DE69216640T2

DE69216640T2 - Verfahren und Gerät zum Nachweis von Nukleinsäurensequenzen.

Info

Publication number: DE69216640T2
Application number: DE69216640T
Authority: DE
Inventors: Sarah Alajem; Max Herzberg; Thierry Paper; Avraham Reinhartz
Original assignee: Orgenics Ltd
Current assignee: Orgenics Ltd
Priority date: 1991-10-04
Filing date: 1992-10-05
Publication date: 1997-06-19
Anticipated expiration: 2012-10-06
Also published as: WO1993007292A1; JPH07501933A; IL102486A; DE69216640D1; EP0612354A1; ATE147440T1; AU2789492A; US5527673A; EP0612354B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft Vorrichtungen und Verfahren für die Trennung von Zielmolekülen, einschließlich Ziel-Nukleinsäuresequenzen, von Oligonukleotiden und Nukleotiden und für die Konzentrierung und den Nachweis der Moleküle.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die Verwendung von Amplifizierungstechniken bei einem Verfahren zum Nachweis von Zielmolekülen, einschließlich Ziel-Nukleinsäuresequenzen, ist im Fachgebiet wohlbekannt. Bei diesem Verfahren werden die Ziel-Nukleinsäuresequenzen gewöhnlich enzymatisch amplifiziert und die Zielmoleküle durch Gelelektrophorese und anschließende Southern-Blot-Verfahren nachgewiesen.
Man hat auch eine Reihe von Festphasen-Einfangtests entwickelt, um die Verfahren zum Nachweis von Zielmolekülen, einschließlich Nukleinsäuresequenzen, zu vereinfachen. Bei diesen Verfahren werden zwei Liganden gewöhnlich in amplifizierte Ziel-Nukleinsäuresequenzen eingebaut. Ein erster Ligand wird verwendet, um die Zielmoleküle, einschließlich der amplifizierten Ziel- Nukleinsäuresequenzen, auf einer festen Matrix einzufangen. Ein zweiter Ligand wird verwendet, um die Zielmoleküle nachzuweisen, indem ein signalerzeugendes Reagenz an diesen zweiten Liganden gebunden wird.
Festphasen-Affinitäts-Einfangtests benötigen jedoch eine längere Reaktionszeit, um einen großen Teil der Zielmoleküle in einem Reaktionsgemisch einzufangen (Sauvaigo et al., Nucleic Acids Research, 1990, Bd. 18, S. 3175 - 3182). Erfolgt das Einfangen durch Amplifizierungsprimer, die einen Festphasen-Affinitätsliganden enthalten, kann die Empfindlichkeit des Testes außerdem durch Konkurrenz zwischen freien Primern und Primern, die in den Ziel-Nukleinsäuresequenzen enthalten sind, beeinträchtigt werden.
Die Verwendung von Chromatographie als Trennungs- und Konzentrations-Verfahren ist im Fachgebiet wohlbekannt. Es ist beschrieben worden, daß DNA-Moleküle auf benetztem Papier chromatographisch mobil sind. Sie können jedoch nicht wandern, wenn Lösungen auf trockenes Papier aufgetragen werden (Bendich et al., Arch. Biochem. Biophys., 1961, 94, 417-423).
EP 0306336 A2 beschreibt ein Gerät zum Durchführen eines Testes, mit dem ein Analyt in einer Probe bestimmt wird, umfassend ein Gehäuse; darin enthaltene Vorrichtungen (z.B. ein immunabsorbierendes oder möglicherweise immunabsorbierendes saugfähiges Material) zum Einfangen eines ersten Bestandteils eines spezifischen Bindungspaares in einem Bereich und zum Befördern von Flüssigkeit durch Kapillarwirkung aus diesem Bereich; eine erste Vorrichtung in dem Gehäuse zum Einbringen der Probe in das Gerät; und eine zweite Vorrichtung in dem Gehäuse zum Einbringen von flüssigem Reagenz, das sich von der Probe unterscheidet, in das Gerät, ohne daß das flüssige Reagenz gleichzeitig durch die erste Vorrichtung eingebracht wird.
EP 0362809 A1 beschreibt ein Gerät zum Bestimmen eines Analyten in einer Körperflüssigkeit, das einen ersten Bereich enthält, bestehend aus einem Material, das die Körperflüssigkeit durch Kapillarwirkung ziehen kann und auf dem ein für Analyten bioselektives gefärbtes Reagenz absorbiert ist, wobei ein Ende des ersten Bereiches in die Körperflüssigkeit getaucht wird und das andere Ende mit dem Ablesebereich in Kontakt steht; einen Ablesebereich, der mit dem vorhergehenden in Kontakt steht und einen Bereich aus einem Material, das den Kapillarstrom der Körperflüssigkeit gewährleisten kann, woran ein Protein gebunden ist, das den Analyten und möglicherweise den Analyten positive Reagenz-Kontrolle) und ein inertes Protein (negative Reagenz-Kontrolle) selektiv binden kann, wobei der saure Analyt und das inerte Protein so verteilt werden, daß (nach Umsetzen mit dem bioselektiven gefärbten Reagenz) zwei verschiedene Figuren entstehen, die je nachdem, ob der Test positiv verläuft, optisch zugeordnet werden können; und einen weiteren Bereich, bei dem ein Ende mit dem Ablesebereich in Kontakt steht, aus einem anderen Material, das den Kapillarstom der Körperflüssigkeit zu dem anderen Ende gewährleisten kann und einen Indikator enthält, der den Durchtritt der Körperflüssigkeit durch das Gerät zeigt.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens und einer Vorrichtung für den Kapillartransport von Molekülen, einschließlich Nukleinsäuresequenzen.
Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens und einer Vorrichtung zur Konzentrierung von Zielmolekülen, einschließlich Ziel-Nukleinsäuresequenzen, in einer flüssigen Probe.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens und einer Vorrichtung für die Trennung von Zielmolekülen, einschließlich Ziel-Nukleinsäuresequenzen, von Nukleotiden und Oligonukleotiden.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens für die Bestimmung von Zielmolekülen, einschließlich spezifischer Nukleinsäuresequenzen.
Nach der vorliegenden Erfindung wird folglich eine Vorrichtung zum Transport von Molekülen, einschließlich Nukleinsäuresequenzen, in einem saugfähigen Träger bereitgestellt, umfassend einen trockenen saugfähigen Träger, der einen Kapillartransportweg vorgibt und den Transport der Moleküle fördert, wenn er mit einer Lösung in Kontakt kommt, die die Moleküle enthält.
Nach einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform wird eine Vorrichtung zur Konzentrierung von Zielmolekülen in einer flüssigen Probe bereitgestellt, umfassend den trockenen saugfähigen Träger, wobei die Zielmoleküle u.a. Ziel-Nukleinsäuresequenzen sind und in dem saugfähigen Träger durch Kapillarwirkung transportiert werden, wenn ein Abschnitt des trockenen saugfähigen Trägers mit der flüssigen Probe mit den Zielmolekülen in Kontakt tritt, und mindestens ein Einfangreagenz, das an mindestens einer Einfangzone auf dem trockenen saugfähigen Träger stromabwärts eines Kontaktabschnittes des saugfähigen Trägers gebunden ist, wobei das mindestens eine Einfangreagenz die Zielmoleküle einfangen kann.
Erfindungsgemäß wird ebenfalls eine Vorrichtung zur Trennung von Zielmolekülen, einschließlich Ziel-Nukleinsäuresequenzen, von Nichtziel-Nukleotiden und -Oligonukleotiden in einer flüssigen Probe, die die Zielmoleküle und die Nichtziel-Nukleotide und -Oligonukleotide enthält, bereitgestellt, umfassend einen Behälter, der eine Verbindung enthält, die die Nichtziel-Oligonukleotide bindet, und eine Vorrichtung zum Transportieren der Zielmoleküle aus dem Behälter durch Kapillarwirkung.
Nach einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform ist der trockene saugfähige Träger eine Nitrocellulosemembran, bei der die Absorptionsstellen blockiert sind, damit der Kapillartransport der Zielmoleküle leichter erfolgt.
Nach einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform wird der trockene saugfähige Träger von einen festen Rahmen getragen.
Nach einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform ist ein absorbierendes Kissen an dem trockenen saugfähigen Träger stromabwärts der mindestens einen Einfangzone befestigt, damit der Kapillartransport einer Flüssigkeit durch den trockenen saugfähigen Träger leichter erfolgt.
Nach einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform sind die Absorptionsstellen der Nitrocellulosemembran durch Verbindungen blockiert, die aus einer Gruppe ausgewählt sind, umfassend Makromoleküle, Detergentien und Kombinationen davon.
Nach einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform sind die Makromoleküle u.a. Proteine.
Nach einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform ist das mindestens eine Einfangreagenz u.a. ein Antikörper gegen einen modifizierten Abschnitt der Ziel-Nukleinsäuresequenzen.
Nach einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform ist das mindestens eine Einfangreagenz u.a. mindestens ein Nukleinsäure-Einfangreagenz, einschließlich Nukleinsäuresonden- Sequenzen, die zu mindestens einem Abschnitt der Ziel-Nukleinsäuresequenzen komplementär sind.
Nach einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform sind die Nukleinsäuresonden-Sequenzen u.a. DNA-Sequenzen.
Nach einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform sind die Nukleinsäuresonden-Sequenzen u.a. RNA-Sequenzen.
Nach einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform sind die Zielmoleküle u.a. Ziel-Nukleinsäuresequenzen, die mehr als 30 Basenpaare umfassen.
Nach einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform sind die Zielmoleküle, einschließlich Ziel-Nukleinsäuresequenzen, u.a ein Nukleinsäure-Produkt einer enzymatischen Amplifizierungsreaktion und enthalten mindestens ein Oligonukleotid-Primerpaar.
Nach einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform beinhaltet das mindestens eine Primerpaar Primer für eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR).
Nach einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform beinhaltet das mindestens eine Primerpaar Primer für eine Ligase-Kettenreaktion (LCR).
Nach einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform beinhaltet mindestens ein zweiter Primer des mindestens einen Primerpaars ein Oligonukleotid, das einen Liganden trägt, der an mindestens ein Einfangreagenz bindet, wodurch die Zielmoleküle, die den mindestens einen ligandentragenden Primer beinhalten, an das mindestens eine Einfangreagenz gebunden werden können.
Nach einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform enthält der Ligand, der an das mindestens eine Einfangreagenz bindet, ein Antigenepitop.
Nach einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform enthält der Ligand, der an das mindestens eine Einfangreagenz bindet, mindestens ein sulfoniertes Cytosin.
Nach einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform umfaßt die Verbindung Gelfiltrationspartikel, die zu groß sind, um von der Transportvorrichtung transportiert zu werden.
Nach einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform umfassen die Nichtziel-Oligonukleotide Oligonukleotidprimer, die nicht in die Ziel-Nukleinsäuresequenzen eingebaut sind.
Nach einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform umfaßt die Verbindung eine Matrix, die nicht durch die Transportvorrichtung transportiert werden kann, und bei der die Verbindung an das Nichtziel-Oligonukleotid hybridisiert.
Nach der vorliegenden Erfindung wird auch ein Verfahren zum Transport von Molekülen, einschließlich Nukleinsäuresequenzen, in einem saugfähigen Träger bereitgestellt, umfassend die Schritte: Bereitstellen eines trockenen saugfähigen Trägers, der einen Kapillartransportweg vorgibt, der den Transport von Molekülen, einschließlich Nukleinsäuresequenzen, fördert, und In-Kontakt- bringen des trockenen saugfähigen Trägers mit einer Lösung, die Moleküle, einschließlich Nukleinsäuresequenzen, enthält.
Nach der vorliegenden Erfindung wird außerdem ein Verfahren zum Konzentrieren von Molekülen, einschließlich Nukleinsäuresequenzen, in einer flüssigen Probe bereitgestellt, umfassend die Schritte: Bereitstellen eines trockenen saugfähigen Trägers, wobei die Moleküle Zielmoleküle, einschließlich Ziel-Nukleinsäuresequenzen, sind, und wobei die Moleküle in dem saugfähigen Träger durch Kapillarwirkung transportiert werden, wenn ein Abschnitt des trockenen saugfähigen Trägers mit der flüssigen Probe, die die Moleküle enthält, in Kontakt tritt, In-Kontakt-bringen eines Abschnittes des trockenen saugfähigen Trägers mit der flüssigen Probe, die die Zielmoleküle enthält, wobei der trockene saugfähige Träger, sobald er benetzt ist, einen Flüssigkeitstransportweg vorgibt, der den Transport von Molekülen, einschließlich Nukleinsäuresequenzen, fördert, Transportieren der Zielmoleküle über den Flüssigkeitstransportweg, und Einfangen der Zielmoleküle mit mindestens einem Einfangreagenz, das in mindestens einer Einfangzone auf dem trockenen saugfähigen Träger stromabwärts des Abschnittes des saugfähigen Trägers, der mit der flüssigen Probe in Kontakt steht, gebunden ist.
Erfindungsgemäß wird zudem ein Verfahren zur Trennung von Zielmolekülen, einschließlich Ziel-Nukleinsäuresequenzen, von Nichtziel-Nukleotiden und -Oligonukleotiden, in einer flüssigen Probe, die die Zielmoleküle und die Nichtziel-Nukleotide und -Oligonukleotide enthält, bereitgestellt, umfassend die Schritte: Bereitstellen eines Behälters, der eine Verbindung enthält, die die Nichtziel- Nukleotid- und -Oligonukleotid-Sequenzen bindet, Zugeben der flüssigen Probe, die die Zielmoleküle und die Nichtziel-Nukleotide und die -Oligonukleotide enthält, und Transportieren der Zielmoleküle durch Kapillarwirkung.
Erfindungsgemäß wird auch eine Vorrichtung bereitgestellt zur Trennung von Zielmolekülen, einschließlich Ziel-Nukleinsäuresequenzen, von Nichtziel-Nukleotiden und -Oligonukleotiden in einer flüssigen Probe, die die Zielmoleküle und die Nichtziel-Nukleotide und -Oligonukleotide enthält, zur Konzentrierung der Zielmoleküle, und zum Nachweis der konzentrierten Zielmoleküle, umfassend:
eine Behältervorrichtung, die eine Vielzahl von Löchern vorgibt, einschließlich eines ersten Teils der Vielzahl von Löchern mit einer Verbindung, die die Nichtziel-Oligonukleotide bindet, wobei die flüssige Probe zu dem ersten Teil der Vielzahl von Löchern zugegeben werden kann, einen trockenen saugfähigen Träger, der einen Flüssigkeitstransportweg aus dem Behälter vorgibt und der, wenn er benetzt ist, den Transport der Zielmoleküle fördert, wobei die Zielmoleküle in dem saugfähigen Träger durch Kapillarwirkung transportiert werden, wenn ein Kontaktabschnitt des trockenen saugfähigen Trägers mit der flüssigen Probe, die die Zielmolekülen enthält, in Kontakt tritt, mindestens ein Einfangreagenz, das die Zielmoleküle einfangen kann, wobei das mindestens eine Einfangreagenz in mindestens einer Einfangzone auf dem trockenen saugfähigen Träger stromabwärts des Kontaktabschnittes des saugfähigen Trägers gebunden ist, und eine Vorrichtung zum Nachweisen der eingefangenen Zielmoleküle.
Erfindungsgemäß wird zudem ein Verfahren zur Konzentrierung und zum Nachweis von Ziel- Nukleinsäuresequenzen in einer flüssigen Probe bereitgestellt, umfassend die Schritte:
