfolgt.
Wenn der zweite Strang durch die Polymerase synthetisiert wird, welche die Nucleotide einbaut, wird der Stamm aus den anelierten komplementären Basen ausgebildet, dies führt zu einer verdoppelten Struktur mit einer inneren Komplementarität.
Die Synthese des zweiten Strangs läuft den ganzen Weg zurück bis zum ersten Nucleotid des zuerst synthetisierten Strangs durch den RNA-Primer dieses ersten Strangs hindurch ab, der am Ende zerfällt, wodurch ein 3'-Überhang bereitgestellt wird. In einer spezifischen Erläuterung geht man davon aus, dass die DNA-Synthese an der terH-Stelle durch einen ähnlichen Mechanismus beendet wird, wie er in Dasgupta et al., Cell 51: 1113 (1987), beschrieben ist.
Durch geeignete Manipulationen kann die Länge des überhängenden 3'-Endes gesteuert werden, z.B. kann es verlängert werden, etwa indem die terH-Stelle von der Primeranlagerungsstelle aus stromabwärts verschoben wird.
Weiterhin ist es auch möglich, dass anstelle eines Stamms mit einem überhängenden 3'-Ende vielmehr die Synthese des zweiten Strangs vor dem Ende des ersten Strangs blockiert wird, indem eine geeignete Terminationsstelle, z.B. terH, stromaufwärts der Primeranlagerungsstelle eingebaut wird. Folglich ist es so gemeint, dass jeder der Stränge im Bezug auf den anderen um eine bestimmte Strecke länger sein kann.
Wenn die Synthese des zweiten Strangs endet, trennen sich die Matrize und die erzeugte sIDNA voneinander.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann in Zyklen so oft wie gewünscht wiederholt werden. Wenn irgendwelche der erforderlichen Bestandteile zur Neige gehen, können sie je nach Bedarf ergänzt werden.
Wenn das Verfahren in vivo durchgeführt wird, wird eine geeignetes kompetentes Replikationsvehikel bereitgestellt, welches das erforderliche Matrizen-DNA-Fragment enthält, das eine Primeranlagerungsstelle und eine IR stromabwärts der Primeranlagerungsstelle aufweist. Das DNA-Fragment, das die IR enthält, wird normalerweise in eine Restriktionsstelle eingefügt, die in einer Polylinkersequenz einmalig vorliegt. Ein Plasmid wurde verwendet, in dem der Polylinker eine IR (und symmetrische Restriktionsstellen) aufweist. Sofern von Natur aus kein Primer vorliegt, kann das DNA-Fragment mit einem Primer für die DNA-Sequenz ausgestattet werden; die Polymerase kann zum Vehikel gehören, dies muss jedoch nicht der Fall sein. Das Vehikel enthält außerdem alle weiteren Elemente, die für die Replikation und die Erzeugung der sIDNAs erforderlich sind.
Aus den vorstehenden Angaben ist ersichtlich, dass jeder beliebige selbstreplizierende Vektor zum Synthetisieren der sIDNAs geeignet ist, der ein DNA-Fragment, das als die Matrize dienen kann, eine IR-Sequenz und die erforderlichen Elemente enthält, um das Priming zu bewirken und die Replikation des Strangs fortzusetzen, der sodann die sIDNA ausbildet.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung stellt die ss-sIDNAs bereit. Diese Strukturen wurden vorstehend bereits beschrieben. Nachstehend folgt noch eine weitere Beschreibung.
Die Struktur, die mit "Stamm-Schleife" oder "sIDNA" bezeichnet wurde, ist einzelsträngig. Eine Erläuterung einer sIDNA findet sich in 4E (aus pUCK106) und in 6 (aus pUC7).
Typische sIDNAs enthalten einen verdoppelten doppelsträngigen Stamm von anelierten komplementären Basen und eine Schleife eines Einzelstrangs von Nucleotiden, welcher die zwei Stränge des Stamms verbindet. Die Einzelsträngigkeit der Schleife stellt ein weiteres interessantes Merkmal der sIDNAs der vorliegenden Erfindung dar. Die sIDNAs können eine Schleife mit einer sehr kurzen Sequenz von Nucleotiden oder auch mit deutlich längeren Sequenzen umfassen. Die sIDNAs können eine Nucleotidsequenz enthalten, die gerade lange genug ist, um die Schleife und eine Basenpaarung auszubilden, durch die ein kurzer verdoppelter Doppelstrang erzeugt wird. Die Mindestgröße sollte eine Basenpaarung möglich machen, die ausreichend groß ist, um eine Primeranlagerungsstelle für den Start der Synthese des zweiten Strangs bereitzustellen. Die Mindestgröße der Schleife wird möglicherweise durch die Spannungen auf den Basen begrenzt, die deren Paarung zu einer stabilen Struktur verhindern könnten. Die maximale Größe wird durch die Verwendung beeinflusst, die für die sIDNAs vorgesehen ist. Die in 4B dargestellte Schleife besteht aus vier Basen; es sind jedoch auch Schleifen mit 10, 20 oder mehr Basen vorstellbar. Die Einzelsträngigkeit der Schleife der sIDNAs stellt ein Merkmal dar, das für die Verwendungsmöglichkeiten recht brauchbar sein kann, die für die sIDNAs vorgeschlagen wurden.
