DE69835679T2

DE69835679T2 - Zufälligverteilt erzeugte kombinatorische peptidbibliotheken

Info

Publication number: DE69835679T2
Application number: DE69835679T
Authority: DE
Inventors: R. Rao Edmonton KOGANTY; Dongxu Edmonton QIU; Sham Edmonton GANDHI
Original assignee: Biomira Inc
Current assignee: Oncothyreon Canada Inc
Priority date: 1997-08-28
Filing date: 1998-08-28
Publication date: 2007-08-23
Anticipated expiration: 2018-08-29
Also published as: CA2302472A1; US20040077826A1; AU8995398A; AU746759B2; WO1999011654A1; DE69835679D1; EP1007541A1; JP2003525837A; ATE337329T1; US20020193563A1; EP1007541B1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung einer kombinatorischen Bibliothek von Glycopeptiden sowie durch das Verfahren erzeugte Glycopeptidbibliotheken. Insbesondere betrifft sie ein Verfahren zum Erzeugen einer kombinatorischen Bibliothek eines Krebsassoziierten Mucins.
Glycopeptide sind eine breite Klasse organischer Verbindungen, die bei diversen biochemischen Prozessen, einschließlich der Regulierung des Zellwachstums, der Bindung von Pathogenen an Zellen, der Kommunikation zwischen den Zellen und der Metastase, wichtig sind. Bei der Biosynthese werden die Kohlenhydrate von Glycoproteinen (co- oder posttranslational) mittels Glycosyltransferaseenzymen angehängt, wobei jedes Enzym für eine bestimmte Monosaccharideinheit und einen Bindungstyp spezifisch ist. Mono- und Oligosaccharide werden im endoplasmatischen Reticulum auf Proteine übertragen und unter Bildung von N-verknüpften Oligosacchariden mit der NH₂-Gruppe in der Seitenkette eines Asparaginrests des Proteins verknüpft. Mono- und Oligosaccharide können auch unter Bildung von O-verknüpften Oligosacchariden mit der OH-Gruppe in der Seitenkette eines Serin-, Threonin- oder Hydroxylysinrests verknüpft werden.
Verschiedene Glycoformen desselben Proteins sind regelmäßig anzutreffen, und diese unterscheiden sich in den angehängten Kohlenhydratstrukturen. Die Glycoformen unterscheiden sich hinsichtlich Eigenschaften, wie Proteasestabilität, Affinität für Rezeptoren und pharmakokinetischem Profil. Um den Einfluß der Glycosylierungsmuster auf die Eigenschaften eines Glycopeptids zu untersuchen und um Verbindungen zu identifizieren, die bei der Diagnose und/oder Therapie geeignet sind, ist es notwendig, Zugang zu mehreren verschiedenen Glycoformen zu haben. Der allgemein am häufigsten verwendete Ansatz zum Erhalten von definierten Glycopeptidfragmenten ist die chemische Synthese unter Verwendung von glycosylierten Aminosäuren, obwohl auch die enzymatische Glycosylierung unter Verwendung von Glycosyltransferasen verwendet wurde.
Die chemische Synthese von Serin und Threonin mit großen O-verknüpften Kohlenhydratstrukturen als Bausteine für die Glycopeptidsynthese ist viel schwieriger als die Synthese von entweder Oligopeptiden oder Oligosacchariden. Beispielsweise wurde eine Anzahl von Mono-, Di- und Trisacchariden auf dem Kern des Karzinom-assoziierten MUC1 identifiziert. Die chemische Synthese der α-O-verknüpften mucinartigen Glycopeptide auf Basis von N-Acetylgalactosamin ist abhängig von dem Zugang zu großen Mengen von O-glycosylierten Aminosäuren. Die sequentiellen Glycosylierungen von Serin und Threonin für die Glycopeptidsynthese auf Basis von Fmoc umfaßt eine komplexe Manipulation der Selektivitäten von basenempfindlichen Schutzgruppen. Durch Fmoc geschütztes Serin und Threonin gehören zu den hochgradiger empfindlichen und gehinderten Aglyconen, die bei Glycosylierungsreaktionen verwendet werden. Es ist praktisch unmöglich, alle mögli chen Kombinationen von Glycopeptiden chemisch zu synthetisieren und sie gegen einen natürlichen Anti-Mucin-Antikörper oder polyklonales Serum zu testen.
Kombinatorische Verfahren haben als Verfahren zum Auffinden wünschenswerter Verbindungen großes Interesse auf sich gezogen. Diese Verfahren umfassen das Erzeugen von Bibliotheken verwandter Verbindungen. Die Wechselwirkung eines Antigens mit der Bibliothek wird dann gemessen, um festzustellen, ob eine oder mehrere Verbindungen in der Bibliothek das Antigen erkennt bzw. erkennen. Die Verwendung der kombinatorischen Chemie, um große Anzahlen von Molekülen, entweder als einzelne Verbindungen oder als Gemische, zu synthetisieren, wird als eine der Grenzen der auf die Arzneimittelforschung angewandten organischen Chemie betrachtet.
Bis heute wird die kombinatorische Chemie auf die Erzeugung von Peptid- und Oligonukleotidbibliotheken angewandt, wobei die gut etablierte Chemie der Ausbildung von Amidbindungen und Phosphodiesterbindungen zu raschen Fortschritten führte. Die kombinatorische Chemie wurde jedoch nicht auf die Erzeugung von Glycopeptidbibliotheken angewandt. Die Glycosylierung der Aminogruppe auf der Seitenkette eines Asparaginrests des Proteins unter Bildung von N-verknüpften Oligosacchariden kann an irgendeiner der drei oder vier Hydroxylgruppen auf dem Saccharid erfolgen. Sowohl für N-verknüpfte als auch für O-verknüpfte Oligosaccharide wird bei der Glycosylierung ein neues Stereozentrum gebildet. Dies führt entweder zu einer α- oder zu einer β-glycosidischen Bindung, die für gewöhnlich axial bzw. äquatorial sind.
Die WO-A-95/18971 offenbart Verfahren für die Festphasensynthese von Glycokonjugaten einschließlich Glycopeptiden. Dieses Dokument offenbart Bibliotheken, bestehend aus Glycopeptiden mit unterschiedlich glycosylierten Spezies, einschließlich Peptidbibliotheken mit Peptiden, die mehrfach glycosyliert wurden, insbesondere durch Umsetzen wenigstens zweier Glycosyl-Donoren mit Peptiden mit mehr als einer Glycosylierungsstelle. Die WO-A-95/10296 richtet sich ebenfalls auf kombinatorische Bibliotheken von Glycopeptiden für die Identifizierung von Zelladhäsionsinhibitoren. Die Erzeugung der verschiedenen Spezies, welche die kombinatorische Bibliothek bilden, erfolgt durch Glycosylieren von Peptidgerüsten.
Es besteht daher ein Bedarf nach einem Verfahren zum Erzeugen einer kombinatorischen Bibliothek von Glycopeptiden. Eine solche Bibliothek könnte verwendet werden, um innerhalb der Bibliothek eine Suche hinsichtlich der biologischen Aktivität verschiedener Glycoformen durchzuführen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Demnach besteht ein Ziel der vorliegenden Erfindung darin, ein kombinatorisches Verfahren zur Erzeugung von Glycopeptidbibliotheken bereitzustellen.
Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zum Identifizieren von Glycopeptiden, die eine definierte biologische Aktivität aufweisen, mittels Durchsuchen einer Zufallsbibliothek von Glycopeptiden hinsichtlich der biologischen Aktivität bereitzustellen.
Noch ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zum Erzeugen einer kombinatorischen Bibliothek von Mucinen bereitzustellen.
Diese und weitere Ziele der Erfindung werden erreicht durch ein Verfahren zum Erzeugen einer Bibliothek von Peptiden oder peptidähnlichen Strukturen, die wenigstens eine Glycosylierungsstelle aufweisen, wobei das Verfahren umfaßt: (a) zufälliges Glycosylieren eines Kerns, der wenigstens eine Glycosylierungsstelle aufweist, mit wenigstens einem Glycosyl-Donor, optional Blockieren nicht umgesetzter Glycosylierungsstellen auf den glycosylierten Kernen und optional selektives Entfernen einer oder mehrerer Schutzgruppen auf den Kohlenhydratgruppen, die auf der ersten Ebene eingeführt wurden, wobei eine Bibliothek von glycosylierten Kernen der ersten Ebene erzeugt wird, und anschließend (b) optional zufälliges Glycosylieren der Bibliothek von glycosylierten Kernen der ersten Ebene oder einer Kombination von Bibliotheken von glycosylierten Kernen der ersten Ebene mit wenigstens einem Glycosyl-Donor, und optional selektives Entfernen einer oder mehrerer ausgewiesener Schutzgruppen auf den Kohlenhydratgruppen, die auf der zweiten Ebene eingeführt wurden, wobei eine Bibliothek von glycosylierten Kernen der zweiten Ebene erzeugt wird. Das Verfahren kann weiterhin folgendes umfassen: zufälliges Glycosylieren der Bibliothek von glycosylierten Kernen der zweiten Ebene oder einer Kombination von Bibliotheken von glycosylierten Kernen der zweiten Ebene oder der ersten und der zweiten Ebene mit wenigstens einem Glycosyl-Donor, und optional selektives Entfernen einer oder mehrerer ausgewiesener Schutzgruppen auf den Kohlenhydratgruppen, die auf der dritten Ebene eingeführt wurden, wobei eine Bibliothek von glycosylierten Kernen der dritten Ebene erzeugt wird, und optional Wiederholen der vorangegangenen Stufe, um Bibliotheken der vierten Ebene und höherer Ebenen mit zunehmender Vielfalt zu erzeugen.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt die zufällig erzeugte Glycopeptidbibliothek Karzinom-assoziierte Mucine oder mit Adhäsionsliganden für Bakterienrezeptoren assoziierte Strukturen, die auf menschlichen Zelloberflächenantigenen exprimiert werden. Die Komponenten der Bibliothek können auf arzneimittelähnliche, kompetitiv hemmende, immunstimulatorische oder antikörperähnliche Aktivität untersucht werden.
Weitere Ziele, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der nachfolgenden ausführlichen Beschreibung offensichtlich. Es versteht sich jedoch, daß die ausführliche Beschreibung und die spezifischen Beispiele, obwohl sie bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung zeigen, lediglich beispielhaft angegeben werden, da verschiedene Veränderungen und Modifikationen innerhalb des Gedankens und des Schutzumfangs der Erfindung sich für Fachleute auf dem Gebiet aus dieser ausführlichen Beschreibung ergeben.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt eine lineare Plattform für die kombinatorische Synthese von Bibliotheken gemäß der vorliegenden Erfindung.
2 (ein zyklisches MUC1-Peptid) ist ein Beispiel einer zyklischen Plattform für die kombinatorische Synthese von Bibliotheken gemäß der vorliegenden Erfindung.
3 zeigt ein einfaches zyklisches Peptid und eine löslich gemachte Version, die eine Lipidkette enthält.
4 zeigt eine Plattform mit nicht natürlichen Glycosylierungsstellen.
