DE69231060T2 - Haptene, tracer, immunogene und antikörper für immunassays für propoxyphen - Google Patents
Haptene, tracer, immunogene und antikörper für immunassays für propoxyphenInfo
- Publication number
- DE69231060T2 DE69231060T2 DE69231060T DE69231060T DE69231060T2 DE 69231060 T2 DE69231060 T2 DE 69231060T2 DE 69231060 T DE69231060 T DE 69231060T DE 69231060 T DE69231060 T DE 69231060T DE 69231060 T2 DE69231060 T2 DE 69231060T2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- immunogen
- formula
- hapten
- immunoassay
- antigenicity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 title claims description 45
- 229960004193 dextropropoxyphene Drugs 0.000 claims description 72
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 64
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 50
- IKACRWYHQXOSGM-UTKZUKDTSA-N norpropoxyphene Chemical compound C([C@](OC(=O)CC)([C@H](C)CNC)C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 IKACRWYHQXOSGM-UTKZUKDTSA-N 0.000 claims description 43
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 41
- 238000002875 fluorescence polarization Methods 0.000 claims description 25
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 24
- -1 poly(amino acid) Polymers 0.000 claims description 19
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 19
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 17
- QMQBBUPJKANITL-MYXGOWFTSA-N dextropropoxyphene hydrochloride Chemical compound [H+].[Cl-].C([C@](OC(=O)CC)([C@H](C)CN(C)C)C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 QMQBBUPJKANITL-MYXGOWFTSA-N 0.000 claims description 15
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 14
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 101000800130 Bos taurus Thyroglobulin Proteins 0.000 claims description 11
- 229920001308 poly(aminoacid) Polymers 0.000 claims description 9
- 239000012948 isocyanate Substances 0.000 claims description 8
- 125000006273 (C1-C3) alkyl group Chemical group 0.000 claims description 7
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 6
- 150000002513 isocyanates Chemical class 0.000 claims description 6
- 239000012280 lithium aluminium hydride Substances 0.000 claims description 5
- JRZJOMJEPLMPRA-UHFFFAOYSA-N olefin Natural products CCCCCCCC=C JRZJOMJEPLMPRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 150000001266 acyl halides Chemical class 0.000 claims description 4
- 150000001336 alkenes Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims description 4
- QLFNUXTWJGXNLH-UHFFFAOYSA-N bis(2-methoxyethoxy)alumane Chemical compound COCCO[AlH]OCCOC QLFNUXTWJGXNLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- SIPUZPBQZHNSDW-UHFFFAOYSA-N bis(2-methylpropyl)aluminum Chemical compound CC(C)C[Al]CC(C)C SIPUZPBQZHNSDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 claims description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 claims 1
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 claims 1
- 238000006268 reductive amination reaction Methods 0.000 claims 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims 1
- XLMALTXPSGQGBX-GCJKJVERSA-N dextropropoxyphene Chemical compound C([C@](OC(=O)CC)([C@H](C)CN(C)C)C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 XLMALTXPSGQGBX-GCJKJVERSA-N 0.000 description 70
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 39
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 30
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 25
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 21
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 15
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 14
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 13
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 12
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 12
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 11
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 9
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 8
- 108010053455 riboflavin-binding protein Proteins 0.000 description 8
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 7
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 6
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 239000001273 butane Substances 0.000 description 5
- 239000012230 colorless oil Substances 0.000 description 5
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 5
- IJDNQMDRQITEOD-UHFFFAOYSA-N n-butane Chemical compound CCCC IJDNQMDRQITEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- OFBQJSOFQDEBGM-UHFFFAOYSA-N n-pentane Natural products CCCCC OFBQJSOFQDEBGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 5
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 4
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- 150000001805 chlorine compounds Chemical class 0.000 description 4
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 4
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 4
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 description 4
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 description 4
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QMMFVYPAHWMCMS-UHFFFAOYSA-N Dimethyl sulfide Chemical compound CSC QMMFVYPAHWMCMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 3
- 125000005708 carbonyloxy group Chemical group [*:2]OC([*:1])=O 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- INTCGJHAECYOBW-APWZRJJASA-N (2s,3r)-4-(dimethylamino)-3-methyl-1,2-diphenylbutan-2-ol Chemical compound C([C@](O)([C@@H](CN(C)C)C)C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 INTCGJHAECYOBW-APWZRJJASA-N 0.000 description 2
- RCHIYTDUVOHAGK-VGSWGCGISA-N 2-[[(2s,3r)-4-(dimethylamino)-3-methyl-1,2-diphenylbutan-2-yl]oxycarbonylamino]acetic acid Chemical compound C([C@@]([C@@H](CN(C)C)C)(OC(=O)NCC(O)=O)C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 RCHIYTDUVOHAGK-VGSWGCGISA-N 0.000 description 2
- FTOAOBMCPZCFFF-UHFFFAOYSA-N 5,5-diethylbarbituric acid Chemical compound CCC1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O FTOAOBMCPZCFFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- USSIQXCVUWKGNF-UHFFFAOYSA-N 6-(dimethylamino)-4,4-diphenylheptan-3-one Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(CC(C)N(C)C)(C(=O)CC)C1=CC=CC=C1 USSIQXCVUWKGNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000006410 Apoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010083590 Apoproteins Proteins 0.000 description 2
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- CBENFWSGALASAD-UHFFFAOYSA-N Ozone Chemical compound [O-][O+]=O CBENFWSGALASAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QVTMGLKIERGFFS-UHFFFAOYSA-N acetic acid;isocyanatoethane Chemical compound CC(O)=O.CCN=C=O QVTMGLKIERGFFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 2
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 2
- RJUIDDKTATZJFE-UHFFFAOYSA-N but-2-enoyl chloride Chemical compound CC=CC(Cl)=O RJUIDDKTATZJFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 2
- KKHPNPMTPORSQE-UHFFFAOYSA-N chlorphenoxamine Chemical compound C=1C=C(Cl)C=CC=1C(C)(OCCN(C)C)C1=CC=CC=C1 KKHPNPMTPORSQE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003686 chlorphenoxamine Drugs 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 2
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 2
- YMEZRVAEMNWGRL-DVECYGJZSA-N ethyl 2-[[(2s,3r)-4-(dimethylamino)-3-methyl-1,2-diphenylbutan-2-yl]oxycarbonylamino]acetate Chemical compound C([C@](OC(=O)NCC(=O)OCC)([C@H](C)CN(C)C)C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 YMEZRVAEMNWGRL-DVECYGJZSA-N 0.000 description 2
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 238000001030 gas--liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 229960001797 methadone Drugs 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- OTTYFDRFBJPGRW-UHFFFAOYSA-N pent-2-enoyl chloride Chemical compound CCC=CC(Cl)=O OTTYFDRFBJPGRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N pristane Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M sodium periodate Chemical compound [Na+].[O-]I(=O)(=O)=O JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- YOETUEMZNOLGDB-UHFFFAOYSA-N 2-methylpropyl carbonochloridate Chemical compound CC(C)COC(Cl)=O YOETUEMZNOLGDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WVTJZCYIIAURJU-UHFFFAOYSA-N 4-(dimethylamino)-3-methyl-1,2-diphenylbutan-1-ol Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(C(CN(C)C)C)C(O)C1=CC=CC=C1 WVTJZCYIIAURJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GZAJOEGTZDUSKS-UHFFFAOYSA-N 5-aminofluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C21OC(=O)C1=CC(N)=CC=C21 GZAJOEGTZDUSKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YCPXWRQRBFJBPZ-UHFFFAOYSA-N 5-sulfosalicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(S(O)(=O)=O)=CC=C1O YCPXWRQRBFJBPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 8-[3-(1-cyclopropylpyrazol-4-yl)-1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-5-yl]-3-methyl-3,8-diazabicyclo[3.2.1]octan-2-one Chemical class C1(CC1)N1N=CC(=C1)C1=NNC2=C1N=C(N=C2)N1C2C(N(CC1CC2)C)=O HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 102000014824 Crystallins Human genes 0.000 description 1
- 108010064003 Crystallins Proteins 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 101000877589 Homo sapiens Protein farnesyltransferase/geranylgeranyltransferase type-1 subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- XNPOFXIBHOVFFH-UHFFFAOYSA-N N-cyclohexyl-N'-(2-(4-morpholinyl)ethyl)carbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NCCN1CCOCC1 XNPOFXIBHOVFFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M Propionate Chemical compound CCC([O-])=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102100035480 Protein farnesyltransferase/geranylgeranyltransferase type-1 subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 102000002248 Thyroxine-Binding Globulin Human genes 0.000 description 1
- 108010000259 Thyroxine-Binding Globulin Proteins 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 159000000032 aromatic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 229960002319 barbital Drugs 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 210000001728 clone cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002967 competitive immunoassay Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 1
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 150000004820 halides Chemical class 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- IDIOJRGTRFRIJL-UHFFFAOYSA-N iodosilane Chemical class I[SiH3] IDIOJRGTRFRIJL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- ACKFDYCQCBEDNU-UHFFFAOYSA-J lead(2+);tetraacetate Chemical compound [Pb+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O.CC([O-])=O.CC([O-])=O ACKFDYCQCBEDNU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000004084 narcotic analgesic agent Substances 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- JDKQTIKEGOOXTJ-UHFFFAOYSA-N pent-4-enoyl chloride Chemical compound ClC(=O)CCC=C JDKQTIKEGOOXTJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000012207 quantitative assay Methods 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 1
- 238000000611 regression analysis Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011973 solid acid Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 1
- XUIIKFGFIJCVMT-UHFFFAOYSA-N thyroxine-binding globulin Natural products IC1=CC(CC([NH3+])C([O-])=O)=CC(I)=C1OC1=CC(I)=C(O)C(I)=C1 XUIIKFGFIJCVMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010792 warming Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000010626 work up procedure Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
- G01N33/9486—Analgesics, e.g. opiates, aspirine
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/815—Test for named compound or class of compounds
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Description
- Die vorliegende Erfindung handelt von Reagenzien und Verfahren für die Durchführung eines Immunoassays, insbesondere eines Fluoreszenzpolarisationsimmunoassays (FPIA), für die Bestimmung des Vorhandenseins und/oder der Menge von Dextropropoxyphen und/oder des Hauptmetaboliten von Dextropropoxyphen (nämlich Nordextropropoxyphen) in Proben, insbesondere wässrigen, flüssigen biologischen Proben wie Urin, Blutserum oder Blutplasma, und von einem Immunoassay auf der Basis dieser Reagenzien. Insbesondere handelt die Erfindung von neuen Haptenen, Immunogenen, die von den Haptenen gebildet werden, Antiseren, die gegen die Haptene gebildet werden, und Immunoassays, die Reagenzien und Verfahren der Erfindung nutzen.