Bereitstellen eines trockenen saugfähigen Trägers, wobei die Ziel-Nukleinsäuresequenzen in dem saugfähigen Träger durch Kapillarwirkung transportiert werden, wenn ein Abschnitt des trockenen saugfähigen Trägers mit der flüssigen Probe, die die Ziel-Nukleinsäuresequenzen enthält, in Kontakt tritt, In-Kontakt-bringen eines Abschnittes des trockenen saugfähigen Trägers mit der flüssigen Probe, die die Ziel-Nukleinsäuresequenzen enthält, wobei der trockene saugfähige Träger, wenn er benetzt ist, einen Flüssigkeitstransportweg vorgibt und den Transport der Ziel-Nukleinsäuresequenzen fördert, Transportieren der Ziel-Nukleinsäuresequenzen über den Flüssigkeitstransportweg, und Einfangen der Ziel-Nukleinsäuresequenzen durch Hybridisierung mit mindestens einem Nukleinsäure- Einfangreagenz, das in mindestens einer Einfangzone auf dem trockenen saugfähigen Träger stromabwärts des Abschnittes des saugfähigen Trägers, der mit der flüssigen Probe in Kontakt steht, gebunden ist.
Erfindungsgemäß wird zudem eine Vorrichtung zur Konzentrierung und zum Nachweis von Ziel-Nukleinsäuresequenzen bereitgestellt, umfassend:
eine Behältervorrichtung, die eine Vielzahl von Löchern vorgibt, einen trockenen saugfähigen Träger, der einen Flüssigkeitstransportweg aus dem Behälter vorgibt und der, wenn er benetzt ist, den Transport der Ziel-Nukleinsäuresequenzen fördert, wobei die Ziel-Nukleinsäuresequenzen in dem saugfähigen Träger durch Kapillarwirkung transportiert werden, wenn ein Kontaktabschnitt des trockenen saugfähigen Trägers mit der flüssigen Probe, die die Ziel-Nukleinsäuresequenzen enthält, in Kontakt steht, mindestens ein Nukleinsäure-Einfangreagenz, einschließlich Nukleinsäuresonden- Sequenzen zum Einfangen der Ziel-Nukleinsäuresequenzen durch Hybridisierung, und wobei das mindestens eine Nukleinsäure-Emfangreagenz in einer Einfangzone auf dem trockenen saugfähigen Träger stromabwärts des Kontaktabschnittes des saugfähigen Trägers gebunden ist, und eine Vorrichtung zum Nachweisen der eingefangenen Ziel-Nukleinsäuresequenzen.
Nach einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform umfaßt die Nachweisvorrichtung einen saugfähigen Träger, auf dem Zielmoleküle, die einen an ein signalerzeugendes Reagenz bindenden Liganden tragen, immobilisiert sind, und eine Vorrichtung zum Kontaktieren der Zielmoleküle, die den Liganden mit dem signalerzeugenden Reagenz tragen, damit ein empfindliches Signal erzeugt wird, das den Nachweis der Zielmoleküle anzeigt.
Nach einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform umfaßt die Nachweisvorrichtung einen saugfähigen Träger, auf dem Zielmoleküle, die einen an ein signalerzeugendes Reagenz bindenden Liganden tragen, immobilisiert sind, und eine Vorrichtung zum Kontaktieren der Zielmoleküle, die den Liganden mit dem signalerzeugenden Reagenz tragen, das mit einem farbentwickelnden Reagenz reagiert, damit ein empfindliches Signal erzeugt wird, das den Nachweis der Zielmoleküle anzeigt.
Nach einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform sind die Ziel- Nukleinsäuresequenzen das Produkt einer enzymatischen Amplifizierungsreaktion und enthalten mindestens ein Paar Oligonukleotidprimer.
Nach einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform enthalten die Nichtziel-Oligonukleotide Oligonukleotidprimer, die nicht in den Ziel-Nukleinsäuresequenzen enthalten sind.
Nach einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform umfassen die mindestens zwei Primersätze Primer für eine Polymerasekettenreaktion (PCR).
Nach einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform umfaßt das mindestens eine Primerpaar Primer für eine Ligasekettenreaktion (LCR).
Nach einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform enthält ein zweiter Primer des mindestens einen Oligonukleotidprimerpaars einen Liganden, der an das mindestens eine Einfangreagenz bindet, wodurch die Zielmoleküle, die den Liganden enthalten, an das mindestens eine Einfangreagenz gebunden werden können.
Nach einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform enthält der Ligand, der an das mindestens eine Einfangreagenz bindet, ein Antigenepitop.
Nach einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform enthält der Ligand, der an das mindestens eine Einfangreagenz bindet, mindestens ein sulfoniertes Cytosin.
Nach einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform enthält ein erster Primer des mindestens einen Primerpaars einen Liganden, der an ein signalerzeugendes Reagenz bindet, wodurch die Zielmoleküle, die den Liganden enthalten, durch das Vorliegen eines Signals nachgewiesen werden können, das durch das signalerzeugende Reagenz erzeugt wird.
Nach einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform enthält der erste Primer des mindestens einen Primerpaars einen Liganden, der an ein signalerzeugendes Reagenz bindet, wodurch die Zielmoleküle, die den Liganden enthalten, durch das Vorliegen eines Signals nachgewiesen werden können, das durch das signalerzeugende Reagenz nach Kontaktieren eines signalentwikkelnden Reagenz erzeugt wird.
Nach einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform enthält der Ligand, der an das signalerzeugende Reagenz bindet, biotinylierte Nukleotidsequenzen.
Nach einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform umfaßt das signalerzeugende Reagenz Streptavidin, das an farbige Latexperlen gebunden ist.
Nach einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform umfaßt das Signal, das von dem signalerzeugenden Reagenz nach Kontaktieren des signalentwickelnden Reagenzes erzeugt wurde, ein Streptavidin-alkalische Phosphatase-Konjugat.
Nach einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform enthält der erste Teil von Löchern auch das signalerzeugende Reagenz.
Nach einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform umfaßt die Vielzahl von Löchern zusätzlich einen zweiten Teil von Löchern, die eine Waschlösung enthalten.
Nach einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform umfaßt die Vielzahl von Löchern auch einen dritten Teil von Löchern, die eine Lösung des signalentwickelnden Reagenzes enthalten.
Nach einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform umfaßt der trockene saugfähige Träger mindestens einen Streifen.
Nach einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform umfaßt die Vielzahl von Löchern einen ersten Teil von Löchern mit einer Probe, die auf die Ziel-Nukleinsäuresequenzen untersucht werden soll.
Nach einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform umfaßt die Vielzahl von Löchern zusätzlich einen zweiten Teil von Löchern mit dem signalerzeugenden Reagenz.
Nach einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform umfaßt die Vielzahl von Löchern zusätzlich einen dritten Teil von Löchern mit einer Waschlösung.
Nach einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform umfaßt die Vielzahl von Löchern zusätzlich einen vierten Teil von Löchern mit einem signalentwickelnden Reagenz.
Nach einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform sind alle Löcher des ersten Teils von Löchern so eingerichtet, daß sie den Kontaktabschnitt jedes Streifens empfangen, so daß die Zielmoleküle zu der mindestens einen Einfangzone, wo sie eingefangen werden, transportiert werden können.
Nach einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform sind alle Löcher des zweiten Teils von Löchern so eingerichtet, daß sie den Kontaktabschnitt jedes Streifens empfangen, so daß der Streifen gewaschen wird und unspezifisch eingefangene Verbindungen nach dem Binden der Zielmoleküle in dem mindestens einen Einfangzone entfernt werden.
Nach einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform sind alle Löcher des dritten Teils von Löchern so eingerichtet, daß sie einen vollständigen Streifen empfangen.
Nach einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform umfaßt die Vorrichtung zum Kontaktieren mindestens ein Loch des dritten Teils von Löchern mit einer Lösung des signalerzeugenden Reagenzes und mindestens einen Streifen nach Binden der Zielnukleinsäure in der mindestens einen Einfangzone, wobei der vollständige Streifen die Lösung des signalentwickelnden Reagenzes kontaktiert, sodaß das signalentwickelnde Reagenz die mindestens eine Einfangzone kontaktieren kann.
Nach einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform sind alle Löcher des ersten Teils von Löchern so eingerichtet, daß sie den Kontaktabschnitt jedes Streifens empfangen, sodaß die Ziel-Nukleinsäuresequenzen zu der mindestens einen Einfangzone, wo sie eingefangen werden, transportiert werden können.
Nach einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform sind alle Löcher des zweiten Teils von Löchern so eingerichtet, daß sie den Kontaktabschnitt jedes Streifens empfangen, sodaß das signalerzeugende Reagenz zu der mindestens einen Einfangzone, wo das signalerzeugende Reagenz an den auf den Ziel-Nukleinsäuresequenzen befindlichen Liganden gebunden wird, transportiert werden kann.
Nach einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform sind alle Löcher des dritten Teils von Löchern so eingerichtet, daß sie den Kontaktabschnitt jedes Streifens empfangen, so daß der Streifen gewaschen wird und unspezifisch eingefangene Verbindungen nach Binden der Ziel- Nukleinsäuresequenzen in der mindestens einen Einfangzone entfernt werden.
Nach einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform umfaßt die Vorrichtung zum Kontaktieren mindestens ein Loch des vierten Teils von Löchern mit einem signalentwickelnden Reagenz und mindestens einen Streifen nach Bindung der Ziel-Nukleinsäuresequenzen in der mindestens einen Einfangzone, wobei der vollständige Streifen die Lösung des signalentwickelnden Reagenzes kontaktiert, sodaß das signalentwickelnde Reagenz mindestens eine Einfangzone kontaktieren kann.
Nach einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform sind alle Löcher des vierten Teils von Löchern so eingerichtet, daß sie einen vollständigen Streifen empfangen.
Nach der vorliegenden Erfindung wird ebenfalls ein Verfahren zum Nachweis einer spezifischen Nukleinsäuresequenz bereitgestellt, umfassend die Schritte: Amplifizieren mindestens eines Abschnitts einer ursprünglichen Nukleinsäuresequenz durch eine enzymatische Reaktion, sodaß Zielmoleküle erzeugt werden, wie u.a. Nukleinsäuresequenzen, die für mindestens einen Abschnitt der ursprünglichen Nukleinsäuresequenz spezifisch sind, Trennen der Zielmoleküle von Nichtziel- Nukleotiden und -Oligonukleotiden, umfassend die Schritte: Bereitstellen eines Behälters mit einem Substrat, das die Nichtziel-Nukleotide und -Oligonukleotide bindet, Zugeben einer flüssigen Probe, die die Zielmoleküle und die Nichtziel-Nukleotide und -Oligonukleotide enthält, und Transportiern der Zielmoleküle durch Kapillarwirkung, Konzentrieren der Zielmoleküle, umfassend die Schritte: Bereitstellen eines trockenen saugfähigen Trägers, wobei die Zielmoleküle in dem saugfähigen Träger durch Kapillarwirkung transportiert werden, wenn ein Abschnitt des trockenen saugfähigen Trägers mit der flüssigen Probe, die die Zielmoleküle enthält, in Kontakt tritt, In-Kontakt-bringen eines Abschnittes des trockenen saugfähigen Trägers mit der flüssigen Probe, die die Ziel-Nukleinsäuresequenzen enthält, wobei der trockene saugfähige Träger, wenn er benetzt ist, einen Flüssigkeitstransportweg vorgibt und den Transport der Zielmoleküle fördert, Transportieren der Zielmoleküle über den Flüssigkeitstransportweg, und Einfangen der Zielmoleküle mit mindestens einem Einfangreagenz, das in mindestens einer Einfangzone auf dem trockenen saugfähigen Träger stromabwärts des Abschnittes des saugfähigen Trägers, der mit der flüssigen Probe in Kontakt steht, gebunden ist, und Nachweisen der Zielmoleküle durch Kontaktieren der Zielmoleküle, die einen Liganden tragen, der an ein signalerzeugendes Reagenz bindet, und die an einem saugfähigen Träger gebunden sind, mit einem signalerzeugenden Reagenz, damit ein empfindliches Signal erzeugt wird.
Nach der vorliegenden Erfindung wird auch ein Verfahren zum Nachweis einer spezifischen Nukleinsäuresequenz bereitgestellt, umfassend die Schritte:
Amplifizieren mindestens eines Abschnitts einer ursprünglichen Nukleinsäuresequenz durch eine enzymatische Reaktion, sodaß Ziel-Nukleinsäuresequenzen erzeugt werden, die für den mindestens einen Abschnitt der ursprünglichen Nukleinsäuresequenz spezifisch sind, Bereitstellen einer flüssigen Probe, die die Ziel-Nukleinsäuresequenzen enthält, Transportieren der Ziel-Nukleinsäuresequenzen durch Kapillarwirkung, Konzentrieren der Ziel-Nukleinsäuresequenzen, umfassend die Schritte: Bereitstellen eines trockenen saugfähigen Trägers, wobei die Ziel-Nukleinsäuresequenzen in dem saugfähigen Träger durch Kapillarwirkung transportiert werden, wenn ein Abschnitt des trockenen saugfähigen Trägers die flüssige Probe mit den Ziel-Nukleinsäuresequenzen kontaktiert, Kontaktieren eines Abschnittes des trockenen saugfähigen Trägers mit der flüssigen Probe, die die Ziel- Nukleinsäuresequenzen enthält, wobei der trockene saugfähige Träger, wenn er benetzt ist, einen Flüssigkeitstransportweg vorgibt, der den Transport der Ziel-Nukleinsäuresequenzen fördert, und Transportieren der Ziel-Nukleinsäuresequenzen über den Flüssigkeitstransportweg, Einfangen der Ziel- Nukleinsäuresequenzen mit mindestens einem Nukleinsäure-Einfangreagenz, das in mindestens einer Einfangzone auf dem trockenen saugfähigen Träger stromabwärts des Abschnittes des saugfähigen Trägers, der mit der flüssigen Probe in Kontakt steht, gebunden ist, und Nachweisen der Ziel- Nukleinsäuresequenzen durch Kontaktieren der Ziel-Nukleinsäuresequenzen, die einen Liganden tragen, der an ein signalerzeugendes Reagenz bindet, und die an einem saugfähigen Träger gebunden sind, mit einem signalentwickelnden Reagenz, damit ein empfindliches Signal erzeugt wird.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Die vorliegende Erfindung läßt sich an der folgenden detaillierten Beschreibung und den begleitenden Zeichnungen besser verstehen und einschätzen. Es zeigt:
Fig. 1 eine zeichnerische Vorderansicht der Vorrichtung zur Trennung der Ziel- Nukleinsäuresequenzen von Nichtziel-Nukleotiden und -Oligonukleotiden in einer flüssigen Probe, Konzentrierung der Ziel-Nukleinsäuresequenzen und zum Nachweis der konzentrierten Ziel- Nukleinsäuresequenzen, die nach der vorliegenden Erfindung konstruiert und funktionsfähig ist und vor Gebrauch gezeigt ist;
Fig. 2 eine zeichnerische Vorderansicht der Vorrichtung von Fig. 1, die während des Gebrauchs gezeigt ist;
Fig. 3 eine zeichnerische Vorderansicht einer alternativen Ausführungsform der Vorrichtung der Fig. 1, die vor Gebrauch gezeigt ist;
Fig. 4 eine zeichnerische Vorderansicht der Vorrichtung der Fig. 3, die während des Gebrauchs gezeigt ist.

