DE69222956T2 - Kleinste erkennungseinheit eines pem-mucin-"tandem repeat"-spezifischen monoklonalen antikoerpers - Google Patents

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft immunoreaktive Verbindungen; insbesondere betrifft sie gentechnologisch veränderte Antikörper.
• Antikörper (Abs) sind Schlüsselmoleküle des Immunsystems. Sie liefern eine Schutzmaßnahme gegen eine Infektion durch mikrobielle Mittel und sind an sehr vielen anderen Immunreaktionen, wie Autoimmunität, Allergien, Entzündungen und Transplantatabstoßung, beteiligt. Abs sind in ihrer Spezifität einzigartig und können zwischen sehr ähnlichen antigenen Determinanten von Antigenen unterscheiden. Unter anderem wegen dieser Eigenschaft stellen Antikörper unschätzbare Reagenzien zum Nachweis, zur Lokalisierung und Quantifizierung von Antigenen dar.
• Abs wurden ursprünglich aus immunisierten Tieren erhalten. Da jedoch verschiedene Antiseren verschiedene Pools für heterogene Abs unterschiedlicher Spezifitäten und Isotypen darstellen, war es schwierig, unter Verwendung der Seren als Quelle für Antikörper reproduzierbare Untersuchungen durchzuführen. Dann wurde realisiert, daß große Mengen homogener Abs bei multiplem Myelom, einem Tumor der Plasmazellen, produziert werden. Ein großer Teil der Information bezüglich der Struktur von Immunglobulinen (Igs) wurde aus Untersuchungen unter Verwendung von Myelomproteinen abgeleitet. Durch die Entwicklung der Hybridomtechnologie wurde es möglich, einen praktisch endlosen Vorrat an monoklonalen Antikörpern (MAbs) der gewünschten Spezifitäten zu erzeugen.
• Antikörper werden aus Polypeptidketten gebildet, die durch nichtkovalente Kräfte und Disulfidbrücken zusammengehalten werden. Ein Paar identischer leichter (L-)Ketten (214 Aminosäuren lang) ist mit zwei identischen schweren (H-)Ketten unter Bildung einer bilateral symmetrischen Struktur verbunden (Fig. 1).
• Die Polypeptidketten sind zu kugelförmigen Domänen, die durch kurze gestreckte Bereiche aus Peptidsegmenten getrennt sind, gefaltet; die H-Kette weist in Abhängigkeit vom Isotyp vier oder fünf Domänen und die L-Kette zwei Domänen auf. Der N-terminale Bereich von jeder Kette stellt die variable Region (VH, VL) dar. Ein VH-VL-Paar trägt die Antigenkombinationsstelle und trägt zur Antikörperspezifität bei. Die übrige Kette bildet die C-Region, die für Effektorfunktionen, wie Fc-Rezeptorbindung, Komplementfixierung, Katabolismus und Placentatransport, verantwortliche Region des Moleküls. Igs mit unterschiedlichen C-Regionen und dadurch von unterschiedlichem Isotyp (beim Menschen sind dies IgM, IgD, IgG1-4, IgA2 und IgE) weisen unterschiedliche biologische Eigenschaften auf. In den meisten Isotypen trennt eine Gelenkregion CH&sub1; und CH&sub2; und verleiht dem Molekül Segmentflexibilität. Das Enzym Papain schneidet in der Nähe des Gelenks, wobei die Fab- und Fc-Bereiche des Antikörpermoleküls erzeugt werden.
• Mäuse-MAbs sind in der Forschung von unschätzbarem Wert. Human-Igs sind jedoch in vielen Applikationen, wie Diagnose und Immuntherapie, bevorzugt, da diese mit dem Immunsystem des Patienten effektiver wechselwirken können. Wegen des Artunterschiedes können an Menschen verabreichte Mäuse-Abs eine Immunantwort induzieren, die zu einer Allergie, Serumkrankheit oder Immunkomplexerkrankung führt. Diese Wirkungen schließen eine wiederholte Verabreichung von MAB aus. In klinischen Tests zeigte sich ferner, daß Wirts-Abs die injizierten Mäuse-MAbs neutralisieren und für deren rasches Verschwinden verantwortlich sind. Während Mäuse- und Rattenhybridome bequem zu erzeugen sind, waren Versuche zur Gewinnung von Human-MAbs nur begrenzt erfolgreich. Mäuse/Human- Hybridome sind häufig genetisch instabil und die Produktion von Human/Human-Hybriden wurde durch den Mangel an geeigneten immortalisierten Humanzellinien und immunisierten Human- B-Zellen behindert. Aufgrund ethischer Bedenken ist die invivo-Immunisierung von Menschen sehr eingeschränkt.
• Gentransfektion liefert ein alternatives Verfahren zur Erzeugung von MAbs. Mit diesem Verfahren ist nun nicht nur die Erzeugung von Wildtyp-Ig-Ketten, sondern auch von in vitro konstruierten neuartigen Igs und Mutanten möglich. Antikörper der gewünschten Spezifitäten, Bindungsaffinitäten, Isotypen und Artenherkunft können durch Transfektion geeigneter Gene in Mäusemyelom- oder Hybridomzellen in Kultur erhalten werden. Durch Gentransfektionen lassen sich viele der mit der Hybridomtechnik verbundenen Probleme umgehen. Da sich Human- oder chimäre Antikörper mit den humanen konstanten (C-)Regionen herstellen lassen, kann das Problem der Immunogenität vermieden oder minimiert werden. Ein weiterer Vorteil gegenüber Mäuse/Human- oder Human/Human-Hybridomen besteht darin, daß die durch Transfektion veränderten Mäusezellen intraperitoneal in Mäuse injiziert werden können, wo sie sich vermehren und Aszites erzeugen können, aus dem große Mengen von Antikörpern isoliert werden können.
• Beim ersten chimären Mäuse/Human-Antikörper wurden die für Phosphocholin spezifischen, umgruppierten und exprimierten Gene der V-Region aus dem Myelom S107 verwendet. VH wurde an Human-Cγ1 oder -Cγ2 und VL an Human-Cκ gebunden [1]. Bei gleichzeitiger Expression in der gleichen Zelle ordneten sich die schweren und leichten Ketten zu H&sub2;L&sub2;-Tetrameren, die sezerniert wurden, an. Dieser Antikörper ging mit Antigen eine Bindung ein, und durch die Reaktion mit drei monoklonalen antiidiotopen Antikörpern wurde verifiziert, daß die Polypeptidketten sich in geeigneter Weise zur Reproduktion der Antigenbindungsdomänen gefaltet hatten.
• Versuche aus dem Labor von Hozumi und Mitarbeitern zeigten, daß die Transfektion der umgruppierten Mäuse-TNP-spezifischen µ- und κ-Gene in Plasmacytom- und Hybridomlinien zur Produktion von pentamerem IgM, das eine Bindung mit Hapten einging und die Komplement-abhängige Hämolyse triggerte, führte [2, 3]. Die TNP-VH- und -VL-Gene wurden an Human-Cµ- bzw. -Cκ-Segmente gebunden, wobei chimäres IgM, das wiederum die Eigenschaften des Wildtyp-Mäuseantikörpers aufwies, produziert wurde [3, 4].
• Es wurden zwei chimäre Mäuse/Human-Iges hergestellt, die bei Vernetzung durch Antigen auf der Zellmembran die Degranulation von Mastzellen triggern konnten [5, 6].
• Zur Erforschung des Potentials chimärer Antikörper bei der Krebstherapie wurde ein Antikörper hergestellt, der aus den von dem Mäuse-MAb 17-1A, der ein Tumor-assoziiertes Oberflächen-Ag erkennt, abgeleiteten V-Regionen und Human-Cγ3 besteht [7]. Dieser chimäre Antikörper wies die gleichen Bindungseigenschaften wie der ursprüngliche Mäuseantikörper auf.
• Ein weiterer chimärer Antikörper mit Spezifität für das mit bestimmten Humankarzinomen assoziierte Oberflächenantigen zeigte eine Bindung an Humankarzinomzellen [8].
