JPS63119680A - アシル担体タンパク質−ｄｎａ配列及び合成 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 アシル担体タンパク質は、このタンパク質を不ノ　ビト
ロで使用するために単離することができるかまたはこの
タンパク質を細胞内で葉緑体または関連したオルガネラ
に転位してエノ　竺爽での脂肪酸の産生を改質する条件
下で発現される。種子に特異的なプロモーターを用いて
種子組織中にアシル担体タンパク質を発現させることが
できる構造体を提供する。

〔従来の技術〕

植物は、食料に原料および最終製品として用いられる各
種生成物の豊富な源を提供する。植物脂肪酸は多種多様
な商業的目的に広範囲に用いられており、料理用植物油
として、潤滑剤として、アルキド樹脂に、特種化学物質
などとして用いられる。それらのほとんどについて、植
物脂肪酸は１８個の炭素原子を有するものでありがちで
あり、１６個より少ない炭素原子を有する脂肪酸は通常
は極めて少ない。多くの目的のために、８〜１４個の炭
素原子を有する脂肪酸を有することが望ましい。従って
、１４個以下の炭素原子を有する総脂肪酸が実質的比率
である植物油の製造法の開発に実質的な興味が向けられ
ている。

この目的を達成するためには、脂肪酸を形成し高級脂肪
酸へ延長する代謝経路の構成メンバーを変更する必要が
あろう。この目的を達成するには、植物の代謝経路を変
更する脂肪酸の代謝鎖に沿った１個以上の成分を製造す
ることができるようにする必要があろう。更に、脂肪酸
の代謝経路の個々の成分については、重要な商業的適用
が存在するであろう。

′−の　　のｆｉＬＦなｒ日 クオ（Ｋｕｏ）とオールロジ（Ｏｈ　ｌｒｏｇｇｅ）は
、へｒｃｈｉｖｅｓ虹」士樹狙し肋土よ四±■、（１９
８４年）、２３４巻、２９０〜２９６頁にホウレン草の
アシル担体タンパク質の一次構造を記載している。クオ
（Ｘｕｏ）とオールロジ（Ｏｈｌｒｏｇｇｅ）は、Ｊ、
Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　（１９８５年）、２６０巻、８
０３２〜８０３７頁に、異なる組織において様々に発現
される様々な同形のアシル担体タンパク質が存在するこ
とを報告している。クローチ（Ｃｒｏｕｃｈ）らは、Ｊ
　、　Ｍ　ｏ　Ｉ　、−剪狙１匹旦ル１．　（１９８３
年）、２巻、２７３〜２８３頁に、ナピンタンパク質を
コードするｃＤＮＡの合成を報告している。

以下余白 溌」Ｉ刈ｌ斐 植物のアシル担体タンパク質の発現を提供するＤＮＡ構
造体を提供する。種子の成熟中に植物の胚に発現する転
写開始領域を用いる特定の構造体を製造する。脂肪酸の
組成と量は、脂肪酸の産生における代謝経路に含まれる
葉緑体または関連のオルガネタ中の成分を変更すること
によって調節され得る。

背淀ｍ砿ｌ肌 −ｍｙ　　ビトロで使用する最終生成物としてのまたは
４ｙ　　ｅ±での脂肪酸の変性された発現を提供するた
めに植物の種子形成と一緒にアシル担体タンパク質を製
造する方法および組成物を提供する。この目的を達成す
るため、ＤＮＡ構造体を調製して、ここで配列をコード
する植物のアシル担体タンパク質は、アシル担体タンパ
ク質の発現のために、所定の宿主中で機能する転写開始
および終結調節領域に連結される。

発現構造体は、転写の５’−３’方向において、構成ま
たは調節されたものである転写開始調節領域、アシル担
体タンパク質の少なくとも一機能部分をコードする読み
取り枠（好ましくは−（７ｅ、ボーで使用する葉緑体へ
の転位を提供するトランジットペプチド配列を含む）、
及び適当な宿主中で機能する転写終結調節領域を提供す
る。

宿主によっては、調節領域は変化する。原核または真核
微生物、具体的には単細胞性の宿主での発現のために、
多種多様な構成的なまたは調節可能なプロモーターを用
いることができる。これらの場合には、アシル担体タン
パク質の調製のおもな目的は、アシル担体タンパク質の
一１’７　　ｅｐ。

での適用に用いることである。

大部分、これらの構造体は、植物中で機能する調製領域
を含み、この領域は、脂肪酸組成物の増強及び変性のた
めにアシル担体タンパク質の弾弦された産生を提供する
。

使用されるコード配列は、天然源に由来され、合成され
、あるいはこれらを組み合わせであってもよい。天然源
から遺伝子を得るには、各種植物または細菌の如何なる
ものを遺伝子の源として用いてもよい。植物には、ホン
レン草、ブラシカ（Ｂｒａｓｓ　１ｃａ）、例えばカン
ペストリス（ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）またはナプス（ｎ
ａｐｕｓ）　、ココヤシ、綿、ベニ花、ヒマワリ、クツ
エア（Ｃｕｐｈｅａ）などがある。遺伝子を得ることが
できる各種方法の中では、ゲノムまたはｃＤＮＡのいず
れかのライフ゛ラリ−を調製してもよい。アシル担体タ
ンパク質のアミノ酸配列に基づいてプローブを調製して
もよい。異なる源からのアシル担体タンパク質の間には
実質的な免疫学的な交差反応性があることが認められて
いるので、原核性および真核性ポリクローン抗体を特定
の源からアシル担体タンパク質を単離するために用いて
もよくそして他の植物源からアシル担体タンパク質を単
離するためにも用いることができる。アシル担体タンパ
ク質を、次に全体または部分的に配列し、そしてプロー
ブをペプチド配列に基づいて設計することができる。部
分的なりＮＡ配列のみが得られる場合には、この部分配
列で十分であるか、または遺伝子を動かして完全なコー
ド配列が得られるようにすることができる。

所望な配列を得たならば、それを各種の方法で操作する
ことができる。配列が非コードフランキング領域を含む
場合には、このフランキング領域を、例えばＢａｌ　３
１のようなヌクレアーゼを用いて切除したり、制限エン
ドヌクレアーゼで制限したり、または且　ビトロでの変
異誘発、プライマー修復あるいは配列中に変異または損
傷を導入する他の方法を用いることによって改質するこ
とができる。従って、トランジション、トランスバージ
ョン、欠、失および挿入を天然に存在する配列に行うこ
とができる。更に、この配列の総てまたは一部分を合成
して、ここで１個以上のコドンを改質して、アミノ酸配
列を変更したり、または１個以上のコドンの突然変異を
導入して、好都合な制限部位を又は、構成または発現に
関与される他の目的を提供することができる。遺伝子を
、合成アダプター、１個以上の好都合な制限部位を導入
するためのリンカ−などを用いることによって更に改質
することもできる。

