CN1192648A - 用于贮存和分析遗传物质的干固体介质 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种干固体介质,用于以适合于随后分析的形式贮存遗传物质样品(包括RNA和DNA)。本发明的干固体介质包括一种干固体基质以及一种组合物,后者包括一蛋白质变性剂和一螯合剂。干固体介质可以还包括一种组分,该组分在利用例如PCR、逆转录酶起始的聚合酶链反应、LCR、RFLP或遗传杂交法进行遗传物质的随后分析中起作用。用于随后分析的组分包括例如一种核苷酸序列(诸如引物、DNA或RNA探针)和一种靶序列稳定剂。干固体介质也可包含一种保留剂,以增强用于随后分析组分的保留。本发明还为利用本发明的干固体介质提供多种方法。干固体介质及其使用方法特别适宜于自动化***。
Description
发明领域
本发明领域涉及以适于贮存或随后分析形式用于收集遗传物质的一种干固体介质和方法。本发明进一步提供贮存遗传物质的分析,包括适用于自动化分析***的方法。
背景
待分析的含有遗传物质(包括DNA或RNA)的血液,通常由采自人或动物的采血地点,以纯化的遗传物质、液态全血、冷冻全血或干于纸上的全血的形式运送到分析地点。但是,所有这些方法都有缺点。血液中遗传物质以干的提纯的遗传物质运输是最称心的,但它需要从人或动物采血处有可用的高标准技术援助。当在采血地点无技术援助可用时,通常将全血或其它未提纯的样品送到中心实验室,在该处提纯遗传物质。
液态全血的运输通常包括必需无菌收集。在某些情况下,例如样品是自婴儿脚后跟针刺取样时,这是极其不方便的。液态全血或冷冻血液的运输可能还需要温度受控的运输或正规的邮政***之外的运输***。甚至在考虑公共卫生关系之前,也是如此。此外,涉及与全血相关的病原体,诸如HIV,除了是在适当的和耗资的监督情况下,一般是拒绝运输潜在传染性液态或冷冻样品的。
在滤纸上干燥的血的运输被证实是上述步骤的一种可替代步骤。遗传物质能从干于滤纸上的全血斑点提取和分离出来,其形式以及足够的量适用于遗传分析。McCabe,E.R.B等报道“从滤纸吸印纸上的血斑进行DNA微量提取:潜在筛选应用于新生儿筛选”Hum.Genet.第75卷,第213-216页(1987)。但是,此步骤仍有许多缺点,例如,通常没有仔细和迅速地破坏与血相关的微生物。病原微生物的存在对处理血的全体人员可能造成一种潜在的危险。此外,某些微生物可能对遗传物质造成损害。虽然通过干燥可以对微生物产生某种抑制,但已知缓慢干燥,或者甚至是在高相对湿度条件下细微程度的再水化,可以允许能破坏DNA或RNA的微生物区系生长。
用现行方法对血液中遗传物质干运输的另一个缺点是缺乏对降解遗传物质过程的有意抑制。因此,甚至在有抑菌剂存在时,仍有条件允许遗传物质的酶促、非酶促和自溶性损坏。此外,利用现在可行的干贮存方法,若需要解附高分子量DNA或RNA会遇到相当大的困难。表面吸附影响能造成遗传物质的丧失,这可能会引起最少降解的、即最想要的一类DNA或RNA分子优先丧失。
因而需要一种安全、方便和最低劳动强度的方法来贮存液态样品中所含的遗传物质。
但是,即使一种遗传物质样品以一种安全、方便而且可靠的贮存方式收集起来,但对贮存样品的随后分析可能会产生计算上的问题。当在一种收集的样品上进行许多不同类型的分析时,尤其如此。当多种样品提交分析时,计算趋向于变得更复杂些。
例如,用于特殊遗传序列的某些遗传物质分析方法,诸如聚合酶链反应(PCR)分析,需要使用一种寡核苷酸的引物对。通常每一次进行的序列分析使用一种不同的引物对,而且因为有极其大量可能的引物对(例如,人、动物和所有其它生物有机体,包括人和动物的病原体的基因内每一序列都有一引物对),在一种单个样品中的多种序列分析可能产生巨大的计算问题。当接受遗传物质的多种样品来分析时,诸如在中心分析实验室,这些问题可能会更大些。
遗传物质的自动化分析对处理大量的样品提供较高的效率。但是,含遗传物质的一种样品的自动化分析,仍需要自动化***对每一套不同的引物具有分开的传送设备,以防止交叉污染的发生。因此,能同时进行遗传序列分析的范围,由于引物交叉污染的内在问题而可能受到限制。因此,需要用自动化***减少分析遗传物质多种序列或多种样品时的限制。
发明概述
本发明为贮存和分析液体介质中所含的遗传物质提供一种安全、方便和最低劳动强度的设备和方法。本发明进一步为遗传物质的贮存提供这样一种方式,以便容许利用自动化***来简化一种或多种遗传物质样品的分析。
本发明包括一种用于贮存遗传物质样品的干固体介质。本发明的干固体介质是由一个固体基质和一种组合物所组成,当将组合物应用于干固体介质时能保护贮存在干固体介质上的遗传物质免遭降解。干固体介质同可进一步提供条件使微生物失活,包括那些可能对人有可能致病的微生物。
干固体介质的组合物可以包括一种弱碱、一种螯合剂和一种蛋白变性剂,诸如一种去污剂。在另一实施方案中,若希望长期贮存遗传物质样品,该组合物可以进一步包括一种自由基捕集剂。
按照本发明,贮存于干固体介质上的遗传物质可以用本领域已知的方法进行分析,例如聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、逆转录酶起始的PCR、DNA或RNA杂交技术(包括限制性片段长度多态性(RFLP)和其它利用基因探针或DNA或RNA探针的技术)、基因组序列分析、酶测定、亲和标记、利用标记或抗体进行检测的方法以及其它类似的方法。
贮存在本发明干固体介质上的遗传物质可以进行原位分析或从干固体介质分离后进行分析。
在本发明的另一实施方案中,本发明的干固体介质可以包含一种组分,它在贮存的遗传物质样品的随后分析中起作用。按照该实施方案,用于随后分析的一种组分包括例如,核苷酸序列(诸如PCR引物)、靶序列稳定剂、基因探针、用于基因测序的引物或用于LCR分析的多套寡核苷酸底物。正如于此公开的,用于随后分析的化合物还可以包括一种适当稳定的酶。
本发明也提供使用干固体介质的方法。在一实施方案中,本发明提供了以一种基本上未降解的形式在干固体介质上贮存一种遗传物质样品的方法。本发明还提供了贮存和随后分析一种贮存的遗传物质样品的一种方法。在一个优选实施方案中,贮存的遗传材料在分析之前可洗涤,以除去可能与遗传材料样品相联的一些化合物和可能抑制随后分析的化合物。这样的化合物包括例如蛋白质、血红蛋白以及干固体介质组合物的组分。本发明提供了利用一种含水或非水的洗涤***洗涤贮存的遗传材料的方法。
用于洗涤遗传材料样品的含水或非水洗涤***,最好达到去除可能抑制随后分析的化合物,而基本上不影响贮存的遗传材料或可能包含在干固体介质上并可用于随后分析的组分。此外,本发明的含水或非水洗涤***还可用于洗涤贮存在例如固体基质上的遗传材料,该固体基质未吸着本发明的组合物。
在一实施方案中,本发明的非水洗涤***提供使本发明的干固体介质上贮存的遗传材料样品与于此描述的单相酚溶液的接触。将单相酚溶液除去,并将含有遗传材料样品的干固体介质随后与含水酒精洗涤溶液相接触。除去含水酒精洗涤溶液,遗传材料样品可以进一步用含水的离子溶液洗涤。然后将洗涤后的遗传材料样品用本领域已知的方法(包括上述的那些方法)进行分析。
含水洗涤***是本领域已知的。在某些情况下,一种洗涤***可能引起包含在本发明干固体介质上并可用于随后分析的组分的一些损失。在本发明的一实施方案中,于此公开的保留剂可用来减少在遗传材料样品处理期间用于随后分析的一种组分的损失。
本发明干固体介质上贮存的遗传材料样品还可用标准的酶促试验进行分析,例如用于检测苯丙酮酸尿症(PKU)或半乳糖血症的酶促试验,最好在用例如于此公开的转化剂溶液(converter solution)中和干固体介质中使蛋白质变性组分的作用后,再进行酶促试验。
干固体介质以及包含一种用于随后分析的组分的干固体介质,对利用自动化***分析遗传物质样品是特别有用的。
附图简述
图1:由贮存在本发明干固体介质上的血液样品所得的PCR扩增DNA的溴化乙锭染色的凝胶照片。
图2:由贮存在本发明干固体介质上的血液样品所得的PCR扩增DNA(包括用于PCR分析的寡核苷酸引物)的溴化乙锭染色的凝胶照片。
图3:贮存于本发明干固体介质上经EcoRI消化的人血DNA的溴化乙锭染色的凝胶照片。
发明的详细描述
本发明提供了在形式上适宜于贮存或随后分析收集的遗传物质的一种干固体介质。本发明还提供了收集在本发明干固体介质上的遗传物质的随后分析方法。于此公开的干固体介质和使用方法,通常提供了一种安全、方便而且可靠的、并考虑到精确分析结果的贮存遗传物质样品的介质。此外,例如在中心分析实验室利用自动化***分析多种样品时,本发明还提供较高的分析效率。
在贯穿于本说明书的几个地方,通过实例一览表提供指导。本发明人希望清楚地表明的是,列举的表仅用作代表性的一组,但它并不意味着列举的那些实例是排他性的。
在此所用的短语“遗传物质”(GM)是指脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)中的任一种或者是两者。按照本发明,通过由来源取样,并把样品加到于此描述的干固体介质上,将一种GM样品收集在本发明的干固体介质上。将GM样品由来源取样的方法是本领域已知的。例如,血液中的一种GM样品可由人或动物来源通过静脉穿刺取样,然后将取样的样品加到本发明的干固体介质上。
此处所用的“遗传物质样品”或“GM样品”包括一种液体(它含有溶解的、悬浮的、混合的或者以其他形式在其中含有DNA或RNA或两者都有)、含有DNA或RNA或两者的细胞,或是含有DNA或RNA或两者的细胞组分。一旦GM样品加到干固体介质上,液体趋向于蒸发(蒸发可通过本领域已知的干燥方法例如一种暖风干燥器来增强)而使携带的DNA或RNA以干燥形式留在干固体介质上。以“干燥形式”留在干固体介质上的GM可以是提纯的DNA或RNA、半提纯的DNA或RNA、或者是在细胞中的DNA或RNA。