5 ist ein Beispiel einer Hybridplattform, die keine Peptidbindungen enthält.
6 (ein Beispiel eines zyklischen Peptids für die zufällige Glycosylierung; die Löslichkeit solcher Peptide kann durch hydrophobe Gruppen gesteigert werden) ist ein Beispiel eines zyklischen Peptids für zufällige Glycosylierungen, wobei die Löslichkeit durch die Einfügung von hydrophoben Gruppen gesteigert wird.
7 zeigt auf Krebs-Mucinen gefundene Kohlenhydratstrukturen.
8 (Darstellung von Funktionen einer Glycopeptidbibliothek mit gut charakterisierten monoklonalen Antikörpern) ist ein Säulendiagramm der Ergebnisse der Untersuchung einer GSTA-Bibliothek.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es möglich, große Glycopeptidbibliotheken durch zufällige Glycosylierung eines ausgewählten Peptids oder einer peptidähnlichen Struktur mit wenigstens einer Glycosylierungsstelle zu erzeugen. Die zufällige Glycosylierung eines Peptids oder einer peptidähnlichen Struktur mit mehr als einer Glycosylierungsstelle liefert eine große Bibliothek aller möglichen Kombinationen von Glycosylierungen, da jede Glycosylierungsstelle für eine gegebene Sequenz einzigartig ist. Die zufälligen Bibliotheken liefern eine schnelle und effiziente Möglichkeit zum Screenen hinsichtlich arzneimittelähnlicher, kompetitiv hemmender, immunstimulatorischer, antikörperähnlicher und anderer biologischer Aktivitäten. Die Größe der Zufallsbibliothek von Glycopeptiden ist abhängig von dem Ausmaß der Glycosylierung im Hinblick auf die Anzahl von Stellen und der Vielfalt der hinzugefügten Kohlenhydratstrukturen.
Die "Plattform" oder der Kern, die bzw. der als Basis für die Glycopeptidbibliothek verwendet wird, ist irgendein Peptid oder eine peptidähnliche Struktur, einschließlich nicht natürlicher, synthetischer Strukturen, und kann Tandemwiederholungen enthalten. Die Plattform enthält eine oder mehrere Glycosylierungsstellen, die natürlich oder nicht natürlich sein können. Eine Plattform mit nicht natürlichen Glycosylierungsstellen ist in 4 gezeigt. Vorzugsweise gibt es von 2 bis 5 Glycosylierungsstellen auf dem Peptid oder der Tandemwiederholung und bevorzugter 2 oder 3 Glycosylierungsstellen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist jede Glycosylierungsstelle auf einer Plattform einzigartig und aufgrund unterschiedlicher struktureller Merkmale in der Nähe der Stelle von anderen Stellen unterscheidbar.
Wenn die Plattform eine peptidähnliche Struktur ist, enthält sie nicht notwendigerweise Peptidbindungen, sondern kann irgendeine Struktur mit Glycosylierungsstellen umfassen, an die Kohlenhydratstrukturen angehängt sein können. Beispielsweise kann eine Plattform eine "hybride" Plattform sein, die ein Nicht-Peptid-Polymer oder sogar eine Kette von Kohlenstoffatomen, an die natürliche Aminosäureseitenketten mit natürlichen Glycosylierungsstellen angehängt sind, umfaßt. Ein Beispiel einer Hybridplattform ist in 5 gezeigt.
Die Glycosylierungsstellen stellen Hydroxyfunktionen für die O-Glycosylierung und/oder natürliche funktionale Carboxy- oder Carboxamid-Gruppen für die N-Glycosylierung bereit. Bevorzugte Glycosylierungsstellen beinhalten eines oder mehrere von Serin, Threonin und Hydroxylysin, dessen Hydroxylgruppe O-Glycosylierungsstellen bereitstellt, oder Asparagin, dessen Aminogruppe eine N-Glycosylierungsstelle bereitstellt.
Die Glycosylierungsstellen können optisch entweder eine D- oder eine L-Konfiguration haben, obwohl es bevorzugt ist, daß die Glycosylierungsstellen optisch vollständig aus einer D-Konfiguration bestehen. Noch bevorzugter ist die Plattform vollständig aus D-Aminosäuren aufgebaut.
Die Plattform kann linear (1) oder zyklisch (2) sein, und sie kann UV-aktive oder fluoreszierende Markierungen enthalten, um die Detektion während des Vorgangs eines Screenings einer Glycopeptidbibliothek, die unter Verwendung der Plattform hergestellt wurde, zu unterstützen. Hydrophobe Aminosäuren werden vorzugsweise in die Plattform eingebracht, wie es in 6 gezeigt ist, um die Löslichkeit der Plattform in den organischen Lösungsmitteln, die verwendet werden, um die Glycosylierungsreaktionen zu fördern, zu steigern. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Glycosylierungsstellen entweder einzeln oder in Clustern zwischen Sequenzen, die hydrophobe Aminosäuren, wie Alanin, Phenylalanin, Valin, Leucin und Isoleucin, oder nicht natürliche hydrophobe Aminosäuren beinhalten, angeordnet. Lipidketten können ebenfalls in die Plattform aufgenommen werden, um die Beschichtung von Mikrotiterplatten zu unterstützen; siehe 3.
Das Peptid der Plattform kann mittels irgendeines bekannten Verfahrens isoliert oder synthetisiert werden. Das Peptid kann an den Glycosylierungs-Bindungsstellen freie Gruppen aufweisen, oder es kann teilweise blockiert sein, so daß nur bestimmte Glycosylierungsstellen zur Verfügung stehen. Die blockierenden Gruppen können während der Synthese der Plattform selektiv eingebracht werden oder sie können zu irgendeinem Zeitpunkt während einer Reihe von Glycosylierungsreaktionen auf der Plattform eingebracht werden. Die blockierenden Stellen können auch während irgendeiner Stufe des Verfahrens selektiv entfernt werden.
Kohlenhydratstrukturen werden zufällig in die Plattform eingebracht oder auf dieser angeordnet, um eine vielfältige Glycopeptidbibliothek zu erzeugen. Die Kohlenhydratstrukturen können Glycoproteine, Proteoglycane und Glycolipide, die sowohl auf normalen als auch auf malignen Zellen zu finden sind, beinhalten oder davon abgeleitet sein. Die Kohlenhydratstrukturen können vorgefertigt sein und ihre Anzahl kann beschränkt sein, um ein effizienteres Screenen der resultierenden kombinatorischen Bibliothek hinsichtlich spezifischer Zwecke zu gestatten. Die Kohlenhydratstrukturen können nicht natürlich sein, d.h. eine zufällige Kombination aus Monosacchariden, die über eine Mischung aus α- und β-Verbindungen verknüpft sind.
Die Glycosyl-(Kohlenhydrat-)Donoren werden auf Basis der Kenntnis der in einem interessierenden Glycopeptid enthaltenen Kohlenhydratkomponenten ausgewählt. Eine bevorzugte Gruppe von Kohlenhydratstrukturen beinhaltet diejenigen Strukturen, von denen bekannt ist, daß es sich um Adhäsionsliganden für Bakterienrezeptoren, die auf menschlichen Zelloberflächenantigenen exprimiert werden, handelt. Eine weitere bevorzugte Gruppe von Kohlenhydratstrukturen beinhaltet diejenigen, von denen bekannt ist, daß sie mit Antigenen gegen maligne Zellen assoziiert sind.
Beispielsweise ist mit Serin oder Threonin O-verknüpftes N-Acetylgalactosamin als Karzinom-assoziiertes Tn-Antigen bekannt, während das mit Serin oder Threonin O-verknüpfte Disaccharid βGal(1-3)αGalNAc in Mucinen allgemein als Karzinom-assoziiertes Thomsen-Friedenreich-(TF-)Antigen bekannt ist. Das Disaccharid ist auch auf der Zelloberfläche von Leukozyten der chronischen und akuten myelogenen Leukämie zu finden. Sialylierte Versionen von TF, insbesondere α2-6-TF, wurden auf den Mucinen gefunden, die von menschlichen Brustkrebszellinien exprimiert werden. Die Struktur und die Synthese der Glycosyl-Donoren der TF-Familie wird von Qiu et al., Tetrahedron Letters, 37: 595–585 (1996) beschrieben. (Der Inhalt dieses Dokuments und aller anderen hier speziell zitierten Dokumente ist durch Bezugnahme vollständig in dieser Beschreibung aufgenommen.) Beispiele von Kohlenhydratstrukturen, die auf Krebs-Mucinen gefunden wurden, sind in 7 gezeigt.
Wenn somit die gewünschten Glycopeptide Karzinom-assoziierte Mucine sind, beinhalten die Glycosyl-Donoren, die verwendet werden, um das Kernpeptid zu glycosylieren, Galactosamin, N-Acetylgalactosamin und Sialyl. Wenn eine kombinatorische Bibliothek für Glycopeptide, die andere sind als Tn- und TF-Glycopeptide, erzeugt wird, werden andere Glycosyl-Donoren eingesetzt.
Die Anzahl von Glycosyl-Donoren auf jeder Ebene beträgt typischerweise wenigstens 2 und bevorzugter wenigstens 3. Typischerweise werden auf den Ebenen oberhalb der ersten Ebene mehr Donoren verwendet als bei der Erzeugung der Bibliothek der ersten Ebene. In einigen Fällen kann es bevorzugt sein, die Größe einer Bibliothek zu beschränken, indem die Anzahl von Donoren auf jeder Ebene auf weniger als 5 beschränkt wird. Die Synthese von Glycosyl-Donoren ist auf dem Gebiet gut bekannt.
Glycosyl-Donoren können gemäß der vorliegenden Erfindung so ausgestaltet werden, daß sie nur bestimmte interessierende Kohlenhydratstrukturen liefern. In dieser Hinsicht kann ein Glycosyl-Donor mit Schutzgruppen, wie 4,6-Benzyliden, ausgestaltet werden, um die Bildung einer bestimmten Kohlenhydratstruktur zu begünstigen. Siehe z.B. Qiu et al., a.a.O., und Yule et al., Tetrahedron Letters, 36: 6839–6842 (1995), und Broddefalk et al., Tetrahedron Letters, 17: 3011–3014 (1996). Die Glycosyl-Donoren können ebenso wie die Glycosylierungssequenz auf Basis einer vorbestimmten Beurteilung der Art und der Anzahl bestehender Kohlenhydratstrukturen für ein ausgewähltes Glycopeptid ausgewählt werden.
Die Glycosyl-Donoren werden gemäß auf dem Gebiet gut bekannter Verfahren mit einem Kernpeptid umgesetzt. Siehe z.B. Qiu et al. und Yule et al., a.a.O., sowie Kunz, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 26: 294–308 (1987) und Garg et al., Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, 50: 277–310 (1994). Eine Bibliothek eines gewünschten Glycopeptids der ersten Ebene wird durch primäre Glycosylierung des Peptids mit einem einzelnen Glycosyl-Donor oder einem Gemisch von Donoren erzeugt. Die Umsetzung eines Kernpeptids mit einem Glycosyl-Donor oder einem Gemisch von Donoren resultiert in einer Bibliothek von zufällig glycosylierten Glycopeptiden. Eine Bibliothek der ersten Ebene kann in einem Screening-Verfahren verwendet werden, wie es unten beschrieben wird, oder sie kann die Grundlage für die Erzeugung von Bibliotheken höherer Ebenen bilden.