Eine weitere interessante Struktur, die für die sIDNAs denkbar ist, besteht aus doppelten sIDNAs. In dieser Struktur sind die freien Enden der Einzelstränge der zwei sIDNAs miteinander verbunden. Man kann davon ausgehen, dass die Struktur extrem stabil ist. Wenn diese ssDNAs Bedingungen ausgesetzt werden, unter denen DNAs normalerweise denaturiert werden, ist es sehr wahrscheinlich, dass sie zu ihrer ursprünglichen Struktur "zurück schnappen". Die Verbindung der Stränge erfolgt durch herkömmliche Verfahren mit DNA- und/oder RNA-Ligasen. Solche Strukturen können auch ausgewählte Gene zum Codieren von Proteinen enthalten und stellen somit interessante neue praktische Möglichkeiten bereit.
Man kann davon ausgehen, dass die Stabilität, eine wichtige Eigenschaft der sIDNAs, immer mehr zunimmt, je länger die verdoppelten Schwänze sind; somit sind solche Strukturen begünstigt, wenn dies eine gewünschte Eigenschaft darstellt. Es sollte beachtet werden, dass alle sIDNAs, die aus einem einzelnen Replikationsvehikel erzeugt werden, nicht notwendigerweise eine identische Größe aufweisen. In der vorstehend dargestellten Erläuterung zeigt sich, dass bei der sIDNA aus pUCK106 das 5'-Ende des ersten Strangs heterogen ist, wobei einige Stränge von der Position +1 aus beginnen (die dem Ursprung der ColE1-Replikation entspricht) (vgl. Tomizawa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 1865 (1977)), während andere Stränge von der Position –1, +2 und +3 aus starten. Somit können die DNAs als eine Familie von analogen sIDNAs angesehen werden.
Außerdem kann darauf hingewiesen werden, dass das Vorliegen von einer oder mehreren Fehlpaarungen in dem DNA-Fragment jenseits der IRs weder die Synthese noch die Struktur der sIDNAs ungünstig beeinflusst. Dies wird durch die Fehlpaarung T für G verdeutlicht, die in diesem Fall 25 Nucleotide entfernt vom Zentrum des Palindroms liegt (vgl. 1B). Diese Fehlpaarung wurde bei der Synthese der sIDNA repariert.
Verschiedene Anwendungsmöglichkeiten für die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung bereitgestellten sIDNAs werden hier vorgeschlagen, die aus dem ssDNA-Überhang des einen Endes des Schwanzes gegenüber dem anderen einen Nutzen ziehen. Man wird deshalb verstehen, dass es sich hierbei um ein wichtiges Merkmal der neuen Strukturen der vorliegenden Erfindung handelt.
Anhand der Synthese der sIDNAs in dem erläuterten Plasmid wird die beste Art und Weise zur Durchführung der Erfindung beschrieben. Jedoch kann zum Synthetisieren der sIDNAs auch jeder beliebige andere Vektor eingesetzt werden, der die IR und die anderen hier beschriebenen Bestandteile enthält.
Die IR ist eine Struktur, die in Procaryoten und in Eukaryoten häufig vorkommt. Jede beliebige solche IR kann in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Ferner können IR-Sequenzen auch synthetisch hergestellt werden. Zur Erläuterung dient die synthetisierte IR, die in 1B dargestellt ist.
IR-Sequenzen oder Palindrom-Sequenzen wurden aus E. coli erhalten (Gilson et al., Nucl. Acids Res. 18: 3941 (1990)); Gilson et al., Nucl. Acids Res. 19: 1375 (1991), beschrieben Palindrom-Sequenzen aus E. coli und Salmonella enteritica (eine Palindromeinheit-Sequenz mit einer Länge von 40 Nucleotiden). Chalker et al., Gene 71 (1): 201–205 (1988), beschreiben die Propagierung eines 571 by großen Palindroms in E. coli; umgekehrte Sequenzwiederholungen werden von Lewis et al., J. Mol. Biol. (England) 215 (1): 73–84 (1990), in Bacillus subtilis beschrieben (eine 26 Basenpaare große Sequenzwiederholung); und Saurin, Comut. Appl. Biosci. 3 (2): 121–127 (1987), diskutiert die Verwendung eines neuen Computerprogramms zur systematischen Suche nach repetitiven Palindrom-Strukturen in E. coli. Die folgenden US Patente beschreiben Palindrom-Sequenzen: 4 975 376; 4 863 858; 4 840 901; 4 746 609; 4 719 179; 4 693 980 und 4 693 979.
