DE69231060T2 - Haptene, tracer, immunogene und antikörper für immunassays für propoxyphen - Google Patents
Haptene, tracer, immunogene und antikörper für immunassays für propoxyphenInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung handelt von Reagenzien und Verfahren für die Durchführung eines Immunoassays, insbesondere eines Fluoreszenzpolarisationsimmunoassays (FPIA), für die Bestimmung des Vorhandenseins und/oder der Menge von Dextropropoxyphen und/oder des Hauptmetaboliten von Dextropropoxyphen (nämlich Nordextropropoxyphen) in Proben, insbesondere wässrigen, flüssigen biologischen Proben wie Urin, Blutserum oder Blutplasma, und von einem Immunoassay auf der Basis dieser Reagenzien. Insbesondere handelt die Erfindung von neuen Haptenen, Immunogenen, die von den Haptenen gebildet werden, Antiseren, die gegen die Haptene gebildet werden, und Immunoassays, die Reagenzien und Verfahren der Erfindung nutzen.
- Dextropropoxyphen ist ein narkotisches Analgetikum, das ein weites therapeutisches Anwendungsfeld gefunden hat. Leider wurde es jedoch auch ein Wirkstoff für den Missbrauch. Dextropropoxyphen ist auch unter den folgenden chemischen Bezeichnungen bekannt: [S-(R*,S*)]-alpha-[2-(Dimethylamino)-1- methylethyl]-alpha-phenylbenzolethanolpropanoat (Ester); alphad-4-Dimethylamino-3-methyl-1,2-diphenyl-2-butanolpropionat; (+) - 1,2-Diphenyl-2-propionoxy-3-methyl-4-dimethylaminobutan.' (+)-4- Dimethylamino-1,2-diphenyl-3-methyl-2-propionyloxybutan; alphad-4-Dimethylamino-3-methyl-1,2-diphenylbutan-2-ol propionat; und d-Propoxyphen. Dextropropoxyphen entspricht der folgenden Strukturformel: Dextropropoxyphen
- Wie von R.J. Flanagan et al. in "Measurement of Dextropropoxyphene and Nordextropropoxyphene in Biological Fluids", Human Toxicol. (1984), 3, 1035-1145, berichtet wurde, wurden verschiedene Verfahrenn zum Nachweis, zur Identifizierung und zum Messen der Menge von Dextropropoxyphen und seines hauptsächlichen Plasmametaboliten, Nordextropropoxyphen, ausgearbeitet. Beispiele für solche Verfahren sind die Dünnschichtchromatographie (TLC) und die Gas-Flüssig- Chromatographie (GLC) von flüssigen oder festen Extrakten von Urin oder von Mageninhalten sowie ein homogenes Enzymimmunoassay-Verfahren.
- US 4.025.501 ist auf Verbindungen gerichtet zur Konjugation an Antigene für die Produktion von Antikörpern, die (d,1)- Propoxyphen und dessen Metabolite in Immunoassays erkennen. Die Verbindungen, auf die dieses Patent gerichtet ist, werden dargestellt durch die Reaktion von 1,2-Diphenyl-3-methyl-4- dimethylamino-2-butanol mit einer zweibasigen Säure zur Bildung eines halbsauren Esters, für dessen Säuregruppe bekannt gegeben wurde, daß sie für die Konjugation an Aminogruppen von Proteinen oder Polypeptiden aktiviert ist.
- Derzeit bestehende Assays für Propoxyphen neigen jedoch dazu, unter den nachteilig hohen Kreuzreaktivitäten für verschiedene, strukturell ähnliche Verbindungen zu leiden. Die vorliegende Erfindung hat mehrere Ziele. Hierzu gehören zum Beispiel die Bereitstellung neuer Haptene, Immunogene, die aus dem Haptenen gebildet werden, und Antiseren, die als Antwort auf die Immunogene gebildet werden, die für die Verwendung in Immunoassays geeignet sind, die sehr scharf unterscheiden zwischen Dextropropoxyphen und seinem Hauptmetaboliten, Nordextropropoxyphen, und in denen die Immunoassay- Kreuzreaktivität für Störverbindungen wie unter anderem Methadon und Chlorphenoxamin minimiert oder im wesentlichen eliminiert sind.
- Weiterhin beinhalten die derzeit bestehenden Assays für Propoxyphen die Verwendung racemischer Gemische von Molekülen zur Herstellung von Immunogenen, um Antikörper gegen Propoxyphen zu erhalten. Propoxyphen kann jedoch wegen des Vorhandenseins von zwei optisch aktiven Zentren innerhalb des Moleküls in vier verschiedenen isomeren Formen vorliegen. Daher wird für die Verwendung solcher racemischer Gemische zur Herstellung von Immunogenen für den Erhalt von Antikörpern angenommen, dass sie zur Bildung von mindestens vier Typen von Antikörpern führt, von denen nur etwa 25% die optische Form von Propoxyphen nachweisen, die für den Assay relevant sind. Die Form von Propoxyphen, die auf dem Markt verfügbar ist, ist eine optisch aktive Form des Wirkstoffs. Darüberhinaus gibt es unter den vier isometrischen Formen von Propoxyphen nur eine Form, die eine substantielle Wirksamkeit bei Menschen zu haben scheint, nämlich Dextropropoxyphen. Dementsprechend wäre es insbesondere für quantitative Assays für die Form von Propoxyphen, die bei Menschen eine Wirksamkeit aufweist, und/oder für seinen bedeutendsten Metaboliten wünschenswert, Antikörper bereitzustellen, von denen ein größerer Teil mit der wirksamen Form des Arzneistoffs reaktionsfähig ist als mit den unwirksamen Formen des Wirkstoffs.
- Die vorliegende Erfindung handelt von Immunoassays, insbesondere kompetitiven Immunoassays, bei denen Reagenzien und Techniken verwendet werden, die besonders geeignet sind für den Nachweis des Vorhandenseins und/oder der Menge von Dextropropoxyphen und/oder Nordextropropoxyphen in biologischen Flüssigkeiten. Die vorliegende Erfindung bietet u. a. den Vorteil, dass sie eine vorteilhaft effektive Bestimmung der Menge von Dextropropoxyphen und/oder seines Hauptmetaboliten, Nordextropropoxyphen, ermöglicht, bei der eine Störung durch andere verwandte Verbindungen minimiert ist. Die vorliegende Erfindung basiert zum Teil auf neuen, im wesentlichen optisch reinen Haptenen, die zur Herstellung von Immunogenen und/oder Tracern verwendet werden können, die für die Verwendung in Immunoassays geeignet sind.
- Die Erfindung liefert ein im wesentlichen optisch reines Hapten, das für die Bildung von Antikörpern und Tracern nützlich ist, die in einem Immunoassay für Dextropropoxyphen und/oder Nordextropropoxyphen nützlich sind. Das Hapten der Erfindung entspricht der Strukturformel (IX):
- In Formel (IX) ist Z eine -NH-Komponente und vorhanden, wenn m = 1 ist. X ist eine funktionelle Gruppe, die aus der Gruppe gewählt ist, die aus -CHO, -COOH, -NH&sub2; und -COOR besteht, wobei R eine C&sub1; -C&sub3;-Alkylgruppe ist. In Formel (IX) kann m gleich 0 oder 1 sein, und n kann eine ganze Zahl zwischen 1 und 3 sein.
- Die Erfindung liefert außerdem ein Immunogen, das von einem Hapten der Erfindung abgeleitet ist.
- Die Erfindung liefert außerdem ein Antiserum, das als Antwort auf ein Immunogen, das von einem Hapten der Erfindung abgeleitet ist, gebildet wird.
- Die Erfindung liefert auch einen fluoreszierenden Tracer, der von einer im wesentlichen optisch reinen Verbindung der Erfindung abgeleitet ist und in einem Immunoassay für Dextropropoxyphen und/oder Nordextropropoxyphen nützlich ist. Die im wesentlichen optisch reine Verbindung entspricht dem Häpten, das in Formel (IX) definiert ist.
- Die Erfindung liefert auch einen verbesserten Immunoassay für die Bestimmung des Vorhandenseins oder der Menge von Dextropropoxyphen und/oder Nordextropropoxyphen in einer biologischen Probe. Der verbesserte Immunoassay enthält einen Schritt, bei dem die Probe mit einem Antikörper (oder Antikörpern) in Kontakt gebracht wird, der als Antwort auf ein Immunogen der Erfindung gebildet wurde. Darüber hinaus liefert die Erfindung einen Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay (FPIA) für die Bestimmung des Vorhandenseins oder der Menge von Dextropropoxyphen und/oder Nordextropropoxyphen in einer biologischen Probe. Der FPIA enthält einen Schritt, bei dem die Probe mit Antikörpern in Kontakt gebracht wird, die als Antwort auf ein Immunogen der Erfindung gebildet wurden, und/oder enthält einen Schritt, bei dem die Probe mit einem fluoreszierenden Tracer der Erfindung in Kontakt gebracht wird.
