DE69933382T2 - Herstellung von ssdna innerhalb der zelle - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein stabiles DNA-Konstrukt, vorteilhafterweise als Kassette bezeichnet, in das eine Nukleinsäuresequenz inkorporiert ist für die Verwendung als Vorlage für die später folgende Herstellung dieser Sequenz in einer prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszelle und auf ein Vektorsystem für die Expression dieser Sequenz in eukaryotischen Wirtzellen ohne flankierende Sequenzen (oder einer minimalen Anzahl an flankierenden Sequenzen). Die Kassette beinhaltet einen invertierten Tandem Repeat, der den Stamm eines Stamm-Schleifen-Intermediats bildet, das in vivo wirkt um die Expression der Sequenz als einzelsträngige DNA Sequenz (single stranded DNA, ssDNA), bezeichnet als die Sequenz von Interesse, zu bewirken. Das Vektorsystem der vorliegenden Erfindung entfernt angrenzendes Plasmid (oder andere Vektorsequenzen) von der ssDNA-Sequenz von Interesse entweder durch Bildung von Stamm-Schleifen mit anschließender Termination einer Reversen Transkriptase – Reaktion durch den Stamm oder durch Spaltung des Stamm-Schleifen-Intermediats. Die in diesem Verfahren hergestellte ssDNA kann so ausgeführt sein, dass sie komplementär zu jeder beliebigen endogenen Ziel-Nukleinsäurensequenz ist.
  • So weit bekannt, ist kein Verfahren für die Herstellung von einzelsträngigen Arten von Desoxyribonukleinsäure (ssDNA) in eukaryotischen Zellen bekannt, die keine störenden und/oder flankierenden Vektorsequenzen enthält. Die wissenschaftliche und Patentliteratur schließt nicht die Offenbarung von cDNA-produzierenden Vektoren ein (siehe A. Ohshima, et al., 89 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1016–1020 (1992); S. Inouye, et al., 3 Current Opin. Genet. Develop. 713–718 (1993); O. Mirochnitchenko, et al., 269 J. Biol. Chem. 2380–2383 (1994); J.-R. Mao, et al., 270 J. Biol. Chem. 19684–19687 (1995); und U.S. Patente 5,436,141 und 5,714,323), aber die Systeme, die in dieser Referenzliteratur offenbart werden, haben anscheinend nicht die Fähigkeit zur Herstellung von ssDNA in eukaryotischen Zellen ohne intervenierende Vektorsequenzen, welche die beabsichtigte Funktion des ssDNA-Produkts stören, gezeigt.
  • Es ist deshalb eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren für die Herstellung von einzelsträngigen Nukleinsäuren in Hefezellen, prokaryotischen und/oder eukaryotischen Zellen, vorzusehen, das diese Einschränkung durch Bereitstellung eines Verfahrens und eines DNA-Konstrukts überwindet, das die Synthese der ssDNA jeder beliebigen Nukleinsequenz in vivo ohne unerwünschte intervenierende oder flankierende Nukleinbasen steuert. Die ssDNA kann eine inhibitorische Nukleinsäure sein (ist aber nicht darauf beschränkt), wie eine Antisense-Sequenz, um mit mRNA in spiegelverkehrter Weise zu binden und so ein Genprodukt oder ein virales Genprodukt von Interesse nach unten zu regulieren und für die Bindung an doppelsträngige (native DNA) um Dreifachstrukturen zu bilden, welche die normale Gentranskription und Genregulation stören können. ssDNA, die auf diese Weise hergestellt wurde, kann auch so wirken, dass eine oder mehrere von vielen stark regulierten Zellfunktionen gestört werden. Zum Beispiel können die ssDNA-Enden von telomeren Repeats durch die Herstellung von ssDNA mit zu der Sequenz der nativen DNA in den telomeren Repeats oder anderen regulierenden Sequenzen identischen oder komplementären Zusammensetzungen von Nukleinbasen sind.
  • Diese Aufgabe und die zahlreichen anderen Aufgaben, die dem Fachmann durch die folgende Beschreibung mehrerer Ausführungsformen der Erfindung erkenntlich gemacht werden, wird gelöst durch die Bereitstellung einer Kassette, oder eines Nukleinsäurekonstrukts, bestehend aus einer Nukleinsäuresequenz, die aus einer Sequenz von Interesse flankiert von invertierten Tandem Repeats, einem Gen, das eine RNA-abhängige DNA-Polymerase kodiert und einem Gen, das eine Restriktions-Endonuklease kodiert, besteht. Die Kassette schließt auch vorzugsweise ein Gen ein, das eine RNase H kodiert und entweder einen oder mehrere konstitutive oder induzierbare eukaryotische Promoter/Enhancer für die RNA-abhängige DNA-Polymerase und Restriktions-Endonuklease Gen. Die Erfindung beinhaltet auch, dass die Kassette in ein Plasmid inkorporiert ist und dass das Plasmid in eine geeignete Wirtszelle inkorporiert ist.
  • In einem weitern Punkt umfasst die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur in vivo Herstellung von einzelsträngiger DNA, welches die folgenden Schritte umfasst: Transkription und Translation einer Kassette, die ein RNA-abhängiges DNA- Polymerase-Gen und eine Sequenz von Interesse in einer eukaryotischen Zelle umfasst und Konversion des mRNA-Transkripts der Sequenz von Interesse in cDNA mit der von dem RNA-abhängigen DNA-Polymerase-Gen hergestellten Polymerase mit gleichzeitigem Verdau der Vorlage der mRNA-Komponente mit einem RNase H exprimierten Enzym. Die Sequenz von Interesse schließt auch einen invertierten Tandem Repeat ein. Die Kassette kann auch ein Restriktions-Endonuklease-Gen einschließen, das, wenn es transkribiert und translatiert ist, eine Restriktions-Endonuklease produziert, die das Transkript der Sequenz von Interesse durch Schneiden der ssDNA an einer Stelle für Restriktions-Endonuklease linearisiert, die gebildet wird wenn der invertierte Tandem Repeat bewirkt, dass der Transkript ein Stamm-Schleifen-Intermediat bildet.
  • Gemäß einem anderen Aspekt umfasst die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Herstellung eines einzelsträngigen Oligonukleotids in einer Zielzelle. In einer Ausführungsform soll dieses Verfahren eine Antisense-Sequenz abgeben. In anderen Ausführungsformen wird das Verfahren verwendet um Triplex-bildende Sequenzen oder Sequenzen, die von spezifischen, DNA-bindenden Proteinen, oder von anderen Nukleinsäuren und/oder Proteinen, die im Zellstoffwechsel und/oder in der Zellreplikation aktiv sind, erkannt und gebunden werden, zu erhalten.
  • Das Verfahren umfasst das Kodieren des Oligonukleotids in eine komplementäre Sequenz von Interesse in einer Kassette, die ein Gen, das für eine RNA-abhängige DNA-Polymerase kodiert und vorzugsweise ein RNase H Gene enthält; und einen induzierbaren oder konstitutiven eukaryotischen Promotor/Enhancer, der für das Polymerase-/RNase H Gen geeignet ist, beinhaltet. Die Kassette beinhaltet ein Gen, das eine Restriktions-Endonuklease (RE) kodiert und, in der bevorzugten Ausführungsform, einen geeigneten Promotor/Enhancer für dieses RE-Gen. Die Kassette umfasst des Weiteren einen invertierten Tandem Repeat und nachdem sie in die Zielzelle assimiliert wurde, wird die Kassette (einschließlich der Sequenz von Interesse und des invertierten Tandem Repeats) von der Zelle, die von dem (den) Promotor(en)/Enhancer(n) kontrolliert wird transkribiert. Die normale Funktion der Zielzelle bewirkt den resultierenden mRNA-Transkript der Polymerase und RE-Genen, die translatiert werden sollen und liefert alles, was für die Produktion von ssDNA aus dem mRNA-Transkript der Sequenz von Interesse benötigt wird. Speziell die RNA-abhängige DNA-Polymerase, die aus der Kassette hergestellt wird, konvertiert das mRNA-Transkript der Sequenz von Interesse und invertierte Tandem Repeats in cDNA; die ss-cDNA bildet ein Stamm-Schleifen-Intermediat während die Nukleinbasen, welche die invertierten Tandem Repeats umfassen, sich paaren und die Restriktions-Endonuklease, hergestellt aus dem RE-Gen in der Kassette verdaut den doppelsträngigen Teil des Stamm-Schleifen-Intermediats um den einzelsträngigen DNA-Oligonukleotid aus dem Schleifenteil des Stamm-Schleifen-Intermediats zu „befreien". Es kann auf viele Systeme zurück gegriffen werden, um die Kassette an die Zielzelle zu abgeben und so die Synthese von ssDNA innerhalb der Zelle zu steuern, einschließlich Plasmid- oder auf Plasmiden basierenden Vektorsystemen oder auf Viren basierende Vektorsysteme, und diese Systeme werden für diesen Zweck gemäß von Standardtechniken für die Abgabe angepasst, die dem Fachmann bekannt sind. Diese Systeme beinhalten, sind aber nicht darauf beschränkt, auf Viren basierende Systeme wie auf Adenoviren, adenoassoziierten Viren, retroviralen Vektoren und konjugierte Vektoren, die doppelsträngige, auf Plasma-DNA beruhende Transfektionssysteme verwenden. Sobald sie in der Zelle ist, wird die Kassette in den normalen Verlauf des Zellstoffwechsels transkribiert, wobei ein mRNA-Transkript der Sequenz von Interesse produziert wird, dass dann von der Reversen Transkriptase in cDNA konvertiert wird, die ebenfalls von der Zelle aus dem Gen für Reverse Transkriptase/RNase H, das in der Kassette enthalten ist, unter Kontrolle durch den Promoter hergestellt wird.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Nukleinsäuren-Konstrukt vorgesehen, das folgendes umfasst: einen invertierten Tandem Repeat, eine Primerbindungsstelle für eine Reverse Transkriptase, die sich 3'-Position mit Bezug auf den invertierten Tandem Repeat befindet, und eine Sequenz von Interesse, die sich entweder zwischen dem invertierten Tandem Repeat oder zwischen dem invertierten Tandem Repeat und der 3' Primerbindungsstelle befindet.
  • Das Nukleinsäurekonstrukt der vorliegenden Erfindung ermöglicht die sichere und stabile Herstellung einer einzelsträngigen Nukleinsäuresequenz in einer Zielzelle. Insbesondere kann der invertierten Tandem Repeat verwendet werden, um eine Stamm-Schleifen-Intermediat aus Nukleinsäuren herzustellen und/oder um die in vivo Herstellung von ssDNA mit reduzierten oder eliminierten angrenzenden Nukleotidsequenzen zu steuern.
  • Auf Grund der Anordnung des Nukleinsäuren-Konstrukts, nämlich mit der Primerbindungsstelle in einer 3'-Position zu der Sequenz von Interesse, gibt es keine Begrenzung für die Größe oder die Art der Sequenz von Interesse, die unter Verwendung des Nukleinsäurekonstrukts der vorliegenden Erfindung hergestellt werden kann und das Konstrukt kann einfach in einen Vektor für die Abgabe über jeden beliebigen gewünschten Weg an eine Zielzelle inkorporiert werden.
  • Wenn die Sequenz von Interesse sich zwischen dem invertierten Tandem Repeat befindet, ist der invertierten Tandem Repeat vorzugsweise in der Lage, ein Stamm-Schleifen-Intermediat mit diesen Sequenzen von Interesse in der Schleife zu bilden und wobei dieser invertierten Tandem Repeat den Stamm bildet.
  • Ein Vorteil dieser Stamm-Schleifen-Struktur ist es, dass die Sequenz von Interesse von der Schleife als einzelsträngige cDNA mit reduzierten oder eliminierten flankierenden und/oder intervenierenden Vektorsequenzen durch Schneiden der Schleife, an der Stelle and der sie in den Stamm übergeht, freigesetzt werden kann. Somit ist die erhaltene ssDNA frei oder im Wesentlichen frei von jedweden intervenierenden und/oder flankierenden Nukleotidsequenzen, z.B. Vektor-Nukleotidsequenzen, welche die gewünschte Funktion des ssDNA-Produkts beeinträchtigen könnten.
  • Wenn eine Sequenz von Interesse zwischen dem invertierten Tandem Repeat lokalisiert ist, kann ferner eine zweite Sequenz von Interesse zwischen dem invertierten Tandem Repeat und der 3' Primerbindungsstelle bereit gestellt werden.
  • Diese Ausführungsform der Erfindung hat den Vorteil, dass der invertierten Tandem Repeat ausgewählt werden kann, um Stamm-Schleifen-Strukturen von unterschiedlicher Stabilität zu produzieren, wodurch eine variable Anzahl von „read-throughs" des mRNA-Transkripts oder frühzeitige Termination der Transkription erzielt werden können und damit auch ein Verfahren für die Regulation der Produktion von zwei oder mehreren Sequenzen von Interesse durch sekundäres Falten des Zwischentranskripts der mRNA bereit gestellt wird. Vorzugsweise umfasst der invertierte Tandem Repeat eine oder mehrere spezifische Erkennungssequenzen für Enzyme.
  • Noch bevorzugter umfasst die spezifische Enzymerkennungs-Sequenz eine für Stelle für Restriktions-Endonuklease. Die Stelle für Restriktions-Endonuklease kann entweder von einer endogenen Restriktions-Endonuklease erkannt werden oder das Nukleinsäurekonstrukt der vorliegenden Erfindung kann des Weiteren ein Gen umfassen, das eine Restriktions-Endonuklease für diese Stelle für Restriktions-Endonuklease kodiert. Im Falle, dass das Nukleinsäurekonstrukt des Weiteren ein Restriktions-Endonuklease-Gen umfasst, befindet sich das Restriktions-Endonuklease-Gen vorzugsweise in einer 5'-Position in Bezug auf den invertierten Tandem Repeat.
  • Die spezifische Enzymerkennungssequenz kann zum Beispiel entweder HindIII und NotI, HindIII oder NotI Restriktionsstellen enthalten. Tatsächlich kann die spezifische Enzym-Erkennungssequenz jede beliebe aus Restriktions-Endonuklease Typ I, Endonuklease Typ II, Endonuklease Typ III, eukaryotischer Rezeptorerkennung, prokaryotischer Rezeptorerkennung, Promotor, Promotor/Enhancer und T-overhang PCR-Stelle oder Kombinationen aus diesen sein.
  • Wenn sich die Sequenz von Interesse zwischen dem invertierten Tandem Repeat und der 3' Primerbindungsstelle befindet oder wenn eine erste Sequenz von Interesse sich zwischen dem invertierten Tandem Repeat und eine zweiten Sequenz von Interesse sich zwischen dem invertierten Tandem Repeat und der 3' Primerbindungsstelle befindet, ist der invertierten Tandem Repeat vorzugsweise in der Lage, eine stabile Stamm-Schleifen-Struktur, eine nicht stabile Stamm-Schleifen-Struktur oder eine Stammschleife von mittlerer Stabilität zu bilden.
  • Die invertierten Tandem Repeats werden ausgewählt, um eine stabile Stamm-Schleifen-Struktur in dem mRNA-Transkript als Mittel zur Auslösung der vorzeitigen Termination der reversen Transkription zu bilden, so dass, wenn sich eine Sequenz von Interesse in dem mRNA-Transkript zwischen der Startstelle für die reverse Transkription und der Stamm-Schleifen-Struktur befindet, wieder ssDNA, die im Wesentlichen frei von angrenzenden Vektorsequenzen ist, hergestellt werden kann.
  • Der/die invertierten Tandem Repeat(s) der vorliegenden Erfindung ermöglichen die Verwendung einer Stamm-Schleifen-Struktur als Vehikel für die Entfernung von unerwünschten, angrenzenden Nukleotidsequenzen, zum Beispiel entweder durch die vorzeitige Auslösung der Termination der reversen Transkription von den mRNA Transkripten oder durch Wegschneiden von unerwünschten Sequenzen von der cDNA mittels Stelle für Restriktions-Endonukleasen in den invertierten Tandem Repeats.
  • Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann der invertierte Tandem Repeat eine oder mehrere eukaryotische, prokaryotische DNA-Bindungsstellen und/oder Virusprotein-DNA-Bindungsstellen umfassen. Die Stamm-Schleifen-Struktur der vorliegenden Erfindung hat somit den weiteren Vorteil, dass sie für sich ebenfalls als funktionale Einheit dienen kann, z.B. um die ssDNA in der Schleife vor dem Abbau durch intrazelluläre Nukleasen zu schützen oder um gewisse Anwendungen mittels funktionaler Elemente (z.B. Proteinbindungsstellen) in den invertierien Tandem Repeats auszuführen.
  • Vorzugsweise wirkt der invertierten Tandem Repeat auf cis-orientierte Weise.
  • Die Primerbindungsseite kann speziell für eine endogene Reverse Transkriptase (z.B. im Fall einer Zelle, die durch den Humanen Immundefizienzvirus oder den Simianen Immundefizienzvirus infiziert ist).
  • Alternativ kann das Nukleinsäurekonstrukt ferner ein Gen, das eine Reverse Transkriptase kodiert, umfassen. Das Gen für Reverse Transkriptase befindet sich vorzugsweise in einer 5'-Position in Bezug zu dem invertierten Tandem Repeat.
  • Alternativ kann das Nukleinsäurekonstrukt ferner ein Gen, das ein Reverse Transkriptase/ein RNase H Polyprotein kodiert, umfassen. Das Gen für das Reverse Transkriptase/RNase H Polyprotein befindet sich vorzugsweise in einer 5'-Position in Bezug zu dem invertierten Tandem Repeat. Das Gen für das Reverse Transkriptase/RNase H Polyprotein kann vom Moloney Murine Leukaemia Virus, vom Humanen Immundefizienzvirus oder vom Simianen Immundefizienzvirus stammen.
  • Im Falle, dass das Nukleinsäurekonstrukt der vorliegenden Erfindung mit einem Reverse Transkriptase oder Reverse Transkriptase/RNase H Polyprotein Gen versehen ist, ist die Primerbindungsstelle vorzugsweise spezifisch für die Reverse Transkriptase oder das Reverse Transkriptase/RNase H Polyprotein, die von ihren jeweiligen Genen kodiert werden.
  • Vorzugsweise umfasst die Nukleinsäure der vorliegenden Erfindung ferner einen Promotor und optional einen Enhancer für jede dieser ersten oder zweiten Sequenzen von Interesse, die Restriktions-Endonuklease, die Reverse Transkriptase und/oder das Reverse Transkriptase/RNase H Gen.
  • Noch bevorzugter ist der Promotor und/oder Enhancer ein eukaryotischer Promotor/Enhancer.
  • Der Promotor kann ein konstitutiver, induzierbarer Promotor mit breitem Spektrum oder gewebespezifischen Eigenschaften sein.
  • Vorzugsweise umfasst das Nukleinsäurekonstrukt der vorliegenden Erfindung ferner eine Polyadenylierungs-Endsequenz, die sich in einer 3'-Position mit Bezug auf die 3' Primerbindungsstelle befindet. Das PolyA-Ende sorgt für die Stabilisierung des mRNA Transkripts.
  • Vorzugsweise beinhaltet die erste oder die zweite Sequenz von Interesse eine Sequenz, die eine einzelsträngige DNA mit enzymatischer Aktivität kodiert. Ein Beispiel für eine solche einzelsträngige DNA mit enzymatischer Aktivität umfasst die Sequenz 5'-GGCTAGCTACAACGA-3', die RNase Aktivität aufweist. Diese Sequenz wird sowohl in 5'- als auch in 3'-Richtung von einer oder mehreren Sequenz(en) flankiert, die komplementär zu einer Art der Ziel-mRNA sind, zum Beispiel h-ras, c-raf kinase, Antisense-Sequenz zu dem angiogenen Wachstumsfaktor Pleiotrophin oder dem tat-Bereich des Simianen Immundefizienz Virus.
  • Vorzugsweise ist die Primerbindungsstelle komplementär zu einer Transfer RNA (tRNA).
  • Vorzugsweise ist das Nukleinsäurekonstrukt DNA.