加到干固体介质上的GM样品可以得自任何来源。这包括:例如生理/病理体液(例如分泌物、***物、渗出物和漏出物)或人和动物的细胞悬浮液(例如血液、淋巴液、滑液、***、含有口腔细胞的唾液、皮屑、发根细胞等);植物的生理/病理液体或细胞悬浮液;细菌、真菌、质粒、病毒等的液态产物、提取物或悬浮液;包括蠕虫、原生动物、螺旋体等寄生物的液态产物、提取物或悬浮液;人或动物躯体组织(例如骨、肝、肾等)的液态提取物或匀浆;来自DNA或RNA合成的媒介;用化学法或生物学法合成的DNA或RNA的混合物;以及DNA或RNA在或可能在一种液态媒介中的任何其他来源。
本发明的干固体介质是供GM样品的贮存或随后分析用的。干固体介质是由一种固体基质所组成的,在其上已吸着一种能保护贮存在介质上的GM免遭降解的组合物。该组合物也能使微生物失活。这包括与GM样品相联的微生物,它可潜在地使GM样品降解或可潜在地对贮存的GM样品的处理者有致病性。
一种干固体介质和一种吸着在固体基质上的组合物公开在国际专利申请PCT/AU89/00430(WO 90/03959)中,它通过引用结合到本文中。
在此使用的术语“用来贮存的”“(Storing)”、“贮藏”“(Storage)”、“被贮存的”“(Stored)”以及“贮存”“(Store)”这字的其他衍生词是指GM以一种适合于随合分析或未遭到实际降解的形式进行保存。按照本发明,GM的贮存时间周期可短至将GM样品由取样处转移到随后进行分析地点所必需的时间。GM样品能贮存在本发明干固体介质上的条件是可变的。样品通常贮存在由-200℃至40℃的温度范围内。此外,贮存的样品可以可选地贮存在干的或干燥的条件下,或贮存在隋性气体中。贮存可以是几秒钟直到许多年,最好是大约几秒钟直到100年。
在本发明的另一实施方案中,干固体介质还能包括一种组分,它是在对贮存的GM样品上进行的随后分析中起作用的。可以对贮存在干固体介质上GM样品进行的随后分析包括本领域已知的分析方法,例如聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、逆转录酶起始的PCR、DNA或RNA杂交技术(包括限制性片段长度多态性(RFLP)以及利用基因探针(DNA或RNA)的其他技术)、基因组序列分析、酶测定、亲合标记、利用标记或抗体的检测方法以及其它类似的方法。此外,本发明人认识到许多新的分析和诊断方法在将来可能被开发出来,本发明的干固体介质和方法对它们可能是合适的,这些方法在这里所附的权利要求书的精神和范围内。
对于贮存的RNA,特别是不稳定的RNA,可包含在干固体介质上用于随后分析的一种组分能保护RNA免受降解。这种组分包括RNA酶抑制剂和灭活剂、基因探针、互补DNA或RNA(或功能相同的化合物)、蛋白质以及稳定RNA或阻止其降解的有机部分。
一般地讲,本发明的干固体介质也是一种适用于贮存一种组分的介质,该组分可用于随后分析,并可包含在干固体介质上。
一旦GM被收集在干固体介质上,它能被包入保护材料(例如一种塑料膜)中,后者能进一步保护GM在贮存期间免受降解。贮存在本发明的干固体介质上GM的随后分析可在原位进行,另一方法是在随后分析前,可首先从干固体介质取出GM。I.干固体介质
本发明的干固体介质提供了将GM带到干固体介质上的方法。此处所用的术语“带”“(entrain)”及其衍生词是指在贮存期间GM被结合到干固体介质上,而基本上不依赖离子的、共价的或范德华的相互作用。于此所用的“基本上不依赖”是指这种相互作用在使GM保持在干固体介质上可能不是一种重要的因素。最好离子的、共价的或范德华的相互作用对将GM带到干固体介质上是非必需的。
本发明的干固体介质包括一种吸着到固体基质的组合物。于此所用的术语“吸着”是指本发明的组合物被吸收、吸附或掺入或掺到固体基质上,使得不容易从基质移开,除非遭受到有意或不慎从固体基质移开吸着的组合物的条件。吸着的组合物在正常的贮存条件下最好不容易移去。
适用于本发明干固体介质和方法的固体基质,包括将组合物吸着到其上的任何材料,而且该材料不抑制加到干固体介质上GM的贮存或随后分析。这包括一种二维平而干的基质或三维基质,诸如与粘合剂结合而形成一个小团或小块的一种基质,而组合物则被吸着在其上。
在一种优选的实施方案中,固体基质具有多孔性质,以将GM带至干固体介质上。一种适合于此目的的固体基质包括(但不限于)一种基质,它是以基于纤维素(例如,纤维素、硝化纤维素或羧甲基纤维素纸)的亲水性聚合物,包括合成的亲水性聚合物(例如聚酯、聚酰胺、碳水化合物聚合物)、聚四氟乙烯(EmporeTM、3M,圣保罗、明尼苏达)、纤维玻璃以及多孔陶瓷。
按照本发明,GM也可收集在缺乏下述本发明组合物的固体基质上。此外,用于GM样品随后分析的组分也可包含在缺乏本发明组合物的固体基质上。此外,利用下述含水的或非水的提取步骤,可将血红蛋白、蛋白质或其它与GM样品相联的化合物从贮存在固体基质上的GM样品中除去,这些化合物可以包括或可以不包括一种用于贮存的GM随后分析的组分。但是,由于仅使用一种固体基质贮存GM,本发明组合物保护GM不受降解和使微生物失活的作用可能不存在。
为了制备一种本发明的干固体介质,将一种保护GM免受降解的组合物吸着到固体基质上。此处所用的短语“保护GM免受降解”是指本发明的干固体介质使贮存的GM保持在基本上未降解的形式。这使GM样品适合于进行许多不同类型的随后分析步骤。保护GM不受降解可包括保护GM不受由于GM受损事件造成的实质损坏,诸如化学试剂或生物学因素(包括细菌、自由基、核酸酶)、紫外辐射、氧化剂、烷化剂或酸性试剂(例如空气中的污染物质)所引起的损坏事件。
吸着到本发明固体基质中的组合物可包括一种或多种弱碱、螯合剂或蛋白质变性剂,诸如去污剂或表面活性剂。此外,吸着到干固体介质上的组合物还可以包括一种自由基捕集剂。
于此所用的“自由基捕集剂”是一种化合物,它作为一种与自由基的反应物,所具有的充分反应性超过了DNA分子或其组分所具有的反应性,而且它足够稳定,本身不会产生有破坏性的自由基。
此处所用的适合于发明组合物的“弱碱”可以是路易氏碱,它的pH值大约是6-10,最好是约为pH8-9.5。弱碱的一种功能是可用作缓冲液以维持组合物的pH约为6-10,最好是约为pH8.0-9.5,例如pH8.6。因此一种适合于本发明组合物的弱碱与组合物的其它组分相结合时,提供组合物的pH为6至10,最好是约为pH8.0至9.5。按照本发明,合适的弱碱包括有机碱和无机碱。合适的无机弱碱包括例如,一种碱金属碳酸盐、碳酸氢盐、磷酸盐或硼酸盐(例如碳酸钠、碳酸锂或碳酸钾)。合适的有机弱碱包括例如,三羟甲基氨基甲烷(Tris)、乙醇胺、三乙醇胺和甘氨酸以及有机酸的碱性盐(例如柠檬酸三钠)。一种推荐的有机弱碱是一种弱的单价有机碱,例如Tris。弱碱可能或者是一种游离碱,或者是一种盐,例如碳酸盐。
虽然本发明人不希望局限于一种单一的理论,但相信弱碱可提供多种功能,包括保护GM免受降解。除了提供一种缓冲液***外,相信弱碱还能起到保证下述螯合剂在结合金属离子时起恰当的作用。此外,弱碱还可防止酸性核酸酶的作用,该酶起作用可能不完全依赖于二价金属离子。
干固体介质的组合物也可以包括一种螯合剂。于此所用的一种螯合剂是能络合多价离子的任何化合物,多价离子包括第II族和第III族多价金属离子和过渡金属离子(例如Cu、Fe、Zn、Mn等)。按照本发明,一种推荐的螯合剂是一种强螯合剂,诸如乙二胺四乙酸(EDTA)。螯合剂诸如一种柠檬酸盐或草酸盐对本发明也是合适的。螯合剂可在将GM样品加到干固体介质的同时加到组合物中去。
虽然本发明人不希望局限于一种特殊的理论,但相信本发明螯合剂的一种功能是结合多价离子。多价离子若与贮存的GM一起存在时,就能参与使GM受到损坏的过程。能被螯合剂螯合的离子包括多价的活性金属离子(例如镁和钙)以及过渡金属离子(例如铁)。钙和镁二者都已知通过作为能破坏GM的酶(例如最著名的核酸酶)的辅因子而促进GM降解的。此外,过渡金属离子(诸如铁)能轻易地经受氧化和还原,并且通过产生自由基或通过直接氧化而破坏核酸。
干固体介质的组合物还可以包括一种蛋白质变性剂。于此所用的一种蛋白质变性剂所起的作用是使非GM化合物变性,例如使与贮存的GM相联的蛋白质变性。若蛋白质变性剂是一种去污剂或表面活性剂,表面活性剂也能起润湿剂的作用,以利于样品被干固体介质所吸收。术语“表面活性剂”和“去污剂”是同义的,并可以在整个说明书中互换使用。按照本发明,使蛋白质变性而不实质上影响GM样品的任何试剂都可适合于本发明。推荐的蛋白质变性剂包括去污剂。此处所用的“去污剂”包括离子去污剂,最好是阴离子去污剂。
一种适合于本发明的推荐阴离子去污剂可具有烃部分,诸如脂族或芳族部分,并有一个或多个阴离子基团。特别推荐的阴离子去污剂包括十二烷基硫酸钠(SDS)和十二烷基肌氨酸钠(SLS)。
在一种推荐实施方案中,本发明的离子去污剂引起在其外膜或衣壳中具有蛋白质或脂类的微生物(例如真菌、细菌或病毒)失活。这包括可能对人类是致病性的微生物,或者能造成GM降解的微生物。
虽然不希望局限于一种单一的理论,但相信用去污剂使微生物失活是有机体外部蛋白质、内部蛋质、含蛋白的膜或生存所必需的任何其它蛋白质的二极结构破坏的结果。本发明人认识到去污染可能不能使某些形式的有机体失活,例如有高抗性细菌孢子和极稳定的肠道病毒粒子。此外,本发明人还认识到:虽然使一种微生物失活可能是合乎需要的,但不论是与贮存的GM样品相联的还是不相联的微生物GM,也适合于在发明的干固体介质上贮存或随后分析。
本发明的组合物可以可选地包括一种自由基捕集剂。按照本发明,一种自由基捕集的定义如上。合适的自由基辅集剂的实例包括:尿酸或尿酸盐、甘露醇、苯甲酸盐(钠盐、钾盐、锂盐或tris盐)、1,3-二甲基尿酸、胍、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶、N-乙酰-组氨酸、组氨酸、去铁胺、二甲亚砜、5,5’-二甲基吡咯啉-N-氧化物、硫氰酸盐和硫脲。优选的自由基捕集剂包括甘露醇、硫氰酸盐、尿酸或尿酸盐。按照本发明,GM贮存的时间越长,则将自由基捕集剂包含在吸着到固体基质上的组合物中就越可能有利。然而,即使GM仅贮存几分钟,一种自由基捕集剂仍可加入组合物中。