- Ein Hapten der Erfindung ist im wesentlichen optisch rein und ist insbesondere nützlich für die Bildung von Antikörpern und Tracern, die in einem Immunoassay für Dextropropoxyphen und/oder für Nordextropropoxyphen, einem Metaboliten von Dextropropoxyphen, nützlich sind. So wie er hier verwendet wird, bedeutet der Ausdruck "im wesentlichen optisch rein", dass das Produkt-Hapten weniger als oder gleich 10 Masse-%, vorzugsweise weniger als oder gleich 5 Masse-%, und noch mehr vorzuziehen weniger als oder gleich 2 Masse-% des linksdrehenden (1 oder -)- Enantiomers des Haptens basierend auf der Summe der Massen der rechtsdrehenden (d oder +)- und der linksdrehenden (1 oder -)- Enantiomere enthält. Ein Hapten der Erfindung entspricht der Formel (IX):
- In Formel (IX) stellt Z eine bivalente -NH-Komponente dar und ist vorhanden, wenn m = 1 ist. X ist eine funktionelle Gruppe, die auf der Gruppe gewählt ist, die aus -CHO, -COOH, -NH&sub2; und -COOR besteht, wobei R eine C&sub1;-C&sub3;-Alkylgruppe ist. Vorzugsweise ist X eine Aldehydgruppe. Es wird ebenfalls bevorzugt, dass R eine Ethylgruppe ist. In Formel (IX) kann m = 0 oder 1 sein, vorzugsweise 0, und n kann eine ganze Zahl von 1 bis 3 sein, vorzugsweise 3. Die funktionelle Gruppe, X, in Formel (IX) ist eine funktionelle Gruppe, die zum Beispiel für die Anlagerung einer Antigenität-verleihenden Komponente an das Hapten geeignet ist, zum Beispiel durch direkte Reaktion mit einer co-reaktiven funktionellen Gruppe eines Antigenität-verleihenden Trägers oder über einen Zwischenschritt.
- Haptene der Erfindung können durch die folgenden illustrativen allgemeinen Verfahren hergestellt werden. Typischerweise werden die optisch aktiven Dextropropoxyphenderivate (Haptene) der Erfindung durch Reaktion von Dextropropoxyphenhydrochlorid mit einem geeigneten Reduktionsmittel hergestellt. Der resultierende Alkohol wird dann derivatisiert durch Behandlung mit einem Acylhalogenid- oder Isocyanatreagenz, das eine zweite Funktionalität aufweist, die in eine andere funktionelle Gruppe umgewandelt werden kann. Diese neue funktionelle Gruppe ermöglicht es, dass das so produzierte Dextropropoxyphenderivat an antigene Moleküle gekoppelt wird. Die zweite Funktionalität kann ein Ester oder ein Olefin sein. Die Gesamtmethodik, die für die Ausarbeitung der Bindung des Dextropropoxyphenderivats in dieser Form verwendet wird, ist zentraler Bestandteil für die Gewinnung von haptenen Dextropropoxyphenderivaten von hoher optischer Reinheit.
- Zu den Reduktionsmitteln, die zur Herstellung von Haptenen der Erfindung verwendet werden können, gehören Mittel wie Lithiumaluminiumhydrid, Diisobutylaluminiumhydrid, bis-(Methoxyethoxy)aluminiumhydrid, wobei Lithiumaluminiumhydrid bevorzugt wird.
- Die oben beschriebenen Acylhalogenid- oder Isocyanatreagenzien sind vorzugsweise aliphatische Säurechloride oder aliphatische Isocyanate wie Pentenoylchlorid, Butenoylchlorid, Ethylisocyanatacetat, Ethyl-3-isocyanatpropionat, wobei Pentenoylchlorid für die Haptenbildung bevorzugt wird. Säurechloride und Isocyanate, die von aromatischen Säuren abgeleitet sind, sind weniger geeignet.
- Für die Modifikation der zweiten Funktionalität, die in dem Säurehalogenidmolekül vorhanden ist und mit der die Kupplung an ein antigenes Molekül ermöglicht wird, werden zwei Typen von Reagenzien genutzt, je nach vorhandener Funktionalität. Ungesättigte Säurechloride wie Butenoylchlorid führen zu Dextropropoxyphenderivaten, die ein Olefin enthalten. Olefine können in Aldehyde umgewandelt werden unter Verwendung mehrerer Oxidationsmittel einschließlich Bleitetraacetat, Natriumperiodat, Ozon gefolgt von geeigneter reduzierender Aufarbeitung. Ungesättigte Isocyanate führen ebenfalls zu olefinen Dextropropoxyphenderivaten, die nach Behandlung mit geeigneten Spaltmitteln Säuren enthalten. Zu diesen Mitteln gehören u. a. Säure, Base, aromatische Sulfidsalze, Silyliodide. Säurechloride, die eine zweite Esterfunktionalität enthalten, können ebenfalls zu Dextropropoxyphenderivaten führen, die eine Säure enthalten.
- Beide Komponenten, die erhaltenen Dextropropoxyphenaldehyde und -säuren, werden zu antigenen Molekülen verknüpft durch Verfahren, die dem Fachmann bestens bekannt sind.
- Es wurde herausgefunden, dass Fluoreszenzpolarisationsimmunoassays, durchgeführt unter Verwendung von Antiseren, die von Immunogenen erhalten wurden, die aus Haptenen der Erfindung gebildet wurden, eine besonders hohe Spezifität für Dextropropoxyphen und/oder Nordextropropoxyphen und eine besonders niedrige Kreuzreaktivität für Störverbindungen wie u. a. Methadon oder Chlorphenoxamin bieten können.
- Ein Immunogen der Erfindung wird von einem im wesentlichen optisch reinen Hapten der Erfindung abgeleitet. Ein Immunogen der Erfindung ist besonders nützlich in einem Immunoassay für Dextropropoxyphen und/oder Nordextropropoxyphen. Das Immunogen entspricht der Formel (X):
- worin Z wie für das Hapten entsprechend Formel (IX) weiter oben definiert ist. Y in Formel (X) ist eine bivalente Komponente für die Anbindung der (CH&sub2;)n-Gruppe an die Antigenität-verleihende Komponente A. Y kann -NH-, -(CO)NH- oder -NH(CO)- sein, wobei -NH- bevorzugt wird. Es versteht sich, dass immer dann, wenn in der Spezifikation und den Ansprüchen eine bivalente Komponente für die Bindung von zwei anderen Strukturen angegeben wird, z. B. -(CO)NH- als Y für die Verknüpfung von (CH&sub2;)n und A, der linke Teil der bivalenten Komponente links an die Struktur und der rechte Teil rechts an die Struktur angelagert wird (d. h. für dieses Beispiel (CH&sub2;)n-(CO)NH-A). In Formel (X) kann das tiefergestellte m 0 oder 1 sein, wobei 0 bevorzugt wird, und das tiefergestellte n kann eine ganze Zahl zwischen 1 und 3 sein, wobei 3 bevorzugt wird. Die Antigenität-verleihende Trägerkomponente A kann aus einer Vielzahl Antigenitätverleihender Trägerkomponenten gewählt werden. Wie aus Formel (X) klar zu erkennen ist, steht die Komponente A für den Rest eines Antigenität-verleihenden Trägers, der über Y an den Haptenteil des Immunogens von Formel (X) gebunden ist.
- Die kovalente Bindung der hier beschriebenen Haptenmaterialien an Antigenität-verleihende Materialien kann durch Verfahren erreicht werden, die auf diesem Gebiet bestens bekannt sind, wobei die Auswahl des Verfahrens durch die Natur der Bindungsfunktionalität im Dextropropoxyphenderivat (z. B. X in Formel (IX)) und den für die Bindung gewählten Träger vorgeschrieben wird.
- Typischerweise wird die Antigenität-verleihende Trägerkomponente A durch Umsetzung der funktionellen Gruppe X eines Haptens entsprechend Formel (IX) mit einer co-reaktiven funktionellen Gruppe eines Antigenität-verleihenden Trägers, wie zum Beispiel einer natürlich vorkommenden oder synthetischen Poly(aminosäure), durch allgemein bekannte präparative Techniken bereitgestellt. Typischerweise wird in bevorzugten Ausführungen der Erfindung die natürlich vorkommende Poly(aminosäure) Rinderthyreoglobulin (BTG) als Antigenitätverleihender Träger zum Bereitstellen der Komponente A in Strukturformel (X) verwendet, aber es versteht sich von selbst, dass andere Proteinträger verwendet werden können, wozu zum Beispiel Albumine und Serumproteine wie Globuline, Lipoproteine, Okularlinsenproteine gehören. Einige beispielhafte Antigenitätverleihende Träger sind Rinderserumalbumin (BSA), Hämocyanin der marinen Schlüssellochschnecke (KLH = keyhole limpet hemocyanin), Eierovalbumin, Rindergammaglobulin (BGG), Thyroxinbindendes Globulin, etc. Alternativ können synthetische Poly(aminosäuren) wie Polylysin verwendet werden.
- Zum Beispiel kann ein Hapten, bei dem X in Formel (IX) Carboxyl ist, an Rinderserumalbumin gekoppelt werden, vorzugsweise unter Bedingungen, die normalerweise für die Bildung von Amidbindungen verwendet werden und die dem Fachmann bestens bekannt sind, unter Verwendung eines Kopplungsmittels wie z. B. Carbodiimid, insbesondere eines wasserlöslichen Carbodiimids wie 1-Ethyl- 3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) oder 1-Cyclohexyl- 3-(2-morpholinethyl)carbodiimidmetho-p-toluolsulfonat. Die gleichen Reagenzien können für den Fall verwendet werden, dass X im Hapten eine NH&sub2;-Gruppe ist, wobei eine Amidbindung mit einer Carboxylgruppe am Rinderserumalbumin gebildet wird. Wenn X im Hapten CHO ist, kann das Aldehyd reduktiv zu einer entsprechenden funktionellen Amingruppe aminiert werden. Weitere Umwandlungen des Aldehyds in nützliche Haptene sind für den Fachmann offensichtlich.
