JPH11510591A - プロポキシフェンのイムノアッセイ用ハプテン、トレーサー、免疫原および抗体 - Google Patents
プロポキシフェンのイムノアッセイ用ハプテン、トレーサー、免疫原および抗体Info
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Abstract
(57)【要約】
デキストロプロポキシフェンおよび/またはノルデキストロプロポキシフェンのイムノアッセイに有用な実質的に光学的に純粋なハプテンを開示する。このハプテンは特定の構造(IX)に相当する。更にハプテンから誘導された免疫原およびこのハプテンから誘導された免疫原に応答して産生された抗体も開示する。更にハプテンに相当する実質的に光学的に純粋な化合物から誘導され、デキストロプロポキシフェンおよび/またはノルデキストロプロポキシフェンのイムノアッセイに有用な蛍光性トレーサーも開示する。更に生物学的サンプル中のデキストロプロポキシフェンおよび/またはノルデキストロプロポキシフェンを決定する改善されたイムノアッセイであって、サンプルと免疫原に応答して産生された抗体とを接触させるステップを含む方法も開示する。更にデキストロプロポキシフェンおよび/またはノルデキストロプロポキシフェンを決定する蛍光偏光イムノアッセイ(FPIA)であって、サンプルと免疫原に応答して産生された抗体とを接触させるステップおよび/またはサンプルと蛍光トレーサーとを接触させるステップを含む方法も開示する。
Description
【発明の詳細な説明】
プロポキシフェンのイムノアッセイ用ハプテン、トレーサー、免疫原および抗 体
発明の背景技術分野
本発明はイムノアッセイ、特に尿、血清または血奨のような特に水性の流体の
生物学的サンプル中のデキストロプロポキシフェンおよび/またはデキストロプ
ロポキシフェンの主な代謝物質(主にノルデキストロプロポキシフェン)の定性
および/または定量分析をするイムノアッセイ、特に蛍光偏光イムノアッセイ(
FPIA)をするための試薬および方法ならびに該試薬に基く免疫アッセイに関
する。より詳しくは本発明は新規のハプテン、このハプテンから製造される免疫
原、このハプテンに対して産生した抗体および本発明の試薬および方法を利用す
るイムノアッセイに関する。従来技術
デキストロプロポキシフェンは麻酔性、鎮痛性を有し、広く治療用途に用いら
れる。不幸にもそれは悪用される薬物にもな
る。デキストロプロポキシフェンはまた以下の化学名によっても知られている。
[S−(R*,S*)]−α−[2−(ジメチルアミノ)−1−メチルエチル]−
α−フェニルベンゼンエタノールプロパノエート(エーテル);α−d−4−ジ
メチルアミノ−3−メチル−1,2−ジフェニル−2−ブタノールプロピオネー
ト;(+)−1,2−ジフェニル−2−プロピノキシ−3−メチル−4−ジメチ
ルアミノブタン;(+)−4−ジメチルアミノ−1,2−ジフェニル−3−メチ
ル−2−プロピオニルオキシブタン;α−d−4−ジメチルアミノ−3−メチル
−1,2−ジフェニルブタン−2−オールプロピオネート;およびd−プロポキ
シフェン。デキストロプロポキシフェンは以下の構造式に相当する。
R.J.Flanagan等によって“Measurement of De
xtropropoxyphene and Nordextropropox
yphene in Bi
ological Fluids”,Human Toxicol.(1984
),3,103S−114S中に報告されているように、デキストロプロポキシ
フェンおよびその主な血奨代謝物質であるノルデキストロプロポキシフェンを検
出、同定および定量するいろいろな方法が調べられた。そのような方法の例には
溶液の薄層クロマトグラフィー(TLC)および気−液クロマトグラフィー(G
LC)または尿もしくは胃内容物の固相抽出ならびにホモジニアスエンザイムイ
ムノアッセイ法が含まれる。
US 4,025,501はイムノアッセイにおいて(d,l)−プロポキシ
フェンおよびその代謝物質を認識する抗体の製造のための抗原と結合する化合物
に関する。この特許が扱っている化合物は1,2−ジフェニル−3−メチル−4
−ジメチルアミノ−2−ブタノールと2塩基酸とを反応させハーフ−酸エステル
を形成させて製造される。この開示されている酸基はタンパクまたはポリペプチ
ドのアミノ基との結合に対して活性化されている。
しかしながら、プロポキシフェンに対する現在存在するアッセイは都合の悪い
ことには種々の構造的に類似の化合物に対してよく交差反応しやすい。本発明は
多数の目的を有する。それ
らの中には、例えば、新規のハプテン、このハプテンから製造された免疫原およ
びこの免疫原に応答して産生された抗体を提供することが含まれる。これらはデ
キストロプロポキシフェンおよびその主な代謝物質ノルデキストロプロポキシフ
ェンに対して高い識別力があるイムノアッセイへの使用に適している。このイム
ノアッセイはとりわけメタドンおよびクロロフェノキサミンのような干渉化合物
に対する交差反応性が最小化または実質的に消去されている。
加えて、現在存在するプロポキシフェンに対するアッセイはプロポキシフェン
に対する抗体を産生する免疫原の製造において分子のラセミ混合物の使用を含む
。しかしながら、プロポキシフェンは分子中に2つの光学活性中心を有するので
、4つの異なった異性体の形態で存在し得る。このように、抗体を産生する免疫
原の製造にこのようなラセミ混合物を使用すると少なくとも4つのタイプの抗体
が導かれると信じられていて、そのうちのただ約25%がアッセイに適したプロ
ポキシフェンの光学形態を検出し得るのみである。市販されているプロポキシフ
ェンの形態は薬剤の光学活性な形態である。さらにいえば、プロポキシフェンの
4つの異性体の中で、ヒトの中で少しでも実質的な効能を有する形態、すなわち
デキストロプロポキシフェ
ンはただ1つの形態のみである。したがって、ヒトに効果を有するプロポキシフ
ェンのその形態および/またはその最も重要な代謝物質に対する定量アッセイに
特に適した抗体であって、その大部分が該薬剤の薬効を有しない形態よりも該薬
剤の薬効を有する形態と反応しやすい抗体を提供することが望まれていた。
本発明はイムノアッセイに関し、特にコンペティティブイムノアッセイに関す
る。これは試薬および技術を含み、生物学的流体中のデキストロプロポキシフェ
ンおよび/またはノルデキストロプロポキシフェンの定性および/または定量に
特に適している。本発明はとりわけ、他の類似化合物の干渉を最小化したデキス
トロプロポキシフェンおよび/またはその主な代謝物質、ノルデキストロプロポ