- Dextropropoxyphen ist ein narkotisches Analgetikum, das ein weites therapeutisches Anwendungsfeld gefunden hat. Leider wurde es jedoch auch ein Wirkstoff für den Missbrauch. Dextropropoxyphen ist auch unter den folgenden chemischen Bezeichnungen bekannt: [S-(R*,S*)]-alpha-[2-(Dimethylamino)-1- methylethyl]-alpha-phenylbenzolethanolpropanoat (Ester); alphad-4-Dimethylamino-3-methyl-1,2-diphenyl-2-butanolpropionat; (+) - 1,2-Diphenyl-2-propionoxy-3-methyl-4-dimethylaminobutan.' (+)-4- Dimethylamino-1,2-diphenyl-3-methyl-2-propionyloxybutan; alphad-4-Dimethylamino-3-methyl-1,2-diphenylbutan-2-ol propionat; und d-Propoxyphen. Dextropropoxyphen entspricht der folgenden Strukturformel: Dextropropoxyphen
- Wie von R.J. Flanagan et al. in "Measurement of Dextropropoxyphene and Nordextropropoxyphene in Biological Fluids", Human Toxicol. (1984), 3, 1035-1145, berichtet wurde, wurden verschiedene Verfahrenn zum Nachweis, zur Identifizierung und zum Messen der Menge von Dextropropoxyphen und seines hauptsächlichen Plasmametaboliten, Nordextropropoxyphen, ausgearbeitet. Beispiele für solche Verfahren sind die Dünnschichtchromatographie (TLC) und die Gas-Flüssig- Chromatographie (GLC) von flüssigen oder festen Extrakten von Urin oder von Mageninhalten sowie ein homogenes Enzymimmunoassay-Verfahren.
- US 4.025.501 ist auf Verbindungen gerichtet zur Konjugation an Antigene für die Produktion von Antikörpern, die (d,1)- Propoxyphen und dessen Metabolite in Immunoassays erkennen. Die Verbindungen, auf die dieses Patent gerichtet ist, werden dargestellt durch die Reaktion von 1,2-Diphenyl-3-methyl-4- dimethylamino-2-butanol mit einer zweibasigen Säure zur Bildung eines halbsauren Esters, für dessen Säuregruppe bekannt gegeben wurde, daß sie für die Konjugation an Aminogruppen von Proteinen oder Polypeptiden aktiviert ist.
- Derzeit bestehende Assays für Propoxyphen neigen jedoch dazu, unter den nachteilig hohen Kreuzreaktivitäten für verschiedene, strukturell ähnliche Verbindungen zu leiden. Die vorliegende Erfindung hat mehrere Ziele. Hierzu gehören zum Beispiel die Bereitstellung neuer Haptene, Immunogene, die aus dem Haptenen gebildet werden, und Antiseren, die als Antwort auf die Immunogene gebildet werden, die für die Verwendung in Immunoassays geeignet sind, die sehr scharf unterscheiden zwischen Dextropropoxyphen und seinem Hauptmetaboliten, Nordextropropoxyphen, und in denen die Immunoassay- Kreuzreaktivität für Störverbindungen wie unter anderem Methadon und Chlorphenoxamin minimiert oder im wesentlichen eliminiert sind.
- Weiterhin beinhalten die derzeit bestehenden Assays für Propoxyphen die Verwendung racemischer Gemische von Molekülen zur Herstellung von Immunogenen, um Antikörper gegen Propoxyphen zu erhalten. Propoxyphen kann jedoch wegen des Vorhandenseins von zwei optisch aktiven Zentren innerhalb des Moleküls in vier verschiedenen isomeren Formen vorliegen. Daher wird für die Verwendung solcher racemischer Gemische zur Herstellung von Immunogenen für den Erhalt von Antikörpern angenommen, dass sie zur Bildung von mindestens vier Typen von Antikörpern führt, von denen nur etwa 25% die optische Form von Propoxyphen nachweisen, die für den Assay relevant sind. Die Form von Propoxyphen, die auf dem Markt verfügbar ist, ist eine optisch aktive Form des Wirkstoffs. Darüberhinaus gibt es unter den vier isometrischen Formen von Propoxyphen nur eine Form, die eine substantielle Wirksamkeit bei Menschen zu haben scheint, nämlich Dextropropoxyphen. Dementsprechend wäre es insbesondere für quantitative Assays für die Form von Propoxyphen, die bei Menschen eine Wirksamkeit aufweist, und/oder für seinen bedeutendsten Metaboliten wünschenswert, Antikörper bereitzustellen, von denen ein größerer Teil mit der wirksamen Form des Arzneistoffs reaktionsfähig ist als mit den unwirksamen Formen des Wirkstoffs.
- Die vorliegende Erfindung handelt von Immunoassays, insbesondere kompetitiven Immunoassays, bei denen Reagenzien und Techniken verwendet werden, die besonders geeignet sind für den Nachweis des Vorhandenseins und/oder der Menge von Dextropropoxyphen und/oder Nordextropropoxyphen in biologischen Flüssigkeiten. Die vorliegende Erfindung bietet u. a. den Vorteil, dass sie eine vorteilhaft effektive Bestimmung der Menge von Dextropropoxyphen und/oder seines Hauptmetaboliten, Nordextropropoxyphen, ermöglicht, bei der eine Störung durch andere verwandte Verbindungen minimiert ist. Die vorliegende Erfindung basiert zum Teil auf neuen, im wesentlichen optisch reinen Haptenen, die zur Herstellung von Immunogenen und/oder Tracern verwendet werden können, die für die Verwendung in Immunoassays geeignet sind.
- Die Erfindung liefert ein im wesentlichen optisch reines Hapten, das für die Bildung von Antikörpern und Tracern nützlich ist, die in einem Immunoassay für Dextropropoxyphen und/oder Nordextropropoxyphen nützlich sind. Das Hapten der Erfindung entspricht der Strukturformel (IX):
- In Formel (IX) ist Z eine -NH-Komponente und vorhanden, wenn m = 1 ist. X ist eine funktionelle Gruppe, die aus der Gruppe gewählt ist, die aus -CHO, -COOH, -NH&sub2; und -COOR besteht, wobei R eine C&sub1; -C&sub3;-Alkylgruppe ist. In Formel (IX) kann m gleich 0 oder 1 sein, und n kann eine ganze Zahl zwischen 1 und 3 sein.
- Die Erfindung liefert außerdem ein Immunogen, das von einem Hapten der Erfindung abgeleitet ist.
- Die Erfindung liefert außerdem ein Antiserum, das als Antwort auf ein Immunogen, das von einem Hapten der Erfindung abgeleitet ist, gebildet wird.
- Die Erfindung liefert auch einen fluoreszierenden Tracer, der von einer im wesentlichen optisch reinen Verbindung der Erfindung abgeleitet ist und in einem Immunoassay für Dextropropoxyphen und/oder Nordextropropoxyphen nützlich ist. Die im wesentlichen optisch reine Verbindung entspricht dem Häpten, das in Formel (IX) definiert ist.
- Die Erfindung liefert auch einen verbesserten Immunoassay für die Bestimmung des Vorhandenseins oder der Menge von Dextropropoxyphen und/oder Nordextropropoxyphen in einer biologischen Probe. Der verbesserte Immunoassay enthält einen Schritt, bei dem die Probe mit einem Antikörper (oder Antikörpern) in Kontakt gebracht wird, der als Antwort auf ein Immunogen der Erfindung gebildet wurde. Darüber hinaus liefert die Erfindung einen Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay (FPIA) für die Bestimmung des Vorhandenseins oder der Menge von Dextropropoxyphen und/oder Nordextropropoxyphen in einer biologischen Probe. Der FPIA enthält einen Schritt, bei dem die Probe mit Antikörpern in Kontakt gebracht wird, die als Antwort auf ein Immunogen der Erfindung gebildet wurden, und/oder enthält einen Schritt, bei dem die Probe mit einem fluoreszierenden Tracer der Erfindung in Kontakt gebracht wird.
- Ein Hapten der Erfindung ist im wesentlichen optisch rein und ist insbesondere nützlich für die Bildung von Antikörpern und Tracern, die in einem Immunoassay für Dextropropoxyphen und/oder für Nordextropropoxyphen, einem Metaboliten von Dextropropoxyphen, nützlich sind. So wie er hier verwendet wird, bedeutet der Ausdruck "im wesentlichen optisch rein", dass das Produkt-Hapten weniger als oder gleich 10 Masse-%, vorzugsweise weniger als oder gleich 5 Masse-%, und noch mehr vorzuziehen weniger als oder gleich 2 Masse-% des linksdrehenden (1 oder -)- Enantiomers des Haptens basierend auf der Summe der Massen der rechtsdrehenden (d oder +)- und der linksdrehenden (1 oder -)- Enantiomere enthält. Ein Hapten der Erfindung entspricht der Formel (IX):
- In Formel (IX) stellt Z eine bivalente -NH-Komponente dar und ist vorhanden, wenn m = 1 ist. X ist eine funktionelle Gruppe, die auf der Gruppe gewählt ist, die aus -CHO, -COOH, -NH&sub2; und -COOR besteht, wobei R eine C&sub1;-C&sub3;-Alkylgruppe ist. Vorzugsweise ist X eine Aldehydgruppe. Es wird ebenfalls bevorzugt, dass R eine Ethylgruppe ist. In Formel (IX) kann m = 0 oder 1 sein, vorzugsweise 0, und n kann eine ganze Zahl von 1 bis 3 sein, vorzugsweise 3. Die funktionelle Gruppe, X, in Formel (IX) ist eine funktionelle Gruppe, die zum Beispiel für die Anlagerung einer Antigenität-verleihenden Komponente an das Hapten geeignet ist, zum Beispiel durch direkte Reaktion mit einer co-reaktiven funktionellen Gruppe eines Antigenität-verleihenden Trägers oder über einen Zwischenschritt.
- Haptene der Erfindung können durch die folgenden illustrativen allgemeinen Verfahren hergestellt werden. Typischerweise werden die optisch aktiven Dextropropoxyphenderivate (Haptene) der Erfindung durch Reaktion von Dextropropoxyphenhydrochlorid mit einem geeigneten Reduktionsmittel hergestellt. Der resultierende Alkohol wird dann derivatisiert durch Behandlung mit einem Acylhalogenid- oder Isocyanatreagenz, das eine zweite Funktionalität aufweist, die in eine andere funktionelle Gruppe umgewandelt werden kann. Diese neue funktionelle Gruppe ermöglicht es, dass das so produzierte Dextropropoxyphenderivat an antigene Moleküle gekoppelt wird. Die zweite Funktionalität kann ein Ester oder ein Olefin sein. Die Gesamtmethodik, die für die Ausarbeitung der Bindung des Dextropropoxyphenderivats in dieser Form verwendet wird, ist zentraler Bestandteil für die Gewinnung von haptenen Dextropropoxyphenderivaten von hoher optischer Reinheit.
- Zu den Reduktionsmitteln, die zur Herstellung von Haptenen der Erfindung verwendet werden können, gehören Mittel wie Lithiumaluminiumhydrid, Diisobutylaluminiumhydrid, bis-(Methoxyethoxy)aluminiumhydrid, wobei Lithiumaluminiumhydrid bevorzugt wird.
- Die oben beschriebenen Acylhalogenid- oder Isocyanatreagenzien sind vorzugsweise aliphatische Säurechloride oder aliphatische Isocyanate wie Pentenoylchlorid, Butenoylchlorid, Ethylisocyanatacetat, Ethyl-3-isocyanatpropionat, wobei Pentenoylchlorid für die Haptenbildung bevorzugt wird. Säurechloride und Isocyanate, die von aromatischen Säuren abgeleitet sind, sind weniger geeignet.