- Antiseren der vorliegenden Erfindung werden durch Entwicklung einer Immunantwort in Tieren auf Immunogene der Erfindung hergestellt. Das Immunogen wird Tieren wie z. B. Kaninchen, Mäusen, Ratten, Schafen oder Kühen durch eine Injektionsreihe verabreicht entsprechend Techniken, die im allgemeinen auf diesem Gebiet bekannt sind. Ein Antiserum gemäß der vorliegenden Erfindung wird als Antwort auf ein Immunogen der Erfindung gebildet, das von einem im wesentlichen optisch reinen Hapten der Erfindung abgeleitet ist. Sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper erkennen spezifische Epitope auf einem Immunogen und sind möglicherweise beide geeignet, auch wenn typischerweise polyklonale Antikörper in der vorliegenden Erfindung verwendet wurden. Polyklonale Antikörper bestehen aus einem Gemisch vieler Antikörper, von denen jeder ein spezifisches Epitop erkennt, während monoklonale Antikörper von Zellen produziert werden, die einen einzigen Antikörper absondern, der ein bestimmtes Epitop erkennt. Techniken für die Herstellung polyklonaler Antikörper sind allgemein im Fachgebiet bestens bekannt.
- Monoklonale Antikörper können hergestellt werden durch intraperitoneale, subkutane, intravenöse oder sonstige Injektion von Tieren wie Mäusen oder Ratten mit einem Antigen, nämlich einem Immunogen entsprechend Formel (X) oben, um eine Immunantwort in den Tieren hervorzurufen (nämlich die Produktion von Antikörpern, die für das Antigen spezifisch sind). Den Tieren wird. Serum entnommen und diese Seren werden untersucht, um den Titer des Antikörpers in den Seren zu bestimmen (um zu bestimmen, ob das Tier die gewünschte Immunantwort hervorgebracht hat oder nicht, und in welchem Ausmaß). Jenen Tieren, in denen die gewünschte Immunantwort gebildet wurde, wird eine Ruhepause von etwa zwei bis drei Monaten gewährt. Nach diesem Zeitraum von 2-3 Monaten und etwa drei Tage vor der erwarteten Fusion von B-Lymphozytzellen (Zellen, die nach Stimulation durch ein Antigen zu Plasmazellen reifen, die Antikörper synthetisieren, und die auch als B-Zellen bezeichnet werden) mit Myelomzellen (Tumorzellen) wird diesen Tieren eine Verstärkungsinjektion des Antigens verabreicht. B- Lymphozytzellen werden dann der jeweiligen Milz der Tiere nach Standardverfahren entnommen und die B-Lymphozytzellen werden dann mit Myelomfusionspartnern gemäß Standardverfahren verschmolzen, die z. B. in Kohler und Milstein, "Continuous Culture of Fused Cells Secreting Antibody of Predefined Specificity", Nature, 256, 495 (1975) beschrieben sind. Die B- Lymphozyt-Myelom-Fusionen werden dann in Multivertiefungs- Gewebekulturplatten plattiert, die HAT-Medium oder andere geeignete Medien enthalten. Die resultierenden Kulturen werden mit HT-Medium oder anderen geeigneten Medien, und fetalem Rinderserum oder Kälberrinderserum am oder um den fünften und siebten Tag nach der Fusion der Zellen gespeist und dann am oder um den 10. Tag nach der Fusion auf das Vorhandensein von Antikörper untersucht, der für das Antigen spezifisch ist.
- Spezifische erwünschte Hybride werden dann durch Grenzwertverdünnung geklont. (Hybridzellen werden in unterschiedlichen Mengen an HT-Medium oder anderen geeigneten Medien verdünnt und in Gewebekulturplatten plattiert, um einen einzelnen erwünschten Klon zu isolieren.) Gebildete Klone werden dann für eine breitere Palette von Kreuzreaktanden auf Spezifität untersucht.
- Die Menge an resultierenden monoklonalen Antikörpern, die von einem erwünschten Klon produziert wird, kann dann gesteigert werden zur Produktion einer ausreichenden Menge an Antikörpern für die Reinigung in entweder: (1) Gewebekultur (durch Expansion der Anzahl der Zellen in Gewebekultur oder HT-Medium) oder (2) Mäusen für Aszites. Die monoklonalen Antikörper können in Mäusen vermehrt werden durch Injektion von Hybridzellen in die Bauchhöhle von Mäusen und Wachsenlassen der Zellen (normalerweise etwa 7 Tage). Die Aszites der Mäuse wird geerntet durch Töten der Mäuse, Sammeln der Aszitesflüssigkeit und Reinigen der Aszitesflüssigkeit. BALB/c-Mäuse sind die bekannteste Linie von Labormäusen, die für dieses Verfahren verwendet werden, und sie können von jedem Mäusehändler bezogen werden. Pristan sollte den Mäusen injiziert werden, um deren Immunsystem für die Produktion von B- und T-Zellen zu stimulieren (etwa zwei oder drei Wochen bevor die Hybridzellen den Mäusen injiziert werden), die als Nährschicht für Klonzellen dienen, die den Mäusen injiziert werden. Dies geschieht, um eine geeignete Umgebung zu schaffen, in der die Hybridzellen wachsen können.
- Die Erfindung liefert auch verbesserte Immunoassays für den Nachweis des Vorhandenseins oder der Menge von Dextropropoxyphen und/oder Nordextropropoxyphen in biologischen Proben. Ein verbesserter Immunoassay der Erfindung enthält (umfaßt) einen Schritt, bei dem die zu bestimmende Probe mit Antikörpern in Kontakt gebracht wird, die als Antwort auf ein Immunogen der Erfindung erhalten wurden. Es wird davon ausgegangen, dass alle Immunoassays für Propoxyphen und /oder Nordextropropoxyphen, die Antikörper verwenden, die gegen Immunogene erhalten wurden, gemäß der Erfindung, innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung liegen. Beispiele für Immunoassays schließen Radioimmunoassays (RIAs), Enzymimmunoassays (EIas), enzyme linked immunosorbent assays (ELISAs) und Fluoreszenzpolarisationsimmunoassays (FPIAs) ein. In einem Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay (FPIA) kann ein fluoreszierender Tracer der Erfindung entweder mit oder ohne Antikörper, die als Antwort auf ein Immunogen der Erfindung aufgezogen wurden, verwendet werden.
- Einen fluoreszierenden Tracer der Erfindung kann man sich vorstellen, von einer im wesentlichen optisch reinen Verbindung abgeleitet zu sein, die einem Hapten der Erfindung entspricht. Ein Tracer der Erfindung ist in einem Immunoassay für Dextropropoxyphen und/oder Nordextropropoxyphen nützlich und entspricht der Formel (XI):
- worin Z wie für das Hapten entsprechend Formel (IX) weiter oben definiert ist, wobei das tiefergestellte m gleich 0 oder 1 ist, vorzugsweise 1. In Formel (XI) ist Y ein bivalentes Radikal, das aus -NH-, -(CO)NH- und -NH(CO)- gewählt ist, wobei -(CO)NH- bevorzugt wird. Das tiefergestellte n ist eine ganze Zahl von 1 bis 3 und ist in einem bevorzugten Tracer der Erfindung gleich 1. In Formel (XI) ist FL eine Fluoreszenz-verleihende Komponente, und Y dient dazu, die Fluoreszenz-verleihende Komponente an das bivalente Radikal -(CH&sub2;)n- zu binden. Die Fluoreszenz-verleihende Komponente FL kann aus einer Vielzahl Fluoreszenz-verleihender Komponenten ausgewählt werden.
- Wie aus Formel (XI) zu erkennen ist, stellt die Komponente FL den monovalenten Rest einer Fluoreszenz-verleihenden Verbindung dar, die über X an den Rest des Tracers gebunden ist. In bevorzugten Ausführungen der Erfindung ist die Fluoreszenzverleihende Komponente des fluoreszierenden Tracers ein monovalenter Rest von Fluorescein oder ein monovalenter Rest eines Fluorescein-Derivats. Zum Beispiel können alle folgenden Fluorescein-Derivate verwendet werden: FL-NH&sub2;, Fluoresceinamin; FL-CH&sub2;NH&sub2;, Aminomethylfluorescein und FL-COOH, Carboxyfluorescein. In diesem Dokument steht FL für eine Fluoresceinkomponente, die der folgenden Formel (XII) entspricht:
- In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung wird FL-NH&sub2; zur Herstellung des Tracers verwendet, vorzugsweise die Form, worin die -NW-Gruppe an FL entweder über die 5- oder 6-Position (siehe Abb. XII oben) gebunden ist, typischerweise an der 5- Position.
- Tracer der Erfindung haben die Formel (XI) und können im allgemeinen hergestellt werden durch Bindung einer geeigneten fluoreszierenden Verbindung an ein Hapten der Erfindung, das durch Formel (IX) weiter oben dargestellt wird und worin X für eine funktionelle Gruppe steht, die geeignet ist dazu eingesetzt zu werden, um die fluoreszierende Verbindung an das Hapten zu binden, z. B. durch direkte Reaktion mit einer co-reaktiven funktionellen Gruppe der fluoreszierenden Verbindung oder über einen Zwischenschritt. Beispiele von funktionellen Gruppen für das Hapten sind: -COOH, -NH&sub2; und -COOR, worin R eine C&sub1;-C&sub3; -Alkylgruppe ist. Reaktionsbedingungen für die Umsetzung solcher funktionellen Gruppen des Haptens, die durch X dargestellt sind, mit co-reaktiven funktionellen Gruppen einer fluoreszierenden Verbindung sind im Fachgebiet bestens bekannt.