アシル担体タンパク質は、特定の宿主中にみいだされる
アイソザイムのいずれであってもよく、例えばホウレン
草中に見出されるようなオールロジ（Ｏｈｌｒｏｇｇｅ
）とクオ（Ｋｕｏ）　（上記文献）おいて命名されたＡ
ＣＰ−１およびＡＣＰ−ＩＩまたは他の植物宿主中に見
出される類似物であってもよい。

特に興味深いものはホウレン草のアシル担体タンパク質
、更に詳細にはＡＣＰ−１であり、次のような配列を有
する。

ホウレン草のＡＣＰ−１ ＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＴＡＣＴＡ
ＣＣ６０らＩｎ　　Ｇｌｙ　　Ａｓｎ　　Ｇｌｙ　　Ａ
ｒｇ　　Ｃｙｓ　　ＳｅｒＧｌｕ　　Ｉｌｅ　　Ｖａｌ
　　Ｍｅｔ　　Ａｓｎ　　Ｌｅｕ　　Ｌｉ１ｕＡＴＣＡ
ＧＴＣＡＡＴＣＡＣＣＴＡＧＣＴＡＧＧＧＡＡＴ　　５
２１ａ　）　　：　ｃＤＮＡ配列。

ｂ）：ＤＮＡ配列によって予測されたアミノ酸配列。

Ｃ）：タンパク質配列決定（クオ（Ｋｕｏ）とオールロ
ジ（Ｏｈｌｒｏｇｇｅ）、１９８４年、上記文献）によ
って決定されるアミノ酸配列。

＊：ｂ）とＣ）との間の差。

目的とする配列は一般的には少なくとも３００ｂｐ（塩
基対）、通常は少なくとも約３６０ｂｐ、好ましくは４
１１ｂｐを有し、全コード配列は４１１ｂｐを有する。

更に、５′および３′非コードフランキング領域が存在
し、これはコード領域の５′または３′末端からｌｂｐ
〜２００ｂｐ以上伸びることができ、通常は天然に存在
する非コードフランキング領域の開始コドンの５′は、
約ｔｏｏｂｐ未満、好ましくは約１０ｂｐ未満である。

アシル担体タンパク質またはその機能性フラグメントを
コードする読み取り枠は、転写開始調節領域にその５′
末端で連結する。多数の転写開始調節領域が利用でき、
これは構造遺伝子の多種多様な構造的または調節可能な
、例えば誘導性転写を行う。宿主によっては、転写開始
調節領域は、ウィルス、プラスミドまたは染色体遺伝子
などからの構造遺伝子からの領域を含むことができる。

上記の転写開始領域の中には、細菌および酵母宿主、例
えばイー・コーリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）、バシルス・ズブチ
リス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）　、サツ
カロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からの領域が存在し、β−
ガラクトシダーゼ、λ−左および右プロモーター、解糖
酵素プロモーターなどのような遺伝子を含む領域がある
。植物に用いられる転写開始領域の中には、ノナピン、
オクトピン、マンノピン、リボース−１，３−ビスホス
フェートカルボキシラーゼ、大小サブユニット、カリフ
ラワー・モザイク・ウィルスからの全長プロモーター、
ナピン、ファゼオビンなどの構造遺伝子と関連する領域
がある。

特に興味あるものは、種子の成熟中に調節されるプロモ
ーター、詳細には胚の子葉で合成されるプロモーターで
ある。これらの調節領域には、ナピン、ファゼオリンお
よびグリシニンのような遺伝子の調節領域がある。特に
興味深いナピン調節領域はブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ
）種、更に詳細にはカンベストリス（ｃａｍｐｅｓ　ｔ
ｒ　ｉｓ）およびナプス（ｎａｐｕｓ）からの領域であ
る。この調節領域は一般的には少なくとも約１５０ｂｐ
且つ約３５００ｂｐ以下、通常は約２５００ｂｐ以下で
あり、好ましくは約１０００以下である。ナピン遺伝子
はクローチ（Ｃｒｏｕｃｈ）ら（上記文献）によって報
告されているが、調節領域あるいは非対応遺伝子に対す
る調節領域の使用については開示されていない。

転写開始調節領域とコード領域は、直接連結され、ここ
で、これら２つの領域のための好都合な制限部位があっ
てもよくまたはそのような制限部位を合成アダプターま
たはリンカ−によって（好適に）導入される。多くの調
節領域は、プラスミドとして利用され、ここで開始およ
び終結調節領域はポリリンカーによって分離されるので
、多くの制限部位は、構造遺伝子の挿入のために利用で
きる。これらの発現構造体は、微生物宿主のために最も
利用できる。

植物で機能する多くの転写開始および終結領域は、Ｔｉ
−およびＲｉ−プラスミド上の遺伝子から単離されてい
るが、これらの領域は、ポリリンカー、マーカー、複製
系などの容易に利用できる構造体の水準に達していない
。更に、本発明については、主な興味は発現を調節して
、転写を種子中で開始することにある。この目的のため
に、ナピン遺伝子のような遺伝子が実質的に興味がある
。

ナピン調節領域は、３′−または５′−末端に隣接する
配列、またはナピン宿主、クローチ（Ｃｒｏｕｃｈ）ら
、１９８３年、（上記文献）の場合にはナタネの種子の
宿主のゲノムライブラリーをスクリーニングするために
構造遺伝子の中間コード配列からなるプローブを用いる
ことによって得ることができる。苛酷な条件下でプロー
ブとハイブリッド形成するフラグメントを同定すること
によって、ナピン構造遺伝子を有するフラグメントを同
定することができる。ナピン構造遺伝子の潜在的調節配
列５′は、制限マツピングおよびＤＮＡ配列分析によっ
て同定することができる。これらの配列は各種条件下で
操作され、ナピンをコードするコドンを全部または部分
的に除去し、コードされていない５′領域をナピンコー
ド領域がないまたは実質的にないようにする。場合によ
っては、開始コドンに隣接する短い非コード領域、通常
は約２０ｂｐ未満、更に一般的には約１０ｂｐ未満を除
去するのが望ましい。更に詳細については、実験の部を
参照されたい。