- Für die Modifikation der zweiten Funktionalität, die in dem Säurehalogenidmolekül vorhanden ist und mit der die Kupplung an ein antigenes Molekül ermöglicht wird, werden zwei Typen von Reagenzien genutzt, je nach vorhandener Funktionalität. Ungesättigte Säurechloride wie Butenoylchlorid führen zu Dextropropoxyphenderivaten, die ein Olefin enthalten. Olefine können in Aldehyde umgewandelt werden unter Verwendung mehrerer Oxidationsmittel einschließlich Bleitetraacetat, Natriumperiodat, Ozon gefolgt von geeigneter reduzierender Aufarbeitung. Ungesättigte Isocyanate führen ebenfalls zu olefinen Dextropropoxyphenderivaten, die nach Behandlung mit geeigneten Spaltmitteln Säuren enthalten. Zu diesen Mitteln gehören u. a. Säure, Base, aromatische Sulfidsalze, Silyliodide. Säurechloride, die eine zweite Esterfunktionalität enthalten, können ebenfalls zu Dextropropoxyphenderivaten führen, die eine Säure enthalten.
- Beide Komponenten, die erhaltenen Dextropropoxyphenaldehyde und -säuren, werden zu antigenen Molekülen verknüpft durch Verfahren, die dem Fachmann bestens bekannt sind.
- Es wurde herausgefunden, dass Fluoreszenzpolarisationsimmunoassays, durchgeführt unter Verwendung von Antiseren, die von Immunogenen erhalten wurden, die aus Haptenen der Erfindung gebildet wurden, eine besonders hohe Spezifität für Dextropropoxyphen und/oder Nordextropropoxyphen und eine besonders niedrige Kreuzreaktivität für Störverbindungen wie u. a. Methadon oder Chlorphenoxamin bieten können.
- Ein Immunogen der Erfindung wird von einem im wesentlichen optisch reinen Hapten der Erfindung abgeleitet. Ein Immunogen der Erfindung ist besonders nützlich in einem Immunoassay für Dextropropoxyphen und/oder Nordextropropoxyphen. Das Immunogen entspricht der Formel (X):
- worin Z wie für das Hapten entsprechend Formel (IX) weiter oben definiert ist. Y in Formel (X) ist eine bivalente Komponente für die Anbindung der (CH&sub2;)n-Gruppe an die Antigenität-verleihende Komponente A. Y kann -NH-, -(CO)NH- oder -NH(CO)- sein, wobei -NH- bevorzugt wird. Es versteht sich, dass immer dann, wenn in der Spezifikation und den Ansprüchen eine bivalente Komponente für die Bindung von zwei anderen Strukturen angegeben wird, z. B. -(CO)NH- als Y für die Verknüpfung von (CH&sub2;)n und A, der linke Teil der bivalenten Komponente links an die Struktur und der rechte Teil rechts an die Struktur angelagert wird (d. h. für dieses Beispiel (CH&sub2;)n-(CO)NH-A). In Formel (X) kann das tiefergestellte m 0 oder 1 sein, wobei 0 bevorzugt wird, und das tiefergestellte n kann eine ganze Zahl zwischen 1 und 3 sein, wobei 3 bevorzugt wird. Die Antigenität-verleihende Trägerkomponente A kann aus einer Vielzahl Antigenitätverleihender Trägerkomponenten gewählt werden. Wie aus Formel (X) klar zu erkennen ist, steht die Komponente A für den Rest eines Antigenität-verleihenden Trägers, der über Y an den Haptenteil des Immunogens von Formel (X) gebunden ist.
- Die kovalente Bindung der hier beschriebenen Haptenmaterialien an Antigenität-verleihende Materialien kann durch Verfahren erreicht werden, die auf diesem Gebiet bestens bekannt sind, wobei die Auswahl des Verfahrens durch die Natur der Bindungsfunktionalität im Dextropropoxyphenderivat (z. B. X in Formel (IX)) und den für die Bindung gewählten Träger vorgeschrieben wird.
- Typischerweise wird die Antigenität-verleihende Trägerkomponente A durch Umsetzung der funktionellen Gruppe X eines Haptens entsprechend Formel (IX) mit einer co-reaktiven funktionellen Gruppe eines Antigenität-verleihenden Trägers, wie zum Beispiel einer natürlich vorkommenden oder synthetischen Poly(aminosäure), durch allgemein bekannte präparative Techniken bereitgestellt. Typischerweise wird in bevorzugten Ausführungen der Erfindung die natürlich vorkommende Poly(aminosäure) Rinderthyreoglobulin (BTG) als Antigenitätverleihender Träger zum Bereitstellen der Komponente A in Strukturformel (X) verwendet, aber es versteht sich von selbst, dass andere Proteinträger verwendet werden können, wozu zum Beispiel Albumine und Serumproteine wie Globuline, Lipoproteine, Okularlinsenproteine gehören. Einige beispielhafte Antigenitätverleihende Träger sind Rinderserumalbumin (BSA), Hämocyanin der marinen Schlüssellochschnecke (KLH = keyhole limpet hemocyanin), Eierovalbumin, Rindergammaglobulin (BGG), Thyroxinbindendes Globulin, etc. Alternativ können synthetische Poly(aminosäuren) wie Polylysin verwendet werden.
- Zum Beispiel kann ein Hapten, bei dem X in Formel (IX) Carboxyl ist, an Rinderserumalbumin gekoppelt werden, vorzugsweise unter Bedingungen, die normalerweise für die Bildung von Amidbindungen verwendet werden und die dem Fachmann bestens bekannt sind, unter Verwendung eines Kopplungsmittels wie z. B. Carbodiimid, insbesondere eines wasserlöslichen Carbodiimids wie 1-Ethyl- 3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) oder 1-Cyclohexyl- 3-(2-morpholinethyl)carbodiimidmetho-p-toluolsulfonat. Die gleichen Reagenzien können für den Fall verwendet werden, dass X im Hapten eine NH&sub2;-Gruppe ist, wobei eine Amidbindung mit einer Carboxylgruppe am Rinderserumalbumin gebildet wird. Wenn X im Hapten CHO ist, kann das Aldehyd reduktiv zu einer entsprechenden funktionellen Amingruppe aminiert werden. Weitere Umwandlungen des Aldehyds in nützliche Haptene sind für den Fachmann offensichtlich.
- Antiseren der vorliegenden Erfindung werden durch Entwicklung einer Immunantwort in Tieren auf Immunogene der Erfindung hergestellt. Das Immunogen wird Tieren wie z. B. Kaninchen, Mäusen, Ratten, Schafen oder Kühen durch eine Injektionsreihe verabreicht entsprechend Techniken, die im allgemeinen auf diesem Gebiet bekannt sind. Ein Antiserum gemäß der vorliegenden Erfindung wird als Antwort auf ein Immunogen der Erfindung gebildet, das von einem im wesentlichen optisch reinen Hapten der Erfindung abgeleitet ist. Sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper erkennen spezifische Epitope auf einem Immunogen und sind möglicherweise beide geeignet, auch wenn typischerweise polyklonale Antikörper in der vorliegenden Erfindung verwendet wurden. Polyklonale Antikörper bestehen aus einem Gemisch vieler Antikörper, von denen jeder ein spezifisches Epitop erkennt, während monoklonale Antikörper von Zellen produziert werden, die einen einzigen Antikörper absondern, der ein bestimmtes Epitop erkennt. Techniken für die Herstellung polyklonaler Antikörper sind allgemein im Fachgebiet bestens bekannt.
- Monoklonale Antikörper können hergestellt werden durch intraperitoneale, subkutane, intravenöse oder sonstige Injektion von Tieren wie Mäusen oder Ratten mit einem Antigen, nämlich einem Immunogen entsprechend Formel (X) oben, um eine Immunantwort in den Tieren hervorzurufen (nämlich die Produktion von Antikörpern, die für das Antigen spezifisch sind). Den Tieren wird. Serum entnommen und diese Seren werden untersucht, um den Titer des Antikörpers in den Seren zu bestimmen (um zu bestimmen, ob das Tier die gewünschte Immunantwort hervorgebracht hat oder nicht, und in welchem Ausmaß). Jenen Tieren, in denen die gewünschte Immunantwort gebildet wurde, wird eine Ruhepause von etwa zwei bis drei Monaten gewährt. Nach diesem Zeitraum von 2-3 Monaten und etwa drei Tage vor der erwarteten Fusion von B-Lymphozytzellen (Zellen, die nach Stimulation durch ein Antigen zu Plasmazellen reifen, die Antikörper synthetisieren, und die auch als B-Zellen bezeichnet werden) mit Myelomzellen (Tumorzellen) wird diesen Tieren eine Verstärkungsinjektion des Antigens verabreicht. B- Lymphozytzellen werden dann der jeweiligen Milz der Tiere nach Standardverfahren entnommen und die B-Lymphozytzellen werden dann mit Myelomfusionspartnern gemäß Standardverfahren verschmolzen, die z. B. in Kohler und Milstein, "Continuous Culture of Fused Cells Secreting Antibody of Predefined Specificity", Nature, 256, 495 (1975) beschrieben sind. Die B- Lymphozyt-Myelom-Fusionen werden dann in Multivertiefungs- Gewebekulturplatten plattiert, die HAT-Medium oder andere geeignete Medien enthalten. Die resultierenden Kulturen werden mit HT-Medium oder anderen geeigneten Medien, und fetalem Rinderserum oder Kälberrinderserum am oder um den fünften und siebten Tag nach der Fusion der Zellen gespeist und dann am oder um den 10. Tag nach der Fusion auf das Vorhandensein von Antikörper untersucht, der für das Antigen spezifisch ist.
- Spezifische erwünschte Hybride werden dann durch Grenzwertverdünnung geklont. (Hybridzellen werden in unterschiedlichen Mengen an HT-Medium oder anderen geeigneten Medien verdünnt und in Gewebekulturplatten plattiert, um einen einzelnen erwünschten Klon zu isolieren.) Gebildete Klone werden dann für eine breitere Palette von Kreuzreaktanden auf Spezifität untersucht.
- Die Menge an resultierenden monoklonalen Antikörpern, die von einem erwünschten Klon produziert wird, kann dann gesteigert werden zur Produktion einer ausreichenden Menge an Antikörpern für die Reinigung in entweder: (1) Gewebekultur (durch Expansion der Anzahl der Zellen in Gewebekultur oder HT-Medium) oder (2) Mäusen für Aszites. Die monoklonalen Antikörper können in Mäusen vermehrt werden durch Injektion von Hybridzellen in die Bauchhöhle von Mäusen und Wachsenlassen der Zellen (normalerweise etwa 7 Tage). Die Aszites der Mäuse wird geerntet durch Töten der Mäuse, Sammeln der Aszitesflüssigkeit und Reinigen der Aszitesflüssigkeit. BALB/c-Mäuse sind die bekannteste Linie von Labormäusen, die für dieses Verfahren verwendet werden, und sie können von jedem Mäusehändler bezogen werden. Pristan sollte den Mäusen injiziert werden, um deren Immunsystem für die Produktion von B- und T-Zellen zu stimulieren (etwa zwei oder drei Wochen bevor die Hybridzellen den Mäusen injiziert werden), die als Nährschicht für Klonzellen dienen, die den Mäusen injiziert werden. Dies geschieht, um eine geeignete Umgebung zu schaffen, in der die Hybridzellen wachsen können.