GENAUE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Nun wird auf die Figuren 1-4 Bezug genommen, die die Vorrichtung 10 zur Trennung von Zielmolekülen, einschließlich Ziel-Nukleinsäuresequenzen, von Nichtziel-Nukleotiden und -Oligonukleotiden in einer flüssigen Probe, zur Konzentrierung der Zielmoleküle, und zum Nachweis der konzentrierten Zielmoleküle veranschaulichen, die gemäß einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform konstuiert und funktionsfähig ist.
Die Vorrichtung 10 umfaßt eine Behältervorrichtung 12, die aus einem nichtporösen Material wie Polystyrol besteht und ein oder mehr einer Vielzahl von Löchern, bspw. die Löcher 14, 16 und 18, enthält. Die Löcher, bspw. die Löcher 14, 16 und 18, sind etwa 1 cm lang, 0,5 cm breit und 2,5 cm tief. Sie sind derart gestaltet, daß sie einen Kontaktabschnitt 20 eines Streifens 22 empfangen.
Der Streifen 22 umfaßt einen saugfähigen Träger 24, der gewöhnlich aus einer mylerisierten Nitrocellulosemembran von etwa 3,0 cm Länge und 0,5 cm Breite und mit einer Porengröße von 3-5 µ besteht. Er kann von einem Stützrahmen 26 umrahmt sein. Der Stützrahmen 26 besteht aus einem nichtporösen Material wie Polystyrol. Der saugfähige Träger 24 kann in Rahmen 26 durch beliebige herkömmliche Mittel wie Klebeverbindungen befestigt werden. Ein absorbierendes Kissen 27 von etwa 2 cm Länge und 0,5 cm Breite, hergestellt aus einem absorbierenden Material wie Whatman 3 MM Papier (kommerziell erhältlich von Whatman, Maidstone, GB) ist am Ende des Streifens 22 gegenüber dem Kontaktabschnitt 20 durch beliebige herkömmliche Mittel wie Klebeverbindungen befestigt. Das Ende des Streifens 22 ist auch an einem Griff 28 durch beliebige herkömmliche Mittel wie Klebeverbindungen befestigt. Der Griff 28 besteht aus einem nichtporösen Material wie Polystyrol. Mindestens ein Streifen 22 ist an dem Griff 28 befestigt und bildet so ein Testelement 30.
Ein einziges Einfangreagenz ist gewöhnlich an dem saugfähigen Träger 24 in dessen Mittelbereich gebunden, so daß eine Einfangzone 32 gebildet wird. Obwohl gewöhnlich ein einzelnes Einfangreagenz eingesetzt wird, können mehrere Einfangreagenzien verwendet werden, so daß Mehrfach- Einfangzonen auf einem einzigen saugfähigen Träger gebildet werden.
Das einzelne Einfangreagenz, gewöhnlich ein anti-sulfonierte-DNA-Antikörper oder eine Nukleinsäure, die zu mindestens einem Abschnitt der Ziel-Nukleinsäuresequenz komplementär ist, ist gewöhnlich durch Absorption auf der Nitrocellulosemambran gebunden.
Die Löcher 14 enthalten gewöhnlich ein Reaktionsgemisch für die enzymatische Amplifizierung. Ist das Einfangreagenz ein anti-sulfonierte-DNA-Antikörper, enthalten die Löcher 14 gewöhnlich außerdem noch Gelfiltrationspartikel (nicht gezeigt), gewöhnlich Gelfiltrationspartikel vom Typ Sephadex G-100 Pharmacia, Uppsala, Schweden). Die Gelfiltrationspartikel sind zu groß gestaltet, um durch Kapillarwirkung in dem saugfähigen Träger 24 transportiert zu werden.
Das Verfahren, mit dem spezifische Nukleinsäuresequenzen unter Verwendung der Vorrichtung 10 nachgewiesen werden, umfaßt gewöhnlich die enzymatische Amplifizierung der spezifischen Nukleinsäuresequenz mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) oder der Ligase-Kettenreaktion (LCR), die zumindest ein Primerpaar einsetzen. Mindestens ein erster Primer des mindestens einen Primerpaars dieser Reaktionen trägt einen Affinitätsliganden, gewöhnlich Biotin, der an ein signalerzeugendes Reagenz, gewöhnlich ein Streptavidin-alkalische Phosphatase-Konjugat bindet. Ist das Einfangreagenz ein anti-sulfonierte-DNA-Antikörper, trägt mindestens ein zweiter Primer des mindestens einen Primerpaars für die enzymatische Amplifizierung einen Affinitätsliganden, gewöhnlich ein sulfoniertes Cytosin, das von dem Einfangreagenz der Einfangzone 32 gebunden wird. Nach einer Reihe von Amplifizierungszyklen, gewöhnlich zwischen 1 und 50 Zyklen, wird ein Aliquot eines Reaktionsgemisches mit der Vorrichtung 10 untersucht.
Ist das Einfangreagenz ein anti-sulfonierte-DNA-Antikörper, wird ein Aliquot des Reaktionsgemisches, das die Ziel-Nukleinsäuresequenzen, die Oligonukleotidprimer und die Nukleotide enthält, gewöhnlich zwischen 1 und 20 µl, in Loch 14 gegeben. Etwa 30 µl einer Lösung, die ein signalerzeugendes Reagenz, gewöhnlich Streptavidin-alkalische Phosphatase-Konjugat in einem TPG-Laufpuffer (0,3 % Tween 20 und 1% Gelatine in PBS), enthält, wird auch in Loch 14 gegeben. Der Kontaktabschnitt 20 des Streifens 22 wird in Loch 14 in Kontakt mit dem Reaktionsgemisch gebracht. Das Reaktionsgemisch, das die Zielmoleküle einschließlich der Nukleinsäuresequenzen enthält, wird durch den saugfähigen Träger 24 durch Kapillartransport über die Einfangzone 32 hinaus, wo die Zielmoleküle durch das Einfangreagenz eingefangen werden, zu dem absorbierenden Kissen 27 befördert.
Nach etwa 10 Minuten sind die meisten Moleküle, die markierte Nukleinsäuren enthalten (gewöhnlich mehr als 80% der markierten Moleküle), in der Einfangzone 32 eingefangen. Der Kontaktabschnitt 20 des Streifens 22 wird dann aus dem Loch 14 entfernt und in Loch 16 untergebracht.
Das Loch 16 enthält gewöhnlich etwa 50 µl TP-Puffer (0,3% Tween in PBS), der durch den saugfähigen Träger24 zu der Einfangzone befördert wird, damit unspezifisch eingefangene Verbindungen, die den Nachweis der Ziel-Nukleinsäuresequenz stören können, entfernt werden. Nach etwa 10 Minuten wird der Streifen 22 aus Loch 16 entfernt und in Loch 18 getaucht.
Das Loch 18 enthält etwa 300 µl Lösung des signalentwickelnden Reagenzes, gewöhnlich eine Chemiprobe -Lösung, die das chromogene Substrat BCIP/NBT (kommerziell erhältlich von Orgenics Ltd., Yavne Israel), enthält. Diese Lösung bedeckt die Einfangzone 32. Das signalerzeugende Reagenz, alkalische Phosphatase, das an die markierten Moleküle in der Einfangzone 32 gebunden ist, wandelt das chromogene Substrat dann in eine fällbare Farbe um. Diese ist ein empfindliches Signal, das den Nachweis der Ziel-Nukleinsäuresequenzen anzeigt.
Ist das Einfangreagenz eine Nukleinsäure, die zu mindestens einem Teil der Ziel-Nukleinsäuresequenz komplementär ist, wird ein Aliquot des Reaktionsgemisches gewöhnlich mit einer Hybridisierungslösung verdünnt, die gewöhnlich aus 0,6 M NaCl, 20 mM Phosphatpuffer, pH-Wert 7,5, 0,02% Ficoll 400 (Sigma, St. Louis, MO, USA), 0,02% Gelatine und 1% PVP besteht. Die Probe wird dann gewöhnlich gekocht und sofort gekühlt. Ein Aliquot jeder Lösung wird in die Löcher 14 der Vorrichtung 12 überführt. Der Kontaktabschnitt 20 jedes Streifens 22 wird dann gewöhnlich mit der Lösung in den Löchern 14 in Kontakt gebracht.
Die Vorrichtung 10 wird dann gewöhnlich etwa 25 Minuten in einem Feuchtinkubator untergebracht. Die Lösung läßt man durch die Nitrocellulosestreifen wandern, die den saugfähigen Träger 24 bilden. Die Lösung mit den Zielmolekülen, einschließlich der Nukleinsäuresequenzen, wird durch den saugfähigen Träger 24 durch Kapillartransport zu dem absorbierenden Kissen 27 über die Einfangzone 32 hinaus befördert, wo die Zielmoleküle von der Nukleinsäure, die zu der Ziel- Nukleinsäuresequenz komplementär ist, eingefangen werden.
Die Streifen 22 werden dann gewöhnlich in die Löcher 16 überführt, die Streptavidin- alkalische Phosphatase-Konjugat enthalten. Dann werden die Streifen 22 gewöhnlich in die Löcher 18 überführt, die eine Lösung aus 150 µl 0,3% Tween 20 in PBS enthalten. Der Kontaktabschnitt 20 des Streifens 22 wird mit der Lösung etwa 15 Minuten in Kontakt gebracht.
Schließlich werden die Streifen 22 dann gewöhnlich vollständig in eine ChemiProbe - BCIP/NBT-Lösung in einem in den Figuren nicht gezeigten Löchersatz etwa 20 Minuten eingetaucht, sodaß ein Substrat für eine chromogene Reaktion bereitgestellt wird. Ein blaues Signal in der Einfangzone 32 des Streifens 22 zeigt das Vorliegen der Zielmoleküle.
Wie aus den Figuren 3 und 4 ersichtlich ist, kann mehr als ein Streifen 22 an dem Griff 28 befestigt sein, so daß mehr als ein Test gleichzeitig ausgeführt werden kann.
Nachstehend wird auf die Beispiele Bezug genommen, die zusammen mit den Figuren 1-4 die Erfindung veranschaulichen.