アシル担体タンパク質構造遺伝子のための読み枠と転写
開始調節領域とを連結した後、構成方法の結果として包
含される機能的転写終結調節領域が存在してもよく、ま
たは導入されてもよい。終結領域は、開始領域と同じ構
造遺伝子、すなわちアシル担体タンパク質遺伝子に由来
してもよく、または好都合には異なる構造遺伝子からの
ものであってもよい。終結領域は、通常、ターミネータ
−およびポリアデニル化をコードする配列を含む。

この遺伝子は天然に産するものでもよ（、または分子内
転位用のシグナル配列を、詳細には種子のロイコプラス
トまたは他の植物細胞のクロロプラストに導入すること
によって改質してもよい。

発現構造体の開発において、発現構造体またはそのフラ
グメントの各種成分は、通常細菌宿主例えば−イー、ユ
ニュ（Ｅ、　５匪Ｕ）において複製することができる好
都合なりローニングベクター中に挿入される。多数のベ
クターが存在して、文献に記載されている。それぞれの
クローニングの後、プラスミドを単離して、制限、新た
なフラグメントの挿入、連結、リセクション、挿入、試
験管内変異誘導、またはプライマー修復のような操作を
行い、これらの成分を所望な配列に適合させることがで
きる。構造体が完成してしまったら、これを次に適当な
ベクターに転位させて、植物細胞の形質転換法にしたが
って更に操作することができる。

通常は、発現構造体と共に宿主において発現するために
必要な調節領域を有し且つ形質転換細胞を選択する構造
遺伝子が含まれる。この遺伝子は、細胞毒性物質、例え
ば抗生物質、重金属、毒素などに対する耐性、栄養要求
株宿主に対して原栄養株を供する相補性、ウィルス免疫
性などを提供する。異なる宿主種の数によって、発現構
造体またはその成分を導入し、１個以上のマーカーを用
いて、異なる選択条件を異なる宿主に用いることができ
る。

構造体を植物宿主に導入する方法は、本発明にとっては
限界的ではない。効率的な形質転換を供する如何なる方
法を用いてもよい。各種方法は、Ｔｉ−またはＲｉ−プ
ラスミド、微量注射法、エレクトロポレーション、リポ
ソーム融合などを用いることから成る。多くの場合には
、Ｔ−ＤＮＡによって一方の側または両側に跨る構造体
、詳細には、左および右のボーダー、更に詳細には右ボ
ーダーを有する構造体が望ましい。これは、構造体が形
質転換の様式としてＡ・チュメファシエンス（Ａ、　ｔ
ｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）またはＡ・リゾジーンズ（Ａ。

ｒｈ　ｉｚｏｇｅｎｅｓ）を用いる場合、特に有用であ
るが、Ｔ−ＤＮＡボーダーは、その他の様式の形質転換
の場合にも使用することができる。

アゲロバクチリア（八ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を植
物細胞の形質転換に用いるときには、アゲロバクチリア
宿主に存在するＴｉ−またはＲｉ−プラスミドのＴ−Ｄ
ＮＡによる相同組換えのためにアゲロバクチリア宿主中
に導入されるベクターを用いることができる。組換え用
Ｔ−ＤＮＡを含むＴｉ−またはＲ１−プラスミドは、武
装され（胆汁形成を引き起こすことができる）るかまた
は武装解除して（胆汁形成を引き起こすことができない
）ことができ、Ｖｉｒ遺伝子が形質転換された宿主に存
在するかぎり、後者が許容される。武装されたプラスミ
ドは、通常の植物細胞と胆汁との混合物を生じることが
できる。

アゲロバクチリアを植物細胞の形質転換用ビヒクルとし
て用いる幾つかの場合には、Ｔ−ＤＮＡボーダーによっ
て境界される発現構造体を、広い宿主スペクトルベクタ
ー中に挿入するのであり、広い宿主スペクトルベクター
は文献に記載されている。通常は、ｐＲＫ２またはその
ＦＡ’Ａ体が用いられる。例えば、ディツタ（Ｄｉｔｔ
ａ）　　らのＰＮＡＳ　ＳＡＤ、　７７巻、７３４７〜
７３５１頁および欧州特許出願第０．１２０．５１５号
明細書を参照されたい。発現構造体およびＴ−ＤＮＡと
共に１種以上のマーカーが含まれ、これによって形質転
換されたアゲロバクチリアおよび形質転換された植物細
胞を選択することができる。

植物細胞と共に使用する多数のマーカーが開発されてお
り、例えばクロラムフェニコール、アミノグリコシド０
４１８　、ハイグロマイシンなどに対する耐性が上げら
れる。用いられる特定のマーカーは本発明に本質的では
ないが、特定の宿主および構成法に依存して、特定のマ
ーカーが好ましい。

発現構造体は、各種の植物生活、詳細には植物油の産生
に包含される植物生活で用いられる。これらの植物には
、ブラシカ（Ｂｒａｓｓ　１ｃａ）、例えばナプス（ｎ
ａｐｕｓ）およびカンペストリス（ｃａｍｐｅｓ　ｔｒ
ｉｓ）、ヒマワリ、ベニ花、綿、クツエア（Ｃｕｐｈｅ
ａ）、大豆およびトウモロコシがある。

アゲロバタテリアを用いて植物細胞を形質転換するため
には、外植片を混合し、そして、形質転換のために十分
な時間形質転換されたアゲロバクチリアと共にインキエ
ベーション行い、バクテリアを殺し、そして植物細胞を
適当な選択培養液中で培養することができる。カルスが
形成されたら、既知の方法によって適当な植物ホルモン
を用いて茎葉形成を促進して、そして茎葉を発根培地に
移して植物を再生させる。これらの植物を次に種子にま
で成長させ、この種子を用いて反復再生を行い、植物油
を単離することができる。

ＤＮＡ配列は、遺伝子を誘導した宿主以外の宿主におい
て、アシル担体タンパク質を検索するプローブとしても
用いることができる。更に、本発明によって産生される
アシル担体タンパク質は、アシル担体タンパク質を検出
するためのアッセイに用いる抗体を調整するのに用いる
ことができる。

アシル担体タンパク質は、葉緑体分解物と共に用いて、
不ノ　ビトロで、調整される脂肪酸の産生を増進させお
よび／または脂肪酸の組成を改質することもできる。ア
シル担体タンパク質は、植物および細菌における脂肪酸
形成の機構を検討するのに用いることもできる。