虽然本发明人并不希望局限于任何单一的理论,但相信自由基捕集剂的一种功能是能捕捉使GM受损的自由基。例如,当所用的自由基捕集剂是尿酸或尿酸盐时,它可转变为尿囊素,后者也能起自由基捕集剂的作用,它优先接受在其它情况下将会损坏核苷酸碱基(例如嘌呤)的自由基。
最好是自由基捕捉剂与自由基反应,而不管其来源(包括存在于空气中的自由基)。自由基可通过血液中铁的氧化或还原而产生。
通常,自由基被认为是通过存在于例如血液的变性血清蛋白中的基团的自发氧化而产生的。自由基还可通过辐射诸如紫外线、α-射线和高能粒子而产生。
此外,也是一种弱酸的自由基捕集剂,例如尿酸,也能作为由上述弱碱提供的缓冲***的一种组分起作用。同样,正如尿酸或尿酸盐的情况一样,自由基捕集剂能作为一种可腐蚀的表面而起作用,因为它是微溶性的,以致干燥在其晶体上的GM样品当尿酸盐在下方腐蚀时被释放出来。因此若不要求原位处理,组合物的组分(诸如自由基捕集剂)能增强贮存的GM样品的取出。
此外,在GM样品加到干固体介质中后,加有GM样品的干固体介质可以包装在一种保护材料(例如一种塑料膜内),后者能进一步保护贮存的GM免遭降解。按照本发明,合适的塑料膜的实例包括聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯以及其它层合塑料。将干固体介质包装在一种保护材料中可通过本领域已知的方法来完成。
把干固体介质包装在塑料膜中的一种简单方法是,将干固体介质放入一容器(例如聚乙烯袋)中,它有足够的大小来容纳干固体介质,以致当液态塑料膜加到容器中时,全部干固体介质都将被液体所包裹。液态形式的塑料膜加到容器中,以包裹干固体介质。让液态塑料膜变干而提供一种塑料膜外套以包装干固体介质。在分析之前,用本领域已知的方法从干固体介质去除掉塑料膜,例如用有机溶剂诸如三氯甲烷溶解或机械剥去。
本发明人进一步指明,带有一种加了GM样品并包含随后分析用的组分(在下面讨论)的干固体介质,也可以包装在一种上述的保护材料中。II.贮存在干固体介质上的遗传物质的随后分析
于此所用的“随后分析”包括在贮存于本发明的干固体介质中GM样品上能进行的任何分析。贮存在一种干固体介质上的GM可进行体外分析。另一方法是,GM可在分析之前从干固体介质取出。GM样品可经受化学的、生物化学的或生物学的分析。能在贮存于干固体介质的GM样品上进行的随后分析实例,包括聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、逆转录酶起始的PCR、DNA或RNA杂交技术(包括限制片段长度多态性(RFLP)和利用基因探针的其它技术)、基因组序列分析、酶分析、亲和标记、利用标记或抗体的检测方法以及其它类似的方法。
此外,目前在全血样品上进行的诊断步骤,例如用于苯丙酮酸尿症(PKU)的Guthrie试验或者酶试验(例如半乳糖血症),都可以在首先例如使用一种“转化剂溶液(converter solution)”中和干固体介质的使蛋白质变性组分的作用之后,在贮存于本发明的干固体介质中血液样品上进行。一种转化剂溶液的实例公开于实施例5中。
贮存在本发明干固体介质上的GM可作为一种模板,用于利用PCR方法进行的GM的随后分析中。这包括利用DNA或RNA作为模板的PCR法。当RNA是待分析的GM时,RNA能作为利用逆转录酶起始的PCR法的模板。然后,由RNA模板产生的DNA序列,能用作进一步PCR扩增的模板。
与贮存的GM样品相联的化合物,包括血红蛋白、蛋白质或干固体介质中组合物的组分,能干扰贮存在干固体介质的GM样品的随后分析。最好是在随后分析之前,将这些干扰化合物基本上从干固体介质除去。例如,若贮存的GM样品是在全血中,在用PCR、LCR、RFLP、逆转录酶起始的PCR、基因探针或其它技术分析之前,最好除去与贮存在干固体介质上GM相联的血红蛋白或蛋白质。例如,利用含水的或非水的提取步骤,能将与GM相联的血红蛋白或蛋白质除去。另外,一种干扰化合物,它是本发明组合物中的一种组分(例如一种离子去污剂),在随后分析之前,能用含水或非水的提取步骤或于此公开的转化剂溶液除去。
在一种优选的实施方案中,利用非水提取步骤,例如下述单相酚洗涤方法,能将血红蛋白、血液蛋白质以及与GM样品相联的其它蛋白质除去。此外,在单相酚洗涤后,可接着用下述离子含水酒精洗涤,以便为随后的PCR、LCR或对贮存在干固体介质上的GM进行类似的分析提供必需的离子。有关PCR、LCR、逆转录酶起始的PCR、DNA或RNA杂交、基因组序列分析法以及其它随后分析方法都是本领域已知的。
在本发明的另一实施方案中,贮存在本发明干固体介质上与蛋白质或血红蛋白相联的GM样品,可利用水提取法除去。例如,一种这样的含水提取步骤,使用含水的SDS和巯基乙醇。按照该步骤,带有或不带随后分析用的组分并贮存在干固体介质上的GM样品,用含水的pH8.5-9.0的6%SDS碱性溶液洗涤,该碱性溶液含有一种硫醇,例如,20mM的2-巯基乙醇或二硫苏糖醇。另一种这样的含水提取步骤,例如用的是纯水。然后用异丙醇洗涤GM,以大体除去所有的水、剩下的杂质和不需要的组分(例如利用下面描述的用于单相酚洗涤的含水酒精洗涤溶液可以完成异丙醇洗涤)。
对本领域技术人员将是显而易见的是,贮存在带有或不带用于随后分析组分的本发明干固体介质上的GM的原位随后分析,在自动化***中可能是特别有好处的。此处所用的一种“自动化***”包括一种“自动的流体传送***”。按照本发明,“自动流体传送***”包括手持和自动控制的流体液传送***。自动的流体传送***通常是这样一种装置,它把流体试剂分配到多孔反应板的各个孔中,并从各个孔中取出流体试剂。一种手持自动流体传送***包括一种单一的活塞把柄,带有多个流体吸取和分发端,以便同时从单一或多种流体反应孔中吸取和分发一种流体反应***的流体。自动控制的自动流体传送***是计算机操纵的而非手持的,包括这样的产品,例如BIOMEK2000(贝克曼仪器,Fullerton,CA),Zymark Benchmate(Zymark,Hopkinton,MA)和Rosys PLATO,Rapperswil,端士。自动流体传送***在国际专利申请PCT/IB 95/00989(WO 96/11406)中也进行了讨论,它通过引用结合到本文中。A.单相酚洗涤
本发明的另一方面提供除去与贮存的GM样品相联的蛋白质或血红蛋白的一种有机提取法。按照本发明,利用一种单相酚洗涤可以把血红蛋白或蛋白质从贮存的GM样品中除去。单相酚洗涤最好也除去本发明组合物中的组分(例如去污剂)。单相酚洗涤是通过将单相酚溶液与其上加有GM样品的干固体介质相接触而进行的。从含有GM样品的干固体介质上除去单相酚洗涤液,然后将干固体介质与一种含水酒精洗涤液接触。然后除掉含水酒精洗涤液。如果GM样品要用PCR、LCR或其它依赖离子的方法进行分析,那么在进行PCR分析之前,GM样品可与一种离子含水酒精洗涤液相接触。一种非水洗涤***诸如单相酚洗涤液(在下面描述)或一种含水洗涤***(在上面已描述)也能用来洗涤贮存在固体基质上的GM样品,该基质缺乏本发明的组合物并且它可以包含或可以不包含一种用于GM随后分析的组分。
单相酚诜涤可用来除去蛋白质、血红蛋白或干固体介质组合物的一种组分,该组分能影响在贮存于干固体介质的GM上进行的随后处理,而不影响贮存的GM。不像现有技术方法,该洗涤***在处理期间不需要两相分离(水相和有机相),并且倾向于不溶解血液中存在的GM。单相酚洗涤同样经得起自动化***的检验。
单相酚洗涤法也公开于国际专利申请PCT/AU 89/0043(WO90/03959)和PCT/IB 95/00989(WO 96/11406)。洗涤包括二种溶液,即下面提到的“单相酚溶液”(溶液A)和“含水酒精洗涤溶液”(溶液B)。假如使用需要额外离子的方法(例如PCR和LCR)去分析GM样品,可在单相酚洗涤后使用第三种溶液,即离子含水酒精洗涤溶液(溶液C)。
溶液A:单相酚溶液包括用Tris-醋酸盐和巯基乙醇饱和的酚和羟基喹啉。最好是将50克(gm)酚与用10毫升1.0摩尔浓度(M)pH6-9、最好是pH8.0的Tris-醋酸盐和1.0毫升2-巯基乙醇饱和的120毫克(mg)8-羟基喹啉混合。在大约0℃到20℃(最好是0℃到4℃)摇动使之饱和后,取去并丢弃水相。(本发明人注意到,单相酚洗涤液相信是用Tris-醋酸盐和巯基乙醇在4℃饱和的,但是,在使用时温度通常高于4℃,因而相信溶液是未被饱和的)。
溶液B:含水酒精洗涤溶液利用任何C2-C5醇类(诸如异丙醇或正-丙醇)或其它类似的水可混溶的溶液并结合一种醋酸盐或类似的有机可溶性盐,它提供的pH约为7.0到9.0,最好是约为pH7.8。在一种优选的实施方案中,75%(体积)的异丙醇与25%(体积)的pH约为7.8的0.1M醋酸镁合并。
溶液C:离子含水洗涤溶液是一种洗涤溶液,它提供合适的离子,例如镁、锰、钠、鱼精蛋白、Tris以及类似的可用于随后分析步骤中的离子。对于PCR分析,优选镁。因此,离子醇洗涤溶液利用任何C2-C5醇类(诸如异丙醇和正-丙醇)或任何其它类似的水可混溶的溶剂,结合以一种醋酸盐或类似的有机可溶性盐,以提供约为6.0到8.5的pH,最好是约为pH7.8。在一种优选的含镁离子的实施方案中,将75%(体积)的异丙醇与25%(体积)、pH约为7.5的0.01M醋酸镁混合。
按照本发明,贮存在干固体介质上并和血红蛋白和蛋白质相联的GM样品,可与溶液A接触大约15分钟到大约3小时,最好是大约1.5小时到大约2小时,温度高于37℃,优选约为45-65℃,更优选约为50℃。如果本发明的干固体介质还不包括一种用于随后分析的组分,诸如一种引物(这在下面讨论),那么GM样品与溶液A接触的温度并非关键性的。然后除掉溶液A。然后,最好是将GM样品迅速地洗涤1-4次,每次用新鲜的溶液A洗几秒钟。