BEISPIEL 1

TRANSPORT UND KONZENTRIERUNG VON DNA AUF NITROCELLULOSE

a) Sequenz-Synthese und Markieren von Primern

Die Primer wurden aus dem HIV-1-Gen ausgewählt und hatten folgende Sequenzen: Primer
Die Primer wurden mit einem DNA-Synthesegerät 380A von Applied Biosystems (Applied Biosystems, Hayward, CA, USA) synthetisiert und unter Verwendung von OPC-Schnellreinigungs- Kartuschen (Applied Biosystems, CA, USA) gereinigt.

Primer-Sulfonierung

Der Primer 3' wurde mit einem Polycytosin-13mer-Schwanz am 5'-Ende synthetisiert. Dieser Primer wurde dann nach dem in dem ChemiProbe -Kit (kommerziell erhältlich von Orgenics Ltd.) beschriebenen Protokoll sulfoniert.
Es wurden 100 µl des C-Schwanz-Primers (0,5 mg/ml) mit 50 µl Lösung A des ChemiProbe -Kits (4 M Natriumbisulfit) und 12,5 µl Lösung B des ChemiProbe -Kits (1 M Methoxyamin) gemischt und über Nacht bei 20ºC inkubiert. Die sulfonierten Oligonukleotide wurden dann durch Zentrifugieren durch ein 2-ml-Bett einer Sephadex -G-50-Zentrifugiersäule entsalzt.

Primer-Biotinylierung

Der Primer 4 wurde am 5'-Ende mit einem Polycytosin-12mer synthetisiert, bei dem 4 Cytosinnukleotide durch N&sup4;-LCA-5-Methyldesoxycytidin (American Bionetics, Hayward, CA, USA) wie folgt ersetzt worden waren:CCCCCCCCCCCC, wobei C das modifizierte Cytosin anzeigt. Diese Oligonukleotide wurden über Acrylamidgel nach den von Maniatis, T. et al., Molecular cloning: a laboratory manual, 1989, S. 646, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. beschriebenen Verfahren gereinigt. Deren Lehren sind hier durch Bezugnahme aufgenommen.
Die gereinigten Oligonukleotide wurden dann nach folgendem Verfahren biotinyliert:
Es wurden 10 nMol getrocknete Primer in 50 µl 100 mM Boratpuffer gelöst und zu 50 µl Dimethylformamid (DMF), das 0,1 mg Biotin-N-Hydroxysuccinimid (Pierce, Rockford, Ill., USA) enthielt, gegeben. Diese Lösung wurde dann über Nacht bei 20 ºC inkubiert und dann durch eine Nensorb-20-Säule (Du Pont Company, Wilmington, DE, USA) nach den Angaben des Herstellers gereinigt. Die Primer wurden dann durch Verdampfen konzentriert und in Wasser auf die ursprüngliche Konzentration resuspendiert.

b) Amplifizierung der HIV-Sequenz

Es wurden 100 µl eines Gemisches mit 1 µg extrahierter DNA einer positiven HIV-Probe (Extraktionsverfahren nach Edwards et al., The Journal of Pediatrics, 1989, Bd. 45, S. 200-203), deren Lehren hier durch Bezugnahme aufgenommen sind, 100 pMol jedes Primers P3 und P4, 0,25 mM der vier Desoxynukleotidtriphosphate (dNTP), 10 µl 10fach-Taq-Puffer (Promega, Madison, Wisconsin, USA) und 2,5 E Taq-Polymerase (Promega) unter folgenden Bedingungen in einem programmierbaren Wasserbad von Grant (Cambridge, UK) amplifiziert.
Nach einem ersten DNA-Denaturierungsschritt während 5 Minuten bei 94ºC folgten 30 Zyklen Denaturieren bei 94ºC während 1 Minute, DNA-Annealing bei 52ºC während 1 Minute und DNA-Verlängerung bei 72ºC während 1 Minute. Die Amplifizierung wurde mit einem siebenminütigen Verlängerungsschritt bei 72ºC beendet.
Eine zweite Amplifizierung über 20 Zyklen wurde unter den gleichen Bedingungen wie bei der ersten Amplifizierung durchgeführt, wobei jedoch die oben beschriebenen markierten biotinylierten und sulfonierten Primer verwendet wurden. Die eingesetzte DNA-Matrize war 1 µl des ersten PCR- Gemisches, verdünnt in 100 µl eines Gemisches, das 100 pMol jedes markierten Primers, 0,25 mM der vier Desoxynukleotidtriphosphate, 10 µl 10fach-Taq-Puffer (Promega) und 2,5 E Taq-Polymerase (Promega) enthielt. Die Primer wurden aus dem PCR-Produkt entfernt, indem 100 µl des Reaktionsgemisches mit 60 µl Polyethylenglykol (PEG) 4000 (Sigma, St. Louis, MO, USA) in 2,5 M NaCl- Lösung gemischt wurden. Dieses Gemisch wurde dann ein Stunde bei 4ºC inkubiert. Nach zehnminütigem Zentrifugieren bei 10000 x g bei 4ºC wurde dann der Überstand verworfen. Das Pellet wurde in 100 µl Wasser resuspendiert.