Palindrome wurden so definiert, dass sie umgekehrte repetitive Sequenzen enthalten, in denen fast die gleichen (nicht notwendigerweise die gleichen) Sequenzen in der entgegengesetzten Richtung laufen. Obwohl einige kurz sind (drei bis zehn Basen in der einen Richtung), sind andere viel länger und umfassen Hunderte von Basenpaaren (vgl. Watson, Molecular Biology of the Gene, 3. Aufl., S. 224–225).
Die IR in dem DNA-Fragment kann in der Größe deutlich variieren. Ohne sich darauf beschränken zu wollen, können sIDNAs mit umgekehrten Sequenzwiederholungen von 10 bis 30 oder mehr Nucleotiden in Betracht gezogen werden. Außerdem wurden umgekehrte Sequenzwiederholungen beschrieben, die mehr als 300 by enthielten (vgl. Current Protocols, Abschnitt 1.4.10).
Die sIDNAs können das Syntheseprodukt der Expression eines prokaryotischen oder eines eukaryotischen Wirts sein (z.B. von bakteriellen Zellen, Hefezellen oder Säugerzellen).
Beispiele von geeigneten Vektoren, z.B. eines Plasmids, und einer dadurch transformierten Wirtszelle sind dem Fachmann bekannt. Zu den geeigneten Wirten für ein Plasmid, das die erforderlichen Bestandteile enthält, zählen Prokaryoten und Eukaryoten. Prokaryoten umfassen Mikroorganismen, z.B. der Gattung Escherichia, insbesondere E. coli; der Gattung Bacillus, insbesondere B. subtilis.
Plasmide, die E. coli transformieren können, umfassen z.B. die Plasmide vom Typ pUC und ColE1 (vgl. das US Patent Nr. 4 910 141). Plasmide, die E. coli transformieren können, umfassen z.B. Plasmide vom Typ ColE1 im Allgemeinen. Andere geeignete Plasmide zum Transformieren von E. coli umfassen: pSC101, pSF2124, pMB8, pMB9, pACYC184, pACYC177, pCK1, R6K, pBR312, pBR313, pML2, pML21, ColE1AP, RSF1010, pVH51 und pVH153.
Plasmide, die B. subtilis transformieren können, umfassen: pC194, pC221, pC223, pUB112, pT127, pE194, pUB110, pSA0501, pSA2100, pTP4, pTP5 und ihre Derivate. Plasmide, die sowohl B. subtilis als auch E. coli transformieren können, sind in J. Bacteriol. 145: 422–428 (1982); in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1433–1436 (1978); und in "Principles of Gene Manipulation", 2. Aufl., Carr et al., Hrsg., University of Ca. Press, Berkley, 1981, S. 48, beschrieben.
Von besonderem Interesse beim Durchführen der Synthese der sIDNAs in Eukaryoten sind die folgenden Plasmide, die S. cerevisiae transformieren können: pMP78, YEp13, pBTI1, pLC544, YEp2, YRp17, pRB8 (YIp30), pBTI7, pBTI10, pAC1, pSLe1, pJDB219, pDB248 und YRp7. Außerdem sollten YIp5, pUC-URA3, pUC-LEU2 und pUC-HIS3 erwähnt werden. Vgl. die Seite 285 und die Seiten 373–378 in: Methods in Enzymology, Bd. 194, "Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology", Hrsg., Guthrie und Fink, (1991),. Academic Press, Inc. Weitere Hefevektoren sind auf den Seiten 100–104 in: "Experimental Manipulation of Gene Expression", Hrsg. Masayori Inouye, Academic Press, Inc., (1983), beschrieben.
Weiterhin sind Pendelvektoren ("shuttel vectors") von besonderem Interesse, die zum Transformieren von sowohl E. coli als auch Hefen wie S. cerevisiae eingesetzt werden können. Solche Vektoren umfassen die Folgenden: pKB42 und pYC1. Andere Beispiele sind in dem Abschnitt über "Cosmid Vectors for Low and Higher Eucaryotes" in: "A Practical Guide to Molecular Cloning", 2. Aufl., von Bernard Perbal (1988), Wiley and Sons, beschrieben. Weitere geeignete Vektoren sind in Bd. 2, in den Abschnitten 13.4.1, 13.4.2, (1989), Current Protocols, beschrieben. Andere geeignete Vehikel umfassen gebräuchliche Multicopy-Vektoren, wie YEp24 (Botstein et al., Gene 8: 17 (1979)) und pJDB207 (Beggs, Genetics Engineering (Hrsg. Williamson), Bd. 2, S. 175, Academic Press, (1992)). Andere, die ausgewählt werden können, umfassen Plasmide der Klassen YIp, wie YEp51 und YEp52.