- Normalerweise werden Kompetitiv-Bindungsimmunoassays entsprechend dem Verfahren der Erfindung verwendet, um das Vorhandensein und/oder die Menge von Dextropropoxyphen und/oder Nordextropropoxyphen in einer biologischen Probe nachzuweisen. Typischerweise werden Kompetitiv-Bindungsimmunoassays verwendet, um Liganden in einer Testprobe zu messen. Für die Zwecke dieser Veröffentlichung ist ein "Ligand" eine Substanz (Dextropropoxyphen und/oder Nordextropropoxyphen), die biologisch interessant ist, quantitativ durch eine Kompetitiv- Bindungsimmunoassay-Technik bestimmt zu werden. Der Ligand konkurriert mit einem markierten Reagenz (einem "Ligandanalogon" oder "Tracer"), um eine begrenzte Anzahl von Ligandbindungsstellen an Antikörpern, die für den Ligand und das Ligandanalogon spezifisch sind (hier Antikörper, die als Antwort auf ein Immunogen der Erfindung hergestellt wurden). Die Konzentration des Liganden in der Probe bestimmt die Menge des Ligandanalogons, die an den Antikörper gebunden wird, und die Menge des Ligandanalogons, die an den Antikörper gebunden wird, ist umgekehrt proportional zu der Konzentration des Liganden in der Probe, da der Ligand und das Ligandanalogon jeweils im Verhältnis der entsprechenden Konzentrationen an den Antikörper gebunden werden.
- In einer Ausführung der Erfindung werden Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay(FPIA)-Techniken für den Nachweis der Menge an Tracer-Antikörper-Konjugat verwendet, die in einem Kompetitiv-Bindungsimmunoassay gebildet wird. Solche Verfahren basieren auf dem Prinzip, dass eine fluoreszierend markierte Verbindung, wenn sie durch linear polarisiertes Licht angeregt wird, Fluoreszenz emittiert, deren Polarisationsgrad umgekehrt proportional zu ihrer Rotationsrate ist. Wenn dementsprechend ein Tracer-Antikörper-Konjugat, das fluoreszierend markiert ist, mit linear polarisiertem Licht angeregt wird, bleibt das emittierte Licht stark polarisiert, da das Fluorophor zwischen der Zeit, in der Licht absorbiert und emittiert wird, von der Rotation abgehalten wird. Im Gegensatz hierzu ist, wenn ein ungebundener Tracer durch linear polarisiertes Licht angeregt wird, dessen Rotation viel schneller als die des entsprechenden Tracer-Antikörper-Konjugats und die Moleküle werden mehr zufällig orientiert. Als ein Ergebnis ist das von den ungebundenen Tracermolekülen emittierte Licht depolarisiert.
- Konkreter enthält ein bevorzugtes FPIA-Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Nachweis des Vorhandenseins oder der Menge von Dextropropoxyphen und/oder Nordextropropoxyphen in einer Probe folgende Schritte: (a) Probe in Kontakt bringen mit: (1) einem Antiserum, das monoklonale oder polyklonale, typischerweie polyklonale, Antikörper enthält, die als Antwort auf ein Immunogen der Erfindung gebildet wurden; und (2) mit einem fluoreszierenden Tracer der Erfindung, der eine nachweisbare Fluoreszenzpolarisationsantwort als Reaktion auf das Vorhandensein des Antiserums hervorrufen kann; (b) Hindurchleiten von linear polarisiertem Licht durch die resultierende Lösung aus Schritt (a), um eine Fluoreszenzpolarisationsantwort zu erhalten; und (c) Bestimmung der Fluoreszenzpolarisationsantwort der Lösung von Schritt (b) als Maß für das Vorhandensein oder die Menge von Dextropropoxyphen und/oder Nordextropropoxyphen in der Probe. Durch Konstanthalten der Konzentration des fluoreszierenden Tracers und Antikörpers ist das Verhältnis des Dextropropoxyphen- und/oder Nordextropropoxyphen-Antikörper- Komplexes zum fluoreszierenden Tracer-Antikörper-Komplex, der gebildet wird, direkt proportional zu der Menge von Dextropropoxyphen und/oder Nordextropropoxyphen in der Probe. Durch Anregen des Gemischs mit linear polarisiertem Licht und Messen der Polarisation (in Millipolarisationseinheiten) der Fluoreszenz, die von einem fluoreszierenden Tracer und einem fluoreszierenden Tracer-Antikörper-Komplex emittiert wird, kann man die Menge von Dextropropoxyphen und/oder Nordextropropoxyphen in der Probe quantitativ oder dessen Vorhandensein qualitativ bestimmen. Die Ergebnisse können in Form von Nettomillipolarisationseinheiten und Spanne (in Millipolarisationseinheiten) quantifiziert werden. Die Messung der Nettomillipolarisationseinheiten zeigt die maximale Polarisation an, wenn eine maximale Menge des fluoreszierenden Tracers an den Antikörper gebunden ist, in Abwesenheit von Dextropropoxyphen und/oder Nordextropropoxyphen. Je höher die Nettomillipolarisationswerte sind, umso besser ist der Tracer am Antikörper gebunden. Die Assayspanne ist die Differenz zwischen den Nettomillipolaristionswerten, die erhalten werden, wenn die maximale Menge Tracer in Abwesenheit von Dextropropoxyphen und/oder Nordextropropoxyphen gebunden ist, und der Nettomillipolarisation, die erhalten wird, wenn eine spezifische Menge Dextropropoxyphen und/oder Nordextropropoxyphen in der Probe vorhanden ist. Eine größere Spanne ermöglicht, dass mehr Millipolarisationseinheiten zwischen den einzelnen Kalibrierpunkten der für den Assay erzeugten Standardkurve angeordnet werden können, wodurch eine bessere Testgenauigkeit erhalten wird, was wiederum in einer besseren numerischen Analyse der erhaltenen Daten resultiert. Es ist wichtig festzustellen, dass die Spanne abhängig von der verwendeten Probengröße variiert, was wiederum die bevorzugte Kombination ändern kann.
- Fluoreszierende Tracer der vorliegenden Erfindung sind im wesentlichen optisch rein. Diese Tracer sind besonders vorteilhaft in Fällen, bei denen Antiseren auf der Basis von polyklonalen Antikörpern verwendet werden. Da Dextropropoxyphen im wesentlichen optisch rein im Körper vorliegt, wurde für die Verwendung von Tracern, die im wesentlichen optisch rein in Kombination mit Antikörpern sind, die von im wesentlich optisch reinen Immunogenen abgeleitet sind, festgestellt, dass damit in einem Dextropropoxyphen- und/oder Nordextropropoxyphen-Assay unter Verwendung von FPIA-Techniken innerhalb des gewählten dynamischen Bereichs ein verbessertes Signal ermöglicht wird.
- Ein resultierender Vorteil ist, dass FPTA-ASSays der vorliegenden Erfindung Empfindlichkeiten in der Größenordnung von 20,0 Nanogramm/Milliliter (ng/ml) Dextropropoxyphen und/oder Nordextropropoxyphen in der Probe erreichen können.
- Einige signifikante Leistungsmerkmale der am meisten bevorzugten Kombination von fluoreszierendem Tracer der vorliegenden Erfindung und Immunogen der vorliegenden Erfindung, sind: (1) das hohe Maß an Spezifität der Antikörper, die als Antwort auf das Immunogen erzeugt werden, für Dextropropoxyphen und/oder Nordextropropoxyphen, und (2) die minimale Kreuzreaktivität dieser Antikörper mit potentiellen Störkomponenten.
- Der pH-Wert, bei dem ein FPIA-Verfahren der vorliegenden Erfindung ausgeführt wird, muss ausreichend sein, damit die Fluorescein-Komponente des fluoreszierenden Tracers in ihrer offenen Form vorliegen kann. Der pH kann von etwa 3 bis 12 reichen, und liegt normalerweise im Bereich von etwa 5 bis 10 und am besten im Bereich von etwa 6 bis 9. Verschiedene Puffer können verwendet werden, um den pH während des FPIA-Verfahrens einzustellen und zu halten. Repräsentative Puffer sind Borat, Phosphat, Carbonat, Tris, Barbital, Citrat usw. Der im einzelnen eingesetzte Puffer ist für die vorliegende Erfindung nicht entscheidend, aber der Tris-, Phosphat- und Citratpuffer werden bevorzugt. Der Kationenanteil des Puffers bestimmt im allgemeinen den Kationenanteil des Tracersalzes in Lösung. Riboflavinbindendes Protein (RBP) wird zu der Probe oder zu einem oder mehreren der Assayreagenzien hinzugegeben, um jegliches in der Probe vorhandenes Riboflavin in RBP-Riboflavin- Komplexen zu binden und damit potentielle Fluoreszenzbeeinträchtigung zu eliminieren. RBP ist ein Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 32.000, das von Eiweißen isoliert wird. Nach der Isolierung vom Ei enthält jedes RBP- Molekül ein Molekül Riboflavin. Daher muss die Holoproteinform von RBP durch Dialyse unter sauren Bedingungen in die Apoproteinform umgewandelt werden, um das gebundene Riboflavin zu entfernen. Ein RBP-Apoprotein, das in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, ist kommerziell erhältlich von Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri. Die verwendete Menge ist nicht entscheidend, vorausgesetzt, dass eine ausreichende Menge verwendet wird, um das gesamte freie Riboflavin in der Probe zu binden.