• Auf diese Weise wurden variable Regionen von Mäusen mit humanen konstanten Regionen kombiniert. Eine weitere Stufe in der Humanisierung von Nagetierantikörpern bestand in der Synthese von hybriden variablen Regionen, bei der die Gerüstgruppen von menschlicher Herkunft sind und die die Komplementarität bestimmenden Regionen (CDRs) von einem Mäuseantikörper stammen. Im Falle eines NP-spezifischen Antikör pers ließ sich zeigen, daß der Transfer der CDRs von einem Anti-NP-Hybridom auf das Humangerüst eines Humanmyelomproteins zu einem Transfer von Antigenspezifität führte [9].
• Dieses Ergebnis, das mit einem Haptenantigen erhalten wurde, wurde auf gegen Hühnerei-Lysozym sowie ein Human-T-Zellenoberflächenantigen gerichtete Antikörper ausgedehnt [10, 11]. Auf diese Weise erleichtert das Transplantieren von CDR nicht nur die Konstruktion chimärer Antikörper, sondern ermöglicht auch die Produktion therapeutischer Reagenzien, in denen nur die Antikörper-CDR-Gruppen nichthumaner Herkunft sind.
• CDR3 scheint zur Bestimmung der Spezifität des Antikörpers besonders wichtig zu sein. So zeigten Taub et al. [52], daß die Spezifität eines Antikörpers gegenüber dem Plättchenfibrinogenrezeptor weitgehend durch die RYD-Sequenz innerhalb der CDR3 der schweren Kette des Antikörpers bestimmt ist. Williams et al. [53] verwendeten ein synthetisches Peptid aus der CDR2 der leichten Kette eines Antikörpers zur Hemmung der Wechselwirkung des Antikörpers mit dessen Rezeptor. Vom Begriff her existiert für jeden gegebenen Antikörper eine "minimale Erkennungseinheit", wie dies von Winter und Milstein [54] diskutiert wurde.
• Wir haben nun die minimale Erkennungseinheit eines für ein mit Epitheltumoren assozuertes Mucinmolekül spezifischen monoklonalen Mäuseantikörpers, nämlich die Aminosäuresequenz EPPT (Glu-Pro-Pro-Thr), identifiziert.
• Eine erfindungsgemäße Ausführungsform gibt daher ein aus der Aminosäuresequenz EPPT bestehendes Molekül an.
• Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform gibt ein aus der Aminosäuresequenz EPPT und weiteren Aminosäuren zur Bildung eines linearen Peptids von bis zu 30 Aminosäuren bestehendes Molekül an.
• Alle Peptide werden im folgenden in der Form H&sub2;N...COOH geschrieben. Bei den Aminosäuren handelt es sich um die natürlich vorkommenden L-Isomere.
• Das kurze Peptid EPPT kann selbst als Bindungseinheit gemäß der folgenden Diskussion geeignet sein oder auch nicht; es kann jedoch bei Nichteignung in dieser Hinsicht zur Herstellung längerer erfindungsgemäßer Moleküle, die die Zieleinheit binden, verwendet werden.
• Vorzugsweise umfaßt das EPPT-Peptid weitere Aminosäuren, die dieses in N-terminaler und/oder C-terminaler Richtung erweitern. Beispielsweise kann es sich bei dem Peptid um EPPTRTFAY, REPPTRTFAYWG oder MYYCAREPPTRTFAYWGQG oder ein EPPT-enthaltendes Fragment hiervon handeln. Das Peptid kann anstelle der CDR-Region (vorzugsweise CDR3) einer variablen Antikörpergerüstregion insertiert sein oder einen Teil dieser Region bilden.
• Vorzugsweise handelt es sich bei der genannten variablen Gerüstregion um eine humane Gerüstregion.
• Das Peptid kann daher einen Teil eines (vorzugsweise huma nen) Antikörpers bilden. Das Peptid bildet günstigerweise einen Teil einer vollständigen (vorzugsweise humanen) VH- oder VL-Region und kann zusätzlich mit den übrigen Teilen des Antikörpers unter Bildung eines vollständigen (vorzugsweise humanisierten) Antikörpers assoziiert sein. Alternativ kann das Peptid einen Teil eines kleineren Fragments eines Antikörpers, wie ein Fab, (Fab)&sub2;, Fv, scFv oder dAb-Molekül, bilden. Ferner kann das Peptid als Teil eines Phagen exprimiert werden.
• Das isolierte EPPT-Peptid selbst, isolierte EPPT enthaltende Peptide einer Länge von bis zu 30 Aminosäuren, EPPT enthaltende Polypeptide, Proteine, Antikörperfragmente und Phagen sowie EPPT enthaltende Moleküle werden im folgenden allgemein als "erfindungsgemäße Moleküle" bezeichnet.
• Moleküle dieser Art sind besonders geeignet, wenn die EPPT- Einheit auf der Moleküloberfläche freiliegt und zur Wechselwirkung mit anderen Molekülen zur Verfügung steht. Es fallen jedoch auch andere derartige Moleküle, die zur Freilegung der EPPT-Einheit umgeordnet werden können, hierunter. Beispielsweise kann ein erfindungsgemäßes Molekül als unlösliches Protein in Bakterien exprimiert und anschließend in vitro zur Verwendung bei den erfindungsgemäßen Verfahren umgefaltet werden.
• Die erfindungsgemäßen Moleküle können für eine Vielzahl von Zwecken bezüglich der Untersuchung oder Isolierung und Reinigung des Mucins, an das sie spezifisch binden, und der Abbildung und Behandlung von Zellen, die das Mucin aufweisen, verwendet werden. Da beispielsweise das Mucin durch die betreffende Zelle ausgeschüttet wird, kann das Molekül in einem diagnostischen Test auf der Basis von Blut oder Serum auf die Anwesenheit der Zelle im Körper verwendet werden (z.B. unter Verwendung einer radioaktiv markierten Version des Moleküls zur Bindung an Antigen im Serum in Konkurrenz zu durch Antigen-spezifische Antikörper im Serum immobilisiertem Antigen). In anderen Ausführungsformen ist das erfindungsgemäße Molekül mit einer radioaktiv markierten Substanz für Szintigraphie, einer cytotoxischen Verbindung oder einem Radioisotop, einem Enzym zur Umwandlung eines nichttoxischen Pro-Arzneimittels in ein cytotoxisches Arzneimittel, einer Verbindung zur Aktivierung des Immunsystems zur zielgerechten Lenkung des hierbei entstandenen Konjugats auf einen gewünschten Zelltyp im Körper, z.B. einer Tumorzelle, oder einer zellstimulierenden Verbindung gekoppelt. Solche Konjugate weisen einen aus dem erfindungsgemäßen EPPT enthaltenden Molekül bestehenden "Bindungsbereich" und einen aus der radioaktiv markierten Substanz, dem Toxin oder Enzym und dgl. bestehenden "funktionellen Bereich" auf.
• Das erfindungsgemäße Molekül kann alternativ allein (oder insbesondere zur Steigerung der in-vivo-Stabilität unter Zugabe eines inerten Polypeptids, wobei mit dem genannten Peptid ein vollständiger Antikörper oder ein Antikörperfragment gebildet werden kann oder auch nicht) einfach zur Blockade der Aktivität des Mucins, speziell durch physikalische Störung der Bindung einer anderen Verbindung, verwendet werden.
• Der Bindungsbereich und der funktionelle Bereich des Konjugats (falls es sich bei beiden um ein Peptid oder Polypeptid handelt) können nach einem der üblichen bekannten Verfahren zur Vernetzung von Polypeptiden, wie den allgemein in [18] beschriebenen, miteinander verbunden werden. Beispielsweise kann ein Bereich mit Thiolgruppen angereichert sein und der andere Bereich mit einem bifunktionellen Mittel, das mit diesen Thiolgruppen reagieren kann, z.B. dem N-Hydroxysuccinimidester von lodessigsäure (NHIA) oder N-Succinimidyl-3- (2-pyridyldithio)propionat (SPDP), umgesetzt werden. Amid- und Thioetherbindungen, die beispielsweise mit m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester erhalten werden, sind im allgemeinen in vivo stabiler als Disulfidbindungen.