Eine Bibliothek der zweiten Ebene wird durch Umsetzen einer oder mehrerer Bibliotheken der ersten Ebene mit einem oder mehreren weiteren Glycosyl-Donoren erzeugt. Vor der weiteren Umsetzung können nicht umgesetzte Glycosylierungsstellen auf den Peptiden beispielsweise mittels Acetylierung blockiert werden, um zu verhindern, daß diese Glycoformen durch Umwandlung in andere Glycoformen aus der Bibliothek eliminiert werden. Nach der Reinigung werden die Schutzgruppen der Kohlenhydratstrukturen auf den Glycoformen selektiv entfernt, um auf den bestehenden Kohlenhydratstrukturen zusätzliche Glycosylierungsstellen zu erzeugen. Die zufällige Glycosylierung mit diesen zusätzlichen Donoren erweitert die bestehenden Kohlenhydratstrukturen zusätzlich, um dadurch komplexere Glycopeptidstrukturen zu erzeugen. Bibliotheken höherer Ebenen werden in ähnlicher Weise durch Umsetzen einer oder mehrerer Bibliotheken der zweiten oder einer höheren Ebene mit einem oder mehreren weiteren Glycosyl-Donoren erzeugt.
Die Gesamtzahl möglicher Glycoformen, die in einer kombinatorischen Bibliothek von Glycopeptiden gemäß der Erfindung enthalten sind, können anhand der folgenden Formel berechnet werden: # Glycoformen = (x + 1)n wobei x die Anzahl verwendeter Glycosyl-Donoren ist und n die Anzahl der Glycosylierungsstellen ist. Beispielsweise zeigt die nachstehende Tabelle die Anzahl von Glycoformen, die erhalten werden, wenn bis zu fünf Glycosyl-Donoren und bis zu fünf Glycosylierungsstellen verwendet werden:
Tabelle 1
Es ist möglich, die Größe und die Komplexität der Glycopeptidbibliotheken auf eine Reihe von Arten selektiv zu kontrollieren. Die Größe und die Komplexität einer zufälligen Bibliothek von Glycopeptiden sind abhängig von dem Ausmaß der Glycosylierung, welche wiederum von der Anzahl an Glycosylierungsstellen auf dem Kernpeptid und von der Anzahl an hinzugefügten Glycosyleinheiten abhängig ist. Bibliotheken mit verschiedenen Kombinationen von Glycoformen können erhalten werden, indem Bibliotheken niedrigerer Ebene vor der Glycosylierung gemischt werden, indem Donoren auf jeder Ebene gemischt werden und indem gemischte Bibliotheken niedrigerer Ebene in Kombination mit gemischten Donoren verwendet werden. Die Stellen einer weiteren Glycosylierung können kontrolliert werden, indem nicht umgesetzte Glycosylierungsstellen auf dem Peptid geschützt werden, wodurch diese Strukturen in der Bibliothek konserviert werden.
Die Glycopeptidbibliotheken können verwendet werden, um Screenings auf biologisch aktive Verbindungen durchzuführen. Durch Screenen einer Anzahl von Bibliotheken, von denen jede verschiedene Kombinationen von Kohlenhydratstrukturen auf dem Kernpeptid aufweist, ist es möglich zu identifizieren, welche Strukturen arzneimittelähnliche, kompetitiv hemmende, immunstimulatorische, antikörperähnliche und viele andere biologische Aktivitäten haben. Eine Bibliothek gemäß der vorliegenden Erfindung kann auf Verbindungen gescreent werden, die eine antibakterielle Wirkung besitzen, einschließlich Verbindungen, die die Adhäsion von Bakterien an einer Wirtszelle kompetitiv hemmen. Die Bibliothek kann auch auf Verbindungen gescreent werden, die eine antivirale Wirkung besitzen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Bibliotheken erzeugt und gescreent, um hochgradig empfindliche diagnostische Antikörper und Antigene für die Detektion und Immuntherapie von Krebs zu entwickeln.
Verfahren zum Screenen hinsichtlich biologischer Aktivitäten unter Verwendung kombinatorischer Bibliotheken sind auf dem Gebiet bekannt. Die US-Patente Nr. 5,510,240 und 5,541,061 geben Beispiele von Verfahren zum Screenen kombinatorischer Bibliotheken, doch kann gemäß der vorliegenden Erfindung jedes geeignete Verfahren zum Screenen hinsichtlich biologischer Aktivität unter Verwendung kombinatorischer Bibliotheken verwendet werden. Beispielsweise kann ein ELISA verschiedener Antikörper, die entweder Schaf-Submaxillar-Mucin (OSM) oder CA27.29 als die Festphase binden, in einem Inhibitionsformat mit Komponenten aus den Bibliotheken als Inhibitoren verwendet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Peptid von einem Krebs-assoziierten Mucin abgeleitet und ist insbesondere ein MUC1-Kernprotein. Die von einer MUC1-Tandemwiederholung abgeleitete Sequenz GVTSAPDTRPAPGSTA enthält fünf O-Glycosylierungsstellen, zwei Serine und drei Threonine, und ist ein Beispiel eines Peptids, welches gemäß der vorliegenden Erfindung glycosyliert werden kann, um eine Glycopeptidbibliothek zu erzeugen. Wenn alle möglichen Glycosylierungsstellen in einer Tandemwiederholung bei der primären Glycosylierung mit N-Acetylgalactosamin (Tn-Antigen) nur einmal verwendet werden, gehen daraus fünf verschiedene monoglycosylierte Tandemwiederholungen hervor, wenn jedoch die Glycosylierung zwischen 0 und 5 Stellen zufällig verteilt ist, gibt es 32 verschiedene Kombinationen von glycosylierten Tandemwiederholungen. Wenn dann 0 bis 5 Sialinsäuren an der 6-Position der bestehenden N-Acetylgalactosamine zufällig hinzugefügt werden, erhöht sich die mögliche Anzahl von Glycoformen auf 243. Diese enthalten nur Kombinationen und variierende Anzahlen von Tn und STn. Wenn bei jeder Glycosylierung ein anderer Donor hinzugefügt wird, z.B. TF bei der ersten und GlcNAc bei der zweiten, wird eine Gesamtzahl von 16807 Glycosylierungsvarianten der MUC1-Tandemwiederholung erzeugt. Diese Bibliothek macht mehr als 90% aller abgestumpften Versionen (Kernstrukturen) aus, die mit MUC1-Krebs-Mucin assoziiert sein können. Diese sind als Impfstoffkomponenten geeignet.
Ein einfacheres Tetrapeptid, GSTA, hat nur zwei O-Glycosylierungsstellen und ist geeignet, um das Verfahren gemäß der Erfindung zu veranschaulichen, wie es in den nachfolgenden Beispielen gezeigt ist. Die Schutzgruppen auf den Glycosyl-Donoren und die Abfolge von Glycosylierungsreaktionen sind so ausgestaltet, daß sie nur die bestehenden Kohlenhydratstrukturen liefern, die in der Mucin-Biosynthese möglich sind. Die "Regeln", nach denen sich die Glycosyltransferasen beim Erzeugen von Kohlenhydratstrukturen auf Mucinen richten, sind in Tabelle 2 gezeigt, wobei GalNAc N-Acetylgalactosamin ist, GlcNAc N-Acetylglucosamin ist und Gal Galactose ist. Sialinsäure ist ein anderer Name für N-Acetylneuraminsäure. Es sei angemerkt, daß die Glycosyl-Donoren auf Basis von N-Acetylgalactosamin nur Alpha-Bindungen mit den Hydroxylen von Serin und Threonin bilden.
Die Bibliothek von GSTA-Glycopeptiden, die nach natürlich vorkommenden Mucinen modelliert wurde, ist ausreichend klein, so daß die Komponenten mittels Massenspektrometrie charaktensiert werden können. Sie ist daher sehr nützlich beim Gewinnen eines präzisen Verständnisses von Glycosylierungsmustern des MUC1-Kernproteins, welches notwendig ist, um wirksame therapeutische Impfstoffe und diagnostische Werkzeuge zu gestalten.
Tabelle 2
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erzeugung einer Bibliothek von GSTA-Glycopeptiden gemäß der vorliegenden Erfindung, beschränken jedoch in keiner Weise den Schutzumfang der Erfindung. Weitere Aspekte und Variationen der Erfindung auf Basis der obigen Beschreibung und der nachfolgenden Beispiele liegen für Durchschnittsfachleute auf dem Gebiet auf der Hand.
BEISPIELE
Beispiel 1: Synthese von geschützten Peptiden von GSTA
GSTA ist ein vier Aminosäuren umfassender Rest von MUC1 mit zwei einmalig vorhandenen Stellen für die Glycosylierung, dem Serinrest (S) und dem Threoninrest (T). Er wird manuell in Lösung mit N-terminalem Fmoc und C-terminalem Benzyl synthetisiert, wobei die Hydroxyle von Serin und Threonin frei sind.
Die Glycosyl-Donoren N-Acetylgalactosamin (Tn-Antigen) und βGal(1-3)αGalNAc (Karzinomassoziiertes Thomsen-Friedenreich- oder TF-Antigen) werden mit 4,6-Benzylidenyl-Schutzgruppen geschützt. Die Synthese geschützter Peptide von GSTA ist in Reaktionsschema I gezeigt.
Herstellung von Verbindung 1
Ein Gemisch von L-Alanin, 20 g, 0,22 mol, und Toluen-4-sulfonsäure, 53 g, 0,28 mol, in 100 ml Benzylalkohol und 150 ml Benzol wurden unter Verwendung einer Dean-Stark-Vorrichtung über Nacht rückflußgekocht. Das Benzol wurde unter Vakuum entfernt, und 250 ml Ether wurden zugegeben unter Erhalt von Verbindung 1, einem Feststoff, 75 g, 78%. [α]D –5,2 (c 0,25, MeOH). ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃), δ = 8,25 (m, 3 H, TSOH, 2 NH₂), 7,00–7,70 (m, 9 H, Ar-H), 5,08, 4,98 (2 d, 2 H, J = 12,5 Hz, CH₂), 4,05 (dd, 1 H, J = 7,5, 15,0 Hz, Ala-(x-H), 2,30 (s, 3 H, PhCH₃), 1,43 (d, 3 H, J = 7,0 Hz, CH₃).
Herstellung von Verbindung 3
Zu einer Lösung von N-Boc-L-Threonin 2, 10 g, 45,6 mmol, in 80 ml trockenem THF wurden 3,5 ml N-Methylmorpholin und 4,5 ml i-Butylchlorformiat bei –20°C unter Stickstoff zugegeben. Nach Rühren bei –20°C für 5 Min. wurde eine Lösung aus Verbindung 1, 15 g, 57 mmol, und 3,5 ml N-Methylmorpholin in 40 ml trockenem THF und 5 ml trockenem DMF zugegeben. Nach Rühren bei –20°C für 30 Min. wurden 10 ml Methanol zugegeben, und das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde mittels einer Silicagelsäule unter Verwendung von Ethylacetat/Hexan (1:1) gereinigt unter Erhalt von Verbindung 3, einem weißen Pulver, nach Gefriertrocknen aus Dioxan, 12,5 g, 71%. [α]D –39,2 (c 0,25, MeOH). ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃), δ = 7,30–7,50 (m, 5 H, Ar-H), 7,10 (d, 1 H, J = 7,0 Hz, NH), 5,56 (d, 1 H, J = 8,0 Hz, NH), 5,20, 5,14 (2 d, 2 H, J = 12,0 Hz, CH₂Ph), 4,60 (m, 1 H, Ala-α-H), 4,30 (m, 1 H, Thr-β-H), 4,14 (dd, 1 H, J = 2,0, 7,5 Hz, Thr-(x-H), 3,46 (m, 1 H, ON), 1,45 (s, 9 H, 3 CH₃), 1,41 (d, 3 H, J = 7,5 Hz, CH₃), 1,18 (d, 3 H, J = 6,5 Hz, CH₃).
Herstellung von Verbindung 4
Eine Lösung von Verbindung 3, 8,7 g, in 50 ml Ameisensäure wurde bei Raumtemperatur für 5 Stunden gerührt. Die Ameisensäure wurde unter Vakuum entfernt, und Ethylacetat wurde zu dem Rückstand zugegeben unter Erhalt von Verbindung 4, einem Feststoff, 5,3 g, 71%. [α]D –66,8 (c 0,25, MeOH). ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃ + CD₃OD), δ = 8,42 (s, 1 H, HCOOH), 7,30–7,50 (m, 5 H, Ar-H), 7,10 (d, 1 H, J = 7,0 Hz, NH), 5,56 (d, 1 H, J = 8,0 Hz, NH), 5,17, 5,09 (2 d, 2 H, J = 12,0 Hz, CH₂Ph), 4,50 (dd, 1 H, J = 7,5, 15,0 Hz, Ala-(α-H), 3,89 (m, 1 H, Thr-α-H), 3,48 (d, 1 H, J = 7,5 Hz, Thr-(X-H), 1,41 (d, 3 H, J = 7,5 Hz, CH₃), 1,23 (d, 3 H, J = 6,5 Hz, CH₃), ES-MS. Ber. für C₁₄H₂₀O₄N₂, 280,3. Gefunden, 279,4.