Beispiele von kommerziell verfügbaren eukaryotischen Vektoren zum Durchführen der vorliegenden Erfindung sind pSVL und pKSV-10 in z.B. COS-, CHO- und HeLa-Zellen. Andere Beispiele sind in "A Practical Guide to Molecular Cloning" aufgeführt.
Das Züchten und die Fermentation der transformierten Wirte wird durch Standardverfahren und herkömmliche Verfahren durchgeführt, die dem Fachmann bekannt sind. Vgl. z.B. Methods in Enzymology, Bd. 185, Gene Expression Technology (Hrsg. Goeddel), 1990 (insbesondere, "Growth of Cell Lines"); für Hefen vgl. Methods in Enzymology, Bd. 194, "Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology"; Wachstumsbedingungen für E. coli sind beschrieben in "Current Protocols in Molecular Biology, Bd. 1, auf den Seiten 1.1.1, 1.1.2, 1.1.3, 1.1.4 und 1.3.1, und "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2. Aufl., S. 1.21; und die Reinigung von Plasmid-DNA ist auf der Seite 1.23 beschrieben, die Wachstumsbedingungen zur Züchtung, die für Säugerzellen geeignet sind, sind beschrieben in: "Current Protocols", Bd. 1 und Bd. 2, auf den Seiten 9.0.4 bis 9.0.6, 9.1.1, 9.1.3, 9.2.5, 9.4.3, 11.5.2, 11.6.2 und 11.7.3.
Zusammenfassend kann gesagt werden, wenn die erforderlichen Bestandteile zum Initiieren und für die Synthese des einzelnen ersten Strangs in einem Replikationsvehikel bereitgestellt werden, nämlich eine DNA-Matrizen-Fragment mit einer Initiationsstelle und eine IR (und die Polymerase(n)), kann man davon ausgehen, dass eine sIDNA erzeugt wird.
Wenn die Synthese der durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellten sIDNAs in vitro durchgeführt wird, erfolgt die Synthese in einem Medium, das die herkömmlichen Bestandteile für die Synthese von Nucleotidsträngen umfasst, unter Verwendung des DNA-Fragments als Matrize. Im Allgemeinen läuft die Synthese in einer gepufferten wässrigen Lösung, vorzugsweise bei einem pH-Wert von 7 bis 9 ab. Vorzugsweise liegt ein molarer Überschuss der Oligonucleotide gegenüber dem DNA-Matrizenstrang vor. Außerdem sind die Desoxyribonucleosidtriphosphate dATP, dCTP, cGTP und dTTP Bestandteile des Synthesegemisches. Die Lösung wird erhitzt und anschließend abgekühlt. Danach wird die Polymerase zugegeben, und die Synthese läuft ab. Diese Bestandteile werden für den Zweck der hier beschriebenen Erfindung "herkömmliche Bestandteile" genannt.
Die Oligonucleotid-Synthese kann durch verschiedene Verfahren durchgeführt werden, umfassend diejenigen, die im US Patent Nr. 4 415 734; und in Matteuci et al., J. Am. Chem. Soc. 103 (11): 3185–3191 (1981); Adams et al., J. Am. Chem. Soc. 105 (3): 661–663 (1983); und Bemcage et al., Tetrahedron Letters 22 (20): 1859–1867 (1981), beschrieben sind.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung nutzen die Verfahren der Gentechnik und der molekularen Clonierung. Allgemeine Verfahren der Gentechnik und der molekularen Clonierung finden sich in Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, 1990; "A Practical Guide to Molecular Cloning", 2. Aufl., Bernard Perbal (1988); Methods in Enzymology, Bd. 68, Recombinant DNA (Hrsg., Wu), Academic Press, N.Y., 1979; Methods in Enzymology, Bd. 185, Gene Expression Technology, (Hrsg., Goeddel), 1990, Current Protocols in Molecular Biology, Bd. 1, 2 und 3.
Die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellten sIDNAs haben mehrere interessante Anwendungsmöglichkeiten. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann eingesetzt werden, um zufällige Mutationen in einem ausgewählten Gen bereitzustellen. Ein solches System wird in 7 erläutert, die das Gen für β-Galactosidase in einem transformierten Vektor zeigt.