c) Herstellung von rückseitig verstärkten Nitrocellulose-Streifen

1. Mylerisierte Nitrocellulose (Porengröße 3 µ) (Schleicher & Schuell, Dassel, Deutschland) wurde in Streifen von 0,5 x 3,0 cm geschnitten, die den saugfähigen Träger 24 der Vorrichtung der Figuren 1-4 bildeten. Die saugfähigen Träger 24 bildeten die Streifen 22. Ein Mikroliter gereinigter monoklonaler anti-modifizierte-DNA-Antikörper aus Maus (2 mg/ml), kommerziell erhältlich bei Orgenics Ltd., Katalog-Nr. 10793010, angereichert mit 1% Saccharose in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) wurde in die Mitte der Nitrocellulosestreifen in einer waagrechten Linie eingebettet, um die Einfangzone 32 zu bilden. Die Streifen wurden dann 1 Stunde bei 37ºC luftgetrocknet.
Freie Absorptionsstellen wurden dann blockiert, indem die Streifen 2 Stunden in einer Lösung aus 1% Gelatine (Norland Products Inc., New Brunswick, Canada) und 0,05 % Tween 20 (Sigma) in PBS inkubiert wurden.. Die Nitrocellulosestreifen wurden dann kurz in Wasser gewaschen, eine Stunde in einem Inkubator bei 37ºC getrocknet und mindestens vier Monate unter Trocknung aufbewahrt. Ein Viereck aus 0,5 x 2 cm Whatman 3MM-Papier wurde an dem Streifen oben befestigt und diente als absorbierendes Kissen 27.
2. Mylerisierte Nitrocellulose-Längsstreifen wurden wie oben, jedoch ohne Blockierungsschritt hergestellt.

d) Transport und Konzentrierung der DNA

Das PCR-Reaktionsgemisch wurde entweder in TGP-Laufpuffer (0,30% Tween 20 und 1% Gelatine in PBS) oder in PBS zehnfach verdünnt. Dann wurden 30 µl jeder Lösung in Löcher überführt, die den Löchern der in den Figuren 1-4 gezeigten Vorrichtung 12 ähnelten. Der Kontaktabschnitt 20 aller Streifen 22 wurde mit den Lösungen in Kontakt gebracht.
Man ließ die Lösung durch die Nitrozelleulosestreifen, die den saugfähigen Träger 24 bildeten, 10 Minuten bei Raumtemperatur wandern. Die Streifen 22 wurden dann vollständig mit einer 1:2500 verdünnten Lösung aus Streptavidin-alkalische Phosphatase-Konjugat (Enzymatix, Cambridge, GB) bedeckt. Nach einer zehnminütigen Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Streifen dann kurz mit Wasser gewaschen und mit BCIP/NBT-ChemiProbe -Lösung (Orgenics Ltd.) bedeckt. Nach 5 Minuten wurden die Streifen kurz mit Wasser gewaschen und untersucht. Die Farbe wurde dann durch kurzes Waschen in Ethanol stabilisiert und dann bei Raumtemperatur getrocknet. Ein Streifen 22 wurde dann als positiv für HIV angesehen, wenn eine purpurne Linie in der Einfangzone auftrat.
Der Lauf des HIV-Produktes aus der PCR-Amplifizierung auf Nitrocellulosestreifen mit PBS als Puffer ergab keine positive Reaktion, wenn die Absorptionsstellen der Nitrocellulosestreifen nicht blockiert waren. Die Streifen 22, bei denen die freien Absorptionsstellen der Nitrocellulose durch Gelatinelösung blockiert waren, erzeugten jedoch ein sichtbares Signal, wenn PBS als Laufpuffer verwendet wurde. Außerdem erzeugten die Streifen 22, bei denen die Absorptionsstellen vor ihrem Kontakt mit den PCR-Reaktionsgemisch-Lösungen nicht blockiert waren, ein sichtbares Signal, wenn der TGP-Laufpuffer verwendet wurde. Das stärkste Signal wurde erhalten, wenn sowohl ein blockierter Streifen als auch der TGP-Laufpuffer verwendet wurden.
Diese Ergebnisse zeigen, daß amplifizierte Nukleinsäuresequenzen durch Kapillarbewegung durch Nitrocellulosestreifen wandern können, bei denen die Absorptionsstellen der Nitrocellulose entweder vor oder während des Kapillartransportes der Nukleinsäuresequenzen blockiert sind. Außerdem zeigen diese Ergebnisse auch, daß amplifizierte DNA in einer Lösung konzentriert werden kann, indem blockierte Nitrocellulosestreifen an einer Kontaktstelle mit einer Lösung in Kontakt gebracht wird, die amplifizierte DNA enthält, und die amplifizierte DNA an einer geeigneten Einfangstelle auf dem Nitrocellulosestreifen stromabwärts der Kontaktstelle eingefangen wird.

BEISPIEL 2

TRANSPORT UND KONZENTRIERUNG VON GENOMISCHER UND PLASMID-DNA AUF NITROCELLULOSE

Menschliche Plazenta-DNA (Sigma), DNA aus CasKi-Zellen und Bluescript-Plasmid-DNA wurden wie von Nur et al. (Ann. Biol. Clin., 1989, 47, 601-606) beschrieben präpariert und sulfoniert, wobei jedes DNA-Molekül aus CasKi-Zellen oder menschlicher Placenta etwa 10¹&sup5; Basenpaare besitzt. HIV-spezifische PCR-Produkte wurden mit einem sulfonierten Primer und einem anderen biotinylierten Primer amplifiziert, wobei die PCR-Produkte wie in Beispiel 1 beschrieben zweifach markiert wurden. Die Nitrocellulosestreifen 22 mit den blockierten Absorptionsstellen wurden auch wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt.
Ein µl einer 20 µl/ml-Lösung jeder der drei DNA-Typen (entweder sulfoniert oder unsulfoniert) wurde zu 20 µl TGP-Laufpuffer gegeben. Die DNA-Lösung wurde in Löcher überführt, und der Kontaktabschnitt 20 der Streifen 22 mit dieser Lösung in Kontakt gebracht. Nach 10 Minuten wurden die Streifen aus der DNA-Lösung entfernt und in andere Löcher überführt, wo der Kontaktabschnitt 20 der Streifen 22 mit doppelt markiertem PCR-Produkt (1:20 Verdünnung der HIV-PCR-Reaktionsgemischlösung aus Beispiel 1) und Streptavidin-alkalische Phosphatase-Konjugat (Enzymatix, Cambridge, GB), 1:2500 in TGP-Laufpuffer verdünnt, in Kontakt gebracht wurde. Nach zehnminütigem Kontakt mit dem doppelt markierten DNA-Produkt wurden die Streifen 22 10 Minuten gewaschen, indem der Kontaktabschnitt der Streifen 22 mit einer Waschlösung aus TGP-Puffer in Kontakt gebracht wurde. Schließlich wurden die Streifen 22 in eine ChemiProbe -BCIP/NBT-Lösung (kommerziell vonOrgenics Ltd. erhältlich) während einer Inkubationsdauer von 5 Minuten wie in Beispiel 1 beschrieben eingetaucht.
Man fand, daß alle drei DNA-Typen, Plazenta-DNA, DNA aus CasKi-Zellen und Bluescript- Plasmid-DNA, wenn sie sulfoniert waren, die Entwicklung eines sichtbaren Signals in der Einfangzone 32 vollständig hemmten. Im Gegensatz zu diesen Ergebnissen konnten Lösungen mit der gleichen, jedoch unsulfonierten DNA das Signal nicht hemmen. Diese Ergebnisse zeigen, daß sowohl genomische als auch Plasmid-DNA durch Kapillarbewegung einer Flüssigkeit durch einen Nitrocelluloseträger transportiert werden kann, und daß diese DNA an einer geeigneten Einfangstelle auf dem Nitrocellulosestreifen konzentriert werden kann.
Die vorstehenden Ergebnisse weisen auch darauf hin, daß die Gegenwart von Ziel-DNA in einer Probe durch Verringerung eines Signals, das durch das doppelt markierte PCR-Produkt erzeugt wird, nachgewiesen werden kann, wenn die Ziel-DNA sulfoniert ist und an die Einfangzone 32 vor dem Einfangen der doppelt markierten DNA wie oben beschrieben gebunden ist.

BEISPIEL 3

VERGLEICH DER NACHWEIS-SYSTEME

Die Primer wurden aus dem E6-Gen des HPV-Genoms ausgewählt. Es waren die in der israelischen Patentanmeldung Nr. 097226, deren Lehren hier durch Bezugnahme aufgenommen sind, beschriebenen Konsensusprimer für HPV 16, HPV 18 und HPV 33. Diese Primer hatten die folgenden Sequenzen: Primer
Die Primersynthese und das Markierungsverfahren wurde in Beispiel 1 beschrieben. Nach diesen Verfahren wurde der Primer h1 sulfoniert und Primer h2 biotinyliert.

Amplifizierung und Markierung der HPV-DNA-Sequenz

100 µl Reaktionsgemisch enthielten 100 pMol markierte oder unmarkierte Primer, 1 µg DNA, die nach den Anweisungen des HybriComp -HPV-Kits (kommerziell von Orgenics Ltd. erhältlich) aus Cervix-Biopsien extrahiert wurde, 0,25 mM Desoxynukleotidtriphosphat (dNTP), 10 µl 10fach Taq-Puffer (kommerziell erhältlich von Promega) und 2,5 Einheiten Taq-Polymerase (kommerziell erhältlich von Promega). Der periodische Temperaturenwechsel des Gemisches erfolgte in einem programmierbaren Wasserbad von Grant.
Ein erster PCR-Schritt erfolgte mit den unmarkierten Primern. Jeder Amplifizierungszyklus bestand aus: DNA-Denaturierung während 1 Minute bei 94ºC, Annealingschritt während 1 Minute bei 55ºC und DNA-Verlängerungsschritt während 1 Minute bei 72ºC. Die Amplifizierungsreaktion wurde durch fünfminütige Verlängerung bei 72ºC nach 20 Zyklen beendet. Ein zweiter PCR-Schritt mit markierten Primern erfolgte nach dem folgenden Verfahren: Ein µl des ersten Reaktionsgemisches wurde zu jedem von sechs Wiederholungsansätzen gegeben. Diese enthielten 100 µl eines zu dem aus der ersten PCR-Reaktion identischen Reaktionsgemisches (ausgenommen, daß markierte Primer statt unmarkierte Primer verwendet wurden). Jeder Wiederholungsansatz wurde während entweder 0, 10, 20, 25 oder 30 Zyklen amplifiziert und dann bei 4ºC aufbewahrt.