Herstellung von Verbindung 5
Eine Lösung von N-Fmoc-L-Glycin, 100 g, 0,336 mol, und DCC, 139 g, 0,67 mol, in 1000 ml trockenem Ethylacetat wurde bei 5°C für 15 Min. gerührt. Eine Lösung von N-Hydroxysuccinimid, 138,8 g, 0,67 mol, in 1000 ml trockenem Ethylacetat wurde zugegeben. Nach Rühren bei 5°C für 2 Stunden wurde der Feststoff filtriert und mit Ethylacetat (3 × 50 ml) gewaschen. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde mittels Kristallisation aus Hexan und Ethylacetat gereinigt unter Erhalt von Verbindung 5, einem Feststoff, 83,2 g, 63%. [α]D +6,0 (c 0,25, MeOH). ¹H- NMR (300 MHz, CDCl₃), δ = 7,30–7,80 (m, 8 H, Ar-N), 5,42 (t, 1 H, J = 5,5 Hz, NH), 4,43 (d, 2 H, J = 7,0 Hz, CH₂ auf Fmoc), 4,37 (d, 2 H, J = 6,0 Hz, Ala-(α-H), 4,23 (t, 1 H, J = 7,0 Hz, CH auf Fmoc), 2,84 (s, 4 H, 2 CH₂).
Herstellung von Verbindung 7
Zu einer Lösung von L-Serin, 20 g, 0,18 mol, und Natriumbicarbonat, 16 g, in 150 ml Wasser wurde Verbindung 5,56 g, 0,142 mol, in 600 ml DME tropfenweise zugegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. DME wurde unter Vakuum entfernt, und 5%-ige wäßrige HCl wurde zugegeben, um einen pH-Wert = 2 einzustellen. Die Wasserlösung wurde mit Ethylacetat (3 × 200 ml) extrahiert. Die organische Schicht wurde mit Wasser gewaschen und über Na₂SO₄ getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde mittels einer Silicagelsäule unter Verwendung von Ethylacetat/Essigsäure (9:1) gereinigt unter Erhalt von Verbindung 7, einem weißen Pulver, nach Gefriertrocknen aus Dioxan, 35 g, 62%. [α]D +9,6 (c 0,50, MeOH). ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃ + CD₃OD), δ = 7,30–7,80 (m, 8 H, Ar-H), 4,61 (t, 1 H, J = 4,0 Hz, Ser-α-H), 4,45 (d, 2 H, J = 7,0 Hz, CH₂ auf Fmoc), 4,30 (t, 1 H, J = 7,0 Hz, CH auf Fmoc), 4,03 (dd, 1 H, J = 4,0, 11,5 Hz, Ser-α-N), 3,90–4,08 (m, 3 H). ES-MS: Ber. für C₂₀H₂₀O₇N₂, 384,3, Gefunden, 384,3.
Herstellung von Verbindung 8
Zu einer Lösung von Verbindung 7, 1,7 g, 4,25 mmol, in 20 ml trockenem THF wurden 0,44 ml N-Methylmorpholin und 0,52 ml i-Butylchlorformiat bei –20°C unter Stickstoff zugegeben. Nach Rühren bei –20°C für 5 Min. wurde eine Lösung von Verbindung 3, 1,12 g, 4 mmol, und 0,44 ml N-Methylmorpholin in 10 ml trockenem THF und 5 ml trockenem DMF in 5 Min. tropfenweise zugegeben. Nach Rühren bei –20°C für 30 Min. wurden 5 ml Methanol zugegeben, und das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde mittels einer Silicagelsäule unter Verwendung von Hexan/Ethylacetat/Methanol (10:10:1) gereinigt unter Erhalt von Verbindung 8, einem weißen Pulver, nach Gefriertrocknen aus Dioxan, 1,7 g, 66%. [α]D –36,5 (c 0,2, MeOH:CHCl₃ = 4:1). ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃ + CD₃OD), δ = 7,30–7,80 (m, 13 H, Ar-H), 4,99, 5,05 (2 d, 2 H, J = 12,5 Hz, CH₂Ph), 4,34–4,45 (m, 2 H), 4,24–4,32 (m, 3 H), 4,08–4,20 (m, 2 H), 3,78–3,85 (m, 2 H), 3,75 (d, 2 H, 7,0 Hz, CH₂), 3,53–3,62 (m, 1 H), 1,28 (d, 3 H, J = 7,0 Hz, CH₃), 1,06 (d, 3 H, J = 6,0 Hz, CH₃). ES-MS. Ber. für C₄₄H₃₇O₉N₄, 645,67. Gefunden, 646,0 (M+H), 669,3 (M+Na).
Beispiel 2: Synthese von Donoren für die Bibliothek der ersten Ebene
Die Synthese von Donoren für die erste Ebene der Bibliothek ist in Reaktionsschema II zusammengefaßt.
Herstellung von Verbindung 9
Ein Gemisch aus N-Acetyl-D-galactosamin, 20 g, 90,4 mmol, 20 ml Benzaldehyddimethylacetal und 200 mg p-Toluensulfonsäure in 500 ml trockenem Acetonitril wurde bei 60°C für 5 Stunden gerührt. Nach Kühlen auf Raumtemperatur wurde der Feststoff filtriert, mit CH₂Cl₂ (3 × 20 ml) gewaschen und unter Vakuum getrocknet unter Erhalt von Verbindung 9, einem Feststoff, 22 g, 88%. [α]D +133,0 (c 1,0, H₂O). ¹H-NMR (DMSO-d6): δ = 7,35–7,71 (m, Ar-H), 5,62 (s, 1 H, CHPH), 5,12 (d, 1 H, J = 3,0 Hz, H-1), 4,21 (bd, 1 H, J = 3,5 Hz, H-4), 4,12 (dd, 1 H, J = 3,5, 11,0 Hz, H-2), 4,06 (m, 2 H, H-6), 3,92 (m, 1 H, H-3), 3,85 (m, 1 H, H-5), 1,90 (s, 3 H, NAc). ¹³C-NMR: δ = 99,7 (CHPh), 91,4 (C-1).
Herstellung von Verbindung 10
Zu einer Lösung von Verbindung 9, 20 g, 64,7 mmol, in 150 ml trockenem Pyridin wurden 8,9 ml Benzoylchlorid in 40 ml CH₂Cl₂ bei –25°C unter Argon in 30 Min. tropfenweise zugegeben und für 2 Stunden gerührt. Nach der Zugabe von 5 ml Ethanol wurde das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt. Die wäßrige Aufarbeitung (CH₂Cl₂) und Umkristallisation aus Ethylacetat ergaben Verbindung 10, einen Feststoff, 16 g, 62%. [α]D +182,0 (c 1, MeOH). ¹H-NMR: δ = 7,30–8,10 (m, Ar-H), 6,05 (s, 1 H, NH), 4,00–5,40 (m), 1,88 (s, 3 H, NAc).
Herstellung von Verbindung 11
Zu einer Lösung von Verbindung 10, 10 g, 24,9 mmol, in 100 ml trockenem CH₂Cl₂ wurden 7 ml Trichloracetonitril und 0,5 ml DBU zugegeben. Die Lösung wurde für 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, und das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde mittels einer Silicagelsäule unter Verwendung von Hexan/Ethylacetat (1:1) gereinigt unter Erhalt von Verbindung 11, einem weißen Pulver, nach Gefriertrocknen aus Benzol, 11,5 g, 85%. [α]D +151,0 (c 1,0, CHCl₃). ¹H-NMR: δ = 8,85 (s, 1 H, NH), 7,40–8,10 (m, Ar-N), 6,75 (d, 1 H, J = 3,5 Hz, H-1), 5,65 (d, 1 H, J = 9,0 Hz, NH), 5,60 (s, 1 H, CHPH), 5,50 (dd, 1 H, J = 3,5 Hz, H-3), 4,00–5,15 (m, 1,90 (s, 3 H, NAc).
Herstellung von Verbindung 12
Zu einer Lösung von N-Acetylgalactosamin, 50 g, 0,226 mol, in 100 ml trockenem Allylalkohol wurden 10 N NCl in 50 ml THF tropfenweise zugegeben. Nach Rühren bei 50°C über Nacht wurde das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde durch Umkristallisation aus Ethanol gereinigt unter Erhalt von Verbindung 12, einem Feststoff, 35 g, 59%. [α]D +165,00 (c 1,0, H₂O). ¹H-NMR (D₂0): δ = 6,00 (m, 1 H, CH=), 5,30 (m, 2 H, =CH₂), 4,95 (d, 1 H, J = 3,5 Hz, H-1), 3,70–4,30 (m), 2,01 (s, 3 H, NAc).
Herstellung von Verbindung 13
Ein Gemisch aus Verbindung 12, 35 g, 0,134 mol, 62 ml Benzaldehyddimethylacetal und 350 mg p-Toluensulfonsäure in 600 ml trockenem Acetonitril wurde bei 60°C für 4 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde durch Umkristallisation aus Ethanol gereinigt unter Erhalt von Verbindung 13, einem Feststoff, 29, g, 62%. [α]D +155,0 (c 1,0, MeOH). ¹H-NMR: δ = 7,30–7,60 (m, Ar-N), 5,80 (m, 1 H, CH=), 5,57 (s, 1 H, CHPh), 5,26 (m, 2 H, =CH₂), 5,00 (d, 1 H, J = 3,5 Hz, H-1), 3,70–4,55 (m), 2,90 (d, 1 H, J = 10,0 Hz, OH), 2,04 (s, 3 H, NAc).
Herstellung von Verbindung 14
Eine Lösung von Verbindung 13, 20 g, 57,3 mmol, 40 g Tetra-O-Acetylbrom-(α-D-galactopyranosid) und Hg(CN)₂, 24 g, in 50 ml trockenem Benzol/50 ml trockenem Nitromethan wurden bei 50°C über Nacht unter Argon gerührt. Tetra-O-Acetylbrom-(α-D-galactopyranosid) (25 g) und Hg(CN)₂ (15 g) wurden zugegeben, und das Rühren wurde für 4 Stunden fortgesetzt. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde in 1000 ml CH₂Cl₂ gelöst, mit gesättigtem Na₂CO₃, 30% KBr und Wasser gewaschen und dann über Na₂SO₄ getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde mittels einer Silicagelsäule (1:1 bis 1:4 Hexan/Ethylacetat) gereinigt unter Erhalt von Verbindung 14, einem weißen Pulver, nach Gefriertrocknen aus Dioxan, 25 g, 64%. [α]D +96,00 (c 2,0, MeOH). ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃): δ = 7,40–7,70 (m, Ar-N), 5,88 (m, 1 H, CH=), 5,65 (d, 1 H, J = 9,5 Hz, NH), 5,55 (s, 1 H, CHPH), 5,35 (m, 1 H, H-4b), 5,25 (m, 3 H), 5,03 (d, 1 H, J = 3,5 Hz, H-1a), 4,96 (dd, 1 H, J = 3,5, 10,0 Hz, H-3b), 4,75 (d, 1 H, J = 7,5 Hz, H-1b), 3,6–4,70 (m), 2,14, 2,04, 1,98, 1,96 (4 s, 15 H, 5 Ac).
Herstellung von Verbindung 15
Durch eine Lösung von Verbindung 14, 23 g, 33 mmol, und [bis-(Methyldiphenylphosphin)-1-(1,5-cyclooctadien)-iridium(1)-hexafluorphosphat, 500 mg, in 500 ml trockenem THF ließ man für 15 Min. Argon und für 5 Min. Wasserstoff hindurchperlen. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur für 4 Stunden gerührt. 15 g I₂, 800 mg Dimethylaminopyridin, 10 ml Pyridin und 80 ml Wasser wurden zugegeben, und die Lösung wurde bei Rautemperatur über Nacht gerührt. Natriumsulfat (5%, 200 ml) wurde zugegeben, und THF wurde unter Vakuum entfernt. Die wäßrige Aufarbeitung (CH₂Cl₂) und Reinigung mittels Silicagel (5:10:2 Hexan/Ethylacetat/Methanol) ergaben Verbindung 15, ein weißes Pulver, nach Gefriertrocknen aus Dioxan, 12,5 g, 58%. [α]D +55,6 (c 1,0, MeOH). ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃): δ = 7,35–7,60 (m, Ar-H), 6,50 (d, 1 H, J = 9,0 Hz, NH), 5,45 (s, 1 H, CHPh), 5,33 (d, 1 H, J = 3,5 Hz, H-1a), 5,15 (m, 2 H, H-2b & N-4b), 4,96 (2 d, 1 H, J = 3,5, 10,5 Hz, H3b), 4,68 (d, 1 H, J = 8,0 Hz, H-1b), 3,60–4,50 (m), 2,11, 2,02, 2,00, 1,96, 1,94 (5 s, 15 H, 5 Ac).
Herstellung von Verbindung 16
Zu einer Lösung von Verbindung 15, 7,5 g, 11,5 mmol, in 100 ml trockenem CH₂Cl₂ wurden 2,6 ml Trichloracetonitril und 0,25 ml DBU zugegeben. Die Lösung wurde für 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, und das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde mittels einer Silicagelsäule unter Verwendung von Hexan/Ethylacetat (1:2) gereinigt unter Erhalt von Verbindung 16, einem weißen Pulver, nach Gefriertrocknen aus Benzol, 5,6 g, 61%. [α]D +81,2 (c 1,0, CH₂Cl₂). ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃): δ = 8,75 (s, 1 H, NH), 7,35–7,60 (m, Ar-H), 6,62 (d, 1 H, J = 3,5 Hz, H-1a), 5,80 (d, 1 H, J = 8,0 Hz, NH), 5,52 (s, 1 H, CHPh), 5,40 (2 d, 1 H, J = 1,0, 3,5 Hz, H-4b), 5,25 (dd, 1 H, J = 8,0, 10,0 Hz, H-2b), 5,01 (dd, 1 H, J = 3,5, 10,5 Hz, H-2a), 4,90 (d, 1 H, J = 8,0 Hz, H-1b), 3,80–4,80 (m), 2,15, 2,04, 2,02, 2,00, 1,96 (5 s, 15 H, 5 Ac).
Beispiel 3: Synthese von Donoren für die Bibliothek der zweiten Ebene
Die Synthese von Donoren für die zweite Ebene der Bibliothek ist in Reaktionsschema III zusammengefaßt.
Herstellung von Verbindung 17