以下の実施例は説明のために堤供し、制限のた“（７）
　ｂ　（７）　Ｔ：　１．：ｔ　ｆ、ｇ　Ｉ、ｚ・　　
　　　　　　　以下令白〔実施例〕 用いられるクローニングベクターは、ｐＵＣベクター、
ｐＵｃ８およびｐｔｌｃ９　Ｃビイラ（Ｖｉｅｉｒａ）
およびスプリング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）　、１９８２年〕
、堕匣、ｕ吏ユ２５９〜２６８頁；ｐＵＣ１８及びｐｕ
ｃ　１９　（ノランダー（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ）　　ら
、１９８３年〕江些、並立、　１０１〜１０６頁、ヤニ
ッシューペロン（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ）　ら
（１９８５年）１匣、剥土、１０３〜１１９頁、上記プ
ラスミドｐＵＣのアンピシリン耐性のためにマーカーと
してのクロラムフェニコール耐性（ＣＡＭ）を交換する
類似ベクター（ｐＵｃ−ＣＡＭ　　（ｐＵｃ　１２−Ｃ
ｍＸｐＵｃ　１３−１ｍ）バンクレイ・ケイ（Ｂｕｃｋ
ｌｅｙ、に、）、博士論文、ＵＣ５Ｄ、　ＣＡ、　１９
８５年）を含む。ｐｔｌｃ　８１およびｐｕｃ　１９ベ
クターの多数のクローニング部位をｐＵｃ　−ＣＡＭと
交換し、ＣＡＭ耐性を有するｐＣＧＮ５６５およびｐＣ
ＧＮ５６６を得た。Ｍ１３の５４６５でのＵＢｉＡ■部
位から５９４１でのＡｈａＩＩＩまでの遺伝子開領域を
ｐＵＣのＮｄｅ　１部位に挿入したｐＵＣ１８およびｐ
ＵＣ１９であるｐＵｃ１１８およびρＵＣ１１９も用い
た。（ビイラ・ジエイ・アンド・スプリング、ジエイ・
ワックスマン・インスティテユート・ラドガース・ユニ
バーシティ（Ｖｉｅｉｒａ　Ｊ、ａｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎ
ｇ＋　Ｊ、　Ｗａｋｓｍａｎｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｒｕ
ｔｇｅｒｓ　ｔｌｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）ラドガース、ニ
ュー・シャーシーより入手）。

林料 末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴＤＴ
）　、ＲＮアーゼＨ，、Ｅ、コリ　（Ｅ、ｃｏｌｉ）、
ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４キナーゼおよび制限酵素が、
ベテスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄ
ａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）か
ら人手し；Ｅ９コリ　（Ｅ、ｃｏｌｉ）のＤＮＡリガー
ゼは、ニュー・イングランド・バイオラプス（Ｎｅｗ　
ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）から入手し；逆転写酵
素はライフ・サイエンス、インコーボレーテド（Ｌｉｆ
ｅ　５ｃｉｅｎｃｅ＋Ｉｎｃ、）から入手し；同位元素
はアメルシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）から入手し；Ｘ−
ｇａｌはビーチャム社、トーランス・カリホルニャから
入手した。

ホウレン　の　か゛のｃＤＮＡライブ′″１−のファシ
オツチ（Ｆａｃｃ　ｔｏ　ｔ　ｔ　ｉ）　　ら」お佳肛
Ｉが互■（１９８５年）、３巻、２４１〜２４６頁、の
方法によって、４Ｍグアニジン・チオシアネート緩衝液
中で若いホウレン草の葉から全ＲＮＡを抽出した。全Ｒ
ＮＡを、２回オリゴ（ｄ　Ｔ）−セルロースカラムクロ
マトグラフィにかけて、マニアチス（Ｍａｎ　ｉａ　ｔ
　ｉｓ）ら、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｃ１ｏｎｉＢ　
　：　　八　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｍａｎｕａｌ　
　、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、
ニューヨーク　（１９８２年）記載の方法にしたがって
ポリ　（Ａ）　　”ＲＮＡを生成させた。ｃＤＮＡライ
ブラリーは、グブラー（Ｇｕｂｌｅｒ）とホフマン（ｔ
ｌｏｆｆｍａｎ）、（Ｇｅｎｅ（１９８３年）２５巻、
２６３〜２６９頁）の方法を若干修正した方法でｐＵｃ
　１３−Ｃｍに構成した。ＲＮアシンは、第一のｃＤＮ
Ａの合成では、完全に除去されない場合、第二の二重鎖
ｃＤＮＡ合成を妨げるので省き、そしてｄＣＴＰを用い
て、ベクターＤＮＡを連結させ、上記文献に記載の逆の
代わりに二重鎖ｃＤＮＡを連結させた。アニールされた
ｃＤＮＡを、ハナハン（Ｈａｎａｈａｎ）　（Ｊ、Ｍｏ
１．Ｂｉｏｌ、　（１９８３年）１６６巻、５５７〜５
８０頁）の方法によってコンピテント・Ｅ、ＤＩＪ（Ｅ
、ｃｏｌｉ）ＪＭ８３　（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｄ
ＮＡ　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｂｕ−−Ｈ且１ム入見」包
幻ユ臼１蝕ルエ醍−９１号１２　　（１９７９年）、２
号、４３〜４日頁のスプリング）細胞に形質転換し、そ
して５０ｎ／−のクロラムフェニコールと０．００５％
のＸ−Ｇａ１を含むＬＢ寒天プレート（ミラー（Ｍｉｌ
ｌｅｒ）、分子遺伝学の実験、（１９７２年）コールド
・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、コールド・ス
プリング・ハーバ−、ニューヨーク）上に塗布した。

ホウレン　のＡＣＰ−１ｃＤＮＡＯ６つそれぞれ２００
ｃＤＮＡクローンを表わす４０のプールからクローン分
析（下記を参照）ＤＮＡとサチン法（サブン（Ｓｏｕ　
ｔｈｅｒｎ）、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　（１９７５年
）９８巻、５０３頁）とドツト法（下記）によって約８
０００個のｃＤＮＡクローンをスクリーンした。ホウレ
ン草ＡＣＰ−１５’− ＧＡＴＧＴＣＴＴＧＡＧＣＣＴＴＧＴＣＣＴＣＡＴＣＣ
ＡＣＡＴＴＧＡＴＡＣＣＡ＾＾ＣＴＣＣＴＣＣＴＣ−３
’の１６個のアミノ酸領域と少なくとも６６％類似する
５′−末端を標識された合成オリゴヌクレオチド（ＡＣ
ＰＰ　４　”）は、１６個のアミノ酸ペプチドｇｌｕ−
ｇｌｕ−ｇｌｕ−ｐｈｅ−ｇｌｙ−ｉｌｅ−ａｓｎ−ｖ
ａｌ−ａｓｐ−ｇｌｕ−ａｓｐ−１ｙｓ−ａｌａ−ｇｌ
ｎ−ａｓｐ−ｉｌｅ　　（ホウレン草のＡＣＰ−Ｉの残
基４９−６４　（クオ（Ｋｕｏ）　　とオールロジ（Ｏ
ｈｌｒｏｇｇｅ）、Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏ
　ｈ　ｓ、（１９８４年）２３４巻、２９０〜２９６頁
）〕をコードすることができるＤＮＡ配列に対する補体
であり、そしてＡＣＰプローブのために使用した。