キシフェンの有意に効果的な定量を与える有益性を提供し得る。本発明は一部分
新規の実質的に光学的に純粋なハプテンに基き、このハプテンはイムノアッセイ
に使用するのに適した免疫原および/またはトレーサーの製造に使用し得る。
発明の要約
本発明は実質的に光学的に純粋なハプテンに関する。これはデキストロプロポ
キシフェンおよび/またはノルデキストロプ
ロポキシフェンのイムノアッセイに有用である。本発明のハプテンは構造式(I
X):
[式(IX)中、Zは−NH−部分であり、m=1のとき存在する。Xは−CH
O、−COOH、−NH2、およびRがC1〜C3アルキル基である−COORか
らなる群から選択される官能基である。式(IX)中、mは0または1であり得
て、nは1から3の整数であり得る。]に相当する。
本発明はまた、本発明のハプテンから誘導される免疫原を提供する。
本発明はまた、本発明のハプテンから誘導される免疫原に応答して産生された
抗体を提供する。
本発明はまた、本発明の実質的に光学的に純粋な化合物から誘導された蛍光ト
レーサーを提供する。このトレーサーはデキストロプロポキシフェンおよび/ま
たはノルデキストロプロポキシフェンに対するイムノアッセイに有用である。こ
の実質的
に光学的に純粋な化合物は式(IX)で示されるハプテンに相当する。
本発明はまた、生物学的サンプル中のデキストロプロポキシフェンおよび/ま
たはノルデキストロプロポキシフェンの定性または定量分析をする改善されたイ
ムノアッセイ法を提供する。この改善されたイムノアッセイ法はサンプルを本発
明の免疫原に応答して産生された抗体と接触させるステップを含む。さらに、本
発明は生物学的サンプル中のデキストロプロポキシフェンおよび/またはノルデ
キストロプロポキシフェンの定性または定量分析をする蛍光偏光イムノアッセイ
(FPIA)を提供する。このFPIAはサンプルを本発明の免疫原に応答して
産生された抗体と接触させるステップおよび/またはサンプルを本発明の蛍光ト
レーサーと接触させるステップを含む。
発明の詳細な説明
本発明のハプテンは実質的に光学的に純粋であり、特にデキストロプロポキシ
フェンおよび/またはデキストロプロポキシフェンの代謝物質であるノルデキス
トロプロポキシフェンのイムノアッセイに有用である。本明細書中において、「
実質的に光学的に純粋」という語句は、製造物であるハプテンが右旋性(dまた
は+)および左旋性(lまたは−)鏡像異性体の合計
に対して右旋性鏡像異性体を重量%で10%以下、好ましくは5%以下、最も好
ましくは2%以下のハプテンの含むことを意味する。本発明のハプテンは式(I
X):
[式(IX)中、Zは2価−NH−部分を示し、m=1のとき存在する。Xは−
CHO、−COOH、−NH2、およびRがC1〜C3アルキル基である−COO
Rからなる群から選択される官能基である。Xがアルデヒド基であるのが好まし
い。またRがエチル基であるのが好ましい。式(IX)中、mは0または1、好
ましくは0であり得て、nは1〜3の整数、好ましくは3であり得る。式(IX
)中、官能基Xは例えばハプテンに抗原性付与部分を、例えば直接のまたは中間
ステップを介する抗原性付与キャリヤーからの共反応性の官能基との反応によっ
て、結合させる用途に適した官能基である]に相当する。
本発明のハプテンは以下に説明する一般的製造方法により製造し得る。典型的
には、光学的に活性な本発明のデキストロプ
ロポキシフェン誘導体(ハプテン)はデキストロプロポキシフェン塩酸塩と適当
な還元剤との反応により製造される。得られたアルコールを他の官能基に変換し
得る第2の官能性を含むアシルハライドまたはイソシアネート試薬での処理によ
って誘導体化する。この新しい官能基はデキストロプロポキシフェン誘導体を与
え、これにより抗原分子にカップリングされるように製造される。第2の官能性
はエステルまたはオレフィンであり得る。この方法中のこのような方法によるデ
キストロプロポキシフェン誘導体の連鎖の同化に用いられる全方法は光学純度の
高いハプテン性デキストロプロポキシフェン誘導体を得る中心である。
本発明のハプテンの製造で使用し得る還元剤にはリチウムアルミニウムハイド
ライド、ジイソブチルアルミニウムハイドライド、ビス−(メトキシエトキシ)
アルミニウムハイドライドおよび類似物のような還元剤が含まれ、リチウムアル
ミニウムハイドライドが好ましい。
上記のアシルハライドまたはイソシアネート試薬は好ましくはペンテノイルク
ロリド、ブテノイルクロリド、エチルイソシアネートアセテート、エチル−3−
イソシアネートプロピネートおよび類似物のような脂肪族酸クロライドまたは脂
肪族イソ
シアネートであり、ハプテン形成にはペテノイルクロリドが好ましい。芳香族酸
から誘導される酸クロライドおよびイソシアネートは好ましくない。
抗原分子とカップリングするための酸ハライド分子中に存在する第2官能性の
改質は、存在する置換基のタイプに依存する2つのタイプの試薬を使用する。ブ
テノイルクロリドのような不飽和酸クロライドは、オレフィンを含んだデキスト
ロプロポキシフェン誘導体を導く。オレフィンはテトラアセチル酸鉛、過ヨウ素
酸ナトリウム、オゾンを含むいろいろな酸化試薬を使用し、その後、適当な還元
操作および類似の操作でアルデヒドに変換し得る。不飽和イソシアネートもまた
適当な開裂試薬での処理により酸を含むオレフィン性デキストロプロポキシフェ
ンを導く。これらの試薬は酸、塩基、芳香族硫化物塩、ヨウ素化シリルおよび類
似物を含む。第2のエステル置換性を含む酸クロライドもまた酸を含むデキスト
ロプロポキシフェン誘導体を導き得る。
得られたデキストロプロポキシフェニックアルデヒドおよび酸の両方を抗原分
子に当業者に公知の方法で連結する。
本発明のハプテンから製造された免疫原から産生した抗血清を使用して行う蛍
光偏光イムノアッセイはデキストロプロポキ
シフェンおよび/またはノルデキストロプロポキシフェンに対する、特に高い特
異性および、とりわけメタドンおよびクロロフェノキサミンのような干渉化合物
に対する、特に低い交差反応性を与え得ることが見出された。
本発明の免疫原は本発明の実質的に光学的に純粋なハプテンから導かれる。本
発明の免疫原は特にデキストロプロポキシフェンおよび/またはノルデキストロ
プロポキシフェンのイムノアッセイに有用である。この免疫原は式(X):
[式中、Zは上記式(IX)に相当するハプテンに対して定義した通りである。
式(X)中、Yは(CH2)n基を抗原性付与部分Aに連結する2価部分である。
Yは−NH−、−(CO)NH−、または−NH(CO)−で有り得て、−NH