  • Das Nukleinsäurekonstrukt der vorliegenden Erfindung liefert somit ein effizientes System für die Steuerung der Synthese einer stabilen, einzelsträngigen Nukleinsäuresequenz, und zwar sowohl in vivo als auch in vitro. Die einzelsträngige Nukleinsäuresequenz kann verwendet werden, um einen gewünschten Effekt in einer Zelle, einem Gewebe oder einem Organismus hervorzurufen. Da die Herstellung der einzelsträngigen Nukleinsäuresequenz von Interesse im Inneren der Zelle stattfindet, werden die im Stand der Technik bekannten Probleme, die von der Abgabe der einzelsträngigen Nukleinsäuresequenz an die Zelle herrühren, überwunden, oder doch zumindest gemildert.
  • Ebenso vorgesehen ist ein mRNA-Transkript des Nukleinsäurekonstrukts der vorliegenden Erfindung.
  • Gemäß eines anderen Aspekts der vorliegenden Erfindung, ist ein mRNA-Transkript, der eine Sequenz von Interesse, flankiert von einem invertierten Tandem Repeat umfasst vorgesehen, und des Weiteren, der eine Primerbindungsstelle in 3' Position zu dem invertierten Tandem Repeat umfasst.
  • Gemäß dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung, ist ein mRNA-Transkript, der einen invertierten Tandem Repeat und eine Primerbindungsstelle in 3' Position zu dem invertierten Tandem Repeat und eine Sequenz von Interesse, die sich zwischen dem invertierten Tandem Repeat und der 3' Primerbindungsstelle befindet, umfasst, vorgesehen.
  • Gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung ist des Weiteren ein mRNA-Transkript vorgesehen, das eine erste Sequenz von Interesse, die von einem invertierten Tandem Repeat flankiert wird, eine Primerbindungsstelle in 3' Position im Verhältnis zu dem invertierten Tandem Repeat und eine zweite Sequenz von Interesse, die sich zwischen dem invertierten Tandem Repeat und der 3' Primerbindungsstelle befindet, umfasst.
  • Des Weiteren ist ein einzelsträngiges DNA-Transkript der mRNA der vorliegenden Erfindung vorgesehen.
  • Ebenso vorgesehen ist ein Vektor, der ein Nukleinsäurekonstrukt gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst.
  • Die Nukleinsäurekonstrukte der vorliegenden Erfindung sind dergestalt, dass sie in gewerblich erhältliche Abgabevektoren für therapeutische Zwecke bei Säugetieren und Menschen inkorporiert sein können und können in jedweder möglichen Art verabreicht werden, in Abhängigkeit von der Zielzelle.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung ist auch ein Vektor vorgesehen, der einen invertierten Tandem Repeat, eine Primerbindungsstelle für eine Reverse Transkriptase, die sich 3'-Position in Bezug auf den invertierten Tandem Repeat befindet, und eine Insertionsstelle für eine Sequenz von Interesse, die sich entweder zwischen dem invertierten Tandem Repeat oder zwischen dem invertierten Tandem Repeat und der Primerbindungsstelle befindet, umfasst.
  • Vorzugsweise umfasst der Vektor eine erste Insertionsstelle zwischen dem invertierten Tandem Repeat und eine zweite Insertionsstelle zwischen dem invertierten Tandem Repeat und der 3'-Primerbindungsstelle. Dadurch wird es einem Benutzer möglich, jede beliebige gewünschte Sequenz von Interesse entweder in eine oder in beide der Insertionsstellen einzusetzen. Wegen der Anordnung des Nukleinsäurekonstrukts mit der Primerbindungsstelle in einer 3'-Position zu dem invertierten Tandem Repeat gibt es keine Einschränkungen was Größe oder Art der Sequenz von Interesse, die in die Insertionsstelle eingesetzt werden kann, betrifft.
  • Vorzugsweise umfasst der Vektor zusätzlich ein Gen, das eine Reverse Transkriptase kodiert oder ein Gen das eine Reverse Transkriptase/ein RNase H Polyprotein kodiert. Vorzugsweise befindet sich das Reverse Transkriptase/RNase H Polyprotein Gen in einer 5'-Position mit Bezug auf den invertierten Tandem Repeat.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung ist auch ein Vektorsystem vorgesehen, welches einen ersten Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung (z.B. einen Vektor, der einen invertierten Tandem Repeat, eine Primerbindungsstelle für eine Reverse Transkriptase, die sich 3'-Position mit Bezug auf den invertierten Tandem Repeat befindet und eine Insertionsstelle für eine Sequenz von Interesse, die sich entweder zwischen dem invertierten Tandem Repeat oder zwischen dem invertierten Tandem Repeat und der Primerbindungsstelle befindet, umfasst) und einen zweiten Vektor, der ein Gen, das eine Reverse Transkriptase, ein Reverse Transkriptase/RNase H Polyprotein oder ein Reverse Transkriptase/RNase Polyprotein, das über einen polinreichen Linker mit einer Restriktions-Endonuklease verbunden ist, umfasst.
  • Der Vektor oder die Vektorsysteme der vorliegenden Erfindung können auch dergestalt ausgeführt sein, dass es möglich ist, dass die Primerbindungsstelle entfernt und ausgetauscht werden kann, so dass in Abhängigkeit von den Erfordernissen des Benutzers und der Spezifität der verwendeten Reversen Transkriptase verschiedene Primerbindungsstellen verwendet werden können.
  • Vorzugsweise ist der Vektor oder das Vektorsystem der vorliegenden Erfindung ein Plasmid-Konstrukt oder ein modifiziertes, virales Konstrukt.
  • Vorzugsweise sind die Reverse Transkriptase, das Reverse Transkriptase/RNase H Polyprotein oder das Reverse Transkriptase-/RNase H-/Restriktions-Endonuklease-Gen operabel mit einer Expressions-Kontrollsequenz verknüpft.
  • Der Vektor oder die Vektorsysteme der vorliegenden Erfindung können vorteilhaft verwendet werden, um Antisense-, Sense-, Triplexsequenzen oder jedwede andere einzelsträngige Nukleotidsequenz von Interesse an eine Zelle ab zu geben, unter Verwendung von bekannten Verdau- und Ligationstechniken um die Sequenz von Interesse in den Vektor zu spleißen. Der Vektor oder das Vektorsystem, der/das hierin beschrieben wird, bietet alle notwendigen Signalanweisungen und enzymatischen Funktionen um es einer Wirtszelle zu ermöglichen, ein einzelsträngiges Nukleinsäuremolekül mit einer erwünschten Sequenz zu produzieren.
  • Ebenso vorgesehen ist eine mit einem erfindungsgemäßen Vektor oder Vektorsystem stabil transformierte oder transfizierte Wirtszelle. Insbesondere die Wirtszelle kann eine eukaryotische oder prokaryotische Zelle sein. Eukaryotische Zellen schließen Hefe-, Pflanzen- und Säugetierzellen ein. Prokaryotische Zellen schließen bakterielle Zellen ein.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung ist des Weiteren ein Kit zur Herstellung einer einzelsträngigen Nukleinsäuresequenz vorgesehen, das einen erfindungsgemäßen Vektor oder ein erfindungsgemäßes Vektorsystem und eine Restriktions-Endonuklease für jede Insertionsstelle vorgesehen.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ist des Weiteren ein Kit zur Herstellung einer einzelsträngigen Nukleinsäuresequenz vorgesehen, das einen erfindungsgemäßen Vektor oder ein erfindungsgemäßes Vektorsystem, einen Behälter für den Vektor/das Vektorsystem und Anweisungen für die Verwendung des Vektors/Vektorsystems umfasst.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung ist des Weiteren ein in vivo oder in vitro Verfahren für die Herstellung einer einzelsträngigen Nukleinsäuresequenz von Interesse vorgesehen, das die folgenden Schritte umfasst: Einführen eines Nukleinsäurekonstrukts gemäß der vorliegenden Erfindung in eine Zielzelle; Transkribieren des Nukleinsäurekonstrukts in mRNA und reverses Transkribieren des mRNA Transkripts in cDNA.
  • Vorzugsweise umfasst das Verfahren des Weiteren den Schritt des Entfernens des mRNA-Transkripts von einer mRNA/cDNA-Heteroduplex, die durch reverse Transkription der mRNA gebildet wird.
  • Die reverse Transkription kann entweder von einer Reversen Transkriptase, die endogen zur Zielzelle ist, ausgeführt werden, oder das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung kann ferner den Schritt des Einführens eines Gens in die Zielzelle, das eine Reverse Transkriptase kodiert oder eines Gens, das ein Polyprotein einer Reversen Transkriptase/RNase H kodiert.
  • Vorzugsweise umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung des Weiteren den Schritt des Linearisierens des cDNA-Transkripts der Sequenz von Interesse durch Schneiden der cDNA Stammschleifenstruktur, die von dem invertierten Tandem Repeat gebildet wird, an der Stelle, an der die Schleifenstruktur in den Stamm übergeht.
  • Gemäß dieser letzteren, bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Verfahren ferner den Schritt des Einführens eines Gens, das eine Restriktions-Endonuklease kodiert, in die Zielzelle. Durch Vorsehen von einer oder mehrerer Stelle für Restriktions-Endonukleasen in dem invertierten Tandem Repeat kann die Restriktions-Endonuklease, die von dem Restriktions-Endonuklease-Gen exprimiert wird, dafür verwendet werden, die cDNA Stamm-Schleifen-Struktur zu zerschneiden. Alternativ kann das Schneiden der cDNA Stammschleifenstruktur auf Restriktions-Endonukleasen beruhen, die endogen zur Zielzelle sind.
  • Die Restriktions-Endonuklease kann auch durch den Schritt des Einführens eines Gens in eine Zielzelle, das ein Polyprotein einer Reversen Transkriptase/einer RNase H kodiert und das mit einem prolinreichen Linker mit einer Restriktions-Endonuklease verbunden ist, versehen sein.
  • Wenn die einzelsträngige Nukleinsäuresequenz mit einem in vitro Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt wird, kann das Verfahren weiters den Schritt des Isolierens des mRNA-Transkripts, der mRNA/cDNA Heteroduplex und/oder einzelsträngiger cDNA von der Zielzelle.
  • Ebenso vorgesehen ist ein einzelsträngiges cDNA-Transkript, ein inhibitorisches Nukleinsäuremolekül (z.B. eine Antisense-Sequenz oder ein Aptamer), eine einzelsträngige DNA mit enzymatischer Aktivität, (z.B. RNase-Aktivität) ein mRNA-Transkript und/oder ein Heteroduplex-Molekül, das mit den Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde.
  • Ein inhibitorisches Nukleinsäuremolekül kann einzelsträngige DNA sein, die aus dem mRNA-Transkript synthetisiert wurde, oder das mRNA-Transkript selbst, das spezifisch an eine komplementäre Nukleinsäuresequenz binden kann. Solche inhibitorischen Nukleinsäuremoleküle können „sense" oder „antisense" Sequenzen sein und sind besonders nützlich für die Regulation der Genfunktion. Ein inhibitorisches Nukleinsäuremolekül kann auch ein Oligonukleotid sein, das spezifisch an ein RNA- oder DNA-bindendes Protein bindet, oder ein Oligonukleotid, das an ein Biomolekül bindet, z.B: Thrombin, Bradykinin oder PGF2α, das normalerweise nicht an RNA oder DNA bindet.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung vorgesehen, die ein Nukleinsäurekonstrukt, einen Vektor oder ein Vektorsystem oder eine Wirtszelle gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst, zusammen mit einem pharmakologisch verträglichen Zusatzstoff, Verdünnungsmittel oder Träger.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Nukleinsäurekonstrukt, ein Vektor oder Vektorsystem oder eine Wirtszelle gemäß der vorliegenden Erfindung für die Verwendung zu therapeutischen Zwecken vorgesehen, insbesondere für die Verwendung bei der Abgabe eines inhibitorischen Nukleinsäuremoleküls an eine Zielzelle. Das Nukleinsäurekonstrukt, der Vektor oder das Vektorsystem und die Wirtszelle der vorliegenden Erfindung sind besonders nützlich, wenn es darum geht einen pathologischen Zustand durch die Regulation der Genexpression zu mildern. Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ist des Weiteren die Verwendung eines Nukleinsäurekonstrukts, eines Vektors oder Vektorsystems oder einer Wirtszelle gemäß der vorliegenden Erfindung für die Herstellung eines Medikaments zur Linderung eines pathologischen Zustands durch die Regulation der Genexpression vorgesehen, insbesondere für die Linderung eines pathologischen Zustands durch Abgabe eines inhibitorischen Nukleinsäuremoleküls an eine Zielzelle. Andere Verwendungen sind ebenfalls offenbart.
  • Die Sets von genetischen Elementen, Vektoren, Vektorsystemen und Wirtszellen der vorliegenden Erfindung können für die prophylaktische oder therapeutische Behandlung einer großen Anzahl and Zuständen oder Krankheiten verwendet werden, insbesondere Zustände oder Krankheiten die von abnormer oder veränderter Genexpression hervorgerufen werden, oder Zustände und Krankheiten, die durch eine Regulation der Genexpression gelindert werden können.
  • Die Sets von genetischen Elementen, die Vektoren, die Wirtszellen, die Kits und Verfahren der vorliegenden Erfindung können für die Herstellung von einzelsträngigen Nukleinsäuremolekülen oder so gut wie jeder beliebigen, zuvor definierten oder gewünschten Zusammensetzung von Nukleinbasen in einer Wirtszelle verwendet werden und sind anpassbar und anwendbar auf jedes in vivo oder in vitro System.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des Nukleinsäurekonstrukts der vorliegenden Erfindung ist das Nukleinsäurekonstrukt der vorliegenden Erfindung ein künstlich synthetisiertes, rekombinantes, chimärisches und/oder heterologes Produkt und die Sequenz von Interesse kann zu der Zelle, in der sie hergestellt wird zellfremd sein.
  • Diese zahlreichen Ausführungsformen der Erfindung sind in den Figuren dargestellt. 1 ist eine schematische Darstellung der Herstellung von ss-cDNA in einer Wirtszelle in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung. Die „Schleifen"-Ausführungsform (1) produziert eine kleine ss-cDNA, die komplementär zu der Sequenz von Interesse ist, die unter Verwendung eines restriktionsähnlichen Enzym für die Spaltung des gefalteten cDNA Zwischenprodukts in die Schleifenposition kloniert wurde. Die „3' Stamm"-Ausführungsform (2) stellt ein ähnliches Produkt her, wenn der Sequenz von Interesse 3' zu dem Stamm-Schleifen-Bereich kloniert wird, wobei der gefaltete mRNA-Stamm die frühzeitige Verkürzung der cDNA während der Transkription bewirkt.
  • 2 ist eine schematische Darstellung des Stamm-Schleifen-Intermediats, das mit Hilfe des in 1 dargestellten Verfahrens gebildet wurde.
  • 3A ist eine schematische Darstellung der Bindung einer Antisense-Sequenz, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde und die das „10-23 DNA Enzym", das mit einer Ziel-mRNA bindet, und die folgende Spaltung der Ziel-mRNA verkörpert.
  • 3B ist eine vergrößerte Darstellung der Bindung der Antisense-Sequenz von 3A mit der Ziel-mRNA und zeigt das Zusammenwirken des 10-23 DNA-Enzyms (das in einer generalisierten inhibitorischen Nukleinsäuresequenz enthalten ist) mit der Spaltungsstelle der Ziel-mRNA.
  • 4 zeigt eine schematische Karte des Plasmids pssDNA-Express A, das in Übereinstimmung mit der Erfindung konstruiert wurde.
  • Die 5A, 5B und 5C zeigen jeweils eine schematische Karte des Plasmids pssDNA-Express B das gemäß der vorliegenden Erfindung konstruiert wurde, einen vergrößerten Ausschnitt des Plasmids pssDNA-Express B und die Sequenz des Insertionsbereichs des Plasmids pssDNA-Express B.
  • Die 6A und 6B stellen die Sequenz der inserierten Bereiche zwischen den ApaI-und NheI-Stellen der Plasmide pTest und pTelo dar, die von dem Plasmid pssDNA-Express B in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung konstruiert wurden.
  • Die 7A zeigt eine schematische Karte des Startplasmids pcDNA3.1Zeo+ (Invitrogen, Inc.) für Plasmid pcDNA3.1Zeo+/NM-link2-gag/pssDNA-Express-4B, das gemäß der Erfindung konstruiert wurde. 7B zeigt eine schematische Karte von pcDNA3.1Zeo+/NM-link2-gag (auch bezeichnet als pssDNA-Express-4B). 7C zeigt eine schematische Darstellung der Klonierungsstellen, der invertierten Repeats und des PBS-Bereichs (Pfeil) für pcDNA3.1Zeo+/NM-link2-gag/pssDNA-Express-4B. 7D zeigt eine Sequenzkarte der Klonierungsstellen, der invertierten Repeats und des PBS-Bereichs (Pfeil) für pcDNA3.1Zeo+/NM-link2-gag/pssDNA-Express-4B.
  • 8A ist eine schematische Karte des Plasmids pssDNA-Express A, das gemäß der Erfindung konstruiert wurde. 8B ist eine schematische Karte des Plasmids pssDNA-Express A nach Deletion des MboIII-Gens durch Verdau mit XmaI und SacII.
  • 9A ist eine schematische Karte des Plasmids pssDNA-Express C, das gemäß der Erfindung konstruiert wurde. 9B ist eine schematische Darstellung der Klonierungsstellen, der invertierten Repeats und des PBS-Bereichs (Pfeil) für das Plasmid pssDNA-Express-C. 9C ist eine Sequenzkarte der Klonierungsstellen, invertierten Repeats und des PBS-Bereichs (Pfeil) für das Plasmid pssDNA-Express-C.
  • 10A zeigt die Teilsequenz des 23. Codon der h-ras Antisense-Bindungssequenz mit der Sequenz des 10-23 DNA-Enzyms, die zwischen den 5' und 3' komplementären Sequenzen inseriert ist. 10B zeigt die Teilsequenz der c-raf Kinase Antisense-Bindungssequenz mit der Sequenz des 10-23 DNA-Enzyms, das zwischen den 5' und 3' komplementären Sequenzen inseriert ist. 10C zeigt die Teilsequenz der Pleiotrophin Antisense-Bindungssequenz mit der Sequenz des 10-23 DNA-Enzyms, das zwischen den 5' und 3' komplementären Sequenzen inseriert ist. 10D zeigt die Teilsequenz des tat Antisense-Bindungsbereichs der SIV-Sequenz mit der Sequenz des 10-23 DNA-Enzyms, das zwischen den 5' und 3' komplementären Sequenzen inseriert ist. Die 11A und 11B sind Gele, welche die Ergebnisse von PCR Reverse Transkriptase Assays (J. Silver, et al., 21 Nucleic Acids Res. 3593–3594 (1993)) auf RNA/ssDNA Extrakten von HeLa-Zelllinien, die mit dem Plasmid pTEst transformiert werden, das in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung konstruiert wurde. Lanes, 11A: (1) Größenmarker, (2) nicht transformierte NeLa-Zellen, (3) Hela-Zellen, die mit dem Vektor pcDNA3.1Zeo+ transformiert wurden, (4) HeLa-Zellen, die mit pssXA transformiert wurden, (5) positive Kontrolle, die 2 Milli-Einheiten von MoMuLV Reverser Transkriptase enthält und (6) negative Kontrolle, die keinen Proteinextrakt enthält. Der Pfeil zeigt das 150 bp Amplifizierungsprodukt. Lanes, 11B: (1) Klon A12, (2) B8, (3) B12, (4) D7, (5) positive Kontrolle, die 2 Milli-Einheiten von MoMuLV Reverser Transkriptase enthält, und (6) negative Kontrolle, die keinen Proteinextrakt enthält.
  • 12 zeigt Gele, welche die PCR-Amplifizierung von einzelsträngiger DNA von Extrakten von HeLa-Zelllinien, die mit dem Plasmid pTest transformiert wurden, der wiederum in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung konstruiert wurde, zeigen. RNA-/ssDNA-Präparate wurden als Vorlagen in PCR-Reaktionen verwendet, unter Verwendung von Primern, die für das erwartete ssDNA-Produkt spezifisch sind. Linkes Feld, Lanes 1–3: Gesamt-RNA-/ssDNA-PCR-Vorlage, die aus der stabil transformierten Kolonie A12 (HeLa-Zelllinie, stabil transfiziert mit Plasmid pssDNA-Express-A) (1) die ohne vorherige Behandlung verwendet wurde, (2) behandelt mit S1-Nuklease, (3) behandelt mit RNase A. Lane (4) Gesamt-RNA/-ssDNA von einer Kolonie, die stabil ausschließlich mit dem Vektor pcDNA3.1Zeo+ transformiert wurde. Rechtes Feld, Lanes 1–3: Gesamt-RNA-/-ssDNA-PCR-Vorlage, isoliert aus der stabil transformierten Kolonie B12 (HeLa-Zelllinie, stabil transfiziert mit Plasmid pssDNA-Express-A) (1) verwendet ohne vorherige Behandlung, (2) behandelt mit S1-Nuklease, (3) behandelt mit RNase A. Lane (4) Gesamt-RNA-/-ssDNA von einer Kolonie, die stabil ausschließlich mit dem Vektor pcDNA3.1Zeo+ transformiert wurde. Lane (5), positive Kontrollvorlage, Plasmid p Test.
