DE3854834T2 - Immuntest unter Verwendung von Antigenen, produziert in heterologen Organismen - Google Patents
Immuntest unter Verwendung von Antigenen, produziert in heterologen OrganismenInfo
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Description
- A. Gebiet der Erfindung.
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Durchführung eines Immunoassays vom Sandwichtyp, zum Nachweis eines Antikörpers, das ein aufgezogenes Antigen und ein markiertes Antigen verwendet, wobei das markierte und das aufgezogene Gen von genetisch nicht verwandten Organismen ("heterologen Spezies") erzeugt werden. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine Festphasen-Verfahren und eine Vorrichtung zum Nachweis von Antikörpern gegen eine Antigen ""X") in Flüssigkeiten oder im Gewebe von Säugetieren, wobei der interessierende Antikörper zwischen einem Antigen "X", das an eine feste Phase gebunden ist, und einem Antigen "X" oder einem gemeinsamen Epitop desselben eingeschlossen ("sandwiched") wird, das von einem heterologen Organismus abgeleitet ist und das an eine Markierung gebunden ist. Das Verfahren und die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung sind in der Labormedizin nützlich, weil sie einem Arzt oder Tierarzt erlauben, schnell und spezifisch festzustellen, ob ein Patient eine Immunantwort gegen einen besonderen Organismus oder ein besonderes Antigen aufweist, wodurch gegenwärtiger oder vorhergehender Kontakt mit diesem Organismus oder Antigen angezeigt wird. Insbesondere sind das Verfahren und die Vorrichtung der Erfindung zum schnellen und spezifischen Nachweis einer Immunantwort und daher des Kontaktes mit dem HTLV-III-Virus nützlich, das mit dem erworbenen Irnmunschwächesyndrom (AIDS) in Zusammenhang gebracht wurde.
- Die meisten Immunoassays zum Nachweis eines Antikörpers umfassen ein Antigen, das auf eine feste Phase aufgezogen ist und das zum Einfangen von Antikörpern verwendet wird, die gegen das aufgezogene Antigen spezifisch sind. Die eingefangenen Antikörper werden dann quantitativ bestimmt und/oder identifiziert, indem ein anti-Antikörper verwendet wird, an den ein Nachweissystem wie ein Enzym oder ein Radioisotop konjugiert ist.
- Eine zweite Sorte von Immunoassay verwendet ebenfalls ein Antigen, das auf eine feste Phase aufgezogen ist, um antigenspezifische Antikörper einzufangen. Jedoch werden eingefangene Antikörper bei diesem zweiten Typ von Immunoassay, anders als im ersten Immunoassay oben, unter Verwendung eines Antigens, das mit einer Radiomarkierung oder einem Enzym, das als Nachweissystem dient, quervernetzt ist, quantitativ bestimmt und/oder identifiziert. Bei dieser zweiten Sorte von Immunoassay sind sowohl das Antigen, das auf die Perle aufgezogen ist, als auch das Antigen, das die Markierung trägt, identisch und stammen vom selben Organismus (von derselben Quelle) und tragen die gleichen Verunreinigungen. Nachfolgend werden Antigene, die von der selben Art oder von verwandten Arten von Organismen erhalten wurden, als "homologe" Antigene bezeichnet.
- Aus der EP-A-0 216 191 ist ein Immunoassay zum Nachweis von HTLV-III-Antigenen in einer biologischen Probe bekannt, das folgendes umfaßt: das Beschichten eines festen Trägers mit einem ersten Antikörper gegen HTLV-III, das In-Kontakt-Bringen des beschichteten festen Trägers mit der biologischen Probe, das In- Kontakt-Bringen des festen Trägers mit einem zweiten Antikörper gegen HTLV-III von einer anderen Tierspezies als der erste Antikörper, das In-Kontakt-Bringen des festen Trägers mit einem markierten Antikörper, der für den zweiten Antikörper spezifisch ist, und den Nachweis der Markierung als Maß für die Anwesenheit von HTLV-III-Antigen in der Probe.
- US-A-4 343 896 offenbart ein Verfahren zum Nachweis von Antikörpern oder Antigenen in einer Testprobe. Für den Nachweis eines Antikörpers wird die Testprobe mit einem Antigen gegen den nachzuweisenden Antikörper, rnit einem zweiten markierten Antikörper gegen das Antigen und mit einem unlöslich gemachten dritten Antikörper gegen den nicht-markierten Antikörper vermischt, wobei der zweite Antikörper in einer anderen Tierart als der nachzuweisende Antikörper erzeugt worden ist.
- EP-A-307 149, die Stand der Technik gemäß Artikel 54 (3) und (4) EPÜ ist, offenbart ein Verfahren zum Nachweis eines antigenspezifischen Antikörpers in einer Testprobe. Dieses Verfahren umfaßt folgendes: (1) das In-Kontakt-Bringen einer festen Phase, auf der ein erstes rekombinantes Peptid immobilisiert worden ist, welches eine antigene Sequenz aufweist, an die der Antikörper binden kann, mit einer Testprobe, (ii) das In-Kontakt-Bringen der festen Phase mit einem zweiten rekombinanten Peptid, das die antigene Sequenz aufweist, wobei dieses markiert ist, und wobei dieses in einem Organismus einer anderen Art ("genus") exprimiert worden ist, als dem, in dem das erste rekombinante Peptid exprimiert wurde, und (iii) die Bestimmung, ob die Testprobe den Antikörper enhielt. Unter den Offenbarungen, die das Prioritätsdatum wirksam beanspruchen, offenbart die EP-A-307 149 spezifisch das p41- und das p24-Antigen des HTLV-III. Bezüglich des Nachweisschrittes offenbart die EP-A-307 149 insbesondere den Nachweis der Anwesenheit des Antikörpers in der Testprobe mittels Messung der Anwesenheit der Markierung auf der festen Phase
- Geläufige Immunoassays zum Nachweis von Antikörpern gegen HTBV-III (anti-HTLV-III) benötigen eine ausgedehnte probenverdünnung; sie verwenden Virus, der aus der humanen Zellinie H9 isoliert wurde, um eine feste Phase zu beschichten; und zuletzt verwenden sie auch eine unspezifische Sonde (zum Beispiel anti-human-IGG, das an Meerrettichperoxidase (HRPO, "horseradish peroxidase")) gekoppelt ist. Bei diesen Immunoassays werden die biologischen Flüssigkeiten auf die Anwesenheit von anti-HTLV-III untersucht, indem die unbekannte Probe mit einer festen Phase in Kontakt gebracht wird, auf die zerstückelter Virus aufgezogen ist. Der Antikörper gegen den HTLV-III-Virus bindet dann an die feste Phase, auf die der Virus aufgezogen ist. Da der zerstückelte Virus eine Vielzahl von Antigenen erzeugt, die auf die feste Phase aufgezogen sind, bindet jeder Antikörper in der Probe, der gegenüber den Verunreinigungen in den Präparaten aus zerstückelten Viren reaktiv ist, ebenfalls an die beschichtete feste Phase. Sobald Antikörper an die feste Phase gebunden ist, produziert er eine nennenswerte Anzahl "falsch positiver" Resultate, egal ob ein markierter Antikörper (erster Immunoassaytyp) oder ein markiertes homologes Antigen (zweiter Immunoassaytyp) als Sonde verwendet wird.