• Bei dem funktionellen Bereich des Konjugats kann es sich um ein Enzym zur Umwandlung eines nichttoxischen Pro-Arzneimittels in ein toxisches Arzneimittel, beispielsweise die Konjugate von Bagshawe und seinen Kollegen [19-21] oder Cyanid freisetzende Systeme [22], handeln.
• Es muß nicht notwendigerweise das gesamte Enzym im Konjugat vorhanden sein, doch muß natürlich der katalytische Bereich vorhanden sein. Es können sogenannte "Abzyme" verwendet werden, in denen ein monoklonaler Antikörper für eine Verbindung, die an der zu katalysierenden Reaktion, üblicherweise am reaktiven Übergangszustand, beteiligt ist, erzeugt wird. Der hierbei entstandene Antikörper kann dann als Enzym für die Reaktion fungieren.
• Das Konjugat kann durch Größenausschluß- oder Affinitätschromatographie gereinigt und in bezug auf zweifache biologische Aktivitäten getestet werden. Die immunologische Reaktivität eines Peptids kann unter Verwendung eines enzymgebundenen Immunsorbensassays (ELISA) mit immobilisiertem Antigen und in einem Lebendzellenradioimmunassay gemessen werden. Ein Enzymtest kann für β-Glucosidase verwendet werden, wobei ein Substrat verwendet wird, dessen Extinktion sich bei der Hydrolyse der Glucosereste ändert, z.B. oNPG (o-Nitrophenyl-β-D-glucopyranosid), das 2-Nitrophenol freisetzt, welches spektrophotometrisch bei 405 nm gemessen werden kann.
• Die Stabilität des Konjugats kann in vitro durch anfängliches Inkubieren bei 37ºC in Serum und anschließende Größenausschluß-FPLC-Analyse getestet werden. Die Stabilität in vivo kann auf die gleiche Weise in Mäusen getestet werden, wobei das Serum zu verschiedenen Zeiten nach der Injektion des Konjugats analysiert wird. Ferner können das Peptid mit 1251 und das Enzym mit 1311 vor der Konjugation radioaktiv markiert und so die biologische Verteilung des Konjugats, des freien Antikörpers und des freien Enzyms in Mäusen bestimmt werden.
• Alternativ kann das Konjugat durch rekombinante DNA-Techniken als Fusionsverbindung hergestellt werden, wobei ein entsprechendes DNA-Stück die jeweiligen Regionen umfaßt, die für die beiden Teile des Konjugats, die entweder nebeneinander liegen oder durch eine Region mit Codierung für ein Linkerpeptid, das die gewünschten Eigenschaften des Konjugats nicht zerstört, getrennt sind, codieren. Verständlicherweise können sich die beiden funktionellen Bereiche der Verbindung insgesamt oder teilweise überlappen. Die DNA wird anschließend in einem geeigneten Wirt in bekannter Weise exprimiert.
• Die Konjugate können in geeigneter Weise, üblicherweise parenteral, beispielsweise intravenös, intraperitoneal oder vorzugsweise (bei Blasenkrebs) intravesikal (d.h. in die Blase) in standardmäßigen sterilen nichtpyrogenen Zubereitungen mit Verdünnungsmitteln und Trägern, beispielsweise isotonischer Kochsalzlösung (bei intravenöser Verabreichung) verabreicht werden. Sobald das Konjugat an die Zielzellen gebunden und (falls nötig) aus dem Blutstrom geklärt ist, was typischerweise einen Tag o.dgl. dauert, wird das Pro- Arzneimittel üblicherweise in einer einzigen Infusionsdosis verabreicht oder der Tumor abgebildet. Bei Bedarf kann wegen einer möglichen immunogenen Wirkung des Konjugats Cyclosporin oder ein anderes Immunsuppressivum zur Ermöglichung einer längeren Behandlungsdauer verabreicht werden. Dies ist jedoch üblicherweise nicht nötig.
• Der Zeitabstand zwischen den Verabreichungen von Konjugat und Pro-Arzneimittel kann auf nicht erfinderische Weise optimiert werden, da das Verhältnis von Konjugat im Tumor zu dem in normalem Gewebe (zumindest nach intravenöser Verabreichung) nach etwa 4-6 d am höchsten, während zu diesem Zeitpunkt die Absolutmenge von an den Tumor gebundenem Konjugat, ausgedrückt als der Prozentsatz der injizierten Dosis pro g, niedriger als zu einem früheren Zeitpunkt ist.
• Der optimale Abstand zwischen der Verabreichung des Konjugats und des Pro-Arzneimittels ergibt sich daher aus einem Kompromiß zwischen der Spitzenkonzentration des Enzyms im Tumor und dem besten Verteilungsverhältnis zwischen Tumor und normalen Geweben. Die Dosierung des Konjugats kann der Arzt entsprechend den üblichen Kriterien wählen. Zumindest im Fall von Verfahren, bei denen ein Zielenzym und intravenöses Amygdalin als toxisches Pro-Arzneimittel angewandt werden, sind wahrscheinlich 1-50 Tagesdosen von 0,1-10,0 g pro m² Körperoberfläche, vorzugsweise 1,0-5,0 g/m² geeignet. Zur oralen Therapie können drei Dosen pro Tag von 0,05-10, g, vorzugsweise 1,0-5,0 g während 1-50 d geeignet sein. Die Dosierung eines beliebigen Konjugats wird in ähnlicher Weise entsprechend üblichen Kriterien, insbesondere in bezug auf die Art, das Stadium und die Lokalisierung des Tumors und das Gewicht des Patienten ausgewählt. Die Behandlungsdauer wird teilweise von dem raschen Einsetzen und dem Ausmaß einer Immunreaktion auf das Konjugat abhängen.
• Die Konjugate sind - bei Bedarf zusammen mit einem geeigneten Pro-Arzneimittel - im Prinzip zur Zerstörung von Zellen in einem Tumor oder einer anderen definierten Klasse von Zellen, die selektiv das durch die EPPT-Einheit erkannte Mucin aufweisen, geeignet. Dieses Mucin scheint von einer großen Vielzahl von Epitheltumoren, umfassend Lungen- und Brusttumore und Tumore des Harntrakts, insbesondere der Blase, exprimiert zu werden. Die Verbindungen sollen hauptsäch lich dem Einsatz bei Menschen dienen, könnten jedoch zur Behandlung anderer Säugetiere einschließlich von Hunden, Kat zen, Rindern, Pferden, Schweinen und Schafen verwendet werden.
• Die erfindungsgemäßen Verfahren sind besonders zur in-situ- Behandlung von Blasenkarzinom geeignet, wobei das Antikörper-/Enzymkonjugat und das Amygdalin intravesikal verab reicht werden. Unsere Untersuchungen über die Verabreichung von radioaktiv markierten Antikörpern auf diesem Weg zeigen, daß hohe Verhältnisse Tumor/normales Blasengewebe erreicht werden und daß der Antikörper nicht in den Kreislauf gelangt. Blasenkrebs betrifft 2% aller bösartigen Humantumore, wobei nahezu 70% der Fälle zum Zeitpunkt der Diagnose oberflächlich sind. Nach chirurgischer Entfernung tritt in 80% der Fälle eine erneute Bildung auf, wobei sich 10% hiervon zu einem höhergradigen Karzinom mit schlechterer Prognose weiterentwickeln.
• Der funktionelle Bereich des Konjugats umfaßt - bei einer Verwendung des Konjugats zur Diagnose - üblicherweise ein radioaktives Atom zur szintigraphischen Untersuchung, beispielsweise Technetium 99m (99mTc) oder Iod-123 (¹²³I), oder eine Spinmarkierung zur Abbildung durch kemmagnetische Resonanz (NMR) (auch als Magnetresonanzabbildung, mri, bekannt), wie wiederum Iod-123, Iod-131, Indium-111, Fluor-19, Kohlenstoff-13, Stickstoff-15, Sauerstoff-17, Gadolinium, Mangan oder Eisen, oder er besteht hieraus.
• Bei Verwendung in einer Verbindung zur selektiven Zerstörung des Tumors kann der funktionelle Bereich ein stark radioaktives Atom, wie Iod-131, Rhenium-186, Rhenium-188 oder Yttrium-90, das genügend Energie zur Zerstörung der benachbarten Zellen emittiert, oder eine cytotoxische chemische Verbindung, wie Methotrexat, Adriamicin, Vincaalkaloide (Vincristin, Vinblastin, Etoposid), Daunorubicin oder andere interkalierende Mittel umfassen.