  • 13 ist ein Gel, das die PCR-Amplifizierung von einzelsträngiger DNA aus Extrakten von Zellen, die mit dem Plasmid pTelo transformiert wurden, das wiederum in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung konstruiert wurde, zeigt. RNA/ssDNA wurde aus transfizierten Zellkulturen 36 h nach Transfektion geerntet und als Vorlage für PCR-Reaktionen verwendet, unter Verwendung von Primern, die für das erwartete ssDNA-Produkt spezifisch sind. Verwendeter 25 bp Lanemarker. Lanes 1–5 mit Isolierung von HeLa-Zelllinie A12, (1) Gesamt-RNA/-ssDNA-Fraktion, (2) Gesamt-RNA behandelt mit S1 Nuklease, (3) Gesamt-RNA behandelt mit RNase A, (4) negative Kontrolle, (5) positiver, telomer Kontroll-DNA-Plasmid. Lanes 6–9, isoliert aus HeLa-Zelllinie B12, (6) Gesamt-RNA-Fraktion, (7) Gesamt RNA behandelt mit S1-Nuklease, (8) Gesamt-RNA behandelt mit RNase A, (9) negative Kontrolle, (10) positiver, telomer Kontroll-DNA-Plasmid. Lanes 11–12 repeat Negativkontrollen. 8% Acrylamid Gel bei 45 V für 20 min.
  • 14 ist ein Gel, das die frühzeitige Verkürzung der ss-cDNA Transkription und „read through" Produkte durch in vitro Reverse Transkriptase-Reaktion zeigt. Lanes 1–5 stehen für Plasmid-Konstrukte mit Stamm-Schleifen-Strukturen, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung konstruiert wurden und für zahlreiche Sequenzen von Interesse, die innerhalb der Schleifenregion kloniert wurden. Die RNA-Vorlage wurde produziert durch in vitro Transkription mit T7RNApolymerase unter Standardbedingungen und dann mit DNase behandelt, um die Plasmidvorlage zu entfernen. Phenol-/Chloroformextrahierte RNA-Pools wurden dann mit Mouse Moloney Reverser Trankriptase revers transkribiert, mit RNase A 15 Minuten lang behandelt und auf einem 6% Acrylamidgel bei 45 V 30 Minuten lang aufgelöst. 25 bp Marker an Rändern. (1) 10 μl RT-Reaktion von dem Originalplasmid pssDNA-Express-B, das in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung konstruiert wurde, (2) 10 μl RT-Reaktion von dem Originalplasmid pTest, konstruiert in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung, (3) 10 μl RT-Reaktion von dem Originalplasmid pTelo, konstruiert in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung, (4) negatives Kontrollplasmid pcDNA-Zeo (Invitrogen), (5) 3 μl Repeat pssDNA-Express-B.
  • 15 zeigt ein Northern Blot eines Antisense-produzierenden Vektors, konstruiert in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung, der eine Antisense-Sequenz gegen c-raf Kinase (10B) und einschließlich der „10-23 DNA-Enzyme" nach Transfektion des Plasmids pssDNA-Express-C (9) einschließlich dieser Sequenz in eine Lungenkrebs-Zelllinie in vitro. In dieser Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden Verfahren und Nukleinsäurekonstrukte für die Verwendung bei der Herstellung von einzelsträngiger Desoxyribonukleinsäure (ss-cDNA) Oligonukleotide von geradezu jeder beliebigen vordefinierten oder gewünschten in vivo Zusammensetzung an Nukleinbasen in Hefe-, prokaryotischen und/oder eukaryotischen Zellen mit oder ohne flankierenden Nukleotidsequenzen. Verfahren und Konstrukte sind beschrieben, welche eher die biologische statt der in vitro oder künstlichen Synthese von ss-cDNA der erwünschten Zusammensetzung von Nukleinbasen verwenden. Auf Grund der Tatsache, dass biologische, z.B. enzymatische Reaktionen in diesen Verfahren verwendet werden, sind sie auf jedes beliebige in vivo System anwendbar.
  • Ein Vektor (wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff "Vektor" auf ein Plasmid oder ein modifiziertes, virales Konstrukt, das zur Abgabe und Manipulation von DNA-Segmenten von Interesse verwendet wird) wurde aufgebaut, dass jede beliebe DNA-Sequenz als ein ss-cDNA-Molekül frei von den meisten angrenzenden Vektorsequenzen in Hefe-, prokaryotischen und/oder eukaryotischen Zellen hergestellt werden kann. Das Vektorsystem enthält alle notwendigen, enzymatischen Funktionen und Signalanweisungen, um die Wirtszelle, an die der Vektor abgegeben wird, in die Lage zu versetzen, ss-cDNA herzustellen. Die Zelle, an die der Vektor der vorliegenden Erfindung abgegeben wird, produziert ein RNA-Transkript (1), initiiert von einem eukaryotischen Promotor, eben so wie die oben beschriebenen Enzyme von eukaryotischen Promotoren initiiert werden, welche als Vorlage verwendet werden, um die Synthese von jeder beliebigen gewünschten einzelsträngigen DNA-Sequenz (eine „Sequenz von Interesse") zu steuern. Detaillierter ausgedrückt wird hierin ein erstes System beschrieben, in dem der Vektor zwei Plasmide umfasst, die in eine geeignete Wirtszelle kotransfiziert werden, bei der es sich um eine Hefezelle oder um eine beliebige prokaryotische oder eukaryotische Zelle handeln kann, um so eine ssDNA, einschließlich der Sequenz von Interesse in der Zelle zu produzieren. Ein zweites System wird beschrieben, in dem das Vektorsystem ein Einzelplasmid umfasst, das die Sequenz von Interesse enthält, die in eine geeignete Wirtszelle transfiziert wird für die Herstellung einer inhibitorischen Nukleinsäure wie der Antisense-Sequenz von der Sequenz von Interesse.
  • Inhibitorische Nukleinsäuren können einzelsträngige ssDNA sein, die aus der mRNA-Vorlage synthetisiert wurde, oder die mRNA-Vorlage selbst, die spezifisch an eine komplementäre Nukleinsäuresequenz binden kann. Durch Bindung an die geeignete Zielsequenz wird eine RNA-RNA-, eine DNA-DNA- oder eine RNA-DNA-Duplex oder -Triplex gebildet. Diese Nukleinsäuren werden oft mit „Antisense" bezeichnet, da sie üblicherweise komplementär zu dem Sense- oder Kodierstrang des Gens sind, aber die "sense"-Sequenz wird in der Zelle auch für therapeutische Zwecke verwendet. Zum Beispiel wurde die Identifizierung von Oligonukleotiden die besonders an Biomoleküle binden, die normalerweise nicht an RNA oder DNA binden, nun für eine Anzahl von Biomolekülen, die sich in Größe, Struktur und Zusammensetzung unterscheiden, demonstriert. Beispiele für solche Moleküle schließen die Folgenden ein (sind aber nicht auf diese beschränkt): (1) Thrombin, ein multifunktionelles, regulierendes Protein, das bei der Blutgerinnung Fibrinogen in Fibrin umwandelt; (2) Bradykinin, ein Nonapeptid Kinin, das in der Blutdruckregulierung eine Rolle spielt und eine Senkung des Blutdrucks bewirkt (3) PGF2α ein Prostaglandin- oder Fettsäurederivat, das hormonelle Aktivität zeigt.
  • Darüber hinaus wurde das Zusammenwirken von Oligonukleotiden mit Biomolekülen deren natürliche biologische Funktion hauptsächlich extrazellulär ist nun bewiesen (siehe zum Beispiel U.S. Patent Nr. 5,840,867). Der Begriff „inhibitorische Nukleinsäuren" wie hierin verwendet, bezieht sich deshalb sowohl auf „Sense"- als auch auf „Antisense" Nukleinsäuren.
  • Durch Bindung an die Zielnukleinsäure hemmt eine inhibitorische Nukleinsäure die Funktion der Zielnukleinsäure. Diese hemmende Wirkung entsteht zum Beispiel durch Blockieren der DNA-Transkription, Prozessierung oder Hinzufügen von Poly(A) zu mRNA, DNA-Replikation, Translation oder durch fördernde inhibitorischer Mechanismen der Zellen (wie zum Beispiel Fördern des RNA-Abbaus). Verfahren mit inhibitorischen Nukleinsäuren umfassen deshalb eine Anzahl von verschiedenen Ansätzen für die Veränderung der Genexpression. Diese verschiedenen Arten von inhibitorischen Nukleinsäuren werden in Helene, C. and J. Toulme, 1049 Biochim. Biophys. Acta. 99–125 (1990) beschrieben.
  • Kurz gesagt können die Therapieansätze mit inhibitorischen Nukleinsäuren in folgende Kategorien eingeteilt werden: (1) jene die DNA-Sequenzen zum Ziel haben, (2) jene die RNA-Sequenzen zum Ziel haben (einschließlich prä-mRNA und mRNA), (3) jene die Proteine zum Ziel haben (Sense-Strang-Ansätze) und (4) jene, welche die Spaltung oder chemische Modifikation der Zielnukleinsäuren wie der ssDNA-Enzyme, einschließlich des so genannten „10-23 Enzyms" bewirken, wie hierin beschrieben. Der erste Ansatz berücksichtigt mehrere Kategorien. Nukleinsäuren sind so ausgelegt, dass sie an die „major groove" der doppelsträngigen DNA binden um eine dreifache Helixstruktur oder „Triplex"-struktur zu bilden. Alternativ sind inhibitorische Nukleinsäuren so ausgelegt, dass sie an Bereiche von einzelsträngiger DNA binden, die aus der Öffnung der doppelsträngigen DNA während der Replikation oder Transkription resultieren. Üblicherweise sind inhibitorische Nukleinsäure so ausgelegt, dass sie an mRNA oder mRNA-Vorläufer binden. Inhibitorische Nukleinsäuren werden verwendet um die Reifung von prä-mRNA zu verhindern. Inhibitorische Nukleinsäuren können so ausgeführt sein, dass sie die Prozessierung, das Spleißen oder die Translation von RNA stören. In dem zweiten Ansatz ist die mRNA das Ziel der inhibitorischen Nukleinsäuren. In diesem Ansatz sind die inhibitorischen Nukleinsäuren so ausgelegt, dass sie die Translation des kodierten Proteins spezifisch blockieren. Bei diesem zweiten Ansatz wird die inhibitorische Nukleinsäure dazu verwendet, selektiv gewisse Zellfunktionen durch Hemmung der Translation von Proteinen, die für die Kodierung der mRNA entscheidet sind, zu unterdrücken. Es wurde gezeigt, dass inhibitorische Nukleinsäuren mit mRNA-targeting mit mehreren verschiedenen Mechanismen arbeiten um die Translation des kodierten Proteins/der kodierten Proteine zu hemmen. Ein Beispiel für solch eine inhibitorische Nukleinsäure ist die Sequenz, die komplementär zu Bereichen von c-myc mRNA ist, welche die Expression des c-myc Proteins in einer humanen promyelocytischen Leukämie-Zelllinie, HL60, hemmen, welche das c-myc Proto-Onkogen überexprimiert. Wickstrom E. L., et al., 85 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1028–1032 (1988); Harel-Bellan, A., et al., 168 Exp. Med. 2309–2318 (1988).
  • Die in der Zelle produzierten Nukleinsäuren können auch den dritten Ansatz für die Ausführung des "Sense"-strangs des Gens oder der mRNA verwenden, um als Enzymfalle zu dienen, oder um kompetitiv bezüglich der Enzyme oder bindenden Proteine, die in der Translation der mRNA eine Rolle spielen, zu wirken. Schließlich werden inhibitorische Nukleinsäuren verwendet, um die chemische Inaktivierung oder Spaltung von Zielgenen oder Ziel-mRNA zu induzieren. Die chemische Inaktivierung erfolgt zum Beispiel durch die Induktion von Vernetzungen zwischen den inhibitorischen Nukleinsäuren und der Ziel-Nukleinsäure in der Zelle und durch das hier erwähnte Verfahren, nämlich der Spaltung der Ziel-mRNA durch die Sequenz mit enzymatischer Aktivität gegen mRNA, die in der Kassette der vorliegenden Erfindung inkorporiert ist.
  • Kurz gesagt umfasst die vorliegende Erfindung in einem Ersten Aspekt ein Set von genetischen Elementen, die für die Abgabe in eine Zelle angepasst sind, um ss-DNA in vitro oder in vivo zu produzieren. Das Set von genetischen Element ist in mindestens einen Vektor für die Abgabe in die Zelle inkorporiert und beinhaltet
    • (a) ein RNA-abhängiges Gen für DNA-Polymerase (Reverse Transkriptase) und
    • (b) eine Kassette, die (1) einen invertierten Tandem Repeat (IR), (2) eine Sequenz von Interesse, die sich entweder zwischen dem invertiertem Repeat (IR) oder 3' zu dem invertierten Repeat befindet und (3) eine Primerbindungsstelle (PBS) für die Reverse Transkriptase, die sich in 3' Position zu dem invertiertem Repeat befindet, einschließt.
  • Das Vektorsystem schließt vorzugsweise die Funktionen und Signalanweisungen für die Transkription dieser Element in vivo und die Funktionen und Signalanweisungen für die Translation des Gens für Reverse Transkriptase (RT) ein. Zusätzliche Elemente, die in dem Set von genetischen Elementen der vorliegenden Erfindung enthalten sein können, schließen folgendes ein: ein Gen für Restriktions-Endonuklease (RE) ein, das für den unten beschriebenen Zweck eingeschlossen werden kann und eine Sequenz mit enzymatischer Aktivität wenn die linearisierte ss-DNA in die zweite Konfiguration faltet, was der Sequenz enzymatische Aktivität verleiht. Die enzymatische Sequenz befindet sich vorzugsweise in einer Sequenz von Interesse unabhängig davon, ob sich die Sequenz von Interesse zwischen den invertierten Tandem Repeats oder zwischen dem 3' Aspekt des invertierten Repeats und der PBS befindet.
  • In einer ersten Ausführungsform des hierin beschriebenen Vektorsystems umfasst der Vektor ein System mit zwei Plasmiden und der erste Plasmid schließ das RNA-abhängige Gen für DNA Polymerase (Reverse Transkriptase) und ein Gen für RNase H, das über einen Histidin-Prolin-Linker mit einem Gen für Restriktions Endonuklease verbunden ist, ein. Das Plasmid, in das diese Gene inseriert wurden, enthält die notwendigen Kontrollelemente für die Transkription und Translation für diese Gene, zusammen mit Endsequenzen für die Polyadenylierung. Dieses Plasmid wird hier als das „A"-Plasmid (pssDNA-Express-A wie in 4 in einer der bevorzugten hier beschriebenen Ausführungsformen gezeigt) bezeichnet. Ein zweites Plasmid, das „B"-Plasmid wurde konstruiert und es beinhaltet in der hierin beschriebenen Ausführungsform die Kassette, bestehend aus drei der oben aufgeführten Elemente, nämlich einer Primerbindungsstelle (PBS) abgestimmt auf die Reverse Transkriptase, einer Sequenz von Interesse und einem invertierten Tandem Repeat. In zwei hierin beschriebenen Ausführungsformen (pMN-new-link und pssDNA-Express-4B; letzteres wird in 7B gezeigt) befindet sich die Sequenz von Interesse entweder zwischen den invertierten Tandem Repeats oder in einer 5'-Position (mit Bezug auf das mRNA-Transkript) zu der Primerbindungssequenz (PBS), wobei die PBS sich meistens am 3' Aspekt des mRNA Transkripts befindet. In anderen Worten befindet sich Sequenz von Interesse (1) zwischen den invertierten Repeats, (2) zwischen den invertierten Repeats und der PBS und/oder (3) sowohl zwischen den invertierten Repeats als auch zwischen den invertierten Repeats und der PBS. Wie Plasmid A enthält auch Plasmid B eine Kombination von Kontrollelementen für die Transkription. Allerdings enthält (oder benötigt) das Plasmid B in zumindest einer bevorzugten Ausführungsform, die hierin beschrieben wird, keine Kontrollelemente für die Translation, da kein Proteinprodukt aus diesem Konstrukt hergestellt wird.
  • In einer anderen Ausführungsform, die hierin beschrieben wird, umfasst das Vektorsystem der vorliegenden Erfindung ein einzelnes Plasmid, als Plasmid C bezeichnet, in dem alle der oben aufgelisteten Elemente eines Sets von genetischen Elementen inkorporiert waren, mit Ausnahme des RE-Gens, das aus Gründen nicht beinhaltet war, die im Folgenden näher dargelegt werden. Außerdem befinden sich die Komponenten der Kassette, die im Plasmid B des oben beschriebenen Systems mit zwei Plasmiden enthalten sind, z.B. die Primerbindungssequenz (PBS), die Sequenz von Interesse und der invertierte Tandem Repeat, in dem nicht translatierten 3'-Teil des Polyproteins der Reversen Transkriptase im C-Plasmid. Mit anderen Worten, wenn die RT-RNase-H-Komponente von dem C-Plasmid unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors transkribiert wird (in den bevorzugten hierin beschriebenen Ausführungsformen wurde der RSV-Promotor verwendet), enthält das daraus resultierende RNA-Transkript den Kodierbereich für das Polyprotein der Reversen Transkriptase – RNase H und, am Ende der Translation an den Stoppsignalen, enthält das zusätzliche mRNA-Transkript (3' zu diesem translatierten Protein) die Elemente von dem Plasmid B mit weiteren 3' Downstream Signalwege für Polyadenylierungsignale von der RT-RNase H Komponente, die intakt bleiben.
  • Das besondere hierin beschriebene Vektorsystem mit einem einzelnen Plasmid (pssDNA-Express-C wie in 9 gezeigt) enthält nicht das Gen für Restriktions-Endonuklease und hat deshalb auch nicht die Fähigkeit, den Stamm des Stamm-Schleifen-Intermediats, der von den invertieren Repeats gebildet wird, zu verdauen. Folglich wird die Sequenz von Interesse (einschließlich des DNA-Enzyms) in den Plasmid C nur in einer 3' Position zu den invertierten Repeats inseriert und unerwünschte Vektorsequenzen werden durch frühzeitige Verkürzung des ss-cDNA-Produkts entfernt, wenn das Transkript auf den relativ stabilen Stamm trifft und nicht in der Lage ist, mit dem Transkribieren des ss-cDNA von dem mRNA-Transkript fort zu fahren. Genauer gesagt, wurde, wie in der folgenden Beschreibung deutlich werden wird, jede der Sequenzen von Interesse nur innerhalb der BamHI-PacI Restriktionsstellen des pssDNAExpress-C Plasmids inseriert.
  • Wie ebenfalls aus der folgenden Beschreibung der Plasmiden B und C deutlich werden wird, schließen die Plasmide Klonierungsstellen für die Insertion der Sequenz von Interesse ein. Beide NotI Stellen (die sich zwischen den invertierten Repeats befinden) und PacI/BamHI Stellen (die 3' zu den invertierten Repeats, z.B. zwischen den invertierten Repeats und den PBS befinden), sind in der hierin beschriebenen, bevorzugten Ausführungsform des Plasmids B vorgesehen. Der bevorzugte Plasmid C, der hierin beschrieben wird, beinhaltet nur die PacI-/BamHI-Stellen für diesen Zweck. Allerdings wird der Fachmann, der von dieser Offenbarung profitiert, erkennen, dass diese besonderen Klonierungsstellen für besondere hierin beschriebene Systeme gewählt wurden und dass andere Klonierungsstellen gleichermaßen nützlich für diesen selben Zweck sein können. Das bestimmte Plasmid A, welches das Vektorsystem mit zwei Plasmiden, das hierin beschrieben ist, umfasst, war nicht darauf ausgelegt die Sequenz von Interesse zu enthalten, aber der Fachmann, der diese Offenbarung liest, wird erkennen, dass, wenn ein Vektorsystem mit zwei Plasmiden verwendet werden soll, die Elemente dieses Sets von genetischen Elementen der vorliegenden Erfindung und vor allem die Sequenz von Interesse je nach Wunsch in beide Plasmide inseriert werden können.