在除去溶液A后,将GM样品用溶液B洗涤1-4次,每次几秒钟。最好是在大约10℃到25℃使用溶液B洗涤液。如果要使用溶液C,可在除去溶液B后,将溶液C加到GM样品上大约1-60分钟,最好是30分钟,温度约为10℃到25℃。除去溶液C并使干固体介质上的GM样品干燥。
一般地说,本发明的单相酚洗涤提供了基本不含蛋白质或血红蛋白的GM,这提供一个非常方便的起始点,用于基于核酸的各种分析步骤。在实施例中还描述了单相酚洗涤液和离子含水酒精洗涤液的用法。
按照本发明,单相酚洗涤用来提供基本不含蛋白或血红蛋白的贮存在任何固体***上的GM样品。此外,如下所描述的,当一种固体贮存***与一种用于随后分析的组分(诸如一种寡核苷酸引物)混合时,单相酚洗涤是特别有好处的。因此,单相酚洗涤对从贮存在一干固体介质上GM样品中除去蛋白质或血红蛋白是有用的,不管贮存介质是否混合了本发明保护GM的组合物,也不管贮存介质是否包含随后分析所必需的组分。B.包含用于遗传物质随分析分的组分的干固体介质
在本发明的另一实施方案中,本发明的干固体介质可包含一种用于GM贮存样品随后分析的组分。此处所用的“随后分析”是指能在贮存于干固体介质GM样品上进行的任何分析。这包括化学的、生物化学的或生物学的分析。能在贮存于干固体介质GM样品上进行随后分析的实例,包括PCR、LCR、逆转录酶起始的PCR、DNA或RNA杂交技术(包括RFLP和利用基因探针或DNA或RNA探针的其它技术)、基因组序列分析、酶分析、亲和标记、利用标记或抗本的检测方法以及本领域已知的其它方法。
于此所用的一种用于贮存的GM样品的“随后分析的组分”,包括一种分子、化合物、试剂或其它组分。该组分在分析一种GM样品时起作用,或在保存一种用于分析的GM样品时起作用,或者在分析与GM一起贮存在干固体介质上的某些其它组分时起作用。
在某些情况下,随后分析将包括一种分析方法,它被用来证实一种特殊的遗传序列的不存在或存在。待分析的遗传序列称为“靶序列”。靶序列或GM样品的其它区域可用作PCR扩增的模板。
用于随后分析的一种或多种组分可包含在干固体介质上。包含在干固体介质上的组分取决于在GM样品上进行分析的类型。包含一种用于随后分析组分的优点,在利用自动化***同时分析大量GM样品的情况下很快地显现出来。可包含在干固体介质上用于随后分析的组分包括,例如一种离子、一种酶和一种核苷酸序列。
此处所用的“核苷酸序列”包括一些化合物,诸如一种引物(例如一种PCR引物、一种逆转录酶起始的PCR的引物)、成套的用于LCR-的寡核苷酸底物、DNA或RNA探针、用于遗传序列分析的寡核苷酸以及一种靶序列稳定剂。
于此所用的一种“引物”是指一对寡核苷酸,其中每一个都能与GM样品中互补的核酸序列退火并定向,以便使每一引物引发一条DNA链的合成(或者可想象地,一条RNA的链),合成的DNA链含有一段与另一寡核苷酸互补的序列。对于某些应用,可能需要预先设定寡核苷酸的序列及其互补序列。在其它的应用中,该序列可以是未知的。许多简并引物或带有预测能与互补序列相结合的序列的引物都可使用。引物对可用来扩增一对互补序列以及在二种已知或未知大小的互补序列之间的序列。此外,引物可用来扩增模板,该模板最初是双链DNA或RNA,也可以是单链DNA或RNA。对于一种单链模板来说,人们理解的是与寡核苷酸之一互补的序列,当它退火杂交到其互补序列上时,通过第一引物的延伸而合成。
用于PCR或逆转录酶起始的PCR的引物,可以象往常一样作为一种引物对而存在,或者可以仅有一种引物,正如在作基因组的序列分析或是在用于逆转录酶起始PCR的某些方案中可能的情况那样。
在本发明的另一实施方案中,用于随后分析的组分可以是称为“靶序列稳定剂”的核苷酸序列。按照该实施方案,“靶序列稳定剂”是一种与待测DNA或RNA整个区域互补的核苷酸序列。靶序列稳定剂可用来增进一种不稳定的单链RNA或DNA的贮藏,该RNA或DNA作为GM样品贮存在干固体介质上。正如本领域已知的,许多单链RNA是不稳定的,而且易受到低水平的无所不在的RNA酶的降解。可是本发明人相信:通过在干固体介质上包含一种靶序列稳定剂,该靶序列稳定剂将与单链RNA(或DNA)样品结合,形成的“杂种”较不易受到降解。例如,本领域已知双链RNA/DNA杂种对普通RNA酶是高抗性的。与靶序列稳定剂退火杂交的RNA或DNA,接着能进一步用本领域已知的方法进行分析,例如,LCR或LCR与逆转录酶起始的PCR相结合使用。因此,按照本发明,用于随后分析的组分包括一种组分,它通过保护贮存的GM样品不受降解而起作用,该组分例如是一种靶序列稳定剂。
包含一种用于随后分析的组分(诸如一种核苷酸序列),为例如通过自动化PCR***简化GM的随后分析提供很大的好处。此外,包含一种合适的核苷酸序列能提供额外的保护,使GM(诸如不稳定的RNA)免遭降解。
能包含在本发明干固体介质上并可用于随后分析的其它组分是,例如离子、遗传探针或寡核苷酸或具有不同类型标记的多核苷酸序列以及适当稳定的酶(诸如热稳定的酶)。标记可包括一种荧光化学基团、放射性同位素、化学结合剂(例如生物素)、抗原或酶类。
为了除去与贮存在干固体介质上GM样品相联的蛋白质或血红蛋白而使用的某些洗涤***,可能造成用于随后分析而包含于干固体介质中的组分的某种损失。本发明人已发现,用本发明的单相酚洗涤液去除与干固体介质上包含一核苷酸序列的GM样品相联的蛋白质或血红蛋白,通常可使包含的核苷酸序列减少损失或无实质性的损失。“无实质性的损失”是指在完成洗涤时,没有造成组分的足够损失以致阻碍随后的分析。在一种引物组分的情况下,“无实质性的损失”是指洗涤没有造成引物的足够损失以致阻止PCR、LCR、逆转录酶起始的PCR、探针探测等。因此,由于核苷酸序列和GM样品二者在洗涤期间,仍然保留干固体介质上,因而原位处理是可能的。熟悉本行的人将很快地认识到这在为使用自动***分析GM方面提供的好处。
在一种贮存的GM样品的处理期间,在某些洗涤***中(例如含水的洗涤***),通过使用一种保留剂可以有利地克服用于随后分析的一种组分的损失。
于此所用的“保留剂”是一种化合物,一种用于随后分析的组分可与它相加、混合、悬浮或者在其它情况下与它相联,以减少处理期间干固体介质上组分的损失。一种优选的保留剂,在干固体介质受到一些条件影响时,可提高干固体介质上组分的保留,否则这些条件会造成干固体介质上的组分的较大损失。例如,一种用于随后分析的组分当使用非水洗涤***时,它在介质中的浓度会减少,可将它与一种保留剂结合,该保留剂在非水提取期间增进该组分在干固体介质上的保留。一种用于随后分析的组分,它在介质上的浓度通过使用一种含水洗涤***会减少,可将它与一种保留剂混合,该保留剂在含水提取期间增进该组分在干固体介质上的保留。
在一种实施方案中,当使用含水洗涤***处理贮存在干固体介质上GM样品时,本发明提供一种保留剂,它可与用于随后分析的组分联合使用。当使用含水洗涤***抽提与贮存在干固体介质上GM相联的蛋白质或血红蛋白时,一种优选的保留剂通常将减少例如一种核苷酸序列的损失。
与一种含水洗涤***一起使用的保留剂的实例是一种蜡。另一方法是,保留剂可以是悬浮于蜡中的亲水性载体。
此处所用的一种“蜡”是一种有机混合物或高分子量的化合物,它在室温下是固体,但在高温时则液化。蜡包括烃类、脂肪酸、醇类、酯类、聚合物、长链酰胺、同系硅基化合物以及热标记树脂。
在一种优选的实施方案中,一种用于随后分析的组分(诸如一种核苷酸序列或一种离子)与亲水性固体载体混合,并且悬浮在蜡中。亲水性固体载体包括例如淀粉、胶态纤维素、棉线和类似的化合物。组分和载体的混合物可随后悬浮在一种蜡中,该蜡的熔点为随后分析的温度或低于该温度。例如,如果GM样品要用PCR方法进行分析,应该选择熔点为45℃-110℃、最好是65℃-90℃的蜡。按照本发明,一种优选的蜡是石蜡。
让蜡悬浮液固化,并把固体悬浮体以小钮扣状物沉积或滴在干固体介质上。如果一种引物是与蜡悬浮体相混合的组分,最好是每滴都含有足够的引物以用于单个的PCR扩增。因此,正如将在下面描述的,用于多种GM样品的许多蜡滴可放在一张干固体介质卡上。
虽然本发明人不希望局限于一种单一的理论,但相信在含水***洗涤期间,蜡会减少保留组分的损失。例如,当利用PCR方法分析GM样品时,在PCR第一循环期间,温度上升引起蜡熔化,因而释放出组分(诸如一种引物),使反应开始进行。
在用于含水洗涤***的保留剂的另一实施方案中,将一种用于随后分析的组分加到棉线载体上,并且涂上或浸渍蜡。例如,可以将棉线拉过一种用于随后分析的水溶性组分的槽,然后可以将线拉过一个干燥室,接着拉过一个含有热蜡的槽。涂蜡线卷能贮存并且随后被切成微小的片段,并热压印到干固体介质上,以提供棉线上悬浮于蜡的用于随后分析的组分。
在另一实施方案中,一种用于随后分析的组分可以与无亲水性载体的蜡相混合,并用静电印刷术方法应用到干固体介质上。按照此实施方案,用于随后分析的组分能沉积到干固体介质上的非水溶性保留剂中,该非水溶性保留剂在有水存在下应用热时会变成水溶性的。因此,用于随后分析的组分能混合到蜡中,而且该组分能作为一种微包涵体而受到保护,直至蜡在水中熔化为止。最好是含有一种用于随后分析组分的蜡沉积在干固体介质的预定位置上。此实施方案的一个实施例与静电印刷术处理相似,将热的含有一种用于随后分析组分的极干蜡粉末加到干固体介质的表面上。
在本发明的另一实施方案中,利用亲水性液体载体可以将一种保留剂溶于蜡中。例如,一种核苷酸序列通过与一种去污剂复合(Complexing)可以首先溶于蜡中。优选的去污剂是阳离子去污剂,诸如溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)。然后将去污剂增溶的组分与蜡混合,如上面描述的那样应用到干固体介质上去。
因此,在某些用来处理GM样品的条件下,保留剂的使用能增进用于随后分析组分的保留,因而改进了的分析结果。