- Die Erfindung liefert auch verbesserte Immunoassays für den Nachweis des Vorhandenseins oder der Menge von Dextropropoxyphen und/oder Nordextropropoxyphen in biologischen Proben. Ein verbesserter Immunoassay der Erfindung enthält (umfaßt) einen Schritt, bei dem die zu bestimmende Probe mit Antikörpern in Kontakt gebracht wird, die als Antwort auf ein Immunogen der Erfindung erhalten wurden. Es wird davon ausgegangen, dass alle Immunoassays für Propoxyphen und /oder Nordextropropoxyphen, die Antikörper verwenden, die gegen Immunogene erhalten wurden, gemäß der Erfindung, innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung liegen. Beispiele für Immunoassays schließen Radioimmunoassays (RIAs), Enzymimmunoassays (EIas), enzyme linked immunosorbent assays (ELISAs) und Fluoreszenzpolarisationsimmunoassays (FPIAs) ein. In einem Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay (FPIA) kann ein fluoreszierender Tracer der Erfindung entweder mit oder ohne Antikörper, die als Antwort auf ein Immunogen der Erfindung aufgezogen wurden, verwendet werden.
- Einen fluoreszierenden Tracer der Erfindung kann man sich vorstellen, von einer im wesentlichen optisch reinen Verbindung abgeleitet zu sein, die einem Hapten der Erfindung entspricht. Ein Tracer der Erfindung ist in einem Immunoassay für Dextropropoxyphen und/oder Nordextropropoxyphen nützlich und entspricht der Formel (XI):
- worin Z wie für das Hapten entsprechend Formel (IX) weiter oben definiert ist, wobei das tiefergestellte m gleich 0 oder 1 ist, vorzugsweise 1. In Formel (XI) ist Y ein bivalentes Radikal, das aus -NH-, -(CO)NH- und -NH(CO)- gewählt ist, wobei -(CO)NH- bevorzugt wird. Das tiefergestellte n ist eine ganze Zahl von 1 bis 3 und ist in einem bevorzugten Tracer der Erfindung gleich 1. In Formel (XI) ist FL eine Fluoreszenz-verleihende Komponente, und Y dient dazu, die Fluoreszenz-verleihende Komponente an das bivalente Radikal -(CH&sub2;)n- zu binden. Die Fluoreszenz-verleihende Komponente FL kann aus einer Vielzahl Fluoreszenz-verleihender Komponenten ausgewählt werden.
- Wie aus Formel (XI) zu erkennen ist, stellt die Komponente FL den monovalenten Rest einer Fluoreszenz-verleihenden Verbindung dar, die über X an den Rest des Tracers gebunden ist. In bevorzugten Ausführungen der Erfindung ist die Fluoreszenzverleihende Komponente des fluoreszierenden Tracers ein monovalenter Rest von Fluorescein oder ein monovalenter Rest eines Fluorescein-Derivats. Zum Beispiel können alle folgenden Fluorescein-Derivate verwendet werden: FL-NH&sub2;, Fluoresceinamin; FL-CH&sub2;NH&sub2;, Aminomethylfluorescein und FL-COOH, Carboxyfluorescein. In diesem Dokument steht FL für eine Fluoresceinkomponente, die der folgenden Formel (XII) entspricht:
- In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung wird FL-NH&sub2; zur Herstellung des Tracers verwendet, vorzugsweise die Form, worin die -NW-Gruppe an FL entweder über die 5- oder 6-Position (siehe Abb. XII oben) gebunden ist, typischerweise an der 5- Position.
- Tracer der Erfindung haben die Formel (XI) und können im allgemeinen hergestellt werden durch Bindung einer geeigneten fluoreszierenden Verbindung an ein Hapten der Erfindung, das durch Formel (IX) weiter oben dargestellt wird und worin X für eine funktionelle Gruppe steht, die geeignet ist dazu eingesetzt zu werden, um die fluoreszierende Verbindung an das Hapten zu binden, z. B. durch direkte Reaktion mit einer co-reaktiven funktionellen Gruppe der fluoreszierenden Verbindung oder über einen Zwischenschritt. Beispiele von funktionellen Gruppen für das Hapten sind: -COOH, -NH&sub2; und -COOR, worin R eine C&sub1;-C&sub3; -Alkylgruppe ist. Reaktionsbedingungen für die Umsetzung solcher funktionellen Gruppen des Haptens, die durch X dargestellt sind, mit co-reaktiven funktionellen Gruppen einer fluoreszierenden Verbindung sind im Fachgebiet bestens bekannt.
- Normalerweise werden Kompetitiv-Bindungsimmunoassays entsprechend dem Verfahren der Erfindung verwendet, um das Vorhandensein und/oder die Menge von Dextropropoxyphen und/oder Nordextropropoxyphen in einer biologischen Probe nachzuweisen. Typischerweise werden Kompetitiv-Bindungsimmunoassays verwendet, um Liganden in einer Testprobe zu messen. Für die Zwecke dieser Veröffentlichung ist ein "Ligand" eine Substanz (Dextropropoxyphen und/oder Nordextropropoxyphen), die biologisch interessant ist, quantitativ durch eine Kompetitiv- Bindungsimmunoassay-Technik bestimmt zu werden. Der Ligand konkurriert mit einem markierten Reagenz (einem "Ligandanalogon" oder "Tracer"), um eine begrenzte Anzahl von Ligandbindungsstellen an Antikörpern, die für den Ligand und das Ligandanalogon spezifisch sind (hier Antikörper, die als Antwort auf ein Immunogen der Erfindung hergestellt wurden). Die Konzentration des Liganden in der Probe bestimmt die Menge des Ligandanalogons, die an den Antikörper gebunden wird, und die Menge des Ligandanalogons, die an den Antikörper gebunden wird, ist umgekehrt proportional zu der Konzentration des Liganden in der Probe, da der Ligand und das Ligandanalogon jeweils im Verhältnis der entsprechenden Konzentrationen an den Antikörper gebunden werden.
- In einer Ausführung der Erfindung werden Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay(FPIA)-Techniken für den Nachweis der Menge an Tracer-Antikörper-Konjugat verwendet, die in einem Kompetitiv-Bindungsimmunoassay gebildet wird. Solche Verfahren basieren auf dem Prinzip, dass eine fluoreszierend markierte Verbindung, wenn sie durch linear polarisiertes Licht angeregt wird, Fluoreszenz emittiert, deren Polarisationsgrad umgekehrt proportional zu ihrer Rotationsrate ist. Wenn dementsprechend ein Tracer-Antikörper-Konjugat, das fluoreszierend markiert ist, mit linear polarisiertem Licht angeregt wird, bleibt das emittierte Licht stark polarisiert, da das Fluorophor zwischen der Zeit, in der Licht absorbiert und emittiert wird, von der Rotation abgehalten wird. Im Gegensatz hierzu ist, wenn ein ungebundener Tracer durch linear polarisiertes Licht angeregt wird, dessen Rotation viel schneller als die des entsprechenden Tracer-Antikörper-Konjugats und die Moleküle werden mehr zufällig orientiert. Als ein Ergebnis ist das von den ungebundenen Tracermolekülen emittierte Licht depolarisiert.
- Konkreter enthält ein bevorzugtes FPIA-Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Nachweis des Vorhandenseins oder der Menge von Dextropropoxyphen und/oder Nordextropropoxyphen in einer Probe folgende Schritte: (a) Probe in Kontakt bringen mit: (1) einem Antiserum, das monoklonale oder polyklonale, typischerweie polyklonale, Antikörper enthält, die als Antwort auf ein Immunogen der Erfindung gebildet wurden; und (2) mit einem fluoreszierenden Tracer der Erfindung, der eine nachweisbare Fluoreszenzpolarisationsantwort als Reaktion auf das Vorhandensein des Antiserums hervorrufen kann; (b) Hindurchleiten von linear polarisiertem Licht durch die resultierende Lösung aus Schritt (a), um eine Fluoreszenzpolarisationsantwort zu erhalten; und (c) Bestimmung der Fluoreszenzpolarisationsantwort der Lösung von Schritt (b) als Maß für das Vorhandensein oder die Menge von Dextropropoxyphen und/oder Nordextropropoxyphen in der Probe. Durch Konstanthalten der Konzentration des fluoreszierenden Tracers und Antikörpers ist das Verhältnis des Dextropropoxyphen- und/oder Nordextropropoxyphen-Antikörper- Komplexes zum fluoreszierenden Tracer-Antikörper-Komplex, der gebildet wird, direkt proportional zu der Menge von Dextropropoxyphen und/oder Nordextropropoxyphen in der Probe. Durch Anregen des Gemischs mit linear polarisiertem Licht und Messen der Polarisation (in Millipolarisationseinheiten) der Fluoreszenz, die von einem fluoreszierenden Tracer und einem fluoreszierenden Tracer-Antikörper-Komplex emittiert wird, kann man die Menge von Dextropropoxyphen und/oder Nordextropropoxyphen in der Probe quantitativ oder dessen Vorhandensein qualitativ bestimmen. Die Ergebnisse können in Form von Nettomillipolarisationseinheiten und Spanne (in Millipolarisationseinheiten) quantifiziert werden. Die Messung der Nettomillipolarisationseinheiten zeigt die maximale Polarisation an, wenn eine maximale Menge des fluoreszierenden Tracers an den Antikörper gebunden ist, in Abwesenheit von Dextropropoxyphen und/oder Nordextropropoxyphen. Je höher die Nettomillipolarisationswerte sind, umso besser ist der Tracer am Antikörper gebunden. Die Assayspanne ist die Differenz zwischen den Nettomillipolaristionswerten, die erhalten werden, wenn die maximale Menge Tracer in Abwesenheit von Dextropropoxyphen und/oder Nordextropropoxyphen gebunden ist, und der Nettomillipolarisation, die erhalten wird, wenn eine spezifische Menge Dextropropoxyphen und/oder Nordextropropoxyphen in der Probe vorhanden ist. Eine größere Spanne ermöglicht, dass mehr Millipolarisationseinheiten zwischen den einzelnen Kalibrierpunkten der für den Assay erzeugten Standardkurve angeordnet werden können, wodurch eine bessere Testgenauigkeit erhalten wird, was wiederum in einer besseren numerischen Analyse der erhaltenen Daten resultiert. Es ist wichtig festzustellen, dass die Spanne abhängig von der verwendeten Probengröße variiert, was wiederum die bevorzugte Kombination ändern kann.
- Fluoreszierende Tracer der vorliegenden Erfindung sind im wesentlichen optisch rein. Diese Tracer sind besonders vorteilhaft in Fällen, bei denen Antiseren auf der Basis von polyklonalen Antikörpern verwendet werden. Da Dextropropoxyphen im wesentlichen optisch rein im Körper vorliegt, wurde für die Verwendung von Tracern, die im wesentlichen optisch rein in Kombination mit Antikörpern sind, die von im wesentlich optisch reinen Immunogenen abgeleitet sind, festgestellt, dass damit in einem Dextropropoxyphen- und/oder Nordextropropoxyphen-Assay unter Verwendung von FPIA-Techniken innerhalb des gewählten dynamischen Bereichs ein verbessertes Signal ermöglicht wird.
- Ein resultierender Vorteil ist, dass FPTA-ASSays der vorliegenden Erfindung Empfindlichkeiten in der Größenordnung von 20,0 Nanogramm/Milliliter (ng/ml) Dextropropoxyphen und/oder Nordextropropoxyphen in der Probe erreichen können.
- Einige signifikante Leistungsmerkmale der am meisten bevorzugten Kombination von fluoreszierendem Tracer der vorliegenden Erfindung und Immunogen der vorliegenden Erfindung, sind: (1) das hohe Maß an Spezifität der Antikörper, die als Antwort auf das Immunogen erzeugt werden, für Dextropropoxyphen und/oder Nordextropropoxyphen, und (2) die minimale Kreuzreaktivität dieser Antikörper mit potentiellen Störkomponenten.