サブン法およびドツト・プロット・ハイブリッド形成用
のクローン分析ＤＮＡは、以下のようにして調製した。

形質転換体を寒天プレートから５０μｇ／−のクロラム
フェニコールを含むＬＢに移して、１０／−培地当り１
０個のクローンを有する群とした。培養物を、振りなが
ら３７℃で、で−晩インキュベーション行い、次いで等
量の培養液で希釈し、更に５時間増殖させた。２００個
のｃＤＮＡクローンのプールを、２０個の試料の内容物
を混合することによって得た。ＤＮＡを、ビルンボイム
（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）とドーリ−（Ｄｏｌｙ）、−ａα
１且匡Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　（１９７９年）７巻、１
５１３〜１５２３頁）の方法によってこれらの細胞から
抽出した。ＤＮＡをフェノールとクロロホルムとを用い
て抽出した後、エタノール沈澱を行うことによって制服
酵素で消化できる程に精製した。ＤＮＡを無菌の蒸溜水
に再懸濁し、そして４０個のプールされたＤＮＡ試料の
それぞれＩＩＪｇを、」並Ｒ１および上ｄ　ＩＩＩで消
化し、０．７％アガロースゲルで電気泳動を行った。Ｄ
ＮＡをニトロセルロースフィルターに移した後、サブン
（Ｓｏｕ　ｔｈｅｒｎ）のプロットハイブリッド形成法
を行った。

ＡＣＰＰ　４を５′−末端を、製造業者の規定にしたが
ってγ−”ＰｄＡＴＰおよびＴ４キナーゼを用いて標識
した。サブンのプロットからのニトロセルロースフィル
ターに移したクローン分析Ｄ　Ｎ　Ａ　ヲハイブリッド
形成しく２４時間、４２℃）、そしてベレント（Ｂｅｒ
ｅｎ　ｔ）ら（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　（１９８
５年）３巻、２０８〜２２０頁）の方法によって洗浄し
た。

ＤＮＡプールの同じセットのドツトプロットを、０、５
　ＭＮａ０１１中でナイロン膜フィルターに１ｐｇの各
ＤＮＡプールを塗布することによって調製した。

これらのプロットを、５０％ホルムアミド／１％ＳＤＳ
／ＬＭのＮａ（Ｊ！中で４２℃で２４時間プローブを用
いてハイブリッド形成し、そして室温で２Ｘ　　５ＳＣ
１０，１％ＳＤＳ　（ＬＸ　　５ＳＣ＝０．１５Ｍ　Ｎ
ａＣ１，０，０１５Ｍクエン酸ナトリウム、５ＤＳ−ド
デシル硫酸ナトリウム）で洗浄した。

ＡＣＰＰ　４オリゴプローブによってハイブリッド形成
されたプールからのＤＮＡを、ＪＭ８３細胞に形質転換
し、そして上記のようにプレートに塗布してそれぞれの
形質転換体を得た。これらのそれぞれのｃＤＮＡクロー
ンのドソトフ゛ロットはＤＮＡを八ＣＰＰ　４オリゴヌ
クレオチドプローブでハイブリッド形成し、ニトロセル
ロースフィルターに塗布することによって調製し、プー
ルしたＤＮＡ試料のサブンブロソトと同じ条件を用いて
分析した。

ヌクレオチド西　１の八Ｆ 陽性のクローンｐｃＧＮ１ｓＯＬを制限酵素で消化する
ことによって分析して、次のような部分マツプを得た。

以下全白 ｐＵＣ１３−Ｃｍｌ−３５−１２４８１−６３−１１５
２１−２００１ＨＩｔ　　　Ｎ　　　　　Ｐ　　　Ｘｈ
　　　　Ｅ　　　　　　ＳＸＢ５ｍ５ｓｌＥ”Ｈ−１１
ｉｎｄｌＩＩ　　Ｎ−Ｎｃｏ　Ｉ　　　Ｐ−Ｐｙｕｌｌ
　　Ｘｈ−Ｘｈｏ　ＩＥ−ＥｃｏＲＩ　　　Ｓ−５ａｌ
　Ｉ　　　　Ｘ−Ｘｂａ　Ｉ　　　Ｓｍ−Ｓｍａ　ＩＢ
−Ｂａｍｌｌ　Ｉ　　　　５ｓ−３ｓｔ　Ｉ＊：ティリ
ングで破壊された前のＰｓｔ１部位。

＊＊：指示された利用可能な制限部位を有するポリリン
カー。

ｃＤＮＡクローンを、制限、連結、形質転換および分析
の標準的実験室技法（マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）
ら、上記（１９８２年））を用いてｐＵｃ１１８および
ｐＵｃ１１９中にサブクローニングした。単一ｉＭ　Ｄ
　Ｎ　Ａ鋳型を調製し、そしてサンガーのジデオキシ法
（サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａ
ｃａｄ、Ｓｃｉ、、　（１９７７年）ＵＳＡ、７４巻、
５４６３〜５４６７頁）を用いてＤＮＡ配列を決定した
。配列分析は、インテリ・ゲネティソクス社からのソフ
トウェア・パッケージを用いて行った。

ｐｃＧＮｌｓＯＬは、ｍＲＮＡのポリ　（Ａ）テイルを
表わす３′末端でＡ残基の伸長部を含む（約）７００ｂ
ｐのｃＤＮＡ挿入体を含む。位置６１でのＡＴＧコドン
は、Ｍ　Ｅ　Ｔ　ｍＢ訳解しコドンをコードするものと
考えられる。

このコドンは、４１１ヌクレオチド読み取り枠の開始で
あり、この読み取り枠のヌクレオチド２２９〜４７１は
、アミノ酸配列が、上記のようなりオ（Ｋｕｏ）とオー
ルロジ（Ｏｈｌｒｏｇｇｅ）　（上記文献）のＡＣＰ−
１の報告されたアミノ酸配列とほぼ完全に一敗するタン
パク質をコードする。２個のアミノ酸配列の間の相違は
、上記配列に示されている。成熟タンパク質に加えて、
ｐＣＧＮＩＳＯＬは、核をコードした葉緑体タンパク質
のために予想されるように、５６残基のトランジットペ
プチド配列をもコードする。