- Ein Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay der vorliegenden Erfindung ist ein "homogener Assay", d. h. die Endablesung der Polarisation erfolgt von einer Lösung, in der gebundener Tracer nicht von ungebundenem Tracer getrennt ist. Das ist ein deutlicher Vorteil gegenüber heterogenen Immunoassayverfahren wie jenen, bei denen gebundener Tracer von umgebundenem Tracer abgetrennt werden muss, bevor eine Ablesung erfolgen kann. Zu den Reagenzien des Fluoreszenzpolarisationsassays der vorliegenden Erfindung gehören: (I) polyklonale oder monoklonale, typischerweise polyklonale, Antikörper für Dextropropoxyphen, und (2) fluoreszierendes Tracerreagenz.
- Andere, weitgehend konventionelle Lösungen einschließlich Vorbehandlungslösung, Verdünnungspuffer, Dextropropoxyphenkalibrierer und Dextropropoxyphenkontrollproben werden nach Wunsch hergestellt. Typische Lösungen dieser Reagenzien, von denen einige weiter unten beschrieben werden, sind kommerziell in Assay"kits" von Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois, erhältlich.
- Alle hier angegebenen Anteile gelten für Masse/Volumen, sofern nichts anderes angegeben ist. Die bevorzugten Reagenzien, Kalibratoren und Kontrollproben für einen bevorzugten Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay der vorliegenden Erfindung sind in Beispiel 7 zu finden.
- Das bevorzugte FPIA-Verfahren ist besonders ausgelegt, um in Zusammenhang mit dem Abbott TDx® Clinical Analyzer, dem Abbott TDxFLxTM oder dem Abbott ADx® Drugs of Abuse System verwendet zu werden, die alle von Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois, erhältlich sind. Die Kalibratoren, Kontrollproben oder unbekannten Proben werden direkt in die Probenvertiefung der TDx® -Probenkassette pipettiert. Einer der Vorteile dieses Verfahrens ist, dass die Probe keine besondere Vorbereitung erfordert. Das Assayverfahren ist von dieser Stelle an voll automatisiert.
- Wenn ein manueller Assay durchgeführt werden soll, wird die Probe mit einer Vorbehandlungslösung in Verdünnungspuffer gemischt und eine Hintergrundablesung vorgenommen. Der Fluoreszenztracer wird danach mit der Probe gemischt. Der Antikörper wird dann zuletzt in die Testlösung gemischt. Nach Inkubation erfolgt eine Ablesung der Fluoreszenzpolarisation. Der Fluoreszenzpolarisationswert für jeden Kalibrator, jede Kontrollprobe und jede Probe wird bestimmt und auf dem Ausgabeband eines Meßgerätes ausgedruckt, z. B. dem Abbott TDx® Analyzer, TDxFLxTM oder dem ADx® System. Eine Standardkurve wird im Messgerät durch Auftragen der Polarisation für jeden Kalibrator über dessen Konzentration unter Verwendung einer nichtlinearen Regressionsanalyse erzeugt. Die Konzentration jeder Kontrollprobe oder Probe wird von der gespeicherten Kalibrierkurve abgelesen und auf dem Ausgabeband ausgedruckt. In Bezug auf das vorhergehende bevorzugte Verfahren sollte beachtet werden, dass Tracer, Antikörper, Vorbehandlungslösung, Waschlösung, Kalibratoren und Kontrollproben zwischen etwa 2ºC und 8ºC aufzubewahren sind, während der Verdünnungspuffer bei Raumtemperatur aufbewahrt werden sollte. Eine Standardkurve und Kontrollproben sollten alle zwei Wochen ermittelt werden, wobei jeder Kalibrator und jede Kontrollprobe zweifach gemessen werden sollte. Alle Proben können zweifach gemessen werden.
- Die folgenden Beispiele dienen dazu, Ausführungen der Erfindung ausführlicher darzustellen, und sind nicht als Beschränkung für den Schutzumfang der Erfindung aufzufassen.
- Die folgenden allgemeinen experimentellen Verfahren wurden zur Herstellung der Haptene der folgenden Beispiele verwendet.
- Dieses Beispiel illustriert die Herstellung von (2S,3R)-4- Dimethylamino-1,2-diphenyl-3-methylbutan-2-ol, entsprechend Formel (I) unten, für die Verwendung in der Herstellung von Haptenen und Tracern der Erfindung.
- Zu einer gekühlten (0ºC) Suspension von 200 Milligramm (mg, 0,53 mmol) Dextropropoxyphenhydrochlorid in 3,0 Milliliter (ml) wasserfreiem Tetrahydrofuran (THF) wurden 22 mg (0,59 mmol) Lithiumaluminiumhydrid hinzugegeben. Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur erwärmt und 4 Stunden (h) gerührt. Die Reaktion wurde dann mit Wasser abgelöscht, mit 2 molarer (M) wässriger Kaliumhydroxidlösung basisch gestellt und 3 mal mit 10 ml Aliquoten Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden über MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und zu 164 mg eines klaren, farblosen Öls von (2S,3R)-4-Dimethylamino-1,2-diphenyl- 3-methylbutan-2-ol eingeengt, was ohne weitere Reinigung weiter verwendet wurde.
- Dieses Beispiel illustriert die Herstellung von (2S,3R)-4- Dimethylamino-1,2-diphenyl-3-methyl- 2-(ethoxycarbonylmethylaminocarbonyloxy)butan, entsprechend Formel (II) unten.
- Eine Lösung von 127 mg (0,45 mmol) des klaren farblosen Öls (des Alkohols), das unmittelbar oben hergestellt wurde, in einer Mischung aus 1,0 ml Benzol und 1,0 ml Toluol wurde fraktionell destilliert, und nur 1,0 ml Destillat wurde gesammelt. Die verbleibende Lösung wurde gekühlt und 0,15 ml (1,34 mmol) Ethylisocyanatacetat, OCN-CH&sub3;COOCH&sub2;CH&sub3;, wurden hineingespritzt. Die resultierende Lösung wurde 1 Stunde am Rückflusskühler erhitzt, gekühlt und mit 2 Tropfen Wasser abgelöscht. Das resultierende Gemisch wurde auf einem Rotationsverdampfer eingeengt und direkt chromatographiert auf einer 1 · 18 Zentimeter (cm) Säule aus Silicagel, gepackt mit Chloroform und eluiert mit 50 ml Aliquoten von Lösungen mit 2 Vol-%, 6 Vol-% bzw. 10Vol-% Methanol in Chloroform. Insgesamt 269 mg eines klaren, farblosen Öls des Esters (2S,3R)-4-Dimethylamino-1,2-diphenyl-3- methyl-2-(ethoxycarbonylmethylaminocarbonyloxy)butan wurden erhalten.
- Dieses Beispiel illustriert die Herstellung von (2S,3R)-4- Dimethylamino-1,2-diphenyh-3-methyl- 2-(carboxymethylaminocarbonyloxy)butan, entsprechend Formel (III) unten, einem Hapten der Erfindung.
- Kaliumhydroxid (24 mg, 0,43 mmol) wurde zu einer Lösung von 118 mg (0,29 mmol) des klaren farblosen Öls des Esters (hergestellt in Beispiel 2 oben) in einem Gemisch aus 0,75 ml Tetrahydrofuran und 0,75 ml Wasser hinzugegeben. Die Lösung wurde 12 h bei Raumtemperatur gerührt, auf pH 7 angesäuert und eingeengt. Das Konzentrat wurde erneut in Methanol gelöst und die Lösung auf zwei 0, 50 Millimeter (mm) · 20 cm · 20 cm Platten aufgestreift, die mit einer 30 Vol-% Lösung von Methanol in Chloroform (Methanol/Chloroform) entwickelt wurden. Das Produkt wurde von der pulverisierten abgeschabten Bande mit 80% Methanol/Chloroform eluiert und zu 50 mg eines weißen Feststoffs der Säure (2S,3R)-4-Dimethylamino-1,2-diphenyl-3-methyl- 2-(carboxymethylaminocarbonyloxy)butan eingeengt.
- Dieses Beispiel illustriert die Herstellung von (2S,3R)-4- Dimethylamino-1,2-diphenyl-3-methyl-2-(5- fluoresceinylaminocarbonylmethylaminocarbonyloxy)butan, entsprechend Formel (IV) unten, einem Tracer der Erfindung.