- Demgemäß ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Immunoassayverfahren und eine Vorrichtung zum Nachweis und/oder zur quantitativen Bestimmung von anti-HTLV-III zur Verfügung zu stellen, das eine Spezifität aufweist, d.h. welches das Problem der "falschen positiven" Ergebnisse überwindet.
- Anders als bei den Immunoassays, existieren konkurrierende Bindungsassays, die die Spezifitätsprobleme zum Teil überwinden. Zum Beispiel verwendet das konkurrierende Proteinbindungsassay für anti-HTLV-III rekombinante Antigene und erlaubt die Unterscheidung zwischen Antikörpern gegen HTLV-III- Hüll- (ENV) und HTLV-III-Kern- (Core) Antigenen. Jedoch ist dieses Verfahren zeitaufwendig und wird typischerweise über Nacht ausgeführt. Darüberhinaus benötigt es zwei feste Phasen, d. h. Perlen, die mit p41-Hüllantigen beschichtet sind, und Perlen, die mit p24- Kernantigen beschichtet sind.
- Demgemäß ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Immunoassay für anti-HTLV-IJI zur Verfügung zu stellen, das nicht nur schnell ist sondern auch die Spezifität eines konkurrierenden Bindungsassays aufweist, ohne daß es zwei feste Phasen benötigt.
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis eines Antikörpers gegen ein spezifisches Antigen in einer Testprobe, das eine feste Phase verwendet, auf der ein erstes Antigen, das gegen den Antikörper, der nachgewiesen werden soll, spezifisch ist, immobilisiert worden ist, wobei der Antikörper, der in der Testprobe nachgewiesen werden soll, an das erste Antigen bindet, wodurch er immobilisiert wird, und wobei der immobilisierte Antikörper darüberhinaus ein zweites Antigen bindet, das eine Markierung trägt, dadurch gekennzeichnet, daß das zweite Antigen von einer Quelle abgeleitet ist, die zur Quelle des ersten Antigens heterolog ist, vorausgesetzt, daß wenn sowohl das erste Antigen als auch das zweite Antigen rekombinant abgeleitete Antigene sind, und wenn die Anwesenheit des Antikörpers in der Testprobe nachgewiesen und/oder titriert wird, indem die Anwesenheit der Markierung auf der feste Phase gemessen wird, dann das Verfahren desweiteren durch eine der folgenden Bedingungen gekennzeichnet ist: (1) das erste und das zweite Antigen sind gleichzeitig ein Glied der Gruppe, die das gp120-Antigen von HTLV-III, HBsAg, HBcAg, HBeAg oder ein antigenes Fragment oder ein Epitop dieser umfaßt, (2) die Markierung ist ¹²&sup5;J, Fluorescein, Fluoresceinanaloga und -derivate, Phycobiliprotein, Umbelliferon und Umbelliferonanaloga und -derivate oder Meerrettichperoxidase, (3) das erste oder zweite Antigen wird von B. megaterium von Mäusezellinien oder von Humanzellinien hergestellt, oder (4) die feste Phase ist aus Mikropartikeln oder Perlen aus Glas oder Latex, Reagenzgläsern aus Kunstharz oder Glas, Zellulose und abgewandelten Zellulosematerialien oder Fasermaterialien aus Glas oder Kunstharz gewählt.
- Insbesondere ist die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zum Nachweis eines antigenspezifischen Antikörpers in einer Testprobe gerichtet, das folgende Schritte umfaßt:
- (a) in-Kontakt-Bringen einer festen Phase, auf der ein erstes rekombinant abgeleitetes Antigen, das für den Antikörper, der nachgewiesen werden soll, spezifisch ist, immobilisiert worden ist, mit einer wässerigen Testprobenphase, die den antigenspezifischen Antikörper enthält, oder von der dies angenommen wird;
- (b) in-Kontakt-Bringen der festen Phase, die in Schritt (a) erhalten worden ist, mit einer wässerigen Phasen, die ein zweites rekombinant abgeleitetes Antigen enthält, das eine an es gebundene Markierung aufweist, wobei das zweite rekombinant abgeleitete Antigen aus einer Quelle abgeleitet wurde, die zu der Quelle des ersten rekombinant abgeleiteten Antigens heterolog ist;
- (c) Abtrennen der wässerigen Phase von der festen Phase;
- (d) Messen der Anwesenheit der Markierung auf der festen Phase oder in der flüssiger Phase, um die Anwesenheit des Antikörpers in der Testprobe nachzuweisen und/oder zu titrieren; vorausgesetzt, daß das erste und das zweite Antigen wenigstens eine antigene Determinante gemeinsam haben, um die Kreuzvernetzung des ersten mit zweiten Antigen über den antigenspezifischen Antikörper in der Testprobe zu erlauben, und desweiteren vorausgesetzt, daß, wenn die Anwesenheit des Antikörpers in der Testprobe nachgewiesen und/oder titriert wird, indem die Anwesenheit der Markierung auf der festen Phase gemessen wird, dann das Verfahren desweiteren durch eine der folgenden Bedingungen gekennzeichnet ist: (1) das erste und das zweite Antigen sind gleichzeitig ein Glied der Gruppe, die das gp120-Antigen von HTLV-III, HBsAg, HBcAg, HBeAg oder ein antigenes Fragment oder ein Epitop dieser umfaßt, (2) die Markierung ist ¹²&sup5;J, Fluorescein, Fluoresceinanaloga und -derivate, Phycobiliprotein, Umbelliferon, und Umbelliferonanaloga und -derivate oder Meerrettichperoxidase,
- (3) das erste oder zweite Antigen wird von B. megaterium, von Mäusezellinien oder Humanzellinien hergestellt, oder (4) die feste Phase ist aus Mikropartikeln oder Perlen aus Glas oder Latex, aus Reagenzgläsern aus Kunstharz oder Glas, aus Zellulose und abgewandelten Zellulosematerialien oder aus Fasermaterialien aus Glas oder Kunstharz gewählt.
- Bei dem Verfahren der Erfindung müssen das aufgezogene Antigen und das markierte Antigen, die aus heterologen Quellen stammen, nicht identisch sein, so lange die Antigene wenigstens eine antigene Determinante ("Epitop") gemeinsam haben.
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Durchführung eines Immunoassays zum Nachweis von Antikörpern, die für Antigene spezifisch sind, in einer Testprobe, die eine biologische Flüssigkeit umfaßt.
- Mit "Immunoassay" wie hierin verwendet, ist ein Verfahren zum Nachweis oder zur quantitaiven Bestimmung eines interessierenden Analyten gemeint, bei dem die Menge an Analyt, die schließlich an eine Markierung gebunden ist, direkt gemessen wird. Ein Immunoassay muß von einem konkurrierenden Proteinassay unterschieden werden, bei dem der Nachweis oder die quantitative Bestimmung eines Analyten in Bezug zur Menge an markiertem Analyt steht, der konkurrierend von den Bindungszentren durch den unmarkierten Analyten aus der biologischen Flüssigkeit verdrängt wird.