• Die radioaktiven oder anderen Markierungen können in das Konjugat auf bekannten Wegen eingeführt werden. Beispielsweise kann das EPPT enthaltende Peptid durch Biosynthese oder durch chemische Aminosäurensynthese unter Verwendung geeigneter Aminosäurevorstufen mit beispielsweise Fluor-19 anstelle von Wasserstoff hergestellt werden. Bei einer derartigen Verbindung wird die radioaktive Markierung in das CDR3-Peptid eingebaut. Markierungen, wie 99mTc, ¹²³I, ¹&sup8;&sup6;Rh, ¹&sup8;&sup8;Rh und ¹¹¹In, können über einen Cysteinrest an das Peptid gebunden werden. Yttrium-90 kann über einen Lysinrest gebunden werden. Die IODOGEN-Methode [23] kann zum Einbau von Iod-123 verwendet werden. In Ref. [24] sind andere Verfahren detailliert beschrieben.
• Weitere erfindungsgemäße Ausführungsformen sind Nucleotidcodierungssequenzen mit Codierung für die erfindungsgemäßen Moleküle (falls das Molekül aus einem Peptid, Polypeptid oder Protein besteht) sowie derartige Codierungssequenzen umfassende Vektoren und Expressionsvehikel, diese Vektoren oder Expressionsvehikel umfassende Wirte (z.B. Bakterien, wie E. coli, Hefen, wie S. cerevisiae, Säugetierzellen, wie Lymphoidzellinien (z.B. Myelomzellen)) und transgene Tiere und Pflanzen, speziell solche, bei denen das Transgen in von B-Lymphozyten verschiedenen Zellen exprimiert werden soll, sowie Verfahren zur Herstellung derartiger Moleküle durch Züchten dieser Wirte und Isolieren der Moleküle.
• In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform wird ein Polynucleotid mit Codierung für ein EPPT enthaltendes Peptid, Polypeptid, Protein oder einen EPPT enthaltenden Bakteriophagen bereitgestellt.
• Derartige Polynucleotide können nach bekannten Techniken, wie die im Handbuch von Sambrook et al. [55], geplant und geschaffen werden. Im speziellen Fall von "Phagenantikörpern", d.h. einen Teil eines Antikörpers (d.h. in diesem Fall die EPPT-Einheit) enthaltenden Bakteriophagen, können die Techniken von McCafferty et al. [56] eingesetzt werden. Auf diese Weise kann die EPPT-Region in der N-terminalen Region des Gen-III-Proteins des Phagen fd exprimiert werden, da das Gen-III-Protein normalerweise an der Spitze des Phagen exprimiert wird.
• Insbesondere kann eine expressionsfähige Polynucleotidcodierungssequenz durch (i) Bereitstellen einer Zelle, die eine erste Codierungssequenz mit Codierung für ein EPPT enthaltendes Peptid, Polypeptid oder Protein umfaßt, (ii) Erhalten von DNA, die dieser Codierungssequenz entspricht, und (iii) Insertieren dieser DNA in eine geeignete Expressionskassette für den geplanten Wirt hergestellt werden.
• Wege zur Durchführung von Stufe (i) sind aus bekannten üblichen immunologischen Techniken und Techniken für monoklonale Antikörper bekannt. Im wesentlichen kann ein Lebewesen mit dem interessierenden Antigen immunisiert werden, worauf Immunsystemzellen, beispielsweise Milzzellen, isoliert werden, wobei diese optional durch Fusion mit Myelomzellen anschließend immortalisiert werden können. Alternativ können auf der Basis neuerer Techniken einzelne B-Lymphozyten oder EBV- immortalisierte Zellen verwendet werden.
• In Stufe (ii) kann die spezifische DNA mit Codierung für EPPT (oder genauer eine Kopie hiervon) unter Verwendung von Primern, deren Spezifität für variable Gerüstregionen bekannt ist, durch Techniken auf der Basis von PCR aus der Zelle isoliert werden. Weitere identische Versionen dieser DNA können natürlich durch PCR, chemische Synthese, in-vivo- Reproduktion oder ein anderes geeignetes Verfahren hergestellt werden.
• Die Stufe (iii) kann unter Verwendung eines Promotors und anderer für den angestrebten Wirt geeigneter regulatorischer Sequenzen mittels üblicher rekombinanter DNA-Ligationstechniken durchgeführt werden.
• Erfindungsgemäße Ausführungsformen und Wege der Umsetzung der Erfindung in die Praxis werden im folgenden unter Bezug auf verschiedenste Beispiele und unter Bezug auf die beigefügten Abbildungen detailliert beschrieben.
• Für die Abbildungen gilt folgendes:
• Fig. 1 zeigt die als Sali-BAMHI-Kassetten klonierten Gene der konstanten Region von Human-y. Die CH1-, CH2- und CH3- Exons von γ&sub3; sind als leere Kästchen und die von γ&sub4; als massive Kästchen angegeben. Die Gelenkregion von Wildtyp γ&sub3; wird durch 4 Exons codiert: Das Gelenkexon 1 (schraffiert) tritt einzeln auf; die Exons 2, 3, 4 (schattiert) sind identisch. Der Wildtyp γ&sub4; weist ein einziges Gelenkexon (quergestreift) auf. Dünne Pfeile deuten auf die Stul-Stelle im Intron, die durch Insertion von Linkem zu PvuI umgewandelt wurde. Die gelenkmodifizierten Konstrukte 1 und 2 zeigen γ&sub3; und γ&sub4; mit reziproken Gelenkwechseln. 3-6 sind Modifikationen innerhalb von γ&sub3;; 3: γ&sub3; mit Gelenkexon 1; 4: Exon 4; 5: Exons 1, 2, 3, 4, 2, 3, 4; und 6: ohne Gelenk.
• Fig. 2 zeigt die Bindung von EPPT-Peptiden an das immobilisierte Mucin-Rezeptorpeptid; und
• Fig. 3 zeigt die gleichen Daten wie Fig. 2 in Form eines Balkendiagramms.
I. ALLGEMEINE TECHNIKEN Expression von für Antikörper codierenden Regionen in transfizierten Myelomzellen
• Seit 1983 beschrieben mehrere Gruppen die Einführung von DNA mit Codierung für eine schwere oder leichte Kette eines Immunglobulins in eine Lymphoidzellinie [25-28]. In allen diesen Fällen wurde die genomische DNA mit Codierung für das Immunglobulinpolypeptid in einen Plasmidvektor auf gpt- oder neo-Basis kloniert. Die hierbei entstandenen Plasmide wurden anschließend entweder mittels Copräzipitation mit Calciumphosphat oder mittels durch DEAE-/Dextran erleichterter DNA- Aufnahme oder durch Fusion der Lymphoidzellen mit aus das Plasmid beherbergenden Escherichia coli hergestellten Sphäroplasten in die Lymphoidzellen eingeführt. Später fand Elektroporation als wirksame Maßnahme zur Einführung von DNA in eine große Vielzahl von Zellinien breite Verwendung. Aus diesen und nachfolgenden Experimenten ist ersichtlich, daß das transfizierte Gen in einer für den Zelltyp geeigneten Weise exprimiert. Mit anderen Worten wird in Myelomzellen das transfizierte Gen stark transkribiert und es werden gute Mengen an Antikörper sezerniert; in prä-B- und B-Zellinien wird das eingeführte Gen in einem viel geringeren Grad exprimiert und in Nichtlymphoidlinien erfolgt keine korrekte Expression des eingeführten Immunglobulingens. Daher wird deutlich, daß Myelome die idealen Wirte für die Expression transfizierter Antikörpergene darstellen, da sie nicht nur die Transkriptionssignale der Immunglobulingene erkennen und daher den Antikörper im Überfluß produzieren, sondern auch für eine Proteinsekretion gut gerüstet sind.