K. Fufase et al., Tetrahedron Lett., 36: 7455–7458.

Zu einer Lösung von D-Glucosaminhydrochlorid, 34 g, in 1 l Wasser wurde Trichlorethylchlorformiat, 33 ml, über 2–3 Stunden bei 0°C tropfenweise zugegeben. Nach Rühren bei Raumtemperatur über Nacht wurde der Feststoff herausfiltriert und mit Wasser und dann mit Ether gewaschen. Der Feststoff wurde aus Ethanol umkristallisiert unter Erhalt von N-troc-D-Glucosamin, 59,5 g, 98%. Eine Lösung von N-troc-D-Glucosamin, 13,5 g, 38,2 mmol in 100 ml Allylalkohol mit 5%-iger HCl wurde bei 100°C für 30 Min. gerührt. Nach Kühlen auf Raumtemperatur wurde der Allylalkohol unter Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde in 250 ml Acetonitril gelöst. 12 ml PhCH(OMe)₂ und 100 mg TSOH wurden zugegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht unter Argon gerührt. 10 g Na₂CO₃ wurden zugegeben, und das Gemisch wurde für 10 Min. gerührt. Der Feststoff wurde entfernt und mit Aceton (5 × 5 ml) gewaschen. Das Lösungsmittel wurde entfernt, und der Feststoff wurde mittels Kristallisation aus Ethanol gereinigt unter Erhalt von Verbindung 17, einem Feststoff, 12 g, 65%. ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃). δ = 7,30–7,60 (m, 5 H, Ar-H), 5,80–6,00 (m, 1 H, CH=), 5,55 (s, 1 H, CHPh), 5,20–5,40 (m, 2 H, =CH₂), 4,92 (d, 1 H, J = 3,0 Hz, H-1), 4,82, 4,69 (2 d, 2 H, J = 12,0 Hz, CH₂), 3,70–4,30 (m), 3,59 (t, 1 H, J = 8,0 Hz, H-4), 2,67 (d, 1 H, J = 2,0 Hz, OH).
Herstellung von Verbindung 18
Eine Lösung von Verbindung 17, 8 g, 16,6 mmol, in 20 ml Pyridin und 10 ml Essigsäureanhydrid wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Das Lösungsmittel wurde entfernt, und der Rückstand wurde mittels Kristallisation aus Ethanol gereinigt unter Erhalt von Verbindung 18, einem Feststoff, 4,7 g, 54%. [α]D +58,5 (c 1, Ethylacetat). ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃): δ = 7,30–7,50 (m, 5 H, Ar-N), 5,80-6,00 (m, 1 H, CH=), 5,53 (s, 1 H, CHPH), 5,38 (t, 1 H, J = 10 Hz, H-3), 5,20–5,35 (m, 2 H, =CH₂), 4,93 (d, 1 H, J = 3,5 Hz, H-1), 4,79, 4,68 (2 d, 2 H, J = 12,0 Hz, CH₂), 3,65–4,35 (m), 2,10 (s, 3 H, CH₃).
Herstellung von Verbindung 19
Zu einer Lösung von Verbindung 18, 9,1 g, 17,4 mmol, in 300 ml THF wurde [bis(Methyldiphenylphosphin)]-(1,5-cyclooctadien)-iridium(1)-hexafluorphosphat, 350 mg, zugegeben. Der Lösung wurde Argon für 10 Min., gefolgt von Wasserstoff für 20 Min. zugeführt. Die Lösung wurde gestoppt und bei Raumtemperatur für 4 Stunden gerührt. 500 mg DMAP, 6,25 ml Pyridin, 50 ml Wasser und 9,35 g I₂ wurden zugegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. THF wurde entfernt, und das Gemisch wurde in 1 l CH₂Cl₂ gelöst. Die Lösung wurde mit gesättigtem Natriumcarbonat, 1 N HCl und Wasser gewaschen und über Na₂SO₄ getrocknet. Das Lösungsmittel wurde entfernt, und der Rückstand wurde mittels einer Silicagelsäule unter Verwen dung von Hexan/Ethylacetat = 7:3 gereinigt unter Erhalt von Verbindung 19, einem weißen Pulver, nach Gefriertrocknen aus Dioxan, 5,5 g, 65%. [α]D +60,0 (c 1, Ethylacetat). ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃): δ = 7,30–7,50 (m, 5 H, Ar-H), 5,53 (s, 1 H, CHPh), 5,52 (d, 1 H, J = 10,0 Hz, NH), 5,43 (t, 1 H, J = 10 Hz, H-3), 5,33 (d, 1 H, J = 3,5 Hz, H-1), 4,81, 4,66 (2 d, 2 H, J = 12,0 Hz, CH₂), 3,65–4,35 (m), 3,17 (dd, 1 H, J = 1,0, 3,5 Hz, OH), 2,06 (s, 3 H, CH₃).
Herstellung von Verbindung 20
Eine Lösung von Verbindung 19, 5,5 g, 11 mmol, 2,42 ml Trichloracetonitril und 6 Tropfen DBU in 70 ml CH₂Cl₂ wurde bei Raumtemperatur für 2 Stunden unter Argon gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde mittels einer Silicagelsäule unter Verwendung von Hexan/Ethylacetat (7:3) gereinigt unter Erhalt von Verbindung 20, einem weißen Pulver, nach Gefriertrocknen aus Benzol, 5,59 g, 81%. [α]D +59,0 (c 1, Ethylacetat). ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃): δ = 8,80 (s, 1 H, NH), 7,30–7,50 (m, 5 H, Ar-H), 6,40 (d, 1 H, J = 3,5 Hz, H-1), 5,56 (s, 1 H, CHPh), 5,46 (t, 1 H, J = 10 Hz, H-3), 5,36 (d, 1 H, J = 9,0 Hz, NH), 4,71 (dd, 2 H, J = 12,0 Hz, CH₂), 4,35 (dd, 1 H, J = 5,0, 10,0 Hz, H-4), 4,27 (m, 1 H, H-2), 3,75–4,00 (m), 2,11 (s, 3 H, CH₃).
Herstellung von Verbindung 21

G. Grundler und R.R. Schmidt, Liebigs Ann. Chem., 1984, 1826–1847.

Zu einer Lösung von 2,0 ml HClO₄ (70%) in 300 ml Essigsäureanhydrid wurde Lactose, 100 g, 0,29 mol, portionsweise zugegeben, um die Temperatur zwischen 30 und 35°C zu halten. Nach der Zugabe von 15 g rotem Phosphor wurde das Gemisch in einem Eis-Salzbad gekühlt, und 90 g (29 ml) Br₂ wurden tropfenweise zugegeben, um die Temperatur unterhalb von 20°C zu halten. 15 ml Wasser wurden in 15 Min. zugegeben. Der Feststoff wurde herausfiltriert und mit Essigsäure gewaschen. Das Gemisch wurde zu einer Lösung von 100 g Zink und 11 g CuSO₄ in 290 ml Wasser und 200 ml Essigsäure in 2 Stunden bei –20°C zugegeben. Das Gemisch wurde bei –20°C für 2 Stunden gerührt, und der Feststoff wurde herausfiltriert und mit Essigsäure gewaschen. Der Feststoff wurde entfernt, und der Rückstand wurde mittels einer Silicagelsäule unter Verwendung von Hexan/Ethylacetat (1:1) gereinigt unter Erhalt von Verbindung 21, einem weißen Pulver, nach Gefriertrocknen aus Benzol, 100 g, 62%. ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃): δ = 6,32 (dd, 1 H, J = 2,0, 6,5 Hz, =CH), 5,32 (m, 1 H, =CH), 5,27 (dd, 1 H, J = 1,0, 3,5 Hz, H-4'), 5,09 (dd, 1 H, J = 8,0, 11,0 Hz, H-2'), 4,92 (dd, 1 H, J = 3,5, 10,5 Hz, H-3'), 4,74 (dd, 1 H, J = 3,5, 6,0 Hz, H-3), 4,60 (d, 1 H, J = 8,0 Hz, H1'), 3,80–4,40 (m), 2,07, 2,03, 2,00, 1,97, 1,96, 1,89 (6 s, 18 H, 6 Ac).
Herstellung von Verbindung 22

G. Grundler und R.R. Schmidt, Liebigs Ann. Chem., 1984, 1826–1847.

Zu einer Lösung von Verbindung 21, 100 g, 0,179 mol, und 300 g Cerammoniumnitrit (CAN) wurden 20 g Natriumazid bei –20°C unter Stickstoff zugegeben. Nach Rühren bei –20°C für 6 Stunden wurde 1 l Wasser zugegeben, und das Gemisch wurde mit Ether (5 × 500 ml) extrahiert. Der Ether wurde mit Wasser gewaschen und verdampft. Der Rückstand wurde in 1 l Dioxan gelöst, und 100 g Na₂NO₂ in 30 ml Wasser wurden zugegeben. Das Gemisch wurde bei 80°C für 6 Stunden gerührt. 500 ml Wasser wurden zugegeben, und das Gemisch wurde mit CH₂Cl₂ (5 × 400 ml) extrahiert. Die Lösung wurde mit Wasser gewaschen und über Na₂SO₄ getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde mittels einer Silicagelsäule unter Verwendung von Hexan/Ethylacetat (1:1 bis 1:2) als Elutionsmittel gereinigt unter Erhalt von Verbindung 22, einem weißen Pulver, nach Gefriertrocknen aus Benzol als ein Gemisch aus α,β-Isomeren.
Herstellung von Verbindung 23

G. Grundler und R.R. Schmidt, Liebigs Ann. Chem., 1984, 1826–1847.

Zu einer Lösung von Verbindung 22, 20 g, 32,4 mmol, in 300 ml CH₂Cl₂ wurden 8 ml Cl₃CCN und 1,7 ml DBU zugegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 3 Stunden unter Argon gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde mittels einer Silicagelsäule unter Verwendung von Hexan/Ethylacetat in einem Verhältnis von 1:1 bis 2:3 gereinigt unter Erhalt von Verbindung 23, einem weißen Pulver, nach Gefriertrocknen aus Benzol, 11,5 g, 47%. ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃): δ = 8,80 (s, 1 H, NH), 6,44 (d, 1 H, J = 3,5 Hz, H-1), 5,51 (dd, 1 H, J = 9,0, 10,5 Hz, H-3), 5,36 (dd, 1 H, J = 1,0, 3,0 Hz, H-4'), 5,13 (dd, 1 H, J = 8,0, 10,0 Hz, H-2'), 4,96 (dd, 1 H, J = 3,5, 10,5 Hz, H-3'), 4,51 (d, 1 H, J = 7,5 Hz, H-1'), 3,70–4,50 (m), 3,62 (dd, 1 H, J = 3,5, 10,5 Hz, H-2), 1,90–2,20 (6 s, 18 H, 6 Ac).
Herstellung von Verbindung 24

T.J. Martin und R.R. Schmidt, Tetrahedron Lett., 36: 7455–7458.