Das Verfahren umfasst das Synthetisieren einer sIDNA, die ein Gen von Interesse enthält, das im Stamm liegt, das Isolieren der sIDNA, das Ausschneiden des Gens aus der sIDNA, sein Clonieren in ein geeignetes Replikationsvehikel und das Exprimieren des Proteins, das durch das Gen codiert wird. Die Proteine können sodann auf die gewünschte Aktivität getestet werden. Die Kolonien können anhand von Standardverfahren abgesucht werden, wobei diejenigen mit den mutierten Genen identifiziert werden können.
Eine Erläuterung zur Erzeugung und Identifizierung von Mutationen sieht wie folgt aus. In pUCK109 (vgl. Beispiel 1), welches das lacZ-Gen enthält, wird das 215 by große DNA-Fragment ligiert, das die 35 by große IR (in Beispiel 1 beschrieben) zwischen dem DNA-Fragment und dem OR enthält (wie in Beispiel 1 dargestellt): Schritt 1. Das Plasmid wird in E. coli CL83 transformiert, das unter Standardbedingungen gezüchtet wird. Während des Zellwachstums wird eine sIDNA produziert, in welcher Mutationen eingebaut sind. Danach wird das lacZ-Gen isoliert und in pUCK19 eingefügt (ohne das IR-enthaltende Fragment): Schritt 2. pUCK19 wird mit KasI und EcoRI gespalten: Schritt 3. Anschließend wird das resultierende mutierte lacZ-Gen in pUC19 ligiert, welches das lacZ-Gen und das Gen für Ampicillin-Resistenz enthält und welches vorher mit KasI und EcoRI gespalten worden war: Schritt 4. Schließlich wird das isolierte lacZ-Gen in E. coli CL83 transformiert.
Die Mutationshäufigkeit wird durch bekannte in vivo-Tests bewertet, indem β-gal, ein farbloses Substrat, eingesetzt wird, das hydrolysiert wird, wodurch ein dunkelblaues Produkt entsteht. Wenn die Kolonien farblos sind, zeigt dies, dass keine β-Galactosidase produziert wurde.
Für diesen Absuchtest können auch andere Gene der Familie der lac-Gene, z.B. lacY oder lacA, oder andere geeignete Gene verwendet werden. Außerdem kann das Gen, welches das Protein (oder Polypeptid) von Interesse codiert, eingesetzt werden, um die Häufigkeit von Mutationen zu bestimmen, und die Selektion des geeignete Gens, welches das hergeleitete Protein (oder Polypeptid) codiert, kann erfolgen.
Dieses Absuchverfahren erlaubt die Selektion von anderen Polymerasen, bei denen eine größere Wahrscheinlichkeit besteht, dass sie eine Mutation einführen oder die Mutationsrate im Zielgen erhöhen. Somit kann ein ausgewähltes Gen, z.B. das lacZ-Gen, als das Absuchgen eingesetzt werden. Die reverse Transkriptase, von der bekannt ist, dass sie eine geringere Replikationsgenauigkeit aufweist, erweist sich somit als ein Enzym der Wahl, um Mutationen in ein Zielgen einzuführen, welches das gewünschte Protein codiert.
Anschließend wird das gewünschte Zielprotein (werden die gewünschten Zielproteine) durch einen ausgewählten transformierten Wirt exprimiert, welcher das mutierte Gen enthält, und sodann auf seine gewünschten biologischen Eigenschaften selektiert.
Die Mutationshäufigkeit soll beeinflusst werden können, indem geeignete Enzyme ausgewählt werden, von denen bekannt ist, dass sie eine geringere Replikationsgenauigkeit aufweisen. Wenn also Ziel-DNA-Fragmente oder Gene amplifiziert werden, hängt das System ab von der Genauigkeit oder Ungenauigkeit der Replikation, d.h. von der Häufigkeit der Fehler, die durch die DNA-Polymerasen bei Replizieren des eingefügten DNA-Fragments oder Gens gemacht werden. Auf diese Weise werden mit jedem Replikationsfehler zufällige Mutationen in die Gene eingeführt. Je höher der Grad der Ungenauigkeit der DNA-Polymerase ist, desto großer ist die Zahl der mutierten Gene, und umgekehrt.
In der vorstehend erläuterten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, in der angenommen wird, dass PolllI und PolI aktiv waren, kann man davon ausgehen, dass die erstere Polymerase die geringere Genauigkeit ausweist, da von PolI bekannt ist, dass sie eine selbst-korrigierende Funktion besitzt. Somit kann die Replikationsgenauigkeit des Systems durch eine geeignete Auswahl der DNA-Polymerasen reguliert werden. Im Allgemeinen geht man davon aus, dass zufällige Mutationen mit einer größeren Wahrscheinlichkeit durch die Polymerase eingeführt werden, die den zweiten Strang synthetisiert. In interessanter Kandidat hierfür wäre die RT.