  • Die Nukleinsäuresequenz, auf die hierin als Kassette Bezug genommen wird, gibt die Vorlage für die Synthese von ss-cDNA in Zielzellen ab. Dieses Element beinhaltet die Sequenz von Interesse, den invertierten Tandem Repeat und die Primerbindungsstelle. Wie dies der Fall für andere Elemente des Sets von genetischen Element der vorliegende Erfindung ist, wird dieses genetische Element vorzugsweise durch einen geeigneten Promotor/Enhancer mit breitem Spektrum oder einen gewebespezifischen Promotor/Enhancer, wie den CMV-Promotor, reguliert; oder Kombinationen von Promotoren/Enhancern werden verwendet, die sich stromaufwärts zu dem genetischen Element befinden. Wie es für andere genetische Elemente der Fall ist, kann der Promotor/Enhancer entweder konstitutiv oder induzierbar sein. Der Fachmann, der von dieser Offenbarung profitiert, wird erkennen, dass eine Anzahl von anderen eukaryotischen Promotoren vorteilhaft verwendet werden kann, um die Expression der Sequenz von Interesse zu kontrollieren, einschließlich SV-40, RSV (nicht zelltypspezifisch) oder das gewebespezifische saure Gliafaserprotein (GFAP).
  • Wie in 1 gezeigt, schließt die Kassette für die Expression in eukaryotischen Zellen stromabwärts eine Polyadenylierungs-Signalsequenz ein, so dass die von der Sequenz von Interesse produzierte mRNA einen Poly(A)-Schwanz aufweist. Die Primerbindungsstelle (PBS) für die Initiation des Primings für die Synthese von cDNA befindet sich zwischen dem 3' invertierten Tandem Repeat und dem Polyadenylierungssignal. Die PBS ist eine Sequenz, die komplementär zu einer Transfer-RNA (tRNA) ist, die sich innerhalb der eukaryotischen Zielzelle befindet. Im Fall der Reversen Transkriptase von Mouse Maloney, deren Verwendung in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung hier beschrieben wird, nutzt die PBS die Prolin-tRNA. Die in Verbindung mit der hier beschriebenen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendete PBS wurde aus dem Sequenzbereich mit 18 Nukleotiden des Mouse Moloney Viruses entnommen. Siehe 293 Nature 81. Im Fall des Gens für Reverse Transkriptase des humanen Immunschwäche Virus, das wie oben angemerkt ebenfalls getestet wurde, wurde die verwendete PBS von der Nukleotidsequenz von HIV entnommen. Y. Li, et al., 66 J. Virology 6587–6600 (1992). Kurz gesagt, jede beliebige PBS, die auf jene Reverse Transkriptase angepasst wird, die in Zusammenhang mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann für diesen Zweck verwendet werden. Die Kassette der vorliegenden Erfindung umfasst auch ein Paar invertierte Tandem Repeats. Nach Verdau der mRNA von der mRNA-cDNA Heteroduplex durch RNase H und der Freisetzung der ss-cDNA bewirken die invertierten Repeats, dass die ss-cDNA sich auf sich selbst zurückfaltet, um den Stamm einer Stamm-Schleifen-Struktur zu bilden, die aus doppelsträngiger, antiparalleler DNA besteht. Die ss-cDNA, die hergestellt wird, wird mit den kodierten 5' und 3' Bereichen, die den Stamm (bestehend aus dem invertierten Repeat) flankieren und einer Schleife, weiche die Sequenz von Interesse enthält, transkribiert. Eine oder mehrer funktionale genetische Elemente können in den doppelsträngigen Teil eingefügt sein, z.B. der invertierte Repeat, der den Stamm des Stamm-Schleifen-Intermediats bildet. In den hierin beschriebenen Beispielen besteht das funktionale genetische Element aus einer oder mehreren Stelle für Restriktions-Endonuklease(n), die, von der Restriktions-Endonuklease, die aus dem oben beschriebenen Gen für Restriktions- Endonuklease hergestellt wird, geschnitten wird (im Fall derjenigen Plasmide, die ein RE-Gen beinhalten), aber der Fachmann wird erkennen das der invertierte Repeat so ausgeführt sein kann, dass er andere funktionelle genetische Elemente einschließt, wie eine spezifische Enzym-Erkennungssequenz (eine andere als die Stelle für Restriktions-Endonuklease), eukaryotische und/oder prokaryotische Erkennungsstellen für Rezeptoren, Stellen für den Promotor oder den Promotor/Enhancer für die Initiierung der Expression einer Zielsequenz (die ebenfalls in dem Stamm angeordnet sein kann oder nicht) in isolierter cis-orientierter Art und Weise. Falls das funktionale genetische Element eine spezifische Enzym-Erkennungssequenz wie eine Stelle für Restriktions-Endonuklease umfasst, wird der Stamm von einem beliebigen der vielen Restriktions-Enzyme geschnitten (auch als verdaut oder gespalten bezeichnet), welche die Schnittstelle, die in dem Stamm ausgeführt ist, erkennen (es ist zu beachten, dass die Stelle für die Erkennung der Endonuklease in dem Stamm ausgeführt sein kann, obwohl das RE-Gen nicht im Vektorsystem der vorliegenden Erfindung enthalten ist), um so die ss-cDNA Schleife freizusetzen. Der Schleifen-Teil der ss-cDNA, der keine ersichtliche DNA Duplex bildet, ist immun gegenüber der Aktivität der Restriktions-Endonuklease, da die Restriktions-Endonukleasen nur doppelsträngige DNA als Zielsubstrat erkennen.
  • Der Fachmann wird erkennen, das die Stelle für Restriktions-Endonuklease(n) nicht in den invertierten Repeats, die den Stamm des Stamm-Schleifen-Intermediats bilden, ausgeführt sein muss, wenn der zweite Aspekt der vorliegenden Erfindung in der Verwendung liegt. In anderen Worten: sollte es erwünscht sein, dass ssDNA von einer zweiten Sequenz von Interesse, die sich zwischen der Primerbindungsstelle und den invertierten Repeats, befindet, mit Transkription der Kassette herzustellen, um an dem aus den invertierten Repeats gebildeten Stamm zu enden, so ist es nicht notwendig, eine Stelle für Restriktions-Endonuklease im Stamm vorzusehen. Eine weitere Option ist es, die invertierten Repeats so auszuführen, dass sie Bindungsstellen für eukaryotische, prokaryotische DNA oder DNA aus viralem Protein enthalten, die bewirken können, dass die gewählten Zellproteine kompetitiv austitrieren. Kombinationen von Restriktions-Stellen oder anderen sequenzspezifischen Elementen können in den invertierten Tandem Repeats beinhaltet sein, in Abhängigkeit von der Zusammensetzung der Basenpaare, die für die Konstruktion von invertierten Repeats gewählt wurde, so dass lineare oder präzise geschnittene Stamm-Schleifen-Intermediate aus ss-DNA hergestellt werden. Es ist allgemein bevorzugt, synthetisch konstruierte funktionale genetische Elemente in dem invertierten Tandem Repeat zu verwenden, da es (wenn das funktionale genetische Element eine Stelle für Restriktions-Endonuklease ist) unwahrscheinlich ist, dass ein natürlich entstehender invertierter Repeat die richtig angeordneten Restriktions-Stellen aufweist.
  • Wie oben erwähnt schließt die Kassette, die eines der Elemente von dem Set von genetischen Elementen der vorliegenden Erfindung umfasst, optional auch eine DNA-Sequenz mit katalytischer Aktivität ein. Auf Grund der Inklusion des so genannten „DNA-Enzyms" in der Kassette und besonders auf Grund der Tatsache, dass angenommen wird, dass das DNA-Enzym sich in der Sequenz von Interesse befindet, wird die vorliegende Erfindung besonders vorteilhaft verwendet, wenn die Sequenz von Interesse als Vorlage für die Synthese von einer inhibitorischen Nukleinsäure, bei der es sich um eine Antisense-Sequenz handelt, dient. Deshalb beschreiben die hier dargestellten Beispiele die Herstellung von vier „Antisense"-Sequenzen von Interesse, wie in 6 dargestellt, wobei jede davon eine Sequenz enthält, die enzymatische Aktivität gegen mRNA aufweist, einschließlich C-raf Kinase, h-ras Antisense-Sequenz, der Antisense-Sequenz zu dem angiogenen Wachstumsfaktor Pleiotrophin und der tat-Region des Simianen Immundefizienz Virus (SIV). Der Fachmann wird jedoch erkennen, dass die vorliegende Erfindung nicht auf „Antisense"-Sequenzen beschränkt ist und dass die inhibitorische Nukleinsäuresequenz auch eine beliebige der anderen Arten der oben beschriebenen inhibitorischen Nukleinsäuresequenzen sein könnte.
  • Die Nukleinsäuresequenz mit enzymatischer Aktivität, welche die Kassette der vorliegenden Erfindung umfasst, kann eine beliebige solche enzymatische Sequenz sein. Die Sequenz mit der gewünschten katalytischen Aktivität wird in die Kassette in einem oder in beiden der zwei Loki inseriert, z.B. (a) zwischen den invertierten Repeats und in der Sequenz von Interesse oder (b) in der zweiten Sequenz von Interesse, die sich in 3'-Position zu den invertierten Repeats und in 5'-Position zu den PBS befindet. In beiden Fällen ist der daraus entstehende Aptamer spezifisch für das Ziel der Sequenz von Interesse und wird deshalb für das targeting anderer DNA-Sequenzen, mRNA-Sequenzen und jedes beliebigen anderen geeigneten Substrats, für das Hemmen oder Verändern von DNA- oder mRNA-Spleißmechanismen, oder sogar für das direkte Verändern des Zellgenoms in einer speziellen Art und Weise.
  • Nukleinsäuresequenzen mit enzymatischer Aktivität, die für die Verwendung in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung geeignet sind, schließen folgende ein, sind aber nicht darauf beschränkt:
    • Sequenzen mit RNase Aktivität, wie die so genannten Enzyme „10-23" und „8-17'' (Santoro, S.W. and G.F. Joyce, supra (1997)) und andere metallabhängige RNasen (Breaker, R.R. and G.F. Joyce, 1 Biol. Chem. 223–229 (1994); Breaker, R.R. and G.F. Joyce, 2 Biol. Chem. 655–660 (1995)) und Histidin-abhängige RNase (Roth, A. and R.R. Breaker, 95 Proc. Natl Acad. Sci. USA 6027–6031 (1998));
    • Sequenzen mit DNase Aktivität wie Kupfer-abhängige DNase (Carmi, N., et al., 3 Chem. Biol. 1039–1046 (1996); Carmi, N., et al., 95 Proc. Natl Acad. Ser. USA 2233–2237 (1998); Sen, D. and C.R. Geyer, 2 Curr. Opin. Chem. Biol. 680–687 (1998)) und die DNasen, die zweiwertige Metallionen als Co-Faktoren benötigen oder hydrolisiert das Substrat unabhängig von zweiwertigen Metallionen wie in Faulhammer, D. and M. Famulok (269 J. Molec. Bio. 18–203 (1997)) berichtet;
    • Sequenzen mit DNA-Ligase Aktivität wie Kupfer-abhängige DNasen (Breaker, R.R., 97 Chem. Rev. 371–390 (1997)) und Zink-abhängige E47 Ligase (Cuenoud, B. and J.W. Szostak, 375 Nature 611–613 (1995));
    • Sequenzen mit DNA-Kinase Aktivität wie Kalzium-abhängige DNA Kinase (Li, Y. and R.R. Breaker, 96 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2746–2751 (1999)); und Sequenzen mit RNA Kinase Aktivität wie Kalzium-abhängiger DNA Kinase (Li, Y., supra (1999)).
  • Die besondere Nukleinsäuresequenz mit enzymatischer Aktivität, die in den hierin beschriebenen Beispielen verwendet wird, ist das "10-23 Enzyme" (Santoro, S.W. and G.F. Joyce, supra (1997))., und es ist diese enzymatische Sequenz, die schematisch in 3A und 3B beschrieben ist. Allerdings wird der Fachmann aus dieser Offenbarung erkennen, dass eine beliebige der in der oben aufgelisteten Literatur Sequenzen für den beabsichtigten Zweck wirksam eingesetzt werden kann, wenn sie in die Kassette der vorliegenden Erfindung inseriert wird.
  • Was das RNA-abhängige Gen für DNA-Polymerase oder für Reverse Transkriptase (RT) angeht, das auch, wie oben angeführt, ein Element aus dem Set der genetischen Elemente der vorliegenden Erfindung betrifft, wurde das Gen für Reverse Transkriptase/RNase H von dem Moloney Murine Leukemia Virus verwendet, um es vorteilhaft in den hierin angeführten Beispielen zu verwenden. Das Gen für Reverse Transkriptase/RNase H von dem Humanen Immundefizienz Virus (HIV) wurde ebenfalls getestet. Viele andere retrovirale Gene für Reverse Transkriptase/RNase H können vorteilhaft in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden, einschließlich jener von Retroviren wie SIV, von Stämmen von Hepatitis B, Hepatitis C, bakteriellen Retron-Elementen und von verschiedenen Hefe- und Bakterienarten isolierte Retrone, wobei es bevorzugt ist, dass das Gen für Reverse Transkriptase/RNase H ein Gen für Reverse Transkriptase/RNase H ist, dessen Expression in eukaryotische Zellen von einem passenden Promotor/Enhancer wie dem Cytomegalovirus (CMV) oder dem Rouse Sarcoma Virus (RSV) Promotor, der sich stromabwärts befindet, reguliert wird.
  • Wie in der Natur haben diese RNA-abhängigen DNA-Polymerasen üblicherweise eine zugeordnetes Enzym für die RNase H-Komponente mit dem selben kodierenden Transkript. Die vorliegende Erfindung benötigt jedoch nicht das natürlich vorkommende RNase H Gen für eine besondere Reverse Transkriptase. Mit anderen Worten, der Fachmann wird von dieser Offenbarung erkennen, dass zahlreiche Kombinationen von Genen für Reverse Transkriptasen und RNase H, für die Verwendung in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung zusammen gespleißt werden können, um so diese Funktion zu erfüllen und das Modifikationen an und/oder Hybridversionen von diesen beiden Enzymsystemen, die in der gewünschten Weise wirken werden, erhältlich sind und/oder dem Fachmann bekannt sind. Der Fachmann wird ebenso erkennen, dass die Zielzelle selbst über genügend endogene RNase H verfügen kann, um diese Funktion zu erfüllen. Auf die gleiche Weise wird der Fachmann erkennen, dass die Zielzelle selbst über genügend endogene Reverse Transkriptase-Aktivität, zum Beispiel von einer früheren retroviralen Infektion verfügen kann, um diese Funktion zu erfüllen.
  • Das Gen für Reverse Transkriptase/RNase H beinhaltet vorzugsweise auch stromabwärts eine Polyadenylierung – Signalsequenz, so dass die aus dem Gen für Reverse Transkriptase/RNase H hergestellte mRNA einen 3' Poly(A)- Schwanz für die Stabilität der mRNA beinhaltet.
  • Wie dem Fachmann bekannt ist, sind multiple Poly(A)-Schwänze verfügbar und werden routinemäßig für die Herstellung von exprimierten eukaryotischen Genen verwendet. Die in der Zelle produzierte Reverse Transkriptase synthetisiert eine komplementäre DNA (cDNA) unter Verwendung des genetischen Elements, das die unten beschriebene Sequenz von Interesse als Vorlage enthält. Die RNase H-Aktivität der Reversen Transkriptase baut zusammen mit der endogenen RNase-Aktivität in der Zelle die mRNA Vorlagenkomponente des RNA/cDNA Hybrids ab, um ss-DNA in vivo herzustellen.
  • Das Gen, das die Restriktions-Endonuklease kodiert (wird nur in dem System mit zwei Plasmiden verwendet und ist nicht einmal eine erforderliche Komponente für dieses System) kann ein beliebiges von mehreren Genen sein, die für Restriktions-Endonuklease kodieren und vorzugsweise jene, die von einem oder mehreren konstitutiven oder induzierbaren Promotoren/Enhancern mit breitem Spektrum oder mit gewebespezifischen Eigenschaften kontrolliert werden, wie unten beschrieben. Die besonderen hierin verwendeten Restriktions-Endonukleasen waren MboII und FokI, aber der Fachmann, der von dieser Offenbarung profitiert, wird erkennen, dass jede beliebige Stelle für Restriktions-Endonuklease (Typ I, II, IIS, oder III) im invertierten Tandem Repeat enthalten sein kann. Diese Enzyme „trennen" oder verdauen den Stamm des Stamm-Schleifen-Intermediats, um die Sequenz von Interesse als einzelsträngige DNA zu linearisieren.
  • Obwohl die Expression des RE Gens durch einen geeigneten konstitutiven oder induzierbaren Promotor/Enhancer, der sich stromaufwärts von dem Gen für Restriktions-Endonuklease befindet, wie der CMV- oder RSV-Promotor für die Expression in humanen Zellen, reguliert werden kann, ist in dem hierin beschriebenen Plasmid pssDNA-Express-A das RE-Gen (MboII) mit dem RT-RNase H Polypeptid verknüpft. Das RE-Gen schließt vorzugsweise eine nachgeschaltete Polyadenylierung – Signalsequenz ein, so dass das mRNA-Transkript von dem Gen für Restriktions-Endonuklease ein 3'-Poly(A)-Schwanz aufweisen wird.
  • Der Fachmann, der von dieser Offenbarung profitiert, wird auch erkennen, dass eine Anzahl von Promotoren/Enhancern mit breitem Spektrum oder gewebespezifischen Eigenschaften, oder andere als die oben aufgelisteten Kombinationen von Promotoren/Enhancern auch vorteilhaft verwendet werden können, um das Gen für Reverse Transkriptase/RNase H, das RE-Gen (wenn verwendet) und die Sequenz von Interesse zu regulieren. Obwohl keine Liste von allen verfügbaren Promotoren/Enhancern benötigt wird, um die Erfindung zu erläutern, können die Promotoren/Enhancer, wie oben angeführt, konstitutiv oder induzierbar sein und können die CMV- oder RS-Promotoren/-Enhancer (nicht zelltyp-spezifisch) oder GFAP-Promotoren/-Enhancer (gewebespezifisch) und viele andere virale oder von Säugetier-Promotoren einschließen. Repräsentative Promotoren/Enhancer, die für die Verwendung in Verbindung mit den Elementen der vorliegenden Erfindung geeignet sind, können folgendes einschließen, sind aber nicht darauf beschränkt: HSVtk (S.L. McKnight, et al., 217 Science 316 (1982)), humaner β-Globulin-Promotor (R. Breathnach, et al., 50 Ann. Rev. of Biochem. 349 (1981)), β-Aktiv (T. Kawamoto, et al., 8 Mol. Cell Biol. 267 (1988)), Ratten Wachstumshormon (P.R. Larsen, et al., 83 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 8283 (1986)), MMTV (A.L. Huang, et al., 27 Cell 245 (1981)), Adenovirus 5 E2 (M.J. Imperiale, et al., 4 Mol. Cell. Biol. 875 (1984)), SV40 (P. Angel, et al., 49 Cell 729 (1987)), α-2-Macroglobulin (D. Kunz, et al., 17 Nucl. Acids Res. 1121 (1989)), MHC Klasse-I Gen H-2kb (M.A. Blanar, et al., 8 EMBO J. 1139 (1989)), und schilddrüsenstimulierendes Hormon (V.K. Chatterjee, et al., 86 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 9114 (1989)).