在本发明干固体介质上包含一种用于随后分析组分的优点,在利用自动化流体传送***进行多个样品的PCR扩增的情况下是显而易见的。例如,通过包含一种扩增特异DNA或RNA基因序列所必需的引物,可以用一种单一的PCR反应混合物去分析含有不同引物的多个样品。所有小瓶所需的仅是一种PCR酶和核苷酸的混合物。此外,即使与各种GM样品包裹在一起的不同引物需要变更反应条件(诸如镁离子和/或pH)时,这些变动仅用两个附加的泵或移液管***就能提供,以分送廉价的盐类和缓冲液。这将适用于大多数意外情况。
在对一个贮存于介质上GM样品处理之前,一种用于随后分析的组分最好包含在干固体介质上。用于包裹组分的种种变更是可允许的。例如,在把组合物加到固体基质之前,可把该组分加到干固体介质的组合物中。或者可将该组分与组合物同时加到固体基质中。另一个办法是,本发明的组合物可加到固体基质中,随后再加各组分。可预见的是,一种GM样品可加到干固体介质中,在收集GM样品之后,但在处理GM样品之前,将用于随后分析的组分加到干固体介质中。还可预见的是,在除去蛋白质和/或血红蛋白之后,但在随后分析之前,可以将一种组分加到干固体介质中。
因此,本发明通过将一种包含用于随后分析组分的干固体介质与容许共处理该组分和贮存GM的方法结合,使以前行不通的新颖的战略变为可行。C.多种核苷酸序列包含在一个干固体介质上
本发明的干固体介质还可以被认为或称为一张卡。一张卡片能以这样的一种方式制作,以致在一张卡片的不同位置提供用于随后分析的不同组分。例如,当用于随后分析的组分是一种核苷酸序列时,用于引发PCR扩增或稳定不同靶序列的多种不同的核苷酸序列可以包括在一张卡上。
于此所用的“多种”是指大于一种。一个待分析GM样品可贮存在一张卡上,后者是大约1毫米到5毫米的方形物。因此,约为5毫米×10毫米的卡片可分为例如200个单独的样品。每一5毫米的正方形可包含一种不同的核苷酸序列。因此,一张5厘米×10厘米的卡能用来进行200种不同靶序列的随后分析。
一张干固体介质卡提供来自一个收集样品的多个GM区域分析。这种卡可以预先制作、预先标记并贮存用于将来使用。在一个优选的实施方案中,一种包含在卡上用于随后分析的核苷酸序列可以是一种引物。按照该实施方案,用于特殊用途的所有或许多引物能包含在一张卡上。例如,一种应用可以是在一个GM样品上筛选多种靶序列,它们一起表示出一种特殊遗传疾病的特性。另一个方法是,一张卡能含有许多引物,以筛选多种病毒病的基因组。因此,可制作、标记或包装这些包含用于随后分析的组分的卡,作为特殊种类的使用,例如处罚目的(例如个人鉴定)、保险公司筛选以及遗传疾病的医学诊断。
此外,包含例如一种核苷酸序列,提供用于不同领域的干固体介质,并且可以在一个集中的非专门化的自动化分析中心一起方便地处理。这将容许自动化***使用一种基础酶混合物,以及可能还有缓冲液,以同时扩增所有的靶序列,对于这些靶序列来说,引物是存在于一种类型的卡上的。正如以前指明的,离子和pH潜在变化能通过不同途径进行处理,例如用单独的传送泵。另一方法是,保留剂的使用能提供在各种各样的条件下用于随后分析的各种离子或其它组分的传送。
设计下面的实施例以指导那些本领域技术人员如何实践本发明。它们无论如何不是打算限定或限制本发明的范围。D.干固体介质试验盒
本发明还提供一种试剂盒用于应用、贮存或处理GM样品。试剂盒可包括一种干固体介质和一个适合于在应用、贮存或处理GM样品期间包含一种干固体介质的容器。按照本发明的这一方面,该试剂盒可以包括一个或多个容器。适用于试剂盒的多于一个容器的一个例子包括在下面描述的96孔板。试剂盒也包含一种或多种于此公开的任何干固体介质。这包括一种固体介质,它带有或不带一种用于随后分析的组分,并带有或不带一种保留剂。包含于一容器中的一个干固体介质能自由地由容器中取出,或固在容器内。
试剂盒的容器可以是适用于下述期间使用的任何容器:将一个GM样品应用于干固体介质期间或在一个GM样品的应用和随后处理的一个或多个阶段期间。因此,一个试剂盒能用来将一个GM样品加到一干固体介质上,将干固体介质从试验盒容器中取出,以在不同的容器中进行处理。另一方法是,一GM样品能在试剂盒容器中使用、贮存和处理。
本发明试剂盒的一个特别有用的方面,是它能将一个GM的液态样品从原先的收集容器(诸如血液试管)转移到该试剂盒的干固体介质上而不需人们接触。因此,例如利用一种自动控制***(诸如PLATO3300II(Rosys,Rapperswil,瑞士)),能将一个全血样品从一个原先的收集容器取出,并转移到干固体介质上而不需人与血液接触,直至它在固体介质上干燥为止。如果自动控制***具有追踪能力,那么可以将多个GM样品从原先的收集容器同时转移到试剂盒容器的干固体介质上,并进行跟踪。例如,使用一种在收集容器上添加条形码的跟踪***,并且在自动控制***中存在条形码阅读器,则来自一个特定收集容器的样品的位置能通过将该GM样品加到干固体介质上而跟踪。此外,如果自动控制***包括一个处理***,则可以将一个GM样品从一个原先的收集容器取出,加到干固体介质中,并且通过处理进行跟踪,不需要人接触。
本发明试剂盒的优点包括:增加了样品处理者在将样品放置在干固体介质上期间的安全性,减少了将样品加到干固体介质上的人工劳动成本,并且降低了在处理期间样品受污染的机会。
用于本发明试剂盒的容器能由任何已知的材料制成。试剂盒容器的材料可根据贮存在干固体介质上有待进行分析的GM样品类型而选用。能制备试剂盒容器的代表性的材料包括聚苯乙烯、聚丙烯以及本领域所用的其它材料。一个试剂盒可包含单个带有干固体介质的容器。另一方法是,一个试剂盒可以含有的容器同自动控制***或其它转移***能操作的一样多。在一个典型实施方案中,本发明的试剂盒可以是一块板,诸如一种Corning的96孔检测板(Corning Glass Works)或Falcon96孔检测板(Becton Dickenson and Company),在该检测板的每一孔中都含有一种干固体介质。一个多容器试剂盒(诸如多孔板),可以在每一容器内包含有一种不同的干固体介质。因此,例如一个试剂盒能配备一种单一类型的干固体介质,以筛选多个血液样品中的一个基因,该基因的引物可包含在干固体介质中。在另一实施例中,一个试剂盒可以筛选一个血样中的多种基因。因而在该实施例中,每一容器可含有一种干固体介质,而每一种干固体介质包含一种不同的引物。
一个利用一种带有96孔容器试剂盒的例子如下,该容器可以用于Rosys 3300II,以加入和洗涤全血中的GM样品:
按照该实施例,96孔板上的每一孔可包含直径为2到5毫米、最好约为3毫米的园盘状物。在96孔的每一孔中预先冲压干固体介质盘状物。
将5微升全血样品从用EDTA、柠檬酸盐或肝素预处理的一个血液收集管中转移到一个孔中的干固体介质盘状物上,每次转移都使用一个新的加样器吸头。如果试管都用条形码标记,并且如果自动控制***包括一个条形码阅读器,那么每一个放到干固体介质上的样品就能被跟踪。将该板在45℃至55℃,最好是50℃保温大约10到20分钟,最好是15分钟,使血液样品干燥。将大约200微升Gentra One-StepTM(gentra System Inc.,Plymouth,MN)加到每一孔中,并且该板保温大约10到20分钟,最好是15分钟,温度在大约25℃到30℃,最好是27℃。该步骤重复两次。在第二次重复后,这些孔都用大约200微升100%异丙醇洗涤两次。然后这些孔在大约55℃到65℃、最好是60℃保温大约10到20分钟,最好是15分钟。
如果每个样品将进行不同的随后分析,那么可以取出在96孔的每孔中含有一个洗涤过的GM样品的干固体介质。另一方法是,如果所有的样品都要经过同样的随后分析,它们可以在96孔容器中进一步处理。
实施例实施例1.贮存于干固体介质上血液DNA的原位PCR扩增
贮存于本发明干固体介质上的一个血液DNA样品,通过用聚合酶链反应(PCR)技术进行原位扩增。该实施例中使用的干固体介质是基于纤维素的纸,其上已吸着一组合物,该组合物包括:每平方厘米纸中有2微摩尔尿酸、8微摩尔tris(游离碱)、0.5摩尔EDTA和1毫克SDS。在进行PCR扩增前,洗涤贮存的血液并加入合适的离子。1.1单相酚洗涤
A.材料
溶液A:
单相酚洗涤液。一种合适的混合物是含有120毫克8-羟基喹啉的50克酚,用10毫升1.0M tris-醋酸盐pH8.0和1.0毫升2-巯基乙醇饱和。通过在室温下摇动使其达饱和后,彻底除去并丢弃水相。
溶液B:
含水酒精洗涤溶液。75%v/v异丙醇,25%v/v 0.1M醋酸钾pH为7.8。
溶液C:
离子含水洗涤溶液。75%v/v异丙醇,25%v/v,0.01M醋酸镁。
B.方法
所有的步骤最好是在由合适的抗酚材料(例如聚乙烯)制成的单个试管中进行。
1.蛋白质的去除:浸渍过血的5毫米×5毫米方形干固体介质在45℃用1毫升溶液A处理约1.5小时(由于引物不存在,该温度和时间并不是关键性的)。然后抽吸并丢弃溶液A,并迅速将纸质方形物用0.25毫升溶液A洗涤三次,每次洗涤仅几秒钟,立即抽吸并丢弃洗涤液。
2.酚的去除和合适离子的添加:来自上面步骤(a)的干固体介质迅速地用1毫升溶液B洗涤三次。洗涤是在室温下进行,而且是简单地加入溶液B,接着抽吸并丢弃溶液B。然后用溶液C在室温下将纸洗涤20分钟(这是为了使纸上的GM被镁离子所饱和,并除去最后的酚)。抽吸并丢弃溶液C,干固体介质用纯异丙醇洗涤一次,进行溶剂干燥,然后再进行真空干燥。
洗涤过的干固体介质相当白,没有任何明显的红棕色的血液残迹。然后,将它用于一种PCR反应混合物中。1.2干固体介质上DNA的扩增
上面描述的洗涤过的干固体介质上的样品,已表明是一种适用于DNA聚合酶链反应(PCR)扩增的合适底物。
A.材料
1.样品
提取的DNA:利用标准操作步骤从一位男性志愿者取1毫升血。
干固体介质:来自同一志愿者的血液样品,象上面描述的那样直接加到干固体介质中,随后用单相酚洗涤。将干固体介质切成大约1毫米×1毫米的碎片以用于PCR反应。
2.用于扩增的靶1号靶:第1条染色体上n-Ras原癌基因的外显子2区域。所用的引物是:R1:5’TGA CTG AGT ACA AAC TGG TGG TG 3’(SEQ ID NO:1)R2:5’CTC TAT GGT GGG ATC ATA TTC A 3’(SEQ ID NO:2)。