ピンプロモーターの　ｊ ｐｇＮ　１クローン（ｐＵｃ８へクローニングされたナ
ピン遺伝子を含む一旦一、ナプス（８，７のゲノムＤＮ
Ａの３．３　ｋｂ　ＥｃｏＲＩフラグメント、マルチ・
クラウチ（Ｍａｒｔｉ　Ｃｒｏｕｃｈ）、インディアナ
大学から入手）中にはナピン遺伝子のＡＴＣ，開始コド
ンの上流には２９８個のヌクレオチドがある。ｐｇＮＩ
ＤＮＡを、ＥｃｏＲＩおよび５ｓｔｌで消化して、Ｅｃ
ｏＲＩ／５ｓｔＩで消化されたｐｃＧＮ７０６に連結し
た。

（ｐｃＧＮ７０６は、３′とＳａｌ　Ｉおよび」旦１部
位でのｐＣＧＮ５６６ヘクローニングされたもう一つの
ナピンｃＤＮＡクローンｐＮ２　（クローチ（Ｃｒｏｕ
ｃｈ）ら、上記文献）のポリアデニル化配列を含むＸｈ
ｏ　１　／　ＰｓｔＩフラグメントである）。その得ら
れたクローンｐｃＧＮ７０７を、工■で消化し、そして
酵素工３１で処理して、ナピン遺伝子のコード領域の幾
分かを除去した。その得られた切断されたＤＮＡを、」
１３１で処理た後、Ｓｍａ　！で消化し、再連結した。

大きさによって選択されたクローンｐｃＧＮ７０７の一
つをＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩの消化によって、」並
Ｒ１／勿Ｈ１の両方で消化されたｐＥ？ＩＢＬ１８（デ
ンテ（Ｄｅｎ　ｔｅ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ
　Ｒｅｓ、１９８３年、１１巻、１６４５〜１６５５頁
）およびｐ’Ｕｃ１１８中にサブクローンして、それぞ
れＥ４１８およびＥ４１１８を得た。

」旦３１の消化の程度は、Ｅ４１８鋳型のサンガージデ
オキシ配列によって確かめた。プロモーター領域の工３
１による欠失は、開始コドンの下流の５７ヌクレオチド
にだけ伸びており、従ってナピンのコード配列の５′末
端及び５′非コード領域の約３００ｂｐを含むＥ４１１
８は、オリゴヌクレオチドプライマー ５　　’　　−ＧＡＴＧＴＴＴＴＧＴＡＴＧＴＧＧＧＣ
ＣＣＣＴＡＧＧＡＧＡＴＧ−３’を用いて、シーラー（
Ｚｏｌｌｅｒ）　とスミス（Ｓｍｉｔｈ）（Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、１９８２年、　１０巻
、　６４８７〜６５００頁）によるインビトロ変異誘導
によってＡＴＧ開始コドンを含むナピンのコード領域の
総てを欠失するようにする。適当な突然変異体のスクリ
ーニングは、Ｅ、コリ　（Ｅ、ｃｏｌｉ）株ＪＭ８３　
（メッシング・ジエイ（Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｊ、）上記文
献）への２段階形質転換及び推定上の形質転換体のＳｍ
ａ　Ｉ消化によって行った。その得られたナピンプロモ
ータークローンは、ｐＣＧＮ７７Ｂであり、そしてｐｇ
Ｎｌの立ＲＩ部位からナピンのＡＴＧ開始コドンの直前
のＡヌクレオチドまでの２９８個のヌクレオチドを含ん
でいる。そのプロモーター領域を、ＥｃｏＲＩおよびＢ
ａｍＨＩにより消化し、そしてＥｃｏＲＩ　／　Ｂａｍ
Ｈｌで消化されたｐＣＧＮ５６５に連結することによっ
てサブクローンして、ｐＣＧＮ７７９ｃを得た。

ナピンプロモータークローンの　− ｐＣＧＮ７７９ｃは、５′−調節配列の２９８個のヌク
レオチドだけを含む。ナピンプロモーターを、起源のλ
ＢｎＮａクローン上の５”−ＥｃｏＲ１部位の上流に見
出された１、　８　ｋｂフラグメントにより伸長した。

λＢｎＮａ　（エム・クラウチ（Ｍ　、Ｃｒｏｕｃｈ）
から入手）の〜３．５　ｋｂ　Ｘｈｏ　Ｉフラグメント
（ナピン領域を含む）を、ツ刀」で消化されたｐＵｃ１
１９にサブクローンし、ｐｃＧＮ９３０を得た。５’Ｘ
ｈｏＩ部位に近い１ＩｉｎｄＩＩＩ部位を用いて、ｐｃ
ＧＮ９３０の」圏ｄｏｌｌ　／　Ｅ並ＲＩフラグメント
を、ｌｌ１ｎｄＩＩＩ　／　ＥｃｏＲＩで消化されたブ
ルースクリプト＋（ベクタークローニング系、サンディ
エゴ、カリフォルニヤ）中にサブクローンし、ｐＣＧＮ
９４２を得た。伸長されたナピンプロモーターは、Ｅｃ
ｏＲＩおよびＰｓｔｌにより消化されたｐＣＧＮ７７９
ｃと」並Ｒ１および」旦Ｉにより消化されたｐＣＧＮ９
４２とを連結することによって、ｐＣＧＮ９４３を製造
した。このプロモーターは、λＢｎＮａ上に含まれるナ
ピン遺伝子の元のＡＴＧの上流に〜２．１ｋｂの配列を
含む。

土星ヱ左皇上上 伸長されたナピンプロモーターとナピン３′−調節領域
を混合し、遺伝子種子を特異的に発現するためにナピン
カセソトを作った。用いたナピン３′領域は、ＥｃｏＲ
Ｉ　／　Ｓａｌ　Ｉにより消化されたｐＣＧＮ５６５中
にサブクローンされたｐｇＮｌ（Ｘｈｏ　１部位はナピ
ン遺伝子の停止コドンカラ１８ヌクレオチドに配置され
ている）からのＸｈｏ　Ｉ　／　ＥｃｏＲＩフラグメン
トを含むプラスミドｐＣＧＮ９２４からのものである。

」釦ｄＩＩＴ　／　Ｐｓｔｌで消化されたｐＣＧＮ９４
３およびｐｃＧＮ１９２４を連結して、遺伝子を挿入す
るための特異的なりローニング部位Ｓｍ、ａ　Ｉ　、Ｓ
ａｌ　ＩおよびＰｓｔｌを用いて、ナピンカセットｐＣ
ＧＮ９４４を作った。