Gene, welche die gewünschte(n) Mutation(en) enthalten, können beim chromosomalen Crossover eingesetzt werden. Durch dieses Verfahren kann bewirkt werden, dass die Gene von Interesse oder die sIDNA, welche das mutierte Gen von Interesse enthält, eingebaut werden bzw. wird und die genetischen Informationen von einem Molekül auf ein anderes ähnliches Molekül ausgetauscht werden. Das mutierte Gen ortet innerhalb des Genoms eine Sequenz, die ähnlich ist wie die Vektorsequenz, und sodann wird das homologe Gen durch das mutierte Gen repliziert.
Auf diese Weise können neue Stämme von Mikroorganismen (oder Wirten) erzeugt werden, die das mutierte Gen enthalten und die sodann ein gewünschtes Protein exprimieren. Die sIDNA, die das mutierte Gen enthält, kann in vitro oder in vivo hergestellt werden.
Die Polymerasekettenreaktion (PCR) ist ein schnelles Verfahren zur enzymatischen Amplifikation eines spezifischen Abschnitts der DNA in vitro. Für das herkömmliche PCR-Verfahren sind erforderlich: ein Abschnitt einer doppelsträngigen DNA, der amplifiziert werden soll, und immer zwei einzelsträngige Oligonucleotid-Primer, welche den Abschnitt flankieren, eine DNA-Polymerase, geeignete Desoxyribonucleotidtriphosphate (dNTPs), ein Puffer und Salze (vgl. Current Protocols, Abschnitt 15).
Die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellte ss-sIDNA kann mit einem einzigen Primer amplifiziert werden. Diese Eigenschaft vereinfacht die Amplifikation deutlich, sie umgeht die Probleme des einen Primers, seine richtige Initiationsstelle zu finden, sie macht das Verfahren wirtschaftlicher und sie trägt zur Lösung der Probleme bei, die mit dem herkömmlichen PCR-Verfahren im Zusammenhang stehen.
Die Amplifikation der sIDNA umfasst das Denaturieren der sIDNA, wodurch eine einzelsträngige DNA entsteht (vom 3'- zum 5'-Ende). Auf diese Umsetzung folgt die übliche Reaktionsfolge: Primeranlagerung am 3'-Ende, Polymerase-Reaktion, Denaturieren und Anelieren. Diese Reaktionsfolge wird 25 Zyklen lang durchgeführt, wodurch eine millionenfache Amplifikation der sIDNA zustande kommt. Die sIDNA kann ein Gen enthalten, das ein Zielprotein codiert.
In einem kürzlich veröffentlichten Bericht in Science 252: 1643–1650 (21. Juni 1991) mit dem Titel "Recent Advances in the Polymerase Chain Reaction" von Erlich et al. werden die mit Primern zusammenhängenden Probleme und auch Verbesserungen diskutiert, die für das PCR-Verfahren vorgeschlagen wurden.
Demgemäß besteht ein großes Interesse an einem Verfahren zur Amplifikation der ss-sIDNA-Strukturen der vorliegenden Erfindung, wobei in dem Verfahren nur ein einziger Primer eingesetzt wird. Die sIDNA könnte ein Gen von Interesse enthalten, z.B. ein mutiertes Gen, das verbesserte biologische Eigenschaften besitzt.
Die in vivo-Herstellung der sIDNAs der vorliegenden Erfindung kann so manipuliert werden, dass eine gewünschte Sequenz bereitgestellt wird. Die auf diese Weise produzierten sIDNAs können sodann als Antisense-DNA eingesetzt werden.
Eine faszinierende Anwendungsmöglichkeit, die hier auch berücksichtigt wird, ist die Rolle, welche die sIDNAs der vorliegenden Erfindung bei der Erzeugung einer dreifachen Helix-DNA oder Triplex-DNA spielen können, sowie die hieraus resultierenden neuen Triplex-sIDNA-Strukturen. Ein kürzlich veröffentlichter Bericht in Science 252: 1374–1375 (27. Juni 1991), "Triplex DNA Finally Comes of Age", betont, dass die vorliegende Erfindung gerade zum richtigen Moment erscheint. Eine Triplex-DNA kann erzeugt werden, indem ein dritter Strang an spezifische erkannte Stellen auf der chromosomalen DNA bindet. Hierfür werden synthetische Stränge in den Größen diskutiert, die vorzugsweise das vollständige Komplement von Basen enthalten (etwa 11 bis 15 und mehr). Die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellten sIDNAs mit langen 3'- (oder 5'-) Enden (und der Schleife aus nicht verdoppelten Basen) könnten sich als außergewöhnlich gute Kandidaten erweisen. Von der resultierenden Triplex-DNA kann man erwarten, dass sie eine erhöhte Stabilität und somit noch weitere Anwendungsmöglichkeiten aufweist. In dem Bericht werden neue Therapien vorgeschlagen, die auf der Erzeugung einer dreifachen Helix beruhen, umfassend zur Behandlung von alDS und zur selektiven Gen-Hemmung und andere.