- Der pH-Wert, bei dem ein FPIA-Verfahren der vorliegenden Erfindung ausgeführt wird, muss ausreichend sein, damit die Fluorescein-Komponente des fluoreszierenden Tracers in ihrer offenen Form vorliegen kann. Der pH kann von etwa 3 bis 12 reichen, und liegt normalerweise im Bereich von etwa 5 bis 10 und am besten im Bereich von etwa 6 bis 9. Verschiedene Puffer können verwendet werden, um den pH während des FPIA-Verfahrens einzustellen und zu halten. Repräsentative Puffer sind Borat, Phosphat, Carbonat, Tris, Barbital, Citrat usw. Der im einzelnen eingesetzte Puffer ist für die vorliegende Erfindung nicht entscheidend, aber der Tris-, Phosphat- und Citratpuffer werden bevorzugt. Der Kationenanteil des Puffers bestimmt im allgemeinen den Kationenanteil des Tracersalzes in Lösung. Riboflavinbindendes Protein (RBP) wird zu der Probe oder zu einem oder mehreren der Assayreagenzien hinzugegeben, um jegliches in der Probe vorhandenes Riboflavin in RBP-Riboflavin- Komplexen zu binden und damit potentielle Fluoreszenzbeeinträchtigung zu eliminieren. RBP ist ein Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 32.000, das von Eiweißen isoliert wird. Nach der Isolierung vom Ei enthält jedes RBP- Molekül ein Molekül Riboflavin. Daher muss die Holoproteinform von RBP durch Dialyse unter sauren Bedingungen in die Apoproteinform umgewandelt werden, um das gebundene Riboflavin zu entfernen. Ein RBP-Apoprotein, das in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, ist kommerziell erhältlich von Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri. Die verwendete Menge ist nicht entscheidend, vorausgesetzt, dass eine ausreichende Menge verwendet wird, um das gesamte freie Riboflavin in der Probe zu binden.
- Ein Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay der vorliegenden Erfindung ist ein "homogener Assay", d. h. die Endablesung der Polarisation erfolgt von einer Lösung, in der gebundener Tracer nicht von ungebundenem Tracer getrennt ist. Das ist ein deutlicher Vorteil gegenüber heterogenen Immunoassayverfahren wie jenen, bei denen gebundener Tracer von umgebundenem Tracer abgetrennt werden muss, bevor eine Ablesung erfolgen kann. Zu den Reagenzien des Fluoreszenzpolarisationsassays der vorliegenden Erfindung gehören: (I) polyklonale oder monoklonale, typischerweise polyklonale, Antikörper für Dextropropoxyphen, und (2) fluoreszierendes Tracerreagenz.
- Andere, weitgehend konventionelle Lösungen einschließlich Vorbehandlungslösung, Verdünnungspuffer, Dextropropoxyphenkalibrierer und Dextropropoxyphenkontrollproben werden nach Wunsch hergestellt. Typische Lösungen dieser Reagenzien, von denen einige weiter unten beschrieben werden, sind kommerziell in Assay"kits" von Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois, erhältlich.
- Alle hier angegebenen Anteile gelten für Masse/Volumen, sofern nichts anderes angegeben ist. Die bevorzugten Reagenzien, Kalibratoren und Kontrollproben für einen bevorzugten Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay der vorliegenden Erfindung sind in Beispiel 7 zu finden.
- Das bevorzugte FPIA-Verfahren ist besonders ausgelegt, um in Zusammenhang mit dem Abbott TDx® Clinical Analyzer, dem Abbott TDxFLxTM oder dem Abbott ADx® Drugs of Abuse System verwendet zu werden, die alle von Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois, erhältlich sind. Die Kalibratoren, Kontrollproben oder unbekannten Proben werden direkt in die Probenvertiefung der TDx® -Probenkassette pipettiert. Einer der Vorteile dieses Verfahrens ist, dass die Probe keine besondere Vorbereitung erfordert. Das Assayverfahren ist von dieser Stelle an voll automatisiert.
- Wenn ein manueller Assay durchgeführt werden soll, wird die Probe mit einer Vorbehandlungslösung in Verdünnungspuffer gemischt und eine Hintergrundablesung vorgenommen. Der Fluoreszenztracer wird danach mit der Probe gemischt. Der Antikörper wird dann zuletzt in die Testlösung gemischt. Nach Inkubation erfolgt eine Ablesung der Fluoreszenzpolarisation. Der Fluoreszenzpolarisationswert für jeden Kalibrator, jede Kontrollprobe und jede Probe wird bestimmt und auf dem Ausgabeband eines Meßgerätes ausgedruckt, z. B. dem Abbott TDx® Analyzer, TDxFLxTM oder dem ADx® System. Eine Standardkurve wird im Messgerät durch Auftragen der Polarisation für jeden Kalibrator über dessen Konzentration unter Verwendung einer nichtlinearen Regressionsanalyse erzeugt. Die Konzentration jeder Kontrollprobe oder Probe wird von der gespeicherten Kalibrierkurve abgelesen und auf dem Ausgabeband ausgedruckt. In Bezug auf das vorhergehende bevorzugte Verfahren sollte beachtet werden, dass Tracer, Antikörper, Vorbehandlungslösung, Waschlösung, Kalibratoren und Kontrollproben zwischen etwa 2ºC und 8ºC aufzubewahren sind, während der Verdünnungspuffer bei Raumtemperatur aufbewahrt werden sollte. Eine Standardkurve und Kontrollproben sollten alle zwei Wochen ermittelt werden, wobei jeder Kalibrator und jede Kontrollprobe zweifach gemessen werden sollte. Alle Proben können zweifach gemessen werden.
- Die folgenden Beispiele dienen dazu, Ausführungen der Erfindung ausführlicher darzustellen, und sind nicht als Beschränkung für den Schutzumfang der Erfindung aufzufassen.
- Die folgenden allgemeinen experimentellen Verfahren wurden zur Herstellung der Haptene der folgenden Beispiele verwendet.
- Dieses Beispiel illustriert die Herstellung von (2S,3R)-4- Dimethylamino-1,2-diphenyl-3-methylbutan-2-ol, entsprechend Formel (I) unten, für die Verwendung in der Herstellung von Haptenen und Tracern der Erfindung.
- Zu einer gekühlten (0ºC) Suspension von 200 Milligramm (mg, 0,53 mmol) Dextropropoxyphenhydrochlorid in 3,0 Milliliter (ml) wasserfreiem Tetrahydrofuran (THF) wurden 22 mg (0,59 mmol) Lithiumaluminiumhydrid hinzugegeben. Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur erwärmt und 4 Stunden (h) gerührt. Die Reaktion wurde dann mit Wasser abgelöscht, mit 2 molarer (M) wässriger Kaliumhydroxidlösung basisch gestellt und 3 mal mit 10 ml Aliquoten Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden über MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und zu 164 mg eines klaren, farblosen Öls von (2S,3R)-4-Dimethylamino-1,2-diphenyl- 3-methylbutan-2-ol eingeengt, was ohne weitere Reinigung weiter verwendet wurde.
- Dieses Beispiel illustriert die Herstellung von (2S,3R)-4- Dimethylamino-1,2-diphenyl-3-methyl- 2-(ethoxycarbonylmethylaminocarbonyloxy)butan, entsprechend Formel (II) unten.
- Eine Lösung von 127 mg (0,45 mmol) des klaren farblosen Öls (des Alkohols), das unmittelbar oben hergestellt wurde, in einer Mischung aus 1,0 ml Benzol und 1,0 ml Toluol wurde fraktionell destilliert, und nur 1,0 ml Destillat wurde gesammelt. Die verbleibende Lösung wurde gekühlt und 0,15 ml (1,34 mmol) Ethylisocyanatacetat, OCN-CH&sub3;COOCH&sub2;CH&sub3;, wurden hineingespritzt. Die resultierende Lösung wurde 1 Stunde am Rückflusskühler erhitzt, gekühlt und mit 2 Tropfen Wasser abgelöscht. Das resultierende Gemisch wurde auf einem Rotationsverdampfer eingeengt und direkt chromatographiert auf einer 1 · 18 Zentimeter (cm) Säule aus Silicagel, gepackt mit Chloroform und eluiert mit 50 ml Aliquoten von Lösungen mit 2 Vol-%, 6 Vol-% bzw. 10Vol-% Methanol in Chloroform. Insgesamt 269 mg eines klaren, farblosen Öls des Esters (2S,3R)-4-Dimethylamino-1,2-diphenyl-3- methyl-2-(ethoxycarbonylmethylaminocarbonyloxy)butan wurden erhalten.
- Dieses Beispiel illustriert die Herstellung von (2S,3R)-4- Dimethylamino-1,2-diphenyh-3-methyl- 2-(carboxymethylaminocarbonyloxy)butan, entsprechend Formel (III) unten, einem Hapten der Erfindung.
- Kaliumhydroxid (24 mg, 0,43 mmol) wurde zu einer Lösung von 118 mg (0,29 mmol) des klaren farblosen Öls des Esters (hergestellt in Beispiel 2 oben) in einem Gemisch aus 0,75 ml Tetrahydrofuran und 0,75 ml Wasser hinzugegeben. Die Lösung wurde 12 h bei Raumtemperatur gerührt, auf pH 7 angesäuert und eingeengt. Das Konzentrat wurde erneut in Methanol gelöst und die Lösung auf zwei 0, 50 Millimeter (mm) · 20 cm · 20 cm Platten aufgestreift, die mit einer 30 Vol-% Lösung von Methanol in Chloroform (Methanol/Chloroform) entwickelt wurden. Das Produkt wurde von der pulverisierten abgeschabten Bande mit 80% Methanol/Chloroform eluiert und zu 50 mg eines weißen Feststoffs der Säure (2S,3R)-4-Dimethylamino-1,2-diphenyl-3-methyl- 2-(carboxymethylaminocarbonyloxy)butan eingeengt.
- Dieses Beispiel illustriert die Herstellung von (2S,3R)-4- Dimethylamino-1,2-diphenyl-3-methyl-2-(5- fluoresceinylaminocarbonylmethylaminocarbonyloxy)butan, entsprechend Formel (IV) unten, einem Tracer der Erfindung.
- Zu einer gekühlten (0ºC) Lösung von 3,6 mg (9,3 Mikromol, umol) der weißen festen Säure aus Beispiel 3 oben, in 100 Mikroliter (ul) Dimethylformamid, wurden 1,2 ul (9,3 umol) Isobutylchlorameisensäureester hinzugegeben. Die resultierende Lösung wurde 1 Stunde gerührt, auf Raumtemperatur erwärmen gelassen und dann wieder auf 0ºC abgekühlt. 5-Fluoresceinamin (3,2 mg, 9,3 umol) wurden dann hinzugegeben und die resultierende Lösung 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde eingeengt, wieder in Methanol gelöst und auf 0,25 mm · 20 cm · 20 cm Platten aufgestreift. Entwicklung mit 20% Methanol/Chloroform und Elution der pulverisierten Bande mit 80% Methanol/Chloroform lieferte 8,1 mg eines orangefarbenen Feststoffs. Dieser Feststoff wurde auf einer weiteren 0,25-mm- Platte erneut chromatographiert unter Elution mit 70 : 30 : 2 Chloroform : Methanol : Eisessig. Die Bande wurde pulverisiert und mit 80% Methanol/Chloroform eluiert und lieferte 32 mg eines orangefarbenen Feststoffs. Dieser Feststoff wurde wieder zweimal auf weiteren 0,25-mm-Platten chromatographiert, mit jeweils 50% Methanol/Chloroform entwickelt, und jede pulverisierte Bande wurde mit 80 : 20 : 1 Methanol: Chloroform : konz. Ammoniumhydroxid eluiert. 4,5 mg eines orangefarbenen Feststoffs von (2S,3R)-4- Dimethylamino-1,2-diphenyl-3-methyl-2-(5- fluoresceinylaminocarbonylmethylaminocarbonyloxy)butan wurden nach der Endreinigung erhalten.