ピン−ＡＴＰ　告 ｐＣＧＮ７９６を、」圏ｄ　ＩＩＩおよび勿Ｈ１で消化
されたｐｃＧＮｌｓＯＬ、　　Ｈｉｎ　ｄ　ＩＩＩおよ
びＢａｍＨＩで消化されたｐＵｃ８およびＢａｍＨＩで
消化されたｐＵｃｌｌＢを連結して構成した。ｐＣＧＮ
７９６からのＡＣＰ遺伝子を、ＢａｍＨＩで消化し且つ
ＢａｍＨＩで消化されたｐＣＧＮ５６５と連結すること
によってクロラムフェニコールバックグラウンドへ転位
させた。得られたｐｃＧＮ１９０２を、」並Ｒ１と一慣
頃Ｉで消化し、」匹Ｒ１／Ｓｍａｌで消化されたｐｌＪ
ｃ１１８に連結して、ｐｃＧＮ１９２０を得た。ｐｃＧ
Ｎ１９２０のＡＣＰ遺伝子を、Ｎｃｏ　１部位で消化し
、フレナラフラグメントで処理することによってフィル
インし、Ｓｍａ　Ｉで消化し、再連結してｐｃＧＮ１９
１９を得た。これをＡＣＰ遺伝子からの５′コ一ド配列
を除去し、ＡＴＧを再生させた。このＡＣＰ遺伝子を、
ＥｃｏＲＩによりｐｃＧＮ１９１９を消化し、タレナラ
フラグメンによりその部位をフィルインし、そしてＰｓ
ｔｌリンカ−を連結することによって、ＰｓｔＩ部位を
フランキングした。このクローンはｐＣＣＧＮ９４５と
呼ばれる。

ρＣＧＮ９４５のＡＣＰ遺伝子を、上Ｈ１／Ｐ■Ｉフラ
グメントとして、ＢａｍＨＩ　ｈ　Ｐｓｔ　Ｉで消化さ
れたｐｔｌｃ１１８に移動して、ｐＣＧＮ９４５を生成
させ、」ｎ１部位（ｐＵｃｌｌＢによって供される）が
、ＡＣＰ配列の５′−末端となり、ナピンカセットｐＣ
ＧＮ　９４４へのクローニングを促進させるようにした
。」憇■とＰｓｔｌで消化されたｐＣＧＮ９４５ａを、
Ｓａｍ　ＩとＰｓｔｌで消化されたｐＣＧＮ９４４に連
結して、ナピンカセソトｐＣＣＧＮ９４６を生成した。

ナピンＡＣＰカセットを次いで、ｔｌｉｎｄＩ１１部位
からのクローニングによって二元ベクターｐＣＧＮ７８
３中に転位°させ、ｐＣＧＮ９４８を生成した。

一四いＭ１悲は威 Ａ・チュメファシエンス（Ａ、　ｔｕｍｅｆａｃｔｅｎ
ｓ）　（ベーカー（Ｂａｋｅｒ）　　ら、Ｐｌａｎｔ　
Ｍｏｌ、Ｂｉｏｌ、　１９８３年、２巻、３３５〜３５
０頁）の左および右Ｔ−ＤＮＡボーダー；ｐＰＩＩＩＪ
Ｉ　　（ヒルシ（ｌｌｉｒｓｃｈ）ら１９８４年、Ｐｌ
ａｓｍｉｄ　１２巻、１３９〜１４１頁）のゲンタマイ
シン耐性遺伝子：カラフラワー・モザイク・ウィルス（
ＣａＭＶ）の３５３プロモーター（ガードナー（Ｇａｒ
ｄｎｅｒ）　　ら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｉ？ｅ
ｓ、１９８１年、９巻、２８７１〜２８９０頁）；Ｔｎ
５のカナマイシン耐性遺伝子（ジョーゲンセン（Ｊｏｒ
ｇｅｎｓｅｎ）　ら、（下記参照）およびウォルフ（Ｗ
ｏｌｆｆ）　　ら、同上（１９８５年）１３巻、３５５
〜３６７頁）およびｐＴｉＡ６の転写７から３′領域（
バーカー（Ｂａｒｋｅｒ）ら、１９８３年、上記文献）
を含む二元プラスミドである。

ゲンタマイシン耐性マーカーを得るために、ゲンタマイ
シン耐性遺伝子をｐｐＨＴＪ１の３．１　ｋｂ　Ｅｃ。

Ｒ１−Ｐｓｔｌフラグメントから単離し、ｐＵＣＱ中に
クローニングしてｐＣＧＮ５４９を得た。ゲンタマイシ
ン耐性遺伝子を含むＨｉｎｄＩＩＩ　−Ｂａｍ１（Ｉフ
ラグメントを、ｐＣＧＮ５９４を作るｐＣＧＮ５８７の
」江ｄｌＴＩ−Ｂａ１ＩＩフラグメントと交換した。

ｐＣＧＮ５８７は次のようにしてｇＩｌ　製した。ＡＰ
ＩＩＩＩ（ジョーゲンセン（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ）　　
らＨｏｔ、　ｅｎ、Ｇｅｎｅｔ。

１９７９年）１７７巻、６５頁）の全構造遺伝子を含む
Ｔｎ５の」江ｄｌｌｌ　−Ｓ胆ｌフラグメントを、ｐＵ
ｃ８（ビイラ（Ｖｉｅｉｒａ）およびメッシング（Ｍｅ
ｓｓｉｎｇ）Ｇｅｎｅ（１９８２年）１９巻、２５９頁
）中にクローニングし、ＥｃｏＲ１部位は−Ｓ＋ｎａ　
１部位の直となりにあるので、このフラグメントをｌ１
ｉｎｄｌｌｌ　−ＥｃｏＲＩフラグメント中に転換する
９次に、ＡＰＨＩＩ遺伝の３′部分を含むＰｓｔ　Ｉ　
−ＥｃｏＲＩフラグメントを、」並Ｒ１−−氾馴Ｈ１−
づ遅ｊ−Ｐｓｔｌリンカ−によりｐＵＣ７（ｐＣＧＮ５
４６Ｗ）の」亜Ｒ１部位中に組合せた。この構造体はカ
ナマイシン耐性を付与しないので、カナマイシン耐性は
、ＡＰＩＩＩＩ遺伝子の１■−Ｐｓｔｌフラグメントを
ＢａｍＨＩ　−Ｐｓｔ　１部位（ｐＣＧＮ５４６Ｘ）に
挿入することによって得た。この処理は、ＡＰＩＩＩＩ
遺伝子を再集合しその結果、」すＲ１部位がその遺伝子
をフランキングする。ＡＴＧコドンは、ＡＰＨＩＩのＡ
ＴＧ開始コドンの上流にあり、そしてその読み取り枠と
整合していない。