  • Wenn die Elemente, die das Set von genetischen Elementen der vorliegenden Erfindung umfassen, in einen Vektor inkorporiert sind, wird es bevorzugt, wenn der Vektor andere spezialisierte genetische Elemente enthält, um die Identifizierung von Zellen, die den Vektor tragen zu erleichtern und/oder das Niveau der Expression der Kassette zu erhöhen. Die spezialisierten genetischen Elemente beinhalten selektierbare Markengene, so dass der Vektor in einem prokaryotischen System transformiert und amplifiziert werden kann. Die am häufigsten verwendeten selektierbaren Marker sind zum Beispiel Gene, die den Bakterien (z.B. E.coli) Resistenz gegenüber Antibiotika wie Ampicillin, Chloramphenicol, Kanamycin (Neomycin) oder Tetracyclin verleihen. Es ist ebenfalls bevorzugt, wenn der Vektor spezialisierte genetische Elemente für die nachfolgende Transfektion, Identifikation und Expression in einem eukaryotischen System enthält. Für die Expression in eukaryotischen Zellen können verschiedene Selektionsstrategien (z.B. Chinese Hamster Ovarian: CHO) verfolgt werden, die der Zelle Resistenz gegenüber einem Antibiotikum oder einem anderem Medikament verleihen oder den Phänotyp der Zelle verändern, wie morphologische Veränderungen, Verlust der Kontaktinhibition oder gesteigerte Wachstumsrate. Selektierbare Marker, die in eukaryotischen Systemen verwendet werden, schließen folgendes ein, sind aber nicht darauf beschränkt: Resistenzmarker für Zeocin, Resistenz gegenüber G418, Resistenz gegenüber Aminoglykosid-Antibiotika oder phenotypische Selektionsmarker wie β-gal oder das Grün fluoreszierende Protein.
  • Die Einfügung dieser Komponenten in einen geeigneten Vektor ermöglicht zwei vorteilhafte Verfahren für die Entfernung zuvor bestimmter Vektorsequenzen nach der Herstellung von ssDNA. In dem ersten Verfahren besteht der Schleifenteil des ssDNA Stamm-Schleifen-Intermediats, das hergestellt wird, aus der Nukleotidsequenz von Interesse und nach Verdau mit der Restriktions-Endonuklease, wird die Schleife als linearisierte, einzelsträngige cDNA ohne flankierende Sequenzen freigesetzt. In dem zweiten Verfahren, bei dem eine zweite Sequenz von Interesse in der Kassette 3' zu dem invertiertem Tandem Repeat beinhaltet ist, wird die reverse Transkription an dem Stamm der Stamm-Schleifen-Struktur abgebrochen, so dass die daraus entstehende ssDNA ohne flankierende Sequenzen hergestellt wird. Wenn es erwünscht ist, ssDNA unter Verwendung der zweiten Methode zu produzieren, ist die Kassette mit einem invertiertem Repeat ausgestattet, der einen Stamm bildet, der stabiler ist als der Stamm des Stamm-Schleifen-Intermediats aus dem die ssDNA durch Verdau des Stamms in Übereinstimmung mit dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung hergestellt wird. Durch Ausführung der Kassette mit einem invertiertem Repeat der einen Stamm bildet, der in Übereinstimmung mit dem ersten Aspekt der Erfindung leicht denaturiert wird, verläuft die reverse Transkription weiter durch die zweite Sequenz von Interesse (falls sie auch in der Kassette ausgeführt ist) zu der Sequenz von Interesse, die sich zwischen dem invertierten Repeat befindet. Ein Stamm, der von mittlerer Stabilität ist, ermöglicht die Herstellung von sowohl der ersten als auch der zweiten Sequenz von Interesse.
  • Diese „vorzeitige Termination" des Reversen Transkriptase cDNA-Transkripts an dem 3'-Aspekt der Stammstruktur wurde entdeckt, als ein Vektor mit einem Stamm, der 29 Basenpaare enthielt, in in vitro Experimenten verwendet wurde, wobei die zusätzlichen in dem Stamm enthaltenen Basenpaare für die zusätzliche Stabilität sorgten, welche die Herstellung von sowohl der ersten als auch der zweiten Sequenz von Interesse bewirkt. Die Ausführung eines Stamm-Schleifen-Intermediats mit einem Stamm von der gewünschten Stabilität, um entweder die Herstellung der ersten (zwischen dem invertiertem Repeat) oder der zweiten (zwischen dem 3' Aspekt des invertiertem Repeat und der PBS) Sequenz von Interesse zu bewirken, liegt im Fachbereich des Fachmanns, der von dieser Offenbarung profitiert. Kurz gesagt können Faktoren wie die Länge des invertierten Repeats (z.B. die Anzahl von Nukleotiden, die den Repeat bilden) und die Identität der Basen, aus denen der Repeat besteht, manipuliert werden (zum Beispiel unter Verwendung des hierin beschriebenen in vitro Systems), um einen Stamm mit der je nach Wunsch niedrigst möglichen oder der höchst möglichen Stabilität zu erhalten, um die Herstellung der ersten oder zweiten Sequenz von Interesse oder eine Mischung aus beiden Sequenzen zu bewirken.
  • Es wird dem Fachmann aus dieser Beschreibung ersichtlich sein, dass die intakte Stamm-Schleifen ss-cDNA Struktur in vielen Anwendungen ähnlich funktionieren kann wie die linearisierte ss-cDNA Form. Folglich wird die Kassette auch vorteilhaft ohne das Gen für Restriktions-Endonuklease und die assoziierten regulierende Elemente und/oder mit einer Sequenz von Interesse ohne entsprechende Stelle für Restriktions-Endonuklease verwendet.
  • Es wird dem Fachmann aus dieser Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ebenfalls ersichtlich sein, dass eine Kassette, die eine ss-cDNA kodiert, die eine „getrimmte" Stamm-Schleifen-Struktur hat, hergestellt werden kann. Die Stellen für Restriktions-Endonuklease, die in den invertierten Repeats, welche die Sequenz von Interesse flankieren, kodiert sind, sind so ausgeführt, dass der Stammteil (nach Duplexbildung) mit der entsprechenden Restriktions-Endonuklease verdaut wird, so dass die dsDNA, die den Stamm umfasst, so schneidet, dass ein Teil des Stammes und die zugeordneten flankierenden Sequenzen entfernt werden, aber dennoch genügend Duplex DNA übrig bleibt, um zu gewährleisten, dass der Transkript die oben beschriebenen Stamm-Schleifen-Struktur beibehält. Eine solche ss-cDNA-Struktur kann durch das Beibehalten der „Enden" einer ssDNA in doppelsträngiger Form stärker resistent gegenüber intrazellulären Nukleasen sein.
  • Es wird dem Fachmann auch offensichtlich sein, dass der Stamm (doppelsträngige DNA) so ausgeführt werden kann, dass er eine zuvor bestimmte Sequenz (oder Sequenzen) enthält, d.h. Aptamere, die von spezifischen DNA-bindenden Proteinen erkannt und gebunden wird. Unter anderen Verwendungen wird eine solche Stammstruktur in der Zelle als Kompetitor verwendet, um ein selektiertes Protein/selektierte Proteine, welche die spezifische Genfunktion regulieren, auszutitrieren. Zum Beispiel wird eine ss-cDNA Stammschleife in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung in einer Zelle, die eine Bindungsstelle für einen gewählten positiven Transkriptionsfaktor wie Adenovirus E1a aufweist, hergestellt. Adenovirus E1a moduliert wie andere Onkogene die Expression von mehreren adenoviralen und zellulären Genen dadurch, dass er auf die Aktivität von zellkodierten Transkriptionsfaktoren wirkt, was zu der Wandlung von normalen Zellen in transformierte Zellen führt. Jones, et al., 2 Genes Dev. 267–281 (1988). Der Doppelstamm des Stamm-Schleifen-Intermediats, der in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde ist deshalb so ausgeführt, dass er ein „Aufbinden" dieses Transkriptionsfaktors bewirkt, so dass das Protein daran gehindert wird, an ein Protein zu binden und so die Expression des besonders schädlichen Gens gehemmt wird. Für den Fachmann wird es klar ersichtlich sein, dass die Duplexstruktur des Stamms optional multiple Bindungsstellen beinhalten kann, zum Beispiel Stellen, die von verschiedenen Transkriptionsfaktoren, die aktiv die Expression von besonderen Genen regulieren. Zum Beispiel wurde gefunden, dass Adenovirus E1a die Transkription des Kollagenase-Gens über das auf Phorbolester ansprechende Element, ein Promotorelement, das für die Induktion der Transkription durch 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-Acetat (TPA), durch ein Anzahl von anderen Mitogenen und durch die ras-, mos-, src- und trk-Onkogene verantwortlich ist, zu unterdrücken. Der Mechanismus bezieht die Hemmung der Funktion der Transkriptionsfaktor – Familie AP-1 ein. Offringa, et al., 62 Cell 527–538 (1990). Jede gewünschte Nukleotidsequenz kann in das genetische Element inseriert sein, das den „Schleifen"-Teil des Stamm-Schleifen-Intermediats kodiert, um schließlich eine gewünschte inhibitorische Funktion auszuführen, z.B. Antisense-Bindung, Downregulation eines Gens, und so weiter wie hierin beschrieben.
  • In einem anderen Aspekt, der für den Fachmann ersichtlich sein wird, wird die vorliegende Erfindung verwendet, um komplexe sekundäre ssDNA-Strukturen zu konstruieren, die dem cDNA-Transkript biologische Reaktionen, basierend auf konformativer, sekundärer Strukturfaltung, verleihen. Solch eine sekundäre Struktur kann technisiert sein um eine beliebige von mehreren Funktionen zu erfüllen. Zum Beispiel kann die Sequenz von Interesse eine Sequenz enthalten (ist aber nicht darauf beschränkt), die in den Schleifenteil des einzelsträngigen cDNA-Transkripts inkorporiert ist, die so genannte „Kleeblatt"- oder „Kreuz"-ähnliche Strukturen bildet, wie jene, die in den long terminal repeats des adenoassoziierten Virus oder in Retrotransposons gefunden wurden. Unter korrekten Bedingungen, wird eine solche Struktur auf für die Stelle spezifische Art und Weise in das Wirtsgenom integriert.
  • Da das Set von genetischen Elementen der vorliegenden Erfindung für die vorliegende Erfindung für die Einfügung in multiple, kommerziell erhältliche Abgabevektoren für therapeutische Zwecke in Säugetieren und beim Menschen anwendbar ist, sind in Abhängigkeit von dem gewählten Vektor für eine besondere Zielzelle multiple Abgabewege umsetzbar. Zum Beispiel sind virale Vektoren momentan die am Häufigsten verwendeten Mittel für die Transformation der Zellen des Patienten und die Einführung von DNA in das Genom. In einem indirekten Verfahren werden virale Vektoren verwendet, die neue, genetische Informationen tragen, verwendet, um Zielzellen, die aus dem Körper entfernt wurden zu infizieren. Anschließend werden die infizierten Zellen dann reimplantiert (z.B. ex vivo). Direkter in vivo Gentransfer in postnatale Tiere wurde für Formulierungen von DNA, die in Liposome verkapselt ist und DNA in Proteoliposomen, die virale, umhüllte Rezeptorproteine enthält, berichtet. Nicolau, et al., 80 Proc. Natl. Acad Sci USA 1068–1072 (1983); Kaneda, et al., 243 Science 375–378 (1989); Mannino, et al., 6 Biotechniques 682–690 (1988).. Positive Ergebnisse wurden auch von mit Kalziumphosphat mitgefällter DNA beschrieben. Benvenisty and Reshef, 83 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 9551–9555 (1986). Andere Systeme, die vorteilhaft verwendet werden, schließen intravenöse, intramuskuläre und subkutane Injektion, ebenso wie direkte intratumorale und intrakavitäre Injektion ein. Das Set von genetischen Elementen, das in den Vektor der Wahl eingefügt wird, wird auch vorteilhaft durch topische, transmukosale, rektale, orale Verabreichung oder Inhalation aufgenommen.
  • Der Vektor, der das Set an genetischen Elementen der vorliegenden Erfindung enthält, kann vorteilhaft verwendet werden, um Antisense-, Triplex- oder jede beliebige inhibitorische Nukleinsäure oder einzelsträngige Nukleotidsequenz von Interesse unter Verwendung von bekannten Verdau- und Ligationstechniken an die Kassette abzugeben, um so die Sequenz von Interesse in den Vektor zu spleißen (zwischen invertiertem Tandem-Repeat oder zwischen PBS und invertiertem Tandem-Repeat). Der Fachmann, der von dieser Offenbarung profitiert wird auch erkennen, das die oben beschriebenen Signale, die für die Expression in eukaryotischen Zellen verwendet werden, auf im Stand der Technik bekannte Weise modifiziert werden können, in Abhängigkeit von der jeweiligen Sequenz von Interesse. Eine mögliche Veränderung besteht zum Beispiel darin, den Promotor zu wechseln, um so der Kassette in dem System, in dem sie die Sequenz von Interesse exprimieren soll, vorteilhafte Expressionseigenschaften zu verleihen. Es gibt so viele mögliche Promotoren und andere Signale und sie sind so abhängig von der jeweiligen Zielzelle für welche die Sequenz von Interesse gewählt wurde, dass es unmöglich ist, alle potentiellen Enhancer, induzierbaren und konstitutiven Promotorsysteme und/oder Poly(A) „Tailing"-Systeme aufzulisten, die für eine bestimmte Zielzelle und Sequenz von Interesse bevorzugt sein könnten.
  • In einer anderen Ausführungsform, liegt die vorliegende Erfindung in Form eines Kits vor, das aus einem Plasmid mit den oben beschriebenen RNA-abhängigen Genen für DNA-Polymerase und Restriktions-Endonuklease, die darin kloniert sind, sowie einer multiplen Klonstelle (multiple cloning site, MCS) besteht, in die der Benutzer des Kits eine/mehrere bestimmte Sequenz(en) von Interesse inseriert. Die Klonstelle, in welche die Sequenz(en) von Interesse inseriert ist (sind), befindet sich zwischen den oben beschriebenen invertierten Tandem Repeats, z.B. stromaufwärts zu dem genetischen Element, das die Primerbindungsstelle kodiert. Das daraus entstehende Plasmid wird dann von der Zellkultur, in der es gehalten wird gereinigt, lyophilisiert oder anderweitig für Verpackung und Verschiffung aufbewahrt und an den Benutzer gesendet. Das Kit schließt vorzugsweise auch die Restriktions-Endonuklease für die Klonstelle, in welche die Sequenz von Interesse kloniert werden soll, die Ligasen und andere Enzyme gemeinsam mit geeigneten Puffern für die Bindung der Sequenz von Interesse in das Plasmid ein, ebenso wie eine Karte des Plasmids und/oder andere Anweisungen für den Benutzer ein.
  • In den hierin beschriebenen Ausführungsformen werden die Sequenzen von Interesse entweder durch Kotransfektion der Zellen mit zwei Plasmiden, genannt A und B, wobei jedes Plasmid so ausgeführt und konstruiert ist, dass es eines oder mehrere der oben aufgelisteten genetischen Elemente einschließt oder mit einem einzelnen "C" Plasmid an eine Wirtszelle abgegeben. Zusammenfassend kodiert in dem System mit zwei Plasmiden der B-Plasmid die Kassette einschließlich der Sequenz von Interesse, die in flankierende Sequenzen eingenistet ist die den invertierten Repeat beinhalten und einschließlich der primären Bindungsstelle, welche die post-transkriptionalen Prozessierungssignale abgibt, welche die Umwandlung der mRNA in einzelsträngige DNA bewirken. Das B-Plasmid beinhaltet ebenfalls die zweite Sequenz von Interesse wenn dieser zweite Aspekt der Erfindung verwendet wird (wie oben festgelegt: wenn das RE-Gen aus dem Konstrukt der vorliegenden Erfindung ausgespart wird; zum Beispiel ist es in dem einzelnen „C"-Plasmid, der hierin beschrieben wird, diese zweite Sequenz von Interesse, welche die besondere inhibitorische Nukleinsäure mit der gewünschten Aktivität kodiert). Aktivitäten, die für die Prozessierung des primären Genprodukts des B-Plasmids in einzelsträngige DNA mit der Entfernung von Vektorsequenzen und Prozessierungssignalen benötigt werden, vor allem die Reverse Transkriptase/RNase H und Restriktions-Endonuklease, werden von dem A-Plasmid exprimiert. Die einzelsträngige DNA-Sequenz, die durch Zusammenwirken der Transkriptionsprodukte dieser Komponenten in vivo freigesetzt wird, ist frei, um intrazelluläre Ziele wie mRNA-Arten und DNA-Promotoren in Antisense- und Triplexstrukturen zu binden.
  • Wie oben erwähnt, schließt der B-Plasmid wie hierin beschrieben Klonierungsstellen (NotI-Stellen wurden in einer Ausführungsform des hierin beschriebenen B-Plasmids verwendet) zwischen welchen jede beliebige DNA-Sequenz von Interesse platziert wird (wie oben in den hierin beschriebenen Beispielen angeführt, beinhalten die Sequenzen eine "Füll-" oder Testsequenz, telomerische Repeats, h-ras, c-raf Kinase, einen Bereich, der den angiogenen Wachstumsfaktor Pleiotrophin kodiert, und den Bereich, der tat von SIV kodiert). Die Klonierungsstellen werden von Signalen flankiert, welche die Prozessierung des primären mRNA-Transkripts, das von einem Promotor hergestellt wurde, (im Fall des hierin beschriebenen bevorzugten B-Plasmids wurde ein CMV-Promotor verwendet) in die gewünschte, einzelsträngige, inhibitorische Nukleinsäure steuern. Nach dem Klonieren der gewünschten Sequenz von Interesse in den B-Plasmid, werden die Plasmide A und B in eine Zelllinie nach Wahl für die konstitutive Expression von ssDNA kotransfiziert. Auf gleiche Weise wird die Sequenz von Interesse in dem hierin beschriebenen Einzelplasmidsystem („C") in diesen Plasmid kloniert und in die Zelllinie für die weitere Prozessierung transfiziert. Unabhängig von der Verteilung der Elemente des oben beschriebenen Sets von genetischen Elementen zwischen zwei (oder sogar mehreren) Plasmiden, oder im Falle, dass alle Elemente in einem einzigen Plasmid enthalten sind, verläuft diese Prozessierung in drei Schritten, die auf die Transkription des einzelsträngigen DNA-Bereichs (d.h. Sequenz von Interesse, invertierte Repeats und PBS) folgen:
    • (1) Reverse Transkription von dem RNA-Transkript der Plasmiden B oder C durch eine Reverse Transkriptase, die in der hierin beschriebenen bevorzugten Ausführungsform eine von den Plasmiden A oder C exprimierte Reverse Transkriptase ist (in der hierin beschriebenen bevorzugten Ausführungsform ist die Reverse Transkriptase Mouse Moloney Leukemia Virus (MoMuLV) Reverse Transkriptase), die von der Primerbindungsstelle in 3'-Position zu der Sequenz von Interesse (einschließlich der Sequenz mit enzymatischer Aktivität), den invertierten Repeats und der Primerbindungsstelle, wie in 1 gezeigt verläuft;
    • (2) RNase H Verdau der resultierenden Heteroduplex, entweder durch die RNase H-Aktivität des Polyproteins der Reversen Transkriptase oder durch endogene RNase H-Aktivität, um den einzelsträngige DNA-Vorläufer von seinem RNA-Gegenstück zu lösen; und
    • (3) Entfernung von flankierenden Sequenzen, entweder durch Verdau des Stamms eines nach Watson-Crick Basenpaarung der Basen gebildeten Stamm-Schleifen-Intermediats durch Restriktions-Endonuklease, umfassend den invertierten Repeat, oder durch vorzeitige Termination des cDNA-Transkripts durch Bildung der Stamm-Schleifen-Sekundärstruktur durch die selbstkomplementären invertierten Tandem Repeats. Dem Fachmann wird aus dieser Offenbarung ersichtlich sein, dass die jeweiligen Klonierungsstellen, welche die Sequenz von Interesse flankieren, die jeweilige Reverse Transkriptase, Restriktions-Endonuklease (wenn verwendet), Promotoren, Primerbindungsstellen und alle anderen Elemente des Sets von genetischen Elementen der vorliegenden Erfindung in Abhängigkeit von der bestimmten Sequenz von Interesse und/oder von dem System, in das die ssDNA exprimiert werden soll, gewählt werden.
  • Wenn nicht anders angegeben wurden die Standardtechniken, wie von Seabrook, et al. (1989) (J. Seabrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed.), Cold Spring Harbor Press (1989) auf die im Folgenden als "Maniatis, et al. 1989)") und Ausubel, et al. 1987)") Bezug genommen wird und Ausubel, et al. Current Protocols in Molecular Biology, New York: John Wiley & Sons (1987)), in den unten dargestellten Beispielen verwendet.