- Dieses Beispiel illustriert die Herstellung von (2S,3R)-4- Dimethylamino-1,2-diphenyl-3-methyl-2-[1-(but-4- enyl)carbonyloxy]butan, entsprechend Formel (V) unten, einer Vorstufe zur Herstellung eines Haptens der Erfindung.
- Eine Lösung von 153 mg (0,54 mmol) des klaren farblosen Öls (des Alkohols), das in Beispiel 1 oben hergestellt wurde, in einem Gemisch aus 1,0 ml Benzol und 1,0 ml Toluol wurde fraktionell destilliert und nur 1,0 ml des Destillats wurden gesammelt. Die verbleibende Lösung wurde auf Raumtemperatur gekühlt, und eine Lösung von 1,00 mmol 4-Pentenoylchlorid in Benzol wurde hinzugegeben. Das resultierende Gemisch wurde allmählich erwärmt; das Benzol wurde durch Destillation entfernt und das verbleibende Gemisch 2 Stunden am Rückflusskühler erhitzt. Der Niederschlag, der sich bildete, wurde filtriert und mit 2 ml Toluol gewaschen. Die vereinigten Filtrate und Waschlösungen wurden in Chloroform verdünnt, mit 2 M Kaliumhydroxidlösung extrahiert, über MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und eingeengt. Der resultierende Olefinester wurde ohne weitere Reinigung verwendet.
- Dieses Beispiel illustriert die Herstellung von (2S,3R)-4- Dimethylamino-1,2-diphenyl-3-methyl-2-[1-(propan-3- al)carbonyloxy]butan, entsprechend Formel (VI) unten, eines Haptens der Erfindung.
- Zu einer gekühlten (0ºC) Lösung von 40 mg (0,11 mmol) des Olefinesters, hergestellt in Beispiel 5 oben, in 0,50 ml Dichlormethan wurden 50 ul Trifluoressigsäure hinzugegeben. Das resultierende Gemisch wurde nach Erwärmung auf Raumtemperatur 5 Minuten gerührt, eingeengt und erneut in 5,0 ml Methanol gelöst. Die resultierende Lösung wurde ozonisiert, bis sich eine blaue Farbe anhielt. Überschüssiges Ozon wurde durch Hindurchleiten eines Argonstroms entfernt, und. die resultierende farblose Reaktionsmischung wurde mit 0,10 ml Dimethylsulfid abgelöscht. Das Reaktionsgemisch wurde langsam (über einen Zeitraum von etwa 1 h) auf Raumtemperatur angewärmt und eingeengt, um 69 mg eines schwachgelben Öls des Haptens, (2S,3R)-4-Dimethylamino-1,2- diphenyl-3-methyl-2-[1-(propan-3-al)carbonyloxy]butan zu liefern. Das Hapten wurde an ein Protein konjugiert zur Bildung eines Immunogens der Erfindung entsprechend dem Verfahren, das in Beispiel 7 unten beschrieben ist.
- Dieses Beispiel illustriert die Herstellung eines Immunogens der Erfindung, das durch Formel (VII) unten illustriert wird, in der BTG für eine Rinderthyroglobulinkomponente steht, die über eine Amidbindung an den Rest der Verbindung angelagert ist.
- (a) Eine Menge von 53,0 mg des Haptens (VI) aus Beispiel 6 wurde zu 1,0 ml deionisiertem Wasser und 0,5 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) hinzugegeben. Ein Volumen von 0,750 ml (mit 26,5 mg Hapten) der resultierenden Lösung wurde zu 10,4 ml einer Lösung von Rinderthyroglobulin (mit 10 mg/ml Thyroglobulin und 0,05 molarem (M) Natriumphosphat und einem pH von 7,0) zugegeben und das Gemisch 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Fünf Zugaben von je 50 mg Natriumcyanotetrahydridoborat wurden in Abständen von 2 Stunden zwischen den jeweiligen Zugaben zu dem resultierenden Gemisch hinzugegeben, wobei der pH des Gemischs mit 0,1 normaler (N) HCl auf etwa 7,0 vor jeder Zugabe eingestellt wurde. Nach der letzten Zugabe von Natriumcyanotetrahydridoborat wurde das Gemisch 2 Stunden gerührt. Als nächstes wurde das Gemisch in einer Cellulosedialysierhülse gegen 0,05 M Natriumphosphat bei pH = 7,5 36 Stunden lang dialysiert, wobei das Dialysat viermal ausgetauscht wurde. Nach der Dialyse wurde das Gemisch in Sorvall bei 10.000 Umdrehungen pro Minute (rpm) 10 Minuten zentrifugiert. Für den Überstand wurde mit dem Lowry- Proteinkonzentrationsbestimmungsverfahren ermittelt, dass er 9,78 mg/ml Protein enthält.
- (b) Antiseren wurden von dem Immunogen von Teil (a) unmittelbar oben hergestellt und in Fluoreszenzpolarisationsimmunoassays (FPIAs) verwendet, die auf die Bestimmung von Propoxyphen in Urinproben ausgerichtet sind.
- Die Konfiguration der Reagenzien, Kalibratoren und Kontrollproben für die FPIAs sind folgendermaßen:
- (c) Die Tracer-Formulierung ist 100 nanomolarer Tracer in: 0,1 molarem Natriumphosphatpuffer mit pH = 6,3, 0,01 Prozent Rindergammaglobulin, 5 Prozent 5-Sulfosalicylat und 0,1 Prozent Natriumazid.
- (d) Die Antiserum-Formulierung enthält Schafserum verdünnt mit: 0,1 molarem Trispuffer mit pH = 7,5, 2 Prozent Ethylenglykol, 0,1 Prozent Natriumazid und 0,05 Prozent Rindergammaglobulin.
- (e) Die Vorbehandlungslösung besteht aus 0,1 molarem Trispuffer mit pH = 7,5, 0,01 Prozent Rindergammaglobulin, 0,1 Prozent Natriumazid und 4 mg/ml Riboflavinbindendes Protein.
- (f) Die Waschlösung besteht aus: 0,1 molarem Natriumphosphatpuffer mit pH = 7,5, 0,1 Prozent Natriumazid und 0,01 Prozent Rindergammaglobulin.
- (g) Der Verdünnungspuffer besteht aus: 0,1 molarem Natriumphosphatpuffer mit pH = 7,5, 0,1 Prozent Natriumazid und 0,01 Prozent Rindergammaglobulin.
- (h) Der Kalibrator-/Kontrollprobenverdünner besteht aus: normalem Humanurin und 0,1 Prozent Natriumazid.
- (i) Propoxyphenkalibratoren bestehen aus Propoxyphen in behandeltem normalen Humanurin bei Konzentrationen von 0,0, 150,0, 300,0, 500,0, 1000,0 und 1500,0 Nanogramm pro Milliliter.
- (j) Propoxyphenkontrollproben bestehen aus: Propoxyphen in behandeltem normalen Humanurin bei Konzentrationen von 200,0, 400,0 und 900,0 Nanogramm pro Milliliter.
- (k) Die Assays verwendeten eine Sechs-Punkte-Kalibrierkurve mit Dextropropoxyphen als Kalibrator. Die Kalibrierkurve hat eine Mindeststabilität von 2 Wochen und erstreckt sich von 0,0 ng/ml bis 1500,0 ng/ml. Die Assays haben eine Empfindlichkeit von 20,0 ng/ml. Die Empfindlichkeit ist definiert als die geringste messbare Konzentration, die mit 95 Prozent Vertrauensbereich von null unterschieden werden kann.
- Die Reproduzierbarkeit des TDx®-Messgeräts wurde an zehn verschiedener Tagen über einen Zeitraum von zwei Wochen durch Testen von je fünf Wiederholungen von Dextropropoxyphen in Humanurin bei 200, 400 und 900 ng/ml bestimmt. Die Konzentration wurde jeweils aus einer einzelnen Standardkurve bestimmt, die am ersten Tag der Studie erstellt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 unten zusammengefasst. Tabelle 1
- Die Reproduzierbarkeit des ADx®-Messgeräts wurde über fünfzehn verschiedene Läufe, in Kombination, Batch- und Panelmodus, durch Prüfen von je vier Wiederholungen von Dextropropoxyphen in Humanurin bei 200, 400 und 900 ng/ml bestimmt. Die Konzentration wurde jeweils aus einer Standardkurve bestimmt, die zweifach am ersten Tag der Studie erstellt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 unten zusammengefasst. Tabelle 2
- Zwei Sätze von Kalibratoren und Kontrollproben wurden durch Zugabe bekannter Mengen Dextropropoxyphen zu Humanurin und X Systems Verdünnungspuffer mit Konzentrationen von 150, 200, 300, 400, 500, 900, 1000 und 1500 ng/ml hergestellt. Eine Kalibrierung wurde mit Urinkalibratoren durchgeführt und beide Sätze der Kalibratoren bezüglich dieser Kalibrierung untersucht. In der folgenden Tabelle 3 entspricht "% Wiedergewinnung" dem Wert 100 · (gemessene Konzentration in Puffer dividiert durch gemessene Konzentration in Urin). Tabelle 3 Wiedergewinnung
- Verschiedene Testverbindungen wurden mit dem Dextropropoxyphenassay untersucht (um die Kreuzreaktivität zu bestimmen), nachdem eine bekannte Menge Testverbindung zu wirkstofffreiem Humanurin hinzugegeben wurde. In den folgenden Tabellen 4 und 5 entspricht "% Kreuzreaktivität" dem Wert 100 · ("Gefundene Konzentration" dividiert durch "Zugesetzte Konzentration"). Die Kreuzreaktivität wurde für Nordextropropoxyphen (N-Norpropoxyphen) untersucht. Die Ergebnisse für Dextropropoxyphen sind in Tabelle 4 unten zusammengefasst. Von den Ergebnissen aus Tabelle 4 ist ersichtlich, dass die Erfindung Immunoassays bereitstellen kann, die eine vorteilhaft hohe Kreuzreaktivität für Nordextropropoxyphen (NDP) aufweisen. Tabelle 4
- Die Kreuzreaktivitäten wurden ebenso für Verbindungen (Störkomponenten) gemessen, die eine ähnliche chemische Struktur aufweisen oder gleichzeitig von Menschen verwendet werden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengefasst. In Tabelle 5 bedeutet "ND*" "None Detected (Nichts nachgewiesen)", was bedeutet, dass die Konzentration kleiner als die Empfindlichkeit des Assays ist. Aus Tabelle 5 ist ersichtlich, dass die Erfindung Immunoassays bereitstellen kann, die eine vorteilhaft geringe Kreuzreaktivität für potentielle Störkomponenten aufweisen. Tabelle 5 Kreuzreaktivität / Störkomponenten
Claims (27)
1. Ein im wesentlichen optisch reines Hapten, das für die
Produktion von Antikörpern und Tracern nützlich ist, die in
einem Immunoassay für Dextropropoxyphen und/oder
Nordextropropoxyphen nützlich sind, und wobei das Hapten der
Formel (IX) entspricht:
worin
Z gleich -NH- ist;
X gleich -CHO, -COOH, -NH&sub2; oder -COOR ist, worin R eine C&sub1;-C&sub3;
-Alkylgruppe ist;
m gleich 0 oder 1 ist; und
n eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist.