• Typischerweise werden die Gene für die schwere und/oder leichte Kette des gewünschten Antikörpers in ein Plasmid auf neo- oder gpt-Basis kloniert. Die zur Transfektion verwendeten Ig-Gene werden in eukaryotische Expressionsvektoren kloniert, wobei am häufigsten die von Berg und Mitarbeitern [42-44] entwickelten PSV2-Plasmide verwendet werden. Diese Vektoren enthalten einen Plasmidreplikationsursprung und einen Marker zur Selektion in Bakterien, so daß große Mengen an DNA bequem für genetische Manipulationen erhalten werden können. Eine weiteres wesentliches Kennzeichen dieser Vektoren ist ein dominanter in eukaryotischen Zellen selektierbarer Marker; dieser Marker besteht aus einem unter der Kontrolle des SV40-early-region-Promotors transkribierten Bakteriengen. In dieser eukaryotischen Transkriptionseinheit 3' des Bakteriengens sind SV40-Sequenzen zum Spleißen und zur Polyadenylierung enthalten. Es ist von Bedeutung, daß diese dominante selektierbare Marker (Marker, die eine selektierbare Veränderung im pHänotyp normaler Zellen erzeugen) darstellen, so daß sie in zuvor nicht wirkstoffmarkierten Zellinien verwendet werden können.
• Einen der selektierbaren Marker stellt das Escherichia-coli- Gen mit Codierung für Xanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (gpt) dar. Dieses Enzym kann - im Gegensatz zum analogen endogenen Enzym - Xanthin als Vorstufe für Xanthinmonophosphat verwenden und gibt mit Xanthin ausgestatteten Zellen die Möglichkeit, bei Anwesenheit von Mycophenolsäure, einem Wirkstoff, der durch Verhinderung der Umwandlung von Inosinmonophosphat zu Xanthinmonophosphat die Purin-Biosynthese blockiert, zu überleben. Einen zweiten selektierbaren Marker stellt das neo-Gen aus dem Transposon Tns dar, wobei das Gen für eine Phosphotransferase codiert, die das Antibiotikum G418 inaktivieren kann. G418 stört die Funktion des 80S-Ribosoms und blockiert die Proteinsynthese in eukaryotischen Zellen.
• Die beiden Plasmide pSV2gpt und pSV2neo (Fig. 1) enthalten den pBR322-Replikationsursprung und das β-Lactamasegen für AmpR. Ein in noch jüngerer Zeit hergestellter Vektor, pSV184neo, enthält das CmR-Gen und den Replikationsursprung aus dem Plasmid pACYC184 [45]. Die von pBR und pACYC abgeleiteten Plasmide sind kompatibel und können so beide nicht kompetitiv in einem Bakterium vermehrt werden. Es ist nicht bekannt, daß die Replikation dieser Vektoren in Mäusezellen als Episome erfolgt. Die Vektoren werden vielmehr in das Chromosom integriert. Sie sind für den Fall, daß stabile Transfektanten als kontinuierliche Quelle für Antikörper gewünscht werden, geeignet. Zusätzlich zu den genannten Genen enthalten pSV5-Vektoren die Early-Region des Polyomavirus, wodurch die Replikation zu Tausenden von Kopien pro Mäusezelle möglich wird. Die pSV5-Vektoren wurden nur zur transienten Expression von Immunglobulingenen angewandt [46]. Das genaue Ausmaß der zur maximalen Expression erforderlichen DNA-Sequenzen des Immunglobulingens wurde bisher noch nicht vollständig bestimmt. Anfangsexperimente erfolgten unter Verwendung der vollständigen genomischen DNA mit mehreren Tausend Basen flankierender Sequenz. Den größten Teil der ein Antikörpergen bildenden DNA stellt tatsächlich ein Intron dar, wovon der größte Teil wahrscheinlich entbehrlich ist. Das Hauptintron am Ort der schweren Kette von Mäusen enthält einen Transkriptionsenhancer [29, 30, 26]; dieser Enhancer kann aus dem Intron entfernt und stromaufwärts des Immunglobulingens plaziert werden. Auf diese Weise kann ein großer Teil des Hauptintrons des schwere-Kette-Gens des Immunglobulins ohne nachfolgenden Verlust an Antikörperausbeute nach der Transfektion deletiert werden [31]. Gegenwärtig gibt es keinen Beleg dafür, daß andere Introns innerhalb eines Immunglobulingens für die Antikörperexpression wesentliche Signale enthalten. Experimente, bei denen die Transkription einer µ-schwere-Kette-cDNA durch eine Kombination aus einem VH-Promotor und einem IgH-Enhancer gesteuert wurde, zeigten, daß zu einer guten Expression die Anwesenheit eines Introns erforderlich ist, obwohl diese Bedingung nicht spezifisch für ein spezielles Intron ist [32].
• Schließlich sei im Kontext der Immunglobulintranskriptionssignale anzumerken, daß mehrfachkopietransfizierte Ig-Gene normalerweise beträchtlich weniger sezernierten Antikörper ergeben als bei endogenen Einzelkopiegenen in Hybridomen erhalten wird. Da dies auch bei analogen Experimenten unter Verwendung von transgenen Mäusen festgestellt wird, ist stark anzunehmen, daß zu einer hohen Immunglobulingenexpression jenseits der normalerweise bei Transfektionsexperimenten verwendeten Region der DNA lokalisierte Sequenzelemente erforderlich sind und diese deshalb von den Exons der konstanten Region in einer gewissen Entfernung vorliegen.
Expression in Transfektanten aus Nichtlymphoidzellen
• Die Expression transfizierter Ig-Gene in Lymphoidzellinien kann ferner durch Nicht-Immunglobulintranskriptionssignale gesteuert werden. Beispielsweise wurden Promotoren aus einem Hitzeschockgen oder aus SV40 oder dem Humancytomegalovirus erfolgreich verwendet [33-35]. Der Einsatz dieser Transkriptionselemente, die nicht lymphoidspezifisch sind, scheint mehrere Vorteile zu bieten. Die Ausbeuten an Antikörper können ebenso gut wie die zur Zeit mittels des VH-Promotors/- IgH-Enhancers erhaltenen sein. [Dies kann jedoch darauf zurückzuführen sein, daß den verwendeten Segmenten der Genom- Ig-Gene wichtige Transkriptionssignale fehlen]. Darüber hinaus ist mit einigen viralen Transkriptionselementen eine gute Expression aus Ig-cDNA-Konstrukten möglich, ohne daß sich die Notwendigkeit eines Introns zeigte; dies kann bei der Synthese von modifizierten Antikörpern oder Antikörperfr,agmenten von großem Nutzen sein.
• Durch den Einsatz von viralen und Hitzeschock-Promotoren war es möglich, die Synthese von Antikörpern durch Transfektanten aus Nichtlymphoidzellinien zu bewerten. Diese war sowohl mit IgM- als auch IgG-Antikörpern in Nichtlymphoid-Säugetierzellinien erfolgreich [33-35]. Tatsächlich können bei einer nur geringen Störung des Glycosylierungsmusters nichtlymphoide Wirte zur Expression gentechnisch veränderter Antikörper verwendet werden.
Expression in transgenen Tieren
• Die Einführung von Immunglobulingen-DNA in die Mäusekeimlinie [36] veranschaulicht die Verwendung transgener Tiere zur Produktion monoklonaler Antikörper. Das Gen für einen chimären Human-IgA2-Antikörper kann in die Mäusekeimlinie einge führt werden [39]. Die transgenen Mäuse enthalten im Serum gute Konzentrationen des chimären Antikörpers (etwa 100 µg/ml). Der Antikörper wurde auch im Kolostrum und der Milch sezerniert.
Expression in Escherichia coli und Hefe
• In den Referenzen 38 und 39 sind Bakterienexpressionssysteme zur Synthese von Antikörperfragmenten (Fv, Fab und Fc von IgE) beschrieben. Auf diese Weise stehen nun viele Expressionssysteme zur Produktion gentechnisch veränderter Antikörper zur Verfügung, obwohl die Technologie sich offensichtlich weiter entwickelt.
Herstellung chimärer Antikörper mit Humaneffektorfunktionen