- Mit "biologischen Flüssigkeiten" wie hierin verwendet, sind Flüssigkeiten gemeint, die von Säugetierorganismen abgeleitet sind, wie Vollblut, Serum, Plasma, Urin, Speichel, Rückenmarksflüssigkeit (CSF) [Cerebrospinal fluid], Fruchtwasser, Gewebeextrakte und Verdünnungen oder Konzentrationen dieser.
- Die Vorrichtung und das Verfahren des Immunoassays, die in der vorliegenden Erfindung beschrieben sind, verwenden sowohl eine feste Phase als auch eine Markierung.
- Mit "fester Phase", wie hierin verwendet, sind alle Materialien gemeint, die nicht der Lösungsphase angehören, und die eine Oberfläche aufweisen, an die das Antigen mittels kovalenter oder nicht-kovalenter Mittel angeheftet werden kann. Mit Anheftung über kovalente Mittel ist allgemein ein Anhef tungsmittel gemeint, das in der Technik gut bekannte Agenzien verwendet, wie etwa die Verwendung von (i) einem Cyanogenhalogenid wie Cyanogenbromid oder (ii) Glutaraldehyd. Mit Anheftung über nicht-kovalente Mittel ist die Absorption oder die Adsorption gemeint. Obwohl die Anheftung des Antigens mittels jedem nicht-kovalenten Mittel unter dem Schutzumfang der Erfindung fällt, wird es besonders bevorzugt, das die Antigene dieser Erfindung an die feste Phase dieser Erfindung mittels Absorption angeheftet werden.
- Beispielhaft für die feste Phase der vorliegenden Erfindung sind Mikropartikel oder Perlen aus Kunstharz, Glas oder Latex; Reagenzgläser aus Kunstharz oder Glas, Zellulose und abgewandelte Zellulosematerialien und Fasermaterialien aus Glas oder Kunstharz. Veranschaulichend für ein Kunstharz das besonders als Festphasenmaterial geeignet ist, ist Polystyrol. Es wird am meisten bevorzugt, daß die feste Phase eine Polystyrolperle von ausreichender Größe ist, um in ein Reaktionsgefäß wie ein Reagenzglas, eine Mikrotiterplattenvertiefung oder dergleichen hineinzupassen.
- Mit "Markierung" wie hierin verwendet, ist jegliches Molekül oder elementare Isotop gemeint, das an das Antigen konjugiert oder gebunden ist, welches zur Erzeugung eines Signals in der Lage ist, oder welches zur Einwirkung auf andere Moleküle fähig ist, so daß eine nachweisbare Spezies gebildet wird. Moleküle die zur "Erzeugnung eines Signals fähig sind", sind Radioisotope wie ¹²&sup5;J und fluoreszierende Moleküle, wie Fluorescein, Fluoresceinanaloga und Derivate, Phycobiliprotein, Unbelliferon, und Umbelliferonanaloga und Derivate. Moleküle, die "dazu fähig sind, auf andere Moleküle einzuwirken, so daß ein nachweisbares Signal gebildet wird", sind verschiedene Enzyme, die in der Technik bekannt sind, die entweder direkt auf ein Substrat einwirken können, oder die an andere Enzyme gekoppelt sein können, die auf ein Substrat einwirken können, was die Erzeugung eines Chromophors oder fluoreszenten Moleküls hervorruft, das man visuell oder instrumentell nachweisen kann.
- Mit "Chromophor" ist ein Molekül gemeint, das einen Absorptionspeak aufweist, wobei der Absorptionspeak zwischen ungefähr 340 bis ungefähr 720nm im elektromagnetischen Spektrum auftritt.
- Die bevorzugten Markierungen in der vorliegenden Erfindung sind die Radioisotope und Enzyme. Besonders bevorzugt wird das Radioisotop ¹²&sup5;I.
- Mit "Sonde", wie hierin verwendet, ist ein heterologes Antigen, Epitop oder Hapten gemeint, das dazu in der Lage ist, von dem Antikörper gebunden zu werden, und an das eine Markierung kovalent oder mittels chemischer oder rekombinanter Technologie angeheftet worden ist.
- Das Immunoassay der vorliegenden Erfindung kann sowohl als Zwei-Schritt- als auch als Ein-Schritt-Verfahren durchgeführt werden. Beim Zwei-Schritt-Verfahren umfaßt der erste Schritt die Inkubation einer festen Phase, die mit dem Antigen aus einer Quelle beschichtet ist, mit einer Testprobe in wässeriger Phase, die eine unbekannte Menge des Antikörpers gegen das Antigen enthält. Der Antikörper gegen das Antigen bindet an das aufgezogene Antigen über eines seiner beiden Bindungszentren, wodurch er Teil der festen Phase ("Festphasenantikörper") wird.
- In dem zweiten Schritt kann die feste Phase zuerst gewaschen werden. Sie wird dann mit einer wässerigen Phase inkubiert, die markiertes Antigen enthält, wobei das markierte Antigen aus einer Quelle stammt, die zur derjenigen des Antigens, das auf die feste Phase aufgezogen ist, heterolog ist. Während der Inkubation wird das markierte Antigen (die Sonde) von der heterologen Quelle aus der wässerigen Phase von dem Festphasenantikörper über das zweite Antigenbindungszentrum des Antikörpers eingefangen.
- Danach werden die feste Phase und die nicht abreagierten Reagenzien in der wässerigen Phase getrennt. Die Anwesenheit der Markierung wird wahlweise entweder auf der festen Phase oder in der wässerigen Phase gemessen. Die Menge an Antikörper, die in der Testprobe vorhanden ist, steht mathematisch sowohl zu der Menge an markiertem Antigen, das an die feste Phase gebunden ist, als auch zu der Menge an markiertem Antigen, das in der wässerigen Phase verbleibt, in Beziehung. Jedoch wird es bevorzugt, die feste Phase zu verwenden, um die Anwesenheit oder Menge von Antikörper in der Testprobe zu bestimmen.
- Mit "wässeriger Phase", wie hierin verwendet, ist jede flüssige Phase gemeint, die von ungefähr 50 bis ungefähr 100% Wasser enthält, im Gleichgewicht mit einer organischen Flüssigkeit, die die Bindung des Antigens an die Perle oder des Antikörpers an das Antigen nicht nachteilig beeinflußt. Solche organischen Flüssigkeiten umfassen niedermolekulare Alkohole, Polyethylenglykole, Dimethylsulfoxid und dergleichen.
- Das Ein-Schritt-Verfahren umfaßt die gleichzeitige Zugabe einer Testprobe und eines markierten Antigens von einer heterologen Antigenquelle zu einer Perle, die mit Antigen aus einer Quelle beschichtet ist. Nach einer abgemessenen Inkubationszeitdauer werden die feste Phase und die nicht abreagierten Reagenzien getrennt, und die Markierung wird gemessen, wie dies zuvor beim Zwei-Schritt-Verfahren beschrieben wurde.