Nachweis des PCR-Produktes

1. Nachweis mit Ethidiumbromid - EtdBr.

Nach der Amplifizierung wurden 10 µl des PCR-Gemisches auf einem 8%igen nicht- denaturierenden (TAE)-Tris-Essigsäure-Puffer-Polyacrylamidgel 1 Stunde bei 50 mA elektrophoritisch aufgetrennt. Die Gele wurden 15 Min. in 10µg/l Ethidiumbromid (EtdBr) eingetaucht. Die DNA wurde mit UV-Licht sichtbar gemacht.

2. Nachweis durch Southern-Blot.

Nach elektrophoretischer Auftrennung wurden die gewanderten PCR-Fragmente auf Hybond- N-Membran (kommerziell erhältlich von Amersham, Bucks, GB) mit TAE-Puffer als Transferpuffer in einer Trans-Blot-Zelle (kommerziell erhältlich von Bio-Rad, Richmond, CA, USA) 3 Stunden bei 1,5 Amp. einem Elektroblotting unterzogen. Die Membran wurde dann an der Luft getrocknet und 2 Stunden bei 80ºC gebacken.
Die Biotinylierungsmarkierung wurde wie folgt sichtbar gemacht: Die Membran wurde durch PBS blockiert, das mit 1-Light (Tropix, MA, USA) und 0,1% Tween 20 angereichert war. Die Nylonmembran wurde 1 Stunde in dem gleichen Blockierungsmittel, das mit 1:2500 verdünntem Streptavidin-alkalische Phosphatase-Konjugat angereichert war, inkubiert, und dann mit einer Lösung gewaschen, die 0,1 % Tween 20 in PBS enthielt. Schließlich wurde die Membran 30 Minuten in eine chromogene ChemiProbe -BCIP/NBT-Lösung eingetaucht, und der Überschuß an Chromogen mit Wasser gespült.

3. Nachweis durch Festträger-Einfang- (Tauchstreifen-)-Test

Nicht saugfähiges schlagzähes Polystyrol (kommerziell erhältlich von Orgenics Ltd.) wurde als fester Träger für einen Tauchstreifen-Emfangtest verwendet.
Herstellung des Tauchstreifens. Ein Mikroliter einer Lösung aus 2 mg/ml gereinigtem monoklonalen anti-modifizierte-DNA-Antikörper aus Maus in PBS wurde auf den unteren Abschnitt des Tauchstreifens aufgetragen und dann 1 Stunde bei 37ºC getrocknet. Die ungebundenen Stellen wurden durch einstündiges Eintauchen des Tauchstreifens in eine Lösung aus 1% Gelatine und 0,05% Tween 20 blockiert. Die Tauchstreifen wurden dann 2-5 Sekunden in Wasser gewaschen und 1 Std. bei 37ºC getrocknet.
Der Test:
Es wurden 5 µl einer Reaktionsgemisch-Lösung von jedem Ansatz der zweiten PCR- Zyklusgruppe zu 45 µl TGP-Laufpuffer gegeben, der Streptavidin-alkalische Phosphatase-Konjugat (1:200) enthielt. Die Lösungen wurden in Löchern untergebracht, und die Tauchstreifen wurden in die Lösungen getaucht. Nach 30 Minuten Inkubation wurden die Tauchstreifen in PBS gewaschen und 20 Minuten in BCIP/NBT-Lösung getaucht. Die Reaktion wurde durch Waschen der Tauchstreifen in Wasser beendet.

4. Nachweis durch kapillaren DNA-Konzentrations-Test (CDCA).

Es wurden 3 µl jeder Reaktionsgemisch-Lösung von jedem Ansatz der zweiten PCR-Zyklus- Gruppe in Löcher gegeben, die 30 µl einer Lösung aus Streptavidin-alkalische Phosphatase-Konjugat, 1:2500 in TGP-Laufpuffer verdünnt, enthielten. Die Nitrocellulosestreifen wurden wie in Beispiel 1 hergestellt. Der Kontaktabschnitt 20 der Streifen 22 wurde10 Minuten mit der Lösung in den Löchern in Kontakt gebracht. Der Kontaktabschnitt der Streifen 22 wurde dann 10 Minuten mit Löchern in Kontakt gebracht, die 50 µl Waschlösung (TP-Puffer) enthielten. Schließlich wurden die Streifen 22 während 5 Minuten vollständig in eine ChemiProbe -BCIP/NBT-Lösung getaucht, um ein Substrat für eine chromogene Reaktion bereitzustellen.
Die Ergebnisse der vorstehenden Verfahren sind in Tabelle 1 dargestellt, die die Nachweisgrenze in Bezug auf die Anzahl der PCR-Zyklen für die oben beschriebenen Tests - EtdBr, Southern- Blot, Festträger-Einfangtest und CDCA - anzeigt. Tabelle 1 Nachweisgrenzen einiger Systeme
± = Schwellenmengen
- = definitiv negativ
+ = definitiv positiv
Wie aus Tabelle 1 ersichtlich ist, ist die Empfindlichkeit des Tauchstreifen-Tests ähnlich der des EtdBr-Fluoreszenz-Tests. Beide sind weniger empfindlich als die Southern-Blot-Technik. Der CDCA erwies sich als mindestens so empfindlich wie die Southern-Blot-Technik.

BEISPIEL 4

WIRKUNG DER PRIMER-ELIMINIERUNG NACH AMPLIFIZIERUNG AUF DIE EMPFINDLICHKEIT DES CDCA-VERFAHRENS

Spezifische HIV-Sequenzen wurden aus einer positiven HIV-Probe in einem 100 µl Reaktionsgemisch während 20 PCR-Zyklen unter Verwendung von 100 pMol unmarkiertem Primer 3 und Primer 4 wie in Beispiel 1 beschrieben amplifiziert. Die zweite Amplifizierung erfolgte unter den gleichen Bedingungen wie die erste Amplifizierung, jedoch mit markierten Primern während 2, 4, 6, 8, 10 und 20 Zyklen. Die Matrize für die zweite PCR-Amplifizierung war 1 µl des ersten PCR-Gemisches, verdünnt in 100 µl Reaktionsgemisch, das 100 pMol jedes markierten Primers, 0,25 mM der vier Desoxynukleotidtriphosphate, 10 µl 10fach Taq-Puffer (Promega) und 2,5 E Taq-Polymerase (Promega) enthielt. Für jede PCR-Amplifizierungs-Zykluszahlgruppe wurden 4 Aliquote, d.h. eins für jeden Test, von 100 µl PCR-Reaktionsgemisch untersucht.

Test-1

Der erste Test war das in Beispiel 3 beschriebene CDCA-System. Von jeder PCR- Amplifizierungs-Zykluszahlgruppe wurden 3 µl Reaktionsgemisch in Löcher mit 30 µl Streptavidin- alkalische Phosphatase in TGP-Laufpuffer gegeben, und der CDCA erfolgte wie in Beispiel 3 beschrieben.

Test-2

Im zweiten Test wurde das PCR-Reaktionsgemisch mit PEG behandelt, um die Primer vor der Durchführung des CDCA zu entfernen. Die Primer jeder PCR-Amplifizierungs-Zykluszahlgruppe wurden entfernt, indem eine PEG-Lösung wie in Beispiel 1 beschrieben verwendet wurde. Es wurden 3 µl des mit PEG behandelten PCR-Amplifizierungsgemisches zu 30 µl TGP-Laufpuffer gegeben, und der Test wurde dann wie in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt.

Test-3

Im dritten Test wurden die Primer in dem PCR-Reaktionsgemisch vor dem CDCA durch Sephadex G-100 entfernt. Die Primer jeder PCR-Amplifizierungs-Zykluszahlgruppe wurden durch Sephadex G-100 wie folgt entfernt. Es wurden 0,5 ml Tris-EDTA-Puffer (TE) in Sephadex G-100 (Pharmacia) in ein Loch überführt und überschüssiges TE wurde mit Filterpapier absorbiert. Von jeder PCR-Reaktionsgemisch-Lösung wurden 15 µl 1:1 mit TGP-Laufpuffer verdünnt, und das Gemisch wurde direkt auf den Boden des Lochs aufgetragen.
Der Kontaktabschnitt 20 eines Streifens 22, einschließlich eines Nitrocellulosestreifens, bei dem die Absorptionsstellen blockiert sind, wurden wie in Beispiel 1 hergestellt und mit der Oberfläche des Sephadex G-100 25 Min. in Kontakt gebracht. Der Kontaktabschnitt des Streifens 22 wurde dann 10 Minuten mit Streptavidin-alkalische Phosphatase-Konjugat, das in einem Loch mit TGP-Laufpuffer 1:2500 verdünnt war, in Kontakt gebracht und dann nach dem Verfahren von Beispiel 1 gewaschen und sichtbar gemacht.

Test-4

Im vierten Test wurden die Primer aus dem PCR-Reaktionsgemisch vor dem CDCA durch Hybridisierung der Primer an komplementäre Oligonukleotid-Sequenzen, die an eine Verbindung gebunden waren, entfernt. Die Primer jeder PCR-Amplifizierungs-Zykluszahlgruppe wurden eingefangen, indem sie mit Perlen in Kontakt gebracht wurden, die mit Oligonukleotiden beschichtet waren, deren Sequenzen zu den Sequenzen der einzufangenden Primer komplementär waren.
a) Herstellung des Einfang-Systems. Streptavidin wurde an Styrol/Vinylcarbonsäure-Perlen (5 µm Durchmesser, kommerziell erhältlich bei Bangs Laboratories, Inc. Carmel, IN, USA) nach den Grundsätzen von Woodward, R.B. und Elofson, R.A. (1961), J. Amer. Soc. 83, 1007-1010 unter Bedingungen gebunden, die in der israelischen Patentanmeldung 098452 beschrieben sind. Deren Lehren sind hier durch Bezugnahme aufgenommen. Die komplementäre Oligonukleotid-Sequenz 5' TATTCCTAATTGAACTTCAA wurde wie in Beispiel 1 beschrieben synthetisiert und biotinyliert.
Das Oligonukleotid wurde an die Perlen durch folgendes Verfahren gebunden. Es wurden 100 µl 1% beschichtete Perlen 1:1 mit einer Lösung aus 1 mg/ml biotinyliertem Oligonukleotid gemischt. Die Lösung wurde 3 Stunden bei 30ºC inkubiert. Das ungebundene Oligonukleotid wurde in PBS gewaschen und in einer Lösung aus 1% Gelatine in PBS aufbewahrt.
b) Das Testverfahren. Es wurden 3 µl jeder PCR-Amplifizierungs-Zykluszahlgruppe in Löcher gegeben, die 30 µl einer Lösung enthielten, die 0,5 % mit komplementärem Oligonukleotid beschichtete Perlen und Streptavidin-alkalische Phosphatasekonjugat (1:500 verdünnt) in TGP-Puffer enthielt, und 10 Minuten inkubieren gelassen.
Ein Kontaktabschnitt 20 des Streifens 22, einschließlich eines Nitrocellulosestreifens, bei dem die Absorptionsstellen wie in Beispiel 1 blockiert und hergestellt wurden, wurde dann 10 Minuten mit der inkubierten Lösung in Kontakt gebracht. Der Streifen 22 wurde dann gewaschen und das Signal wie in Beispiel 3 entwickelt.
Die Tabelle 2 zeigt die Wirkung der Eliminierung der Primer nach Amplifizierung auf die Empfindlichkeit des CDCA. Tabelle 2 Nachweisgrenze der Tests 1-4
+ = Nachweis der HIV-DNA-Sequenzen
Wie aus Tabelle 2 ersichtlich ist, kann unbehandelte PCR-Lösung selbst nach 8 Amplifizierungszyklen kein sichtbares Signal in dem CDCA-Test erzeugen. Erst nach etwa 10 Zyklen tritt eine positve Reaktion auf. Die Eliminierung der Primer nach Amplifizierung durch einen Trenungsschritt oder während des Tests ermöglicht den Nachweis der Ziel-Nukleinsäuresequenzen nach nur 2 - 6 PCR- Zyklen. Die Eliminierung der Primer durch jede Technik wurde durch Gelelektrophorese und Sichtbarmachung mit EtdBr (Daten nicht gezeigt) bestätigt.