- Zu einer gekühlten (0ºC) Lösung von 3,6 mg (9,3 Mikromol, umol) der weißen festen Säure aus Beispiel 3 oben, in 100 Mikroliter (ul) Dimethylformamid, wurden 1,2 ul (9,3 umol) Isobutylchlorameisensäureester hinzugegeben. Die resultierende Lösung wurde 1 Stunde gerührt, auf Raumtemperatur erwärmen gelassen und dann wieder auf 0ºC abgekühlt. 5-Fluoresceinamin (3,2 mg, 9,3 umol) wurden dann hinzugegeben und die resultierende Lösung 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde eingeengt, wieder in Methanol gelöst und auf 0,25 mm · 20 cm · 20 cm Platten aufgestreift. Entwicklung mit 20% Methanol/Chloroform und Elution der pulverisierten Bande mit 80% Methanol/Chloroform lieferte 8,1 mg eines orangefarbenen Feststoffs. Dieser Feststoff wurde auf einer weiteren 0,25-mm- Platte erneut chromatographiert unter Elution mit 70 : 30 : 2 Chloroform : Methanol : Eisessig. Die Bande wurde pulverisiert und mit 80% Methanol/Chloroform eluiert und lieferte 32 mg eines orangefarbenen Feststoffs. Dieser Feststoff wurde wieder zweimal auf weiteren 0,25-mm-Platten chromatographiert, mit jeweils 50% Methanol/Chloroform entwickelt, und jede pulverisierte Bande wurde mit 80 : 20 : 1 Methanol: Chloroform : konz. Ammoniumhydroxid eluiert. 4,5 mg eines orangefarbenen Feststoffs von (2S,3R)-4- Dimethylamino-1,2-diphenyl-3-methyl-2-(5- fluoresceinylaminocarbonylmethylaminocarbonyloxy)butan wurden nach der Endreinigung erhalten.
- Dieses Beispiel illustriert die Herstellung von (2S,3R)-4- Dimethylamino-1,2-diphenyl-3-methyl-2-[1-(but-4- enyl)carbonyloxy]butan, entsprechend Formel (V) unten, einer Vorstufe zur Herstellung eines Haptens der Erfindung.
- Eine Lösung von 153 mg (0,54 mmol) des klaren farblosen Öls (des Alkohols), das in Beispiel 1 oben hergestellt wurde, in einem Gemisch aus 1,0 ml Benzol und 1,0 ml Toluol wurde fraktionell destilliert und nur 1,0 ml des Destillats wurden gesammelt. Die verbleibende Lösung wurde auf Raumtemperatur gekühlt, und eine Lösung von 1,00 mmol 4-Pentenoylchlorid in Benzol wurde hinzugegeben. Das resultierende Gemisch wurde allmählich erwärmt; das Benzol wurde durch Destillation entfernt und das verbleibende Gemisch 2 Stunden am Rückflusskühler erhitzt. Der Niederschlag, der sich bildete, wurde filtriert und mit 2 ml Toluol gewaschen. Die vereinigten Filtrate und Waschlösungen wurden in Chloroform verdünnt, mit 2 M Kaliumhydroxidlösung extrahiert, über MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und eingeengt. Der resultierende Olefinester wurde ohne weitere Reinigung verwendet.
- Dieses Beispiel illustriert die Herstellung von (2S,3R)-4- Dimethylamino-1,2-diphenyl-3-methyl-2-[1-(propan-3- al)carbonyloxy]butan, entsprechend Formel (VI) unten, eines Haptens der Erfindung.
- Zu einer gekühlten (0ºC) Lösung von 40 mg (0,11 mmol) des Olefinesters, hergestellt in Beispiel 5 oben, in 0,50 ml Dichlormethan wurden 50 ul Trifluoressigsäure hinzugegeben. Das resultierende Gemisch wurde nach Erwärmung auf Raumtemperatur 5 Minuten gerührt, eingeengt und erneut in 5,0 ml Methanol gelöst. Die resultierende Lösung wurde ozonisiert, bis sich eine blaue Farbe anhielt. Überschüssiges Ozon wurde durch Hindurchleiten eines Argonstroms entfernt, und. die resultierende farblose Reaktionsmischung wurde mit 0,10 ml Dimethylsulfid abgelöscht. Das Reaktionsgemisch wurde langsam (über einen Zeitraum von etwa 1 h) auf Raumtemperatur angewärmt und eingeengt, um 69 mg eines schwachgelben Öls des Haptens, (2S,3R)-4-Dimethylamino-1,2- diphenyl-3-methyl-2-[1-(propan-3-al)carbonyloxy]butan zu liefern. Das Hapten wurde an ein Protein konjugiert zur Bildung eines Immunogens der Erfindung entsprechend dem Verfahren, das in Beispiel 7 unten beschrieben ist.
- Dieses Beispiel illustriert die Herstellung eines Immunogens der Erfindung, das durch Formel (VII) unten illustriert wird, in der BTG für eine Rinderthyroglobulinkomponente steht, die über eine Amidbindung an den Rest der Verbindung angelagert ist.
- (a) Eine Menge von 53,0 mg des Haptens (VI) aus Beispiel 6 wurde zu 1,0 ml deionisiertem Wasser und 0,5 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) hinzugegeben. Ein Volumen von 0,750 ml (mit 26,5 mg Hapten) der resultierenden Lösung wurde zu 10,4 ml einer Lösung von Rinderthyroglobulin (mit 10 mg/ml Thyroglobulin und 0,05 molarem (M) Natriumphosphat und einem pH von 7,0) zugegeben und das Gemisch 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Fünf Zugaben von je 50 mg Natriumcyanotetrahydridoborat wurden in Abständen von 2 Stunden zwischen den jeweiligen Zugaben zu dem resultierenden Gemisch hinzugegeben, wobei der pH des Gemischs mit 0,1 normaler (N) HCl auf etwa 7,0 vor jeder Zugabe eingestellt wurde. Nach der letzten Zugabe von Natriumcyanotetrahydridoborat wurde das Gemisch 2 Stunden gerührt. Als nächstes wurde das Gemisch in einer Cellulosedialysierhülse gegen 0,05 M Natriumphosphat bei pH = 7,5 36 Stunden lang dialysiert, wobei das Dialysat viermal ausgetauscht wurde. Nach der Dialyse wurde das Gemisch in Sorvall bei 10.000 Umdrehungen pro Minute (rpm) 10 Minuten zentrifugiert. Für den Überstand wurde mit dem Lowry- Proteinkonzentrationsbestimmungsverfahren ermittelt, dass er 9,78 mg/ml Protein enthält.
- (b) Antiseren wurden von dem Immunogen von Teil (a) unmittelbar oben hergestellt und in Fluoreszenzpolarisationsimmunoassays (FPIAs) verwendet, die auf die Bestimmung von Propoxyphen in Urinproben ausgerichtet sind.
- Die Konfiguration der Reagenzien, Kalibratoren und Kontrollproben für die FPIAs sind folgendermaßen:
- (c) Die Tracer-Formulierung ist 100 nanomolarer Tracer in: 0,1 molarem Natriumphosphatpuffer mit pH = 6,3, 0,01 Prozent Rindergammaglobulin, 5 Prozent 5-Sulfosalicylat und 0,1 Prozent Natriumazid.
- (d) Die Antiserum-Formulierung enthält Schafserum verdünnt mit: 0,1 molarem Trispuffer mit pH = 7,5, 2 Prozent Ethylenglykol, 0,1 Prozent Natriumazid und 0,05 Prozent Rindergammaglobulin.
- (e) Die Vorbehandlungslösung besteht aus 0,1 molarem Trispuffer mit pH = 7,5, 0,01 Prozent Rindergammaglobulin, 0,1 Prozent Natriumazid und 4 mg/ml Riboflavinbindendes Protein.
- (f) Die Waschlösung besteht aus: 0,1 molarem Natriumphosphatpuffer mit pH = 7,5, 0,1 Prozent Natriumazid und 0,01 Prozent Rindergammaglobulin.
- (g) Der Verdünnungspuffer besteht aus: 0,1 molarem Natriumphosphatpuffer mit pH = 7,5, 0,1 Prozent Natriumazid und 0,01 Prozent Rindergammaglobulin.
- (h) Der Kalibrator-/Kontrollprobenverdünner besteht aus: normalem Humanurin und 0,1 Prozent Natriumazid.
- (i) Propoxyphenkalibratoren bestehen aus Propoxyphen in behandeltem normalen Humanurin bei Konzentrationen von 0,0, 150,0, 300,0, 500,0, 1000,0 und 1500,0 Nanogramm pro Milliliter.
- (j) Propoxyphenkontrollproben bestehen aus: Propoxyphen in behandeltem normalen Humanurin bei Konzentrationen von 200,0, 400,0 und 900,0 Nanogramm pro Milliliter.
- (k) Die Assays verwendeten eine Sechs-Punkte-Kalibrierkurve mit Dextropropoxyphen als Kalibrator. Die Kalibrierkurve hat eine Mindeststabilität von 2 Wochen und erstreckt sich von 0,0 ng/ml bis 1500,0 ng/ml. Die Assays haben eine Empfindlichkeit von 20,0 ng/ml. Die Empfindlichkeit ist definiert als die geringste messbare Konzentration, die mit 95 Prozent Vertrauensbereich von null unterschieden werden kann.