- Bei diesem Assay reagiert nur das Antigen, das für den nachzuweisenden Antikörper spezifisch ist, unter Ausbildung eines Antigen-Antikörper-Antigensandwiches, wobei ein Immunoassay mit einem hohen Ausmaß an Spezifität zur Verfügung gestellt wird. Insbesondere besteht das Sandwich insgesamt aus fester Phase-Antigen-Antikörper-heterologem Antigen-Markierung.
- Die Immunoassayvorrichtung und das Verfahren der vorliegenden Erfindung sind spezifischer als die Sandwich- Immunoassays nach dem Stand der Technik, bei denen das Antigen für die feste Phase und die Sonde (das markierte Antigen) von der gleichen Quelle abgeleitet sind. Insbesondere enthält Antigen, das aus einer einzelnen Quelle (Organismus) isoliert worden ist, Spurenverunreinigungen von diesem Organismus, die während der Verarbeitung an die feste Phase des Immunoassays gebunden werden, oder in diese eingebaut. Diese Verunreinigungen auf der festen Phase sind dann zur Bindung von Antikörpern gegen die Verunreinigungen, die in der Testprobe vorhanden sein können, fähig. Wenn jedoch das gleiche Antigen aus einer heterologen Quelle (Organismus) erhalten wurde und als die Sonde markiert wurde, enthält es einen unterschiedlichen Satz von Verunreinigungen. Demgemäß findet der Antikörper gegen die ersten Verunreinigungen, der an die feste Phase gebunden ist, keine markierte Verunreinigung, an die er binden kann, um falsche positive Ergebnisse zu erzeugen, wenn das heterologe Antigen und sein Satz von Verunreinigungen markiert sind. Nur das Antigen selbst, das beiden Organismen gemeinsam ist, ist zur Ausbildung des Sandwiches aus Antigen-Antikörper-heterologem Antigen in der Lage. Daher kann nur markiertes Antigen an den Antikörper auf der festen Phase binden, unter Ausbildung eines wahren positiven Ergebnisses. Demgemäß verleiht dieses Merkmal diesem Verfahren für Immunoassays eine Spezifität, die nicht anderweitig nach den Immunoassayverfahren, die im Stand der Technik beschrieben sind, erhältlich ist.
- Obwohl die Vorrichtung und das Verfahren, die in dieser Erfindung beschrieben sind, zum Nachweis und/oder zur Titration jedweden Antikörpers in einer biologischen Flüssigkeit verwendet werden können, ist eine bevorzugte Verwendung dieser Erfindung der Nachweis oder die Titration von entweder Antikörper gegen das p41-Hüllantigen von HTLV III, von Antikörper gegen Hepatitis B Oberflächenantigen (HBsAg), oder auch Antikörper gegen Hepatitis B Kernantigen (HBcAg). Vorzugsweise werden die Vorrichtung und das Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Nachweis und/oder der Titration von Antikörper gegen p41-Antigen von HTLV III verwendet, von dem angenommen wird, daß er die erste und am meisten universelle Antikörperantwort in Individuen darstellt, die mit HTLV-III infiziert sind.
- Die Herstellung von Antigenen, wie dem p41-Hüllantigen von HTLV-III ist in der Technik gut bekannt. Zum Beispiel kann man einen Virus wie das HTLV-III zerstückeln, und das p41- Antigen über mehrfache chromatographische Trennungen, über isoelektrische Fokussierung und über Affinitätschromatographie auf reinigen.
- Ein bevorzugteres Verfahren für die Herstellung eines reinen Antigens wie dem p41-Antigen ist über die Anwendung rekombinanter DNA-Techniken. Der erste Schritt bei einem solchen Verfahren ist der Erhalt eines Abschnittes von cDNA, die für das gewünschte p41-Antigen kodiert. Eine Möglichkeit, dies durchzuführen, wäre die Isolation von mRNA aus dem HTLV-III- Virus und die Herstellung von cDNA, die für das gewünschte p41- Antigen codiert, über die in vitro-Anwendung von Revers transkiptase
- Alternativ kann die DNA chemisch synthetisiert werden. Es kann eine Anzahl von Oligonukleotiden hergestellt werden, aus denen die gewünschte cDNA synthetisch unter Anwendung von DNA- Polymerase und DNA-Ligase aufgebaut werden kann. Der Aufschluß mit Restriktionsendonuklesase beider Enden kann geeignete kohäsive Restriktionsstellen für die Insertion in ein Plasmid hinterlassen.
- Die oben offenbarte synthetische DNA oder cDNA kann mit terminalem Endabschnitt ausgelegt werden (d. h. sie kann mit kohäsiven Enden ausgestattet sein), indem entweder Restriktionsendonuklease verwendet wird, oder sie kann mit einem terminalen Endabschnitt ausgelegt werden, indem das geeignete Nukleotid wie Oligo-dC und terminale Transferase verwendet werden.
- Welches Verfahren auch immer zur Ausgestaltung des Endabschnittes gewählt wird, es kann dann ein Plasmid wie pUC-9 (Pharmacia, Piscataway, New Jersey) genommen werden, und an einer einzelnen Stelle mittels einer Restriktionsendonuklease gespalten werden, wie mittels PstI (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) . Dem gespaltenen pUC-9 kann ein Oligo-dC Endabschnitt erteilt werden, der zu dem Oligo-dC Endabschnitt der DNA komplementär ist, die für das gewünschte Peptid codiert. Das gespaltene Plasmid und die DNA, die für das Antigen codiert, können verschmolzen und ligiert werden. Wirtszellen wie Escherichia coli (E. coli) können durch Inkubation mit dem geeigneten rekombinanten Plasmid zu Zellen transformiert werden, die das p41-Antigen herstellen. Die transformierten E. coli Wirtszellen können dann unter geeigneten Bedingungen aufgezogen werden, um das p41-Antigen in gewissen Mengen zu exprimieren. Die Abtrennung des p41-Proteins wird wie in Beispiel 6 beschrieben durchgeführt. Die verschiedenen Arbeitsschritte, die Nukleinsäuren betreffen, sind in Miniatis, et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 3-17 (1982) beschrieben.
- Ähnlich kann jegliches andere Protein oder Glycoprotein, für das ein cDNA-Fragment erhalten wurde, unter Anwendung der oben beschriebenen Technik exprimiert werden. Jedoch sind folgende, als Proteine und Glycoproteine, die die Antigene der vorliegenden Erfindung zur Verfügung stellen, besonders bevorzugt: das p41-Hüllprotein, das p24-Kernprotein und das gp120-Oberflächenglycoprotein von HTLV-III (ebenfalls als HIV bekannt); und die verschiedenen Antigene des Hepatitis-B-Virus (HEV); wie das Oberflächenantigen (HBsAg), das Kernantigen (HBcAg), und das e-Antigen (HBeAg). Die Abtrennung dieser Proteine wird unter Anwendung der in Beispiel 6 beschriebenen Verfahren durchgeführt.