Eine Lösung von Sialinsäure, 10 g, und IR120+ Harz, 4 g, in 1000 ml trockenem Methanol wurde bei Raumtemperatur über Nacht unter Argon gerührt. Das Harz wurde herausfiltriert und mit Methanol gewaschen. Das Lösungsmittel wurde unter Erhalt von Verbindung 24, einem Feststoff, 10,65 g, 100%, entfernt.
Herstellung von Verbindung 25

T.J. Martin und R.R. Schmidt, Tetrahedron Lett., 36: 7455–7458.

Zu einer Lösung von 20 ml Essigsäureanhydrid wurde 0,1 ml HClO₄ zugegeben. Verbindung 24, 10,65 g, wurde portionsweise zu dem Gemisch zugegeben, um die Temperatur zwischen 30 und 35°C zu halten. Nach Beendigung der Zugabe wurde das Gemisch bei Raumtemperatur für 3 Stunden gerührt. Die Lösung wurde in Eiswasser gegossen und über Nacht bei Raumtemperatur gehalten. Die Lösung wurde mit Chloroform (3 × 100 ml) extrahiert und mit gesättigtem NaHCO₃ und Wasser gewaschen und über Na₂SO₄ getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde mittels einer Silicagelsäule unter Verwendung von Hexan/Ethylacetat/Methanol (5:20:1) gereinigt unter Erhalt von Verbindung 25, einem weißen Pulver, nach Gefriertrocknen aus Dioxan als ein Gemisch aus α,p-Isomeren, 6 g, 76%. ¹H-NMR des Hauptisomers (300 MHz, CDCl₃): δ = 6,15 (d, 1 H, J = 10,0 Hz, NH), 5,39 (dd, 1 H, J = 2,0, 4,5 Hz, H-7), 5,23 (m, 1 H, H-8), 5,16 (t, 1 H, J = 9,0 Hz, H-4), 4,97 (s, 1 H, OH), 4,60 (dd, 1 H, J = 2,0, 10,0 Hz, H-9a), 4,18 (t, 1 H, J = 10,0 Hz, H-5), 4,03 (dd, 1 H, J = 8,0, 11,5 Hz, H-9b), 3,85 (s, 3 H, CH₃), 2,22 (d, 1 H, J = 7,0 Hz, H-3e), 2,15, 2,07, 2,02, 2,01, 1,90 (5 s, 15 H, 5 Ac), 2,02 (m, 1 H, H-3a).
Herstellung von Verbindung 26

T.J. Martin und R.R. Schmidt, Tetrahedron Lett., 36: 7455–7458.

Zu einer Lösung von Verbindung 25, 7,2 g, 14,4 mmol, in 150 ml trockenem Acetonitril wurden 6 ml EtNi-Pr₂ und 4,5 ml Phosphorchloriddiethylester zugegeben. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur für 10 Min. gerührt, und das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde mittels einer Silicagelsäule unter Verwendung von Hexan/Aceton 1:1 gereinigt unter Erhalt von Verbindung 26, einem Sirup, als ein Gemisch aus α,β-Isomeren, 8,5 g, 97%. ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃): δ = 2,80 (dd, 0,33 H, H-2eβ), 2,50 (dd, 0,67 H, H-2eα).
Beispiel 4: Erzeugung einer Bibliothek der ersten Ebene
GSTA wird unter Erhalt von Bibliotheken der ersten Ebene mit jeweils vier Glycoformen separat mit den geschützten Tn- und TF-Donoren glycosyliert:

1. Tn: 00, Tn0, 0Tn, TnTn,
2. TF: 00, TF0, 0TF, TFTF,

GSTA wird auch mit Tn und TF im Gemisch umgesetzt. Das Ergebnis ist eine Bibliothek der ersten Ebene, die neun Glycoformen enthält:

3. Tn + TF: 00, Tn0, 0Tn, TnTn, TF0, 0TF, TFTF, TnTF, TFTn

Wie zu erkennen ist, unterscheiden sich die Bibliotheken 1, 2 und 3 der ersten Ebene hinsichtlich ihrer Zusammensetzung und/oder Größe. Bibliothek 3, die mit gemischten Tn- und TF-Glycosyl-Donoren gebildet wurde, enthält alle Glycoformen, die in den Bibliotheken 1 und 2 vorkommen, welche gebildet werden, wenn Tn und TF separat als Glycosyl-Donoren verwendet werden, zusätzlich zu anderen Komponenten, die sich aus der Verwendung gemischter Donoren ergeben. Eine Bibliothek, die mit einem Gemisch der beiden Donoren gebildet wurde, ist daher umfangreicher als eine Bibliothek, die durch Kombinieren zweier Bibliotheken, die erzeugt werden, wenn die beiden Donoren separat mit dem Kernpeptid umgesetzt werden, gebildet wurde. Die Erzeugung einer Bibliothek der ersten Ebene ist in Reaktionsschema IV zusammengefaßt.
Herstellung von Verbindung 27
Eine Lösung von Verbindung 8, 0,6 g, 0,925 mmol, Verbindung 11, 2 g, 3,73 mmol, Verbindung 16, 2,45 g, 3,088 mmol, und 3,5 g 3Å-Molekularsieben in 20 ml trockenem THF wurde bei Raumtemperatur für 10 Min. unter Argon gerührt und auf –20°C gekühlt. Zehn ml 0,1 mol BF₃EtO₂ in trockenem THF wurden in 5 Min. zugegeben. Nach Rühren bei –20°C für 1 Stunde wurde das Reaktionsgemisch dann auf Raumtemperatur erwärmt. Die Molekularsiebe wurden herausfiltriert und mit Ethylacetat (3 × 20 ml) gewaschen. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde mittels einer Silicagelsäule unter Verwendung von Hexan/Ethylacetat/Methanol (10:10:1,5) gereinigt unter Erhalt von 2,3 g eines Gemischs in Form eines weißen Pulvers nach Gefriertrocknen aus Dioxan.
Herstellung von Verbindung 28
Eine Lösung von Verbindung 27, 2,3 g, in 40 ml trockenem Pyridin und 5 ml trockenem Essigsäureanhydrid wurde bei Raumtemperatur über Nacht unter Argon gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde mittels einer Silicagelsäule unter Verwendung von Hexan/Ethylacetat/Methanol (10:10:1,5) gereinigt unter Erhalt von 2,34 g eines weißen Pulvers nach Gefriertrocknen aus Dioxan.
Herstellung von Verbindung 29
Eine Lösung von Verbindung 28, 1,9 g, in 30 ml 80%-iger wäßriger Essigsäure wurde bei 80°C für 2 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde mittels einer Silicagelsäule unter Verwendung von Hexan/Ethylacetat/Methanol (5:10:3) gereinigt unter Erhalt von 1,61 g eines weißen Pulvers nach Gefriertrocknen aus Dioxan.
Herstellung von Verbindung 30
Ein Gemisch aus Verbindung 29, 150 mg, und 5 ml 0,1 N NaOH in 5 ml Methanol wurde bei Raumtemperatur für 24 Stunden gerührt. Dann wurden 5 ml 0,1 N NaOH und 5 ml Methanol zugegeben, und das Rühren wurde für 24 Stunden fortgesetzt. IR120+ Harz wurde zugegeben, um einen pH-Wert = 4,5 einzustellen. Das Harz wurde herausfiltriert und mit Wasser (5 × 5 ml) gewaschen. Das Wasser wurde unter Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde mittels einer P-2-Säule unter Verwendung von Wasser als Elutionsmittel unter Erhalt eines Feststoffs, 13,1 g, entfernt.
ES-MS

30-1: Ber. für C₂₀H₃₅O₁₂N₅, 537,50. Gefunden, 538,55 (M+H)
30-2: Ber. für C₂₈H₄₈O₁₇N₆, 740,31. Gefunden, 741,41 (M+H)
30-3: Ber. für C₂₆H₄₅O₁₇N₅, 699,64. Gefunden, 700,43 (M+H)
30-4: Ber. für C₄₀H₆₈O₂₇N₆, 1064,41. Gefunden, 1065,67 (M+H)
30-5: Ber. für C₃₄H₅₈O₂₂N₆, 902,36. Gefunden, 903,51 (M+H)
30-6: Ber. für C₃₄H₅₈O₂₂N₆, 902,36. Gefunden, 903,51 (M+H)

Beispiel 5: Erzeugung von Bibliotheken der zweiten Ebene
Unglycosylierte Serin- und Threoninreste in den Bibliotheken der ersten Ebene werden durch Acetylierung vorübergehend blockiert, um zu verhindern, daß der nächste Satz von Glycosyl-Donoren mit nicht umgesetzten Stellen reagiert. Nach der Reinigung werden die 4,6-Benzylidenyl-Schutzgruppen aller Glycoformen mittels Säurespaltung selektiv entfernt, um zusätzliche Glycosylierungsstellen auf allen existierenden Kohlenhydratstrukturen zu erzeugen. GlcNAc, Sialinsäure (S) und N-Acetyllactosamin (L) werden mit den existierenden Kohlenhydratstrukturen der Glycopeptide jeder Bibliothek der ersten Ebene umgesetzt, um Bibliotheken der zweiten Ebene mit neuen Strukturen zu erzeugen. Sialinsäure und N-Acetyllactosamin reagieren an der 6-O-Position von N-Acetylgalactosamin, die den glycosylierten Tn- und TF-Komponenten der Bibliotheken der ersten Ebene gemeinsam ist.
Beispielsweise werden die folgenden Bibliotheken der zweiten Ebene erzeugt, wenn die Bibliotheken 1, 2 und 3 aus Beispiel 1 mit Sialinsäure umgesetzt werden:

4. 1 + S: 00, Tn0, STn0, 0Tn, 0STn, TnTn, TnSTn, STnTn, STnSTn
5. 2 + S: 00, TF0, STF0, 0TF, 0STF, TFTF, TFSTF, STFTF, STFSTF
6. 3 + S: 00, Tn0, STN0, 0Tn, 0STn, TnTn, STnTn, TnSTn, STnSTn, TF0, STF0, 0TF, 0STF, TFTF, STFTF, TFSTF, STFSTF, TnTF, STnTF, TnSTF, STnSTF, TFTn, STFTn, TFSTn, STFSTn

Die Bibliothek 6 der zweiten Ebene ist umfangreicher als 4 und 5 zusammengenommen.
Die Anzahl an Komponenten kann unter Verwendung gemischter Donoren weiter gesteigert werden, wie in Bibliothek 7. Wenn Bibliothek 3 der ersten Ebene mit einem Gemisch aus Sialinsäure und N-Acetyllactosamin umgesetzt wird, wird die folgende Bibliothek erzeugt:

7. 3 + SL: 00, Tn0, STn0, 0Tn, 0STn, TnTn, STnTn, TnSTn, STnSTn, TF0, STF0, 0TF, 0STF, TFTF, STFTF, TFSTF, STFSTF, TnTF, STnTF, TnSTF, STnSTF, TFTn, STFTn, TFSTn, STFSTn, LTn0, 0LTn, LTnTn, TnLTn, LTnLTn, LTF0, 0LTF, TFLTF, LTFTF, LTFLTF, STnLTn, LTnSTn, LTFSTF, STFLTF