−が好ましい。本明細書中および請求の範囲中において、2つの別々の構造を連
結する2原子価部分は常に次のように特定する。例えばYとして(CH2)nおよ
びAを連結する−(CO)NH−
は2価部分の左手部分が、左の構造と結合していて、右手部分が、右の構造と結
合している((換言すると、この例では(CH2)n−(CO)NH−A))。式
(X)中において、下付き文字mは0または1であり得て、0が好ましく、下付
き文字nは1〜3の整数であり得て、3が好ましい。抗原性付与キャリヤー部分
Aは広くいろいろな抗原性付与キャリヤー部分から選択され得る。式(X)で認
められ得たように、A部分は式(X)の免疫原のハプテニック部分にYを介して
結合する抗原性付与キャリヤーの残基を示す。]に相当する。
本明細書中に記載されているハプテン物質と免疫原性付与物質との共有連結は
当業界で公知の方法で完成され得て、その選択はデキストロプロポキシフェン誘
導体(すなわち、式(IX)中、X)中の結合する官能性の性質および連結に対
して選択したキャリヤーに依存する。
典型的には抗原性を与えるキャリヤー部分Aは一般的な公知の製造方法によっ
て式(IX)に相当するハプテンの官能基(X)と例えば天然のまたは合成ポリ
(アミノ酸)のような免疫原性付与キャリヤーと反応させることにより提供され
る。典型的には、本発明の好ましい実施態様において、天然ポリ(アミノ酸)、
ウシチログロブリン(BTG)は、構造式(X)中
の部分Aに抗原性付与キャリヤーとして使用されるが、以下のものを含む他のタ
ンパクキャリヤー例えば、アルブミンおよびグロブリン、リポプロテイン、オキ
ュラーレンズタンパクのような血清タンパクおよびその類似物が使用し得ること
を理解されたい。いくつかの例示し得る抗原性付与タンパクキャリヤーはウシ血
清アルブミン(BSA)、鍵穴笠貝ヘモアニン(KLH)、卵白オボアルブミン
、ウシγ−グロブリン(BGG)、チロキシン結合グロブリン等を含む。または
、ポリリシン等のような合成ポリ(アミノ酸)が使用し得る。
例えば、式(IX)中、Xがカルボキシルであるハプテンはウシ血清アルブミ
ンと、好ましくはアミド結合を形成する普通の当業者に公知である条件下で、カ
ップリング剤として、例えば、カルボジイミド、特に、1−エチル−3−(3−
ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)または1−シクロヘキシル
−3−(2−モルフォリノエチル)カルボジイミドメト−p−トルエンスルホネ
ートのような水溶性カルボジイミドを使用してカップリングし得る。同様な試薬
が、ハプテンのXが−NH2基の場合使用し得て、この場合、ウシ血清アルブミ
ンのカルボキシル基とアミド結合が形成される。ハプテンのQが−CHOである
とき、このアルデヒドは対応するアミン官能
基に還元的にアミン化され得る。他のアルデヒドの有用なハプテンへの変換は当
業者にとって公知である。
本発明の抗体は動物中で、本発明の免疫原に対する免疫応答を発生させて製造
される。この免疫原はラビット、マウス、ラット、ヒツジまたはウシのような動
物に当業界で一般的に知られている技術による一連の注射によって投与される。
本発明の抗体は本発明の実質的に光学的に純粋なハプテンから誘導される本発明
の免疫原に応答して産生される。免疫原上の特定のエピトープを認識するポリク
ローナルおよびモノクローナル抗体の両方および、一方本発明で使用されている
典型的なポリクローナル抗体は両方ともに適し得る。それぞれ特定のエピトープ
を認識する多様な抗体の混合物からなるポリクローナル抗体、それに対して、モ
ノクローナル抗体は特定のエピトープを認識する単一の抗体を分泌する細胞によ
って製造される。一般にポリクローナル抗体を製造する技術は当業界で公知であ
る。
モノクローナル抗体はマウスまたはラットのような動物に腹腔内に、皮下に、
静脈内にまたはいくらかの他の方法で注射して、抗原すなわち上記式(X)に相
当する免疫原で動物中の免疫応答を誘引して、製造される(すなわち、抗原に特
異的な抗体の製造)。動物からの血清を抜き取り、この血清を血清中の
抗体の力価を決定する試験をした(動物が所望の免疫応答を誘引したかどうかお
よびどの程度かを決定する)。所望の免疫応答が体内で起こった動物をほぼ2〜
3ケ月残した。この2〜3ケ月の期間の後、B−リンパ球細胞(抗原による刺激
によって、抗体を合成する血漿細胞中に成熟した細胞であり、B細胞とも呼ばれ
る細胞)と骨髄腫細胞(腫瘍細胞)の前融合に先立ってほぼ3日前、抗原の圧力
を高めた注射をこれらの動物に投与した。その後、B−リンパ球細胞をこれらの
動物の脾臓から標準方法で取り除き、B−リンパ球細胞をその後、骨髄腫融合相
手とKohlerおよびMilstein、「Continuous Cult
ure of Fused Cells Secreting Antibod
y of Predefined Specificity」Nature,2
56,495(1975)に記載されているような標準方法に従って、融合した
。B−リンパ球−骨髄腫融合細胞をHAT培地または他の適した培地を含むマル
チウエル組織培養プレートに入れた。得られた培養物をHT培地または、他の適
当な培地、およびウシ胎児血清または子ウシ血清上で細胞の融合と同時または約
5〜7日後に培養し、その後、細胞融合と同時にまたは10日後、抗原に特異的
な抗体の存在を試験した。特定の所望のハイブリ
ッドをその後限界希釈によってクローン化した。(ハイブリッド細胞は異なった
量のHT培地または他の好適な培地中に希釈し、所望の1つのクローン体を単離
するために組織培養プレートに入れた。)株化クローンをその後、交差反応の幅
広いパネルへの特異性を再試験した。
所望のクローンにより製造されて得られたモノクローナル抗体の量はその後、
(1)組織培養(組織培養物またはHT培地中の細胞の数を増やすことによって
);または(2)腹水用のマウスでの両方で精製に対して十分な量の抗体を製造
するためにスケールアップし得る。このモノクローナル抗体はハイブリッド細胞
をマウスの腹腔中に注射し、細胞を増殖させて(一般的には約7日間)、マウス
中でスケールアップし得る。この腹水はマウスから、マウスを犠牲にして腹水体
液を集めこの腹水を精製して収穫した。BALB/cマウスはこの方法に用いら
れる最も一般的な実験室マウス種であり、それらはいかなるマウス売人からも入
手し得る。プリスタンはマウスのBおよびT細胞を産生する免疫系を刺激するた
めに注射されねばならない(ハイブリッド細胞がマウスに注射される約2〜3週