- Auf ähnliche Weise und unter Anwendung der oben beschriebenen Verfahren, kann auch Hefe zu einem Organismus transformiert werden, der das Antigen produziert, indem der Hefe ein geeignetes rekombinantes Plasmid verabreicht wird, das die DNA enthält, die für das interesierende Antigen codiert, wie beispielsweise p41, wodurch der heterologe Organismus der vorliegenden Erfindung zur Verfügung gestellt wird.
- Beispiele für heterologe Organismen, die für die Antigenherstellung geeignet sind, umfassen Bakterien wie Escherichia coli und Bacillus megaterium, Hefe, Mäusezellinien, und humane Zellinien sie H9 (Messing et al., Methods Enzymol., 101, 20-78 (1983)). Obwohl die Antigene, die von jedweden der beiden heterologen Organismen hergestellt werden, zufriedenstellende Ergebnisse bei der vorliegenden Erfindung liefern, wird Hefe besonders als der Organsimus bevorzugt, der das p41-Antigen zur Beschichtung der Kunstharzperlen herstellt; und E. coli ist der bevorzugte Organismus zur Herstellung des p41-Antigens zur Konjugation an eine Markierung.
- Es ist bemerkenswert, daß die Verfahren der vorliegenden Erfindung, die die Verwendung von rekombinant abgeleiteten Antigenen aus heterologen Quellen umfassen, durch den oben genannten Vorbehalt eingeschränkt sind.
- Es fällt ebenfalls unter den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung, daß das Antigen das auf die feste Phase aufgezogen ist, und das Antigen, das an die Markierung gebunden ist, nicht vollständig identisch sind, solange beide Antigene wenigstens eine antigene Determinate ("Eptiop") gemeinsam haben, die das hochspezifische Antigen-Antikörper-Antigen-Sandwich der vorliegenden Erfindung zu erzeugen vermag.
- Zum Beispiel kann im Falle des p41 Antigens das vollständige p41-Antigen geklont, und in einem Organismus exprimiert werden, so daß es die immunodominante Domäne von p41 und seine hydrophobe carboxylterminale Domäne enthält. Die hydrophobe carboxylterminale Domäne ist auf Grund ihrer Fähigkeit, an der festen Phase anzuhaften, hilfreich. Das p41- Antigen zur Verwendung in der Markierung kann allein aus der aminoterminalen Hälfte des p41-Moleküls bestehen, dem die hydrophobe Region fehlt, das aber die immunodominante Domäne enthält, wodurch dem Antikörper erlaubt wird, sowohl an p41- Antigene zu binden, als auch den hochspezifischen Antigen- Antikörper-Antigen-Sandwichkomplex dieser Erfindung auszubilden.
- Es fällt ebenfalls unter den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung, daß Epitope des Antigens in der Sonde (d. h. Epitope, die an die Markierung konjugiert sind, wahlweise mittels rekombinanter Technologie exprimiert werden können. Ähnlich fällt es unter den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung, daß die rekombinante Technologie zur Expression eines Epitops gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, wobei das Epitop mit einer enzymatischen Markierung exprimiert wird, die bereits an ihm angeheftet ist.
- Andere Anwendungen der vorliegenden Erfindung umfassen die Verwendung der gleichen Konfiguration zur Herstellung eines Kombinationsassays, indem 2 oder mehr Antigene auf eine feste Phase aufgezogen werden, und 2 oder mehr Antigene aus heterologen Quellen als Sonde verwendet werden, so daß mehrere Antikörper gleichzeitig nachgewiesen werden können.
- Daher weisen das bei der vorliegenden Erfindung beschriebene Immunoassayverfahren und die Vorrichtung viele Vorteile auf. Insbesondere ist das Immunoassay, das in der vorliegenden Erfindung beschrieben ist, spezifischer als die Immunoassays nach dem Stand der Technik, die keine heterologen Antigenquellen verwenden. Darüber hinaus sind das beschriebene Immunoassayverfahren und die Vorrichtung zum Nachweis von Antikörper gegen HTLV-III wesentlich spezifischer als die Immunoassays nach dem Stand der Technik auf human anti-HTLV-III, die relativ nicht-spezifische Sonden wie markiertes Ziegen Antihuman-IgG, IgM oder IgA verwenden. Darüber hinaus ist das Assay einfach durchzuführen. Zusätzlich benötigt das Anti-HTLV-III- Immunoassay das hierin beschrieben ist, keine 1:100 oder 1:400 Verdünnungen der Testprobe, wie sie nach dem Stand der Technik benötigt werden.
- Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung der Erfindung und nicht der Einschränkung ihres Schutzumfanges.
- Dieses Beispiel stellt einen Vergleich mit dem Stand der Technik an.
- Dieses Beispiel veranschaulicht ein direktes Zwei-Schritt Immunoassay zum Nachweis von anti-p41 unter Verwendung einer radioaktiven Markierung. Das radioaktiv markierte Antigen wird nach dem Verfahren von Greenwood, et al., J. Biochem., 89:114- 123 (1963) hergestellt.
- Zunächst wird ein Verfahren gemäß dem Stand der Technik beschrieben, bei dem das Antigen, das auf einem Träger immobilisiert ist und das markierte Antigen von der gleicben Quelle abgeleitet sind.
- Eine Polystyrolperle (1/4 Inch) wird mit p41-Antigen, das in Hefe exprimiert worden ist, und von Hefe abgeleitet ist, in mit Phosphat gepufferter Salzlösung, 0,5µg/ml, pH 7,0, 2 Stunden lang bei 45º C beschichtet. Anschließend werden 200µl humaner Serumprobe, die eine unbekannte Menge an anti-p41 enthält, zu der Perle hinzugegeben, und auf einer Niveauoberfläche 2 Stunden lang bei 40º C inkubiert. Die Perle wird drei mal mit vier Milliliter deionisiertem Wasser gewaschen. Dann werden 200µl p41-Antigen, das von Hefe abgeleitet ist und mit 125 Jod markiert ist, zu der gewaschenen Perle hinzugegeben und eine Stunde lang bei 40º C inkubiert. Die Perle wird drei mal mit 5ml deionisiertem Wasser gewaschen und in ein Reagenzglas zur Auszählung der Raioaktivität auf einem Gamma- Scintillationszähler wie einem ANSR-Gammazähler von Abbott Laboratories, North Chicago, Illinois überführt. Je größer die Menge an anti-p41, die in der Serumprobe vorhanden ist, ist umso größer ist die Menge an nachgewiesener Radioaktivität.
- Das gleiche Immunoassay kann ebenfalls gemäß der Erfindung durchgeführt werden, indem eine Polystyrolperle verwendet wird, die mit p41 beschichtet ist, das von E. coli. abgeleitet ist. Bei der Anwendung dieses Verfahrens wird p41 aus Hefe verwendet, das mit ¹²&sup5;J markiert ist. Beide Assays sind für den Nachweis von Anti-p41 gleich gut.