用这些引物所得的扩增的DNA片段,其大小为110bp。2号靶:一种男性特异性Y染色体的重复序列。引物是:007:5’TGG GCT GGA ATG GAA AGG AAT GCA AAC 3’(SEQ IDNO:3)以及008:5’TCC ATT CGA TTC CAT TTT TTT CGA GAA 3’(SEQ ID NO:4)。用这些引物所得的扩增DNA片段,其大小为124bp。3号靶:一种男性特异性Y染色体的重复序列。所用的引物是:004:5’GAA TGT ATT AGA ATG TAA TGA ACT TTA 3’(SEQ IDNO:5)以及006:5’TTC CAT TCC ATT CCA TTC CTT TCC TTT 3’(SEQ ID NO:6)。
用这些引物所得的扩增的DNA片段,其大小为250bp。B.方法
1.PCR操作步骤
将提供的DNA(1微克)或洗涤过的含有血液DNA样品的干固体介质(其大小约为1毫米×1毫米的片段)放进0.5毫升Eppendorf管中,构成25微升PCR反应混合物,其组成为:
67mM Tris HCl(在25℃下pH8.8)
16.6mM(NH4)2SO4
2.0mM MgCl2
0.01%(w/v)明胶
0.1mM脱氧核苷酸(dATP,dTTP,dCTP,dGTP)
0.25微克每种引物(用于各自的靶)
0.25单位Taq DNA聚合酶
2.扩增条件
混合物上铺25微升轻矿物油,通过在Perkin Elmer-Cetus“热循环仪”上进行30个循环的扩增,以扩增DNA。首次循环由下述操作构成:
DNA变性 在94℃ 6分钟
引物-DNA退火 在55℃ 1分钟
Taq DNA聚合酶促延伸 在75℃ 1分钟
接着如上进行29个循环,只是DNA变性是在94℃进行1分钟,并且在将反应混合物冷却至4℃以前,最后一次循环的延伸时间是在72℃经10分钟。1.3结果
扩增之后,将10微升等份的PCR混合物在15%(w/v)聚丙烯胺凝胶上进行电泳分析。通过紫外线照射经溴化乙锭染过的凝胶,目测扩增的靶DNA。
提取的血液DNA以及贮存在干固体介质上的血液DNA的PCR扩增产物的分析如下显示于图1:
1-3泳道:1号靶,第1泳道:1微克DNA,第2泳道:1平方毫米滤纸片,第3泳道:对照(无DNA);
4-5泳道:2号靶,第4泳道:1微克DNA,第5泳道:1平方毫米滤纸片,第6泳道:对照(无DNA);
7-9泳道:3号靶,第7泳道:1微克DNA,第8泳道:1平方毫米滤纸片,第9泳道:对照(无DNA);
S泳道:DNA大小标记物(pUC 19/Hpa II消化物)。
显示于图1的结果清楚地表明:贮存在本发明干固体介质上的DNA未发任何程度的改变,而且它能在原位使用,正如在此所描述的那样。实施例2贮存在包含引物的干固体介质上DNA的PCR反应
在收集血液DNA样品前将引物加到干固体介质上,在含该引物的干固体介质上进行PCR分析。2.1遗传物质
A.材料
1.DNA模板
为了制备含DNA的遗传材料样品,将3微升人血加到一个3平方毫米的干固体介质样品上,让血液干燥。除非另外指出,这个3平方毫米的方形物接着用于每一PCR反应中。3微升血液相当于大约250纳克白细胞DNA。另外,利用PCR法在自由溶液中扩增了一种纯化的人DNA的对照样品。
2.引物
得自人II类HLA基团、DQ-α的两种合成寡核苷酸引物用于实验中,它们的序列是:
5’GTGCTGCAGGTGTAAACTTGTACCAG 3’(SEQ ID NO:7)
5’CACGGATCCGGTAGCAGCGGTAGAGTTC 3’(SEQ ID NO:8)
使用这两种引物预期得到的PCR产物大小为262bp。每种引物以50ng/μl的浓度作为储备溶液贮存。当在处理前加到干固体介质上时,将150ng的两种引物加到3平方毫米的干固体介质上。该引物总是以相同浓度一起使用。
2.2单相酚洗涤
溶液A:
单相酚溶液。含有120毫克8-羟基喹啉的50克酚用10毫升1.0MTris-醋酸盐pH8.0和1.0毫升2-巯基乙醇饱和。在0-4℃饱和后,彻底取出并丢弃。
溶液B:
含水酒精洗涤溶液。75%v/v异丙醇,25%v/v 0.1M醋酸钾,pH7.8。
溶液C:
离子含水洗涤溶液。75%v/v异丙醇,25%v/v 0.01M醋酸镁。
B.方法
1.洗涤干固体介质
贮存在包含一种引物的干固体介质上的GM样品进行下述处理:首先用200微升溶液A或者在37℃或者在50℃下洗涤该介质二小时,接着用溶液A迅速冲洗水相二次。该介质紧接着在室温下用溶液B冲洗三次,每次用200微升,每次5分钟。然后在室温用200微升溶液C洗涤介质20分钟,并随后进行真空干燥(洗涤时间都是过量的,实际上可使用较短的时间。通过观察(1)血红蛋白和(2)羟基喹啉颜色的消失可监测洗涤的有效性)。
2.3 PCR操作步骤
A.材料
1. 50微升实例PCR混合物
在加热循环之前,将下述混合物放置在含有血液样品的洗涤过的干固体介质上:
67mM tris-HCl(在25℃下pH8.8)
16.6mM(NH4)2SO4
0.2毫克/毫升明胶
0.45%Triton X-100
2.0mM MgCl2
0.2mM每种dATP,dTTP,dCTP,dGTP
2.5单位Taq聚合酶
模板血液DNA在干固体介质上,或为作为自由溶液的提纯的人DNA(当是自由溶液时,在其中加50毫微克模板)。
如表1中所示,引物被干固体介质所包含和/或引物在自由溶液中(如果是自由溶液时,每一引物加100毫微克)。
B.方法
1.扩增条件
在94℃ 4分钟(开始条件)
在94℃ 1分钟
在50℃ 40秒(32次循环)
在72℃ 1分钟
4℃ (浸渍-结束条件)
预期的产物是人II类HLA基因、DQ-α的242bp片段。
2.电泳条件
电泳是在1%琼脂糖中进行,内含0.045M tris、0.046M硼酸、1mM EDTA,pH8.0,在8.5伏/厘米电泳1.5小时。
C.结果
取3毫米×3毫米加引物的干固体介质。将来自一位供血者的3微升新收集的人血加到所有的干固体介质样品上,并让其干燥,然后在室温贮存7天。
然后用单相酚洗涤液洗涤干固体介质的方形物,接着将所有的介质方形物滴入PCR混合物中,混合物中或是已有引物或者未加引物。因而有多种试验:其中在将血加到介质上的前后将引物加到介质中和加到最后的PCR混合物中(见表1)。
在循环后,将8微升每一反应混合物样品与Promega PCR标记混合物(Promega Corp.Madison,威士康辛)一起电泳(DNA带在1000bp、750bp、500bp、300bp、150bp、50bp)。凝胶用溴化乙锭染色,并拍照产物DNA带(见图2)。
用单相酚洗涤液在37℃对4种样品进行处理,并将4种样品用单相酚洗涤液在50℃进行处理。用于两套样品的随后算得步骤和PCR反应条件都是相同的。图2表明,在37℃进行提取产生了预期大小的DNA带,并且它们的强度不同(1-4泳道),而在50℃进行提取时产生了预期大小的强带(5-8泳道)。为了表明由于干体介质回收DNA的PCR产物是有特异性的,并且与预期的PCR产物相符,用标准方法对提纯的人DNA进行PCR反应(图2,第12泳道),或者不加DNA进行PCR反应(图2,第13泳道)。若反应中未加外源DNA就看不到产物(图2,第13泳道),并且用提纯DNA所得产物与由处理过的介质样品所得PCR产物的迁移率是一样的(图2,比较第11泳道和第12泳道)。
然后将另外两套样品在37℃提取。对一种反应,引物是在加血后才加到干固体介质中。对第二种反应,引物同样是加血后才加到干固体介质中,并将额外的引物恰好在PCR反应开始前加入。这一实验的结果分别显示于图2的第9泳道和第10泳道。第9泳道展现出当引物在取血后加到干固体介质中时,干固体介质上的DNA产生了预期大小的PCR产物。当引物恰好在进行PCR反应前加入时,则获得了更强的预期大小的PCR产物(比较第9泳道和第10泳道)。这些实验的结果总结于表1中。
表1.贮存在干固体介质上DNA的PCR反应的实验条件
表注:A=在收集血液样品前,将引物包在干固体介质上。B=在将血液收集在介质上后,将引物包在干固体介质上。C=在将血液收集在干固体介质上后,将引物包在干固体介质上,并
模板DNA的来源 | 引物的加入时间 | 酚洗涤时间 | 图2中的泳道 | PCR的平均结果 |
洗涤过的干固体介质上的人血 | A | 37℃ | 1-4 | ++ |
” | A | 50℃ | 5-8 | ++++ |
” | A | 50℃ | 11 | ++++ |
溶液中提纯的人DNA | D | N.A. | 12 | ++++ |
无DNA | D | N.A. | 13 | - |
洗涤过的干固体介质上的人血 | B | 37℃ | 9 | +++ |
” | C | 37℃ | 10 | ++++ |
恰好在PCR反应前加入额外的引物。D=引物恰好在PCR反应前加入。N.A=不能应用。++++=强亮带+++=中等强亮带++=中等带+=弱带
概括地说,含有引物的干固体介质的使用显然是可行的,它打开了一扇技术之窗,该技术使大规模的PCR分析更加实用,并且经得起较不熟练工人的检验,它还开辟了利用不稳定模板的潜在的、新的应用途径。实施例3.限制性内切酶EcoRI对贮存血液的原位消化
为了确定贮存在一个基于纤维素的干固体介质上的血液DNA样品是否被限制性内切酶原位消化,并且因而适用于诸如RFLP的分析步骤,将血液样品收集在基于纤维素的干固体介质上,用单相酚洗涤液洗涤,并用限制性内切酶EcoRI消化。在此实验中,血液样品在处理前贮存在干固体介质上长达18个月。3.1单相酚洗涤
A.材料与方法
单相酚洗涤液和其它洗涤溶液在实施例1和实施例2中进行了描述。将1.5毫升溶液A加到一种含有大约0.1毫升干的人血的干燥的干固体介质片上,该介质的大小为10毫米×10毫米,用标准的实验室混合器混合该溶液,并且在37℃保温30分钟。然后通过抽吸除去溶液A,再加新鲜的溶液A。用溶液A重复处理直到血红素颜色从干固体介质全部消失。