間前に)。そのBおよびT細胞はマウスに注射されたクローン細胞の供給層とし
て働く。これは、ハイブリッド細胞が増殖し得る好適な
実施態様を与える働きをする。
本発明は生物サンプル中のデキストロプロポキシフェンおよび/またはノルデ
キストロプロポキシフェンの定性または定量分析をする改善されたイムノアッセ
イ法を提供する。本発明の改善されたイムノアッセイ法は、決定しようとするサ
ンプルを本発明の免疫原に応答して産生された抗体と接触させるステップを含む
。本発明のハプテン、免疫原および/または免疫原に対して産生された抗体を使
用するプロポキシフェンおよび/またはノルデキストロプロポキシフェンに対す
るいかなる免疫アッセイも本発明の範囲であることを意図する。イムノアッセイ
の例はラジオイムノアッセイ(RIA)、エンザイムイムノアッセイ(EIA)
、エンザイムリンクトイムノソルベントアッセイ(ELISA)および蛍光偏光
イムノアッセイ(FPIA)を含む。蛍光偏光イムノアッセイ(FPIA)にお
いて、本発明の蛍光トレーサーは本発明の免疫原に応答して産生された抗体を用
いてまたは用いずに使用し得る。
本発明の蛍光トレーサーは本発明のハプテンに相当する実質的に光学的に純粋
な化合物から誘導されると見なし得る。本発明のトレーサーはデキストロプロポ
キシフェンおよび/またはノルデキストロプロポキシフェンに対するイムノアッ
セイに有
用であり、式(XI):
[式中、Zは上記式(IX)に相当するハプテンで定義した通りであり、下付き
文字mは0または1、好ましくは1である。式(XI)において、Yは−NH−
、−(CO)NH−、および−NH(CO)−から選択される2原子価ラジカル
であり、−(CO)NH−が好ましい。下付き文字nは1〜3の整数であり、本
発明の好ましいトレーサー中、1である。式(XI)中、FLは蛍光性付与部分
であり、Yは蛍光性付与部分FLと2価ラジカル−(CH2)n−とを連結する働
きをする。蛍光性付与部分FLはいろいろな蛍光性付与部分から選び得る。]に
相当する。
式(XI)から認められ得るように、部分FLはYを介してトレーサーの残り
の部分と結合する蛍光性付与化合物の1原子価残基を示す。本発明の好ましい実
施態様において、蛍光トレーサーの蛍光性付与部分はフルオレシンの1価残基ま
たはフル
オレシン誘導体の1価残基である。例として、以下のフルオレシン誘導体のいず
れも使用し得る。FL−NH2、フルオレシンアミン;FL−CH2NH2、アミ
ノメチルフルオレシン;およびFL−COOH、カルボキシフルオレシン。本明
細書中で使用しているように、FLは以下の式(XII):
に相当するフルオレシン部分を表す。
本発明の好ましい実施態様において、FL−NH2はトレーサーの製造に使用
され、好ましくは−NH2基はFLに5−または6−位(上記図XII参照)に
結合し、典型的には5−位に結合する。
本発明のトレーサーは適当な蛍光化合物と式中Xがハプテンに蛍光化合物を結
合させるのに適した置換基を示す上記式(IX)で示される本発明のハプテンと
を例えば、直接のまたは中間ステップを介した、蛍光化合物からの共反応性官能
基での反応によって、連結することにより一般に提供され得る。ハ
プテンに対する官能基の例は−COOH、−NH2、およびRがC1〜C3のアル
キル基である−COORを含む。Xで示されるハプテンのこのような官能基と蛍
光性化合物の共反応性官能基を反応させる反応条件は当業界において公知である
。
一般的にはコンペティティブバインディングイムノアッセイ法は本発明の生物
学的サンプル中のデキストロプロポキシフェンおよび/またはノルデキストロプ
ロポキシフェンの定性およびまたは定量分析をする方法に従って使用し得る。典
型的にはコンペティティブバインディングイムノアッセイ法は試験サンプル中の
リガンドを測定するために用いられる。本開示の目的で、「リガンド」はコンペ
ティティブバインディングイムノアッセイ技術で定量される生物学的興味の物質
(デキストロプロポキシフェンおよび/またはノルデキストロプロポキシフェン
)である。このリガンドをラベル化試薬(「リガンド類似物」または「トレーサ
ー」)とリガンドおよびリガンド類似物(本明細書中、本発明の免疫原に応答し
て製造された抗体)に特異的な抗体上の限定数のリガンド結合サイトに対して競
合させる。サンプル中のリガンドの濃度は抗体と結合するリガンド類似物の量を
決定し、抗体と結合し得るリガンド類似物の量はサンプル中のリガンドの濃度に
反比例する。なぜなら、リガンドおよ
びリガンド類似物はともに、それらのそれぞれの濃度の割合で抗体と結合するか
らである。
本発明の1つの実施態様において、蛍光偏光イムノアッセイ(FPIA)技術
はコンペティティブバインディングイムノアッセイ法で生成したトレーサー抗体
共有生成物の量を決定するのに用いられる。このような方法は蛍光ラベル化化合
物は平行に偏光された光により励起されたとき、その回転割合に逆の偏光の度合
いを有する蛍光を発する原理に基く。従って、蛍光ラベルを有するトレーサー−
抗体共有体が平行偏光で励起されたとき、放射された光は高く偏光されたままで
ある。なぜなら、発蛍光団が光の吸収および放出の間の時間に回転することを強
いられるからである。非結合トレーサーが平行偏光で励起されたとき、その回転
は相当するトレーサー−抗体共有体に比べて、非常に早く、この分子はよりラン
ダムな配向になる。この結果、非結合トレーサー分子から発生された光は非偏光
される。
より特定すると、サンプル中のデキストロプロポキシフェンおよび/またはノ
ルデキストロプロポキシフェンを定性または定量分析する本発明の好適なFPI
A法は(a)サンプルと(1)モノクローナルまたはポリクローナル、典型的に
はポリクローナル抗体であって、本発明の免疫原に応答して産生され
た抗体を含む抗血清および(2)本発明の蛍光トレーサー、(この蛍光トレーサ
ーは抗血清の存在に応答して検出し得る蛍光偏光を発生し得る)を接触させ;(
b)平行偏光をステップ(a)で得られた溶液に通して、蛍光偏光応答を得て;
(c)サンプル中のデキストロプロポキシフェンおよび/またはノルデキストロ
プロポキシフェンの定性または定量分析としてステップ(b)の溶液の蛍光偏光
応答を検出をするステップからなる。
蛍光トレーサーおよび抗体の濃度を一定に保って、デキストロプロポキシフェ
ンおよび/またはノルデキストロプロポキシフェン−抗体錯体と形成された蛍光
トレーサー−抗体錯体との比をサンプル中のデキストロプロポキシフェンおよび
/またはノルデキストロプロポキシフェンの量に正比例させる。線状に偏光した