- Dieses Beispiel ist ein direktes Zwei-Schritt Immunoassay für anti-p41 unter Verwendung eines Enzyms. Mit Meerrettich- Peroxidase (HRPO) markiertes Antigen wird gemäß dem Verfahren nach Nakane, et al., J. Histochem. Cytochem., 22:1084-1091 (1974) hergestellt, oder p41 wird biotinyliert (Hofmann, K. et al., (1982) Biochem.) und mit Kaninchen-anti-Biotin, das mit HRPO markiert ist, umgesetzt.
- Eine Polystyrolperle wird mit p41-Antigen (Hefe) beschichtet, wie dies in Beispiel 1 beschrieben ist. Zu der Perle werden 200µl humaner Serumprobe hinzugegeben, und die vereinigte feste und wässerige Phase wird auf einer Niveauoberfläche 2 Stunden bei 40º C inkubiert. Die Perle wird dann drei mal mit 5ml deionisiertem Wasser gewaschen. Als nächstes werden 200µl von p41-Antigen (E. coli) das mit Meerrettich-Peroxidase markiert ist, entweder direkt oder mittels Verwendung eines Biotin/Anti-Biotinsystems der Perle zugesetzt und 1 Stunde lang bei ungefähr 40º C inkubiert. Die Perle wird drei mal mit 5ml deionisiertem Wasser gewaschen und in ein Reagenzglas für die Farbentwicklung überführt. Zu der Perle in dem Reagenzglas werden 300µl o-Phenylendiamin-(OPD)- Substratlösung zugesetzt (enthaltend eine 12,8mg Tablette von 0- Phenylendiamin 2HCl, verdünnt in 5ml 1M Zitrat-Phosphat- Puffer, pH 5,5-6,0, enthaltend 0,02% Wasserstoffperoxid), und die Kombination wird 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wird 1,0ml 1N Schwefelsäure zu dem Reagenzglas zugesetzt. Die Farbe, die sich ausbildet wird auf einem Spektrophotometer abgelesen, bei einer Extinktion, die bei einer Wellenlänge von ungefähr 492nm bestimmt wird. Je größer die Menge an anti-p41 in der Probe, desto höher ist die gemessene Extinktion.
- Wie bei dem isotopischen Immunoassay nach Beispiel 1 angedeutet, kann die Quelle von p41, die für die Perle in Beispiel 2 ausgewählt worden, mit der p41-Quelle, die markiert werden soll, ausgetauscht werden, solange eine p41-Quelle gegenüber der anderen heterolog ist.
- Dieses Beispiel zeigt ein Ein-Schritt-Assay gemäß der vorliegenden Erfindung, das entweder eine ¹²&sup5;J- oder eine Meerrettich- Peroxidase-Markierung verwendet.
- Eine Polystyrolperle wird mit p41 (aus Hefe) beschichtet, wie dies in Beispiel 1 beschrieben ist. Zu der Perle werden in einem Reaktionsgefäß 100µl Humanserumprobe und 100µl p41 (E. coli) zugesetzt, das entweder mit ¹²&sup5;J oder mit Meerrettich- Peroxidase markiert ist, und dessen Inkubation ungefähr 2 Stunden bei 40º C fortschreitet. Die Perle wird dann drei mal mit 5ml deionisiertem Wasser gewaschen und in ein Reagenzglas entweder für die Auszählung der Radioaktivität (wie in Beispiel 1) oder für die Entwicklung der Farbe und die Messung der Extinktion bei 492nm (wie in Beispiel 2) überführt.
- Dieses Verfahren beschreibt eingehend ein direktes Zwei- Schritt-Immunoassayverfahren für Antikörper gegen Hepatitis-B- Oberflächenantigen. Bei diesem Verfahren wird Meerrettich- Peroxidase (HRPO), die nach dem Verfahren Nakane, et al., J. Histochem. Cytochem., 22:1084-1091 (1974) hergestellt wird verwendet. Alternativ, kann HBsAg nach dem Verfahren von Ngo, et al., biotinyliert werden und entw eder hit anti-Biotin (monoklonaler Antikörper der Maus oder polyklonaler Antikörper der Ziege) oder mit Avidin, das mit HRPO markiert ist, umgesetzt werden. Siehe: Ngo, et al., J. Appl. Biochem. Biotech., 7, 443- 454 (1982). Das mit HRPO markierte Avidin ist im Handel von der Sigma Chemical Co., St. Louis, MO erhältlich.
- Dieses Verfahren wurde gemäß Beispiel 2 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß das aus Humanplasma abgeleitete HBsAg zur Beschichtung der Perle verwendet wurde, und daß das rekombinant abgeleitete HBsAg aus transfektierten Maus-L-Zellen als Sonde verwendet wurde, d. h. es wurde an die HRPO-Markierung konjugiert.
- Die unten dargestellte Reaktionskurve war für die nach diesem Verfahren erhaltenen Ergebnisse typisch. anti-HBSAA Konzentration Extinktion bei 492nm Negative Kontrolle Positive Kontrolle
- Dieses Beispiel beschreibt ein direktes Drei-Schritt- Immunoassayverfahren für anti-p41 bei dem Mikropartikel, die mit rekombinantem p41 beschichtet sind, dad in Bacillus megaterium (B. meg.) exprimiert wurde und von diesem abgeleitet ist, auf einem Filter abgelegt werden, und als feste Phase verwendet. See beschreibt im U. 5. Patent Nr. 4 632 901 eine feste Phase, die beschichtete Mikropartikel umfaßt, die auf einem Filter abgelegt sind.
- Bei diesem Verfahren werden 300µl einer Testprobe zu 200µl Probenverdünner zugesetzt, auf den Filter gegossen, der sich überhalb eines absorbierenden Bausches befindet, und 3 Minuten inkubieren lassen. Der Filter, der die Mikropartikel enthält, über den die verdünnte Probe laufengelassen wird, wird dann 3 Minuten lang mit biotinylierten p41 umgesetzt, das nach dem Verfahren von Ngo, et al., J. Appl. Biochem and Biotech., 7, 443-454, (1982) hergestellt worden ist. Anschließend wird der Filter zu einer Lösung zugesetzt, die entweder Antikörper gegen Biotin enthält, die mit alkalischer Phosphatase markiert sind, oder Avidin, das mit alkalischer Phosphatase markiert ist. Nach einer 3-minütigen Inkubationsdauer wird der Filter ausgiebig mit einer gepufferten Salzlösung, pH 6,5-9,5, 0,9%ig NaCl, gewaschen. Zu dem Filter wird dann eine Lösung des Substrates zugesetzt, das dann mit der gesamten immobilisierten alkalischen Phosphatase unter Ausbildung eines Chromogens reagiert, wodurch die Anwesenheit des Antikörpers gegen p41 und daher der Kontakt mit dem HTLV-III-Virus angezeigt wird.