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7. Gilson et al., Nucl. Acids Res. 18: 3941 (1990);
8. Simmett et al., J. Biol. Chem. 266: 8675 (1991);
9. Tomizawa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 1865 (1977);
10. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Sambrook et al., 2. Aufl., (Abschnitte 1.121–1.40)
11. Kornberg, in: DNA Replication (W. H. Freeman and Company, San Francisco, CA, 1980), S. 101–166, und Kapitel 4, DNA Polymerase I of E. coli, Kapitel 5, Other Procaryotic Polymerases, Kapitel 6, Eucaryotic DNA Polymerases, und Kapitel 7;
12. Watson, Molecular Biology of the Gene, 3. Aufl., W. A. Benjamin, Inc.;
13. DNA Synthesis: Present and Future, Molineux und Kohiyama, Hrsg., (1977), Teil V, "G4 and ST-1 DNA Synthesis In Vitro" von Wickner; und Teil VII, "DNA Synthesis in Permeable Cell Systems from Saccharomyces cerevisiae" von Oertel und Goulian;
14. Dasgupta et al., Cell 51: 1113 (1987);
15. Chalker et al., Gene 71, (1): 201–205 (1988);
16. Lewis et al., J. Mol. Biol. (England) 215, (1): 73–84 (1990);
17. Saurin, W., Comput. Appl. Biosci. 3, (2): 121–127 (1987);
18. 4 975 376; 4 863 858; 4 840 901; 4 746 609; 4 719 179; 4 693 980 und 4 693 979;
19. Current Protocols, Abschnitt 1.4.10;
20. US Patent Nr. 4 910 141;
21. J. Bacteriol. 145: 422–428 (1982);
22. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1433–1436 (1978);
23. Principles of Gene Manipulation, 2. Aufl., Carr et al., Hrsg., University of Ca. Press, Berkeley, 1981, S. 48;
24. Methods in Enzymology, Bd. 194, "Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology", Hrsg. Guthrie und Fink, (1991), Academic Press, Inc., S. 285 und S. 373–378;
25. Experimental Manipulation of Gene Expression, Hrsg. Masayori Inouye, Academic Press, Inc., (1983), S. 100–104;
26. A Practical Guide to Molecular Cloning, "Cosmid Vectors for Low and Higher Eucaryotes", 2. Aufl., von Bernard Perbal (1988), Wiley and Sons;
27. Current Protocols, Bd. 2, Abschnitte 13.4.1, 13.4.2, (1989);
28. Botstein et al., Gene 8: 17 (1979);
29. Beggs, Genetic Engineering (Hrsg. Williamson), Bd. 2, S. 175, Academic Press (1982);
30. Methods in Enzymology, Bd. 185, Gene Expression Technology (Hrsg. Goeddel), (1990), (insbesondere: Growth of Cell Lines);
31. Current Protocols in Molecular Biology, Bd. 1, auf den Seiten 1.1.1, 1.1.2, 1.1.3, 1.1.4 und 1.3.1;
32. Current Protocols, Bände 1 und 2, auf den Seiten 9.0.4–9.0.6, 9.1.1, 9.1.3, 9.2.5, 9.4.3, 11.5.2, 11.6.2 und 11.7.3;
33. US Patent Nr. 4 415 734;
34. Matteuci et al., J. Am. Chem. Soc. 103, (11): 3185–3191 (1981);
35. Adams et al., J. Am. Chem. Soc. 105, (3): 661–663 (1983);
36. Bemcage et al., Tetrahedron Letters 22, (20): 1859–1867 (1981);
37. Methods in Enzymology, Bd. 68, Recombinant DNA (Wu, R., Hrsg.), Academic Press, N.Y., 1979;
38. Current Protocols in Molecular Biology, Bände 1, 2 und 3;
39. Current Protocols, Abschnitt 15;
40. Science 252: 1643–1650 (21. Juni 1991) mit dem Titel "Recent Advances in the Polymerase Chain Reaction", von Erlich et al.;