• Die in-vitro-Manipulation von Immunglobulingen-DNA vor deren Einführung in Myelomzellen macht die Produktion chimärer Antikörper, die antigenbindende variable (V-)Regionen von Mäusen oder Ratten an humane konstante (C-)Regionen gebunden enthalten, möglich. Zur Konstruktion derartiger Antikörper wird ein für das gewünschte Antigen spezifisches Mäuse- oder Rattenhybridom unter Verwendung von Standardverfahren hergestellt; die exprimierten V-Region-Gene des Hybridoms werden dann isoliert und mit den Human-C-Region-Genen durch in-vi tro-DNA-Rekombination verbunden. Anschließend wird ein die Gene für diesen chimären Antikörper enthaltendes Plasmid in eine Myelomzellinie eingeführt. Auf diese Weise wurden chimäre Human-IgM-, -IgG- oder -IgE-Antikörper, die für TNP, Phosphocholin oder NP spezifisch sind, hergestellt [40, 41, 31].
Verfahren zur Klonierung von Immunglobulingenen zur Expression
• Umgruppierte bzw. rearrangierte Gene mit variabler Region von Ig können aus Genombibliotheken von Hybridomen unter Verwendung der geeigneten DNA-Sonden isoliert werden.
• In den meisten Fällen nutzt die Klonierungsstrategie die Tatsache, daß sowohl die variable Region der schweren als auch der leichten Kette vor der Expression durch eine J-Region verbunden sein müssen. Die J-Regionsonden können daher zur Unterscheidung der exprimierten variablen Regionen von den Hunderten nicht exprimierter variabler Regionen verwendet werden. Dieser Versuch erfährt häufig Komplikationen durch die Anwesenheit von irrtümlich rearrangierten variablen Regionen, so daß ein zweiter Test zur Unterscheidung irrtümlicher von Produktions-Rearrangements verwendet werden muß [8]. Die aus Genom-DNA klonierten variablen Regionen werden gewöhnlich unter Verwendung ihrer eigenen Promotorregionen exprimiert.
• Ferner ist auch die Expression von rearrangierten V-Region- Genen, die aus cDNA-Bibliotheken kloniert wurden, möglich [47, 48]. Zwei Versuche wurden zur Expression von cDNA verwendet. Bei einem Versuch wurden die cDNAs zur Konstruktion einer variablen Region, die mit einem genomischen Klon mit einem zur Expression verwendeten Human-Ig-Promotor identisch war, verwendet [47]. Bei einem zweiten Versuch wurde eine in-vitro-Mutagenese eingesetzt, um der Ig-Region die Eignung zur Expression durch einen SV40-Promotor zu verleihen [48]. Beide Versuche stellen Alternativen zur Genomklonierung zur Expression der gewünschten variablen Regionen dar.
• Die Produktion eines funktionellen Antikörpers erfordert die Synthese und den geeigneten Zusammenbau von sowohl H- als auch L-Ketten. Zur Gentransfektion können beide Gene in einen Vektor kloniert werden [3]; dies ist jedoch wegen der Begrenzung einzelner Restriktionsstellen innerhalb eines großen Plasmids technisch schwierig. Daher sind kleinere Plasmide für genetische Manipulationen und DNA-Herstellung bevorzugt.
• Ein in der Praxis besser geeigneter Versuch bestand darin, die H- und L-Ketten in zwei getrennte Plasmide zu klonieren (Fig. 1). Beispielsweise wird das H-Ketten-Gen in PSV2-gpt und die L-Kette in pSB184-neo eingeführt (vgl. oben). Beide Plasmide werden dann in Escherichia coli transfiziert und es werden ampRCmR-Klone isoliert. Durch Protoplastenfusion werden beide Vektoren gleichzeitig in die Empfängerzelle in einer einzigen Stufe transfiziert. Durch die beiden Ketten auf verschiedenen Plasmiden können Veränderungen innerhalb des Gens einer Kette unabhängig vom anderen durchgeführt werden. Die Transfektion unterschiedlicher Kombinationen von H- und L-Ketten wird dadurch erleichtert.
• Ein günstiges Verfahren ist die Bildung von "Genkassetten", wodurch es bequem wird, Exons kompletter Gene zu unterschiedlichen C-Regionen zu verschieben oder ein V-Gen an unterschiedliche C-Regionen zu binden und umgekehrt. Hierzu können Linker zur Einführung einzelner Restriktionsstellen in die Gene verwendet werden. In den Originalvektoren zur Expression chimärer Igs wurden die konstanten Regionen als SalI-BamHI-Kassette konstruiert. In späteren Konstruktionen wurden einzelne PvuI-Stellen innerhalb der Zwischensequen zen, die die einzelnen Human-γ-konstante-Region-Domänen trennen (unterer Teil von Fig. 1), plaziert; die Plazierung von Linkern innerhalb der Zwischensequenzen führt zur Vermeidung einer Unterbrechung des Translationsleserasters. Das Vorhandensein einzelner Restriktionsstellen zwischen Exons vereinfacht die Verschiebung von Exons stark.
• Es wurden Ig-Ketten hergestellt, in denen VH an CL und VL an CH gebunden ist [49-51]. Diese Moleküle wurden zusammengebaut, wurden sezerniert und banden, wenn sie die entsprechenden variablen Regionen enthielten, Antigen. Diese leichte-Kette-Heterodimere liefern möglicherweise die Fähigkeit zur Antigenbindung ohne eine Effektorfunktion. Diese und ähnliche Moleküle, die in vivo nicht auftreten, können erfindungsgemäß modifiziert werden.
II. SPEZIELLE BEISPIELE BEISPIEL 1: ISOLIERUNG DER VARIABLEN DOMANEN VON KLON B
• Bei Klon B handelt es sich um eine Lymphoblastoidzellinie (die Antikörper gegen ein Tumor-assozuertes Mucinmolekül sezerniert), die vor einer EBV-Transformation und Klonierung von B-Zellen aus peripherem Blut eines Patienten herrührt. Nach der Isolierung der DNA wurde die Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung von für die variablen leichten und schweren Ketten von Immunglobulinen spezifischen Oligonucleotid-Primern (Tabelle 1) durchgeführt.
TABELLE 1 Oligonucleotid-Primer Für die variable Domäne: Schwere Kette (VH)
• (wobei S = C oder G, M = A oder C, R = A oder G und W = A oder T)
• Der Vorwärts-Primer enthält eine EcoRI-Stelle und eine BstEII-Stelle. Der Rückwärts-Primer enthält eine BamHI- Stelle und eine PstI-Stelle.
• Die isolierte DNA wurde durch Agarosegelelektrophorese untersucht und zeigte eine Größe von 350 Basenpaaren. Die DNA mit Codierung für die VH-Region wurde einer Gen-Reinigung unterzogen und in ein Plasmid (pUC18) ligiert. Eine einzige Kolonie von Plasmid enthaltenden TG-1-Bakterien wurde isoliert. Diese Kolonie wurde expandiert und hieraus ein Minipräparat der DNA erhalten.
• Aus diesem Minipräparat wurde das VH-Gen des Humanantikörpers, das wir nun als Klon B bezeichnen, mittels Restrikti onsenzymverdauung isoliert. Das Gen mit Codierung für die VH-Region wurde anschließend in einen Sequenzierungsphagen (M13mp18) ligiert. Die TG-l-Bakterienzellen wurden mit dem Phagen transformiert und wachsengelassen. Die einzelsträngige DNA wurde isoliert. Die einzelsträngige DNA wurde unter Verwendung der Sequenase-Reaktion sequenziert und in ein 6%- Acrylamidgel (0,4 mm dick) laufengelassen.
• Die Sequenzierung des Gens mit Codierung für die VH-Region von Klon B ergab eine Sequenz, die mit der Kabat-Humanschwere-Kette-Subgruppe-II-Klassifikation konsistent war (Tabelle 2). TABELLE 2 HUMAN-ANTI-MUCIN-MoAb: DNA- & AMINOSÄURESEQUENZ
BEISPIEL 2: ISOLIERUNG DER VARIABLEN DOMNNEN VON NM-2
• Bei dem Antikörper NM-2 handelt es sich um einen monoklonalen Mäuseantikörper der Klasse IgG.1, Lambda leichte Kette, der Spezifität für das Mucinmolekül aufweist. Der Antikörper reagiert mit etwa 95% der Epitheltumore und weist eine Kreuzreaktion mit normalem Mucin auf.