光で混合物を励起し、蛍光トレーサーおよび蛍光トレーサー−抗体錯体により発
生された蛍光偏光を(ミリポーラリゼーション単位で)測定することにより、サ
ンプル中のデキストロプロポキシフェンおよび/またはノルデキストロプロポキ
シフェンの量の定量分析および存在の定性分析ができる。この結果は正味のミリ
ポーラリゼーション単位および(ミリポーラリゼーション単位での)スパンによ
って定量し得る。正味のミリポーラリゼーション単位の測定は、いかなるデキス
トロプロ
ポキシフェンおよび/またはノルデキストロプロポキシフェンも存在しないため
に蛍光トレーサーの最大量が抗体に結合したとき、最大偏光を示す。正味のミリ
ポーラリゼーション単位が多いほど、トレーサーの抗体への結合が多い。このア
ッセイのスパンはいかなるデキストロプロポキシフェンおよび/またはノルデキ
ストロプロポキシフェンも存在しないために最大量のトレーサーが結合したとき
得られた正味のミリポーラリゼーションの値と特定の量のデキストロプロポキシ
フェンおよび/またはノルデキストロプロポキシフェンがサンプル中に存在した
とき得られた正味のミリポーラリゼーションの値との差である。大きなスパンに
よってアッセイ用につくられた標準曲線の各キャリブレーターの間に位置するよ
り多くのミリポーラリゼーション単位が与えられ、そのことにより、よいアッセ
イ精度が与えられ、さらに得られたデータのよい定量分析が得られる。スパンは
使用したサンプルの大きさに依存して変わり、サンプルの大きさは順番に好まし
い組み合わせに変え得ることに注意することが重要である。
本発明の蛍光トレーサーは実質的に光学的に純粋である。これらのトレーサー
はポリクローナル抗体が使われている例のなかで、特定の利点を有する。デキス
トロプロポキシフェンは体
内において本質的に光学的に純粋であるので、実質的に光学的に純粋な免疫原か
ら誘導された抗体と組み合わせた実質的に光学的に純粋なトレーサーの使用は、
FPIA技術を使用するデキストロプロポキシフェンおよび/またはノルデキス
トロプロポキシフェンアッセイにおいて選択したダイナミックレンジと交差する
強調されたシグナルを与えることが見出された。本発明のFPIAアッセイはサ
ンプル中のデキストロプロポキシフェンおよび/またはノルデキストロプロポキ
シフェン20.0ナノグラム/ミリリットル(ng/ml)のオーダーの感度に
到達し得たことが得られた利点の1つである。
本発明の蛍光トレーサーおよび本発明の免疫原の最も好ましい組み合わせのい
くつかの顕著な特徴は(1)デキストロプロポキシフェンおよび/またはノルデ
キストロプロポキシフェンに対する免疫原に応答して発生したデキストロプロポ
キシフェンおよび/またはノルデキストロプロポキシフェンに対する抗体の特異
性の高い度合いおよび、(2)干渉し得る抗体との最小の交差反応性、を含む。
本発明のFPIA法のpHは蛍光トレーサーのフルオレシン部分がその開環形
態で存在するのに十分であるように実施される。pHは約3〜12の間、より一
般には約5〜10の間、最
も好ましくは約6〜9の間の値をとる。いろいろな緩衝液がFPIA法の間に、
そのpHに達するためにおよびそのpHに保つために使用され得る。典型的な緩
衝液はホウ酸塩、リン酸塩、炭酸塩、トリス、バルビタル、クエン酸塩および類
似物を含む。採用した特定の緩衝液は本発明に対して臨界的ではないが、トリス
、リン酸塩およびクエン酸塩緩衝液が好ましい。この緩衝液のカチオン部分は一
般的に溶液中のトレーサー塩のカチオン部分を決定する。リボフラビン結合タン
パク(RBP)をサンプルまたは1種もしくは多種のアッセイ試薬に加え、サン
プル中に存在するいかなるリボフラビンもRBP−リボフラビン錯体へと結合さ
せ、この様にして、蛍光し得る干渉物を消去し得る。RBPはほぼ32,000
M.W.のタンパクであり、卵白から単離し得る。卵から分離する際に、各RB
P分子はリボフラビン分子1つを含む。このRBPのホロタンパク(holop
rotein)形態は透析によりアポプロテイン(apoprotein)形態
に酸条件のもとで変換し、結合したリボフラビンを除かねばならない。本発明で
使用するRBPアポタンパクはSigma Chemical Company
, St.Louis, Missouriから商業的に入手し得る。使用量は
臨界的ではなく、サンプル中のすべての遊離のリ
ボフラビンと結合するのに十分な量が使用される。
本発明の蛍光偏光イムノアッセイは「ホモジニアスアッセイ」であり、これは
最終偏光読取りが結合トレーサーが非結合トレーサーから分離されていない溶液
に対して行われていることを意味する。このことは結合トレーサーが非結合トレ
ーサーから読取りが行われる前に取り除かねばならないような他のヘテロジニア
スイムノアッセイ法に対して異なった利点である。
本発明の蛍光偏光アッセイ用の試薬は(1)デキストロプロポキシフェンに対
するポリクローナルまたはモノクローナル、典型的にはポリクローナル抗体、お
よび(2)蛍光トレーサー試薬、を含む。
加えて、前処理溶液、希釈緩衝液、デキストロプロポキシフェンキャリブレー
ターおよびデキストロプロポキシフェンコントロールを含む広く一般的な溶液が
望ましくは製造し得る。これらの試薬の典型的な溶液は(これらのいくつかは後
述するが)、Abbott Laboratories,Abbott Par
k,Illinoisからアッセイ「キット」として商業的に入手し得る。
とくに断らない限り、ここに示す全てのパーセンテージは重量/体積である。
本発明の好ましい蛍光偏光イムノアッセイ用
の好ましい試薬、キャリブレーターおよびコントロールは、以下の実施例7で見
られ得る。
好ましいFPIA法はAbbott TDX(登録商標)Clinical
Analyzer、Abbott TDXFLX(商標)またはAbbott A
DX(登録商標)Drugs of Abuse Systemを用いて行われ
ると特に示され、これら3つ全てはAbbott Laboratories,
Abbott Park,Illinoisから入手し得る。キャリブレーター
、コントロールまたは未知のサンプルをTDX(登録商標)のサンプルカートリ
ッジのサンプルウエル中に直接ピペットで入れる。この方法の利点の1つはこの
サンプルはいかなる特別な準備も必要としないということである。この点の故に
このアッセイ法はよく自動化されている。
手動アッセイをする場合には、サンプルを希釈緩衝液中で前処理溶液と混合し
、バックグラウンドの読取りを行う。蛍光トレーサーをその後このアッセイ用混
合物と混合する。抗体を最後に試験溶液中に混合する。インキュベーションの後