  • Das Plasmid pcDNA3.1/Zeo(+) wurde von Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA) und das Plasmid pBK-RSV von Statagene (La Jolla, CA) erworben. Oligodeoxynukleotide (ODN) wurden von Midland Certified Reagent Co. (Midland, TX) synthetisiert. Polymerase Kettenreaktionen (Polymerase Chain Reactions, PCR) wurden unter Verwendung von Taq DNA-Polymerase, erworben von Boehringer Mannheim Corp. (Indianapolis, IN) in einem "Robo-gradient thermal cycler" (Stratagene (La Jolla, CA) durchgeführt. Restriktions-Endonukleasen und T4 DNA-Ligase wurden von Boehringer Mannheim Corp. (Indianapolis, IN) erworben. Die verwendeten ODNs sind in dem angefügten Sequenzprotokoll aufgelistet.
  • Beispiel 1 in vitro Synthese von ss-DNA
  • Vier synthetische, einzelsträngige ODNs (mit einer Länge von 129, 121, 111 und 103 Basen, jeweilige Sequenz ID Nummern 4, 5, 15 und 16) wurden so ausgeführt (siehe Sequenzprotokoll in Tabelle 1), dass sie eine Struktur eines invertierten Tandem Repeats mit einem so genannten „Füll"-Bereich mit einer zufälligen Zusammensetzung von Nukleotiden enthalten, die als Sequenz von Interesse zwischen dem invertierten Tandem Repeat inseriert ist. Der invertierte Tandem Repeat wurde in solcher Weise ausgeführt (2), dass er ein Paar von Erkennungs-Schnittstellen für Restriktions-Endonuklease in den Repeats aufweist. Die ausgeführten Schnittstellen für NotI und FokI (jeweils Typ II und Typ IIS Erkennungs-Stellen für Restriktions-Endonuklease) waren die Oligonukleotide von einer Länge von 111 (Sequenz ID 15) und 102 (Sequenz ID 16) Basen und die ausgeführte Restriktions-Endonuklease Schnittstellen für NotI und MboII waren Oligonukleotide von einer Länge von 129 (Seq. ID 4) und 121 (Seq. ID 5) Basen. Darüber hinaus wurde eine tRNA Primerbindungssequenz (PBS) für die Erkennung durch Primer für Reverse Transkriptase in den Oligonukleotiden ausgeführt. Die PBS befand sich 3' stromabwärts zu dem invertierten Tandem Repeat.
  • Für jeden der synthetischen Oligonukleotide wurden 1 μl (5 μgl/μl in Wasser) Aliquoten zu vier separaten Röhrchen hinzugefügt und für einen Zeitraum von 5 Minuten auf 70° erhitzt und Selbstanlagerung fand über einen Zeitraum von 15 Minuten bei Raumtemperatur statt. Dieser Prozess ermöglicht die optimale Hybridisierung für die Bildung einer Stamm-Schleifen-Struktur; der Schleifenteil, der keine Abschnitte von komplementären Sequenzen aufweist, sollte keiner signifikanten Selbstanlagerung ausgesetzt sein und vorwiegend einzelsträngig bleiben. Verdau von Standard-Restriktions-Endonuklease wurde dann mit NotI, FokI, MboII (geeignet für jeden Oligonukleotid für den eine Schnittstelle für Restriktions-Endonuklease vorhanden war) und EcoRI (als Negativkontrolle) mit 10 Enzymeinheiten in einem Gesamtreaktionsvolumen von 15 μl und entsprechenden Reaktionspuffer durchgeführt. Die Verdaus wurden durch elektrophoretische Gelanalyse bestätigt.
  • Die Ergebnisse dieses Experiments zeigten, dass eine synthetische ss-cDNA mit invertierten Repeats doppelsträngige DNA bildete. Die doppelsträngige DNA, mutmaßlich der Stamm einer Stamm-Schleifen-Struktur, bildete spezifische und erkennbare Stellen für Restriktions-Endonuklease von den Sequenzen in den invertierten Tandem Repeats, die so ausgeführt wurden, dass sie NotI und FokI Stellen für Restriktions-Endonuklease durch Watson-Crick Basenpaarung der Basen, welche die invertierten Tandem Repeats ausmachen, bilden. Wenn die ss-cDNA mit NotI und FokI inkubiert wurde, wurde die DNA verdaut. Wenn mit EcoRI (Negativkontrolle) inkubiert wurde, wurde dieselbe DNA nicht verdaut.
  • Beispiel 2 In vitro Bildung von ss-DNA von Kassetten-Transkripten
  • Zwei Testplasmide wurden konstruiert, um dieses Experiment durchzuführen. pcDNA3.1/Zeo(+) wurde unter Standardbedingungen mit NheI und ApaI verdaut. Zwei Sets (A und B) von 5' phosphorylierten Oligonukleotiden, die so ausgeführt wurden, dass sie zu einander komplementär sind (siehe angefügte Sequenzprotokolle), durften hybridisieren. Die Hybridisierung wurde durch Erwärmen der komplementären Oligonukleotide bei 95°C durchgeführt, und dann 15 Minuten auf Raumtemperatur abgekühlt. Die entstehenden Duplex Oligonukleotid-Linker mit geeigneten kohäsiven Enden wurden unter Standardbedingungen an den vorher präparierten pcDNA3.1/Zeo(+) Vektor gebunden.
  • Die Auswahl von positiven Klonen auf Ampicillin-Platten wurde nach der Transformation in kompetente XL1-Blue MRF'-Zellen (Stratagene) durchgeführt, wie von Maniatis, et.al (1998) und den begleitenden Anweisungen beschrieben. Nachdem positive Klone gewählt wurden, wurde Plasmid-DNA unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Plasmid-Isolations-Kit (Quiagen, Inc., Sant Caita, CA) isoliert. Die Bestätigung der DNA-Ligation erfolgte durch DNA-Sequenzierung.
  • Positive kreisförmige Testplasmide wurden durch Verdau mit PmeI linearisiert und Standard-Reverse-Transkriptions-Reaktionen wurden wie folgt ausgeführt: Jedem Röhrchen wurden 0,1 μg linearisierter Plasmid-DNA, 25 Einheiten von T7 Polymerase (d.h. eine DNA-abhängige RNA-Polymerase), 2,5 mM rNTPs (Ribonukleotidtriphosphate rUTP, rCTP, rGTP, rATP) und geeignete Puffer hinzugefügt. Das Reaktionsröhrchen wurde bei 37°C über einen Zeitraum von 90 Minuten inkubiert. Nach der Inkubation wurden 10 Einheiten DNase hinzugefügt und 15 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Inkubation (bei 70°C für 10 Minuten) abgebrochen.
  • Standardreaktionen der cDNA-Synthese wurden unter Verwendung der oben genannten Reaktionen ausgeführt. In ein frisches Röhrchen wurden 5 μl der obigen Reverse Transkriptase-Reaktion, 0,2 μg Primer (siehe Sequenzprotokoll) komplementär zu dem PBS-Bereich (stromabwärts zu den invertierten Tandem Repeats) hinzugefügt. Zu dieser Mischung wurden 25 Einheiten Reverser Transkriptase von dem Moloney murine Leukemia Virus, 2,5 mM dNTPs (Deoxyribonukleotid-Triphosphate dTTP, dCTP, dGTP, dATP) und der geeignete Reaktionspuffer hinzugefügt. Die Reaktionsmischungen wurden bei 37°C über einen Zeitraum von 1,5 h inkubiert. Nach dem Inkubationszeitraum wurden 100 Einheiten RNase H hinzugefügt und die Röhrchen wurden bei 37° C 15 Minuten lang inkubiert. Die Reaktionsröhrchen wurden bei 70° C inkubiert und anschließend 15 Minuten lang auf Raumtemperatur abgekühlt und dabei fanden Anlagerungen statt. Die Mischung wurde gleichmäßig in vier Röhrchen aufgeteilt, in die entweder 10 Einheiten der Restriktionsenzyme NotI, FokI, MboII oder EcoRI hinzugefügt wurden, zusammen mit dem geeigneten Reaktionspuffer. Die Rohre wurden bei 37°C über einen Zeitraum von 1 Stunde inkubiert. Replikationsreaktionen wurden mit S1 Nuklease behandelt (spezifisch für ssDNA). Die DNA aus den obigen Reaktionen wurde durch Gelelektrophorese gelöst.
  • Dieses Experiment zeigte die in vitro Produktion von ssDNA durch die sequentiellen enzymatischen Aktivitäten von T7 RNA-Polymerase, Reverser Transkriptase und RNase H. Der Linker enthielt invertierte Tandem Repeats mit den Restriktionsstellen NotI, FokI und MboII, einen „Füll"-Bereich (der die Schleife des Stamm-Schleifen-Intermediats umfasst) und eine tRNA-PBS. Das Plasmid enthielt den T7 Promotor direkt stromaufwärts zu dem Linker-Region. Die Analyse mittels Agarose-Gelelektrophorese zeigte die schrittweise Herstellung von (1) einem mRNA-Intermediat von vorhergesagter Länge, (2) eine cDNA von vorhergesagter Länge und (3) den darauf folgenden Verdau der ssDNA durch die entsprechenden Restriktions-Endonukleasen NotI, FokI und MboII. Eine Negativkontrolle, bei der EcoRI verwendet wurde, verdaute die ss-cDNA nicht.
  • BEISPIEL 3. In vivo Synthese von ss-cDNA in eukaryotischen Zellen
  • Die folgenden in vivo Experimente wurden ausgeführt, um die in Beispiel 2 hergestellten Plasmide, die verschiedene „Füll"-Bereiche enthielten, die zwischen die invertierten Tandem Repeats inseriert wurden, zu untersuchen. Die Gewebskulturzellen, die in diesen Experimenten verwendet wurden, kodierten und exprimierten endogen eukaryotische DNA-abhängige RNA-Polymerase II, die den RSV-Promotor verwendet, der sich stromaufwärts zu dem klonierten genetischen Element, welches das oben in Beispiel 1 beschriebene Linker-/Füll-Segment ausmacht. Der Fachmann, der von dieser Offenbarung profitiert, wird erkennen, dass jeder beliebige eukaryotische Promotor für diesen Zweck verwendet werden kann. Der Fachmann wird des Weiteren erkennen, dass eine Vektor-kodierte DNA-abhängige RNA-Polymerase auch in dieser Eigenschaft wirken wird.
  • Plasmid-Konstrukte
  • Die ODNs konnten in 1 μl (5 μg/μl in Wasser) in vier separaten Röhrchen hybridisieren, die bei 70°C 5 Minuten lang inkubiert wurden und konnten 15 Min. bei Raumtemperatur hybridisieren. Standard-Verdaus der Restriktions-Endonuklease wurden (EcoRI wurde als Negativkontrolle verwendet) mit 10 Enzymeinheiten in einem Gesamtreaktionsvolumen von 15 μl und geeigneten Reaktionspuffern ausgeführt. DNA-Fragmente wurden in Agarosegelen gelöst und von diesen isoliert. Die Auswahl von positiven Klonen auf Ampicillin-Platten wurde nach der Transformation in kompetente XL1-Blue MRF-Zellen (Stratagene) durchgeführt, wie von Maniatis, et.al (1989). Nachdem positive Klone gewählt wurden, wurde Plasmid-DNA unter Verwendung des oben beschriebenen Quiagen Plasmid-Isolations-Kits isoliert.
  • Die Konstruktion von drei Expressions-Plasmiden wird beschrieben. Der erste „B"-Plasmid wurde von pcDNA3.1/Zeo(+) (7A) durch Verdau mit Restriktions-Endonuklease NheI und ApaI, die sich in der multiplen Klonierungsstelle (multiple cloning site, MCS) befinden, gewonnen. Der doppelsträngige Oligodesoxynukleotid mit kompatiblen NheI- und ApaI-Enden, der durch Annealing der synthetischen, einzelsträngigen Oligodesoxynukleotide Seq. ID 4/ODN-PMMV(+) und Seq. ID 5/ODN-PMMV(–) gebildet wird, wurde in die verdauten pcDNA3.1/Zeo(+) gebunden um pPMMV zu ergeben. Dieses Insert enthält den Promotor-Region/die Primerbindungsstelle (PBS-Sequenz) der Reversen Transkriptase des Moloney Mouse Leukemia Virus (MoMuLV-RT). Es enthält ebenfalls zwei Stellen für NotI, die auf pMMV beschränkt sind und eine Stelle für MboII. In diesem Plasmid und den von diesem Konstrukt stammenden Plasmiden sind die mit (+) bezeichneten Stränge so positioniert, dass sie von dem Cytomegalovirus-Promotor von pcDNA3.1/Zeo(+) in RNA transkribiert werden. Die Stellen, die den B-Plasmid, pssDNA-Express-B, für die vorteilhafte Inserierung einer Sequenz von Interesse, die in vivo als ssDNA exprimiert werden soll, enthalten, wurden durch Binden der doppelsträngigen Sequenz, die durch Annealing von ODN-XB(+) und ODN-XB(–) gebildet wurde und die Not 1-kompatible Überstände zwischen den Stellen für Not 1 von pMMV hat, erhalten.
  • Die Struktur von pssDNA-Express-B wird in 5 gezeigt. Säugetierzellen, die den Plasmid enthalten, können mit dem Antibiotikum Zeocin ausgewählt werden. Die Lage und allgemeine Anordnung von Schlüsselregionen des Inserts werden in 5A gezeigt und die spezifische Anordnung der Sequenzen des Inserts wird in 5B gezeigt. Die exakten Positionen der strukturellen Merkmale werden in 5C gezeigt. Die Transkription des Insert-Bereichs wird von dem Cytomegalovirus-Promotor initiiert und in der BGH-PolyA-Region abgebrochen. Das RNA-Transkript enthält den MoMuLV Core-Promotor zusammen mit einigen flankierenden Regionen dieses Promotors, deren Positionen in 5B angezeigt sind. Die Reverse Transkriptase synthetisiert eine Kopie von dem (+) (top) Strang unter Verwendung der tRNA pro als Primer, beginnend an der Position des Core Promoters. Der Verdau des RNA-Strangs durch RNase H, setzt eine einzelsträngige DNA-Sequenz frei, welche die komplementären invertierten Repeats IR-L und IR-R (1) enthält. Die Duplexbildung durch diese Repeats, die in 2 gezeigt wird, führt zur Entstehung einer Stamm-Schleife mit der Sequenz von Interesse in der Schleife. Der Stamm enthält eine Erkennungsstelle für MboII, GAAGA, die so positioniert ist, dass das Enzym, das die 817 Basen 3' zu der GAAGA Erkennungsstelle spaltet die Sequenz von Interesse von den flankierenden Vektorsequenzen löst.
  • Um den B-Plasmid pTest, von dem eine Sequenz von Interesse, die als Kontrollsequenz diente, exprimiert wird, zu erhalten, wurde der doppelsträngige Oligodesoxynukleotid der gebildet wurde durch Annealing (Hybridisieren/Anlagerung) der synthetischen, einzelsträngigen Oligodesoxynukleotide Seq. ID 11/ODN-Test(+) und Seq. ID 12/ODN-Test(–), die kompatible NotI Enden haben, zwischen die Not I Stellen von pMMV inseriert. Der B-Plasmid, der die telomere Repeatsequenz pTelo als die Sequenz von Interesse exprimiert, wurde in ähnlicher Weise erhalten, nämlich durch inserieren der angelagerten, NotI-kompatiblen Oligodesoxynukleotide Seq. ID 13/ODN-Telo(+) und Seq. ID 14/ODN-Telo(–) zwischen den Stellen für NotI von pMMV (6A) Die letztere Linker-Sequenz enthält Neun Repeats der Wirbeltier-Telomersequenz 5'-AGGGTT-3' (6B). Blackburn, E.H., 350 Nature 569–573 (1991). Ein dritter B-Plasmid, genannt pMN-new-link, in dem der Stamm aus 29 Basenpaaren (an Stelle der Stammstelle von 27 Basenpaaren von pMNV) bestand, wurde konstruiert auf Grund der Tatsache, dass ein Stamm aus 29 Basenpaaren eine stabilere Stamm-Schleifen-Struktur in dem Stamm-Schleifen-Intermediat ergibt, als die Stammstelle aus 27 Basenpaaren von pMNV. Der pNM-new-link wurde durch Bindung von zwei selbstkomplementären ODNs, ODN-NM-new-link(+) und ODN-NM-new-link(–) zwischen den beiden Stellen für NotI in pMNV gebildet.
  • Der A-Plasmid, pss-DNA-Express-A (4), wurde aus pBK-RSV (Stratagene) unter Verwendung von XL-1 Blue MRF' als Wirtszelle hergestellt. Eine Mauszelllinie, die den Moloney Murine Leukemia Virus exprimiert, wurde von der American Type Culture Collection (#CRL-1858) erhalten. Die RNA des Virus wurde isoliert und für Reverse Transkriptase PCR (RT-PCR) präpariert. Ein 2,4 kb Fragment, das die kodierende Sequenz von MoMuLV-RT enthielt, wurde unter Verwendung von Primern, wie in Seq. ID 1/ODN-RT(–) (Primerposition bei Nucleotid #2545) und Sequenz ID 2/ODN-RT(+) (Primerposition bei Nucleotid #4908) dargestellt, PCR-amplifiziert, um ein DNA-Fragment mit einem 5'-SacI- und einem 3'-HindIII-kompatiblen Ende herzustellen. Das erhaltene 2,4 kb Produkt schließt die Sequenz des MoMuLV-Genom zwischen Positionen 2546 und 4908 ein. Das reife Reverse Transkriptase Peptid des Virus wird von der Sequenz zwischen den Positionen 2337 und 4349 kodiert (Petropoulos, C.J., Retroviral taxonomy, protein structure, sequences and genetic maps, in J.M Coffin (Ed.), Retroviruses, 757, Appendix 2, New York: Cold Spring Harbor Press (1997)), aber Peptide, die am Amino-Ende verkürzt wurden, behalten ihre volle Aktivität bei (N. Tanese, et al., 85 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1777–1781 (1998)). Das von diesem Konstrukt kodierte Peptid schließt einen Teil des Integrase-Gens ein, das auf die Reverse Transkriptase in dem MoMuLV-Polyprotein folgt, hier jedoch nicht relevant ist, so dass die Länge des Konstrukts auf Grund der Verfügbarkeit einer vorteilhaften Restriktionsstelle für die Klonierung gewählt wurde.
  • Das Bakterium Moraxella bovis, das die Restriktions-Endonuklease MboII (Bocklage, H., et al., 19 Nucleic Acids Res. 1007–1013 (1991)) kodiert, wurde von der American Type Culture Collection (ATCC#10900) erhalten. Genomische DNA wurde von M.bovis isoliert und als DNA-Vorlage in der PCR verwendet. Ein 1,2 kb Fragment, welches das MboII Gen enthielt wurde durch PCR unter Verwendung von Seq. ID 3/ODN-Mbo(+) (Primerposition bei Nukleotid #887) und Seq. ID 8/ODN-Mbo(–) (Primerposition bei Nukleotid #2206) als Primer amplifiziert. Diese Primer enthalten Fehlpaarungen, um eine HindIII Stelle in den 5'-Primer und eine XbaI Stelle in den Primer 3' stromabwärts einzuführen. Das 1,2 kb DNA-Amplifizierungsprodukt, welches das Genom von M. bovis zwischen Position 888 und 2206 kopiert, enthält deshalb den Kodierbereich für das MboII Protein. Das Produkt aus der Amplifizierung wurde mit HindIII und XbaI verdaut.
  • pBK-RSV wurde mit XbaI und NheI verdaut, um die Promotorregion zu entfernen. Unter Verwendung des durch die angelagerten Oligodesoxynukleotide Seq. ID 6/ODN-N > S(+) and Seq. ID 7/ODN-N > S(–) gebildeten Linker wurde das NheI-Ende zu einem SacI-Ende konvertiert. Die Reverse Transkriptase- und MboII-Amplimere wurden durch die HindIII Stellen gebunden und dieses Konstrukt wurde darauf hin zwischen den SacI- und XbaI-Stellen von pBK-RSV gebunden, um pBK-RSV-RT/Mbo herzustellen.