• Klonierung der variablen Domänen von NM-2. Sowohl die variable schwere als auch leichte Kette wurde unter Verwendung der in Beispiel 1 angegebenen Techniken kloniert und sequenziert. Eine vollständige Liste der Primer und ihrer Sequenzen ist in Tabelle 3 angegeben.
TABELLE 3
• Primer, die zur Isolierung und Sequenzierung der VH- und VL- Gene von NM-2 verwendet wurden. i) Für das variable-schwere-Kette-Gen (VH)
• Anmerkung: Alle Primersequenzen sind 5'-3'
• Nach der Sequenzierung der Gene für sowohl die schwere (VH) als auch die leichte (VL) Kette für NM-2 können wir nun alle CDR-Sequenzen angeben (Tabelle 4 und 5). TABELLE 4 DNA- UND AMINOSÄURESEQUENZ DER VH-DOMÄNE DES MONOKLONALEN ANTIKÖRPERS NM-2 TABELLE 5 NM2LAMBDA
• Es wurden sechs den CDRS der variablen schweren Kette von NM-2 entsprechende Peptide synthetisiert (Tabelle 6). TABELLE 6
• Die CDR3-Peptide mit der Aminosäurekernsequenz EPPT zeigten Antigen-bindende Spezifität. Als besonders interessantes Ergebnis zeigte sich, daß die Aminosäuresequenz EPPT in der CDR3 von sowohl Mäuseantikörpern (NM-2) als auch Humanantikörpern (Klon B) vorhanden war.
• CDR3-Transplantation. Die EPPT-Sequenz wurde zur Substitution des 5'-Endes von CDR3 von sowohl Human- als auch Mäuseantikörpern verwendet. Es zeigte sich, daß diese neuen Antikörper Anti-Mucin-Spezifität aufwiesen. Dadurch wurde nachgewiesen, daß die Transplantation von CDR3 allein zur Verleihung von Antitumorspezifität ausreicht. Diese Beobachtung macht die Notwendigkeit der Transplantation der vollständigen CDR, d.h. von CDR1 und CDR2 zusätzlich zu CDR3 (wie dies zuvor von G. Winter und Kollegen beschrieben wurde), in mindestens einigen Fällen von Antikörpern überflüssig.
BEISPIEL 3: BINDUNG DER ERFINDUNSGEMÄSSEN MOLEKÜLE AN RADIOAKTIV MARKIERTES MUCINPEPTID
• Herstellung von immobilisierten Mucinrezeptorpeptid. 7,5 mg YVTSAPDTRPAPGST (die Epitopsequenz des Mucinmoleküls) wurden in 100 mM Natriumphosphatpuffer eines pH-Werts von 8 gelöst. Diese Lösung wurde mit 7,5 mg Rinderserumalbumin (BSA) gemischt und mit Puffer auf 0,5 ml aufgefüllt. Nach Zugabe von 5 µl 25% Glutaraldehyd wurde das Ganze gemischt und 15 min bei Raumtemperatur stehen gelassen. Nach Zugabe von weiteren 2,5 µl Glutaraldehyd wurde das Gemisch weitere 15 min stehen gelassen.
• Nach der Inkubation wurde die Lösung mit 100 µl 1 M Glycin eines pH-Werts von 6 versetzt und 10 min zum Quenchen des Glutaraldehyds stehen gelassen. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend in aliquote Teile von 100 µl aufgeteilt und bei -20ºC bis zur Verwendung gelagert.
• Radioaktive Markierung der EPPT-Peptide vor den Bindungstests. Die Peptide wurden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung, 100 mM Natriumphosphat eines pH-Werts von 8 oder 5% DMSO in Natriumphosphat gelöst. Alle Peptide wurden unter Verwendung der lodogenreaktion mit I¹²&sup5; markiert. In Abhängigkeit von der Löslichkeit wurde bis zu 1 mg Peptid mit etwa 137MBq I¹²&sup5; in einem Volumen von 200 µl in einem Iodogenröhrchen (20 µg Iodogen pro Röhrchen) während unterschiedlicher Zeitspannen bis zu 60 min bei Raumtemperatur radioaktiv markiert. Die Iodogenröhrchen wurden anschließend mit 1 ml Puffer gewaschen und über Sephadex-G10-Säulen (Bettvolumen 5 ml), die zuvor mit dem Puffer equilibriert worden waren, eluiert. Das Eluat wurde in 1-ml-Fraktionen gesammelt und bezüglich Radioaktivität getestet.
• Beispielsweise wurden 200 µl (1 ml) des Peptids REPPTRTFAYWG plus 10 µl (37MBq) I¹²&sup5; 60 min bei Raumtemperatur in einem Iodogenröhrchen gemischt. Die beim anschließenden Eluieren über eine Gb-Säule gesammelten Fraktionen waren die folgenden: TABELLE 7
• Gesamtaktivität der Proben 2-12 einschließlich (äquivalent zu 1 mg Peptid) = 34,62 MBq. Daher, Probe 3 = (8,92/34,62) x 1 mg = 0,258 mg ml&supmin;¹.
• Bindung der EPPT-Peptide an immobilisiertes Mucinrezeptorpeptid. Die Technik der Gleichgewichtsdialyse wurde zur Bestimmung der Bindung von EPPT-Peptiden an das immobilisierte Mucinrezeptorpeptid verwendet. Bei dieser Technik werden zwei durch eine Dialysemembran getrennte Kammern verwendet, so daß sich für kleine Moleküle (unter 12.000-14.000 Dalton) ein freies Gleichgewicht zwischen den beiden Kammern einstellen kann. Der Rezeptor ist auf eine Hälfte der Dialysekammer beschränkt. Sobald das Peptid an seinen Rezeptor gebunden ist, kann es im System keine osmotische Wirkung mehr entfalten und es erfolgt eine darauffolgende Verschiebung im Gleichgewicht derart, daß die Zählrate in der Rezeptorkammer höher als in der gegenüberliegenden Kammer ist. Proben werden von beiden Seiten der Membran entfernt und auf das Vorhandensein von Radioaktivität getestet. Zum Zwecke dieser Untersuchungen wurde ein durch eine Dialysemembran in gleiche Teile getrenntes 1-ml-Dialysemodul verwendet. Das immobilisierte Rezeptorpeptid wurde in eine Kammer mit einer Endkonzentration von 83,3 µg (in bezug auf das Peptid) gegeben. Beide Kammern wurden mit verschiedenen Konzentrationen von EPPT-Peptiden versetzt und zur Equilibrierung 24-48 h bei Raumtemperatur unter konstanter Rotation des Dialysemoduls inkubiert. Darüber hinaus wurden einige Module mit ähnlichen Konzentrationen an EPPT-Peptid (mit I¹²&sup5; mar kiert), jedoch mit einem zehnfachen Überschuß an unmarkiertem ("kaltem") Peptid zum Zwecke der Bestimmung der nichtspezifischen Bindung (nsb) angesetzt. Nach der Inkubation und Equilibrierung wurden die Proben aus dem Dialysemodul entfernt und bezüglich des Vorhandenseins von I¹²&sup5; gezählt. Die Radioaktivität wurde anschließend zum Zwecke der Bestimmung der an das immobilisierte Rezeptorpeptid gebundenen Peptidmenge in die Peptidmenge umgerechnet.
• Die Fig. 2 und 3 beziehen sich auf die Bindung von EPPT-Peptid an das Mucinrezeptorpeptid, wobei die eine die Bindung für die einzelnen Peptide bei den getesteten Konzentrationen angibt, während das Balkendiagramm zum einfacheren Vergleich der bisher getesteten vier Peptide die Aufnahmemenge bei einer speziellen Peptidkonzentration angibt. Das Peptid EPPTRTFAY zeigt keine wirkliche Bindung an das Mucinrezeptorpeptid. Wir glauben, daß dies die Tatsache widerspiegelt, daß die geladene Aminogruppe von diesem Glutamylrest innerhalb der Bindestelle entfernt werden muß.
• Das EPPTRTFAY umfaßt die gesamte VH-CDR-3-Domäne ohne Reste aus der Gerüstregion und scheint selbst das Mucinrezeptorpeptid nicht zu binden. Durch Anfügen von drei Resten aus der anschließenden Gerüstregion (ARG an den N-Terminus, TRP und GLY an den C-Terminus) an diese Sequenz wird das Bindungsvermögen wiederhergestellt und durch weitere Addition von Aminosäureresten verbessert. Wir meinen, daß die flankierenden Gruppen nicht die der Gerüstregion sein müssen: Unter der Voraussetzung, daß die Aminogruppe des N-Terminus vom Glutaminsäurerest eine gewisse Entfernung aufweist, kann das Molekül Bindungsfähigkeit aufweisen.
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Claims (15)