、蛍光偏光読取りを行う。
各キャリブレーター、コントロールまたはサンプルの蛍光偏光値を決定し、A
bbott TDX(登録商標)Analy
zer、TDXFLX(商標)またはADX(登録商標)Systemのような機
器のアウトプットテープにプリントアウトする。各キャリブレーターの偏光対そ
の濃度をプロットし、非線形回帰分析を使用することにより、機器中で標準曲線
が作成される。各コントロールまたはサンプルの濃度は蓄積されたキャリブレー
ションカーブから読み取られ、アウトプットテープに記録される。
前述の好ましい方法に関していえば、トレーサー、抗体、前処理溶液、洗浄溶
液、キャリブレーターおよびコントロールは約2℃〜約8℃の間で貯蔵しなけれ
ばならず、一方、希釈緩衝液は周囲温度で貯蔵しなければならないことに注意し
なければならない。標準曲線およびコントロールは各キャリブレーターおよびコ
ントロールをそれぞれ2回測定して、2週間毎に作成せねばならない。
以下の実施例は本発明の実施態様をさらに説明するが、本発明の範囲を限定す
ると解釈されるべきではない。
以下の一般的実験法は以下の実施例のハプテンの製造に使用された。
実施例1
本実施例は以下の式(I)に相当し、本発明のハプテンおよ
びトレーサーの製造に使用する(2S,3R)−4−ジメチルアミノ−1,2−
ジフェニル−3−メチル−ブタン−2−オールの製造を説明する。
無水テトラヒドロフラン(THF)3.0ミリリットル(ml)中のデキスト
ロプロポキシフェン塩酸塩200ミリグラム(mg、0.53mmol)の冷却
した(0℃)サスペンジョンにリチウムアルミニウムハイドライド22mg(0
.59mmol)を加えた。混合物を周囲温度まで温め、4時間(hr)攪拌し
た。反応を水で停止させ、2モル濃度(M)の水酸化カリウム水溶液で塩基性化
し、酢酸エチル10mlで3回抽出した。抽出物を合わせて、MgSO4で乾燥
し、濾過し、濃縮して、無色透明のオイル状の(2S,3R)−4−ジメチルア
ミノ−1,2−ジフェニル−3−メチル−ブタン−2−オールを得た(164m
g)。これをその後、さらなる精製をせずに使用した。
実施例2
本実施例は以下の式(II)に相当する(2S,3R)−4−ジメチルアミノ
−1,2−ジフェニル−3−メチル−2−エトキシカルボニルメチルアミノカル
ボニルオキシ)−ブタンの製造を説明する。
ベンゼン1.0mlおよびトルエン1.0mlの混合物中の前記実施例で製造
した無色透明のオイル(アルコール)127mg(0.45mmol)溶液を分
留し、1.0mlの蒸留物だけを集めた。残留溶液を冷却し、0.15ml(1
.34mmol)のエチルイソシアネートアセテートOCN−CH3COOCH2
CH3を注入した。得られた溶液を1時間還流し、冷却し、水2滴で反応を停止
させた。得られた混合物をロータリーエバポレーターで濃縮し、1×18センチ
メートル(cm)のシリカゲルのカラムで直接クロマトグラフィーし、クロロホ
ルムを充填し、クロロホルム中、2容量%、6容量%、10容
量%の各メタノール溶液50mlで溶出させた。エステル(2S,3R)−4−
ジメチルアミノ−1,2−ジフェニル−3−メチル−2−(エトキシカルボニル
メチルアミノカルボニルオキシ)−ブタンの無色透明オイルを全部で269mg
得た。
実施例3
本実施例は以下の式(III)に相当する本発明のハプテン(2S,3R)−
4−ジメチルアミノ−1,2−ジフェニル−3−メチル−2−(カルボキシメチ
ルアミノカルボニルオキシ)−ブタンの製造を説明する。
テトラヒドロフラン0.75mlおよび水0.75mlの混合物中の(上記実
施例2で製造した)無色透明オイルのエステル118mg(0.29mmol)
溶液に水酸化カリウム(24mg、0.43mmol)を加えた。溶液を12時
間周囲温度で攪拌し、pH7に酸性化し、濃縮した。濃縮物をメタノールに再溶
解させ、その溶液を2枚の0.5ミリメートル(mm)
×20cm×20cmの板に塗り、それを30容量%のメタノールのクロロホル
ム溶液(メタノール/クロロホルム)で展開させた。生成物を粉々にして切り裂
いた帯から80%メタノール/クロロホルムで溶出させ、そして濃縮し、酸(2
S,3R)−4−ジメチルアミノ−1,2−ジフェニル−3−メチル−2−(カ
ルボキシメチルアミノカルボニルオキシ)−ブタンの白色固体50mgを得た。
実施例4
本実施例は以下の式(IV)に相当する本発明のトレーサー、(2S,3R)
−4−ジメチルアミノ−1,2−ジフェニル−3−メチル−2−(5−フルオレ
セイニルアミノカルボニルメチルアミノカルボニルオキシ)−ブタン、の製造を
説明する。
ジメチルホルムアミド100マイクロリットル(μl)中の上記実施例3の白
色固体の酸3.6mg(9.3マイクロモル、
μmol)の冷却した(0℃)溶液に、イソブチルクロロホーメート1.2μl
(9.3μmol)を加えた。得られた溶液を1時間攪拌し、周囲温度まで温め
、0℃まで再冷却した。5−フルオレセインアミン(3.2mg、9.3μmo
l)をその後加え、得られた溶液を周囲温度で12時間攪拌した。混合物を濃縮
し、メタノールに再溶解し、0.25mm×20cm×20cmのプレートに塗
った。20%メタノール/クロロホルムで展開し、80%メタノール/クロロホ
ルムで粉々にした帯から溶出させ、オレンジ色の固体8.1mgを得た。この固
体をさらなる0.25mmのプレート上でクロロホルム:メタノール:氷酢酸7
0:30:2で溶出させるクロマトグラフィーに再びかけた。帯を粉砕し、80
%メタノール/クロロホルムで溶出させ、オレンジ色の固体32mgを得た。こ
の固体をさらに2回さらなる0.25mmのプレート上で各回ともにメタノール
/クロロホルム50%で展開し、各粉砕した帯を80:20:1のメタノール:
クロロホルム:濃水酸化アンモニウムで溶出させた。(2S,3R)−4−ジメ
チルアミノ−1,2−ジフェニル−3−メチル−2−(5−フルオレセイニルア
ミノカルボニル−メチルアミノカルボニルオキシ)−ブタンのオレンジ色の固体
4.5mgを最終精製の後に得た。
実施例5
この実施例は以下の式(V)に相当する本発明のハプテンの製造の前駆体、(
2S,3R)−4−ジメチルアミノ−1,2−ジフェニル−3−メチル−2−[
1−(ブト−4−エニル)カルボニルオキシ]−ブタンの製造を説明する。
ベンゼン1.0mlおよびトルエン1.0mlの混合物中の上記実施例1で製
造した無色透明のオイル153mg(0.54mmol)の溶液を部分的に蒸留
し、ただ1.0mlの蒸留物を集めた。残った溶液を周囲温度に冷却し、溶液に