  • Um einen flexiblen Linker zwischen den Reverse Transkriptase- und MboII-Bereichen des Polyproteins zu inserieren und um einen für die Reinigung des Proteins nützlichen Marker vorzusehen, wurde die doppelsträngige Sequenz, die durch Annealing der Oligodesoxynukleotide Seq. ID 9/ODN-HisPro(+) und Seq. ID 10/ODN-HisPro(–), die alternierend Histidin- und Prolin-Aminosäuren kodieren, gebildet wurde, durch Verdau mit HindIII in pBK-RSV-RT/Mbo inseriert. Der his-pro-Linker, mit kompatiblen HindIII-Enden wurde an der HindIII-Stelle inseriert, um Plasmid pBK-RSV-RT/Mbo-L herzustellen und die Orientierung wurde durch Sequenzierung bestätigt. Allerdings zeigte pBK-RSV-RT/Mbo-L eine frame-shift Mutation am 5'-Ende des MboII-Bereichs. Diese Mutation wurde korrigiert und der nicht relevante Teil des Integrase-Gens von MoMuLV wurde gleichzeitig entfernt, und zwar durch Exzidieren des Fragments des Plasmids, der zwischen den Stellen für AseI und BglII liegt und der das 5'-Ende des MboII-Gens, die his-pro-Linker-Region und das Integrase-Genfragments kodiert und durch Ersetzen derselben mit einem Insert, das einen modifizierten his-pro-Linker und ein Fragment des 5'-MboII-Gens enthält. Der modifizierte his-pro-Linker erhöhte die Anzahl von Histidinen um eins auf sechs und schloss am 5'-Ende eine Anzahl an einmaligen Restriktionsstellen ein. Das 5'-Ende des MboII-Gens wurde modifiziert, um das Leucin am N-Terminus zu ersetzen, das durch die Fehlpaarung in dem PCR-Primer zu dem ursprünglichen Methionin eingeführt wurde und um die Verwendung des Kodons für die Expression dieses Segments des Gens in Säugetierzellen zu optimieren. Das Repair-Konstrukt wurde durch „mutually primed" DNA Synthese von zwei Vorlagen, ODN-Rep(+) und ODN-Rep(–), die komplementäre Sequenzen von 16 Basen an den 3'-Enden aufweisen. Diese Oligodesoxynukleotide wurden Annealing und Extension mit dem modifizierten SEQUENASETMDNApolymerase-Enzym ((United States Biochemical Corp.) unterzogen. Das doppelsträngige Produkt wurde mit AseI und BglII verdaut und in den Plasmid inseriert, um pssDNA-Express-A (Plasmid A) zu ergeben.
  • Die Struktur von pssDNA-Express-A wird in 8A gezeigt. Wie oben dargestellt wurden für die Konstruktion dieses Plasmids Sequenzen, die eine aktives Fragment der Reversen Transkriptase von MoMuLV kodieren und das Restriktionsenzym von M. bovis MboII zwischen die NheI- und XmaI-Stellen des eukaryotischen Expressionsvektor pBK-RSV kloniert. Die Transkription des klonierten Bereichs wird von dem RSV-Promotor initiiert und die Selektion der transformierten Zellen erfolgt in Anwesenheit des Antibiotikums G418 (Neomycin). Die Reverse Transkriptase und MboII werden als einzelsträngige, bifunktionale Proteinkette mit zwei funktionalen Bereichen, die durch einen kurzen, histidin- und prolinreichen Linker getrennt sind, exprimiert.
  • Studien an Gewebekulturen
  • Stabile und transiente Transfektionen wurden unter Verwendung von Lipofectant (Boehringer Mannheim Corp.) unter Beachtung der begleitenden Anweisungen des Herstellers ausgeführt. Alle Plasmid-Konstrukte wurden in HeLa-Zelllinien transfiziert. ssDNA-Assays wurden durch PCR und durch Dot-Blot-Anaylsen 24–48 Stunden nach der Transfektion durchgeführt.
  • Die Aktivität der Reversen Transkriptase wurde untersucht indem der von Silver, J., et al. (21 Nucleic Acids Res. 3593–3594 (1993)) entwickelte RT-PCR-Assay nach Transfektion mit pssDNA-Express-A-Plasmid druckgeführt wurde (11, Feld A). Individuelle Kolonie-Isolate von stabil substituierten HeLa-Zelllinien (A12 und B12) wurden ebenfalls auf RT-Aktivität untersucht (11B). Die ss-cDNA wurde aus Zellen isoliert, die 48–72 Stunden zuvor transfiziert worden waren. Wie oben beschrieben, wurde die ss-cDNA, die mit RNA kolokalisiert, unter Verwendung von Trizal-Reagenz (Gibco Life Technologies, Gaithersburg, MD) durchgeführt. Assays für spezifische ss-cDNA-Arten wurden sowohl mit auf PCR basierenden Assays für interne Fragmente durchgeführt (12 für pTest und 13 für pTelo) als auch mit Hilfe von denaturierter einzelsträngiger Gelelektrophorese mit anschließendem Nylon-blotting und Untersuchung mit einer internen Biotin-markierten Probe.
  • Dieses Experiment zeigte, dass humane Gewebekulturzellen (HeLa- und Cos-7-Zelllinien), die mit A- und B-Plasmiden kotransfiziert wurden, ss-cDNA der vorhergesagten Größe herstellten. Der Fachmann wird allerdings erkennen, dass ein einzelnes Plasmid, das die RNA-Vorlage für das Stamm-Schleifen-Intermediat und die Gene für die Reverse Transkriptase und Restriktions-Endonuklease enthält, auch für diesen Zweck, wie auch in anderen hier dargelegten Beispielen beschrieben, verwendet werden kann.
  • Der Vektor pNM-New-Link (der nach der einzelsträngigen Konversion die stabilere Stammstruktur mit 29 Basenpaaren enthält) wurde für in vitro Experimente verwendet, um die vorzeitige Termination des cDNA-Transkripts der Reversen Transkriptase am 3' Aspekt der Stammstruktur zu zeigen. Wie in 14 gezeigt, gab es auch einige „read throughs" dieses Transkripts, auch durch die Stammstruktur (siehe die größeren Banden in 14). Die Sequenz von Interesse, die aus dieser vorzeitigen Termination hergestellt wurde, ist die zweite Sequenz von Interesse, auf die hier Bezug genommen wird.
  • BEISPIEL 4. In vivo Synthese von ss-cDNA einschließlich DNA-Enzym in eukaryotischen Zellen.
  • Die folgenden in vivo Experimente wurden ausgeführt, um zu überprüfen, ob das Vektorsystem der vorliegenden Erfindung für die Herstellung von ssDNA einschließlich einer DNA-Enzymsequenz in eukaryotischen Gewebekulturzellen verwendet werden kann.
  • Plasmidkonstrukte
  • ODNs wurden auf dieselbe Weise wir hier in Beispiel 3 beschrieben hergestellt und Plasmide auf dieselbe Weise wie oben in Beispiel 3 beschrieben konstruiert.
  • Konstruktion von B-Plasmid
  • Eine zweite Ausführungsform des ersten der beiden Plasmide, der eine Ausführungsform des Vektorsystems der vorliegenden Erfindung mit zwei Plasmiden ausmacht, ist der „4B"-Plasmid. Der 4B-Plasmid, wie der Plasmid pssDNAExpress-B, der in Beispiel 3 beschrieben wurde, stammte von pcDNA3.1/Zeo(+) (Invitrogen Corp.), dargestellt in 7A. pssDNAExpress-4B wurde durch Verdau mit Restriktions-Endonuklease HindIII und NotI, in Position 911 beziehungsweise in Position 978, konstruiert. Die doppelsträngige Linker-Region mit kompatiblen HindIII- und NotI-Enden, der durch Annealing des synthetischen, einzelsträngigen Oligodesoxynukleotid ODN-5'-N/M(link)2-H/N und ODN-3'-N/M(link)2-H/N gebildet wird, wurde unter Standardbedingungen in den verdauten pcDNA3.1/Zeo(+) gebunden und in Sure II-Zellen (Stratagene, Inc.) transformiert. Die ODNs konnten in 1 μl (5 μg/μl in Wasser) in Eppendorf Röhrchen hybridisieren, die bei 70°C 5 Minuten lang inkubiert wurden und konnten dann über einen Zeitraum von 15 Min. bei Raumtemperatur hybridisieren. Geeignete Klone wurden ausgewählt und sequenziert, um die Inserierung der Linker-Region zu gewährleisten. Das entstandene Plasmid wurde als pcDNA3.1/Zeo(+)/NM-link2-gag und in pssDNA-Express-4B umbenannt. pssDNA-Express-4B wird in 7B gezeigt und ist das Plasmid, in das die Sequenz von Interesse kloniert wird. Für Klonierung von Sequenzen von Interesse zwischen die invertierten Tandem Repeats wurden die zwei Stellen für NotI an Position 935 beziehungsweise Position 978 (siehe 7B) verwendet. Diese beiden Stellen sind in den invertierten Tandem Repeats enthalten. Für die Inserierung von Sequenzen von Interesse zwischen die invertierten Tandem Repeats wurden zwei vorteilhafte Stellen für Restriktions-Endonuklease, PacI und BamHI, an Position 1004 beziehungsweise Position 1021, verwendet.
  • Konstruktion von A-Plasmid
  • Der zweite Plasmid des Systems mit zwei Plasmiden, welches diese zweite Ausführungsform des Vektors der vorliegenden Erfindung ausmacht, ist der A-Plasmid, pssDNA-Express-A, wie in 8A gezeigt und wie in Beispiel 3 beschreiben.
  • Konstruktion von C-Plasmid
  • Wie oben erwähnt, kann das Vektorsystem der vorliegenden Erfindung auch in Form eines einzelnen Plasmids vorliegen. Um ein Vektorsystem mit einem einzelnen Plasmid, oder „C"-Plasmid herzustellen, wurde der Plasmid pssDNA-Express-A mit SacI XmaI verdaut, um das MboII-Gen zu entfernen (8B). Eine Linker-Region bestehend aus den Oligonukleotiden 5'-(link)2-Hind/Xba und 3'-(link)2-Hind/Xba (Tabelle 1), deren Annealing bei 70°C über einen Zeitraum von 15 Minuten stattfand und die dann langsam auf Raumtemperatur abgekühlt wurden, wurde nach Verdau unter Standardbedingungen in den Plasmid gebunden. Positive Klone wurden geerntet und sequenziert, um die Linker-Platzierung zu überprüfen und anschließend wurde dieses Plasmid mit Xba und HindIII verdaut. Das Plasmid pssDNAExpress-B wurde dann mit HindIII und Xba verdaut und das entsprechende DNA-Fragment mit 300 Basenpaaren, das die vorher beschriebenen invertierten Tandem Repeats, multiple Klonierungsstellen und PBS enthält, wurde in das verdaute Plasmid kloniert, um pssDNA-Express-C (9A) zu ergeben. Standard Ligationsreaktionen wurden ausgeführt und in SureII-Zellen (Stratagene, Inc.) transformiert. Transformierte positive Kolonien wurden geerntet und positive Klone wurden durch Restriktionsanalyse identifiziert.
  • Die Sequenzen von Interesse wurden in die multiplen Klonierungsstellen von pssDNAExpress-C unter Verwendung der Stellen BamHI und PacI in der multiplen Klonierungsstelle kloniert (9B). Vier verschiedene Sequenzen von Interesse, wie in Tabelle 1 aufgelistet, von denen jede einzelne das „10-23 DNA-Enzym" enthält und zwischen dem 5'- und 3' Aspekt der Antisense-Sequenz inseriert ist (9C) und die in den 10A–10D gezeigt werden, wurden für diese Konstrukte synthetisiert und ähnliche Prozeduren wurden dafür verwendet, jede einzelne der vier Sequenzen von Interesse zu inserieren. Jedes Konstrukt wurde hergestellt durch mögliches Annealing der gepaarten Oligonukleotide bei 70° für einen Zeitraum von 15 Minuten und anschließendem Abkühlen auf Raumtemperatur, gefolgt durch Ligation in den Plasmid unter Standardbedingungen. Nach der Transformation in Sure II Zellen wurden geeignete Kolonien ausgewählt, mit Überprüfung auf die einzelnen Inserts durch Sequenzierung. Die Antisense-Fähigkeit jedes einzelnen dieser Plasmide wurde dadurch getestet, dass jedes Plasmid mit geeigneten Kontrollen, die eine Zufallssequenz von gleicher Länge und weder Antisense-Inserts noch das "10-23 DNA-Enzym" enthielten, in HeLa-Zellen transfiziert wurde, und zwar unter Verwendung von Lipofectant-Reagenz (Boehringer Mannheim) unter Standardbedingungen. Trizol-Reagenz wurde verwendet, um die Zellen und die RNA-Fraktion zu ernten und anschließend wurde eine Northern Blot Analyse durchgeführt, um die spezifische Antisense-Expression zu zeigen.
  • Gewebekulturstudien
  • Stabile und transiente Transfektionen wurden unter Verwendung von Lipofectant (Boehringer Mannheim Corp.) unter Beachtung der begleitenden Anweisungen des Herstellers ausgeführt. Alle Plasmid-Konstrukte wurden in HeLa-Zelllinien transfiziert. ssDNA-Assays wurden durch PCR und durch Dot-Blot Anaylsen 24–48 Stunden nach der Transfektion durchgeführt. Die Aktivität der Reversen Transkriptase wurde untersucht, indem der von Silver, J., et al., supra, entwickelte RT-PCR-Assay nach Transfektion mit pssDNA-Express-A-Plasmid durchgeführt wurde. Individuelle Kolanie-Isolate von stabil substituierten HeLa-Zelllinien (A12 und B12) wurden ebenfalls auf RT-Aktivität untersucht. Die ss-cDNA wurde aus Zellen isoliert, die 48–72 Stunden zuvor unter Verwendung von Trizol-Reagenz transfiziert worden waren. Assays für spezifische ss-cDNA-Arten wurden sowohl mit auf PCR basierenden Assays für interne Fragmente durchgeführt als auch mit Hilfe von denaturierter einzelsträngiger Gelelektrophorese mit anschließendem Nylon-blotting und Untersuchung mit einer internen Biotin-markierten Probe.
  • Dieses Experiment zeigte, dass humane Gewebekulturzellen (HeLa-Zelllinien), die mit Plasmiden transfiziert wurden, die eine prozessierte ss-cDNA synthetisieren sollen, ss-cDNA der vorhergesagten Größe prozessierten. Wie in Beispiel 3 beschrieben, wird die in Übereinstimmung mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellte ssDNA-Sequenz von Interesse entweder von der Position zwischen den invertierten Repeats nach Verdau des Stamms des Stamm-Schleifen-Intermediats oder von der Position zwischen den invertierten Repeats und der Primerbindungsstelle durch vorzeitige Termination des cDNA-Transkripts der Reversen Transkriptase am 3' Aspekt der Stammstruktur hergestellt. Die Sequenz von Interesse, die von dieser vorzeitigen Termination hergestellt wurde, ist die zweite Sequenz von Interesse, auf die hier Bezug genommen wird. 15 zeigt, dass die mit dem Plasmid pssDNAExpress-4B transfizierten Zellen, die das 10-23 Enzym, das in der Antisense-Sequenz gegen c-raf Kinase enthalten ist, die als die Sequenz von Interesse verwendet wurde, enthalten, eine Antisense-Sequenz gegen c-raf Kinase herstellten, die das 10-23 DNA-Enzym von der Position zwischen den invertierten Tandem Repeats und der Primerbindungsstelle einschloss.
  • Die oben beschriebenen Experimente zeigen ein Verfahren für die in vitro und in vivo Herstellung von ssDNA durch multiple, schrittweise Reaktionen unter Verwendung eukaryotischer Reverse Transkriptase-Reaktionen und zahlreicher cDNA-Priming-Reaktionen. Auf diese Reaktion folgte die Bildung eines „Stamm-Schleifen"-Intermediats, das dafür verwendet werden kann, jede beliebige unerwünschte Sequenz, entweder stromaufwärts 5' oder stromabwärts 3' von einem ausgeführten (und gebildeten) „Stamm" zu eliminieren, nachdem sie anschließend von einer Restriktions-Endonuklease gespalten wurde.
  • Jede beliebige Sequenz von Interesse könnte durch dieses Verfahren in einer eukaryotischen Zelle hergestellt werden. Diese Sequenz von Interesse wird zwischen die ausgeführten invertierten Tandem Repeats kloniert (oder synthetisiert) und steht für die Sequenz in der „Schleife" nach der Herstellung von ssDNA und folgender Bildung der Stamm-Schleifen-Struktur. Die Sequenz von Interesse, die hergestellt werden soll, kann jede beliebige Zusammensetzung von Basen (d.h. A, T, G, C) aufweisen, vorausgesetzt, dass die Sequenz nicht mit der Bildung des Stamms des stabilen Stamm-Schleifen-Intermediats interferiert, die optional funktionale genetische Elemente, wie eine spezifische Enzym-Erkennungssequenz, zum Beispiel eine Stelle, die als Substrat für eine bestimmte Restriktions-Endonuklease dient, einschließen kann. Eine Restriktions-Endonuklease kann auch verwendet werden, um den Stammteil des Stamm-Schleifen-Intermediats zu verdauen (oder zu spalten), vorausgesetzt, dass die Erkennungsstelle für diese bestimmte Restriktions-Endonuklease in die invertierten Tandem Repeats ausgeführt wurde.
  • Obwohl mit Bezug auf die Figuren und spezifischen hier dargelegten Beispiele beschrieben, wird der Fachmann erkennen, dass bestimmte Änderungen an den spezifischen hier dargelegten Elementen vorgenommen werden können, ohne die Art und Weise, auf die diese Elemente wirken, um ihre jeweiligen beabsichtigten Ergebnisse zu erzielen, zu verändern. Zum Beispiel besteht die hierin beschriebene Kassette aus drei genetischen Elementen: einer Sequenz von Interesse, einem invertierten Tandem Repeat und einer Primerbindungsstelle. Andere genetische Elemente schließen ein optionales Gen für Restriktions-Endonuklease und ein Gen für Reverse Transkriptase ein, wobei jedes einzelne dieser Gene mit geeigneten Promotoren, wie hierin beschrieben, versehen ist. Der Fachmann wird erkennen, dass zum Beispiel das beschriebene Reverse Transkriptase-Gen des Moloney Murine Leukemia Virus für die Verwendung als das Reverse Transkriptase-Gen der Kassette durch andere Reverse Transkriptase-Gene ersetzt werden kann (das Reverse Transkriptase-Gen des humanen Immundefizienz Virus, war, wie oben angeführt, eines dieser Gene) und dass andere Promotoren als der CMV-Promotor vorteilhaft verwendet werden können. Darüber hinaus sind oben mehrer Reverse Transkriptase-Gene angeführt, aber der Fachmann wird von dieser Beschreibung erkennen, dass die oben dargestellte Liste nicht vollständig ist und dass viele andere Restriktions-Endonuklease-Gene vorteilhaft in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung wirken können. In gleicher Weise ist der beschriebene RSV-Promotor, der in Zusammenhang mit dem hier dargestellten Restriktions-Endonuklease-Genen beschrieben wird, nicht der Einzige Promotor, der vorteilhaft verwendet werden kann. All diese Veränderungen und Modifikationen, die nicht vom Wesen der vorliegenden Erfindung abweichen, fallen in den Schutzumfang der folgenden nicht beschränkenden Ansprüche. Tabelle 1 Oligodesoxynukeotide (ODNs)
    Figure 00550001
    Figure 00560001
    • 1. Name: 3'-RT/Mol-HindIII (24-mer) Sequenz: 5'-CTT GTG CAC AAG CTT TGC AGG TCT-3'
    • 2. Name: 5'-RT/Mol-SacI (32-mer) Sequenz: 5'-GGG ATC AGG AGC TCA GAT CAT GGG ACC AAT GG-3'
    • 3. Name: 5'-MboII-HindIII (30-mer) Sequenz: 5'-CAA TTA AGG AAA GCT TTG AAA AAT TAT GTC-3'
    • 4. Name:5'-RT-Not-Mbo-Link (129-mer)
      Figure 00570001
    • 5. Name: 3'-RT-Not-Mbo-Link (121-mer)
      Figure 00570002
    • 6. Name: 5'-Nhe-Sac-Link (18-mer) Sequenz: 5'-CTA GCG GCA AGC GTA GCT-3'
    • 7. Name: 3'-Nhe-Sac-Link (10-mer) Sequenz: 5'-ACG CTT GCC G-3'
    • 8. Name: 3'-MboII-XbaI (27-mer) Sequenz: 5'-TAA TGG CCC GGG CAT AGT CGG GTA GGG-3'
    • 9. Name:5'-Hind-link-Histag (43-mer) Sequenz: 5'-A GCT GGA TCC CCC GCT CCC CAC CAC CAC CAC CAC CCT GCC CCT-3'
    • 10. Name: 3'-Hind-link-Histag (42-mer) Sequenz: 5'-AGC AGG GGC AGG GTG GTG GTG GTG GTG GGG AGC GGG GGA TCC-3'
    • 11. Name: 5'-Not-link-test1 (57-mer) Sequenz: 5'-G GCC GGA AGA TTG GGG CGC CAA AGA GTA ACT CTC AAA GGC ACG CGC CCC AAT CTT CC-3'
    • 12.. Name: 3'-Not-link-testI (57-mer) Sequenz: 5'-GGC CGG AAG ATT GGG GCG CGT GCC TTT GAG AGT TAC TCT TTG GCG CCC CAA TCT TCC-3'
    • 13. Name: 5'-Not-Mbo-link-telo (92-mer) Sequenz: 5'-GGC CGG AAG ATT GGG GCG TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG CGC CCC AAT CTT CC-3'
    • 14. Name: 3'-Not-Mbo-link-telo (92-mer) Sequenz: 5'-GGC CGG AAG ATT GGG GCG CCC TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA CGC CCC AAT CTT CC-3'
    • 15. 5'-SL-linker-Fok1-RT (111-mer)
      Figure 00580001
    • 16. 3'-SL-linker-Fok1-RT (103-mer)
      Figure 00580002
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00590001
  • Figure 00600001
  • Figure 00610001
  • Figure 00620001
  • Figure 00630001
  • Figure 00640001
  • Figure 00650001
  • Figure 00660001
  • Figure 00670001
  • Figure 00680001
  • Figure 00690001

Claims (65)

  1. Nukleinsäurekonstrukt zur Abgabe in eine Zelle, das umfasst: 3' und 5'komplementäre Sequenzen, die einen invertierten Tandem Repeat umfassen, eine Sequenz, die eine Primerbindungsstelle für eine Reverse Transkriptase codiert, die komplementär ist zu einer Transfer-RNA (tRNA) und im Hinblick auf den invertierten Tandem Repeat in einer 3'Position lokalisiert ist, und eine Sequenz, die für eine Sequenz von Interesse kodiert und entweder zwischen den 3' und 5'komplementären Sequenzen des invertierten Tandem Repeat lokalisiert ist oder zwischen dem invertierten Tandem Repeat und der Sequenz, die die 3'Primerbindungsstelle kodiert.