1. Molekül, bestehend aus der Aminosäuresequenz EPPT.

2. Molekül, bestehend aus der Aminosäuresequenz EPPT und weiteren Aminosäuren zur Bildung eines Peptids einer Länge von bis zu 30 Aminosäuren.

3. Molekül nach Anspruch 2, wobei gilt, daß es nicht aus GEGSTEPPTVT besteht.

4. Molekül, welches das variable Gerüst eines Antikörpers umfaßt, wobei die Aminosäuresequenz EPPT einen Teil einer CDR des variablen Gerüsts bildet, wobei gilt, daß es sich bei dem Molekül nicht um den monoklonalen antipolymorphen Epithelmucin-Antikörper HMFG2 handelt.

5. Bakteriophage, welcher die Aminosäuresequenz EPPT um-

6. Konjugat, umfassend (1) ein die Aminosäuresequenz EPPT umfassendes Molekül und (2) einen funktionellen Bereich, der physiologisch aktiv, chemisch reaktionsfähig, katalytisch oder in vivo abbildbar ist, wobei gilt, daß es sich bei dem Molekül nicht um den monoklonalen anti-polymorphen Epithelmucin-Antikörper HMFG2 handelt.

7. Gereinigtes Konjugat nach Anspruch 6, wobei der funktionelle Bereich eine cytotoxische Komponente, einen enzymatisch aktiven Teil mit der Fähigkeit zur Metabolisierung eines relativ nichttoxischen Pro-Arzneimittels in eine cytotoxische Verbindung, eine Markierung zur bildlichen Darstellung von Zellen, an die das Konjugat gebunden ist, einen inerten Teil mit der Fähigkeit zur Blockade einer Funktion auf einer Zelle, an die das Konjugat gebunden ist, oder eine zellenstimulierende Verbindung umfaßt.

8. Polynucleotid mit Kodierung für ein Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder (wenn es sich bei dem Konjugat um ein Polypeptid handelt) ein Konjugat nach Anspruch 6 oder 7.

9. Mit einem Nucleotid nach Anspruch 8 transformierter Wirt mit der Fähigkeit zur Expression des Moleküls oder Konjugats.

10. Ex-vivo-Methode zur Identifizierung, Lokalisierung oder Störung der Eigenschaften (i) einer Zelle mit einer Zellenoberflächeneinheit mit der Fähigkeit, durch eine Verbindung mit einer auf ihrer Oberfläche freiliegenden Aminosäuresequenz EPPT selektiv gebunden zu werden, oder (ii) der aus einer solchen Zelle isolierten Einheit durch Einwirkenlassen eines Moleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder eines Konjugats nach Anspruch 6 oder 7 auf die Zelle oder die Einheit.

11. Molekül oder Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Verwendung in der Medizin.

12. Arzneimittelzubereitung mit einem Konjugat, umfassend (i) ein die Aminosäuresequenz EPPT umfassendes Molekül und (ii) einen funktionellen Teil, der physiologisch aktiv, chemisch reaktionsfähig, katalytisch oder in vivo abbildbar ist, wobei es sich bei dem Molekül nicht um den monoklonalen anti-polymorphen Epithelmucin-Antikörper HMFG2 handelt.

13. Arzneimittelzubereitung nach Anspruch 12, umfassend ein Konjugat, dessen funktioneller Teil eine cytotoxische Komponente, einen enzymatisch aktiven Teil mit der Fähigkeit zur Metabolisierung eines relativ nichttoxischen Pro-Arzneimittels in eine cytotoxische Verbindung, eine Markierung zur bildlichen Darstellung von Zellen, an die das Konjugat gebunden ist, einen inerten Teil mit der Fähigkeit zur Blockade einer Funktion auf einer Zelle, an die das Konjugat gebunden ist, oder eine zellenstimulierende Verbindung umfaßt.

14. Verwendung eines die Aminosäuresequenz EPPT umfassenden Moleküls bei der Herstellung eines Medikaments zur Krebsbehandlung, wobei es sich bei dem Molekül nicht um den monoklonalen anti-polymorphen Epithelmucin-Antikörper HMFG2 handelt.

15. Verwendung eines die Aminosäuresequenz EPPT umfassenden Moleküls bei der Herstellung eines Reagens zur Krebsdiagnose, wobei es sich bei dem Molekül nicht um den monoklonalen anti-polymorphen Epithelmucin-Antikörper HMFG2 handelt.