ベンゼン中の4−ペンテノイルクロリド溶液1.00mmolを加えた。得られ
た混合物を徐々に温め、ベンゼンを蒸留によって除去し、残った混合物を2時間
還流した。生成した沈殿物を濾過し、トルエン2mlで洗浄した。濾液および洗
浄液を合わせてクロロホルムで希釈し、水酸化カリウム2M溶液で抽出し、Mg
SO4で乾燥し、濾過し、濃縮した。得られたオレフィン
のエステルをさらに精製することなく使用した。
実施例6
以下の式(VI)に相当する本発明のハプテン(2S,3R)−4−ジメチル
アミノ−1,2−ジフェニル−3−メチル−2−[1−(プロパン−3−アル)
カルボニルオキシ]−ブタンの製造を説明する。
ジクロロメタン0.5ml中の上記実施例5で製造した冷却した(0℃)オレ
フィンエステル40mg(0.11mmol)溶液に、トリフルオロ酢酸50μ
lを加えた。得られた混合物を周囲温度に温めた後、5分間攪拌し、濃縮し、メ
タノール5.0mlに再溶解した。得られた溶液を青色が持続するまでオゾン化
した。過剰なオゾンをアルゴンを吹き込んで除き、得られた無色の反応混合物を
硫化ジメチル0.1mlで反応を停止させた。反応混合物を周囲温度までゆっく
りと(約1時間かけて)温め、濃縮して、ハプテン、(2S,3R)−4−ジメ
チルア
ミノ−1,2−ジフェニル−3−メチル−2−[1−(プロパン−3−アル)カ
ルボニルオキシ]−ブタンの明るい黄色のオイル69mgを得た。以下の実施例
7にしたがって、このハプテンをタンパクと共有させ本発明の免疫原を製造した
。
実施例7
本実施例は以下の式(VII)に図示され、式中、アミド結合を介するこの化
合物の残りの部分に結合したウシチログロブリン部分を示す本発明の免疫原の製
造を説明する。
(a)実施例6のハプテン(VI)の53.0mgの量を脱イオン水1.0m
lおよびジメチルスルホキシド(DMSO)0.5mlに加えた。得られた溶液
0.75mlの体積(ハプテン26.5mgを含む)を30分間室温で攪拌しな
がらウシチログロブリン溶液(チログロブリン10mg/mlおよびリン酸0.
05モル濃度(M)を含み、pH=7.0を有する)
10.4mlに加えた。得られた混合物を混合物のpHを0.1規定(N)HC
lで約7.0に調整しておき、各50mgのナトリウムシアノボロハイドライド
を2時間の間隔をおいて5回添加した。ナトリウムシアノボロハイドライドの最
終添加の後に、混合物を2時間攪拌した。次に、混合物をセルロース透析チュー
ブ中で、0.05Mのリン酸ナトリウムに対してpH=7.5で36時間、4回
透析物をかえて透析した。透析の後、混合物をSorvall中で、10,00
0回転毎分(rpm)で10分間遠心分離した。浮遊物はタンパクを9.78m
g/ml含んでいることがLowryのタンパク濃度決定法により見出された。
(b)抗血清はすぐ上のパート(a)の免疫原から製造され、尿サンプル中の
プロポキシフェンの決定に関する蛍光偏光イムノアッセイ(FPIA)に利用さ
れた。
このFPIAに対するキャリブレーターおよびコントロールの構成は以下の通
りである。
1. トレーサー処方はpH=6.3の0.1モル濃度のリン酸ナトリウム緩
衝液、ウシγ−グロブリン、5−スルフォ−サリシレート5%およびナトリウム
アジド0.1%中、トレーサー100ナノモル濃度である。
2. 抗血清処方はpH=7.5のトリス緩衝液0.1モル
濃度、エチレングリコール2%、ナトリウムアジド0.1%およびウシγ−グロ
ブリン0.05%で希釈したヒツジ血清からなる。
3. 前処理溶液はpH=7.5のトリス緩衝液0.1モル濃度、ウシγ−グ
ロブリン0.01%、ナトリウムアジド0.1%およびリボフラビン結合タンパ
ク4mg/mlからなる。
4. 洗浄液はpH=7.5のリン酸ナトリウム緩衝液0.1モル濃度、ナト
リウムアジド0.1%およびウシγ−グロブリン0.01%からなる。
5. 希釈緩衝液はpH=7.5のリン酸ナトリウム緩衝液0.1モル濃度、
ナトリウムアジド0.1%およびウシγ−グロブリン0.01%からなる。
6. キャリブレーター/コントロール希釈液は健康なヒトの尿およびナトリ
ウムアジド0.1%からなる。
7. プロポキシフェンキャリブレーターは処理をした健康なヒトの尿中の濃
度0.0、150.0、300.0、500.0、1000.0および1500
.0ナノグラム/ミリリットルのプロポキシフェンからなる。
8. プロポキシフェンコントロールは処理をした健康なヒトの尿中の濃度2
00.0、400.0および900.0ナノグラム/ミリリットルのプロポキシ
フェンからなる。
(c)このアッセイはデキストロプロポキシフェンをキャリブレーターとする
6ポイントキャリブレーションカーブを使用した。このキャリブレーションカー
ブは2つの弱い最小安定性および0.0ng/mlから1500.0ng/ml
の範囲を有する。このアッセイは20.0ng/mlの感度を有する。感度は9
5%の確度で0と識別し得る最低測定可能濃度として定義される。
TDX(登録商標)装置の再現性は2週間の期間中の異なった10日でヒト尿
中の200、400および900ng/mlのデキストロプロポキシフェンの各
5つの応答をアッセイすることにより決定された。各濃度を研究の最初の日に作
成した単一の標準曲線から決定した。結果を以下の表1に示す。
ADX(登録商標)装置の再現性をバッチおよびパネルモードを組み合わせて
15の異なった試行をかけて、ヒト血清中の200、400および900ng/
mlのデキストロプロポキシフェンの4つの反復実験をアッセイすることによっ
て決定した。それぞれの濃度は研究の最初の日に各点2回測定して作成した標準
曲線を使用して決定した。結果を以下の表2に示す。
キャリブレーターとコントロールの2セットを既知の量のデキストロプロポキ
シフェンをヒト尿に加えて、X Systems Dilution Buff
erを150、200、300、400、500、900、1000および15
00ng/mlのレベルにして作成した。キャリブレーションをウシキャリブレ
ーターで行って、キャリブレーターの各組みをこのキ
ャリブレーターと比較してアッセイした。以下の表3において、「%回復」は1
00Xに等しい(緩衝液中で測定された濃度を、尿中で測定した濃度で割る)。
既知の量の試験化合物をドラッグフリーのヒト尿に加えた後、いろいろな試験
化合物を(交差反応性を決定するために)、デキストロプロポキシフェンアッセ
イによってアッセイした。以下の表4および5において、「%交差反応性」は1
00Xに等しい(「検出濃度」を「添加濃度」で割る)。交差反応性はノルデキ