  2. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 1, wobei die Sequenz, die die Sequenz von Interesse kodiert, zwischen den 3' und 5'komplementären Sequenzen des invertierten Tandem Repeat lokalisiert ist.
  3. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 2, das eine zweite Sequenz umfasst, die für eine Sequenz von Interesse kodiert, die zwischen dem invertierten Tandem Repeat und der Sequenz, die die 3'Primerbindungsstelle kodiert, lokalisiert ist.
  4. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 1, wobei die Sequenz, die die Sequenz von Interesse kodiert, zwischen dem invertierten Tandem Repeat und der Sequenz, die die 3'Primerbindungsstelle kodiert, lokalisiert ist.
  5. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei der invertierte Tandem Repeat geeignet ist, ein Stamm-Schleifen-Intermediat in einem einzelsträngigen Nukleinsäureprodukt zu formen, das von dem besagten Nukleinsäurekonstrukt kodiert wird, wobei der besagte invertierte Tandem Repeat den Stamm des Stamm-Schleifen-Intermediats formt.
  6. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 2 bis 5, wobei der invertierte Tandem Repeat eine Sequenz umfasst, die für ein oder mehrere spezifische Enzym-Erkennungsstellen kodiert.
  7. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 6, wobei die spezifische Enzymerkennungsstelle eine Stelle für Restriktions Endonuklease umfasst.
  8. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 7, das weiterhin ein Gen umfasst, das eine Restriktions-Endonuklease kodiert
  9. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 8, wobei das Restriktions-Endonuklease-Gen im Hinblick auf den invertierten Tandem Repeat in einer 5'Position angeordnet ist.
  10. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 6 bis 9, wobei die spezifische Enzym-Erkennungsstelle eine HindIII oder eine Not 1 Restriktionsstelle umfasst, oder eine Erkennungssequenz für eine Restriktions-Endonuklease, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Endonuklease Typ I, Endonuklease Typ II und Endonuklease Typ III besteht.
  11. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei der invertierte Tandem Repeat eine Sequenz umfasst, die eine oder mehrere eukaryotische, prokaryotische und/oder virale Protein DNA-Bindungsstellen kodiert.
  12. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei der invertierte Tandem Repeat in einer cis-orientierten Art und Weise funktioniert.
  13. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Primerbindungsstelle spezifisch ist für eine endogene Reverse Transkriptase.
  14. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 12, das weiterhin ein Gen umfasst, das eine Reverse Transkriptase oder ein Reverse Transkriptase/RNase H Polyprotein kodiert.
  15. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 14, wobei das Gen, das die Reverse Transkriptase oder das Reverse Transkriptase/RNase H Polyprotein kodiert, im Hinblick auf den invertierten Tandem Repeat in einer 5'Position angeordnet ist.
  16. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 14 oder 15, wobei das Gen, das das Reverse Transkriptase/RNase H Polyprotein kodiert von dem Moloney Murine Leukemia Virus, dem humanen Immundefizienz Virus (HIV) oder dem Simianen Immundefizienz Virus (SIV) ist.
  17. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 14 bis 16, wobei die Primerbindungsstelle spezifisch ist für eine Reverse Transkriptase, die von dem Reverse-Transkriptase-Gen oder dem Reverse Transkriptase/RNase H Polyprotein Gen kodiert wird.
  18. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das weiterhin einen Promotor für jede besagte erste oder zweite Sequenz umfasst, die eine Sequenz von Interesse, das besagte Restriktions Endonuklease Gen, das besagte Reverse-Transkriptase-Gen oder das besagte Reverse Transkriptase/RNase H Gen kodiert.
  19. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 18, wobei der Promotor und/oder Enhancer ein eukaryotischer Promotor ist.
  20. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 18 oder 19, wobei der Promotor ein konstitutiver, ein induzierbarer, ein Promotor mit breitem Spektrum oder ein gewebespezifischer Promotor ist.
  21. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das ferner eine Sequenz umfasst, die eine Polyadenylierungs-Endsequenz kodiert, die im Hinblick auf die 3'Primerbindungsstelle in 3'Position angeordnet ist.
  22. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die erste oder zweite Sequenz, die eine Sequenz von Interesse kodiert, eine Sequenz einschließt, die eine einzelsträngige DNA (ssDNA) kodiert, die enzymatische Aktivität hat.
  23. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 22, wobei die erste oder zweite Sequenz, die eine Sequenz von Interesse kodiert, eine Sequenz 5'-GGCTAGCTACAACGA-3' einschließt und in den beiden 5' und 3'Richtungen von Sequenzen flankiert wird, die eine oder mehrere Sequenz(en) kodieren, die komplementär sind zu einer Ziel mRNA Spezies.
  24. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 23, wobei die Ziel mRNA-Spezies ist für: (i) h-ras, (ii) c-raf Kinase, (iii) angiogener Wachstumsfaktor Pleiotrophin, oder (iv) die tat Region des Simianen Immundefizienz Virus (SIV).
  25. Set von genetischen Elementen, die angepasst sind für das Einfügen in einen. Vektor zum Einbringen in eine Zelle, umfassend: (i) eine Kassette, die ein Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 2 bis 4 umfasst; und (ii) ein Gen, das eine Reverse Transkriptase kodiert.
  26. Set von genetischen Elementen nach Anspruch 25, wobei das besagte Reverse Transkriptase Gen ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus den Reverse Transkriptase Genen des Moloney Murine Leukemia Virus oder des humanen Immundefizienz Virus besteht.
  27. Set von genetischen Elementen nach Anspruch 25 umfassend (a) eine Sequenz, die für eine Sequenz von Interesse kodiert und von 3' und 5'komplementären Sequenzen flankiert wird, die einen invertierten Tandem Repeat umfassen, (b) eine Sequenz, die eine Primerbindungsstelle (PBS) für eine Reverse Transkriptase kodiert, die hinsichtlich des invertierten Tandem Repeat in einer 3'Position ist, wobei die PBS aus einer Nukleinsäure besteht, die komplementär ist zu einer Transfer-RNA (tRNA)-Sequenz, die innerhalb einer eukaryotischen Zielzelle ansässig ist, und (c) ein Gen, das eine Reverse Transkriptase/RNase H und eine Restriktions-Endonuklease kodiert.
  28. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 24, oder ein Set von genetischen Elementen nach einem der Ansprüche 25 bis 27, wobei die Sequenz von Interesse ein einzelsträngiges Nukleinsäuremolekül ist.
  29. Nukleinsäurekonstrukt oder Set von genetischen Elementen nach Anspruch 28, wobei das einzelsträngige Nukleinsäuremolekül eine cDNA oder eine mRNA ist.
  30. Nukleinsäurekonstrukt oder Set von genetischen Elementen nach einem der Ansprüche 28 oder 29, wobei das einzelsträngige Nukleinsäuremolekül ein inhibitorisches Nukleinsäuremolekül ist.
  31. Nukleinsäurekonstrukt oder Set von genetischen Elementen nach Anspruch 30, wobei das inhibitorische Nukleinsäuremolekül eine Antisense-Sequenz oder ein Aptamer ist.
  32. Nukleinsäurekonstrukt oder Set von genetischen Elementen nach einem der Ansprüche 1 bis 31, wobei die Nukleinsäure eine DNA ist.
  33. mRNA-Transkript, das umfasst: (a) 3' und 5'komplementäre Sequenzen umfassend einen invertierten Tandem Repeat, (b) eine Primerbindungsstelle, die komplementär ist zu einer Transfer-RNA (tRNA) und 3' zu dem invertierten Tandem Repeat angeordnet ist, und (c) eine Sequenz kodierend für eine Sequenz von Interesse, die entweder zwischen den 3' und 5'komplementären Sequenzen des invertierten Tandem Repeat oder zwischen dem invertierten Tandem Repeat und der 3'Primerbindungsstelle angeordnet ist.
  34. mRNA Transkript nach Anspruch 33, wobei die Sequenz, die die Sequenz von Interesse kodiert, zwischen dem invertierten Tandem Repeat und der 3'Primerbindungsstelle angeordnet ist.
  35. mRNA Transkript nach einem der Ansprüche 33 oder 34, wobei die Sequenz, die die Sequenz von Interesse kodiert, eine Sequenz einschließt, die eine ssDNA mit enzymatischer Aktivität kodiert.
  36. mRNA nach Anspruch 33, die ein Transkript des Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 32 ist.
  37. ssDNA Transkript von der mRNA nach einem der Ansprüche 33 bis 36.
  38. Vektor, der umfasst: 3' und 5'komplementäre Sequenzen umfassend einen invertierten Tandem Repeat, eine Sequenz, die eine Primerbindungsstelle für eine Reverse Transkriptase kodiert, die komplementär ist zu einer Transfer-RNA (tRNA) und im Hinblick auf den invertierten Tandem Repeats in einer 3'Position lokalisiert ist, und eine Insertionsstelle für eine Sequenz, die für eine Sequenz von Interesse kodiert und zwischen den 3' und 5'komplementären Sequenzen des invertierten Tandem Repeat lokalisiert ist, oder zwischen dem invertierten Tandem Repeat und der Sequenz, die die 3'Primerbindungsstelle kodiert.
  39. Vektor nach Anspruch 38, der eine erste Insertionsstelle zwischen den 3' und 5'komplementären Sequenzen des invertierten Tandem Repeat umfasst und eine zweite Insertionsstelle zwischen dem invertierten Tandem Repeat und der Sequenz, die die 3'Primerbindungsstelle kodiert.
  40. Vektor nach Anspruch 38 oder 39, weiterhin umfassend ein Gen, das eine Reverse Transkriptase oder ein Reverse Transkriptase/RNase H Polyprotein kodiert.
  41. Vektor nach Anspruch 40, wobei das Gen für Reverse Transkriptase oder Reverse Transkriptase/RNase H Polyprotein hinsichtlich des invertierten Tandem Repeat in einer 5'Position angeordnet ist.
  42. Vektor nach Anspruch 38 umfassend ein Nukleinsäurekonstrukt oder ein Set von genetischen Elementen nach einem der Ansprüche 1 bis 32.
  43. Vektorsystem, das einen ersten Vektor nach Anspruch 38 oder 39 umfasst und einen zweiten Vektor umfassend ein Gen für eine Reverse Transkriptase.
  44. Vektor oder Vektorsystem nach einem der Ansprüche 38 bis 43, wobei der Vektor ein Plasmid oder ein modifiziertes virales Konstrukt ist.
  45. Vektor oder Vektorsystem nach einem der Ansprüche 38 bis 44, wobei das Gen nutzbar an eine Expressionskontrollsequenz gebunden ist.
  46. Wirtszelle stabil transformiert oder transfiziert mit einem Vektor oder einem Vektorsystem nach einem der Ansprüche 38 bis 45 oder umfassend ein Transkript nach einem der Ansprüche 33 bis 37.
  47. Wirtszelle nach Anspruch 46, die eine eukaryotische Zelle oder eine Bakterienzelle ist.
  48. In vitro Verfahren zur Herstellung eines einzelsträngigen Nukleinsäuremoleküls, das eine Sequenz von Interesse hat, wobei das Verfahren die Schritte des Einführens eines Nukleinsäurekonstrukts oder eines Set von genetischen Elementen nach einem der Ansprüche 1 bis 32 in eine Zielzelle, der Transkription des Nukleinsäurekonstrukts oder des Sets von genetischen Elementen in mRNA, und der reversen Transkription des mRNA Transkripts in cDNA umfasst.
  49. Verfahren nach Anspruch 48, wobei die Reverse Transkription durch eine Reverse Transkriptase ausgeführt wird, die endogen zu der Zielzelle ist.
  50. Verfahren nach Anspruch 48, weiterhin umfassend den Schritt des Einführens eines Gens in eine Zielzelle, das eine Reverse Transkriptase oder ein Reverse Transkriptase/RNase H Polyprotein kodiert.
  51. Verfahren nach einem der Ansprüche 48 bis 50, weiterhin umfassend den Schritt der Linearisierung des cDNA Transkripts durch Schneiden der cDNA Stamm-Schleifen Struktur, die von dem invertierten Tandem Repeat geformt wird, in dem die Schlaufenstruktur den Stamm verbindet.
  52. Verfahren nach Anspruch 51, wobei die cDNA, die ein Stamm-Schlaufe Intermediat durch Watson-Crick Basenpaarung des invertierten Tandem Repeat bildet, linearisiert wird durch Einschluss einer Restriktions-Endonuklease-Stelle in dem invertierten Tandem Repeat und Schneiden des Stamms des Stamm-Schleifen-Intermediats mit einer Restriktions-Endonuklease.
  53. Verfahren nach Anspruch 52, weiterhin umfassend den Schritt des Einführens eines Gens, das eine Restriktions-Endonuklease kodiert oder eines Gens, das ein Reverse Transkriptase/RNAse H Polyprotein kodiert, das über einen Prolin-reichen Linker an eine Restriktions-Endonuklease in der Zielzelle gebunden ist.
  54. Verfahren nach einem der Ansprüche 48 bis 53 zusätzlich das induzierte Fördern der Transkription des Reverse Transkriptase Gens umfassend.
  55. Verfahren nach Anspruch 48, umfassend die Schritte des Einführens des Set von genetischen Elementen nach Anspruch 27 in eine Zielzelle, der Transkription des Sets von genetischen Elementen in mRNA, der reversen Transkription des mRNA Transkripts der besagten Kassette mit der Reversen Transkriptase im Zellkern von humanen Gewebekulturzellen, des Verdaus der resultierenden Heteroduplex mit RNAse H und die Entfernung der flankierenden Sequenzen entweder durch (a) Verdau des Stamm-Schleifen-Intermediats mit Restriktions-Endonuklease oder (b) durch vorzeitige Termination des cDNA Transkripts durch Bildung einer Stamm-Schleife Sekundärstruktur durch die selbst-komplementären invertierten Tandem Repeats.
  56. Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Nukleinsäurekonstrukt oder ein Set von genetischen Elementen nach einem der Ansprüche 1–32, einen Vektor oder ein Vektorsystem nach einem der Ansprüche 38 bis 45 oder eine Wirtszelle nach Anspruch 46 oder 47, zusammen mit einem pharmakologisch akzeptablen Zusatzmittel, einem Verdünnungsmittel oder einem Träger umfasst.
  57. Nukleinsäurekonstrukt oder Set von genetischen Elementen nach einem der Ansprüche 1 bis 32, Vektor oder Vektorsystem nach einem der Ansprüche 38 bis 45 oder Wirtszelle nach Anspruch 46 oder 47 zur Verwendung in der Therapie, insbesondere zur Verwendung zur Abgabe eines Inhibitor-Nukleinsäuremoleküls in eine Zielzelle.
  58. Nukleinsäurekonstrukt oder Set von genetischen Elementen nach Anspruch 57, wobei das Nukleinsäurekonstrukt oder das Set von genetischen Elementen zur Verwendung in einem in vivo Verfahren zur Herstellung eines einzelsträngigen Nukleinsäuremoleküls ist, das eine Sequenz von Interesse aufweist, wobei das Verfahren die Schritte des Einführens eines Nukleinsäurekonstrukts oder eines Set von genetischen Elementen in eine Zielzelle, die Transkription des Nukleinsäurekonstrukts in mRNA und die reverse Transkription des mRNA Transkripts in cDNA umfasst.
  59. Nukleinsäurekonstrukt oder Set von genetischen Elementen nach Anspruch 58, wobei die reverse Transkription durch eine Reverse Transkriptase ausgeführt wird, die endogen zu der Zielzelle ist.
  60. Nukleinsäurekonstrukt oder Set von genetischen Elementen nach Anspruch 58, wobei das Verfahren weiterhin den Schritt des Einführens eines Gens umfasst, das eine Reverse Transkriptase oder ein Reverse Transkriptase/RNAse H Polyprotein in die Zielzelle kodiert.
  61. Nukleinsäurekonstrukt oder Set von genetischen Elementen nach einem der Ansprüche 58 bis 60, wobei die Herstellung weiterhin den Schritt der Linearisierung des cDNA-Transkripts umfasst durch Schneiden der cDNA Stamm-Schleifen Struktur, die von dem invertierten Tandem Repeat geformt wird, in dem die Schlaufenstruktur den Stamm verbindet.
  62. Nukleinsäurekonstrukt oder Set von genetischen Elementen nach Anspruch 61, wobei die cDNA, die ein Stamm-Schleifen-Intermediat durch Watson-Crick-Basenpaarung des invertierten Tandem Repeat bildet, linearisiert wird durch Einschluss einer Restriktions-Endonuklease-Stelle in dem invertierten Tandem Repeat, und durch Schneiden des Stamms des Stamm-Schleifen-Intermediats mit der Restriktions-Endonuklease.
  63. Nukleinsäurekonstrukt oder Set von genetischen Elementen nach Anspruch 62, wobei das Verfahren weiterhin den Schritt des Einführens eines Gens umfasst, das eine Restriktions-Endonuklease kodiert oder eines Gens, das ein Reverse Transkriptase/RNAse H Polyprotein kodiert, das über einen Prolinreichen Linker an eine Restriktions-Endonuklease in der Zielzelle gebunden ist.
  64. Nukleinsäurekonstrukt oder Set von genetischen Elementen nach einem der Ansprüche 58 bis 63, wobei das Verfahren zusätzlich das induzierte Fördern der Transkription des Reverse Transkriptase Gens umfasst.
  65. Verwendung eines Nukleinsäurekonstrukts oder eines Set von genetischen Elementen nach einem der Ansprüche 1 bis 32, eines Vektors oder eines Vektorsystems nach einem der Ansprüche 38 bis 45 oder einer Wirtszelle nach Anspruch 46 oder 47, zur Herstellung eines Medikaments zur Linderung von krankhaften Zuständen durch Regulation der Genexpression, insbesondere zur Linderung von krankhaften Zuständen durch Abgabe eines inhibitorischen Nukleinsäuremoleküls in eine Zielzelle.
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