2. Das Hapten nach Anspruch 1, worin m = 0 und n = 3 ist.
3. Das Hapten nach Anspruch 2, worin X gleich -CHO ist.
4. Immunogen, das von einem im wesentlichen optisch reinen
Hapten abgeleitet ist und in der Lage ist, Antikörper zu bilden,
die in einem Immunoassay für Dextropropoxyphen und/oder
Nordextropropoxyphen nützlich sind, und wobei das Immunogen der
Formel (X) entspricht:
worin
Z gleich -NH- ist;
Y gleich -NH-, -(CO)NH- oder -NH(CO)- ist;
m gleich 0 oder 1 ist;
n eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist; und
A eine Antigenität-verleihende Trägerkomponente ist.
5. Das Immunogen nach Anspruch 4, worin m = 0 und n = 3 ist.
6. Das Immunogen nach Anspruch 5, worin Y gleich -NH- ist.
7. Das Immunogen nach Anspruch 4, worin die
Antigenitätverleihende Trägerkomponente eine Poly(aminosäure) ist.
8. Das Immunogen nach Anspruch 4, worin die
Antigenitätverleihende Trägerkomponente Rinderthyroglobulin ist.
9. Ein Antiserum, das als Antwort auf ein Immunogen
gebildet wird, das von einem im wesentlichen optisch reinen
Hapten abgeleitet ist, und das in einem Immunoassay für
Dextropropoxyphen und/oder Nordextropropoxyphen nützlich ist,
und wobei das Immunogen der Formel (X) entspricht:
worin
Z gleich -NH- ist;
Y gleich -NH-, - (CO) NH- oder -NH (CO) - ist;
m gleich 0 oder 1 ist;
n eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist; und
A eine Antigenität-verleihende Trägerkomponente ist.
10. Das Antiserum nach Anspruch 9, worin m = 0 und n = 3 ist.
11. Das Antiserum nach Anspruch 10, worin Y gleich -NH-
ist.
12. Das Antiserum nach Anspruch 9, worin die
Antigenitätverleihende Trägerkomponente eine Poly(aminosäure) ist.
13. Das Antiserum nach Anspruch 9, worin die
Antigenitätverleihende Trägerkomponente Rinderthyroglobulin ist.
14. Ein fluoreszierender Tracer, der von einer im
wesentlichen optisch reinen Verbindung abgeleitet ist, und der
in einem Immunoassay für Dextropropoxyphen und/oder
Nordextropropoxyphen nützlich ist und der Formel (XI)
entspricht:
worin
Z gleich -NH- ist;
Y gleich -NH-, -(CO)NH- oder -NH(CO)- ist;
m gleich 0 oder 1 ist;
n eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist; und
FL eine Fluoreszenz-verleihende Komponente ist.
15. Der fluoreszierende Tracer nach Anspruch 14, worin m = 1
und n = 1 ist.
16. Der fluoreszierende Tracer nach Anspruch 15, worin Y
gleich -(CO)NH- ist.
17. Der fluoreszierende Tracer nach Anspruch 14, worin die
Fluoreszenz-verleihende Komponente ein monovalenter Rest von
Fluorescein oder ein monovalenter Rest eines Fluorescein-
Derivats ist.
18. Ein verbesserter Immunoassay für den Nachweis des
Vorhandenseins oder der Menge von Dextropropoxyphen und/oder
Nordextropropoxyphen in einer Probe, der einen Schritt enthält,
bei dem die Probe mit Antikörpern in Kontakt gebracht wird, die
als Antwort auf ein Immunogen aufgezogen wurden, und worin die
Verbesserung umfaßt, daß als Immunogen ein Immunogen verwendet
wird, das von einem im wesentlichen optisch reinen Hapten
abgeleitet ist, und das Immunogen der Formel (X) entspricht:
worin
Z gleich -NH- ist;
Y gleich -NH-, -(CO)NH- oder -NH(CO)- ist;
m gleich 0 oder 1 ist;
n eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist; und
A eine Antigenität-verleihende Trägerkomponente ist.
19. Der verbesserte Immunoassay nach Anspruch 18, worin Y
gleich -NH-, m = 0 und n = 3 ist.
20. Der verbesserte Immunoassay nach Anspruch 19, worin die
Antigenität-verleihende Trägerkomponente eine Poly(aminosäure)
ist.
21. Der verbesserte Immunoassay nach Anspruch 19, worin die
Antigenität-verleihende Trägerkomponente Rinderthyroglobulin
ist.
22. Ein Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay für den
Nachweis des Vorhandenseins oder der Menge von Dextropropoxyphen
und/oder Nordextropropoxyphen in einer Probe, der einen Schritt
enthält, bei dem die Probe mit Antikörpern in Kontakt gebracht
wird, die als Antwort auf ein Immunogen aufgezogen wurden, das
von einem im wesentlichen optisch reinen Hapten abgeleitet
wurde, und wobei das Immunogen der Formel (X) entspricht:
worin
Z gleich -NH- ist;
Y gleich -NH-, -(CO)NH- oder -NH(CO)- ist;
m gleich 0 oder 1 ist;
n eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist; und
A eine Antigenität-verleihende Trägerkomponente ist.
23. Der Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay nach Anspruch
22, der einen Schritt enthält, bei dem die Probe mit einem
fluoreszierenden Tracer in Kontakt gebracht wird, der von einer
im wesentlichen optisch reinen Verbindung abgeleitet ist, und
wobei der Tracer der Formel (XI) entspricht:
worin
Z gleich -NH- ist;
Y gleich -NH-, -(CO)NH- oder -NH(CO)- ist;
m gleich 0 oder 1 ist;
n eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist; und
FL eine Fluoreszenz-verleihende Komponente ist.
24. Der Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay nach Anspruch
23, worin für den Tracer m = 1 und n = 1 ist.
25. Der Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay nach Anspruch
24, worin für den Tracer Y gleich -(CO)NH- ist.
26. Der Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay nach Anspruch
23, worin die Fluoreszenz-verleihende Komponente ein
monovalenter Rest von Fluorescein oder ein monovalenter Rest
eines Fluorescein-Derivats ist.
PATENTANSPRÜCHE
1. Ein verbesserter Immunoassay für den Nachweis des
Vorhandenseins oder der Menge von Dextropropoxyphen und/oder
Nordextropropoxyphen in einer Probe, der einen Schritt enthält,
bei dem die Probe mit Antikörpern in Kontakt gebracht wird, die
als Antwort auf ein Immunogen aufgezogen wurden, und worin die
Verbesserung darin besteht, dass als Immunogen ein Immunogen
verwendet wird, das von einem im wesentlichen optisch reinen
Hapten abgeleitet ist, und das Immunogen der Formel (X)
entspricht:
worin
Z gleich -NH- ist;
Y gleich -NH-, -(CO)NH- oder -NH(CO)- ist;
m gleich 0 oder 1 ist;
n eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist; und
A eine Antigenität-verleihende Trägerkomponente ist.
2. Der verbesserte Immunoassay nach Anspruch 1, worin Y
gleich -NH-, m = 0 und n = 3 ist.
3. Der verbesserte Immunoassay nach Anspruch 2, worin die
Antigenität-verleihende Trägerkomponente eine Poly(aminosäure)
ist.
4. Der verbesserte Immunoassay nach Anspruch 2, worin die
Antigenität-verleihende Trägerkomponente Rinderthyroglobulin
ist.
5. Ein Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay für den Nachweis
des Vorhandenseins oder der Menge von Dextropropoxyphen und/oder
Nordextropropoxyphen in einer Probe, der einen Schritt enthält,
bei dem die Probe mit Antikörpern in Kontakt gebracht wird, die
als Antwort auf ein Immunogen aufgezogen wurden, das von einem
im wesentlichen optisch reinen Hapten abgeleitet wurde, und
wobei das Immunogen der Formel (X) entspricht:
worin
Z gleich -NH- ist;
Y gleich -NH-, -(CO)NH- oder -NH(CO)- ist;
m gleich 0 oder 1 ist;
n eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist; und
A eine Antigenität-verleihende Trägerkomponente ist.
6. Der Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay nach Anspruch 5,
der einen Schritt enthält, bei dem die Probe mit einem
fluoreszierenden Tracer in Kontakt gebracht wird, der von einer
im wesentlichen optisch reinen Verbindung abgeleitet ist, und
der Tracer der Formel (XI) entspricht:
worin
Z gleich -NH- ist;
Y gleich -NH-, -(CO)NH- oder -NH(CO)- ist;
m gleich 0 oder 1 ist;
n eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist; und
FL eine Fluoreszenz-verleihende Komponente ist.
7. Der Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay nach Anspruch 6,
worin für den Tracer m = 1 und n = 1 ist.
8. Der Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay nach Anspruch 7,
worin für den Tracer Y gleich -(CO)NH- ist.
9. Der Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay nach Anspruch 6,
worin die Fluoreszenz-verleihende Komponente ein monovalenter
Rest von Fluorescein oder ein monovalenter Rest eines
Fluorescein-Derivats ist.
10. Verwendung eines Immunogens, das von einem im
wesentlichen optisch reinen Hapten abgeleitet ist, zur Bildung
von Antiserum, das in einem Immunoassay für Dextropropoxyphen
und/oder Nordextropropoxyphen nützlich ist, und das Immunogen
der Formel (X) entspricht:
worin
Z gleich -NH- ist;
Y gleich -NH-, -(CO)NH- oder -NH(CO)- ist;
m gleich 0 oder 1 ist;
n eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist; und
A eine Antigenität-verleihende Trägerkomponente ist.
11. Die Verwendung eines Immunogens nach Anspruch 10, worin
m = 0 und n = 3 ist.
12. Die Verwendung eines Immunogens nach Anspruch 11, worin
Y gleich -NH- ist.
13. Die Verwendung eines Immunogens nach Anspruch 10, worin
die Antigenität-verleihende Trägerkomponente eine
Poly(aminosäure) ist.
14. Die Verwendung eines Immunogens nach Anspruch 10, worin
die Antigenität-verleihende Trägerkomponente Rinderthyroglobulin
ist.
15. Ein Verfahren zum Herstellen eines Immunogens, mit dem
Antikörper gebildet werden können, die in einem Immunoassay für
Dextropropoxyphen und/oder Nordextropropoxyphen nützlich sind,
und wobei das Immunogen der Formel (X) entspricht:
worin
Z gleich -NH- ist;
Y gleich -NH-, -(CO)NH- oder -NH(CO)- ist;
m gleich 0 oder 1 ist;
n eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist; und
A eine Antigenität-verleihende Trägerkomponente ist,
und wobei das Verfahren den Schritt des kovalenten Anbindens
eines im wesentlichen optisch reinen Haptens an eine
Antigenität-verleihende Trägerkomponente umfaßt, wobei das
Hapten der Formel (IX) entspricht:
worin
Z, m und n wie oben definiert sind und
X gleich -CHO, -COOH, -NH&sub2; oder -COOR ist, worin R eine C&sub1;-C&sub3;
-Alkylgruppe ist.