下一步,用溶液B洗涤样品五次,每次两分钟,然后用溶液C洗涤两次,每次也是大约两分钟。在每次洗涤之间,使介质样品经过离心萃取。为此,将介质置一小微量离心管中短暂地离心,在该离心管上已刺穿了一小孔,并且套入一个较大的微量离心管中。然后介质在真空下干燥,另一方法是通过离心萃取。在加了血液和随后干燥后,最初呈黑色的样品在经过处理步骤后变白了。
3.2用限制性内切酶消化贮存在干固体介质上的样品
A.材料
在Boehringer Manheim公司提供的缓冲液中使用限制性内切酶EcoRI。
B.方法
将洗涤过的干固体介质用50微升含有过量限制性内切酶的限制性内切酶缓冲液润湿。为了用限制性内切酶EcoRI消化,加入60单位的酶。为了保证完全润湿,将介质在缓冲液中弄湿,用离心法除去液体,用缓冲液和酶的混合物再润湿。在37℃消化2.5小时。
首先通过离心萃取介质,并收集萃取流体,把用限制性内切酶消化过的DNA从介质中取出,然后通过用25微升7.5M醋酸铵洗涤固体介质,接着用25微升2.5M醋酸铵洗涤。进一步取出DNA。在每一洗涤步骤中,介质经过离心萃取,以便最大限度地回收流体。将来自各洗涤步骤的流体合并至终体积约为100微升。通过加入250微升乙醇,从收集的液体中沉淀出DNA,并在风干最后的沉淀物。将沉淀物再悬浮于20微升水中,并把10微升再悬浮的沉淀物用于凝胶电泳中。
3.3凝胶电泳
A.凝胶电泳条件
将消化产物在Tris-醋酸盐(其成分是0.01M Tris,0.005M醋酸钠,0.5M EDTA,用醋酸调至pH7.8)中制备的1.5%琼脂糖凝胶中,于50伏、8毫安电泳2小时,此后凝胶用溴化乙锭染色并照相(见图3)。
3.4结果
为了确定贮存在本发明介质上的血液样品经较长时间后是否能被限制性内切酶消化,处理了基于纤维素的干固体介质上的样品(血液是在19个月以前、11个月以前或两周前加到介质上的),然后用EcoRI消化样品。图3包括一张用溴化乙锭染色的模式照片,展示了一种用EcoRI消化人DNA特有的模糊图案。因而可见,在介质上起码贮存19个月的DNA可被限制性内切酶消化的。实施例4通过干固体介质使I型单纯疱疹病毒和其他微生物失活
在这些实验中,检测按照本发明制备的干固体介质使I型单纯疱疹病毒(HSV)失活的能力。之所以选用I型单纯疱疹病毒,是因为它对灭活相对地有抗性,并且是可通过血液和其他体液传染的。
4.1单纯疱疹病毒的分离
A.材料与方法
将由眼部损伤获得的I型单纯疱疹病毒的新近临床分离物,在HEP 2上皮细胞和MRC-5成纤维细胞的组织培养瓶中生长至高效价(>18空斑形成单位/毫升),将其由瓶中收获出来,并用超声波处理以释放出细胞内的病毒。通过将超声波处理物的澄清上清液经高速高心而浓缩病毒颗粒,并重新悬浮于含有0.2M蔗糖(溶于0.02M磷酸盐缓冲液(pH7.6)内)、10%胎牛血清和抗生素的病毒运输培养基(VTM)中。4.2将病毒加到干固体介质上以及随后的回收
关于实验I,将病毒的粗制品按1∶10或者在VTM中稀释,或者在新鲜的加了肝素的血液中稀释。将10微升稀释液样品成双地在未经处理的基于纤维素的10毫米×10毫米纸片上进行试验,并同样在按照本发明制备的干固体介质10毫米×10毫米方片上进行试验。在施加病毒后,方形物用精细的镊子支承在空气中,并在适当的时间间隔后,在1毫升含有2%胎牛血清的MRC-5维持培养基(MM)(Eagles MEM基础培养基加上Earle氏盐类)中通过强烈搅动,使病毒从方形物中洗脱下来。
在实验II中,从贮存在-70℃处取出病毒储液,按1∶4在加了柠檬酸盐的血液中稀释。4.2测定病毒的感染性
A.材料与方法
利用一种荧光病灶测定法检验洗脱液的感染性。将样品按1∶100在MM中稀释,然后聚0.2毫升稀释液加到一48孔浅盘的一个有MRC-5成纤维细胞的孔中。在37℃保温45分钟后,样品用0.5毫升MM液更换,并将浅盘置37℃在5%CO2存在下保温过夜。然后将细胞固定,用与荧光素结合的单纯疱疹病毒的抗本进行染色,并用倒置荧光显微镜数出荧光病灶的数目。4.3结果与讨论
I型单纯疱疹病毒颗粒或者加到未处理过的基于纤维素的纸上,或加到按照本发明处理的基于纤维素的纸而产生出的干固体介质上。然后在经过不同的时间长度后将病毒洗脱下来。在一个实验中,病毒贮存在VTM中,而在第二个实验中,病毒重悬浮于血液中。实验结果显示于表2中。在两个实验中,当病毒加到干固体介质上,甚至当病毒颗粒被立即洗脱下来时,病毒的感染性被降低到检测不到的水平,在这些条件下,抑制作用大于99.5%。对比之下,由未处理过的基于纤维素的纸(CBP)洗脱下来的血中病毒,如果被抑制的话,则仅被轻微地抑制。当实验是用从冰冻的病毒贮液复苏的病毒进行时,观察到对HSV感染性有相似的抑制作用。
本发明也证明了干固体介质对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌以及环境中不定的微生物的生长有抑制作用。
表2.在加到未处理的基于纤维素的纸(CBP)上或加到
干固体介质上之后单纯疱疹病毒的感染性
实施例5为用于标准分析***而处理本发明干固体介质的方法
处 理 | 病毒效价 | 抑制百分率 | 病毒效价 | 抑制百分率 |
A.在VTM中的HSV | B.在血液中的HSV | |||
未处理过的(病毒直接加到MM液中) | 1.9×107 | 0 | -- | |
病毒点在处理过的CBP上,并立即洗脱到MM液中 | <5.0×104(未检测到病毒) | >99.5 | <5×104(未检测到病毒) | 99.5 |
病毒点在未处理过的CBP上,并立即洗脱至MM液中 | 1.2×107 | 37 | 9.8×106 | 48 |
病毒点在处理过的CBP上,并在10分钟后洗脱到MM液中 | <5×104(未检测到病毒) | >97 | <5×104(未检测到病毒) | >97 |
病毒被点在未处理过的CBP上,并在10分钟后洗脱到MM液中 | 1.8×106 | 90 | 9.7×106 | 47.5 |
有或没有用于随后分析组分的本发明干固体介质,也可以用于诊断目的的分析物的标准检定中,例如用于苯丙酮酸尿症(PKU)的Guthrie试验中以及酶测定中,诸如用于半乳糖血症的试验中。这两种试验都是对新生婴儿常规开展。在用这类标准检定***分析之前,最好在分析这类分析物以前,通过加一种“转化剂溶液”以中和含有血液样品的干固体介质上的SDS和EDTA。
5.1干固体介质转化剂溶液
干固体介质转化剂溶液是通过结合SDS和EDTA而起作用的。
A.材料与方法
干固体介质转化剂溶液包括下述混合物。
1.将577毫升鱼精蛋白硫酸盐(鲑精蛋白)(Sigma公司编号-4380,批号71F-0037)加到7.69毫升水中并摇动(形成75毫克/毫升)。
在透析前这批溶液在名义上是75毫克/毫升。该浓度接近于鱼精蛋白的溶解度,它作为一种胶质混浊团块缓慢地溶解。
2.透析:这是一种清除性的预防措施,以保证该材料基本上是无菌的和完全溶解的。
将胶质混浊团块放在一透析袋中,透析袋直径约为1.5厘米,长度为2厘米至10厘米。袋的两端被紧紧结扎。然后将该袋称重并投入一个含有大约800毫升50mM醋酸镁以及氯仿和一搅棒的1升烧瓶中。该材料在烧瓶中对800毫升50mM醋酸镁和作为消毒剂存在的过量氯仿(约5毫升)透析过夜。鱼精蛋白在过夜后几乎完全溶解,产生清澈的溶液和少数明显的小块碎片。
该袋的重量增加:
在透析以前袋重=8.1克
在4℃用氯仿饱和的液体透析20小时。
透析后的袋重=8.67克
因而,鱼精蛋白的浓度现在名义上是70毫克/毫升。(假定通过袋无损失)。
3.然后将袋在底部穿刺,并收集流体,而且以4000rpm(约2000×g)离心10分钟以除去碎片。
4. 1毫升装的这批溶液贮存在-80℃。
5.在分析前,将大约3微升转化剂溶液加到每一含有血液样品的3毫米直径的盘状干固体介质上。5.2苯丙酮酸尿症(PKU)的筛选步骤(Guthrie试验)
Guthrie试验基于在生长抑制剂β-噻吩基丙氨酸存在下,苯丙氨酸对枯草杆菌生长的刺激作用。
将贮存在本发明干固体介质上的血液样品盘状物放在含有细菌孢子和抑制剂的琼脂上。在37℃培养16至18小时后,盘状物周围菌生长的直径是与苯丙氨酸浓度成比例的。婴儿中高于正常水平的则显示为苯丙酮酸尿症。
将干固体介质用于Guthria试验的优点是:干固体介质盘状物保留了来自样品的蛋白质和血红蛋白,而在盘状物周围留下一个较清洁的区域,并使解释结果变得较为容易。实际上贮存在干固体介质上含苯丙氨酸的血液样品,产生的细菌生长环始终至少象标准纸上相同样品一样强。
同样地,由于足够的细菌孢子用于Guthria试验,而且菌长生速率是如此,因而与干固体介质最接近、由干固体介质的试剂抑制或杀死的细菌并未使解释结果产生问题。因此,当使用干固体介质时,没有必要在试验前将转化剂溶液加到盘状物上。但是,向盘状物加转化剂溶液对除去可观察到的弱的生长抑制区带是有好处的。5.3用于半乳糖血症的筛选
半乳糖血症的筛选需要使用活性酶以分析半乳糖和磷酸半乳糖。主要的酶:β-半乳糖脱氢酶使NAD还原为NADH,这可用分光光度计法进行观察。
这种分析被干固体介质组合物中的组分严重地抑制,但是通过将转化剂溶液加到贮存在干固体介质上的血液样品,可以基本上消除抑制。
在加转化剂溶液后,恰好在酶分析之前,观察到分析进行的方式与对未处理过的、基于纤维素的纸上血液样品进行分析的方式相同。当然,与使用标准材料相比,干固体介质的优点是提供杀死病原体和保存样品的好处。
本说明书中所有的专利显示了与本发明有关领域普通技术人员的水平。所有的专利通过引用结合到本文中,其范围与每一个专利和公开物通过引用具体和单独指出的范围相同。
在不违反所附的权利要求书的精神或范围的情况下,对本发明能做许多变化和修改,这对本领域一普通技术人员来说是显而易见的。
序列表(1)一般资料
(i)申请者:Flinders Technologies Pty. Ltd.