- Die Reproduzierbarkeit des TDx®-Messgeräts wurde an zehn verschiedener Tagen über einen Zeitraum von zwei Wochen durch Testen von je fünf Wiederholungen von Dextropropoxyphen in Humanurin bei 200, 400 und 900 ng/ml bestimmt. Die Konzentration wurde jeweils aus einer einzelnen Standardkurve bestimmt, die am ersten Tag der Studie erstellt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 unten zusammengefasst. Tabelle 1
- Die Reproduzierbarkeit des ADx®-Messgeräts wurde über fünfzehn verschiedene Läufe, in Kombination, Batch- und Panelmodus, durch Prüfen von je vier Wiederholungen von Dextropropoxyphen in Humanurin bei 200, 400 und 900 ng/ml bestimmt. Die Konzentration wurde jeweils aus einer Standardkurve bestimmt, die zweifach am ersten Tag der Studie erstellt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 unten zusammengefasst. Tabelle 2
- Zwei Sätze von Kalibratoren und Kontrollproben wurden durch Zugabe bekannter Mengen Dextropropoxyphen zu Humanurin und X Systems Verdünnungspuffer mit Konzentrationen von 150, 200, 300, 400, 500, 900, 1000 und 1500 ng/ml hergestellt. Eine Kalibrierung wurde mit Urinkalibratoren durchgeführt und beide Sätze der Kalibratoren bezüglich dieser Kalibrierung untersucht. In der folgenden Tabelle 3 entspricht "% Wiedergewinnung" dem Wert 100 · (gemessene Konzentration in Puffer dividiert durch gemessene Konzentration in Urin). Tabelle 3 Wiedergewinnung
- Verschiedene Testverbindungen wurden mit dem Dextropropoxyphenassay untersucht (um die Kreuzreaktivität zu bestimmen), nachdem eine bekannte Menge Testverbindung zu wirkstofffreiem Humanurin hinzugegeben wurde. In den folgenden Tabellen 4 und 5 entspricht "% Kreuzreaktivität" dem Wert 100 · ("Gefundene Konzentration" dividiert durch "Zugesetzte Konzentration"). Die Kreuzreaktivität wurde für Nordextropropoxyphen (N-Norpropoxyphen) untersucht. Die Ergebnisse für Dextropropoxyphen sind in Tabelle 4 unten zusammengefasst. Von den Ergebnissen aus Tabelle 4 ist ersichtlich, dass die Erfindung Immunoassays bereitstellen kann, die eine vorteilhaft hohe Kreuzreaktivität für Nordextropropoxyphen (NDP) aufweisen. Tabelle 4
- Die Kreuzreaktivitäten wurden ebenso für Verbindungen (Störkomponenten) gemessen, die eine ähnliche chemische Struktur aufweisen oder gleichzeitig von Menschen verwendet werden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengefasst. In Tabelle 5 bedeutet "ND*" "None Detected (Nichts nachgewiesen)", was bedeutet, dass die Konzentration kleiner als die Empfindlichkeit des Assays ist. Aus Tabelle 5 ist ersichtlich, dass die Erfindung Immunoassays bereitstellen kann, die eine vorteilhaft geringe Kreuzreaktivität für potentielle Störkomponenten aufweisen. Tabelle 5 Kreuzreaktivität / Störkomponenten
Claims (27)
1. Ein im wesentlichen optisch reines Hapten, das für die
Produktion von Antikörpern und Tracern nützlich ist, die in
einem Immunoassay für Dextropropoxyphen und/oder
Nordextropropoxyphen nützlich sind, und wobei das Hapten der
Formel (IX) entspricht:
worin
Z gleich -NH- ist;
X gleich -CHO, -COOH, -NH&sub2; oder -COOR ist, worin R eine C&sub1;-C&sub3;
-Alkylgruppe ist;
m gleich 0 oder 1 ist; und
n eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist.
2. Das Hapten nach Anspruch 1, worin m = 0 und n = 3 ist.
3. Das Hapten nach Anspruch 2, worin X gleich -CHO ist.
4. Immunogen, das von einem im wesentlichen optisch reinen
Hapten abgeleitet ist und in der Lage ist, Antikörper zu bilden,
die in einem Immunoassay für Dextropropoxyphen und/oder
Nordextropropoxyphen nützlich sind, und wobei das Immunogen der
Formel (X) entspricht:
worin
Z gleich -NH- ist;
Y gleich -NH-, -(CO)NH- oder -NH(CO)- ist;
m gleich 0 oder 1 ist;
n eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist; und
A eine Antigenität-verleihende Trägerkomponente ist.
5. Das Immunogen nach Anspruch 4, worin m = 0 und n = 3 ist.
6. Das Immunogen nach Anspruch 5, worin Y gleich -NH- ist.
7. Das Immunogen nach Anspruch 4, worin die
Antigenitätverleihende Trägerkomponente eine Poly(aminosäure) ist.
8. Das Immunogen nach Anspruch 4, worin die
Antigenitätverleihende Trägerkomponente Rinderthyroglobulin ist.
9. Ein Antiserum, das als Antwort auf ein Immunogen
gebildet wird, das von einem im wesentlichen optisch reinen
Hapten abgeleitet ist, und das in einem Immunoassay für
Dextropropoxyphen und/oder Nordextropropoxyphen nützlich ist,
und wobei das Immunogen der Formel (X) entspricht:
worin
Z gleich -NH- ist;
Y gleich -NH-, - (CO) NH- oder -NH (CO) - ist;
m gleich 0 oder 1 ist;
n eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist; und
A eine Antigenität-verleihende Trägerkomponente ist.
10. Das Antiserum nach Anspruch 9, worin m = 0 und n = 3 ist.
11. Das Antiserum nach Anspruch 10, worin Y gleich -NH-
ist.
12. Das Antiserum nach Anspruch 9, worin die
Antigenitätverleihende Trägerkomponente eine Poly(aminosäure) ist.
13. Das Antiserum nach Anspruch 9, worin die
Antigenitätverleihende Trägerkomponente Rinderthyroglobulin ist.
14. Ein fluoreszierender Tracer, der von einer im
wesentlichen optisch reinen Verbindung abgeleitet ist, und der
in einem Immunoassay für Dextropropoxyphen und/oder
Nordextropropoxyphen nützlich ist und der Formel (XI)
entspricht:
worin
Z gleich -NH- ist;
Y gleich -NH-, -(CO)NH- oder -NH(CO)- ist;
m gleich 0 oder 1 ist;
n eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist; und
FL eine Fluoreszenz-verleihende Komponente ist.
15. Der fluoreszierende Tracer nach Anspruch 14, worin m = 1
und n = 1 ist.
16. Der fluoreszierende Tracer nach Anspruch 15, worin Y
gleich -(CO)NH- ist.
17. Der fluoreszierende Tracer nach Anspruch 14, worin die
Fluoreszenz-verleihende Komponente ein monovalenter Rest von
Fluorescein oder ein monovalenter Rest eines Fluorescein-
Derivats ist.
18. Ein verbesserter Immunoassay für den Nachweis des
Vorhandenseins oder der Menge von Dextropropoxyphen und/oder
Nordextropropoxyphen in einer Probe, der einen Schritt enthält,
bei dem die Probe mit Antikörpern in Kontakt gebracht wird, die
als Antwort auf ein Immunogen aufgezogen wurden, und worin die
Verbesserung umfaßt, daß als Immunogen ein Immunogen verwendet
wird, das von einem im wesentlichen optisch reinen Hapten
abgeleitet ist, und das Immunogen der Formel (X) entspricht:
worin
Z gleich -NH- ist;
Y gleich -NH-, -(CO)NH- oder -NH(CO)- ist;
m gleich 0 oder 1 ist;
n eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist; und
A eine Antigenität-verleihende Trägerkomponente ist.
19. Der verbesserte Immunoassay nach Anspruch 18, worin Y
gleich -NH-, m = 0 und n = 3 ist.
20. Der verbesserte Immunoassay nach Anspruch 19, worin die
Antigenität-verleihende Trägerkomponente eine Poly(aminosäure)
ist.
21. Der verbesserte Immunoassay nach Anspruch 19, worin die
Antigenität-verleihende Trägerkomponente Rinderthyroglobulin
ist.
22. Ein Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay für den
Nachweis des Vorhandenseins oder der Menge von Dextropropoxyphen
und/oder Nordextropropoxyphen in einer Probe, der einen Schritt
enthält, bei dem die Probe mit Antikörpern in Kontakt gebracht
wird, die als Antwort auf ein Immunogen aufgezogen wurden, das
von einem im wesentlichen optisch reinen Hapten abgeleitet
wurde, und wobei das Immunogen der Formel (X) entspricht:
worin
Z gleich -NH- ist;
Y gleich -NH-, -(CO)NH- oder -NH(CO)- ist;
m gleich 0 oder 1 ist;
n eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist; und
A eine Antigenität-verleihende Trägerkomponente ist.
23. Der Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay nach Anspruch
22, der einen Schritt enthält, bei dem die Probe mit einem
fluoreszierenden Tracer in Kontakt gebracht wird, der von einer
im wesentlichen optisch reinen Verbindung abgeleitet ist, und
wobei der Tracer der Formel (XI) entspricht:
worin
Z gleich -NH- ist;
Y gleich -NH-, -(CO)NH- oder -NH(CO)- ist;
m gleich 0 oder 1 ist;
n eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist; und
FL eine Fluoreszenz-verleihende Komponente ist.
24. Der Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay nach Anspruch
23, worin für den Tracer m = 1 und n = 1 ist.
25. Der Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay nach Anspruch
24, worin für den Tracer Y gleich -(CO)NH- ist.
26. Der Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay nach Anspruch
23, worin die Fluoreszenz-verleihende Komponente ein
monovalenter Rest von Fluorescein oder ein monovalenter Rest
eines Fluorescein-Derivats ist.
PATENTANSPRÜCHE
1. Ein verbesserter Immunoassay für den Nachweis des
Vorhandenseins oder der Menge von Dextropropoxyphen und/oder
Nordextropropoxyphen in einer Probe, der einen Schritt enthält,
bei dem die Probe mit Antikörpern in Kontakt gebracht wird, die
als Antwort auf ein Immunogen aufgezogen wurden, und worin die
Verbesserung darin besteht, dass als Immunogen ein Immunogen
verwendet wird, das von einem im wesentlichen optisch reinen
Hapten abgeleitet ist, und das Immunogen der Formel (X)
entspricht:
worin
Z gleich -NH- ist;
Y gleich -NH-, -(CO)NH- oder -NH(CO)- ist;
m gleich 0 oder 1 ist;
n eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist; und
A eine Antigenität-verleihende Trägerkomponente ist.