Zusätzliche Bibliotheken der zweiten Ebene können durch Mischen jeder der Bibliotheken 1, 2 und 3 mit N-Acetyllactosamin und durch Mischen jeder der Bibliotheken 1 und 2 mit einem Gemisch aus Sialinsäure und N-Acetyllactosamin gebildet werden.
Die letztendliche Größe und Definition der Bibliothek wird durch die Anzahl und die Identität der Donoren, das zuvor erfolgte Blockieren definierter Stellen auf dem Peptid und die Anwendung einer Syntheseart, bei der geteilt, gemischt und wieder geteilt wird, wie sie in Plunkett et al., Scientific American, April 1997, 68–73 beschrieben wird, deren Inhalt durch Bezugnahme hierin aufgenommen ist, kontrolliert. Die Erzeugung von Bibliotheken der zweiten Ebene ist in den Reaktionsschemata V, VI, VII und VIII zusammengefaßt.
Synthese einer Bibliothek der zweiten Ebene mit GlcNAc als Donor
Herstellung von Verbindung 31
Eine Lösung von Verbindung 29, 0,4 g, Verbindung 20, 1,2 g, und 2 g 3Å-Molekularsieben in 15 ml trockenem Acetonitril wurde bei Raumtemperatur für 10 Min. unter Argon gerührt. Das Gemisch wurde auf –20°C gekühlt, und 3 ml 0,1 mol TMS-OTF in trockenem Acetonitril wurden in 5 Min. zugegeben. Die Lösung wurde bei –20°C für 1 Stunde gerührt und auf Raumtemperatur erwärmt. Die Molekularsiebe wurden herausfiltriert und mit Ethylacetat (5 × 5 ml) gewaschen. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde mittels einer Silicagelsäule unter Verwen dung von Hexan/Ethylacetat/Methanol (5:10:2) gereinigt unter Erhalt von 0,64 g eines weißen Pulvers nach Gefriertrocknen aus Dioxan.
Herstellung von Verbindung 32
Eine Lösung von Verbindung 31, 0,63 g, und 4 g aktiviertem Zink in 50 ml 80%-iger Essigsäure in Ethylacetat wurde bei Raumtemperatur für 2 Stunden gerührt. Das Zink wurde herausfiltriert und mit Ethylacetat (5 × 20 ml) gewaschen. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde in 15 ml trockenem Pyridin und 5 ml trockenem Essigsäureanhydrid gelöst. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur für 12 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde mittels einer Silicagelsäule unter Verwendung von Hexan/Ethylacetat/Methanol (5:10:2) gereinigt unter Erhalt von 0,60 g eines weißen Pulvers nach Gefriertrocknen aus Dioxan. Eine Lösung des obigen Feststoffs, 200 mg, in 200 ml 80%-iger wäßriger Essigsäure wurde bei 80°C für 2 Stunden gerührt, und das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde in 5 ml Methanol gelöst und 20 ml 0,1 N NaOH wurden zugegeben, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 24 Stunden gerührt. IR120+ Harz wurde zugegeben, um einen pH-Wert = 4,5 einzustellen, und das Harz wurde herausfiltriert und mit Wasser (5 × 5 ml) gewaschen. Das Wasser wurde unter Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde mittels einer P-2-Säule unter Erhalt eines Feststoffs, 15 mg, gereinigt.
ES-MS:

32-1: Bei. für C₂₈H₄₈O₁₇N₆, 740,31. Gefunden, 741,30 (M+H)+
32-2: Ber. für C₃₆H₆₁O₂₂N₇, 943,39. Gefunden, 944,46 (M+H)+
32-3: Ber. für C₃₆H₆₁O₂₂N₇, 943,39. Gefunden, 944,46 (M+H)+
32-4: Ber. für C₄₄H₇₄O₂₇N₈, 1146,46. Gefunden, 574,50 (M+2H)2+
32-5: Ber. für C₃₄H₅₈O₂₂N₆, 902,36. Gefunden, 903,41 (M+H)+
32-6: Ber. für C₄₂H₇₁O₂₇N₇, 1105,44. Gefunden, 1106,72 (M+H)+
32-7: Ber. für C₄₂H₇₁O₂₇N₇, 1105,44. Gefunden, 1106,72 (M+H)+
32-8: Ber. für C₅₆H₉₄O₃₇N₈, 1470,57. Gefunden, 737,00 (M+2H)+
32-9: Ber. für C₅₀H₈₄O₃₂Na, 1308,52. Gefunden, 1309,57 (M+H)+
32-10: Ber. für C₅₀H₈₄O₃₂N₈, 1308,52. Gefunden, 1309,57 (M+H)+
32-11: Ber. für C₄₂H₇₁O₂₇N₇, 1105,44. Gefunden, 1106,72 (M+H)+
32-12: Ber. für C₄₂H₇₁O₂₇N₇, 1105,44. Gefunden, 1106,72 (M+H)+
32-13: Ber. für Ca₈H₈₁O₃₂N₇, 1268,16. Gefunden, 635,0 (M+2H)2+
32-14: Ber. für C₄₈H₈₁O₃₂N₇, 1268,16. Gefunden, 635,0 (M+2H)2+

Synthese einer Bibliothek der zweiten Ebene mit N-Acetyllactosamin als Donor
Herstellung von Verbindung 33
Eine Lösung von Verbindung 29, 0,4 g, Verbindung 23, 1,5 g, und 2 g 3Å-Molekularsieben in 15 ml trockenem CH₂Cl₂ wurde bei Raumtemperatur für 10 Min. unter Argon gerührt. Drei ml 0,1 mol BF₃OEt₂ in trockenem CH₂Cl₂ wurden in 10 Min. zugegeben. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur für 1 Stunde gerührt. Die Molekularsiebe wurden herausfiltriert und mit Ethylacetat (5 × 10 ml) gewaschen, und das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde mittels einer Silicagelsäule unter Verwendung von Hexan/Ethylacetat/Methanol (5:10:2) gereinigt unter Erhalt von 0,43 g eines weißen Pulvers nach Gefriertrocknen aus Dioxan.
Herstellung von Verbindung 34
In eine Lösung von Verbindung 33, 0,42 g, in 30 ml Pyridin und 2 ml Wasser wurde für 30 Min. H₂S-Gas eingeleitet. Die Lösung wurde gestoppt und bei Raumtemperatur für 48 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde in 15 ml trockenem Pyridin und 5 ml trockenem Essigsäureanhydrid gelöst. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 12 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde mittels einer Silicagelsäule unter Verwendung von Hexan/Ethylacetat/Methanol (5:10:2) gereinigt unter Erhalt von 0,44 g eines weißen Pulvers nach Gefriertrocknen aus Dioxan. Eine Lösung des obigen Feststoffs, 200 mg, wurde in 5 ml Methanol und 20 ml 0,1 N NaOH gelöst, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 24 Stunden gerührt. IR120+ Harz wurde zugegeben, um einen pH-Wert = 4,5 einzustellen, und das Harz wurde herausfiltriert und mit Wasser (5 × 5 ml) gewaschen. Das Wasser wurde unter Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde mittels einer P-2-Säule unter Erhalt eines Feststoffs, 12,7 mg, gereinigt.
ES-MS

34-1: Ber. für C₃₄H₅₈O₂₂N₆, 902,36. Gefunden, 903,46 (M+H)+
34-2: Ber. für C₄₂H₇₁O₂₇N₇, 1105,44. Gefunden, 1106,54 (M+H)+
34-3: Ber. für C₄₂H₇₁O₂₇N₇, 1105,44. Gefunden, 1106,54 (M+H)+
34-4: Ber. für C₅₆H₉₄O₃₇N₈, 1470,57. Gefunden, 736,60 (M+2H)+
34-5: Ber. für C₄₀H₆₈O₂₇N₆, 1064,41. Gefunden, 1065,54 (M+H)+
34-6: Ber. für C₄₈H₈₁O₃₂N₇, 1267,49. Gefunden, 1268,52 (M+H)+
34-7: Ber. für C₄₈H₈₁O₃₂N₇, 1267,49. Gefunden, 1268,52 (M+H)+
34-8: Ber. für C₆₈H₁₁₄O₄₇N₈, 1794,68. Gefunden, 898,70 (M+2H)2+
34-9: Ber. für C₆₂H₁₀₄O₄₂N₈, 1632,62. Gefunden, 817,64 (M+2H)+
34-10: Ber. für C₆₂H₁₀₄O₄₂N₈, 1632,62. Gefunden, 817,64 (M+2H)+
34-11: Ber. für C₄₈H₈₁O₃₂N₇, 1267,49. Gefunden, 1268,52 (M+H)+
34-12: Ber. für C₄₈H₈₁O₃₂N₇, 1267,49. Gefunden, 1268,52 (M+H)+
34-13: Ber. für C₅₄H₉₁O₃₇N₇, 1430,30. Gefunden, 1430,71 (M+H)+
34-14: Ber. für C₅₄H₉₁O₃₇N₇, 1430,30. Gefunden, 1430,71 (M+H)+

Synthese einer Bibliothek der zweiten Ebene mit Sialinsäure als Donor
Herstellung von Verbindung 35
Eine Lösung von Verbindung 29, 0,4 g, Verbindung 26, 0,8 g, und 2 g 3Å-Molekularsieben in 15 ml trockenem THF wurde bei Raumtemperatur für 10 Min. unter Argon gerührt und auf –20°C gekühlt. Zwei ml 0,1 mol TMS-OTF in trockenem THF wurden in 5 Min. zugegeben. Die Lösung wurde bei –20°C für 1 Stunde gerührt. Die Molekularsiebe wurden herausfiltrierf und mit Ethylacetat (5 × 10 ml) gewaschen, und das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde mittels einer Silicagelsäule unter Verwendung von Hexan/Ethylacetat/Methanol (5:10:3) gereinigt unter Erhalt von 0,55 g eines weißen Pulvers nach Gefriertrocknen aus Dioxan.
Herstellung von Verbindung 36
Eine Lösung von Verbindung 35, 0,2 g, in 10 ml 0,1 N NaOH und 5 ml Methanol wurde bei Raumtemperatur für 24 Stunden gerührt. IR120+ Harz wurde zugegeben, um einen pH-Wert = 4,5 einzustellen, und das Harz wurde herausfiltriert und mit Wasser (5 × 5 ml) gewaschen. Das Wasser wurde unter Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde mittels einer P-2-Säule unter Erhalt eines Feststoffs, 18,3 mg, gereinigt.
ES-MS

36-1: Ber. für C₃₁H₅₂O₂₀N₆, 828,32. Gefunden, 829,60 (M+H)+
36-2: Ber. für C₃₉H₆₅O₂₅N₇, 1031,40. Gefunden, 1032,80 (M+H)+
36-3: Ber. für C₃₉H₆₅O₂₅N₇, 1031,40. Gefunden, 1032,80 (M+H)+
36-4: Ber. für C₅₀H₈₂O₃₃N₈, 1322,50. Gefunden, 662,00 (M+2H)2+
36-5: Ber. für C₃₇H₆₂O₂₅N₆, 990,37. Gefunden, 991,70 (M+H)+
36-6: Ber. für C₄₅H₇₅O₃₀N₇, 1193,45. Gefunden, 1194,80 (M+H)+
36-7: Ber. für C₄₅H₇₅O₃₀N₇, 1193,45. Gefunden, 1194,80 (M+H)+
36-8: Ber. für C₆₂H₁₀₂O₄₃N₈, 1646,60. Gefunden, 824,20 (M+2H)2+
36-9: Ber. für C₅₆H₉₂O₃₈N₈, 1484,55. Gefunden, 743,60 (M+2H)2+
36-10: Ber. für C₅₆N₉₂O₃₈N₈, 1484,55. Gefunden, 743,60 (M+2H)2+
36-11: Ber. für C₄₅H₇₅O₃₀N₇, 1193,45. Gefunden, 1194,80 (M+H)+
36-12: Ber. für C₄₅H₇₅O₃₀N₇, 1193,45. Gefunden, 1194,80 (M+H)+
36-13: Ber. für C₅₁H₈₅O₃₅N₇, 1356,22. Gefunden, 1356,60 (M+H)+
36-14: Ber. für C₅₁H₈₅O₃₅N₇, 1356,22. Gefunden, 1356,60 (M+H)+