(ii)发明题目:用于贮存和分析遗传物质的干固体介质
(iii)序列数:8
(iv)通信地址:
(A)收集人:Davies Collison Cave
(B)街道:I Little Collins Street
(C)城市:墨尔本(Melbourne)
(D)州:维多利亚(Victoria)
(E)国家:澳大利亚
(F)邮政编码:3000
(v)计算机可读形式:
(A)媒介类型:Diskette
(B)计算机:国际商用机器公司(IBM)兼容机
(C)操作***:DOS
(D)软件:快速序列版本1.5(Fast SEQ Version 1.5)
(vi)目前的申请资料:
(A)申请号码:
(B)归档日期:
(C)分类:
(vii)先前申请资料:
(A)申请号:US 08/480135
(B)归档日期:1995年6月7日
(vii)先前申请资料:
(A)申请号:US 08/574888
(B)归档日期:1995年12月19日
(viii)代理律师/代理人信息
(A)姓名:Slattery,John M
(B)注册号:
(C)参考/代理机构编号:
(ix)电信信息
(A)电话:+613 9254 2777
(B)电传:+613 9254 2770(2)SEQ ID NO:1的信息
(i)序列特征
(A)长度:23个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链性:单链
(D)拓扑学:线性
(ii)分子类型:基因组DNA
(iii)假设的:否
(iv)反义:否
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(vi)最初来源:
(xi)序列描述,SEQIDNO:1TGACTGAGTA CAAACTGGTG GTG 23(2)SEQ ID NO:2的信息
(i)序列特征
(A)长度:22个碱基对
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(iv)反义:否
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(xi)序列描述:SEQ ID NO:2CTCTATGGTG GGATCATATT CA 22(2)SEQ ID NO:3的信息
(i)序列特征
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(i)序列特征
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(i)序列特征
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(i)序列特征
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(i)序列特征
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(C)链性:单链
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(vi)最初来源:
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(i)序列特征
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(iv)反义:否
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(xi)序列描述:SEQ ID NO:8CACGGATCCG GTAGCAGCGG TAGAGTTC 28
Claims (55)
1.一种贮存至少一个遗传物质样品的干固体介质,所述固体介质包括:
(a)一种已吸着一种包含蛋白质变性剂和螯合剂的组合物的固体基质;以及
(b)一种用于所述遗传物质样品随后分析的组分。
2.按照权利要求1的干固体介质,其中所述蛋白质变性剂是一种去污剂。
3.按照权利要求2的干固体介质,其中所述去污剂是一种阴离子去污剂。
4.按照权利要求1的干固体介质,其中所述用于随后分析的组分包含一种核苷酸序列。
5.按照权利要求1的干固体介质,其中所述用于随后分析的组分包含一种靶序列稳定剂。
6.按照权利要求1的干固体介质,其中所述用于随后分析的组分包含PCR引物。
7.按照权利要求1的干固体介质,其中所述组合物还包含一种自由基捕集剂。
8.按照权利要求7的干固体介质,其中所述自由基捕集剂是尿酸或一种尿酸盐。
9.按照权利要求1的干固体介质,其中所述组合物还包括一种碱。
10.按照权利要求1的干固体介质,其中还包括一种保留剂。
11.按照权利要求10的干固体介质,其中所述保留剂是一种疏水性物质。
12.按照权利要求11的干固体介质,其中所述疏水性物质是一种蜡。
13.按照权利要求10的干固体介质,其中所述的保留剂减少在含水洗涤步骤期间用于随后分析的所述组分的损失。
14.按照权利要求1的干固体介质,其中所述的用于随后分析的所述组分,在所述遗传物质样品被加到所述的干固体介质中之后,被包入所述的干固体介质。
15.按照权利要求1的干固体介质,其中所述的干固体介质是一张包含多于一种用于随后分析的组分的卡。
16.一种用于贮存并可选进行遗传物质样品的随后分析的方法,包括:
(a)将一个遗传物质样品加到干固体介质中,所述干固体介质包括一种固体基质,在其上已吸着一种组合物,该组合物包括一种蛋白质变性剂、一种螯合剂和一种用于所述遗传物质样品随后分析的组分;
(b)贮存所述的遗传物质样品;
(c)可选地洗涤所述遗传物质样品;并且
(d)可选地分析所述遗传物质样品。
17.按照权利要求16的方法,其中所述步骤(a)、(b)、(c)或(d)中任一步骤都是在一种自动化***上进行的。
18.按照权利要求16的方法,其中所述的遗传物质样品是RNA。
19.按照权利要求18的方法,其中所述被分析的遗传物质样品是RNA,利用逆转录酶在聚合酶链支应中,将它转录成DNA。
20.按照权利要求16的方法,其中所述的遗传物质样品是DNA。
21.按照权利要求20的方法,其中所述的遗传物质样品是血液或口腔细胞。
22.按照权利要求16的方法,其中步骤(d)的所述遗传物质样品用聚合酶链反应进行分析。
23.按照权利要求16的方法,其中洗涤步骤(c)所述的遗传物质样品是用一种含水洗涤***进行的。
24.按照权利要求16的方法,其中所述的干固体介质还包括一种保留剂。
25.按照权利要求24的方法,其中所述的保留剂是一种疏水性物质。
26.按照权利要求25的方法,其中所述的疏水性物质是一种蜡。
27.按照权利要求16的方法,所述的蛋白质变性剂是一种去污剂。
28.按照权利要求27的方法,其中所述的去污剂是一种阴离子去污剂。
29.按照权利要求16的方法,其中所述的组合物还包含一种碱。
30.按照权利要求16的方法,其中所述组合物还包括一种自由基捕集剂。
31.按照权利要求30的方法,其中所述的自由基捕集剂是尿酸或一种尿酸盐。
32.按照权利要求16的方法,其中所述的用于随后分析的组分包含一种核苷酸序列。
33.按照权利要求16的方法,其中所述的用于随后分析的组分包含一种靶序列稳定剂。
34.按照权利要求16的方法,其中所述的用于随后分析的组分包含一种PCR引物。
35.按照权利要求16的方法,其中步骤(c)所述的遗传物质样品是用一种单相酚洗涤液洗涤的。
36.按照权利要求16的方法,其中步骤(c)所述的遗传物质样品是用一种碱性含水洗涤液洗涤的。
37.按照权利要求16的方法,其中步骤(d)所述的遗传物质样品是用RFLP分析的。
38.一种用于贮存并可选地进行遗传物质样品的随后分析的方法,包括:
(a)将一个遗传物质样品加到一种包括一固体基质的干固体介质中;
(b)将一种包含一蛋白质变性剂、一种螯合剂和一种用于所述遗传物质样品随后分析的组分配成的组合物加到所述固体基质中;
(c)贮存所述的遗传物质样品;
(d)可选地洗涤所述遗传物质样品;以及
(e)可选地分析所述的遗传物质样品。
39.一种用于贮存并可选地进行遗传物质样品的随后分析的方法,包括:
(a)将一个遗传物质样品加到一种包括一固体基质的干固体介质中,在该固体基质上已吸着一种包括一蛋白质变性剂和一螯合剂的组合物;
(b)将一种用于所述遗传物质样品随后分析的组分加到所述干固体介质中;
(c)贮存所述的遗传物质样品;
(d)可选地洗涤所述遗传物质样品;以及
(e)可选地分析所述的遗传物质样品。
40.一种用于贮存并利用一种酶试验随后分析一血液样品的方法,包括:
(a)将一个血液样品加到一种干固体介质中,所述的干固体介质包括一种在其上已吸着一种组合物的固体基质,该组合物包括一螯合剂和一具有使蛋白质变性效应的蛋白质变性剂;
(b)将所述的血液样品贮存在所述干固体介质上;
(c)中和所述蛋白质变性剂的所述的蛋白质变性作用;以及
(d)利用所述的酶试验分析所述的血液样品。
41.按照权利要求40的方法,其中在步骤(c)中所述的蛋白质变性剂被一种转化剂溶液所中和。
42.按照权利要求40的方法,其中所述的蛋白质变性剂是一种去污剂。
43.按照权利要求42的方法,其中所述的去污剂是一种阴离子去污剂。
44.按照权利要求40的方法,其中所述干固体介质包含一种用于随后分析的组分。
45.按照权利要求40的方法,其中所述的组合物还包含一种自由基捕集剂。
46.按照权利要求45的方法,其中所述的自由基捕集剂是尿酸或一种尿酸盐。
47.按照权利要求40的方法,其中所述的组合物还包含一种碱。
48.按照权利要求40的方法,其中所述的酶试验是Guthria试验。
49.按照权利要求40的方法,其中所述的酶试验用于半乳糖血症。
50.一种用于贮存并可选地进行遗传物质样品的随后分析的干固体介质试剂盒,所述试剂盒包括:
(a)至少一个容器;以及
(b)一种干固体介质包含在该容器内,所述的干固体介质包括一种固体基质,在该固体基质上已吸着了一种包括一蛋白质变性剂和一螯合剂的组合物。
51.按照权利要求50的一种试剂盒,其中所述的干固体介质还包含一种用于所述遗传物质样品的随后分析的组分。
52.按照权利要求50的一种试剂盒,其中所述的干固体介质还包含一种保留剂。
53.按照权利要求50的一种试剂盒,其中干固体介质能自由地从所述的或每一个所述的容器中取出。
54.按照权利要求50的一种试剂盒,其中干固体介质固定在所述的或每一个所述的容器内。
55.按照权利要求50的一种试剂盒,其中至少一个所述的容器包括一个多孔分析板。
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