BEISPIEL 5

NACHWEIS DER HPV-SEQUENZEN IN KLINISCHEN PROBEN DURCH HYBRIDISIERUNG IN LÖSUNG

Herstellung der Sonde. Eine einzelsträngige HPV-Sequenz wurde durch asymmetrische PCR- Amplifizierung unter Verwendung des in Beispiel 3 beschriebenen HPV-Primers h1 hergestellt. Folgende Amplifizierungsbedingungen wurden eingesetzt. 10 ng unmarkiertes HPV-PCR-Produkt, hergestellt wie in Beispiel 3 beschrieben, wurde als Matrize verwendet. Es wurde nur ein Primer h1 für die Amplifizierung verwendet. Es wurden 50 PCR-Zyklen wie in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt.
Das einzelsträngige Produkt wurde dann eine Stunde bei 30ºC sulfoniert und dann durch Verwendung von Sephadex G-50 wie in den Anleitungen für die Verwendung des ChemiProbe -Kits (Orgenics Ltd.) beschrieben entsalzt.

Amplifizierung der HPV-Sequenz

Die HPV-Sequenzen wurden aus einer klinischen Probe durch zwei Verfahren amplifiziert: A) unter Verwendung biotinylierter h2-Primer und unmarkierter h1-Primer und B) unter Verwendung biotinylierter h2-Primer und sulfonierter h1-Primer. Bei beiden Verfahren wurde die PCR wie in Beispiel 3 über 35 Zyklen durchgeführt.

Hybridisierung

Es wurden 5 µl der PCR-Reaktionsgemischlösung des Verfahrens A (nach 35 Zyklen) zu 95 µl einer Hybridisierungslösung gegeben, die 0,66 M NaCl, 65 mM Natriumcitrat, 0,3 mM EDTA, 0,1 M Phosphatpuffer pH-Wert 6,6, 0,02% Ficoll , 0,2% Polyvinylpyrrolidon, 0,5% Polyethylenglykol, 0,12% Rinderserumalbumin und 100 ng einer oben beschriebenen sulfonierten Sonde enthielt. Die Lösung wurde dann 5 Minuten bei 95ºC erhitzt und sofort gekühlt. Die Hybridisierung erfolgte 45 Minuten bei 65ºC.

Einfangen durch CDCA

Es wurden 3 µl des Hybridisierungsgemisches nach Beendigung der Hybridisierung oder 0,3 µl der PCR-Reaktionsgemischlösung aus Verfahren B in Löcher gegeben, die 30 µl Streptavidin- alkalische Phosphatase in TGP-Laufpuffer enthielten. Ein Kontaktabschnitt 20 des Streifens 22, einschließlich eines Nitrocellulosestreifens, der wie in Beispiel 1 hergestellt worden war, wurde dann 10 Minuten mit der Lösung in dem Loch in Kontakt gebracht. Das Hybrid wurde wie in Beispiel 3 eingefangen und sichtbar gemacht.

Ergebnisse

Zwölf Proben wurden bewertet. Bei beiden getesteten Verfahren erwiesen sich die gleichen 5 Proben als positiv und die gleichen 7 Proben als negativ.

BEISPIEL 6

NACHWEIS VON HPV IN DEM CDCA-SYSTEM UNTER VERWENDUNG VON FARBIGEN LATEXPERLEN ALS FARBERZEUGENDES REAGENZ

Streptavidin (Sigma) wurde kovalent an farbige 0,2 µm Styrol/Vinylcarbonsäure-Perlen (Bangs Laboratories Inc. Carmel, IN, USA) gebunden. Die Bindung erfolgte nach den Verfahren von Woodward et al wie in Beispiel 4 beschrieben.
Das PCR-Produkt aus einer klinischen Probe, von der angenommen wurde, daß sie HPV- Sequenzen enthielt, wurde durch einen zweiten PCR-Amplifizierungsschritt unter Verwendung des sulfonierten h1- und des biotinylierten h2-Primers wie in Beispiel 3 beschrieben amplifiziert. Die Primer wurden aus der PCR-Reaktionsgemischlösung entfernt, indem wie in Beispiel 1 beschrieben PEG- Lösung verwendet wurde. Es wurden 3 µl dieser Lösung in ein Loch gegeben, das 0,05% an Perlen gebundenes Streptavidin in 1,0% Gelatine, 0,3% Tween 20 und 0,25 M NaCl enthielt. Der Kontaktabschnitt 20 eines wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellten Streifens 22 wurde mit der Lösung in dem Loch in Kontakt gebracht. Nach einigen Minuten wurde ein blau gefärbtes Signal in der Einfangzone 32 des Streifens 22 sichtbar.

BEISPIEL 7

NACHWEIS DER HPV-SEQUENZEN IN EINEM KAPILLAREN DNA- KONZENTRIERUNGSTEST MIT DNA ALS EINFANGREAGENZ

a) Auswahl der Primer

Die Primer wurden aus dem E6-Gen von HPV/16 ausgewählt und hatten die folgenden Sequenzen: Primer

b) Oligonukleotid-Sonden-Einfangreagenz

Die Oligonukleotid-Sonde, die als Einfangreagenz diente, wurde so ausgewählt, daß sie zu der Sequenz eines biotinylierten Stranges, der durch Verlängerung des Primers 2 in einer PCR-Reaktion hergestellt wurde, komplementär war. Die folgende Sequenz wurde gewählt:
CAACAACAACAAGTTTCAGGACCCACAGGAGCGACCC

c) Herstellung der rückseitig verstärkten Nitrocellulosestreifen

Mylerisierte Nitrocellulose, Porengröße 5 µl (Micron Seperation Inc. Westboro, MA, USA) wurde in 0,5 x 3,0 cm Streifen geschnitten. Ein Mikroliter einer Lösung, bestehend aus 5 ng Oligonukleotid-Sonden-Einfangreagenz in 10x SSC (SSC besteht aus 0,15 M NaCl und 0,015 M Natriumcitrat, pH-Wert 7,0) wurde in die Mitte aller Nitrocellulosestreifen als Punkt aufgetragen. Die Streifen wurden dann 15 Minuten bei 37ºC getrocknet und die Oligonukleotid-Sonden wurden dann an die Nitrocellulosestreifen gebunden, indem die Streifen 5 Minuten mit UV bestrahlt wurden.

d) Amplifizierung der HPV-Sequenz

Die PCR-Amplifizierung wurde in einem Reaktionsgemisch aus 100 µl-Aliquoten durchgeführt, die entweder 1000, 100, 10, 1 oder 0 pg DNA aus CasKi-Zellen in Gegenwart von 1 µg gewöhnlicher menschlicher Plazenta-DNA enthielten. Jedes PCR-Reaktionsgemisch enthielt außerdem 100 pMol jeder Primer (P1 und P2), 0,25 mM der vier Desoxynukleotidtriphosphate, 10 µl 10fach Taq-Puffer und 2,5 E Taq-DNA-Polymerase.
Einem ersten DNA-Denaturierungsschritt von 5 Minuten bei 94ºC folgten 30 Zyklen von 1 Minute Denaturieren bei 94ºC, 1,5 Minuten Annealing bei 47ºC und 1,5 Minuten Verlängerung bei 72ºC. Die Amplifizierung wurde mit sieben Minuten Verlängerung bei 72ºC beendet.

e) Transport und Konzentrierung der DNA

Die Konzentrierung und das Einfangen der Ziel-Nukleinsäuresequenzen erfolgte durch folgendes Chromatographie-Hybridisierungsverfahren:
Es wurden 50 µl jedes in Schritt d oben erhaltenen PCR-Produktes 1:10 in 450 µl Hybridisierungslösung verdünnt, die aus 0,6 M NaCl, 20 mM Phosphatpuffer, pH-Wert 7,5, 0,02% Ficoll 400 (Sigma, St. Louis, MO, USA), 0,02%Gelatine und 1% PVP bestand. Die Proben wurden 10 Minuten gekocht und sofort auf Eis gekühlt. 200 µl jeder Lösung wurden dann in die Löcher 14 der in den Figuren 1-4 gezeigten Vorrichtung 12 überführt. Der Kontaktabschnitt 20 jedes Streifens 22 wurde mit der Lösung in den Löchern 14 in Kontakt gebracht.
Die Vorrichtung 12 wurde 25 Minuten in einem Feuchtinkubator (90% relative Feuchtigkeit) bei 37ºC untergebracht. Die Lösung ließ man durch die Nitrocellulosestreifen wandern, die den saugfähigen Träger 24 bildeten. Die Streifen 22 wurden dann für 20 Minuten in die Löcher 16 überführt, die 100 µl Streptavidin-alkalische Phosphatase-Konjugat, 1:2500 in PBS verdünnt, und 0,3% Tween 20 enthielten. Die Streifen 22 wurden dann in Löcher überrührt, die eine Lösung aus 150 µl PBS und 3% Tween 20 enthielten. Der Kontaktabschnitt 20 des Streifens 22 wurde 15 Minuten bei 37ºC mit der Lösung in Kontakt gebracht. Die Streifen 22 wurden schließlich vollständig während 20 Minuten bei 37ºC in eine ChemiProbe -BCIP/NBT-Lösung getaucht, sodaß ein Substrat für eine chromogene Reaktion bereitgestellt wurde. Ein blau gefärbtes Signal in der Einfangzone 32 des Streifens 22 zeigte die Anwesenheit von HPV-DNA.
Man fand, daß HPV-Sequenzen, die in nur 1 pg CasKi-DNA vorliegen, durch dieses Chromatographie-Hybridisierungs-Verfahren nachgewiesen werden können.
Der Fachmann erkennt, daß die vorliegende Erfindung nicht auf das insbesondere hier Gezeigte und Beschriebene beschränkt ist. Der Schutzumfang der vorliegenden Erfindung ist nur durch die nachfolgenden Patentansprüche definiert:

Claims

1. Vorrichtung zur Konzentration von Zielmolekülen in einer flüssigen Probe, umfassend:

einen trockenen unblockierten saugfähigen Träger, wobei die Absorptionsstellen auf dem Träger von Blockierungsmitteln wie u.a. Makromolekülen, Detergentien und Kombinationen davon unblockiert sind und wobei die Zielmoleküle, einschl. Ziel- Nukleinsäuresequenzen, in dem trockenen unblockierten saugfähigen Träger durch Kapillarwirkung befördert werden, wenn ein Teil des trockenen unblockierten saugfähigen Trägers mit einer flüssigen Probe in Kontakt kommt, die die Zielmoleküle und ein Blockierungsmittel enthält; und

mindestens ein Einfangreagens, das in mindestens einer Einfangzone auf dem trockenen unblockierten saugfähigen Träger stromabwärts eines Kontaktbereichs des trockenen unblockierten saugfähigen Trägers fixiert ist, wobei das mindestens eine Einfangmittel die Zielmoleküle einfangen kann, und wobei

die Zielmoleküle einschl. Nukleinsäuresequenzen ein Nukleinsäureprodukt einer enzymatischen Amplifikationsreaktion umfassen und mindestens ein Oligonukleotidprimerpaar beinhalten.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das mindestens eine Primerpaar Primer für eine Polymerasekettenreaktion (PCR) umfaßt.