ストロプロポキシフェン(N−ノルプロポキシフェン)に対して試験された。デ
キストロプロポキシフェンに対する結果は以下の表4でまとめている。表4の結
果から本発明が好都合にノルデキストロプロポキシフェン(NDP)に対する高
い交差反応性を有するイムノアッセイを提供し得ると考えられ得る。
同様な交差反応性が類似の化学構造を有するまたはヒトにより同時に使用され
る(干渉する)化合物に対して、測定された。その結果を以下の表5に示す。表
5中において、「ND*」は
「観測されず」を意味し、濃度がアッセイの感度より小さいことを意味する。表
5から、本発明が好都合に干渉し得るものとの低い交差反応性を有するイムノア
ッセイを提供し得ることが理解され得る。
─────────────────────────────────────────────────────
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(51)Int.Cl.6 識別記号 FI
G01N 33/542 G01N 33/542 A
(72)発明者 クーン,ドンナ・アール
アメリカ合衆国、イリノイ・60070、プロ
スペクト・ハイツ、イースト・オールド・
ウイロウ・ロード・18、ユニツト・103・
エヌ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1. デキストロプロポキシフェンおよび/またはノルデキストロプロポキシフ ェンのイムノアッセイに有用な式(IX): [式中、 Zは−NH−であり、 Xは−CHO、−COOH、−NH2またはRがC1−C3のアルキル基であ る−COORであり、 mは0または1であり、 nは1〜3の整数である] に相当する、実質的に光学的に純粋なハプテン。 2. m=0であり、n=3である請求項1に記載のハプテン。 3. Xが−CHOである請求項2に記載のハプテン。 4. 実質的に光学的に純粋なハプテンから誘導され、デキストロプロポキシフ ェンおよび/またはノルデキストロプロポキ シフェンのイムノアッセイに有用な式(X): [式中、 Zは−NH−であり、 Yは−NH−、−(CO)NH−または−NH(CO)−であり、 mは0または1であり、 nは1〜3の整数であり、 Aは抗原性付与キャリヤー部分である] に相当する免疫原。 5. m=0であり、n=3である請求項4に記載の免疫原。 6. Yが−NH−である請求項5に記載の免疫原。 7. 前記抗原性付与キャリヤー部分がポリ(アミノ酸)である請求項4に記載 の免疫原。 8. 前記抗原性付与キャリヤー部分がウシチログロブリンである請求項4に記 載の免疫原。 9. 実質的に光学的に純粋なハプテンから誘導される免疫原に応答して産生さ れ、デキストロプロポキシフェンおよび/またはノルデキストロプロポキシフェ ンのイムノアッセイに有用な抗体であって、該免疫原が式(X): [式中、 Zは−NH−であり、 Yは−NH−、−(CO)NH−または−NH(CO)−であり、 mは0または1であり、 nは1〜3の整数であり、 Aは抗原性付与キャリヤー部分である] に相当する、前記抗体。 10. m=0であり、n=3である請求項9に記載の抗体。 11. Yが−NH−である請求項10に記載の抗体。 12. 前記抗原付与キャリヤー部分がポリ(アミノ酸)であ る請求項9に記載の抗体。 13. 前記抗原付与キャリヤー部分がウシチログロブリンである請求項9に記 載の抗体。 14. 実質的に光学的に純粋な化合物から誘導され、デキストロプロポキシフ ェンおよび/またはノルデキストロプロポキシフェンのイムノアッセイに有用な 式(XI): 「式中、 Zは−NH−であり、 Yは−NH−、−(CO)NH−または−NH(CO)−であり、 mは0または1であり、 nは1〜3の整数であり、 FLは蛍光性付与部分である] の蛍光トレーサー。 15. m=1でありn=1である請求項14に記載の蛍光ト レーサー。 16. Yが−(CO)NH−である請求項15に記載の蛍光トレーサー。 17. 前記蛍光性付与部分がフルオレセインの1価残基またはフルオレセイン 誘導体の1価残基である請求項14に記載の蛍光トレーサー。 18. サンプル中のデキストロプロポキシフェンおよび/またはノルデキスト ロプロポキシフェンを定性または定量分析する改善されたイムノアッセイ法であ り、前記サンプルと免疫原に応答して産生された抗体とを接触させるステップを 含み、該改善が免疫原として、実質的に光学的に純粋なハプテンから誘導される 免疫原を使用し、この免疫原が式(X): [式中、 Zは−NH−であり、 Yは−NH−、−CO(NH)−または−NH(CO)−であり、 mは0または1であり、 nは1〜3の整数であり、 Aは抗原性付与キャリヤー部分である] に相当する、前記方法。 19. Yは−(CO)NH−であり、m=1でありそしてn=1である請求項 18の改善されたイムノアッセイ法。 20. 前記抗原性付与キャリヤー部分がポリ(アミノ酸)である請求項19に 記載の改善されたイムノアッセイ法。 21. 前記抗原性付与キャリヤー部分がウシチログロブリンである請求項19 に記載の改善されたイムノアッセイ法。 22. サンプル中のデキストロプロポキシフェンおよび/またはノルデキスト ロプロポキシフェンを定性または定量分析する蛍光偏光イムノアッセイであって 、前記サンプルと実質的に光学的に純粋なハプテンから誘導される免疫原に応答 して産生された抗体とを接触させるステップを含み、前記免疫原が式(X): [式中、 Zは−NH−であり、 Yは−NH−、−(CO)NH−または−NH(CO)−であり、 mは0または1であり、 nは1〜3の整数であり、 Aは抗原性付与部分である] に相当する、前記方法。 23. サンプルと、実質的に光学的に純粋な化合物から誘導される式(XI) : [式中、 Zは−NH−であり、 Yは−NH−、−(CO)NH−または−NH(CO)−であり、 mは0または1であり、 nは1〜3の整数であり、 FLは蛍光性付与部分である] に相当する蛍光トレーサーとを接触させるステップを含む請求項22に記載の蛍 光偏光イムノアッセイ。 24. 前記トレーサーに於いてm=1およびn=1である、請求項23に記載 の蛍光偏光イムノアッセイ。 25. トレーサーにおいてYが−(CO)NH−である請求項24に記載の蛍 光偏光イムノアッセイ。 26. 蛍光性付与部分がフルオレシンの1価残基またはフルオレシン誘導体の 1価残基である請求項23に記載の蛍光偏光イムノアッセイ。
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