- Obwohl jegliche organische Phosphatverbindung, die zur Ausbildung eines Chromophors nach Hydrolyse durch alkalische Phosphatase fähig ist, als Substrat verwendbar ist, sind die bevorzugten Substrate substituierte Phenyl-, Naphthyl- und Indolphosphate. Insbesondere bevorzugt als Substrate für die alkalische Phosphatase-Markierung ist 5-Brom-4-chlor-3- indolylphosphat oder 3-Indoxylphosphat und Analoga und Derivate dieser.
- Das rekombinante HTLV-III-p41-Protein, das in E. coli hergestellt worden ist, wird unter Verwendung einer Affinitätssäule und von Ionenaustauschchromatographie gereinigt. Der Überstand des bakteriellen Lysats wird auf eine Affinitätssäule aufgegeben, die aus Sepharose -4B-Perlen besteht, an die monoklonaler anti-HTLV-III-p41-Antikörper gebunden ist. Die Säule wird mit einem Puffer aus 0,5% TRITON X- gewaschen, und das gebundene HTLV-III-p41 wird mit dem gleichen Puffer eluiert, der SM Nal enthält. Die eluierte Proteinlösung wurde eingehend dialysiert, um das Nal zu entfernen und 1:1 mit einem Ethanolaminpuffer vermischt, der 0,1%ig Tween 20 und 7M Harnstoff (Puffer A) enthielt, und sie wurde auf eine DEAE-Anionenaustauschsäule aufgegeben. Die Säule wurde ausgiebig in Puffer A gewaschen, dann wurde das gebundene Protein unter Verwendung eines 100-500mM NaCl-Gradienten in Puffer A eluiert. Die Peakfraktionen der p41-Aktivität wurden vereinigt und dialysiert, um den Harnstoff zu entfernen.
- Auf ähnliche Weise wurde das rekombinante p24, das in E. coli hergestellt worden war, mittels Durchgang des Überstandes des bakteriellen Lysats durch eine Affinitätssäule, die aus Sepharose-4B -Perlen bestand, an die monoklonaler anti-HTLV-III p24-Antikörper gebunden war, gereinigt. Die Säule wurde mit einem Puffer gewaschen, der 0,1% TRITON X-100 enthielt, und das gebundene p24 wurde mit dem gleichen Puffer eluiert, der 4M Guanidinhydrochlond (GuHCl) enthielt. Die eluierte Proteinlösung wurde ausgiebig dialysiert und dann erneut auf eine zweite Affinitätssäule aufgegeben und wie oben eluiert. Die Peakfraktionen an p24 wurden vereinigt und dialysiert, um das GuHCl zu entfernen
- Um die rekombinanten Proteine weiter zu charakterisieren, wurden die gereinigten p24-Kern oder p41-Hüllantigene einer Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS PAGE) und einer Western Blot Analyse nach Schupbach et al., Science, 224, 503-505 (1984) unterworfen.
Claims (13)
1. Verfahren zum Nachweis eines gegen ein Antigen
spezifischen Antikörpers in einer Testprobe, das eine feste
Phase verwendet, auf der ein erstes Antigen, das gegen den
nachzuweisenden Antikörper spezifisch ist, immobilisiert worden
ist, wobei der Antikörper, der in der Probe nachgewiesen werden
soll, an das erste Antigen bindet, wodurch er immobilisert wird,
und wobei der immobilisierte Antikörper darüberhinaus an ein
zweites Antigen bindet, das eine Markierung trägt, dadurch
gekennzeichnet, daß das zweite Antigen von einer Quelle
abgeleitet ist, die zu der Quelle des ersten Antigens heterolog
ist, vorausgesetzt daß, wenn sowohl das erste als auch das
zweite Antigen rekombinant abgeleitete Antigene sind, und wenn
die Anwesenheit des Antikörpers in der Testprobe durch Messen
der Anwesenheit der Markierung auf der festen Phase nachgewiesen
und/oder titriert wird, dann das Verfahren durch eine der
folgenden Bedingungen weiter gekennzeichnet ist:
(1) das erste und das zweite Antigen sind gleichzeitig ein Glied
der Gruppe, die das gpl2c-Antigen von HTLV-III, HBsAg, HBcAg,
HBeAg oder ein antigenes Fragment oder ein Epitop von diesen
umfaßt, (2) die Markierung ist ¹²&sup5;I, Fluorescein,
Fluoresceinanaloga und Fluoresceinderivate, Phycobiliprotein,
Umbelliferon und Umbelliferonanaloga und Umbelliferonderivate
oder Meerrettichperoxidase, (3) das erste oder zweite Antigen
wird von B. megaterium, von Mäusezellinien oder von
Humanzellinien hergestellt, oder (4) die feste Phase ist aus
Mikropartikeln oder Perlen aus Glas oder Latex, aus
Reagenzgläsern aus Kunstharz oder Glas, aus Zellulose und
modifizierten Zellulosematerialien oder aus faserigen
Materialien aus Kunstharz oder aus Glas gewählt.
2. Verfahren zum Nachweis eines gegen ein Antigen
spezifischen Antikörpers in einer Testprobe, das folgende
Schritte umfaßt:
(a) Inkubieren einer festen Phase auf der ein erstes
Antigen, das gegen den Antikörper, der nachgewiesen werden soll,
spezifisch ist, immobilisiert worden ist, mit einer Testprobe,
die eine wässerige Phase darstellt, und die den gegen das
Antigen spezifischen Antikörper enthält, oder von der dies
vermutet wird,
(b) Inkubieren der in Schritt (a) erzeugten festen Phase
mit einer wässerigen Phase, die ein zweites Antigen mit einer an
diesem angebrachten Markierung enthält, wobei das zweite Antigen
von einer Quelle abgeleitet ist, die zur Quelle des ersten
Antigens heterolog ist,
(c) Abtrennen der wässerigen Phase von der festen Phase,
(d) Messen der Anwesenheit der Markierung auf der festen
Phase oder in der flüssigen Phase zum Nachweis und/oder zur
Titration der Anwesenheit von Antikörper in der Testprobe,
vorausgesetzt, daß das erste und das zweite Antigen
wenigstens eine antigene Determinante gemeinsam haben, um die
Kreuzvernetzung des ersten und zweiten Antigens durch den
antigenspezifischen Antikörper in der Testprobe zu erlauben, und
desweiteren vorausgesetzt, daß wenn sowohl das erste als auch
das zweite Antigen rekombinant abgeleitete Antigene sind, und
wenn die Anwesenheit des Antikörpers in der Testprobe durch
Messen der Anwesenheit der Markierung auf der festen Phase
nachgewiesen und/oder titriert wird, dann das Verfahren durch
eine der folgenden Bedingungen weiter gekennzeichnet ist:
(1) das erste und das zweite Antigen sind gleichzeitig ein Glied
der Gruppe, die das gp120-Antigen von HTLV-III, HBsAg, HBcAg,
HBeAg oder ein antigenes Fragment oder ein Epitop von diesen
umfaßt, (2) die Markierung ist ¹²&sup5;I, Fluorescein,
Fluoresceinanaloga und Fluoresceinderivate, Phycobiliprotein,
Umbelliferon und Umbelliferonanaloga und Umbelliferonderivate
oder Meerrettichperoxidase, (3) das erste oder zweite Antigen
wird von B megaterjum, von Mäusezellinien oder von
Humanzellinien hergestellt, oder (4) die feste Phase ist aus
Mikropartikeln oder Perlen aus Glas oder Latex, aus
Reagenzgläsern aus Kunstharz oder Glas, aus Zellulose oder
modifizierten Zellulosematerialien oder aus faserigen
Materialien aus Kunstharz oder aus Glas gewählt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 wobei das erste oder
das zweite Antigen nach folgendem Verfahren abgeleitet wurde:
Zerstückeln eines Virus und Aufreinigen des Antigens.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das erste oder
das zweite Antigen das p41-Antigen von HTLV-III ist, das nach
folgendem Verfahren abgeleitet wurde: Zerstückeln des HTLV-III-
Virus und Aufreinigen des p41-Antigens.