16. Das Verfahren nach Anspruch 15, worin m = 0 und n = 3 ist.
17. Das Verfahren nach Anspruch 16, worin X im Hapten
gleich NH&sub2; ist und das Hapten an die Trägerkomponente gekoppelt
wird durch Bildung einer Amidbindung mit einer Carboxylgruppe an
dieser Trägerkomponente zur Bildung eines Immunogens nach Formel
(X) , worin Y gleich -NH- ist.
18. Das Verfahren nach Anspruch 15, worin die
Antigenitätverleihende Trägerkomponente eine Poly(aminosäure) ist.
19. Das Verfahren nach Anspruch 15, worin die
Antigenitätverleihende Trägerkomponente Rinderthyroglobulin ist.
20. Ein Verfahren zum Herstellen eines fluoreszierenden
Tracers, der in einem Immunoassay für Dextropropoxyphen und/oder
Nordextropropoxyphen nützlich ist und der Formel (XI)
entspricht:
worin
Z gleich -NH- ist;
Y gleich -NH-, -(CO)NH- oder -NH(CO)- ist;
m gleich 0 oder 1 ist;
n eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist; und
FL eine Fluoreszenz-verleihende Komponente ist,
wobei das Verfahren den Schritt des Anbindens eines im
wesentlichen optisch reinen Haptens an eine geeignete
fluoreszierende Komponente umfaßt, wobei das Hapten der Formel
(IX) entspricht:
worin
Z, m und n wie oben definiert sind und
X gleich -CHO, -COOH, -NH&sub2; oder -COOR ist, worin R eine C&sub1;-C&sub3;
-Alkylgruppe ist.
21. Das Verfahren nach Anspruch 20, worin m = 1 und n = 1 ist.
22. Das Verfahren nach Anspruch 21, worin X im Hapten
gleich -COOH ist und das Hapten an FL-NH&sub2; gekoppelt wird durch
Bildung einer Amidbindung zur Bildung eines Tracers nach Formel
(XI), worin Y gleich -(CO)NH- ist.
23. Das Verfahren nach Anspruch 20, worin die
Fluoreszenzverleihende Komponente ein monovalenter Rest von Fluorescein
oder ein monovalenter Rest eines Fluorescein-Derivats ist.
24. Ein Verfahren zum Herstellen eines im wesentlichen
reinen Haptens, das für die Bildung von Antikörpern und Tracern
nützlich ist, die in einem Immunoassay für Dextropropoxyphen
nützlich sind, und das Hapten der Formel (IX) entspricht:
worin
Z gleich -NH- ist;
X gleich -CHO, -COOH, -NH&sub2; oder -COOR ist, und worin R eine C&sub1;-C&sub3;
-Alkylgruppe ist;
m gleich 0 oder 1 ist; und n eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist,
und das Verfahren folgende Schritte umfaßt:
a) In-Kontakt-Bringen von Dextropropoxyphenhydrochlorid mit
einem Reduktionsmittel zur Bildung des entsprechenden Alkohols;
b) Behandeln des Alkohols aus Schritt (a) mit einem
Acylhalogenid- oder Isocyanatreagenz, das eine zweite
Funktionalität enthält, die aus folgendem gewählt ist:
(i) einem Ester zur Bildung einer Verbindung nach Formel (IX),
worin X gleich -COOR ist, oder
(ii) einem Olefin zur Bildung eines ungesättigten
Zwischenprodukts; und alternativ
c) Hydrolysieren der -COOR-Gruppe aus Schritt (b) zur Bildung
einer Verbindung nach Formel (IX), worin X gleich -COOH ist;
d) Behandeln des ungesättigten Zwischenprodukts aus Schritt (b)
mit einem Oxidationsmittel und dann Durchführen einer geeigneten
Reduktion zur Umwandlung des Zwischenprodukts in eine Verbindung
nach Formel (IX), worin X gleich -CHO ist, optional gefolgt von
einer reduktiven Aminierung zur Bildung einer Verbindung nach
Formel (IX), worin X gleich -NH&sub2; ist; oder
e) Behandeln des ungesättigten Isocyanatzwischenprodukts aus
Schritt (b) mit einem Spaltungsreagenz zur Bildung einer
Verbindung nach Formel (IX), worin m gleich 1 ist und X gleich
-COOH ist.
25. Das Verfahren nach Anspruch 1 zum Herstellen eines
Haptens, worin n = 3 ist, und wobei das Verfahren die Behandlung
des Alkohols aus Schritt (a) mit einem Acylhalogenid in Schritt
(b) umfasst.
26. Das Verfahren nach Anspruch 25, die Schritt (d) enthält
zur Bildung einer Verbindung nach Formel (IX), worin X gleich
-CHOist.
27. Das Verfahren nach Anspruch 24, worin das
Reduktionsmittel aus Schritt (a) Lithiumaluminiumhydrid,
Diisobutylaluminiumhydrid oder
bis-(Methoxyethoxy)aluminiumhydrid ist, vorzugsweise
Lithiumaluminiumhydrid.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/736,890 US5239086A (en) | 1991-07-29 | 1991-07-29 | Haptens and tracers for immunoassays for propoxyphene |
| PCT/US1992/006297 WO1993003344A2 (en) | 1991-07-29 | 1992-07-22 | Haptens, tracers, immunogens and antibodies for immunoassays for propoxyphene |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE69231060D1 DE69231060D1 (en) | 2000-06-21 |
| DE69231060T2 true DE69231060T2 (de) | 2001-02-15 |
Family
ID=24961749
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE69231060T Expired - Fee Related DE69231060T2 (de) | 1991-07-29 | 1992-07-22 | Haptene, tracer, immunogene und antikörper für immunassays für propoxyphen |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5239086A (de) |
| EP (1) | EP0597034B1 (de) |
| JP (1) | JP3130043B2 (de) |
| CA (1) | CA2114327C (de) |
| DE (1) | DE69231060T2 (de) |
| ES (1) | ES2147731T3 (de) |
| WO (1) | WO1993003344A2 (de) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2175862A1 (en) * | 1995-05-19 | 1996-11-20 | Roberto Sundoro Wu | Propoxyphene derivatives for immunoassay reagents |
| DE102005019104A1 (de) * | 2005-04-25 | 2006-10-26 | Albupharm Heidelberg Gmbh & Co. Kg | Herstellung von Albumin-Fluorescein-Konjugaten für die intra-operative Diagnostik |
| WO2019204727A1 (en) * | 2018-04-19 | 2019-10-24 | Ellie LLC | Sample clarification and reduction of background fluorescence for fluorescent detection of analytes |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4025501A (en) * | 1975-03-20 | 1977-05-24 | Syva Company | Polypeptide propoxyphene derivatives for immunoassay reagents |
| US4012525A (en) * | 1975-10-10 | 1977-03-15 | Eli Lilly And Company | Novel propoxyphene dosage regimen |
| US6037455A (en) * | 1992-11-09 | 2000-03-14 | Biosite Diagnostics Incorporated | Propoxyphene derivatives and protein and polypeptide propoxyphene derivative conjugates and labels |
-
1991
- 1991-07-29 US US07/736,890 patent/US5239086A/en not_active Expired - Fee Related
-
1992
- 1992-07-22 ES ES92917936T patent/ES2147731T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-07-22 EP EP92917936A patent/EP0597034B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-07-22 DE DE69231060T patent/DE69231060T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1992-07-22 JP JP05503709A patent/JP3130043B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1992-07-22 CA CA002114327A patent/CA2114327C/en not_active Expired - Fee Related
- 1992-07-22 WO PCT/US1992/006297 patent/WO1993003344A2/en active IP Right Grant
-
1993
- 1993-05-12 US US08/060,937 patent/US5356820A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69231060D1 (en) | 2000-06-21 |
| EP0597034A1 (de) | 1994-05-18 |
| JP3130043B2 (ja) | 2001-01-31 |
| ES2147731T3 (es) | 2000-10-01 |
| JPH11510591A (ja) | 1999-09-14 |
| US5356820A (en) | 1994-10-18 |
| CA2114327C (en) | 2003-04-22 |
| EP0597034B1 (de) | 2000-05-17 |
| CA2114327A1 (en) | 1993-02-18 |
| US5239086A (en) | 1993-08-24 |
| EP0597034A4 (en) | 1996-04-10 |
| WO1993003344A2 (en) | 1993-02-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE69332988T2 (de) | Reagenzien zum Nachweis und zur Quantifizierung von Thyroxin in flüssigen Proben | |
| DE69022286T2 (de) | Reagenzien, Verfahren und Testsätze zum Nachweis von Amphetaminen durch einen Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassay. | |
| DE3875354T2 (de) | Fluoreszenzpolarisationsimmunassay fuer amphetamin/methamphetamin. | |
| DE3751432T2 (de) | Rezeptoren für Immunkomplexe, Verfahren zur ihrer Herstellung und Verfahren zur Prüfung diese benutzend. | |
| DE69113114T2 (de) | Test für Phencyclidin und Phencyclidin-Metaboliten, Tracer, Immunogene, Antikörper und Reagenzsatz dafür. | |
| DE69610716T2 (de) | Topiramate-immunoassay, sowie analoge und antikörper | |
| DE69231382T2 (de) | Neue konjugate und testverfahren für die gleichzeitige bestimmung von multiplen liganden | |
| DE69231559T2 (de) | Reagenzien und verfahren zur quantifizierung des totalgehaltes an doxepinen in biologischen flüssigkeiten | |
| US4160016A (en) | Receptor fluorescent immunoassay | |
| EP0013910B1 (de) | Theophyllin-Antigene und -Antikörper, Verfahren zu deren Herstellung, ihre Verwendung zur Bestimmung von Theophyllin, Reagens-Set und Antiserum für diese Verwendung | |
| DE69400709T2 (de) | Pterinderivate und seine anwendung zur herstellung von immunotestverfahren | |
| DE68924243T2 (de) | Verfahren und Reagenzien zum Nachweis von Amphetamin und/oder d-Methamphetamin in biologischen Proben. | |
| DE60207016T2 (de) | Verfahren und Kit zur Quantifizierung von Beta-Laktam Penizillinen | |
| CH627188A5 (de) | ||
| DE3205506C2 (de) | Carboxyfluorescein-Derivate und ihre Verwendung als Tracer zur Bestimmung von Liganden in biologischen Flüssigkeiten mittels einer Fluoreszenzpolarisationstechnik | |
| AU652809B2 (en) | Haptens, tracers, immunogens and antibodies for immunoassays for cotinine | |
| DE69428998T2 (de) | Reagenzien und verfahren zur detektion und quantitativen bestimmung von testosteron in flüssigen proben | |
| EP0747699A1 (de) | Entstörungsreagenz für die Bestimmung eines Analyten mit einem lumineszenzfähigen Metallkomplex | |
| DE69231060T2 (de) | Haptene, tracer, immunogene und antikörper für immunassays für propoxyphen | |
| DE69800486T2 (de) | Immunoassay für Glucuronid-Metabolite von LSD | |
| DE69023357T2 (de) | Fluoreszenz-Polarisationsimmunoassay für Methadon. | |
| DE3689688T2 (de) | Verbindungen und Immunoassay für tricyclische Antidepressiva. | |
| DE69722917T2 (de) | Reagenzien für tests für mycophenolsäure | |
| DE69126915T2 (de) | Test für Barbiturate, Tracer, Immunogene, Antikörper und Testsatz dafür | |
| DE3786037T2 (de) | Tracer zur Benutzung in immunologischen Fluoreszenz-Polarisationsverfahren zum Nachweis von Flecainid. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 8364 | No opposition during term of opposition | ||
| 8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |