JPS63119680A - アシル担体タンパク質−dna配列及び合成 - Google Patents
アシル担体タンパク質−dna配列及び合成Info
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Landscapes
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Cultivation Of Plants (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
アシル担体タンパク質は、このタンパク質を不ノ ビト
ロで使用するために単離することができるかまたはこの
タンパク質を細胞内で葉緑体または関連したオルガネラ
に転位してエノ 竺爽での脂肪酸の産生を改質する条件
下で発現される。種子に特異的なプロモーターを用いて
種子組織中にアシル担体タンパク質を発現させることが
できる構造体を提供する。
ロで使用するために単離することができるかまたはこの
タンパク質を細胞内で葉緑体または関連したオルガネラ
に転位してエノ 竺爽での脂肪酸の産生を改質する条件
下で発現される。種子に特異的なプロモーターを用いて
種子組織中にアシル担体タンパク質を発現させることが
できる構造体を提供する。
植物は、食料に原料および最終製品として用いられる各
種生成物の豊富な源を提供する。植物脂肪酸は多種多様
な商業的目的に広範囲に用いられており、料理用植物油
として、潤滑剤として、アルキド樹脂に、特種化学物質
などとして用いられる。それらのほとんどについて、植
物脂肪酸は18個の炭素原子を有するものでありがちで
あり、16個より少ない炭素原子を有する脂肪酸は通常
は極めて少ない。多くの目的のために、8〜14個の炭
素原子を有する脂肪酸を有することが望ましい。従って
、14個以下の炭素原子を有する総脂肪酸が実質的比率
である植物油の製造法の開発に実質的な興味が向けられ
ている。
種生成物の豊富な源を提供する。植物脂肪酸は多種多様
な商業的目的に広範囲に用いられており、料理用植物油
として、潤滑剤として、アルキド樹脂に、特種化学物質
などとして用いられる。それらのほとんどについて、植
物脂肪酸は18個の炭素原子を有するものでありがちで
あり、16個より少ない炭素原子を有する脂肪酸は通常
は極めて少ない。多くの目的のために、8〜14個の炭
素原子を有する脂肪酸を有することが望ましい。従って
、14個以下の炭素原子を有する総脂肪酸が実質的比率
である植物油の製造法の開発に実質的な興味が向けられ
ている。
この目的を達成するためには、脂肪酸を形成し高級脂肪
酸へ延長する代謝経路の構成メンバーを変更する必要が
あろう。この目的を達成するには、植物の代謝経路を変
更する脂肪酸の代謝鎖に沿った1個以上の成分を製造す
ることができるようにする必要があろう。更に、脂肪酸
の代謝経路の個々の成分については、重要な商業的適用
が存在するであろう。
酸へ延長する代謝経路の構成メンバーを変更する必要が
あろう。この目的を達成するには、植物の代謝経路を変
更する脂肪酸の代謝鎖に沿った1個以上の成分を製造す
ることができるようにする必要があろう。更に、脂肪酸
の代謝経路の個々の成分については、重要な商業的適用
が存在するであろう。
′−の のfiLFなr日
クオ(Kuo)とオールロジ(Oh lrogge)は
、へrchives虹」士樹狙し肋土よ四±■、(19
84年)、234巻、290〜296頁にホウレン草の
アシル担体タンパク質の一次構造を記載している。クオ
(Xuo)とオールロジ(Ohlrogge)は、J、
Biol、Chem、 (1985年)、260巻、8
032〜8037頁に、異なる組織において様々に発現
される様々な同形のアシル担体タンパク質が存在するこ
とを報告している。クローチ(Crouch)らは、J
、 M o I 、−剪狙1匹旦ル1. (1983
年)、2巻、273〜283頁に、ナピンタンパク質を
コードするcDNAの合成を報告している。
、へrchives虹」士樹狙し肋土よ四±■、(19
84年)、234巻、290〜296頁にホウレン草の
アシル担体タンパク質の一次構造を記載している。クオ
(Xuo)とオールロジ(Ohlrogge)は、J、
Biol、Chem、 (1985年)、260巻、8
032〜8037頁に、異なる組織において様々に発現
される様々な同形のアシル担体タンパク質が存在するこ
とを報告している。クローチ(Crouch)らは、J
、 M o I 、−剪狙1匹旦ル1. (1983
年)、2巻、273〜283頁に、ナピンタンパク質を
コードするcDNAの合成を報告している。
以下余白
溌」I刈l斐
植物のアシル担体タンパク質の発現を提供するDNA構
造体を提供する。種子の成熟中に植物の胚に発現する転
写開始領域を用いる特定の構造体を製造する。脂肪酸の
組成と量は、脂肪酸の産生における代謝経路に含まれる
葉緑体または関連のオルガネタ中の成分を変更すること
によって調節され得る。
造体を提供する。種子の成熟中に植物の胚に発現する転
写開始領域を用いる特定の構造体を製造する。脂肪酸の
組成と量は、脂肪酸の産生における代謝経路に含まれる
葉緑体または関連のオルガネタ中の成分を変更すること
によって調節され得る。
背淀m砿l肌
−my ビトロで使用する最終生成物としてのまたは
4y e±での脂肪酸の変性された発現を提供するた
めに植物の種子形成と一緒にアシル担体タンパク質を製
造する方法および組成物を提供する。この目的を達成す
るため、DNA構造体を調製して、ここで配列をコード
する植物のアシル担体タンパク質は、アシル担体タンパ
ク質の発現のために、所定の宿主中で機能する転写開始
および終結調節領域に連結される。
4y e±での脂肪酸の変性された発現を提供するた
めに植物の種子形成と一緒にアシル担体タンパク質を製
造する方法および組成物を提供する。この目的を達成す
るため、DNA構造体を調製して、ここで配列をコード
する植物のアシル担体タンパク質は、アシル担体タンパ
ク質の発現のために、所定の宿主中で機能する転写開始
および終結調節領域に連結される。
発現構造体は、転写の5’−3’方向において、構成ま
たは調節されたものである転写開始調節領域、アシル担
体タンパク質の少なくとも一機能部分をコードする読み
取り枠(好ましくは−(7e、ボーで使用する葉緑体へ
の転位を提供するトランジットペプチド配列を含む)、
及び適当な宿主中で機能する転写終結調節領域を提供す
る。
たは調節されたものである転写開始調節領域、アシル担
体タンパク質の少なくとも一機能部分をコードする読み
取り枠(好ましくは−(7e、ボーで使用する葉緑体へ
の転位を提供するトランジットペプチド配列を含む)、
及び適当な宿主中で機能する転写終結調節領域を提供す
る。
宿主によっては、調節領域は変化する。原核または真核
微生物、具体的には単細胞性の宿主での発現のために、
多種多様な構成的なまたは調節可能なプロモーターを用
いることができる。これらの場合には、アシル担体タン
パク質の調製のおもな目的は、アシル担体タンパク質の
一1’7 ep。
微生物、具体的には単細胞性の宿主での発現のために、
多種多様な構成的なまたは調節可能なプロモーターを用
いることができる。これらの場合には、アシル担体タン
パク質の調製のおもな目的は、アシル担体タンパク質の
一1’7 ep。
での適用に用いることである。
大部分、これらの構造体は、植物中で機能する調製領域
を含み、この領域は、脂肪酸組成物の増強及び変性のた
めにアシル担体タンパク質の弾弦された産生を提供する
。
を含み、この領域は、脂肪酸組成物の増強及び変性のた
めにアシル担体タンパク質の弾弦された産生を提供する
。
使用されるコード配列は、天然源に由来され、合成され
、あるいはこれらを組み合わせであってもよい。天然源
から遺伝子を得るには、各種植物または細菌の如何なる
ものを遺伝子の源として用いてもよい。植物には、ホン
レン草、ブラシカ(Brass 1ca)、例えばカン
ペストリス(campestris)またはナプス(n
apus) 、ココヤシ、綿、ベニ花、ヒマワリ、クツ
エア(Cuphea)などがある。遺伝子を得ることが
できる各種方法の中では、ゲノムまたはcDNAのいず
れかのライフ゛ラリ−を調製してもよい。アシル担体タ
ンパク質のアミノ酸配列に基づいてプローブを調製して
もよい。異なる源からのアシル担体タンパク質の間には
実質的な免疫学的な交差反応性があることが認められて
いるので、原核性および真核性ポリクローン抗体を特定
の源からアシル担体タンパク質を単離するために用いて
もよくそして他の植物源からアシル担体タンパク質を単
離するためにも用いることができる。アシル担体タンパ
ク質を、次に全体または部分的に配列し、そしてプロー
ブをペプチド配列に基づいて設計することができる。部
分的なりNA配列のみが得られる場合には、この部分配
列で十分であるか、または遺伝子を動かして完全なコー
ド配列が得られるようにすることができる。
、あるいはこれらを組み合わせであってもよい。天然源
から遺伝子を得るには、各種植物または細菌の如何なる
ものを遺伝子の源として用いてもよい。植物には、ホン
レン草、ブラシカ(Brass 1ca)、例えばカン
ペストリス(campestris)またはナプス(n
apus) 、ココヤシ、綿、ベニ花、ヒマワリ、クツ
エア(Cuphea)などがある。遺伝子を得ることが
できる各種方法の中では、ゲノムまたはcDNAのいず
れかのライフ゛ラリ−を調製してもよい。アシル担体タ
ンパク質のアミノ酸配列に基づいてプローブを調製して
もよい。異なる源からのアシル担体タンパク質の間には
実質的な免疫学的な交差反応性があることが認められて
いるので、原核性および真核性ポリクローン抗体を特定
の源からアシル担体タンパク質を単離するために用いて
もよくそして他の植物源からアシル担体タンパク質を単
離するためにも用いることができる。アシル担体タンパ
ク質を、次に全体または部分的に配列し、そしてプロー
ブをペプチド配列に基づいて設計することができる。部
分的なりNA配列のみが得られる場合には、この部分配
列で十分であるか、または遺伝子を動かして完全なコー
ド配列が得られるようにすることができる。
所望な配列を得たならば、それを各種の方法で操作する
ことができる。配列が非コードフランキング領域を含む
場合には、このフランキング領域を、例えばBal 3
1のようなヌクレアーゼを用いて切除したり、制限エン
ドヌクレアーゼで制限したり、または且 ビトロでの変
異誘発、プライマー修復あるいは配列中に変異または損
傷を導入する他の方法を用いることによって改質するこ
とができる。従って、トランジション、トランスバージ
ョン、欠、失および挿入を天然に存在する配列に行うこ
とができる。更に、この配列の総てまたは一部分を合成
して、ここで1個以上のコドンを改質して、アミノ酸配
列を変更したり、または1個以上のコドンの突然変異を
導入して、好都合な制限部位を又は、構成または発現に
関与される他の目的を提供することができる。遺伝子を
、合成アダプター、1個以上の好都合な制限部位を導入
するためのリンカ−などを用いることによって更に改質
することもできる。
ことができる。配列が非コードフランキング領域を含む
場合には、このフランキング領域を、例えばBal 3
1のようなヌクレアーゼを用いて切除したり、制限エン
ドヌクレアーゼで制限したり、または且 ビトロでの変
異誘発、プライマー修復あるいは配列中に変異または損
傷を導入する他の方法を用いることによって改質するこ
とができる。従って、トランジション、トランスバージ
ョン、欠、失および挿入を天然に存在する配列に行うこ
とができる。更に、この配列の総てまたは一部分を合成
して、ここで1個以上のコドンを改質して、アミノ酸配
列を変更したり、または1個以上のコドンの突然変異を
導入して、好都合な制限部位を又は、構成または発現に
関与される他の目的を提供することができる。遺伝子を
、合成アダプター、1個以上の好都合な制限部位を導入
するためのリンカ−などを用いることによって更に改質
することもできる。
アシル担体タンパク質は、特定の宿主中にみいだされる
アイソザイムのいずれであってもよく、例えばホウレン
草中に見出されるようなオールロジ(Ohlrogge
)とクオ(Kuo) (上記文献)おいて命名されたA
CP−1およびACP−IIまたは他の植物宿主中に見
出される類似物であってもよい。
アイソザイムのいずれであってもよく、例えばホウレン
草中に見出されるようなオールロジ(Ohlrogge
)とクオ(Kuo) (上記文献)おいて命名されたA
CP−1およびACP−IIまたは他の植物宿主中に見
出される類似物であってもよい。
特に興味深いものはホウレン草のアシル担体タンパク質
、更に詳細にはACP−1であり、次のような配列を有
する。
、更に詳細にはACP−1であり、次のような配列を有
する。
ホウレン草のACP−1
CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTTACTA
CC60らIn Gly Asn Gly A
rg Cys SerGlu Ile Val
Met Asn Leu Li1uATCA
GTCAATCACCTAGCTAGGGAAT 5
21a ) : cDNA配列。
CC60らIn Gly Asn Gly A
rg Cys SerGlu Ile Val
Met Asn Leu Li1uATCA
GTCAATCACCTAGCTAGGGAAT 5
21a ) : cDNA配列。
b):DNA配列によって予測されたアミノ酸配列。
C):タンパク質配列決定(クオ(Kuo)とオールロ
ジ(Ohlrogge)、1984年、上記文献)によ
って決定されるアミノ酸配列。
ジ(Ohlrogge)、1984年、上記文献)によ
って決定されるアミノ酸配列。
*:b)とC)との間の差。
目的とする配列は一般的には少なくとも300bp(塩
基対)、通常は少なくとも約360bp、好ましくは4
11bpを有し、全コード配列は411bpを有する。
基対)、通常は少なくとも約360bp、好ましくは4
11bpを有し、全コード配列は411bpを有する。
更に、5′および3′非コードフランキング領域が存在
し、これはコード領域の5′または3′末端からlbp
〜200bp以上伸びることができ、通常は天然に存在
する非コードフランキング領域の開始コドンの5′は、
約toobp未満、好ましくは約10bp未満である。
し、これはコード領域の5′または3′末端からlbp
〜200bp以上伸びることができ、通常は天然に存在
する非コードフランキング領域の開始コドンの5′は、
約toobp未満、好ましくは約10bp未満である。
アシル担体タンパク質またはその機能性フラグメントを
コードする読み取り枠は、転写開始調節領域にその5′
末端で連結する。多数の転写開始調節領域が利用でき、
これは構造遺伝子の多種多様な構造的または調節可能な
、例えば誘導性転写を行う。宿主によっては、転写開始
調節領域は、ウィルス、プラスミドまたは染色体遺伝子
などからの構造遺伝子からの領域を含むことができる。
コードする読み取り枠は、転写開始調節領域にその5′
末端で連結する。多数の転写開始調節領域が利用でき、
これは構造遺伝子の多種多様な構造的または調節可能な
、例えば誘導性転写を行う。宿主によっては、転写開始
調節領域は、ウィルス、プラスミドまたは染色体遺伝子
などからの構造遺伝子からの領域を含むことができる。
上記の転写開始領域の中には、細菌および酵母宿主、例
えばイー・コーリ(E、coli)、バシルス・ズブチ
リス(Bacillus 5ubtilis) 、サツ
カロミセス・セレビシアエ(Saccharomyce
s cerevisiae)からの領域が存在し、β−
ガラクトシダーゼ、λ−左および右プロモーター、解糖
酵素プロモーターなどのような遺伝子を含む領域がある
。植物に用いられる転写開始領域の中には、ノナピン、
オクトピン、マンノピン、リボース−1,3−ビスホス
フェートカルボキシラーゼ、大小サブユニット、カリフ
ラワー・モザイク・ウィルスからの全長プロモーター、
ナピン、ファゼオビンなどの構造遺伝子と関連する領域
がある。
えばイー・コーリ(E、coli)、バシルス・ズブチ
リス(Bacillus 5ubtilis) 、サツ
カロミセス・セレビシアエ(Saccharomyce
s cerevisiae)からの領域が存在し、β−
ガラクトシダーゼ、λ−左および右プロモーター、解糖
酵素プロモーターなどのような遺伝子を含む領域がある
。植物に用いられる転写開始領域の中には、ノナピン、
オクトピン、マンノピン、リボース−1,3−ビスホス
フェートカルボキシラーゼ、大小サブユニット、カリフ
ラワー・モザイク・ウィルスからの全長プロモーター、
ナピン、ファゼオビンなどの構造遺伝子と関連する領域
がある。
特に興味あるものは、種子の成熟中に調節されるプロモ
ーター、詳細には胚の子葉で合成されるプロモーターで
ある。これらの調節領域には、ナピン、ファゼオリンお
よびグリシニンのような遺伝子の調節領域がある。特に
興味深いナピン調節領域はブラシカ(Brassica
)種、更に詳細にはカンベストリス(campes t
r is)およびナプス(napus)からの領域であ
る。この調節領域は一般的には少なくとも約150bp
且つ約3500bp以下、通常は約2500bp以下で
あり、好ましくは約1000以下である。ナピン遺伝子
はクローチ(Crouch)ら(上記文献)によって報
告されているが、調節領域あるいは非対応遺伝子に対す
る調節領域の使用については開示されていない。
ーター、詳細には胚の子葉で合成されるプロモーターで
ある。これらの調節領域には、ナピン、ファゼオリンお
よびグリシニンのような遺伝子の調節領域がある。特に
興味深いナピン調節領域はブラシカ(Brassica
)種、更に詳細にはカンベストリス(campes t
r is)およびナプス(napus)からの領域であ
る。この調節領域は一般的には少なくとも約150bp
且つ約3500bp以下、通常は約2500bp以下で
あり、好ましくは約1000以下である。ナピン遺伝子
はクローチ(Crouch)ら(上記文献)によって報
告されているが、調節領域あるいは非対応遺伝子に対す
る調節領域の使用については開示されていない。
転写開始調節領域とコード領域は、直接連結され、ここ
で、これら2つの領域のための好都合な制限部位があっ
てもよくまたはそのような制限部位を合成アダプターま
たはリンカ−によって(好適に)導入される。多くの調
節領域は、プラスミドとして利用され、ここで開始およ
び終結調節領域はポリリンカーによって分離されるので
、多くの制限部位は、構造遺伝子の挿入のために利用で
きる。これらの発現構造体は、微生物宿主のために最も
利用できる。
で、これら2つの領域のための好都合な制限部位があっ
てもよくまたはそのような制限部位を合成アダプターま
たはリンカ−によって(好適に)導入される。多くの調
節領域は、プラスミドとして利用され、ここで開始およ
び終結調節領域はポリリンカーによって分離されるので
、多くの制限部位は、構造遺伝子の挿入のために利用で
きる。これらの発現構造体は、微生物宿主のために最も
利用できる。
植物で機能する多くの転写開始および終結領域は、Ti
−およびRi−プラスミド上の遺伝子から単離されてい
るが、これらの領域は、ポリリンカー、マーカー、複製
系などの容易に利用できる構造体の水準に達していない
。更に、本発明については、主な興味は発現を調節して
、転写を種子中で開始することにある。この目的のため
に、ナピン遺伝子のような遺伝子が実質的に興味がある
。
−およびRi−プラスミド上の遺伝子から単離されてい
るが、これらの領域は、ポリリンカー、マーカー、複製
系などの容易に利用できる構造体の水準に達していない
。更に、本発明については、主な興味は発現を調節して
、転写を種子中で開始することにある。この目的のため
に、ナピン遺伝子のような遺伝子が実質的に興味がある
。
ナピン調節領域は、3′−または5′−末端に隣接する
配列、またはナピン宿主、クローチ(Crouch)ら
、1983年、(上記文献)の場合にはナタネの種子の
宿主のゲノムライブラリーをスクリーニングするために
構造遺伝子の中間コード配列からなるプローブを用いる
ことによって得ることができる。苛酷な条件下でプロー
ブとハイブリッド形成するフラグメントを同定すること
によって、ナピン構造遺伝子を有するフラグメントを同
定することができる。ナピン構造遺伝子の潜在的調節配
列5′は、制限マツピングおよびDNA配列分析によっ
て同定することができる。これらの配列は各種条件下で
操作され、ナピンをコードするコドンを全部または部分
的に除去し、コードされていない5′領域をナピンコー
ド領域がないまたは実質的にないようにする。場合によ
っては、開始コドンに隣接する短い非コード領域、通常
は約20bp未満、更に一般的には約10bp未満を除
去するのが望ましい。更に詳細については、実験の部を
参照されたい。
配列、またはナピン宿主、クローチ(Crouch)ら
、1983年、(上記文献)の場合にはナタネの種子の
宿主のゲノムライブラリーをスクリーニングするために
構造遺伝子の中間コード配列からなるプローブを用いる
ことによって得ることができる。苛酷な条件下でプロー
ブとハイブリッド形成するフラグメントを同定すること
によって、ナピン構造遺伝子を有するフラグメントを同
定することができる。ナピン構造遺伝子の潜在的調節配
列5′は、制限マツピングおよびDNA配列分析によっ
て同定することができる。これらの配列は各種条件下で
操作され、ナピンをコードするコドンを全部または部分
的に除去し、コードされていない5′領域をナピンコー
ド領域がないまたは実質的にないようにする。場合によ
っては、開始コドンに隣接する短い非コード領域、通常
は約20bp未満、更に一般的には約10bp未満を除
去するのが望ましい。更に詳細については、実験の部を
参照されたい。
アシル担体タンパク質構造遺伝子のための読み枠と転写
開始調節領域とを連結した後、構成方法の結果として包
含される機能的転写終結調節領域が存在してもよく、ま
たは導入されてもよい。終結領域は、開始領域と同じ構
造遺伝子、すなわちアシル担体タンパク質遺伝子に由来
してもよく、または好都合には異なる構造遺伝子からの
ものであってもよい。終結領域は、通常、ターミネータ
−およびポリアデニル化をコードする配列を含む。
開始調節領域とを連結した後、構成方法の結果として包
含される機能的転写終結調節領域が存在してもよく、ま
たは導入されてもよい。終結領域は、開始領域と同じ構
造遺伝子、すなわちアシル担体タンパク質遺伝子に由来
してもよく、または好都合には異なる構造遺伝子からの
ものであってもよい。終結領域は、通常、ターミネータ
−およびポリアデニル化をコードする配列を含む。
この遺伝子は天然に産するものでもよ(、または分子内
転位用のシグナル配列を、詳細には種子のロイコプラス
トまたは他の植物細胞のクロロプラストに導入すること
によって改質してもよい。
転位用のシグナル配列を、詳細には種子のロイコプラス
トまたは他の植物細胞のクロロプラストに導入すること
によって改質してもよい。
発現構造体の開発において、発現構造体またはそのフラ
グメントの各種成分は、通常細菌宿主例えば−イー、ユ
ニュ(E、 5匪U)において複製することができる好
都合なりローニングベクター中に挿入される。多数のベ
クターが存在して、文献に記載されている。それぞれの
クローニングの後、プラスミドを単離して、制限、新た
なフラグメントの挿入、連結、リセクション、挿入、試
験管内変異誘導、またはプライマー修復のような操作を
行い、これらの成分を所望な配列に適合させることがで
きる。構造体が完成してしまったら、これを次に適当な
ベクターに転位させて、植物細胞の形質転換法にしたが
って更に操作することができる。
グメントの各種成分は、通常細菌宿主例えば−イー、ユ
ニュ(E、 5匪U)において複製することができる好
都合なりローニングベクター中に挿入される。多数のベ
クターが存在して、文献に記載されている。それぞれの
クローニングの後、プラスミドを単離して、制限、新た
なフラグメントの挿入、連結、リセクション、挿入、試
験管内変異誘導、またはプライマー修復のような操作を
行い、これらの成分を所望な配列に適合させることがで
きる。構造体が完成してしまったら、これを次に適当な
ベクターに転位させて、植物細胞の形質転換法にしたが
って更に操作することができる。
通常は、発現構造体と共に宿主において発現するために
必要な調節領域を有し且つ形質転換細胞を選択する構造
遺伝子が含まれる。この遺伝子は、細胞毒性物質、例え
ば抗生物質、重金属、毒素などに対する耐性、栄養要求
株宿主に対して原栄養株を供する相補性、ウィルス免疫
性などを提供する。異なる宿主種の数によって、発現構
造体またはその成分を導入し、1個以上のマーカーを用
いて、異なる選択条件を異なる宿主に用いることができ
る。
必要な調節領域を有し且つ形質転換細胞を選択する構造
遺伝子が含まれる。この遺伝子は、細胞毒性物質、例え
ば抗生物質、重金属、毒素などに対する耐性、栄養要求
株宿主に対して原栄養株を供する相補性、ウィルス免疫
性などを提供する。異なる宿主種の数によって、発現構
造体またはその成分を導入し、1個以上のマーカーを用
いて、異なる選択条件を異なる宿主に用いることができ
る。
構造体を植物宿主に導入する方法は、本発明にとっては
限界的ではない。効率的な形質転換を供する如何なる方
法を用いてもよい。各種方法は、Ti−またはRi−プ
ラスミド、微量注射法、エレクトロポレーション、リポ
ソーム融合などを用いることから成る。多くの場合には
、T−DNAによって一方の側または両側に跨る構造体
、詳細には、左および右のボーダー、更に詳細には右ボ
ーダーを有する構造体が望ましい。これは、構造体が形
質転換の様式としてA・チュメファシエンス(A、 t
umefaciens)またはA・リゾジーンズ(A。
限界的ではない。効率的な形質転換を供する如何なる方
法を用いてもよい。各種方法は、Ti−またはRi−プ
ラスミド、微量注射法、エレクトロポレーション、リポ
ソーム融合などを用いることから成る。多くの場合には
、T−DNAによって一方の側または両側に跨る構造体
、詳細には、左および右のボーダー、更に詳細には右ボ
ーダーを有する構造体が望ましい。これは、構造体が形
質転換の様式としてA・チュメファシエンス(A、 t
umefaciens)またはA・リゾジーンズ(A。
rh izogenes)を用いる場合、特に有用であ
るが、T−DNAボーダーは、その他の様式の形質転換
の場合にも使用することができる。
るが、T−DNAボーダーは、その他の様式の形質転換
の場合にも使用することができる。
アゲロバクチリア(八grobacterium)を植
物細胞の形質転換に用いるときには、アゲロバクチリア
宿主に存在するTi−またはRi−プラスミドのT−D
NAによる相同組換えのためにアゲロバクチリア宿主中
に導入されるベクターを用いることができる。組換え用
T−DNAを含むTi−またはR1−プラスミドは、武
装され(胆汁形成を引き起こすことができる)るかまた
は武装解除して(胆汁形成を引き起こすことができない
)ことができ、Vir遺伝子が形質転換された宿主に存
在するかぎり、後者が許容される。武装されたプラスミ
ドは、通常の植物細胞と胆汁との混合物を生じることが
できる。
物細胞の形質転換に用いるときには、アゲロバクチリア
宿主に存在するTi−またはRi−プラスミドのT−D
NAによる相同組換えのためにアゲロバクチリア宿主中
に導入されるベクターを用いることができる。組換え用
T−DNAを含むTi−またはR1−プラスミドは、武
装され(胆汁形成を引き起こすことができる)るかまた
は武装解除して(胆汁形成を引き起こすことができない
)ことができ、Vir遺伝子が形質転換された宿主に存
在するかぎり、後者が許容される。武装されたプラスミ
ドは、通常の植物細胞と胆汁との混合物を生じることが
できる。
アゲロバクチリアを植物細胞の形質転換用ビヒクルとし
て用いる幾つかの場合には、T−DNAボーダーによっ
て境界される発現構造体を、広い宿主スペクトルベクタ
ー中に挿入するのであり、広い宿主スペクトルベクター
は文献に記載されている。通常は、pRK2またはその
FA’A体が用いられる。例えば、ディツタ(Ditt
a) らのPNAS SAD、 77巻、7347〜
7351頁および欧州特許出願第0.120.515号
明細書を参照されたい。発現構造体およびT−DNAと
共に1種以上のマーカーが含まれ、これによって形質転
換されたアゲロバクチリアおよび形質転換された植物細
胞を選択することができる。
て用いる幾つかの場合には、T−DNAボーダーによっ
て境界される発現構造体を、広い宿主スペクトルベクタ
ー中に挿入するのであり、広い宿主スペクトルベクター
は文献に記載されている。通常は、pRK2またはその
FA’A体が用いられる。例えば、ディツタ(Ditt
a) らのPNAS SAD、 77巻、7347〜
7351頁および欧州特許出願第0.120.515号
明細書を参照されたい。発現構造体およびT−DNAと
共に1種以上のマーカーが含まれ、これによって形質転
換されたアゲロバクチリアおよび形質転換された植物細
胞を選択することができる。
植物細胞と共に使用する多数のマーカーが開発されてお
り、例えばクロラムフェニコール、アミノグリコシド0
418 、ハイグロマイシンなどに対する耐性が上げら
れる。用いられる特定のマーカーは本発明に本質的では
ないが、特定の宿主および構成法に依存して、特定のマ
ーカーが好ましい。
り、例えばクロラムフェニコール、アミノグリコシド0
418 、ハイグロマイシンなどに対する耐性が上げら
れる。用いられる特定のマーカーは本発明に本質的では
ないが、特定の宿主および構成法に依存して、特定のマ
ーカーが好ましい。
発現構造体は、各種の植物生活、詳細には植物油の産生
に包含される植物生活で用いられる。これらの植物には
、ブラシカ(Brass 1ca)、例えばナプス(n
apus)およびカンペストリス(campes tr
is)、ヒマワリ、ベニ花、綿、クツエア(Cuphe
a)、大豆およびトウモロコシがある。
に包含される植物生活で用いられる。これらの植物には
、ブラシカ(Brass 1ca)、例えばナプス(n
apus)およびカンペストリス(campes tr
is)、ヒマワリ、ベニ花、綿、クツエア(Cuphe
a)、大豆およびトウモロコシがある。
アゲロバタテリアを用いて植物細胞を形質転換するため
には、外植片を混合し、そして、形質転換のために十分
な時間形質転換されたアゲロバクチリアと共にインキエ
ベーション行い、バクテリアを殺し、そして植物細胞を
適当な選択培養液中で培養することができる。カルスが
形成されたら、既知の方法によって適当な植物ホルモン
を用いて茎葉形成を促進して、そして茎葉を発根培地に
移して植物を再生させる。これらの植物を次に種子にま
で成長させ、この種子を用いて反復再生を行い、植物油
を単離することができる。
には、外植片を混合し、そして、形質転換のために十分
な時間形質転換されたアゲロバクチリアと共にインキエ
ベーション行い、バクテリアを殺し、そして植物細胞を
適当な選択培養液中で培養することができる。カルスが
形成されたら、既知の方法によって適当な植物ホルモン
を用いて茎葉形成を促進して、そして茎葉を発根培地に
移して植物を再生させる。これらの植物を次に種子にま
で成長させ、この種子を用いて反復再生を行い、植物油
を単離することができる。
DNA配列は、遺伝子を誘導した宿主以外の宿主におい
て、アシル担体タンパク質を検索するプローブとしても
用いることができる。更に、本発明によって産生される
アシル担体タンパク質は、アシル担体タンパク質を検出
するためのアッセイに用いる抗体を調整するのに用いる
ことができる。
て、アシル担体タンパク質を検索するプローブとしても
用いることができる。更に、本発明によって産生される
アシル担体タンパク質は、アシル担体タンパク質を検出
するためのアッセイに用いる抗体を調整するのに用いる
ことができる。
アシル担体タンパク質は、葉緑体分解物と共に用いて、
不ノ ビトロで、調整される脂肪酸の産生を増進させお
よび/または脂肪酸の組成を改質することもできる。ア
シル担体タンパク質は、植物および細菌における脂肪酸
形成の機構を検討するのに用いることもできる。
不ノ ビトロで、調整される脂肪酸の産生を増進させお
よび/または脂肪酸の組成を改質することもできる。ア
シル担体タンパク質は、植物および細菌における脂肪酸
形成の機構を検討するのに用いることもできる。
以下の実施例は説明のために堤供し、制限のた“(7)
b (7) T: 1.:t f、g I、z・
以下令白〔実施例〕 用いられるクローニングベクターは、pUCベクター、
pUc8およびptlc9 Cビイラ(Vieira)
およびスプリング(Messing) 、1982年〕
、堕匣、u吏ユ259〜268頁;pUC18及びpu
c 19 (ノランダー(Norrander) ら
、1983年〕江些、並立、 101〜106頁、ヤニ
ッシューペロン(Yanisch−Perron) ら
(1985年)1匣、剥土、103〜119頁、上記プ
ラスミドpUCのアンピシリン耐性のためにマーカーと
してのクロラムフェニコール耐性(CAM)を交換する
類似ベクター(pUc−CAM (pUc 12−C
mXpUc 13−1m)バンクレイ・ケイ(Buck
ley、に、)、博士論文、UC5D、 CA、 19
85年)を含む。ptlc 81およびpuc 19ベ
クターの多数のクローニング部位をpUc −CAMと
交換し、CAM耐性を有するpCGN565およびpC
GN566を得た。M13の5465でのUBiA■部
位から5941でのAhaIIIまでの遺伝子開領域を
pUCのNde 1部位に挿入したpUC18およびp
UC19であるpUc118およびρUC119も用い
た。(ビイラ・ジエイ・アンド・スプリング、ジエイ・
ワックスマン・インスティテユート・ラドガース・ユニ
バーシティ(Vieira J、and Messin
g+ J、 Waksmaninstitute、Ru
tgers tlniversity)ラドガース、ニ
ュー・シャーシーより入手)。
b (7) T: 1.:t f、g I、z・
以下令白〔実施例〕 用いられるクローニングベクターは、pUCベクター、
pUc8およびptlc9 Cビイラ(Vieira)
およびスプリング(Messing) 、1982年〕
、堕匣、u吏ユ259〜268頁;pUC18及びpu
c 19 (ノランダー(Norrander) ら
、1983年〕江些、並立、 101〜106頁、ヤニ
ッシューペロン(Yanisch−Perron) ら
(1985年)1匣、剥土、103〜119頁、上記プ
ラスミドpUCのアンピシリン耐性のためにマーカーと
してのクロラムフェニコール耐性(CAM)を交換する
類似ベクター(pUc−CAM (pUc 12−C
mXpUc 13−1m)バンクレイ・ケイ(Buck
ley、に、)、博士論文、UC5D、 CA、 19
85年)を含む。ptlc 81およびpuc 19ベ
クターの多数のクローニング部位をpUc −CAMと
交換し、CAM耐性を有するpCGN565およびpC
GN566を得た。M13の5465でのUBiA■部
位から5941でのAhaIIIまでの遺伝子開領域を
pUCのNde 1部位に挿入したpUC18およびp
UC19であるpUc118およびρUC119も用い
た。(ビイラ・ジエイ・アンド・スプリング、ジエイ・
ワックスマン・インスティテユート・ラドガース・ユニ
バーシティ(Vieira J、and Messin
g+ J、 Waksmaninstitute、Ru
tgers tlniversity)ラドガース、ニ
ュー・シャーシーより入手)。
林料
末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ(TDT
) 、RNアーゼH,、E、コリ (E、coli)、
DNAポリメラーゼ、T4キナーゼおよび制限酵素が、
ベテスダ・リサーチ・ラボラトリーズ(Bethesd
a Re5earch Laboratories)か
ら人手し;E9コリ (E、coli)のDNAリガー
ゼは、ニュー・イングランド・バイオラプス(New
EnglandBiolabs)から入手し;逆転写酵
素はライフ・サイエンス、インコーボレーテド(Lif
e 5cience+Inc、)から入手し;同位元素
はアメルシャム(Amersham)から入手し;X−
galはビーチャム社、トーランス・カリホルニャから
入手した。
) 、RNアーゼH,、E、コリ (E、coli)、
DNAポリメラーゼ、T4キナーゼおよび制限酵素が、
ベテスダ・リサーチ・ラボラトリーズ(Bethesd
a Re5earch Laboratories)か
ら人手し;E9コリ (E、coli)のDNAリガー
ゼは、ニュー・イングランド・バイオラプス(New
EnglandBiolabs)から入手し;逆転写酵
素はライフ・サイエンス、インコーボレーテド(Lif
e 5cience+Inc、)から入手し;同位元素
はアメルシャム(Amersham)から入手し;X−
galはビーチャム社、トーランス・カリホルニャから
入手した。
ホウレン の か゛のcDNAライブ′″1−のファシ
オツチ(Facc to t t i) ら」お佳肛
Iが互■(1985年)、3巻、241〜246頁、の
方法によって、4Mグアニジン・チオシアネート緩衝液
中で若いホウレン草の葉から全RNAを抽出した。全R
NAを、2回オリゴ(d T)−セルロースカラムクロ
マトグラフィにかけて、マニアチス(Man ia t
is)ら、 Mo1ecular C1oniB
: 八 Laboratory Manual
、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、
ニューヨーク (1982年)記載の方法にしたがって
ポリ (A) ”RNAを生成させた。cDNAライ
ブラリーは、グブラー(Gubler)とホフマン(t
loffman)、(Gene(1983年)25巻、
263〜269頁)の方法を若干修正した方法でpUc
13−Cmに構成した。RNアシンは、第一のcDN
Aの合成では、完全に除去されない場合、第二の二重鎖
cDNA合成を妨げるので省き、そしてdCTPを用い
て、ベクターDNAを連結させ、上記文献に記載の逆の
代わりに二重鎖cDNAを連結させた。アニールされた
cDNAを、ハナハン(Hanahan) (J、Mo
1.Biol、 (1983年)166巻、557〜5
80頁)の方法によってコンピテント・E、DIJ(E
、coli)JM83 (Recombinant D
NA Technical Bu−−H且1ム入見」包
幻ユ臼1蝕ルエ醍−91号12 (1979年)、2
号、43〜4日頁のスプリング)細胞に形質転換し、そ
して50n/−のクロラムフェニコールと0.005%
のX−Ga1を含むLB寒天プレート(ミラー(Mil
ler)、分子遺伝学の実験、(1972年)コールド
・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、コールド・ス
プリング・ハーバ−、ニューヨーク)上に塗布した。
オツチ(Facc to t t i) ら」お佳肛
Iが互■(1985年)、3巻、241〜246頁、の
方法によって、4Mグアニジン・チオシアネート緩衝液
中で若いホウレン草の葉から全RNAを抽出した。全R
NAを、2回オリゴ(d T)−セルロースカラムクロ
マトグラフィにかけて、マニアチス(Man ia t
is)ら、 Mo1ecular C1oniB
: 八 Laboratory Manual
、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、
ニューヨーク (1982年)記載の方法にしたがって
ポリ (A) ”RNAを生成させた。cDNAライ
ブラリーは、グブラー(Gubler)とホフマン(t
loffman)、(Gene(1983年)25巻、
263〜269頁)の方法を若干修正した方法でpUc
13−Cmに構成した。RNアシンは、第一のcDN
Aの合成では、完全に除去されない場合、第二の二重鎖
cDNA合成を妨げるので省き、そしてdCTPを用い
て、ベクターDNAを連結させ、上記文献に記載の逆の
代わりに二重鎖cDNAを連結させた。アニールされた
cDNAを、ハナハン(Hanahan) (J、Mo
1.Biol、 (1983年)166巻、557〜5
80頁)の方法によってコンピテント・E、DIJ(E
、coli)JM83 (Recombinant D
NA Technical Bu−−H且1ム入見」包
幻ユ臼1蝕ルエ醍−91号12 (1979年)、2
号、43〜4日頁のスプリング)細胞に形質転換し、そ
して50n/−のクロラムフェニコールと0.005%
のX−Ga1を含むLB寒天プレート(ミラー(Mil
ler)、分子遺伝学の実験、(1972年)コールド
・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、コールド・ス
プリング・ハーバ−、ニューヨーク)上に塗布した。
ホウレン のACP−1cDNAO6つそれぞれ200
cDNAクローンを表わす40のプールからクローン分
析(下記を参照)DNAとサチン法(サブン(Sou
thern)、J、Mo1.Biol、 (1975年
)98巻、503頁)とドツト法(下記)によって約8
000個のcDNAクローンをスクリーンした。ホウレ
ン草ACP−15’− GATGTCTTGAGCCTTGTCCTCATCC
ACATTGATACCA^^CTCCTCCTC−3
’の16個のアミノ酸領域と少なくとも66%類似する
5′−末端を標識された合成オリゴヌクレオチド(AC
PP 4 ”)は、16個のアミノ酸ペプチドglu−
glu−glu−phe−gly−ile−asn−v
al−asp−glu−asp−1ys−ala−gl
n−asp−ile (ホウレン草のACP−Iの残
基49−64 (クオ(Kuo) とオールロジ(O
hlrogge)、Arch、Biochem、Bio
h s、(1984年)234巻、290〜296頁
)〕をコードすることができるDNA配列に対する補体
であり、そしてACPプローブのために使用した。
cDNAクローンを表わす40のプールからクローン分
析(下記を参照)DNAとサチン法(サブン(Sou
thern)、J、Mo1.Biol、 (1975年
)98巻、503頁)とドツト法(下記)によって約8
000個のcDNAクローンをスクリーンした。ホウレ
ン草ACP−15’− GATGTCTTGAGCCTTGTCCTCATCC
ACATTGATACCA^^CTCCTCCTC−3
’の16個のアミノ酸領域と少なくとも66%類似する
5′−末端を標識された合成オリゴヌクレオチド(AC
PP 4 ”)は、16個のアミノ酸ペプチドglu−
glu−glu−phe−gly−ile−asn−v
al−asp−glu−asp−1ys−ala−gl
n−asp−ile (ホウレン草のACP−Iの残
基49−64 (クオ(Kuo) とオールロジ(O
hlrogge)、Arch、Biochem、Bio
h s、(1984年)234巻、290〜296頁
)〕をコードすることができるDNA配列に対する補体
であり、そしてACPプローブのために使用した。
サブン法およびドツト・プロット・ハイブリッド形成用
のクローン分析DNAは、以下のようにして調製した。
のクローン分析DNAは、以下のようにして調製した。
形質転換体を寒天プレートから50μg/−のクロラム
フェニコールを含むLBに移して、10/−培地当り1
0個のクローンを有する群とした。培養物を、振りなが
ら37℃で、で−晩インキュベーション行い、次いで等
量の培養液で希釈し、更に5時間増殖させた。200個
のcDNAクローンのプールを、20個の試料の内容物
を混合することによって得た。DNAを、ビルンボイム
(Birnboim)とドーリ−(Doly)、−aα
1且匡Ac1ds Res、 (1979年)7巻、1
513〜1523頁)の方法によってこれらの細胞から
抽出した。DNAをフェノールとクロロホルムとを用い
て抽出した後、エタノール沈澱を行うことによって制服
酵素で消化できる程に精製した。DNAを無菌の蒸溜水
に再懸濁し、そして40個のプールされたDNA試料の
それぞれIIJgを、」並R1および上d IIIで消
化し、0.7%アガロースゲルで電気泳動を行った。D
NAをニトロセルロースフィルターに移した後、サブン
(Sou thern)のプロットハイブリッド形成法
を行った。
フェニコールを含むLBに移して、10/−培地当り1
0個のクローンを有する群とした。培養物を、振りなが
ら37℃で、で−晩インキュベーション行い、次いで等
量の培養液で希釈し、更に5時間増殖させた。200個
のcDNAクローンのプールを、20個の試料の内容物
を混合することによって得た。DNAを、ビルンボイム
(Birnboim)とドーリ−(Doly)、−aα
1且匡Ac1ds Res、 (1979年)7巻、1
513〜1523頁)の方法によってこれらの細胞から
抽出した。DNAをフェノールとクロロホルムとを用い
て抽出した後、エタノール沈澱を行うことによって制服
酵素で消化できる程に精製した。DNAを無菌の蒸溜水
に再懸濁し、そして40個のプールされたDNA試料の
それぞれIIJgを、」並R1および上d IIIで消
化し、0.7%アガロースゲルで電気泳動を行った。D
NAをニトロセルロースフィルターに移した後、サブン
(Sou thern)のプロットハイブリッド形成法
を行った。
ACPP 4を5′−末端を、製造業者の規定にしたが
ってγ−”PdATPおよびT4キナーゼを用いて標識
した。サブンのプロットからのニトロセルロースフィル
ターに移したクローン分析D N A ヲハイブリッド
形成しく24時間、42℃)、そしてベレント(Ber
en t)ら(BioTechniques (198
5年)3巻、208〜220頁)の方法によって洗浄し
た。
ってγ−”PdATPおよびT4キナーゼを用いて標識
した。サブンのプロットからのニトロセルロースフィル
ターに移したクローン分析D N A ヲハイブリッド
形成しく24時間、42℃)、そしてベレント(Ber
en t)ら(BioTechniques (198
5年)3巻、208〜220頁)の方法によって洗浄し
た。
DNAプールの同じセットのドツトプロットを、0、5
MNa011中でナイロン膜フィルターに1pgの各
DNAプールを塗布することによって調製した。
MNa011中でナイロン膜フィルターに1pgの各
DNAプールを塗布することによって調製した。
これらのプロットを、50%ホルムアミド/1%SDS
/LMのNa(J!中で42℃で24時間プローブを用
いてハイブリッド形成し、そして室温で2X 5SC
10,1%SDS (LX 5SC=0.15M N
aC1,0,015Mクエン酸ナトリウム、5DS−ド
デシル硫酸ナトリウム)で洗浄した。
/LMのNa(J!中で42℃で24時間プローブを用
いてハイブリッド形成し、そして室温で2X 5SC
10,1%SDS (LX 5SC=0.15M N
aC1,0,015Mクエン酸ナトリウム、5DS−ド
デシル硫酸ナトリウム)で洗浄した。
ACPP 4オリゴプローブによってハイブリッド形成
されたプールからのDNAを、JM83細胞に形質転換
し、そして上記のようにプレートに塗布してそれぞれの
形質転換体を得た。これらのそれぞれのcDNAクロー
ンのドソトフ゛ロットはDNAを八CPP 4オリゴヌ
クレオチドプローブでハイブリッド形成し、ニトロセル
ロースフィルターに塗布することによって調製し、プー
ルしたDNA試料のサブンブロソトと同じ条件を用いて
分析した。
されたプールからのDNAを、JM83細胞に形質転換
し、そして上記のようにプレートに塗布してそれぞれの
形質転換体を得た。これらのそれぞれのcDNAクロー
ンのドソトフ゛ロットはDNAを八CPP 4オリゴヌ
クレオチドプローブでハイブリッド形成し、ニトロセル
ロースフィルターに塗布することによって調製し、プー
ルしたDNA試料のサブンブロソトと同じ条件を用いて
分析した。
ヌクレオチド西 1の八F
陽性のクローンpcGN1sOLを制限酵素で消化する
ことによって分析して、次のような部分マツプを得た。
ことによって分析して、次のような部分マツプを得た。
以下全白
pUC13−Cml−35−12481−63−115
21−2001HIt N P Xh
E SXB5m5slE”H−11
indlII N−Nco I P−Pyull
Xh−Xho IE−EcoRI S−5al
I X−Xba I Sm−Sma IB
−Bamll I 5s−3st I*:ティリ
ングで破壊された前のPst1部位。
21−2001HIt N P Xh
E SXB5m5slE”H−11
indlII N−Nco I P−Pyull
Xh−Xho IE−EcoRI S−5al
I X−Xba I Sm−Sma IB
−Bamll I 5s−3st I*:ティリ
ングで破壊された前のPst1部位。
**:指示された利用可能な制限部位を有するポリリン
カー。
カー。
cDNAクローンを、制限、連結、形質転換および分析
の標準的実験室技法(マニアチス(Maniatis)
ら、上記(1982年))を用いてpUc118および
pUc119中にサブクローニングした。単一iM D
N A鋳型を調製し、そしてサンガーのジデオキシ法
(サンガー(Sanger)ら、Proc、Nat、A
cad、Sci、、 (1977年)USA、74巻、
5463〜5467頁)を用いてDNA配列を決定した
。配列分析は、インテリ・ゲネティソクス社からのソフ
トウェア・パッケージを用いて行った。
の標準的実験室技法(マニアチス(Maniatis)
ら、上記(1982年))を用いてpUc118および
pUc119中にサブクローニングした。単一iM D
N A鋳型を調製し、そしてサンガーのジデオキシ法
(サンガー(Sanger)ら、Proc、Nat、A
cad、Sci、、 (1977年)USA、74巻、
5463〜5467頁)を用いてDNA配列を決定した
。配列分析は、インテリ・ゲネティソクス社からのソフ
トウェア・パッケージを用いて行った。
pcGNlsOLは、mRNAのポリ (A)テイルを
表わす3′末端でA残基の伸長部を含む(約)700b
pのcDNA挿入体を含む。位置61でのATGコドン
は、M E T mB訳解しコドンをコードするものと
考えられる。
表わす3′末端でA残基の伸長部を含む(約)700b
pのcDNA挿入体を含む。位置61でのATGコドン
は、M E T mB訳解しコドンをコードするものと
考えられる。
このコドンは、411ヌクレオチド読み取り枠の開始で
あり、この読み取り枠のヌクレオチド229〜471は
、アミノ酸配列が、上記のようなりオ(Kuo)とオー
ルロジ(Ohlrogge) (上記文献)のACP−
1の報告されたアミノ酸配列とほぼ完全に一敗するタン
パク質をコードする。2個のアミノ酸配列の間の相違は
、上記配列に示されている。成熟タンパク質に加えて、
pCGNISOLは、核をコードした葉緑体タンパク質
のために予想されるように、56残基のトランジットペ
プチド配列をもコードする。
あり、この読み取り枠のヌクレオチド229〜471は
、アミノ酸配列が、上記のようなりオ(Kuo)とオー
ルロジ(Ohlrogge) (上記文献)のACP−
1の報告されたアミノ酸配列とほぼ完全に一敗するタン
パク質をコードする。2個のアミノ酸配列の間の相違は
、上記配列に示されている。成熟タンパク質に加えて、
pCGNISOLは、核をコードした葉緑体タンパク質
のために予想されるように、56残基のトランジットペ
プチド配列をもコードする。
ピンプロモーターの j
pgN 1クローン(pUc8へクローニングされたナ
ピン遺伝子を含む一旦一、ナプス(8,7のゲノムDN
Aの3.3 kb EcoRIフラグメント、マルチ・
クラウチ(Marti Crouch)、インディアナ
大学から入手)中にはナピン遺伝子のATC,開始コド
ンの上流には298個のヌクレオチドがある。pgNI
DNAを、EcoRIおよび5stlで消化して、Ec
oRI/5stIで消化されたpcGN706に連結し
た。
ピン遺伝子を含む一旦一、ナプス(8,7のゲノムDN
Aの3.3 kb EcoRIフラグメント、マルチ・
クラウチ(Marti Crouch)、インディアナ
大学から入手)中にはナピン遺伝子のATC,開始コド
ンの上流には298個のヌクレオチドがある。pgNI
DNAを、EcoRIおよび5stlで消化して、Ec
oRI/5stIで消化されたpcGN706に連結し
た。
(pcGN706は、3′とSal Iおよび」旦1部
位でのpCGN566ヘクローニングされたもう一つの
ナピンcDNAクローンpN2 (クローチ(Crou
ch)ら、上記文献)のポリアデニル化配列を含むXh
o 1 / PstIフラグメントである)。その得ら
れたクローンpcGN707を、工■で消化し、そして
酵素工31で処理して、ナピン遺伝子のコード領域の幾
分かを除去した。その得られた切断されたDNAを、」
131で処理た後、Sma !で消化し、再連結した。
位でのpCGN566ヘクローニングされたもう一つの
ナピンcDNAクローンpN2 (クローチ(Crou
ch)ら、上記文献)のポリアデニル化配列を含むXh
o 1 / PstIフラグメントである)。その得ら
れたクローンpcGN707を、工■で消化し、そして
酵素工31で処理して、ナピン遺伝子のコード領域の幾
分かを除去した。その得られた切断されたDNAを、」
131で処理た後、Sma !で消化し、再連結した。
大きさによって選択されたクローンpcGN707の一
つをEcoRIおよびBamHIの消化によって、」並
R1/勿H1の両方で消化されたpE?IBL18(デ
ンテ(Den te)ら、Nucleic Ac1ds
Res、1983年、11巻、1645〜1655頁
)およびp’Uc118中にサブクローンして、それぞ
れE418およびE4118を得た。
つをEcoRIおよびBamHIの消化によって、」並
R1/勿H1の両方で消化されたpE?IBL18(デ
ンテ(Den te)ら、Nucleic Ac1ds
Res、1983年、11巻、1645〜1655頁
)およびp’Uc118中にサブクローンして、それぞ
れE418およびE4118を得た。
」旦31の消化の程度は、E418鋳型のサンガージデ
オキシ配列によって確かめた。プロモーター領域の工3
1による欠失は、開始コドンの下流の57ヌクレオチド
にだけ伸びており、従ってナピンのコード配列の5′末
端及び5′非コード領域の約300bpを含むE411
8は、オリゴヌクレオチドプライマー 5 ’ −GATGTTTTGTATGTGGGC
CCCTAGGAGATG−3’を用いて、シーラー(
Zoller) とスミス(Smith)(Nucle
ic Ac1ds Res、1982年、 10巻
、 6487〜6500頁)によるインビトロ変異誘導
によってATG開始コドンを含むナピンのコード領域の
総てを欠失するようにする。適当な突然変異体のスクリ
ーニングは、E、コリ (E、coli)株JM83
(メッシング・ジエイ(Messing、J、)上記文
献)への2段階形質転換及び推定上の形質転換体のSm
a I消化によって行った。その得られたナピンプロモ
ータークローンは、pCGN77Bであり、そしてpg
Nlの立RI部位からナピンのATG開始コドンの直前
のAヌクレオチドまでの298個のヌクレオチドを含ん
でいる。そのプロモーター領域を、EcoRIおよびB
amHIにより消化し、そしてEcoRI / Bam
Hlで消化されたpCGN565に連結することによっ
てサブクローンして、pCGN779cを得た。
オキシ配列によって確かめた。プロモーター領域の工3
1による欠失は、開始コドンの下流の57ヌクレオチド
にだけ伸びており、従ってナピンのコード配列の5′末
端及び5′非コード領域の約300bpを含むE411
8は、オリゴヌクレオチドプライマー 5 ’ −GATGTTTTGTATGTGGGC
CCCTAGGAGATG−3’を用いて、シーラー(
Zoller) とスミス(Smith)(Nucle
ic Ac1ds Res、1982年、 10巻
、 6487〜6500頁)によるインビトロ変異誘導
によってATG開始コドンを含むナピンのコード領域の
総てを欠失するようにする。適当な突然変異体のスクリ
ーニングは、E、コリ (E、coli)株JM83
(メッシング・ジエイ(Messing、J、)上記文
献)への2段階形質転換及び推定上の形質転換体のSm
a I消化によって行った。その得られたナピンプロモ
ータークローンは、pCGN77Bであり、そしてpg
Nlの立RI部位からナピンのATG開始コドンの直前
のAヌクレオチドまでの298個のヌクレオチドを含ん
でいる。そのプロモーター領域を、EcoRIおよびB
amHIにより消化し、そしてEcoRI / Bam
Hlで消化されたpCGN565に連結することによっ
てサブクローンして、pCGN779cを得た。
ナピンプロモータークローンの −
pCGN779cは、5′−調節配列の298個のヌク
レオチドだけを含む。ナピンプロモーターを、起源のλ
BnNaクローン上の5”−EcoR1部位の上流に見
出された1、 8 kbフラグメントにより伸長した。
レオチドだけを含む。ナピンプロモーターを、起源のλ
BnNaクローン上の5”−EcoR1部位の上流に見
出された1、 8 kbフラグメントにより伸長した。
λBnNa (エム・クラウチ(M 、Crouch)
から入手)の〜3.5 kb Xho Iフラグメント
(ナピン領域を含む)を、ツ刀」で消化されたpUc1
19にサブクローンし、pcGN930を得た。5’X
hoI部位に近い1IindIII部位を用いて、pc
GN930の」圏doll / E並RIフラグメント
を、ll1ndIII / EcoRIで消化されたブ
ルースクリプト+(ベクタークローニング系、サンディ
エゴ、カリフォルニヤ)中にサブクローンし、pCGN
942を得た。伸長されたナピンプロモーターは、Ec
oRIおよびPstlにより消化されたpCGN779
cと」並R1および」旦Iにより消化されたpCGN9
42とを連結することによって、pCGN943を製造
した。このプロモーターは、λBnNa上に含まれるナ
ピン遺伝子の元のATGの上流に〜2.1kbの配列を
含む。
から入手)の〜3.5 kb Xho Iフラグメント
(ナピン領域を含む)を、ツ刀」で消化されたpUc1
19にサブクローンし、pcGN930を得た。5’X
hoI部位に近い1IindIII部位を用いて、pc
GN930の」圏doll / E並RIフラグメント
を、ll1ndIII / EcoRIで消化されたブ
ルースクリプト+(ベクタークローニング系、サンディ
エゴ、カリフォルニヤ)中にサブクローンし、pCGN
942を得た。伸長されたナピンプロモーターは、Ec
oRIおよびPstlにより消化されたpCGN779
cと」並R1および」旦Iにより消化されたpCGN9
42とを連結することによって、pCGN943を製造
した。このプロモーターは、λBnNa上に含まれるナ
ピン遺伝子の元のATGの上流に〜2.1kbの配列を
含む。
土星ヱ左皇上上
伸長されたナピンプロモーターとナピン3′−調節領域
を混合し、遺伝子種子を特異的に発現するためにナピン
カセソトを作った。用いたナピン3′領域は、EcoR
I / Sal Iにより消化されたpCGN565中
にサブクローンされたpgNl(Xho 1部位はナピ
ン遺伝子の停止コドンカラ18ヌクレオチドに配置され
ている)からのXho I / EcoRIフラグメン
トを含むプラスミドpCGN924からのものである。
を混合し、遺伝子種子を特異的に発現するためにナピン
カセソトを作った。用いたナピン3′領域は、EcoR
I / Sal Iにより消化されたpCGN565中
にサブクローンされたpgNl(Xho 1部位はナピ
ン遺伝子の停止コドンカラ18ヌクレオチドに配置され
ている)からのXho I / EcoRIフラグメン
トを含むプラスミドpCGN924からのものである。
」釦dIIT / Pstlで消化されたpCGN94
3およびpcGN1924を連結して、遺伝子を挿入す
るための特異的なりローニング部位Sm、a I 、S
al IおよびPstlを用いて、ナピンカセットpC
GN944を作った。
3およびpcGN1924を連結して、遺伝子を挿入す
るための特異的なりローニング部位Sm、a I 、S
al IおよびPstlを用いて、ナピンカセットpC
GN944を作った。
ピン−ATP 告
pCGN796を、」圏d IIIおよび勿H1で消化
されたpcGNlsOL、 Hin d IIIおよ
びBamHIで消化されたpUc8およびBamHIで
消化されたpUcllBを連結して構成した。pCGN
796からのACP遺伝子を、BamHIで消化し且つ
BamHIで消化されたpCGN565と連結すること
によってクロラムフェニコールバックグラウンドへ転位
させた。得られたpcGN1902を、」並R1と一慣
頃Iで消化し、」匹R1/Smalで消化されたplJ
c118に連結して、pcGN1920を得た。pcG
N1920のACP遺伝子を、Nco 1部位で消化し
、フレナラフラグメントで処理することによってフィル
インし、Sma Iで消化し、再連結してpcGN19
19を得た。これをACP遺伝子からの5′コ一ド配列
を除去し、ATGを再生させた。このACP遺伝子を、
EcoRIによりpcGN1919を消化し、タレナラ
フラグメンによりその部位をフィルインし、そしてPs
tlリンカ−を連結することによって、PstI部位を
フランキングした。このクローンはpCCGN945と
呼ばれる。
されたpcGNlsOL、 Hin d IIIおよ
びBamHIで消化されたpUc8およびBamHIで
消化されたpUcllBを連結して構成した。pCGN
796からのACP遺伝子を、BamHIで消化し且つ
BamHIで消化されたpCGN565と連結すること
によってクロラムフェニコールバックグラウンドへ転位
させた。得られたpcGN1902を、」並R1と一慣
頃Iで消化し、」匹R1/Smalで消化されたplJ
c118に連結して、pcGN1920を得た。pcG
N1920のACP遺伝子を、Nco 1部位で消化し
、フレナラフラグメントで処理することによってフィル
インし、Sma Iで消化し、再連結してpcGN19
19を得た。これをACP遺伝子からの5′コ一ド配列
を除去し、ATGを再生させた。このACP遺伝子を、
EcoRIによりpcGN1919を消化し、タレナラ
フラグメンによりその部位をフィルインし、そしてPs
tlリンカ−を連結することによって、PstI部位を
フランキングした。このクローンはpCCGN945と
呼ばれる。
ρCGN945のACP遺伝子を、上H1/P■Iフラ
グメントとして、BamHI h Pst Iで消化さ
れたptlc118に移動して、pCGN945を生成
させ、」n1部位(pUcllBによって供される)が
、ACP配列の5′−末端となり、ナピンカセットpC
GN 944へのクローニングを促進させるようにした
。」憇■とPstlで消化されたpCGN945aを、
Sam IとPstlで消化されたpCGN944に連
結して、ナピンカセソトpCCGN946を生成した。
グメントとして、BamHI h Pst Iで消化さ
れたptlc118に移動して、pCGN945を生成
させ、」n1部位(pUcllBによって供される)が
、ACP配列の5′−末端となり、ナピンカセットpC
GN 944へのクローニングを促進させるようにした
。」憇■とPstlで消化されたpCGN945aを、
Sam IとPstlで消化されたpCGN944に連
結して、ナピンカセソトpCCGN946を生成した。
ナピンACPカセットを次いで、tlindI11部位
からのクローニングによって二元ベクターpCGN78
3中に転位°させ、pCGN948を生成した。
からのクローニングによって二元ベクターpCGN78
3中に転位°させ、pCGN948を生成した。
一四いM1悲は威
A・チュメファシエンス(A、 tumefacten
s) (ベーカー(Baker) ら、Plant
Mol、Biol、 1983年、2巻、335〜35
0頁)の左および右T−DNAボーダー;pPIIIJ
I (ヒルシ(llirsch)ら1984年、Pl
asmid 12巻、139〜141頁)のゲンタマイ
シン耐性遺伝子:カラフラワー・モザイク・ウィルス(
CaMV)の353プロモーター(ガードナー(Gar
dner) ら、NucleicAcids I?e
s、1981年、9巻、2871〜2890頁);Tn
5のカナマイシン耐性遺伝子(ジョーゲンセン(Jor
gensen) ら、(下記参照)およびウォルフ(W
olff) ら、同上(1985年)13巻、355
〜367頁)およびpTiA6の転写7から3′領域(
バーカー(Barker)ら、1983年、上記文献)
を含む二元プラスミドである。
s) (ベーカー(Baker) ら、Plant
Mol、Biol、 1983年、2巻、335〜35
0頁)の左および右T−DNAボーダー;pPIIIJ
I (ヒルシ(llirsch)ら1984年、Pl
asmid 12巻、139〜141頁)のゲンタマイ
シン耐性遺伝子:カラフラワー・モザイク・ウィルス(
CaMV)の353プロモーター(ガードナー(Gar
dner) ら、NucleicAcids I?e
s、1981年、9巻、2871〜2890頁);Tn
5のカナマイシン耐性遺伝子(ジョーゲンセン(Jor
gensen) ら、(下記参照)およびウォルフ(W
olff) ら、同上(1985年)13巻、355
〜367頁)およびpTiA6の転写7から3′領域(
バーカー(Barker)ら、1983年、上記文献)
を含む二元プラスミドである。
ゲンタマイシン耐性マーカーを得るために、ゲンタマイ
シン耐性遺伝子をppHTJ1の3.1 kb Ec。
シン耐性遺伝子をppHTJ1の3.1 kb Ec。
R1−Pstlフラグメントから単離し、pUCQ中に
クローニングしてpCGN549を得た。ゲンタマイシ
ン耐性遺伝子を含むHindIII −Bam1(Iフ
ラグメントを、pCGN594を作るpCGN587の
」江dlTI−Ba1IIフラグメントと交換した。
クローニングしてpCGN549を得た。ゲンタマイシ
ン耐性遺伝子を含むHindIII −Bam1(Iフ
ラグメントを、pCGN594を作るpCGN587の
」江dlTI−Ba1IIフラグメントと交換した。
pCGN587は次のようにしてgIl 製した。AP
IIII(ジョーゲンセン(Jorgensen)
らHot、 en、Genet。
IIII(ジョーゲンセン(Jorgensen)
らHot、 en、Genet。
1979年)177巻、65頁)の全構造遺伝子を含む
Tn5の」江dlll −S胆lフラグメントを、pU
c8(ビイラ(Vieira)およびメッシング(Me
ssing)Gene(1982年)19巻、259頁
)中にクローニングし、EcoR1部位は−S+na
1部位の直となりにあるので、このフラグメントをl1
indlll −EcoRIフラグメント中に転換する
9次に、APHII遺伝の3′部分を含むPst I
−EcoRIフラグメントを、」並R1−−氾馴H1−
づ遅j−Pstlリンカ−によりpUC7(pCGN5
46W)の」亜R1部位中に組合せた。この構造体はカ
ナマイシン耐性を付与しないので、カナマイシン耐性は
、APIIII遺伝子の1■−Pstlフラグメントを
BamHI −Pst 1部位(pCGN546X)に
挿入することによって得た。この処理は、APIIII
遺伝子を再集合しその結果、」すR1部位がその遺伝子
をフランキングする。ATGコドンは、APHIIのA
TG開始コドンの上流にあり、そしてその読み取り枠と
整合していない。
Tn5の」江dlll −S胆lフラグメントを、pU
c8(ビイラ(Vieira)およびメッシング(Me
ssing)Gene(1982年)19巻、259頁
)中にクローニングし、EcoR1部位は−S+na
1部位の直となりにあるので、このフラグメントをl1
indlll −EcoRIフラグメント中に転換する
9次に、APHII遺伝の3′部分を含むPst I
−EcoRIフラグメントを、」並R1−−氾馴H1−
づ遅j−Pstlリンカ−によりpUC7(pCGN5
46W)の」亜R1部位中に組合せた。この構造体はカ
ナマイシン耐性を付与しないので、カナマイシン耐性は
、APIIII遺伝子の1■−Pstlフラグメントを
BamHI −Pst 1部位(pCGN546X)に
挿入することによって得た。この処理は、APIIII
遺伝子を再集合しその結果、」すR1部位がその遺伝子
をフランキングする。ATGコドンは、APHIIのA
TG開始コドンの上流にあり、そしてその読み取り枠と
整合していない。
好ましくないATGは、スーパーフルーアス(supe
rf 1uous) A T Gを欠いているAPII
Iの5′末端からの5au3A −Pst Iフランキ
ングを、pCGN546WのBamHI −Pst I
部位に挿入して、プラスミドpcGN550を供するこ
とによって回避した。
rf 1uous) A T Gを欠いているAPII
Iの5′末端からの5au3A −Pst Iフランキ
ングを、pCGN546WのBamHI −Pst I
部位に挿入して、プラスミドpcGN550を供するこ
とによって回避した。
APIIII遺伝子を含むEcoRIフラグメントを次
に、発現用のオクトパイン・シンターゼ・カセットを含
むpcGN451のユニークEcoR1部位中にクロー
ニングして、ρCGN552 (I A T G)を供
した。
に、発現用のオクトパイン・シンターゼ・カセットを含
むpcGN451のユニークEcoR1部位中にクロー
ニングして、ρCGN552 (I A T G)を供
した。
pcGN451は、」匹R1リンカ−を介してpTiA
6のオクトパイン・シンターゼ遺伝子の3′非コード領
域に融合された5′非コード領域の約1556bpを含
むオクトパイン・カセットヲ有する。pTi座標は、バ
ーカー(Barker)ら、Plant Mo+、Bi
ol。
6のオクトパイン・シンターゼ遺伝子の3′非コード領
域に融合された5′非コード領域の約1556bpを含
むオクトパイン・カセットヲ有する。pTi座標は、バ
ーカー(Barker)ら、Plant Mo+、Bi
ol。
(1983年)2巻、325頁によって定義されたよう
に、3′令頁域では11 、207〜12,823であ
り、5′令頁域に対しては13.643〜15,208
であった。
に、3′令頁域では11 、207〜12,823であ
り、5′令頁域に対しては13.643〜15,208
であった。
5′フラグメントは次のようにして得た。コード領域の
5′末端を含むBamHI −EcoRIフラグメント
のような小さなサブクローニングされたフラグメントを
、プラスミドρCGN407としてpBR322にクロ
ーニングした。BamHI −EcoRIフラグメント
は、コード領域にXmn 1部位を有し、そしてpBR
322は2個のXmn I部位を有する。pCGN40
7を、Xmn Iで消化し、Ba131ヌクレアーゼに
再切断し、そしてEcoRIリンカ−を該フラグメント
に付加した。EcoRIおよびBamHIによる消化の
後、フラグメントの大きさを両分し、これらの両分をク
ローニングして配列した。ある場合には、全コード領域
と5′非關訳配列のtobpは、5′非転写領域と、m
RNAカップ部位と、BamHI部位に対する)5′非
転写領域の16bpは損なわれないままに除去されてし
まった。この小さなフラグメントは、7%アクリルアミ
ドゲル上でサイプ分別することによって得られ、約13
0bpの長さのフラグメントが?8出した。
5′末端を含むBamHI −EcoRIフラグメント
のような小さなサブクローニングされたフラグメントを
、プラスミドρCGN407としてpBR322にクロ
ーニングした。BamHI −EcoRIフラグメント
は、コード領域にXmn 1部位を有し、そしてpBR
322は2個のXmn I部位を有する。pCGN40
7を、Xmn Iで消化し、Ba131ヌクレアーゼに
再切断し、そしてEcoRIリンカ−を該フラグメント
に付加した。EcoRIおよびBamHIによる消化の
後、フラグメントの大きさを両分し、これらの両分をク
ローニングして配列した。ある場合には、全コード領域
と5′非關訳配列のtobpは、5′非転写領域と、m
RNAカップ部位と、BamHI部位に対する)5′非
転写領域の16bpは損なわれないままに除去されてし
まった。この小さなフラグメントは、7%アクリルアミ
ドゲル上でサイプ分別することによって得られ、約13
0bpの長さのフラグメントが?8出した。
このサイズ分別されたDNAを、M13n+p9と配列
された数個のクローンとに連結し、そしてこの配列をオ
クトパイン・シンターゼ遺伝子の既知配列と比較した。
された数個のクローンとに連結し、そしてこの配列をオ
クトパイン・シンターゼ遺伝子の既知配列と比較した。
M13構造体は、p14と呼ばれ、このプラスミドはB
amI(IとEcoRIで消化され、小さなフラグメン
トが得られ、これをpTi46(ガルフィケル(Gar
f 1nkel)とネステル(Nester)J、Ba
cte−riol、 1980年、144巻、732頁
)からの上流の5′配列を有するBam1(I −Xh
o Iに連結させ、3′配列を有するXho I 〜E
coRIフラグメントに連結した。
amI(IとEcoRIで消化され、小さなフラグメン
トが得られ、これをpTi46(ガルフィケル(Gar
f 1nkel)とネステル(Nester)J、Ba
cte−riol、 1980年、144巻、732頁
)からの上流の5′配列を有するBam1(I −Xh
o Iに連結させ、3′配列を有するXho I 〜E
coRIフラグメントに連結した。
得られたXho Iフラグメントを、pCGN426と
呼ばれるpUc8誘導体のXho 1部位にクローニン
グした。このプラスミドは、Xho Iリンカ−がpU
c8の非反復)fin c 11部位に挿入される場合
、DNAポリポリーゼ■によりフィルインされた全Ec
oRI部位を有し、且つtlin c II制限エンド
ヌクレアーゼのヌクレアーゼ混入によってPstlと1
(in d III部位を喪失している点でpUc8と
は異なっている。
呼ばれるpUc8誘導体のXho 1部位にクローニン
グした。このプラスミドは、Xho Iリンカ−がpU
c8の非反復)fin c 11部位に挿入される場合
、DNAポリポリーゼ■によりフィルインされた全Ec
oRI部位を有し、且つtlin c II制限エンド
ヌクレアーゼのヌクレアーゼ混入によってPstlと1
(in d III部位を喪失している点でpUc8と
は異なっている。
その得られたプラスミドpcGN451は、(T −D
NAの右ボーダー、mRNAカップ部位および5′非
翻訳配列の16bpを有する非転写配列の1550bp
を含む)5′非コ一ド令頁域と、(267bpのコード
領J或、停止コドン、196bpの3′非翻訳DNA、
1153bpのポリA部位および3′非転写配列を含む
)3′領域との間に、タンパク質コード配列を挿入する
ための単一EcoR1部位を有する。pcGN451は
右T−DNAボーダーをも供する。
NAの右ボーダー、mRNAカップ部位および5′非
翻訳配列の16bpを有する非転写配列の1550bp
を含む)5′非コ一ド令頁域と、(267bpのコード
領J或、停止コドン、196bpの3′非翻訳DNA、
1153bpのポリA部位および3′非転写配列を含む
)3′領域との間に、タンパク質コード配列を挿入する
ための単一EcoR1部位を有する。pcGN451は
右T−DNAボーダーをも供する。
オクス5′およびオクス3′を適正な配置で有するその
得られたプラスミドpcGN451を、」並R1により
消化し、そして完全なカナマイシン耐性遺伝子をを有す
るpcGN551からのEcoRIフラグメントを、E
coRIの部位に挿入し、正しい位置にカナマイシン耐
性遺伝子を、適正な位置有するpCGN552を得た。
得られたプラスミドpcGN451を、」並R1により
消化し、そして完全なカナマイシン耐性遺伝子をを有す
るpcGN551からのEcoRIフラグメントを、E
coRIの部位に挿入し、正しい位置にカナマイシン耐
性遺伝子を、適正な位置有するpCGN552を得た。
このオクス/KAN遺伝子を用いて、トランス型二元ベ
クターpCGN587のための選択マーカーを供した。
クターpCGN587のための選択マーカーを供した。
このように工作したオクトパイン・シンターゼ・プロモ
ーター・カセットの5′部分は、15208〜1364
4bp (バーカー(Barker)の計数)でXho
IがらのpTiA6DNAからなり、それはT−DN
A転位に関係したT DNA境界配列(ボーダー)を
有する。プラスミドpCGN587では、pCGN55
2からのオクス/KAN遺伝子は、選択可能なマーカー
と右ボーダーを供する。左の境界領域は最初に、」旦d
lll −Sn1片(+)CGN502) (602〜
2213bp)として旧3mpQ中にクローニングされ
、そしてpCGN565中に」匹1− Eco RIと
して再クローニングされ、pcGN580を供する。p
CGN565は、pHc8− Cmに基づいたクローニ
ングベクターであるが、pUc18リンカ−を有する。
ーター・カセットの5′部分は、15208〜1364
4bp (バーカー(Barker)の計数)でXho
IがらのpTiA6DNAからなり、それはT−DN
A転位に関係したT DNA境界配列(ボーダー)を
有する。プラスミドpCGN587では、pCGN55
2からのオクス/KAN遺伝子は、選択可能なマーカー
と右ボーダーを供する。左の境界領域は最初に、」旦d
lll −Sn1片(+)CGN502) (602〜
2213bp)として旧3mpQ中にクローニングされ
、そしてpCGN565中に」匹1− Eco RIと
して再クローニングされ、pcGN580を供する。p
CGN565は、pHc8− Cmに基づいたクローニ
ングベクターであるが、pUc18リンカ−を有する。
pcGN580をBamHIで線状にして、pVcK1
02 (フナラフ(Knauf)とネスター(Nes
ter)、Plasmid 、1982年、8巻、45
頁)のより小さなlIIフラグメントを置換するのに用
いて、pCGN585を生成した。pCGN585(7
)小さな方(lDsalI7ラグメントをオクス/KA
N遺伝子を有するpCGN552からのXho Iフラ
グメントで置換することによって、pCGN587が得
られた。
02 (フナラフ(Knauf)とネスター(Nes
ter)、Plasmid 、1982年、8巻、45
頁)のより小さなlIIフラグメントを置換するのに用
いて、pCGN585を生成した。pCGN585(7
)小さな方(lDsalI7ラグメントをオクス/KA
N遺伝子を有するpCGN552からのXho Iフラ
グメントで置換することによって、pCGN587が得
られた。
5′−オクスーカナマイシンーオクスー3′(オクスは
プロモーター領域を指示する5′と停止領域を指示する
3′を有するオクトパイン・シンターゼであり、198
5年9月13日出願の米゛国特許出願第775,923
号明細書を参照されたい)フラグメントを有するpcG
N594(7) HindIII −BamH1領域を
、pUc18からの1IindlII −BamHIポ
リリンカーで置換した。
プロモーター領域を指示する5′と停止領域を指示する
3′を有するオクトパイン・シンターゼであり、198
5年9月13日出願の米゛国特許出願第775,923
号明細書を参照されたい)フラグメントを有するpcG
N594(7) HindIII −BamH1領域を
、pUc18からの1IindlII −BamHIポ
リリンカーで置換した。
ポリリンカーを有する。pTiA6のORF 1及び2
を含むpNW31c −8、29−1(トーマスハウ(
Thomashow)ら、釦旦、1980年、19巻、
729頁) (7) Hind I[I −JI I
7−7グメントを、pCGN566(7) Hin d
nl −BamHI部位にサブクローニングしてpC
GN703ヲ住成させた。
を含むpNW31c −8、29−1(トーマスハウ(
Thomashow)ら、釦旦、1980年、19巻、
729頁) (7) Hind I[I −JI I
7−7グメントを、pCGN566(7) Hin d
nl −BamHI部位にサブクローニングしてpC
GN703ヲ住成させた。
転写7 (pTiA6 (バーカー(Barker)ら
、1983年、上記文献、の塩基2396〜2920に
対応する)の3′領域を含むpcGN703の5au3
Aフラグメントを、pUc18k BamH1部位にサ
ブクローニングして、pcGN709を生成させた。p
cGN709の」すRI−5ma I ホリリンカー領
域を、カナマイシン耐性遺伝子(API+3− II)
を有するpCGN587の」匹R1−3ma Iフラグ
メントで置換して、pCGN726を生成させた。
、1983年、上記文献、の塩基2396〜2920に
対応する)の3′領域を含むpcGN703の5au3
Aフラグメントを、pUc18k BamH1部位にサ
ブクローニングして、pcGN709を生成させた。p
cGN709の」すRI−5ma I ホリリンカー領
域を、カナマイシン耐性遺伝子(API+3− II)
を有するpCGN587の」匹R1−3ma Iフラグ
メントで置換して、pCGN726を生成させた。
pCGN726(7) E並R1−5旦■フラグメント
とpCGN734のLII−ユ並R1フラグメントを、
pUc8−CmのBamHI−3旦■部位に挿入して、
pCGN73Bを生成させた。pCGN726cは、9
00bpのEcoRr−EcoR1フラグメントを欠失
させることによってpCGN738から誘導される。
とpCGN734のLII−ユ並R1フラグメントを、
pUc8−CmのBamHI−3旦■部位に挿入して、
pCGN73Bを生成させた。pCGN726cは、9
00bpのEcoRr−EcoR1フラグメントを欠失
させることによってpCGN738から誘導される。
pcGN167を構成するため、CaMV (7144
〜7735bp)(ガードナー(Gardner)
ら、1981年、上記文献)のAlu Iフラグメント
を、^lulを用いて消化することによって得、そして
M13mp7 (メッシング(Messing)ら、N
ucl、Ac1d Res、、1981年、9巻、30
9〜321頁)のtlin c 11部位にクローニン
グして、C614を得た。C614(7) EcoRr
消化物は、35Sプロモーターを含むC614からEc
oRIフラグメントを生成し、これをpUc8(ビイラ
(Vieira)およびメンシング団essing)
、傾匣、1982年、19巻、259頁)の」並RI部
位にクローニングして、pcGN146を生成させた。
〜7735bp)(ガードナー(Gardner)
ら、1981年、上記文献)のAlu Iフラグメント
を、^lulを用いて消化することによって得、そして
M13mp7 (メッシング(Messing)ら、N
ucl、Ac1d Res、、1981年、9巻、30
9〜321頁)のtlin c 11部位にクローニン
グして、C614を得た。C614(7) EcoRr
消化物は、35Sプロモーターを含むC614からEc
oRIフラグメントを生成し、これをpUc8(ビイラ
(Vieira)およびメンシング団essing)
、傾匣、1982年、19巻、259頁)の」並RI部
位にクローニングして、pcGN146を生成させた。
プロモーター領域を整えるために、j111部位(76
70bp)を、」れIIで処理し、続いて」且す1で再
切断し、その後、JLLIIリンカ−を、」lす1で処
理されたDNAに結合し、pcGN147を生成させた
。
70bp)を、」れIIで処理し、続いて」且す1で再
切断し、その後、JLLIIリンカ−を、」lす1で処
理されたDNAに結合し、pcGN147を生成させた
。
プロモーター領域、選択マーカー(2ATGを有するK
AN)および3′領域を有するpcGN148aを、B
gl n テpCGN528を消化し、そしてpcGN
147がら(7) Bam HI −」しIIプロモー
ターフラグメントを挿入することによって調製した。こ
のフラグメントラpCGN52Bの」烈■■部位中にク
ローニングし、上I■部位を、pCGN528のカナマ
イシン遺伝子に接近させた。
AN)および3′領域を有するpcGN148aを、B
gl n テpCGN528を消化し、そしてpcGN
147がら(7) Bam HI −」しIIプロモー
ターフラグメントを挿入することによって調製した。こ
のフラグメントラpCGN52Bの」烈■■部位中にク
ローニングし、上I■部位を、pCGN528のカナマ
イシン遺伝子に接近させた。
この構成に用いたシャトルベクターpCGN52Bは、
以下のようにして調製した。カナマイシン遺伝子(ジョ
ーゲンソン(Jorgenson) ら、Mo1.g
en、Genet1979年、177巻、65頁)を含
むTn5を有するプラスミドを、tlindIII−シ
Hrで消化し、そしてカナマイシン遺伝子を有するHi
n d III −BamHI7ラグメントをpACY
C184(チャフ (Chang)とコーエン(Coh
en) 、J、Bacteriol、、1978年、1
34巻、1141〜1156頁)のテトラサイクリン遺
伝子(D 1lind III −BamHI部位に挿
入することによって、pCGN525を調製した。pC
GN526は、Sma■部位中に挿入されたXho I
リンカ−により改質されたpTiA6(トーマスハウ(
Thomashoh) ら、Ce1l、1980年、
19巻、729〜739頁)のBawl−IIフラグメ
ントを、pCGN525のBamHI部位に挿入するこ
とによって3周製した。pcGN528は、pCGN5
26がらの小さなXho IフラグメントをXho I
で消化することによって欠失させ、再連結することによ
って得た。
以下のようにして調製した。カナマイシン遺伝子(ジョ
ーゲンソン(Jorgenson) ら、Mo1.g
en、Genet1979年、177巻、65頁)を含
むTn5を有するプラスミドを、tlindIII−シ
Hrで消化し、そしてカナマイシン遺伝子を有するHi
n d III −BamHI7ラグメントをpACY
C184(チャフ (Chang)とコーエン(Coh
en) 、J、Bacteriol、、1978年、1
34巻、1141〜1156頁)のテトラサイクリン遺
伝子(D 1lind III −BamHI部位に挿
入することによって、pCGN525を調製した。pC
GN526は、Sma■部位中に挿入されたXho I
リンカ−により改質されたpTiA6(トーマスハウ(
Thomashoh) ら、Ce1l、1980年、
19巻、729〜739頁)のBawl−IIフラグメ
ントを、pCGN525のBamHI部位に挿入するこ
とによって3周製した。pcGN528は、pCGN5
26がらの小さなXho IフラグメントをXho I
で消化することによって欠失させ、再連結することによ
って得た。
pcGN149aは、pMB9KanXX IからのB
amHI−カナマイシン遺伝子フラグメントを、pcG
N148aの勿HI部位にクローニングすることによっ
て製造し、 た。
amHI−カナマイシン遺伝子フラグメントを、pcG
N148aの勿HI部位にクローニングすることによっ
て製造し、 た。
pMB9KanXX Iは、Xho 1部位を喪失して
いるが、Ti2O3からの機能的カナマイシン遺伝子を
有するρ1Ic4に変異株(ビイラ(Vteira)お
よびメソシング(Messing) 、Gene、19
82年、19巻、259〜268頁)であり、アゲロバ
クチリアで効率的選択を行うことができる。
いるが、Ti2O3からの機能的カナマイシン遺伝子を
有するρ1Ic4に変異株(ビイラ(Vteira)お
よびメソシング(Messing) 、Gene、19
82年、19巻、259〜268頁)であり、アゲロバ
クチリアで効率的選択を行うことができる。
pcGN149aを、IIIと31で消化した。pCG
N149aのこの小さな1II−IIフラグメントを、
BamHl−づflで消化することによって単離された
Ml (下記を参照)からのBamHI−」Iフラグ
メントで置換した。これによって、pcGN167を生
成し、この構造体は完全な長さのCaMVプロモーター
、IATG−カナマイシン遺伝子、3′末端および細菌
性Tn 903型カナマイシン遺伝子を含んでいる。M
lはpCGN546χ(pCGN587の構成を参照)
からのEcoRIフラグメントであり、そしてこれを1
^TG−カナマイシン遺伝子のPst1部位が、M13
mp9のポリリンカー領域に接近するような方法で、M
13mp9のEcoRIクローニング部位にクローニン
グした。
N149aのこの小さな1II−IIフラグメントを、
BamHl−づflで消化することによって単離された
Ml (下記を参照)からのBamHI−」Iフラグ
メントで置換した。これによって、pcGN167を生
成し、この構造体は完全な長さのCaMVプロモーター
、IATG−カナマイシン遺伝子、3′末端および細菌
性Tn 903型カナマイシン遺伝子を含んでいる。M
lはpCGN546χ(pCGN587の構成を参照)
からのEcoRIフラグメントであり、そしてこれを1
^TG−カナマイシン遺伝子のPst1部位が、M13
mp9のポリリンカー領域に接近するような方法で、M
13mp9のEcoRIクローニング部位にクローニン
グした。
CaMV −355プロモーター、14TG−カナマイ
シン遺伝子およびpTiA6のBamHI−フラグメン
ト19を有するpcGN167(7) HindlII
−BamHI 7ラグメントを、ptlc19のBa
mHI −Hind I11部位中にクローニングして
pCGN976を生成させた。
シン遺伝子およびpTiA6のBamHI−フラグメン
ト19を有するpcGN167(7) HindlII
−BamHI 7ラグメントを、ptlc19のBa
mHI −Hind I11部位中にクローニングして
pCGN976を生成させた。
転写7からの355プロモーターと3′頭域を、pCG
N976の0.7 kb 1lin d lll−血R
1フラグメ7 ト(35S7”o−t: −ター) ト
1)CGN709(7)0.5kb」匹R1−5…Iフ
ラグメント(転写7 : 3 ’)を、pCGN566
の」旦dlll −S旦■部位に挿入して、 pCGN
766cを製造した。
N976の0.7 kb 1lin d lll−血R
1フラグメ7 ト(35S7”o−t: −ター) ト
1)CGN709(7)0.5kb」匹R1−5…Iフ
ラグメント(転写7 : 3 ’)を、pCGN566
の」旦dlll −S旦■部位に挿入して、 pCGN
766cを製造した。
pCGN766c (CaMV−35S 7’l:1モ
ータ) (7)0.7kb11indlll −Eco
RI 7ラグメントを、pcGN726c(1八TG−
MAN 3 ’令M域)の15kbH並R1−5旦Iに
連結シテ、pUc119ノHind III −Sal
1部位として、pCGN778を生成させた。pcG
N778ノ2.2kbfil域である、CaMV −3
5SプロモーターおよびIATG−KAN −3’ R
1b2ヲ有t4 Hind m −Sal Iフラクメ
ントヲ用イテ、pCGN739(7) Hin d I
II −5al Iリンカ−領域を置換して、pCGN
783を生成させた。
ータ) (7)0.7kb11indlll −Eco
RI 7ラグメントを、pcGN726c(1八TG−
MAN 3 ’令M域)の15kbH並R1−5旦Iに
連結シテ、pUc119ノHind III −Sal
1部位として、pCGN778を生成させた。pcG
N778ノ2.2kbfil域である、CaMV −3
5SプロモーターおよびIATG−KAN −3’ R
1b2ヲ有t4 Hind m −Sal Iフラクメ
ントヲ用イテ、pCGN739(7) Hin d I
II −5al Iリンカ−領域を置換して、pCGN
783を生成させた。
pCGN948を、形質転換によってアグロバクテリウ
ム・チュメファシェンス(Agrobacterium
tume−faciens) EHAIOI (フッ
ド(Hood)ら、J、Bacteriol、、198
6年、168巻、1291〜1301頁)に導入した。
ム・チュメファシェンス(Agrobacterium
tume−faciens) EHAIOI (フッ
ド(Hood)ら、J、Bacteriol、、198
6年、168巻、1291〜1301頁)に導入した。
−晩EIIAIOLの2ml培養液を、MG/Lブイヨ
ン中で30℃で増殖させ、0.5 nt/を10100
m7(7)/Lブイヨン(ガルフィンケル(Garf
1nkel)とネスターCNe5 ter)、J、Ba
cteriol、、1980年、144巻、732〜7
43頁)に接種して、振盪インキュベーター中で30℃
で5時間生長させた。m胞を7にで遠心分離することに
よってベレット化し、MG/LブイヨンI−に再懸濁さ
せ、氷上に置いた。約1■ノpCGN94BDNAを、
100.J+7)MC;/Lブイヨンニ入れ、コレニ、
EIIAIOI?AM1200μlヲ加え、DNA−細
胞混合物を有する試験管を直ちにドライアイス/エタノ
ール浴に5仲間入れた。この試験管を、37℃での水浴
中で5分間速やかに融解させた後、1−の新鮮なM G
/l、 1@養液を加えて、30℃で2時間振盪し、
た。細胞をペレット化し、そして100■/1のゲンタ
マイシンを含むMG/Lプレー)(1,5%寒天)に塗
布した。プラスミドDNAを、それぞれのゲンタマンシ
ン耐性コロニーから単乱し、1L2i(E、coli)
中に形質転換させ、そして制限酵素分析を行ったところ
、ゲンタマイシン耐性EHAIOIが、pCGN948
の完全なコピーを含むことが判った。単一コロニーを採
取して、100■/lのゲンタマイシンを含むMG/L
プレート上に更に2回塗布することによって精製した。
ン中で30℃で増殖させ、0.5 nt/を10100
m7(7)/Lブイヨン(ガルフィンケル(Garf
1nkel)とネスターCNe5 ter)、J、Ba
cteriol、、1980年、144巻、732〜7
43頁)に接種して、振盪インキュベーター中で30℃
で5時間生長させた。m胞を7にで遠心分離することに
よってベレット化し、MG/LブイヨンI−に再懸濁さ
せ、氷上に置いた。約1■ノpCGN94BDNAを、
100.J+7)MC;/Lブイヨンニ入れ、コレニ、
EIIAIOI?AM1200μlヲ加え、DNA−細
胞混合物を有する試験管を直ちにドライアイス/エタノ
ール浴に5仲間入れた。この試験管を、37℃での水浴
中で5分間速やかに融解させた後、1−の新鮮なM G
/l、 1@養液を加えて、30℃で2時間振盪し、
た。細胞をペレット化し、そして100■/1のゲンタ
マイシンを含むMG/Lプレー)(1,5%寒天)に塗
布した。プラスミドDNAを、それぞれのゲンタマンシ
ン耐性コロニーから単乱し、1L2i(E、coli)
中に形質転換させ、そして制限酵素分析を行ったところ
、ゲンタマイシン耐性EHAIOIが、pCGN948
の完全なコピーを含むことが判った。単一コロニーを採
取して、100■/lのゲンタマイシンを含むMG/L
プレート上に更に2回塗布することによって精製した。
ウェスター(1+les ter)のブラシヵナプス(
Brassicanapus)の種子を、95%エタノ
ールに4分間浸漬した。それらを、殺菌溶液100mZ
当り“Tween 20”溶液界面活性剤50mを有す
る次亜塩素酸ナトリウムの1%溶液中で殺菌した。45
分間浸漬した後、種子を無菌蒸溜水で4回濯いだ。それ
らを、無菌のプラスチック製の幅7cm、長さ7cmお
よび高さが10cmの箱(マゼンタ(Magen ta
)でMS(ムラシゲ最少有機培養液(Murashig
e minimalorga−nics medium
)ギプコ(Gibco))の10/10?W度のもの5
0m1を有し、ピリドキシン(5Lqr/l)、ニコチ
ン酸(50ガ/1)、グリシン(200μg/l)を加
え、06%寒天で固化させたものに植えた。
Brassicanapus)の種子を、95%エタノ
ールに4分間浸漬した。それらを、殺菌溶液100mZ
当り“Tween 20”溶液界面活性剤50mを有す
る次亜塩素酸ナトリウムの1%溶液中で殺菌した。45
分間浸漬した後、種子を無菌蒸溜水で4回濯いだ。それ
らを、無菌のプラスチック製の幅7cm、長さ7cmお
よび高さが10cmの箱(マゼンタ(Magen ta
)でMS(ムラシゲ最少有機培養液(Murashig
e minimalorga−nics medium
)ギプコ(Gibco))の10/10?W度のもの5
0m1を有し、ピリドキシン(5Lqr/l)、ニコチ
ン酸(50ガ/1)、グリシン(200μg/l)を加
え、06%寒天で固化させたものに植えた。
光強度を約65 p Em−”s−’として16時間−
8時間の明−暗サイクルで22℃で種子が発芽して、生
長した。5日後に実生を無菌条件にして、胚軸を切除し
て、約4龍の長さに細片に切断した。胚軸切片を支持層
上に平らに置き、支持細胞層がない場合には固化下B5
0/l/1またはB50/I10培養液上のフィルタ
ーの上部に置いた。
8時間の明−暗サイクルで22℃で種子が発芽して、生
長した。5日後に実生を無菌条件にして、胚軸を切除し
て、約4龍の長さに細片に切断した。胚軸切片を支持層
上に平らに置き、支持細胞層がない場合には固化下B5
0/l/1またはB50/I10培養液上のフィルタ
ーの上部に置いた。
B5 0/I10培地はB5塩とビタミン類(ガンボル
フ(Ganborg) % ミラー(Mi 1ler)
およびオジマ(Ojima) 、Experiment
al Ce1l Res、、1968年、50@、15
1〜158頁)、3%スクロース、2.4−ジクロロフ
ェノキシ酢酸(1,0■/1)を含み、pHは5.8に
調整され、培地は0.6%フイトアーガ一(Phyta
gar)で固化している。B5 0/1/1は、上記と
同じものにキネチン1.Oar/lを加えたものである
。支持プレートは、B5 0/L10またはB5 0/
1/l培地に24時間前に、(フィラソチ(Filla
tti)ら、Mo1.gen、Genet、、1987
年、206巻、192〜199真に記載の方法で保持さ
れた)固定相タバコ分散液培養液1.0−を加えること
によって調製した。胚軸切片を切断して、アゲロバクチ
リア(Agrobacterium)処理の24時間前
に支持層プレート上に載せた。
フ(Ganborg) % ミラー(Mi 1ler)
およびオジマ(Ojima) 、Experiment
al Ce1l Res、、1968年、50@、15
1〜158頁)、3%スクロース、2.4−ジクロロフ
ェノキシ酢酸(1,0■/1)を含み、pHは5.8に
調整され、培地は0.6%フイトアーガ一(Phyta
gar)で固化している。B5 0/1/1は、上記と
同じものにキネチン1.Oar/lを加えたものである
。支持プレートは、B5 0/L10またはB5 0/
1/l培地に24時間前に、(フィラソチ(Filla
tti)ら、Mo1.gen、Genet、、1987
年、206巻、192〜199真に記載の方法で保持さ
れた)固定相タバコ分散液培養液1.0−を加えること
によって調製した。胚軸切片を切断して、アゲロバクチ
リア(Agrobacterium)処理の24時間前
に支持層プレート上に載せた。
アグロバクテリウム・チュメファシェンス(Agrob
acterium tumefaciens(EHAl
olx 948株)を、MG/Lブイヨン中で30℃で
アグロバクテリウムの単一コロニーをインキュベートす
ることによって調製した。16時間後に、バクテリアを
集め、MG/Lブイヨン中に10’個のバクテリア/−
に希釈したものを調製した。胚軸切片を、アグロバクテ
リウムQi液に入れることによってバクテリアにより接
種し、そして30〜60分間放置した後、取り出して、
上記B5 0/1/lまたは0/110培地を有するペ
トリ皿に移した。このペトリ皿を、22℃で、薄明りの
中でインキュベートした。バクテリアと胚軸切片との共
インキュベーションを、24〜48時間行った。胚軸切
片を取り出し、500■/1のカルベニシリン(この時
点で、時には硫酸カナマイシン10 、25または50
■/1加えた)を含むB5 0/l/1またはO/I1
0上に、22℃で連続光(約65 u Em−”S−’
)中で7日装置いた。それらを、1%スクロース、3■
/lのベンジルアミノ−プリンおよび1■/1のゼアチ
ンを含むB5塩培地に移した。これに500■/Iのカ
ルベニシリン、10 、25または50■/l硫酸カナ
マイシンを補充して、0.6%フィトアーガー(Phy
tagar) (ギブコ(Gibco))で固化した。
acterium tumefaciens(EHAl
olx 948株)を、MG/Lブイヨン中で30℃で
アグロバクテリウムの単一コロニーをインキュベートす
ることによって調製した。16時間後に、バクテリアを
集め、MG/Lブイヨン中に10’個のバクテリア/−
に希釈したものを調製した。胚軸切片を、アグロバクテ
リウムQi液に入れることによってバクテリアにより接
種し、そして30〜60分間放置した後、取り出して、
上記B5 0/1/lまたは0/110培地を有するペ
トリ皿に移した。このペトリ皿を、22℃で、薄明りの
中でインキュベートした。バクテリアと胚軸切片との共
インキュベーションを、24〜48時間行った。胚軸切
片を取り出し、500■/1のカルベニシリン(この時
点で、時には硫酸カナマイシン10 、25または50
■/1加えた)を含むB5 0/l/1またはO/I1
0上に、22℃で連続光(約65 u Em−”S−’
)中で7日装置いた。それらを、1%スクロース、3■
/lのベンジルアミノ−プリンおよび1■/1のゼアチ
ンを含むB5塩培地に移した。これに500■/Iのカ
ルベニシリン、10 、25または50■/l硫酸カナ
マイシンを補充して、0.6%フィトアーガー(Phy
tagar) (ギブコ(Gibco))で固化した。
その後、外植片を、2週間毎に新しい培地に移しかえた
。
。
1月後に、カナマイシンを含む培地上で選択された緑の
カルス(calli)から緑の茎葉が発生した。
カルス(calli)から緑の茎葉が発生した。
これらの茎葉を少なくとも1cI11の高さになったら
、カルスから切断して、1%のスクロースを含み、生長
物質を加えず、300■/lカーペニシリンを有するB
5培地上に置き、0.6%フイトアーガーで固化した。
、カルスから切断して、1%のスクロースを含み、生長
物質を加えず、300■/lカーペニシリンを有するB
5培地上に置き、0.6%フイトアーガーで固化した。
茎葉を生長を続け、数枚の葉を取ってネオマイシンホス
ホトランスフェラーゼII(NPTII)活性を試験し
た。NPTII活性のために陽性である茎葉を、1%の
スクロース、2■/lのインドール酪酸、200w/l
のカーペニシリンを有し、0.6%フィトアーガーで固
化したB50/1/1培地を含んだマゼンタ箱に入れた
。2.3週間後に茎葉が発根し、土壌に移した。植物を
、22℃で、光強度220μEm −2s −1で、1
6−8時間の明−暗サイクルで生育室で生育し、数週間
後、温室に移した。
ホトランスフェラーゼII(NPTII)活性を試験し
た。NPTII活性のために陽性である茎葉を、1%の
スクロース、2■/lのインドール酪酸、200w/l
のカーペニシリンを有し、0.6%フィトアーガーで固
化したB50/1/1培地を含んだマゼンタ箱に入れた
。2.3週間後に茎葉が発根し、土壌に移した。植物を
、22℃で、光強度220μEm −2s −1で、1
6−8時間の明−暗サイクルで生育室で生育し、数週間
後、温室に移した。
サブン2の一゛−ター
pCGN948とブラシカ・ナプス(Brassica
napus)の胚軸を含む、アグロバクテリウム・チ
ュメファシエンス(八grobacterium tu
mefaciens(EIIAIOIの共培養からの再
生ブラシカ・ナプスを、ホウレン草の葉ACP遺伝子の
適性組込みおよび胚特異性発現について検討した。デラ
ボルタ(Dellaporta)ら、(Plant B
iol、Res、、1983年、1巻、19〜21頁)
の方法によって再生した植物の葉から単離されたDNA
を用いて、サブン分析を行い、CsC1中でバンドする
ことによって精製した。DNA (10g)を制限酵素
EcoRIで消化し、0.7%アガロースゲル上で電気
泳動を行い、ニトロセルロースに移した(マニアチス(
Maniatis)ら、1982年、上記文献を参照さ
れたい)。プロットをホウレン草ACT配列の1.8
kbを含むpCGN945DNAで、または(pcGN
930の」江dllI/E赳R1フラグメントをpCG
N566へ転位させることによって製造した) pCG
N936cから単離した一EcoRI / HindI
IIフラグメントであって、ニックトランスレーション
(製造業者によって記載されていて、ピーアールエル・
ニック・トランスレーション・キット、ベテスダ(Be
thesda Re5earch Laborator
ies)、ガイザースブルク、エム・ディー(MD))
によって32 P −dCTPにより標識されたナピン
5′配列を含むものでプローブした。プロットを、42
℃で、50%ホルムアミド、10xデンハート(Den
hard t)、5 xSSC,0,1%S D
S 、 5 mMEDTA、 100μg/−の修
生胸腺DNAおよび10%硫酸デキストラン(ハイブリ
ッド形成のみ)で予備ハイブリッド形成およびハイブリ
ッド形成を行った。(試薬はマニアチス(Maniat
is)ら、1982年、上記文献に記載)。
napus)の胚軸を含む、アグロバクテリウム・チ
ュメファシエンス(八grobacterium tu
mefaciens(EIIAIOIの共培養からの再
生ブラシカ・ナプスを、ホウレン草の葉ACP遺伝子の
適性組込みおよび胚特異性発現について検討した。デラ
ボルタ(Dellaporta)ら、(Plant B
iol、Res、、1983年、1巻、19〜21頁)
の方法によって再生した植物の葉から単離されたDNA
を用いて、サブン分析を行い、CsC1中でバンドする
ことによって精製した。DNA (10g)を制限酵素
EcoRIで消化し、0.7%アガロースゲル上で電気
泳動を行い、ニトロセルロースに移した(マニアチス(
Maniatis)ら、1982年、上記文献を参照さ
れたい)。プロットをホウレン草ACT配列の1.8
kbを含むpCGN945DNAで、または(pcGN
930の」江dllI/E赳R1フラグメントをpCG
N566へ転位させることによって製造した) pCG
N936cから単離した一EcoRI / HindI
IIフラグメントであって、ニックトランスレーション
(製造業者によって記載されていて、ピーアールエル・
ニック・トランスレーション・キット、ベテスダ(Be
thesda Re5earch Laborator
ies)、ガイザースブルク、エム・ディー(MD))
によって32 P −dCTPにより標識されたナピン
5′配列を含むものでプローブした。プロットを、42
℃で、50%ホルムアミド、10xデンハート(Den
hard t)、5 xSSC,0,1%S D
S 、 5 mMEDTA、 100μg/−の修
生胸腺DNAおよび10%硫酸デキストラン(ハイブリ
ッド形成のみ)で予備ハイブリッド形成およびハイブリ
ッド形成を行った。(試薬はマニアチス(Maniat
is)ら、1982年、上記文献に記載)。
洗浄は1 xSSC,0,1%SDSで30分間、0.
1xSSC,O,1%SDSで55℃で2回行った。
1xSSC,O,1%SDSで55℃で2回行った。
オートラジオダラムは、ACP遺伝子(pCGN945
)でプローブしたところ、4種の植物からのDNAのE
coRI消化物中でハイブリッド形成された約3.3お
よび3.2kbの2つのバンドを示しており、3.3お
よび3.2kbの」並R1フラグメントはpCGN94
8のT DNAF+Jf域に存在するので、植物ゲノ
ムにホウレン草の葉ACP構造が適性に組込まれている
ことを示した。この遺伝子構造は、ナピン5′配列でプ
ローブしたところ、検出された植物DNA−構造DNA
ボーダーフラグメントの数によって判定すると、異なる
植物において単一または複数の遺伝子座に存在した。
)でプローブしたところ、4種の植物からのDNAのE
coRI消化物中でハイブリッド形成された約3.3お
よび3.2kbの2つのバンドを示しており、3.3お
よび3.2kbの」並R1フラグメントはpCGN94
8のT DNAF+Jf域に存在するので、植物ゲノ
ムにホウレン草の葉ACP構造が適性に組込まれている
ことを示した。この遺伝子構造は、ナピン5′配列でプ
ローブしたところ、検出された植物DNA−構造DNA
ボーダーフラグメントの数によって判定すると、異なる
植物において単一または複数の遺伝子座に存在した。
ノーザンー゛−−
ナピンプロモーターからの組込まれたホウレン草の葉A
CP遺伝子の発現は、ノーザン分析によって検出された
が、構造DNAを含むことが示された、形質転換された
植物の一つの葉では検出されなかった。生育している種
子を、形質転換された植物から開花後21日日月集めた
。種子を切り開いて胚を取り出し、液体窒素中で凍結し
た。総RNAを、種子の胚およびクローチ(Crouc
h)ら、1983年、上記文献記載の方法によって、形
質転換された植物の葉から単離し、(シューメーカー(
Shewmaker) ら、Virology、、 1
985年、140巻、281〜288頁記載の方法によ
って)ホルムアルデヒドを含む1.5%アガロースゲル
上で電気泳動を行い、ニトロセルロースにプロットした
(トーマス(Thomas)、Proc、Natl、A
cad、Sci、、 USA% 1980年、77巻、
5201〜5205頁)。プロットを、上記のように予
備ハイブリッド形成およびハイブリッド形成し、洗浄し
た。プローブは、ニックトランスレーションによって標
識されたホウレン草の葉ACP配列のみを含むpCGN
945から単離されたノ11/BamHIフラグメント
であった。
CP遺伝子の発現は、ノーザン分析によって検出された
が、構造DNAを含むことが示された、形質転換された
植物の一つの葉では検出されなかった。生育している種
子を、形質転換された植物から開花後21日日月集めた
。種子を切り開いて胚を取り出し、液体窒素中で凍結し
た。総RNAを、種子の胚およびクローチ(Crouc
h)ら、1983年、上記文献記載の方法によって、形
質転換された植物の葉から単離し、(シューメーカー(
Shewmaker) ら、Virology、、 1
985年、140巻、281〜288頁記載の方法によ
って)ホルムアルデヒドを含む1.5%アガロースゲル
上で電気泳動を行い、ニトロセルロースにプロットした
(トーマス(Thomas)、Proc、Natl、A
cad、Sci、、 USA% 1980年、77巻、
5201〜5205頁)。プロットを、上記のように予
備ハイブリッド形成およびハイブリッド形成し、洗浄し
た。プローブは、ニックトランスレーションによって標
識されたホウレン草の葉ACP配列のみを含むpCGN
945から単離されたノ11/BamHIフラグメント
であった。
約0.8kbのRNAバンドが胚に検出されたが、形質
転換された植物の葉からは検出されなかった。
転換された植物の葉からは検出されなかった。
このことは、ホウレン草の葉のACP遺伝子の発現が種
子に特異的であることを示している。
子に特異的であることを示している。
ACP残基がエシエリシキア・コーリー(Esche−
richia coli) A CPである時には、高
級植物脂肪酸の生合成遺伝子がアシル−ACP基質を認
識することが示されているが、異なる源からの異なる形
のACPは生体内での脂肪酸合成の効率および/または
最終生成物に影響を及ぼす可能性がある。
richia coli) A CPである時には、高
級植物脂肪酸の生合成遺伝子がアシル−ACP基質を認
識することが示されているが、異なる源からの異なる形
のACPは生体内での脂肪酸合成の効率および/または
最終生成物に影響を及ぼす可能性がある。
例えば、ホウレン草(オールロジ(Ohlrogge)
とクオ(Kuo) 、J、Biol、Chem、、1
985年、260巻、8032〜8037頁)と大麦(
ホジ(Hoj)とスベンゼン(Svendsen)、C
arlsberg、Res、Comn+un、 、19
84年、49巻、483〜492頁)は共に1種以上の
形のACPを有する。ACPのイソ型を使用する普遍性
を支持して、油脂種子作物の価値を高めるために、油脂
種子作物ターニップ・レイプ(ブラシカ・カンペストリ
ス(Brassica campestris))の種
子に見出されるACPの遺伝子のcDNAコピーを単離
して、特徴付けた。
とクオ(Kuo) 、J、Biol、Chem、、1
985年、260巻、8032〜8037頁)と大麦(
ホジ(Hoj)とスベンゼン(Svendsen)、C
arlsberg、Res、Comn+un、 、19
84年、49巻、483〜492頁)は共に1種以上の
形のACPを有する。ACPのイソ型を使用する普遍性
を支持して、油脂種子作物の価値を高めるために、油脂
種子作物ターニップ・レイプ(ブラシカ・カンペストリ
ス(Brassica campestris))の種
子に見出されるACPの遺伝子のcDNAコピーを単離
して、特徴付けた。
次の説明はブラシカ・ナプス(Brassica na
pus)ではなく、ブラシカ・カンペストリス(Bra
ssicacampestris)からのナピンプロモ
ーターを用いて、ACP遺伝子をキメラ遺伝子に組込む
処理法の説明である。
pus)ではなく、ブラシカ・カンペストリス(Bra
ssicacampestris)からのナピンプロモ
ーターを用いて、ACP遺伝子をキメラ遺伝子に組込む
処理法の説明である。
通常はrR−500Jと呼ばれるターニップ・レイプの
自己適合性変種であるブラシカ・カンペストリスから未
成熟種子を集める。種子全体は、開花後約14〜28日
に相当する段階で集める。cDNA/<ンクのRNA単
離と調製は、ホウレン草ACPcDNAクローンの単離
について上記した通りであった。
自己適合性変種であるブラシカ・カンペストリスから未
成熟種子を集める。種子全体は、開花後約14〜28日
に相当する段階で集める。cDNA/<ンクのRNA単
離と調製は、ホウレン草ACPcDNAクローンの単離
について上記した通りであった。
cDNAバンクをプローブするため、アプライド・バイ
オシステムス・DNA・シンセサイザー(Appli−
ed Biosystems DNA 5ynthes
izer)3BOA型を用いて、製造業者の勧めにした
がってオリゴヌクレオチド(5’ ) −ACT
TTCTCAACTGTCTCTGGTTTAGCAG
C−(3)を合成した。この合成りNA分子は、アミノ
酸配列(ala−ala−1ys−pro−glu−t
hr−val−glu−1ys−val)をコードする
DNAまたはRNA配列に対して低緊縮性でハイブリッ
ド形成する。このアミノ酸配列は、ブラシカ・ナプス(
Brassica napus)の種子から単離された
ACPについて報告されており (スラバス(Slab
as)ら、第7回植物脂質の構造と機能についての国際
シンポジウム、カリフォルニア大学、デービス、カリフ
ォルニア、プレナム出版、ニューヨーク、1987年)
、ブラシカ・カンペストリスからのACPは極めて類似
している。
オシステムス・DNA・シンセサイザー(Appli−
ed Biosystems DNA 5ynthes
izer)3BOA型を用いて、製造業者の勧めにした
がってオリゴヌクレオチド(5’ ) −ACT
TTCTCAACTGTCTCTGGTTTAGCAG
C−(3)を合成した。この合成りNA分子は、アミノ
酸配列(ala−ala−1ys−pro−glu−t
hr−val−glu−1ys−val)をコードする
DNAまたはRNA配列に対して低緊縮性でハイブリッ
ド形成する。このアミノ酸配列は、ブラシカ・ナプス(
Brassica napus)の種子から単離された
ACPについて報告されており (スラバス(Slab
as)ら、第7回植物脂質の構造と機能についての国際
シンポジウム、カリフォルニア大学、デービス、カリフ
ォルニア、プレナム出版、ニューヨーク、1987年)
、ブラシカ・カンペストリスからのACPは極めて類似
している。
約2200個の異なるcDNAクローンを、コロニーハ
イブリダイゼーション法(タウブ(Taub)とトンプ
ソン(Thompson) 、Anal、Bioche
m、 、1982年、126巻、222〜230頁)と
ウッド(Wood)ら、Proc。
イブリダイゼーション法(タウブ(Taub)とトンプ
ソン(Thompson) 、Anal、Bioche
m、 、1982年、126巻、222〜230頁)と
ウッド(Wood)ら、Proc。
Natl、Acad、Sci、、US^、1985年、
82巻、1585〜1588頁に記載の条件に対応する
ハイブリダイゼーション条件を用いて分析する。オリゴ
ヌクレオチドプローブに明らかなプローブを示す2種の
cDNAクローンのDNA配列分析は、ブラシカ・ナプ
ス(Brassica napus)(スラバス(Sl
abas)ら、上記)から記載されるA CPタンパク
質とコードされたアミノ酸配列がかなり類似しているこ
とによって明らかなように、pcGNIBcsと呼ばれ
るものはACP前駆体タンパク質をコードすることを示
していた。pcGNIBcs (AGBIとも呼ばれる
)のDNA配列は、次のように表わされる。
82巻、1585〜1588頁に記載の条件に対応する
ハイブリダイゼーション条件を用いて分析する。オリゴ
ヌクレオチドプローブに明らかなプローブを示す2種の
cDNAクローンのDNA配列分析は、ブラシカ・ナプ
ス(Brassica napus)(スラバス(Sl
abas)ら、上記)から記載されるA CPタンパク
質とコードされたアミノ酸配列がかなり類似しているこ
とによって明らかなように、pcGNIBcsと呼ばれ
るものはACP前駆体タンパク質をコードすることを示
していた。pcGNIBcs (AGBIとも呼ばれる
)のDNA配列は、次のように表わされる。
laThrSerLeuAlaAIaThrThrAr
g11eSerPheG1nLysIuI 硼 Dde[Alul ll acI !1v1 AGCCAAGGCTTTGTTGGGTTTGTTG
TTTTC483484ATAATCTTCCTGTC
ATTTTCTTTTTCTTTAATGTGTCAA
Hinfl Dral 553 TTGCCAAAAAAA 564トランスゲ
−ニック・ブラシカ・ナプス(Brassica na
pus)において、ブラシカ−カンペストリス(Bra
ssica campestris)の種子ACPの高
水準の胚特異的な発現を達成するため、キメラ遺伝子を
、pCGN946について記載したようにホウレン草A
CP−コードDNA配列を用いて胚特異的なキメラ遺伝
子に類似させる。pcGNIBcsAcPコード領域は
、pcGN1t303 (下記)に存在するブラシカ・
カンペストリス(Brassica campesLr
is)ナピン型プロモーター要素に適合するように調整
する。
g11eSerPheG1nLysIuI 硼 Dde[Alul ll acI !1v1 AGCCAAGGCTTTGTTGGGTTTGTTG
TTTTC483484ATAATCTTCCTGTC
ATTTTCTTTTTCTTTAATGTGTCAA
Hinfl Dral 553 TTGCCAAAAAAA 564トランスゲ
−ニック・ブラシカ・ナプス(Brassica na
pus)において、ブラシカ−カンペストリス(Bra
ssica campestris)の種子ACPの高
水準の胚特異的な発現を達成するため、キメラ遺伝子を
、pCGN946について記載したようにホウレン草A
CP−コードDNA配列を用いて胚特異的なキメラ遺伝
子に類似させる。pcGNIBcsAcPコード領域は
、pcGN1t303 (下記)に存在するブラシカ・
カンペストリス(Brassica campesLr
is)ナピン型プロモーター要素に適合するように調整
する。
確立されたプロトコール(マニアチス(Maniati
s)ら、1982年、上記文献)を用いて、ラムダベク
ター・シャロン(Charon) 35において、ブラ
シカ・カンペストリスの」■II一部分ゲ部分クツムラ
イブラリ−た。増幅されたライブラリーの力価は、約1
.2xlO−’ファージ/ nlであった。、ioo、
ooOの組換えバタテリオファージを、37℃で20分
間、DHI B、コリ (E、coli)細胞(ハナハ
ン・ディー (Hanahan、 D、)、J、Mo1
.Biol、 、1983年、166巻、557頁)に
吸着させた後、N Z Y + 10 mM(7)Mg
SO4+0.9%アガロース中に105/9x9NZY
プレートノ密度で(NZYMはマニアチス(Mania
tis)ら、1982年、上記文献に記載した通りであ
る)加えた。プレートを37℃で約13時間インキユヘ
ートし、4°Cで2.5時間冷却し、前もって切断され
たフィルターをプレート上に約1分間置き、それらを剥
がすことによってファージをジーン・スクリーン・プラ
スにュー・イングランド・ニューフレアー(New E
ngland Nuclear))に移した。吸着され
たファージDNAを、フィルターを1.5 MのNaC
1,0,5MのNa0tlに1分間浮漉させ、1.5M
のNaCf、0、5 M トリス−11C/! 、po
8. Oで2分間、2 xSSCで3分間中和するこ
とによって固定した。フィルターを湿っぽい程度まで風
乾し、サブン分析について記載した方法で42℃で予備
ハイブリッド形成およびハイブリッド形成を行った。フ
ィルターを、プローブpN1 (クローチ(Crou
ch)ら工983年、上記文献)を用いて上記記載のブ
ラシカ・カンペストリス(B、campestris)
の種子cDNAライブラリーから単離されたcDNAク
ローンBE5の上I/−ジ1゜■フラグメントを用いて
ナピンを含むクローンをプローブした。3個のプラーク
を二重フィルター上で強力にハイブリッド形成して、(
マニアチス(Maniatis)ら、1982年、上記
文献に記載の方法で)プラークを精製した。
s)ら、1982年、上記文献)を用いて、ラムダベク
ター・シャロン(Charon) 35において、ブラ
シカ・カンペストリスの」■II一部分ゲ部分クツムラ
イブラリ−た。増幅されたライブラリーの力価は、約1
.2xlO−’ファージ/ nlであった。、ioo、
ooOの組換えバタテリオファージを、37℃で20分
間、DHI B、コリ (E、coli)細胞(ハナハ
ン・ディー (Hanahan、 D、)、J、Mo1
.Biol、 、1983年、166巻、557頁)に
吸着させた後、N Z Y + 10 mM(7)Mg
SO4+0.9%アガロース中に105/9x9NZY
プレートノ密度で(NZYMはマニアチス(Mania
tis)ら、1982年、上記文献に記載した通りであ
る)加えた。プレートを37℃で約13時間インキユヘ
ートし、4°Cで2.5時間冷却し、前もって切断され
たフィルターをプレート上に約1分間置き、それらを剥
がすことによってファージをジーン・スクリーン・プラ
スにュー・イングランド・ニューフレアー(New E
ngland Nuclear))に移した。吸着され
たファージDNAを、フィルターを1.5 MのNaC
1,0,5MのNa0tlに1分間浮漉させ、1.5M
のNaCf、0、5 M トリス−11C/! 、po
8. Oで2分間、2 xSSCで3分間中和するこ
とによって固定した。フィルターを湿っぽい程度まで風
乾し、サブン分析について記載した方法で42℃で予備
ハイブリッド形成およびハイブリッド形成を行った。フ
ィルターを、プローブpN1 (クローチ(Crou
ch)ら工983年、上記文献)を用いて上記記載のブ
ラシカ・カンペストリス(B、campestris)
の種子cDNAライブラリーから単離されたcDNAク
ローンBE5の上I/−ジ1゜■フラグメントを用いて
ナピンを含むクローンをプローブした。3個のプラーク
を二重フィルター上で強力にハイブリッド形成して、(
マニアチス(Maniatis)ら、1982年、上記
文献に記載の方法で)プラークを精製した。
下記のものは、BE5cDNA配列である。
BB5cDNA 長さ=734
BES CDNA
AluI
HpaII AvaIl
5tNI
「
aql
ζ
八luI
珊
5LN1
■
cc1
GAGTGTGTATACCACGGTGATATGA
GTGTG 62111incll ■ 622 GTTGTTGATGTATGTTAACAC
TACATAGTCATGGTGTGTsaI ■ GTTCCATAAATAATGTACTAATGTA
ATAAG 690cc 1 691 AACTACTCCGTAGACGGTAA
TAAAAGAG八八GTTTTTTTTra 1 TTTAA へへ4 ラムダCGNI−2と呼ばれるクローンの一つを制限マ
ツプして、ナピン遺伝子を重なり合う2.7kbのXh
o Iと2.1kbの5alIとの制限フラグメントに
局在させた。2個のフラグメントをラムダCGNI−2
DNAからのpCGN789にサブクローンした(pU
Cに基づいたベクターは、合成リンカー−5′GGAA
TTCGTCGAGAGATCTCTGCAGCTCG
AGGGATCCAAGCTT3′−であってポリリン
カー」並RI、5ail、3ir、Pstl、Xhol
、 BamHTおよび」旦dIIIを表わすものによ
って置換される正常なポリリンカーを有するpUc11
9と同じである)。ナピンのようなサブクローンの同一
性を配列によって確かめた。全コード領域配列と外延的
な5′上流および3′下流配列を決定した。
GTGTG 62111incll ■ 622 GTTGTTGATGTATGTTAACAC
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ツプして、ナピン遺伝子を重なり合う2.7kbのXh
o Iと2.1kbの5alIとの制限フラグメントに
局在させた。2個のフラグメントをラムダCGNI−2
DNAからのpCGN789にサブクローンした(pU
Cに基づいたベクターは、合成リンカー−5′GGAA
TTCGTCGAGAGATCTCTGCAGCTCG
AGGGATCCAAGCTT3′−であってポリリン
カー」並RI、5ail、3ir、Pstl、Xhol
、 BamHTおよび」旦dIIIを表わすものによ
って置換される正常なポリリンカーを有するpUc11
9と同じである)。ナピンのようなサブクローンの同一
性を配列によって確かめた。全コード領域配列と外延的
な5′上流および3′下流配列を決定した。
ラムダCGNI−2
NCG−186線状 長さ= 4325゜1 CTC
GAGGCAGTCACTAACATGAAGTTTG
ACGAGGAGCCCHindIII HhaI Xbal 70 ACTCTAATTGAGCCGTGCGCT
CTATCTAGACCAATTAGASac! lul 八TTGATGGAGCTCTAAAGGTTGCTG
GCTGT 13Bde1 139 TTTCTTGTTCATATGATTAA
CTTCTAAACTTGTGTATAA5O del ATATTCTCTGAAAGTGCTTCT’rTT
GGCATA 207208 TGTAGGTTG
GGCAAAAACGAGGAAGATTGCTTCT
CAATTTGGAAGAGGATGAACAGCCG
AAGAAGAAAA 276ATAACGGTCG
TCGTCCCATGAAACAGAGGT 3453
46 ^へへACATTTTTTGCATATACAC
TTTGAAAGTTCCTCACTcoRV 瑠 AACTGTGTAATCTTTTGGTAGATAT
CACTA 414al1 415 CAATGTCGGAGAGACAA3GG
CTGMNCANCATATACAAA八553 T
GAGTTGTCAへCGGTCTTCCTACACA
AGGTAATAATCAG1nfI 畷 TTGAAGC^^TTAAGAATCAATTTGA
TTTGT 621deI 622 AGTAAACTAAGAAGAACTTA
CCTTATGTTTTCCCCGCAGGACTGG
ATTATGGAACAATGGGAAAAGAAC6
90Alul AluI 691 TACTATATAAGCTCCATAGC
TGGTTCAGATAACGGGAGacI AluI CTCTTTAGTTGTTATGTCAAAAGGT
TAGTGT 759760 TTAGTGAAT
AATAAACTTATACCACAAAGTCTTC
ATTG八CTTATTTATATACTTGTTGT
GAATTGCTAG 828Dへel
1linfl829 GAAC
TACTTATTCTCAGCAGTCATACAAA
GTGAGTGACTCATTTCCGTTCAAGT
GGATAAATAAGAAAT 897mn I 898 GGAAAG八八GATへへTCATGTA
ACCTCCATGACAACTGCTGaq1 GTAATCGTTGGGGTGTGGTAATGTC
GAGGA 966967 ACTCTGGCTT
CTCTGATCAGGTAGGTTTTTGTCTC
TTATTGTCTGGTGTTTTTATTTTCC
CCTGATAGT 1035lu1 1036 CTAATATGATAAACTCTGC
GTTGTGAAAGGTGGTGGAGCTTGsa
1 ACTTTTTGTACCCAAGCGATGGGAT
AC11041105ATAGGAGGTGGGAGA
ATGGGTATAGAATAACATCAATGGS
au3AI AluI I CAGCAACTGCGGATCAAGCAGCTTT
CATAT 11731174 TAAGCATA
CCAAAGCGTAAGATGGTGGATGAAA
CTCAAGI AGACTCTCCGCACCACCGCCTTTCC
AAGTA 1242lul $ 1243 CTCATGTCAAGGTTGGTTT
CTTTAGCTTTGAACACAGATdel Avail Alul 1312 TAGGACCTGAGAGCTTTTG
GTTGATTTTTTTTTCAGGACtlinf
l Rsal へAATGGGCGへへG/IATcTGTAcATT
GcATcA 13801381 ATATGCT
ATGGCAGGACAGTGTGCTGATACAC
ACTTAAGCATCATGTGGAAAGCCA八
八GACAATTGGAG 1449II i n
f I de1 1450 CGAGACTCAGGGTCへへCAT