3. Vorrichtung nach Anspruch 2, wobei das mindestens eine Primerpaar Primer für eine Ligasekettenreaktion (LCR) umfaßt.

4. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei mindestens ein zweiter Primer des mindestens einen Primerpaars ein Oligonukleotid enthält, das einen Liganden trägt, der an mindestens ein Einfangmittel bindet, wodurch die Zielmoleküle mit dem u.a. mindestens einen ligandentragenden Primer an mindestens ein Einfangmittel gebunden werden können.

5. Vorrichtung nach Anspruch 4, wobei der Ligand ein Antigenepitop umfaßt.

6. Vorrichtung nach Anspruch 5, wobei der Ligand mindestens ein sulfoniertes Cytosin umfaßt.

7. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das mindestens eine Einfangreagens Nukleinsäuresequenzen enthält und dadurch an den trockenen unblockierten saugfähigen Träger fixiert ist, daß es einer Hochsalzlösung und Ultraviolett-Bestrahlung ausgesetzt wird.

8. Vorrichtung zum Konzentrieren amplifizierter Zielmoleküle nach Anspruch 1, wobei das mindestens eine Einfangreagens ein Nukleinsäure-Einfangreagens umfaßt, einschl. Nukleinsäuresequenzen, die an den trockenen unblockierten saugfähigen Träger fixiert sind und wobei die Nukleinsäuresequenzen eine Nukleinsäuresonde enthalten, die zumindest zu einem Teil der amplifizierten Nukleinsäuresequenzen komplementär ist und wobei die Nukleinsäuresonde mindestens 5 Basen von einer komplementären Primersequenz in einer markierten amplifizierten Sequenz entfernt ist.

9. Verfahren zum Konzentrieren amplifizierter Ziel- Nukleinsäuresequenzen in einem trockenen unblockierten saugfähigen Träger, wobei die Absorptionsstellen auf dem Träger von Blockierungsmitteln, einschl. Makromolekülen, Detergentien oder deren Kombinationen unblockiert sind, und wobei die Ziel-Nukleinsäuresequenzen klassiert sind, um die Ziel-Nukleinsäuresequenz-Konzentration in dem trockenen unblockierten saugfähigen Träger zu erleichtern, umfassend die Schritte:

Bereitstellen der Vorrichtung nach Anspruch 1, einschl. des trockenen unblockierten saugfähigen Trägers, der einen Kapillartransportweg definiert, der den Transport der amplifizierten Ziel-Nukleinsäuresequenzen unterstützt; und

Amplifizieren mindestens eines Teils einer Nukleinsäuresequenz, um Ziel-Nukleinsäuresequenzen zwischen 30 und 500 Basen bereitzustellen.

10. Verfahren zum Konzentrieren von Zielmolekülen einschl. Nukleinsäuresequenzen, umfassend die Schritte

Fixieren eines Einfangreagens einschl. Nukleinsäuresequenzen auf dem trockenen unblockierten saugfähigen Träger, wobei die Absorptionsstellen auf dem Träger von Blockierungsmitteln einschließlich Makromolekülen, Detergentien oder deren Kombinationen unblockiert sind, in dem Gerät nach Anspruch 7 dadurch, daß es einer Hochsalzlösung und Ultraviolettbestrahlung ausgesetzt wird.

11. Vorrichtung zum Trennen von Zielmolekülen, einschließlich Ziel-Nukleinsäuresequenzen, die das Produkt einer enzymatischen Amplifizierungsreaktion sind und die mindestens ein Oligonukleotid-Primerpaar beinhalten, von Nichtziel- Nukleotiden und -Oligonukleotiden in einer flüssigen Probe, die die Zielmoleküle, Nichtziel-Nukleotide und -Oligonukleotide und ein Blockierungsmittel enthält, einschließlich Makromolekülen, Detergentien oder deren Kombinationen, für die Blockierung von Absorptionsstellen auf einem saugfähigen Träger, die Konzentrierung der Zielmoleküle und den Nachweis der konzentrierten Zielmoleküle, umfassend:

eine Behältervorrichtung, die eine Vielzahl von Löchern definiert, einschließlich eines ersten Teils der Vielzahl von Löchern, die eine Verbindung enthalten, die die Nichtziel- Oligonukleotide bindet und bei der die flüssige Probe zu dem ersten Teil der Vielzahl von Löchern gegeben werden kann;

einen trockenen unblockierten saugfähigen Träger, wobei die Absorptionsstellen auf dem Träger von Blockierungsmitteln unblockiert sind, wodurch ein flüssiger Transportweg von dem Gefäß definiert wird, der bei Benetzung mit einer Lösung mit dem Blockierungsmittel den Transport der Zielmoleküle unterstützt, wobei die Zielmoleküle innerhalb des trockenen unblockierten saugfähigen Trägers durch Kapillarwirkung transportiert werden, wenn ein Kontaktbereich des trockenen unblockierten saugfähigen Trägers mit der flüssigen Probe, die die Zielmoleküle und das Blockierungsmittel enthält, in Kontakt kommt;

mindestens ein Einfangreagens, das die Zielmoleküle einfangen kann, wobei das mindestens eine Einfangreagens in mindestens einer Einfangzone auf dem trockenen unblockierten saugfähigen Träger stromabwärts des Kontaktbereichs des trockenen unblockierten saugfähigen Trägers fixiert ist; und

Mittel zum Nachweisen der eingefangenen Moleküle, umfassend:

einen saugfähigen Träger, an dem Zielmoleküle, einschließlich Nukleinsäuresequenzen, mit einem Liganden, der an ein signalerzeugendes Reagens bindet, fixiert werden; und

Mittel zum Kontaktieren der Zielmoleküle, einschließlich der Nukleinsäuresequenzen, die den Ligand tragen, mit dem signalerzeugenden Reagens, zum Erzeugen eines empfindlichen Signals, das den Nachweis der Zielmoleküle einschließlich der Nukleinsäuresequenzen anzeigt.

12. Vorrichtung nach Anspruch 11, wobei das mindestens eine Oligonukleotidprimerpaar Primer für eine Polymerasekettenreaktion (PCR) umfaßt.

13. Vorrichtung nach Anspruch 11, wobei das mindestens eine Oligonukleotidprimerpaar Primer für eine Ligasekettenreaktion (LCR) umfaßt.

14. Vorrichtung nach Anspruch 11, wobei ein zweiter Primer des mindestens einen Oligonukleotidprimerpaares einen Liganden enthält, der an das mindestens eine Einfangreagens bindet, wodurch die Zielmoleküle, die den Liganden enthalten, an das mindestens eine Einfangreagens gebunden werden können.

15. Vorrichtung nach Anspruch 14, wobei der Ligand ein Antigenepitop umfaßt.

16. Vorrichtung nach Anspruch 15, wobei das Antigenepitop mindestens ein sulfoniertes Cytosin umfaßt.

17. Vorrichtung nach Anspruch 11, wobei ein erster Primer des mindestens einen Primerpaars einen Liganden enthält, der an das signalerzeugende Reagens bindet, wodurch die Zielmoleküle, die den Liganden enthalten, durch die Gegenwart eines Signals nachgewiesen werden können, das durch das signalerzeugende Reagens erzeugt wird.

18. Vorrichtung nach Anspruch 17, wobei die Zielmoleküle, die den Liganden enthalten, durch die Gegenwart eines Signals nachgewiesen werden können, das von dem signalerzeugenden Reagens nach Kontaktieren eines signalentwickelnden Reagens erzeugt wird.

19. Vorrichtung nach Anspruch 17, wobei der Ligand biotinylierte Nukleotide umfaßt.

20. Vorrichtung nach Anspruch 17, wobei das durch das signalerzeugende Reagens erzeugte Signal an Partikel gebundenes Streptavidin umfaßt.

21. Vorrichtung nach Anspruch 18, wobei das durch das signalerzeugende Reagens nach Kontaktieren des signalentwickelnden Reagens erzeugte Signal ein Streptavidin- alkalische Phosphatase-Konjugat enthält.

22. Vorrichtung zum Konzentrieren von amplifizierten Ziel- Nukleinsäuresequenzen nach Anspruch 1, wobei die Ziel- Nukleinsäuresequenzen klassiert sind, um die Konzentrierung der Ziel-Nukleinsäuresequenz in dem saugfähigen Träger zu erleichtern, und mindestens einen amplifizierten Teil zwischen 30 und 500 Basen einer Nukleinsäuresequenz enthalten.

23. Vorrichtung nach Anspruch 22, wobei mindestens ein Oligonukleotidprimerpaar Primer für eine Polymerasekettenreaktion (PCR) umfaßt.

24. Vorrichtung nach Anspruch 22, wobei das mindestens eine Oligonukleotidprimerpaar Primer für eine Ligasekettenreaktion (LCR) umfaßt.

25. Vorrichtung zum Nachweis einer spezifischen amplifizierten Nukleinsäuresequenz, die mindestens ein Oligonukleotidprimerpaar beinhaltet, umfassend:

eine flüssige Probe, einschließlich den Zielmolekülen, den Nichtzielnukleotiden und -Oligonukleotiden und eine transportgeschwindigkeitssteuernde Verbindung;

einen trockenen unblockierten saugfähigen Träger, wobei die Absorptionsstellen auf dem Träger von Blockierungsmitteln einschl. Makromolekülen, Detergentien oder deren Kombinationen unblockiert sind, und wobei die Zielmoleküle in dem trockenen saugfähigen Träger durch Kapillarwirkung bei einer gesteuerten Geschwindigkeit befördert werden, wenn ein Kontaktbereich des trockenen unblockierten saugfähigen Trägers mit der flüssigen Probe, einschließlich den Zielmolekülen und der transportgeschwindigkeitssteuernden Verbindung in Kontakt kommt;

Mittel für das Einfangen der Zielmoleküle einschließlich mindestens eines Nukleinsäure-Einfangreagens, das durch Hochsalz und Ultraviolettstrahlung in einer Einfangzone auf dem trockenen saugfähigen Träger stromabwärts des Teils des trockenen unblockierten saugfähigen Trägers, der die flüssige Probe kontaktiert, fixiert ist; und

Mittel zum Nachweis der eingefangenen Zielmoleküle.