Synthese einer Bibliothek der zweiten Ebene mit GlcNAc und Sialinsäure als Donoren
Herstellung von Verbindung 37
Eine Lösung von Verbindung 29, 0,2 g, Verbindung 26, 0,22 g, und Verbindung 20, 0,22 g, mit 2 g 3 Å-Molekularsieben in 15 ml trockenem THF wurde bei Raumtemperatur für 10 Min. unter Argon gerührt und auf –20°C gekühlt. Ein ml 0,1 mol TMS-OTF in trockenem THF wurde in 5 Min. zugegeben. Die Lösung wurde bei –20°C für 1 Stunde gerührt. Die Molekularsiebe wurden herausfiltriert und mit Ethylacetat (5 × 10 ml) gewaschen, und das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde mittels einer Silicagelsäule unter Verwendung von Hexan/Ethylacetat/Methanol (5:10:1) gereinigt unter Erhalt von 0,27 g eines weißen Pulvers nach Gefriertrocknen aus Dioxan.
Herstellung von Verbindung 38
Eine Lösung von Verbindung 37, 0,27 g, und 1 g aktiviertem Zink in 20 ml 80%-iger Essigsäure in Ethylacetat wurde bei Raumtemperatur für 2 Stunden gerührt. Das Zink wurde herausfiltriert und mit Ethylacetat (5 × 20 ml) gewaschen. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde in 4 ml trockenem Pyridin und 2 ml trockenem Essigsäureanhydrid gelöst. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur für 12 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde mittels einer Silicagelsäule unter Verwendung von Hexan/Ethylacetat/Methanol (5:10:1) gereinigt unter Erhalt von 0,25 g eines weißen Pulvers nach Gefriertrocknen aus Dioxan. Eine Lösung des obigen Feststoffs, 0,25 g, in 10 ml 80%-iger wäßriger Essigsäure wurde bei 80°C für 2 Stunden gerührt, und das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde in 3 ml Methanol gelöst und 7 ml 0,1 N NaOH wurden zugegeben, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 24 Stunden gerührt. IR120+ Harz wurde zugegeben, um einen pH-Wert = 4,5 einzustellen, und das Harz wurde herausfiltriert und mit Wasser (5 × 5 ml) gewaschen. Das Wasser wurde unter Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde mittels einer P-2-Säule unter Erhalt eines Feststoffs, 16,1 mg, gereinigt.
Beispiel 6: Screenen von GSTA-Bibliotheken
Ein ELISA-Test mit Antikörpern, die an eine feste Phase von entweder Schaf-Submaxillar-Mucin (OSM) oder CA27.29 binden, wurde in einem Inhibitionsformat verwendet, um die GSTA-Bibliotheken zu screenen, wobei Komponenten der Bibliotheken als Inhibitoren verwendet wurden. Wells wurden mit 110 μl Antigen, verdünnt in PBS, beschichtet und über Nacht bei 4°C stehen gelassen. Ein μg/ml OSM oder 10 U/ml CA27.29 wurden in dem Test verwendet. Am Tag des Tests wurden die Wells abgesaugt und zweimal mit PBS gewaschen, dann wurden 200 μl 2% BSA-Blockierlösung zu jedem Well zugegeben. Die Wells wurden 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert.
Die monoklonalen Antikörper und die Inhibitoren wurden unter Verwendung von Glas-Kulturröhrchen in 1% FBS/PBS auf verschiedene Konzentrationen verdünnt. Monoklonaler Antikörper und Inhibitor wurden in Vorinkubationsröhrchen vereinigt. In das Röhrchen mit Null Inhibition wurden monoklonaler Antikörper und 1% FBS/PBS als Verdünnungsmittel gegeben. Die Vorinkubation für jede Platte wurde exakt eine Stunde vor dem Ende der Blockier-Inkubation abgeschlossen. Wenn die Blockier-Inkubation abgeschlossen war, wurden die Wells abgesaugt und 4-mal mit TPBS (PBS + 0,05% Tween 20) gewaschen, und 100 μl des Vorinkubationsgemischs wurden zu zwei parallelen Wells zugegeben. Leerwert- und Substrat-Negativkontroll-Wells erhielten nur 100 μl 1% FBS/PBS als Verdünnungsmittel.
Die Wells wurden für 90 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Kurz vor dem Ende der Inkubation wurde Ziege-Anti-Maus-IgG, H + L, HRP-markiert, mit 1% FBS/PBS verdünnt. Die Wells wurden abgesaugt und 4-mal mit TPBS gewaschen, und 90 μl verdünnter Ziege-Anti-Maus-HRP wurde zu allen Wells mit Ausnahme der Substrat-Negativkontroll-Wells, die 90 μl 1% FBS/PBS erhielten, zugegeben.
Die Wells wurden für 90 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und dann abgesaugt und 4-mal mit TPBS gewaschen. Gleiche Volumina von ABTS und Peroxidlösung B-Substrat wurden gemischt, und 100 μl wurden zu jedem Well zugegeben. Die Platte wurde unverzüglich in einen Plattenleser gegeben und im kinetischen Modus bei einer Wellenlänge von 405–490 nm, 10 Minuten Auslesen, 20-sekündiger Intervall, ausgelesen. Die Daten wurden in mOD/Min. ausgedrückt, und die Ergebnisse sind in Tabelle 3 und 8 gezeigt:
Schema I. Synthese von geschütztem Peptid
Schema II. Synthese von Donoren für die erste Ebene der Bibliothek
Schema III. Synthese von Donoren für die zweite Ebene der Bibliothek
Schema IV. Erste Ebene der Bibliothek
Schema V. Zweite Ebene der Bibliothek mit GlcNAc als Donor
Schema VI. Zweite Ebene der Bibliothek mit N-Acetyllactosamin als Donor
Schema VII. Zweite Ebene der Bibliothek mit Sialinsäure als Donor
Schema VIII. Zweite Ebene der Bibliothek mit GlcNAc und Sialinsäure als Donoren

Claims

Verfahren zum Erzeugen einer Bibliothek von Peptiden oder peptidähnlichen Strukturen, die wenigstens eine Glycosylierungsstelle haben, welches die folgenden Stufen umfaßt: a) zufälliges Glycosylieren eines Kerns, der wenigstens eine Glycosylierungsstelle aufweist, mit wenigstens einem Glycosyl-Donor, optional Blockieren nicht umgesetzter Glycosylierungsstellen auf den glycosylierten Kernen und optional selektives Entfernen einer oder mehrerer Schutzgruppen auf den Kohlenhydratgruppen, die auf der ersten Ebene eingeführt wurden, wobei eine Bibliothek von glycosylierten Kernen der ersten Ebene erzeugt wird, und anschließend b) optional zufälliges Glycosylieren der Bibliothek von glycosylierten Kernen der ersten Ebene oder einer Kombination von Bibliotheken von glycosylierten Kernen der ersten Ebene mit wenigstens einem Glycosyl-Donor, und optional selektives Entfernen einer oder mehrerer ausgewiesener Schutzgruppen auf den Kohlenhydratgruppen, die auf der zweiten Ebene eingeführt wurden, wobei eine Bibliothek von glycosylierten Kernen der zweiten Ebene erzeugt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, welches weiterhin folgendes umfaßt: zufälliges Glycosylieren der Bibliothek von glycosylierten Kernen der zweiten Ebene oder einer Kombination von Bibliotheken von glycosylierten Kernen der zweiten Ebene oder der ersten und der zweiten Ebene mit wenigstens einem Glycosyl-Donor, und optional selektives Entfernen einer oder mehrerer ausgewiesener Schutzgruppen auf den Kohlenhydratgruppen, die auf der dritten Ebene eingeführt wurden, wobei eine Bibliothek von glycosylierten Kernen der dritten Ebene erzeugt wird, und optional Wiederholen der vorangegangenen Stufe, um Bibliotheken der vierten Ebene und höherer Ebenen mit zunehmender Vielfalt zu erzeugen.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Peptid eine Aminosäuresequenz GVTSAPDTRPAPGSTA hat.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Peptid eine Aminosäuresequenz GSTA hat.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die nicht-umgesetzten Glycosylierungsstellen blockiert werden.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Stellen durch Acetylierung blockiert werden.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Glycosyl-Donoren aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus GalNAc, βGal (1-3) αGalNAc und Sialyl.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Glycosyl-Donoren aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus GalNAc, βGal (1-3) αGalNAc und Sialyl.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei Hydroxylgruppen auf den Glycosyl-Donoren vor der Reaktion der Glycosyl-Donoren mit dem Kern oder dem glycosylierten Kern geschützt werden.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Hydroxylgruppen nach der Reaktion mit dem Kern oder dem glycosylierten Kern entschützt werden.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei einige der Hydroxylgruppen während der Stufe der Schutzgruppenentfernung bzw. Entschützung entfernt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Kern ein Peptid ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Kern keine Peptidbindungen enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Kern natürliche Glycosylierungsstellen enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Kern nicht natürliche Glycosylierungsstellen enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Kern Tandem-Wiederholungen enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei jede Glycosylierungsstelle auf dem Kern einzigartig und aufgrund unterschiedlicher struktureller Merkmale in der Umgebung der Stelle von anderen Stellen unterscheidbar ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Kern ein Hybridkern ist, der ein Nicht-Peptid-Polymer umfaßt, an welches natürliche Aminosäureseitenketten mit natürlichen Aminosäureseitenketten mit natürlichen Glycosylierungsstellen angehängt sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Glycosylierungsstellen Hydroxyfunktionen für die O-Glycosylierung oder carboxy- oder carboxamidofunktionale Gruppen für die N-Glycosylierung bereitstellen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Glycosylierungsstellen eines oder mehrere von Serin, Threonin, Hydroxylysin und Asparagin beinhalten.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Glycosylierungsstellen vollständig aus einer d-optischen Konfiguration bestehen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Kern vollständig aus d-Aminosäuren besteht.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Kern linear ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Kern zyklisch ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Kern eine UV-aktive oder fluoreszente Markierung enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Kern hydrophobe Aminosäuren enthält, die die Löslichkeit des Kerns in organischen Lösungsmitteln steigern.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Glycosylierungsstellen einzeln oder in Clustern zwischen Sequenzen, die hydrophobe Aminosäuren beinhalten, angeordnet sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei Lipidketten in den Kern aufgenommen sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Glycosyl-Donoren nicht natürlich sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Glycosyl-Donoren Strukturen umfassen, die mit Adhäsionsliganden für Bakterienrezeptoren, die auf humanen Zelloberflächenantigenen exprimiert sind, assoziiert sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Glycosyl-Donoren Strukturen umfassen, die mit Antigenen gegen maligne Zellen assoziiert sind.
Verfahren zum Identifizieren einer biologisch wirksamen Verbindung, welches folgendes umfaßt: Erzeugen einer Bibliothek von glycosylierten Kernen, hergestellt durch das Verfahren von Anspruch 1, und Screenen von Komponenten der Bibliothek auf arzneimittelartige, kompetitiv hemmende, immunstimulierende oder antikörperartige Wirkung.
Verfahren zum Identifizieren einer antiviralen Verbindung, welches folgendes umfaßt: Erzeugen einer Bibliothek von glycosylierten Kernen, hergestellt durch das Verfahren von Anspruch 1, und Screenen von Komponenten der Bibliothek auf antivirale Wirkung.
Verfahren zum Identifizieren einer antibakteriellen Verbindung, welches folgendes umfaßt: Erzeugen einer Bibliothek von glycosylierten Kernen, hergestellt durch das Verfahren von Anspruch 1, wobei die Glycosyl-Donoren Strukturen umfassen, die mit Adhäsionsliganden für Bakterienrezeptoren, die auf humanen Zelloberflächenantigenen exprimiert sind, assoziiert sind, und Screenen von Komponenten der Bibliothek auf die Fähigkeit, die Anhaftung von Bakterien an eine Wirtszelle kompetitiv zu hemmen.
Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen für die Erkennung oder Behandlung von Krebs, welches folgendes umfaßt: Erzeugen einer Bibliothek von glycosylierten Kernen, hergestellt durch das Verfahren von Anspruch 1, und Screenen von Komponenten der Bibliothek auf eine Anti-Krebs-Wirkung.