AATACCAATCAAAGACGTAAAACCA
GACGCAACCTCTTTGGTTGAATGTA
1518sa1 1519 ATGAAAGGGATGTGTCTTG
GTATGTATGTACGAATAACAAAAGA
GAAGATGGAATTAGTAGTAGAAATA
1587lu1 1588 TTTGGGAGCTTTTTAAGCC
CTTC^^GTGTGCTTTTTATCcoRV ― TTATTGATATCATCCATTTGCGTTG
TTTAA 1656XbaI
Dde11657 TGCGTCTC
TAGATATGTTCCTATATCTTTCTCA
GTGTCTGATAAGTGAAATGTGAGAA
AACCATACCAA 17251inf1 1726 へCCAAAATATTCAへへTCTTA
TTTTTAATAATGTTGAATCACTCGG
AGTTGCCACCTTCTGTGCCAATTG
179411infl ■ 1795 TGCTG八^TCへATCACACTA
GAAAAAAACATTTCTTCAAGcoR1 GTAATGACTTGTGGACTATGTTCTG
AATTC18631864TCATTAAGTTTT
TATTTTCTG^八GTTTAAGTTTTTAC
CTTCTGへTTTGAAATATATCGTTCA
TAAGATG 1932BstNI A
lul 1933 TCACGCCAGGACATGAGCT
ACACATCGCACATAGCATG2071
ATCTCCATTCTCACCTATAAATTAG
AGCCTCGGCTTCACTCTTTACTCAA
ACCAAAACTCATCACTACA 21391
uI ■ aeI 1nf1 AIuI I AIuI Taql 1u1 Bs tN 1 G1nVallleSerArgIleTyrGlnT
hrAla八1u1 5tNI 八ccI 番 TGTGTATACCACGGTGATATGAGTG
TGGTT 276011inclT 2761 GTTGATGTATGTTAACACT
ACATAGTCATGGTGTGTGTTsal 痕 CCATAAATAATGTACTAATGTAATA
AGAAC2829ccl ■ 2830 TACTCCGTAGACGGTAATAA
AAGAGAAGTTTTTTTTTTTACTCTT
GCTACTTTCCTATAAAGTGATGAT
28982899 TAACAACAGATACA
CCAAAAAGAAAACAATTAATCTATA
ca I saI TTCACAATGAAGCAGTACTAGTCTA
TTGAA 29672968 CATGTCAG
ATTTTCTTTTTCTAAATGTCTAATT
AAGCCTau3A1 TCAAGGCTAGTGATGATAAAAGATC
ATCC八 3036TACTTCAAAACTATT
TTTGTATTCATTAAA 31051inf
1 3106 TTATGCAAGTGTTCTTTTA
TTTGGTGAAGACTCTTTAGAAGCAA
AGAACGACAAGCAGTAATAAAAAAA
31743175 AC八へAGTTCAGTT
TTAAGATTTGTTATTGACTTATTGT
CATTTGAAAAATATAGTATGATATT
AATAT^ 32433244 GTTTTATT
TATATAATGCTTGTCTATTCAAGAT
TTGAGAACATTAATATGATACTGTC
CACATATCCAA 3312deI 3313 TATATTAAGTTTCATTTCT
GTTCAAACATATGATAAGATGGTCA
AATGATTATGAGTTTTGTTATTTAC
3381au3AI 3451 ^TATGACATCACCTAGAGAA
AGCCGATAATAGTAAACTCTGTTCT
TGGTTTTTGGTTTAATCAAACCGA
35193589 GTTGTAAACCGGTA
TTTCATTTGGTGA八^ACCCTAGAAG
CCAGCCANCCTTTTへAATCTAATTT
TTGCA 36573658 AACGAGAA
GTCACCACACCTCTCCACTA^八ACC
CTGAACCTTへCTGAGAGAAGCAGAG
NCANNAAAGAA 37263727 CA
AATAAAACCCGAAGATGAGACCACC
ACGTGCGGCGGGACGTTCAGGGGAC
GGGGAGGAAGAGAATGR3795vail 書 GGCGGTGGACGTTTTGGTGGCGGCG
GTGGA3864EcoRV 、Av
a I13865 CCTTTGGTGGTGGAT
ATCGTGACGAAGGACCTCCCAGTGD
del 聡 AAGTCATTGGTTCGTTTACTCTTTT
CTTAG 3933HinfI Ddel TCCTTTGTTTTGAGTTGAATCACTG
TCTTA 40711infl 4072 GCACTTTTGTTAGATTCAT
CTTTGTGTTTAAGTTAAAAGGTAGA
AACTTTGTGACTTGTCTCCGTTATG
41401nc11 4141 ACAAGGTTAACTTTGTTGG
TTATAACAGAAGTTGCGACCTTTCT
CCATGCTTGTGAGGGTGATGCTGTG
4009CCCAATCTACTTGGAAAAC
AAGACACAGAT 427BcoRI ■ GAATTC4325 ラムダCGNI−2ナピン遺伝子は、ヌクレオチド配列
が精確に一致することによって決定される場合、BE5
cDNAに対応するmRNAをコードする遺伝子である
。
GAGGCAGTCACTAACATGAAGTTTG
ACGAGGAGCCCHindIII HhaI Xbal 70 ACTCTAATTGAGCCGTGCGCT
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CTGMNCANCATATACAAA八553 T
GAGTTGTCAへCGGTCTTCCTACACA
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TGGTTCAGATAACGGGAGacI AluI CTCTTTAGTTGTTATGTCAAAAGGT
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AATAAACTTATACCACAAAGTCTTC
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CATAT 11731174 TAAGCATA
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GTTGATTTTTTTTTCAGGACtlinf
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AAGACACAGAT 427BcoRI ■ GAATTC4325 ラムダCGNI−2ナピン遺伝子は、ヌクレオチド配列
が精確に一致することによって決定される場合、BE5
cDNAに対応するmRNAをコードする遺伝子である
。
発現カセットは、pCGN944の構成と同様な方法で
以下のようにして、ラムダCGNI−2ナピン遺伝子の
5′末端および3′末端から構成された。
以下のようにして、ラムダCGNI−2ナピン遺伝子の
5′末端および3′末端から構成された。
pcGN940のナピンコード領域の大半は、旦■によ
る消化によって削除し、そして再連結してpCGN18
00を形成した。pcGN1800からの単一鎖DNA
を用いて、合成オリゴヌクレオチド5 ’ −GCTT
GTTCGCCATGGATACTTGTGTATG
TTC−3’を用いる土ノ1?上口の変異誘導反応(ニ
ーデルマン(Adelman)ら、DNA 1983年
、2巻、183〜193頁・)を行った。
る消化によって削除し、そして再連結してpCGN18
00を形成した。pcGN1800からの単一鎖DNA
を用いて、合成オリゴヌクレオチド5 ’ −GCTT
GTTCGCCATGGATACTTGTGTATG
TTC−3’を用いる土ノ1?上口の変異誘導反応(ニ
ーデルマン(Adelman)ら、DNA 1983年
、2巻、183〜193頁・)を行った。
このオリゴヌクレオチドは、プロモーター領域とナピン
遺伝子のATG開始コドンとの接合点で、EcoRIお
よびNco I制限部位を挿入した。適切な変異体が、
変異誘導と配列分析を用いて、pCGN1801と呼ば
れるオリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーショ
ンによって同定された。
遺伝子のATG開始コドンとの接合点で、EcoRIお
よびNco I制限部位を挿入した。適切な変異体が、
変異誘導と配列分析を用いて、pCGN1801と呼ば
れるオリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーショ
ンによって同定された。
1.7kbプロモーターフラグメントを、EcoRIに
よる部分消化及びEcoRIにより切断されたpCGN
786 (正常なポリリンカーの代わりに上記の合成リ
ンカ−を有するpCGN566クロラムフエニコールを
ベースとしたベクター)への連結によってpcGN18
01からサブクローンし、そしてDNAポリポリーゼエ
クレノウフラグメントによりフィルインし、pcG81
802を製造した。ラムダCGNI−2ナピン遺伝子か
らの3′配列を、Xho I / Hin d III
テ消化サレすpCGN1802ニ付加し、Xho Iと
−H1ndIIIで消化されたpcGN941に連結す
ることによってカセットを完成した。その得られた発現
力セラ) pcGN1803は、1.725kbのナピ
ンプロモーター配列と1.265kbのナピン3′配列
を含み、それらの間に非反復クローニング部位Sal
I 、」しII、PstlおよびXho Iを有してい
た。
よる部分消化及びEcoRIにより切断されたpCGN
786 (正常なポリリンカーの代わりに上記の合成リ
ンカ−を有するpCGN566クロラムフエニコールを
ベースとしたベクター)への連結によってpcGN18
01からサブクローンし、そしてDNAポリポリーゼエ
クレノウフラグメントによりフィルインし、pcG81
802を製造した。ラムダCGNI−2ナピン遺伝子か
らの3′配列を、Xho I / Hin d III
テ消化サレすpCGN1802ニ付加し、Xho Iと
−H1ndIIIで消化されたpcGN941に連結す
ることによってカセットを完成した。その得られた発現
力セラ) pcGN1803は、1.725kbのナピ
ンプロモーター配列と1.265kbのナピン3′配列
を含み、それらの間に非反復クローニング部位Sal
I 、」しII、PstlおよびXho Iを有してい
た。
pcGNIBcsからACP前駆体コード領域を、l■
とEcoRIとを用いて二重消化することによって切断
し、5alIとEcoRIによりあらかじめ消化された
クローニングベクターpUc18に連結する。
とEcoRIとを用いて二重消化することによって切断
し、5alIとEcoRIによりあらかじめ消化された
クローニングベクターpUc18に連結する。
連結されたDNAの適当な一旦エーユ4 (E、col
i)宿主中への形質転換、及びpUCベクターのペニシ
リン耐性青色−白色スクリーニング系(ビイラ(Vie
ira)およびメッシング(Messing) 、Ge
nes1982年、19巻、259〜268頁)を用い
るスクリーニングによって、ACP−前駆体コード領域
のための停止コドンの下流に配置されたユニーク」■3
部位を含むプラスミドが生成される。」胆3で消化した
後、」旦■リンカ−による連結は、プラスミドを生成し
、こしコード領域は、III〜Pstlフラグメントと
して切断され、これはpCGN1803のPstlおよ
びI11部位へクローニングされ、そしてACP−前駆
体コード領域がpcGN1803によってコードされる
胚特異的発現情報のナピンプロモーターおよびターミネ
ータ一部分に対して精確に配列される。次に、その得ら
れたキメラ遺伝子を、二πベクター中に導入して、アグ
ロバクテリウムに転位させて、pCGN946のホウレ
ン草ACPキメラ遺伝子を用いたのと同じ条件を用いて
ブラシカ・ナプス(Brassica napus)の
胚軸セグメントと共培養を行う。
i)宿主中への形質転換、及びpUCベクターのペニシ
リン耐性青色−白色スクリーニング系(ビイラ(Vie
ira)およびメッシング(Messing) 、Ge
nes1982年、19巻、259〜268頁)を用い
るスクリーニングによって、ACP−前駆体コード領域
のための停止コドンの下流に配置されたユニーク」■3
部位を含むプラスミドが生成される。」胆3で消化した
後、」旦■リンカ−による連結は、プラスミドを生成し
、こしコード領域は、III〜Pstlフラグメントと
して切断され、これはpCGN1803のPstlおよ
びI11部位へクローニングされ、そしてACP−前駆
体コード領域がpcGN1803によってコードされる
胚特異的発現情報のナピンプロモーターおよびターミネ
ータ一部分に対して精確に配列される。次に、その得ら
れたキメラ遺伝子を、二πベクター中に導入して、アグ
ロバクテリウムに転位させて、pCGN946のホウレ
ン草ACPキメラ遺伝子を用いたのと同じ条件を用いて
ブラシカ・ナプス(Brassica napus)の
胚軸セグメントと共培養を行う。
本発明によれば、機能的アシル担体タンパク質、詳細に
は植物アシル担体タンパク質をコードする配列が提供さ
れ、そしてこれはアシル担体タンパク質の存在を検出し
、植物および細閉からゲノムまたはcDNAのいずれの
ライブラリーをもスクリーニングするプローブとして用
いることができ、アシル担体タンパク質遺伝子の存在を
検出する方法に使用するプローブとして用いることがで
きる。
は植物アシル担体タンパク質をコードする配列が提供さ
れ、そしてこれはアシル担体タンパク質の存在を検出し
、植物および細閉からゲノムまたはcDNAのいずれの
ライブラリーをもスクリーニングするプローブとして用
いることができ、アシル担体タンパク質遺伝子の存在を
検出する方法に使用するプローブとして用いることがで
きる。
更に、コード配列は、発現構造の調製に用いることもで
き、このコード配列を調節領域が機能する適当な宿主に
おいて発現するための転写および翻訳開始および終結調
節領域と組み合わせることもできる。特に興味深いこと
は、ACPコード配列を転写開始領域と共に使用して、
植物において機能させ、詳細には、種子に発現するよう
に調節することである。この方法では、種子油の産生を
増進させ、好適には、脂肪酸の組成を調製することがで
きる。
き、このコード配列を調節領域が機能する適当な宿主に
おいて発現するための転写および翻訳開始および終結調
節領域と組み合わせることもできる。特に興味深いこと
は、ACPコード配列を転写開始領域と共に使用して、
植物において機能させ、詳細には、種子に発現するよう
に調節することである。この方法では、種子油の産生を
増進させ、好適には、脂肪酸の組成を調製することがで
きる。
本明細書において述べた総ての出版物および特許出願明
細書は、本発明が関係する当業者の技術水準を示すため
のものである。総ての刊行物および特許出願明細書は、
それぞれの刊行物および特許出願明細書が具体的且つ個
別的に参考のために説明しているのと同じ程度に参考の
ために引用している。
細書は、本発明が関係する当業者の技術水準を示すため
のものである。総ての刊行物および特許出願明細書は、
それぞれの刊行物および特許出願明細書が具体的且つ個
別的に参考のために説明しているのと同じ程度に参考の
ために引用している。
上記説明を、理解を明確にするために例示および実施例
によって幾分詳細に記載したが、特許請求の範囲内で変
更および修正を行うことができることは明らかであろう
。
によって幾分詳細に記載したが、特許請求の範囲内で変
更および修正を行うことができることは明らかであろう
。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、植物のアシル担体タンパク質をコードするcDNA
配列。 2、上記植物がホウレン草である、特許請求の範囲第1
項記載のcDNA配列。 3、上記植物がブラシカ(Brassica)である、
特許請求の範囲第1項記載のcDNA配列。 4、上記ブラシカ(Brassica)がカペストリス
(capestris)である、特許請求の範囲第3項
記載のcDNA。 5、上記ブラシカ(Brassica)がナプス(na
pus)である、特許請求の範囲第3項記載のcDNA
。 6、細胞宿主中で機能的な転写および翻訳開始および終
結調節領域およびその下に結合された植物のアシル担体
タンパク質をコードする読み取り枠からなるDNA構造
体であり、上記調節領域の少なくとも一つが上記読み取
り枠の野生型領域以外のものであることを特徴とする、
DNA構造体。 7、上記読取り枠がホウレン草またはブラシカ(Bra
ssica)のアシル担体タンパク質をコードする、特
許請求の範囲第6項記載のDNA構造体。 8、上記調節領域が植物宿主中で機能する、特許請求の
範囲第6項記載のDNA構造体。 9、上記転写開始領域を細胞の分化中に調節する、特許
請求の範囲第8項記載のDNA構造体。 10、上記調節が、発生する胚において、転写を提供す
る、特許請求の範囲第9項記載のDNA構造体。 11、上記転写開始調節領域がナピン調節領域である、
特許請求の範囲第10項記載のDNA構造体。 12、特許請求の範囲第6項〜第11項のいずれか1項
記載のDNA構造体からなるTi−またはRi−プラス
ミド。 13、特許請求の範囲第6項〜第11項のいずれか1項
記載のDNA構造体からなる植物細胞。 14、上記植物細胞が胚細胞および種子の一部である、
特許請求の範囲第13項記載の植物細胞。 15、上記植物がブラシカ(Brassica)植物で
ある、特許請求の範囲第14項記載の植物細胞。 16、植物種子油の生成を増進させる方法であって、 植物を苗から種子へ成長させ、(ここで、上記植物の細
胞が特許請求の範囲第8項記載の構造体からなりそして
増加した量の植物油を含むその得られた種子を収穫する
ことを特徴とする方法。 17、上記植物がブラシカ(Brassica)植物で
ある、特許請求の範囲第16項記載の方法。 18、上記転写開始調節領域がナピン領域である、特許
請求の範囲第16項または第17項のいずれか1項記載
の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US89152986A | 1986-07-31 | 1986-07-31 | |
US891529 | 1986-07-31 | ||
US078924 | 1987-07-28 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS63119680A true JPS63119680A (ja) | 1988-05-24 |
Family
ID=25398352
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP62190531A Pending JPS63119680A (ja) | 1986-07-31 | 1987-07-31 | アシル担体タンパク質−dna配列及び合成 |
JP62192538A Pending JPS63112987A (ja) | 1986-07-31 | 1987-07-31 | 種子特異的転写調節造成物 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP62192538A Pending JPS63112987A (ja) | 1986-07-31 | 1987-07-31 | 種子特異的転写調節造成物 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
JP (2) | JPS63119680A (ja) |
FI (2) | FI873253A (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011138891A1 (ja) * | 2010-05-06 | 2011-11-10 | 花王株式会社 | チオエステラーゼ及びそれを用いた脂肪酸又は脂質の製造方法 |
JP2016034258A (ja) * | 2014-08-04 | 2016-03-17 | 花王株式会社 | ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼを用いた脂質の製造方法 |
-
1987
- 1987-07-24 FI FI873253A patent/FI873253A/fi not_active Application Discontinuation
- 1987-07-24 FI FI873252A patent/FI873252A/fi not_active Application Discontinuation
- 1987-07-31 JP JP62190531A patent/JPS63119680A/ja active Pending
- 1987-07-31 JP JP62192538A patent/JPS63112987A/ja active Pending
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011138891A1 (ja) * | 2010-05-06 | 2011-11-10 | 花王株式会社 | チオエステラーゼ及びそれを用いた脂肪酸又は脂質の製造方法 |
JP2011250781A (ja) * | 2010-05-06 | 2011-12-15 | Kao Corp | チオエステラーゼ及びそれを用いた脂肪酸又は脂質の製造方法 |
US8940514B2 (en) | 2010-05-06 | 2015-01-27 | Kao Corporation | Thioesterase and a method of producing fatty acids or lipids using the thioesterase |
JP2016034258A (ja) * | 2014-08-04 | 2016-03-17 | 花王株式会社 | ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼを用いた脂質の製造方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
FI873252A (fi) | 1988-02-01 |
FI873253A (fi) | 1988-02-01 |
FI873252A0 (fi) | 1987-07-24 |
FI873253A0 (fi) | 1987-07-24 |
JPS63112987A (ja) | 1988-05-18 |
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