5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das erste oder
das zweite Antigen ein rekombinant abgeleitetes Antigen ist.
6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das erste Antigen
gereinigtes p41-Antigen aus Hefe ist, das auf einer
Polystyrolperle immobilisiert ist.
7. Verfahren zum Nachweis eines gegen ein Antigen
spezifischen Antikörpers in einer Testprobe, das folgende
Schritte aufweist:
(a) In-Kontakt-Bringen einer festen Phase, auf der ein
erstes rekombinant abgeleitetes Antigen, das gegen den
Antikörper, der nachgewiesen werden soll, spezifisch ist,
immobilisiert worden ist, mit einer Testprobe, die eine
wässerige Phase darstellt, und die den gegen das Antigen
spezifischen Antikörper enthält, oder von der dies vermutet
wird,
(b) In-Kontakt-Bringen der in Schritt (a) erzeugten
festen Phase mit einer wässerigen Phase, die ein zweites
rekombinant abgeleitetes Antigen mit einer an diesem
angebrachten Markierung enthält, wobei das zweite rekombinant
abgeleitete Antigen von einer Quelle abgeleitet ist, die zur
Quelle des ersten rekombinant abgeleiteten Antigens heterolog
ist,
(c) Abtrennen der wässerigen Phase von der festen Phase,
(d) Messen der Anwesenheit der Markierung auf der festen
Phase oder in der flüssigen Phase zum Nachweis und/oder zur
Titration der Anwesenheit von Antikörper in der Testprobe,
vorausgesetzt, daß das erste und das zweite Antigen
wenigstens eine antigene Determinante gemeinsam haben, um die
Kreuzvernetzung des ersten und zweiten Antigens durch den
antigenspezifischen Antikörper in der Testprobe zu erlauben, und
desweiteren vorausgesetzt, daß wenn die Anwesenheit des
Antikörpers in der Testprobe durch Messen der Anwesenheit der
Markierung auf der festen Phase nachgewiesen und/oder titriert
wird, dann das Verfahren durch eine der folgenden Bedingungen
weiter gekennzeichnet ist:
(1) das erste und das zweite Antigen sind gleichzeitig ein Glied
der Gruppe, die das gp120-Antigen von HTLV-III, HBsAg, HBcAg,
HBeAg oder ein antigenes Fragment oder ein Epitop von diesen
umfaßt, (2) die Markierung ist ¹²&sup5;I, Fluorescein,
Fluoresceinanaloga und Fluoresceinderivate, Phycobiliprotein,
Umbelliferon und Umbelliferonanaloga und Umbelliferonderivate,
oder Meerrettichperoxidase, (3) das erste oder zweite Antigen
wird von B. mepaterium, von Mäusezellinien oder von
Humanzellinien hergestellt, oder (4) die feste Phase ist aus
Mikropartikeln oder Perlen aus Glas oder Latex, aus
Reagenzgläsern aus Kunstharz oder Glas, aus Zellulose und
modifizierten Zellulosematerialien oder aus faserigen
Materialien aus Kunstharz oder aus Glas gewählt.
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Markierung ein Enzym
oder ein Radioisotop ist.
9. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Schritte (a) und (b)
gleichzeitig durchgeführt werden.
10. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die feste Phase eine
Polystyrolperle ist.
11. Verfahren zum Nachweis von Antikörper. gegen p41 (HTLV-
III) in Humanserum, das folgende Schritte umfaßt:
(a) Zugeben einer Humanserumprobe zu einer
Polystyrolperle, die mit gereinigtem p41-Antigen aus Hefe
beschichtet ist,
(b) etwa 2-stündiges Inkubieren bei ungefähr 40ºC,
(c) Waschen der Perle mit deionisiertem Wasser,
(d) Zugeben von gereinigtem und markiertem p41-Antigen
oder eines gereinigten und markierten Fragmentes oder Epitopes
desselben zu der Perle, wobei das p41-Antigen oder dessen
Fragment oder Epitop von Mäusezellen abgeleitet ist, und wobei
das Fragment oder Epitop genügend antigene Determinanten mit dem
Antigen aus Schritt (a) gemeinsam hat, so daß dadurch die
Kreuzvernetzung mittels eines im Humanserum vorhandenen
Antikörpers gegen p41 erlaubt wird,
(e) Inkubieren für ungefähr eine Stunde bei etwa 40º C,
(f) Waschen der Perle mit deionisiertem Wasser,
(g) Abtrennen von nicht umgesetzten Reagenzien von der
Perle, und
(h) Messen der Anwesenheit der Markierung auf der Perle.
12. Verfahren zum Nachweis von Antikörper gegen p41 (HTLV-
III) in Humanserum, das folgende Schritte umfaßt:
(a) Zugeben einer Humanserumprobe zu einer
Polystyrolperle, die mit gereinigtem p41-Antigen aus Hefe
beschichtet ist,
(b) etwa 2-stündiges Inkubieren bei ungefähr 40ºC,
(c) Waschen der Perle mit deionisiertem Wasser,
(d) Zugeben von gereinigtem und mit 1251 markiertem p41-
Antigen oder eines gereinigten und mit 1251 markierten Fragmentes
oder Epitopes desselben zu der Perle, wobei das p41-Antigen oder
dessen Fragment oder Epitop von einem Organismus abgeleitet ist,
der zu demjenigen, der zur Herstellung des p41-Antigens auf der
Perle verwendet wurde, heterolog ist, und wobei das Fragment
oder Epitop genügend antigene Determinanten mit dem Antigen aus
Schritt (a) gemeinsam hat, so daß dadurch die Kreuzvernetzung
mittels eines im Humanserum vorhandenen Antikörpers gegen p41
erlaubt wird,
(e) Inkubieren für ungefähr eine Stunde bei etwa 40º C,
(f) Waschen der Perle mit deionisiertem Wasser,
(g) Abtrennen von nicht umgesetzten Reagenzien von der
Perle, und
(h) Messen der Anwesenheit der Markierung 1251 auf der
Perle.
13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei das p41-Antigen nach
Schritt (d) in E. coli hergestellt wird.
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