41. Science 252: 1374–1375 (27. Juni 1991), "Triplex DNA Finally Comes of Age".

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

In-vitro-Verfahren zur Synthese einer Stamm-Schleife-DNA (sIDNA), die eine einzelsträngige DNA mit 5'- und 3'-Enden und einer umgekehrten Sequenzwiederholung umfaßt, die zu einer Struktur gefaltet ist, die durch Basenpaarung der Elemente der umgekehrten Sequenzwiederholung einen Doppelstamm ausbildet, der an einem Ende durch eine einzelsträngige Schleife mit ungepaarten Basen verbunden ist und am anderen Ende 5'- und 3'-Enden der einzelsträngiger DNA aufweist, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt: (a) Bereitstellung der nötigen Bestandteile zur DNA-Polymerase-Synthese: eine doppelsträngige DNA, deren einer Strang eine DNA-Matrize ist, die eine Primeranlagerungsstelle ("priming site") und eine umgekehrte ("inverted") Sequenzwiederholung stromabwärts der Primeranlagerungsstelle enthält, einen Primer für die Matrize, um die DNA-Polymerisation zu starten, und eine DNA-Polymerase, um die sIDNA von der Matrize zu replizieren; (b) Primeranlagerung an die Matrize, um die DNA-Polymerisation zu starten; und (c) Synthetisieren der sI-DNA durch Erzeugen einer einzelsträngigen DNA, ausgehend vom Primer unter Verwendung von einem der Doppelstränge der DNA-Matrize als Elternstrang, Fortsetzen der DNA-Synthese in die umgekehrte Sequenzwiederholung, um einen ersten Strang zu erzeugen, dann Erzeugen einer Sequenz, die komplementär dazu ist und an sich selbst aneliert, dadurch Erzeugen einer anderen Primeranlagerungsstelle, Fortsetzen der DNA-Synthese unter Verwendung des neu-synthetisierten Stranges oder des anderen Elternstranges der doppelsträngigen DNA oder beider als Matrize, Um einen zweiten Strang zu erzeugen, dadurch Erzeugen einer einzelsträngigen sIDNA, die einen Stamm der verdoppelten einzelsträngigen sIDNA von anelierten komplementären Basen enthält, umfassend den ersten Strang und den zweiten Strang, die an einem Ende durch eine Schleife von nicht verdoppelter einzelsträngiger DNA zusammengefügt sind, und an dem anderen Ende die einzelnen 5'- und die einzelnen 3'-Enden der sIDNA hat; und Isolieren der sIDNA.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Synthese von einem der beiden Stränge der DNA, die den Stamm der sIDNA ausbildet, durch Fortführen der Synthese erfolgt, bis einer der beiden Stränge länger ist als der andere.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die DNA-Synthese des zweiten Stranges der DNA, die den Stamm der sIDNA ausbildet, abgebrochen wird, bevor der zweite Strang länger ist als der erste Strang.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin zwei verschiedene DNA-Polymerasen bereitgestellt werden, von denen die eine den ersten Strang und die andere den zweiten Strang synthetisiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die Matrize zur Synthese des zweiten Stranges der erste synthetisierte Strang ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die Matrize zur Synthese des zweiten Stranges der Strang der doppelsträngigen DNA ist, der nicht die Matrize für die Synthese des ersten Stranges war.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Synthese in einer prokaryontischen oder eukaryontischen Zelle durchgeführt wird, die einen selbst-replizierenden Vektor aufweist, der die doppelsträngige DNA umfaßt, von der ein Strang eine DNA-Matrize ist, die eine Primeranlagerungsstelle und stromabwärts der Primeranlagerungsstelle eine umgekehrte Sequenzwiederholung enthält.
Verfahren nach Anspruch 7, worin der Vektor ein Plasmid ist.
Verfahren nach Anspruch 8, worin das Plasmid ein Escherichia coli-Plasmid ist.
Verfahren nach Anspruch 9, worin das Plasmid pUCK106 ist.
Verfahren nach Anspruch 9, worin das Plasmid pUCK106 und ein eingefügtes Gen umfasst, das ein Protein codiert, wobei das Gen zwischen der Primeranlagerungsstelle, die ein Replikationsursprung ist, und der umgekehrten Sequenzwiederholung positioniert ist.
Verfahren nach Anspruch 11, worin das Gen ein lacZ-Gen ist.
Verfahren nach Anspruch 8, worin das Plasmid eine Primeranlagerungsstelle für die DNA-Polymerase enthält, die stromaufwärts zu der umgekehrten Sequenzwiederholung positioniert ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei eine Familie isolierter sIDNAs produziert wird, worin die entsprechenden 5'-Enden in ihren Größen variieren.