2. Der verbesserte Immunoassay nach Anspruch 1, worin Y
gleich -NH-, m = 0 und n = 3 ist.
3. Der verbesserte Immunoassay nach Anspruch 2, worin die
Antigenität-verleihende Trägerkomponente eine Poly(aminosäure)
ist.
4. Der verbesserte Immunoassay nach Anspruch 2, worin die
Antigenität-verleihende Trägerkomponente Rinderthyroglobulin
ist.
5. Ein Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay für den Nachweis
des Vorhandenseins oder der Menge von Dextropropoxyphen und/oder
Nordextropropoxyphen in einer Probe, der einen Schritt enthält,
bei dem die Probe mit Antikörpern in Kontakt gebracht wird, die
als Antwort auf ein Immunogen aufgezogen wurden, das von einem
im wesentlichen optisch reinen Hapten abgeleitet wurde, und
wobei das Immunogen der Formel (X) entspricht:
worin
Z gleich -NH- ist;
Y gleich -NH-, -(CO)NH- oder -NH(CO)- ist;
m gleich 0 oder 1 ist;
n eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist; und
A eine Antigenität-verleihende Trägerkomponente ist.
6. Der Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay nach Anspruch 5,
der einen Schritt enthält, bei dem die Probe mit einem
fluoreszierenden Tracer in Kontakt gebracht wird, der von einer
im wesentlichen optisch reinen Verbindung abgeleitet ist, und
der Tracer der Formel (XI) entspricht:
worin
Z gleich -NH- ist;
Y gleich -NH-, -(CO)NH- oder -NH(CO)- ist;
m gleich 0 oder 1 ist;
n eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist; und
FL eine Fluoreszenz-verleihende Komponente ist.
7. Der Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay nach Anspruch 6,
worin für den Tracer m = 1 und n = 1 ist.
8. Der Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay nach Anspruch 7,
worin für den Tracer Y gleich -(CO)NH- ist.
9. Der Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay nach Anspruch 6,
worin die Fluoreszenz-verleihende Komponente ein monovalenter
Rest von Fluorescein oder ein monovalenter Rest eines
Fluorescein-Derivats ist.
10. Verwendung eines Immunogens, das von einem im
wesentlichen optisch reinen Hapten abgeleitet ist, zur Bildung
von Antiserum, das in einem Immunoassay für Dextropropoxyphen
und/oder Nordextropropoxyphen nützlich ist, und das Immunogen
der Formel (X) entspricht:
worin
Z gleich -NH- ist;
Y gleich -NH-, -(CO)NH- oder -NH(CO)- ist;
m gleich 0 oder 1 ist;
n eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist; und
A eine Antigenität-verleihende Trägerkomponente ist.
11. Die Verwendung eines Immunogens nach Anspruch 10, worin
m = 0 und n = 3 ist.
12. Die Verwendung eines Immunogens nach Anspruch 11, worin
Y gleich -NH- ist.
13. Die Verwendung eines Immunogens nach Anspruch 10, worin
die Antigenität-verleihende Trägerkomponente eine
Poly(aminosäure) ist.
14. Die Verwendung eines Immunogens nach Anspruch 10, worin
die Antigenität-verleihende Trägerkomponente Rinderthyroglobulin
ist.
15. Ein Verfahren zum Herstellen eines Immunogens, mit dem
Antikörper gebildet werden können, die in einem Immunoassay für
Dextropropoxyphen und/oder Nordextropropoxyphen nützlich sind,
und wobei das Immunogen der Formel (X) entspricht:
worin
Z gleich -NH- ist;
Y gleich -NH-, -(CO)NH- oder -NH(CO)- ist;
m gleich 0 oder 1 ist;
n eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist; und
A eine Antigenität-verleihende Trägerkomponente ist,
und wobei das Verfahren den Schritt des kovalenten Anbindens
eines im wesentlichen optisch reinen Haptens an eine
Antigenität-verleihende Trägerkomponente umfaßt, wobei das
Hapten der Formel (IX) entspricht:
worin
Z, m und n wie oben definiert sind und
X gleich -CHO, -COOH, -NH&sub2; oder -COOR ist, worin R eine C&sub1;-C&sub3;
-Alkylgruppe ist.
16. Das Verfahren nach Anspruch 15, worin m = 0 und n = 3 ist.
17. Das Verfahren nach Anspruch 16, worin X im Hapten
gleich NH&sub2; ist und das Hapten an die Trägerkomponente gekoppelt
wird durch Bildung einer Amidbindung mit einer Carboxylgruppe an
dieser Trägerkomponente zur Bildung eines Immunogens nach Formel
(X) , worin Y gleich -NH- ist.
18. Das Verfahren nach Anspruch 15, worin die
Antigenitätverleihende Trägerkomponente eine Poly(aminosäure) ist.
19. Das Verfahren nach Anspruch 15, worin die
Antigenitätverleihende Trägerkomponente Rinderthyroglobulin ist.
20. Ein Verfahren zum Herstellen eines fluoreszierenden
Tracers, der in einem Immunoassay für Dextropropoxyphen und/oder
Nordextropropoxyphen nützlich ist und der Formel (XI)
entspricht:
worin
Z gleich -NH- ist;
Y gleich -NH-, -(CO)NH- oder -NH(CO)- ist;
m gleich 0 oder 1 ist;
n eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist; und
FL eine Fluoreszenz-verleihende Komponente ist,
wobei das Verfahren den Schritt des Anbindens eines im
wesentlichen optisch reinen Haptens an eine geeignete
fluoreszierende Komponente umfaßt, wobei das Hapten der Formel
(IX) entspricht:
worin
Z, m und n wie oben definiert sind und
X gleich -CHO, -COOH, -NH&sub2; oder -COOR ist, worin R eine C&sub1;-C&sub3;
-Alkylgruppe ist.
21. Das Verfahren nach Anspruch 20, worin m = 1 und n = 1 ist.
22. Das Verfahren nach Anspruch 21, worin X im Hapten
gleich -COOH ist und das Hapten an FL-NH&sub2; gekoppelt wird durch
Bildung einer Amidbindung zur Bildung eines Tracers nach Formel
(XI), worin Y gleich -(CO)NH- ist.
23. Das Verfahren nach Anspruch 20, worin die
Fluoreszenzverleihende Komponente ein monovalenter Rest von Fluorescein
oder ein monovalenter Rest eines Fluorescein-Derivats ist.
24. Ein Verfahren zum Herstellen eines im wesentlichen
reinen Haptens, das für die Bildung von Antikörpern und Tracern
nützlich ist, die in einem Immunoassay für Dextropropoxyphen
nützlich sind, und das Hapten der Formel (IX) entspricht:
worin
Z gleich -NH- ist;
X gleich -CHO, -COOH, -NH&sub2; oder -COOR ist, und worin R eine C&sub1;-C&sub3;
-Alkylgruppe ist;
m gleich 0 oder 1 ist; und n eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist,
und das Verfahren folgende Schritte umfaßt:
a) In-Kontakt-Bringen von Dextropropoxyphenhydrochlorid mit
einem Reduktionsmittel zur Bildung des entsprechenden Alkohols;
b) Behandeln des Alkohols aus Schritt (a) mit einem
Acylhalogenid- oder Isocyanatreagenz, das eine zweite
Funktionalität enthält, die aus folgendem gewählt ist:
(i) einem Ester zur Bildung einer Verbindung nach Formel (IX),
worin X gleich -COOR ist, oder
(ii) einem Olefin zur Bildung eines ungesättigten
Zwischenprodukts; und alternativ
c) Hydrolysieren der -COOR-Gruppe aus Schritt (b) zur Bildung
einer Verbindung nach Formel (IX), worin X gleich -COOH ist;
d) Behandeln des ungesättigten Zwischenprodukts aus Schritt (b)
mit einem Oxidationsmittel und dann Durchführen einer geeigneten
Reduktion zur Umwandlung des Zwischenprodukts in eine Verbindung
nach Formel (IX), worin X gleich -CHO ist, optional gefolgt von
einer reduktiven Aminierung zur Bildung einer Verbindung nach
Formel (IX), worin X gleich -NH&sub2; ist; oder
e) Behandeln des ungesättigten Isocyanatzwischenprodukts aus
Schritt (b) mit einem Spaltungsreagenz zur Bildung einer
Verbindung nach Formel (IX), worin m gleich 1 ist und X gleich
-COOH ist.
25. Das Verfahren nach Anspruch 1 zum Herstellen eines
Haptens, worin n = 3 ist, und wobei das Verfahren die Behandlung
des Alkohols aus Schritt (a) mit einem Acylhalogenid in Schritt
(b) umfasst.
26. Das Verfahren nach Anspruch 25, die Schritt (d) enthält
zur Bildung einer Verbindung nach Formel (IX), worin X gleich
-CHOist.
27. Das Verfahren nach Anspruch 24, worin das
Reduktionsmittel aus Schritt (a) Lithiumaluminiumhydrid,
Diisobutylaluminiumhydrid oder
bis-(Methoxyethoxy)aluminiumhydrid ist, vorzugsweise
Lithiumaluminiumhydrid.
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