好ましくないＡＴＧは、スーパーフルーアス（ｓｕｐｅ
ｒｆ　１ｕｏｕｓ）　Ａ　Ｔ　Ｇを欠いているＡＰＩＩ
Ｉの５′末端からの５ａｕ３Ａ　−Ｐｓｔ　Ｉフランキ
ングを、ｐＣＧＮ５４６ＷのＢａｍＨＩ　−Ｐｓｔ　Ｉ
部位に挿入して、プラスミドｐｃＧＮ５５０を供するこ
とによって回避した。

ＡＰＩＩＩＩ遺伝子を含むＥｃｏＲＩフラグメントを次
に、発現用のオクトパイン・シンターゼ・カセットを含
むｐｃＧＮ４５１のユニークＥｃｏＲ１部位中にクロー
ニングして、ρＣＧＮ５５２　（Ｉ　Ａ　Ｔ　Ｇ）を供
した。

ｐｃＧＮ４５１は、」匹Ｒ１リンカ−を介してｐＴｉＡ
６のオクトパイン・シンターゼ遺伝子の３′非コード領
域に融合された５′非コード領域の約１５５６ｂｐを含
むオクトパイン・カセットヲ有する。ｐＴｉ座標は、バ
ーカー（Ｂａｒｋｅｒ）ら、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ＋、Ｂｉ
ｏｌ。

（１９８３年）２巻、３２５頁によって定義されたよう
に、３′令頁域では１１　、２０７〜１２，８２３であ
り、５′令頁域に対しては１３．６４３〜１５，２０８
であった。

５′フラグメントは次のようにして得た。コード領域の
５′末端を含むＢａｍＨＩ　−ＥｃｏＲＩフラグメント
のような小さなサブクローニングされたフラグメントを
、プラスミドρＣＧＮ４０７としてｐＢＲ３２２にクロ
ーニングした。ＢａｍＨＩ　−ＥｃｏＲＩフラグメント
は、コード領域にＸｍｎ　１部位を有し、そしてｐＢＲ
３２２は２個のＸｍｎ　Ｉ部位を有する。ｐＣＧＮ４０
７を、Ｘｍｎ　Ｉで消化し、Ｂａ１３１ヌクレアーゼに
再切断し、そしてＥｃｏＲＩリンカ−を該フラグメント
に付加した。ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩによる消化の
後、フラグメントの大きさを両分し、これらの両分をク
ローニングして配列した。ある場合には、全コード領域
と５′非關訳配列のｔｏｂｐは、５′非転写領域と、ｍ
ＲＮＡカップ部位と、ＢａｍＨＩ部位に対する）５′非
転写領域の１６ｂｐは損なわれないままに除去されてし
まった。この小さなフラグメントは、７％アクリルアミ
ドゲル上でサイプ分別することによって得られ、約１３
０ｂｐの長さのフラグメントが？８出した。

このサイズ分別されたＤＮＡを、Ｍ１３ｎ＋ｐ９と配列
された数個のクローンとに連結し、そしてこの配列をオ
クトパイン・シンターゼ遺伝子の既知配列と比較した。

Ｍ１３構造体は、ｐ１４と呼ばれ、このプラスミドはＢ
ａｍＩ（ＩとＥｃｏＲＩで消化され、小さなフラグメン
トが得られ、これをｐＴｉ４６（ガルフィケル（Ｇａｒ
ｆ　１ｎｋｅｌ）とネステル（Ｎｅｓｔｅｒ）Ｊ、Ｂａ
ｃｔｅ−ｒｉｏｌ、　１９８０年、１４４巻、７３２頁
）からの上流の５′配列を有するＢａｍ１（Ｉ　−Ｘｈ
ｏ　Ｉに連結させ、３′配列を有するＸｈｏ　Ｉ　〜Ｅ
ｃｏＲＩフラグメントに連結した。

得られたＸｈｏ　Ｉフラグメントを、ｐＣＧＮ４２６と
呼ばれるｐＵｃ８誘導体のＸｈｏ　１部位にクローニン
グした。このプラスミドは、Ｘｈｏ　Ｉリンカ−がｐＵ
ｃ８の非反復）ｆｉｎ　ｃ　１１部位に挿入される場合
、ＤＮＡポリポリーゼ■によりフィルインされた全Ｅｃ
ｏＲＩ部位を有し、且つｔｌｉｎ　ｃ　ＩＩ制限エンド
ヌクレアーゼのヌクレアーゼ混入によってＰｓｔｌと１
（ｉｎ　ｄ　ＩＩＩ部位を喪失している点でｐＵｃ８と
は異なっている。

その得られたプラスミドｐｃＧＮ４５１は、（Ｔ　−Ｄ
　ＮＡの右ボーダー、ｍＲＮＡカップ部位および５′非
翻訳配列の１６ｂｐを有する非転写配列の１５５０ｂｐ
を含む）５′非コ一ド令頁域と、（２６７ｂｐのコード
領Ｊ或、停止コドン、１９６ｂｐの３′非翻訳ＤＮＡ、
１１５３ｂｐのポリＡ部位および３′非転写配列を含む
）３′領域との間に、タンパク質コード配列を挿入する
ための単一ＥｃｏＲ１部位を有する。ｐｃＧＮ４５１は
右Ｔ−ＤＮＡボーダーをも供する。

オクス５′およびオクス３′を適正な配置で有するその
得られたプラスミドｐｃＧＮ４５１を、」並Ｒ１により
消化し、そして完全なカナマイシン耐性遺伝子をを有す
るｐｃＧＮ５５１からのＥｃｏＲＩフラグメントを、Ｅ
ｃｏＲＩの部位に挿入し、正しい位置にカナマイシン耐
性遺伝子を、適正な位置有するｐＣＧＮ５５２を得た。

このオクス／ＫＡＮ遺伝子を用いて、トランス型二元ベ
クターｐＣＧＮ５８７のための選択マーカーを供した。

このように工作したオクトパイン・シンターゼ・プロモ
ーター・カセットの５′部分は、１５２０８〜１３６４
４ｂｐ　（バーカー（Ｂａｒｋｅｒ）の計数）でＸｈｏ
　ＩがらのｐＴｉＡ６ＤＮＡからなり、それはＴ−ＤＮ
Ａ転位に関係したＴ　　ＤＮＡ境界配列（ボーダー）を
有する。プラスミドｐＣＧＮ５８７では、ｐＣＧＮ５５
２からのオクス／ＫＡＮ遺伝子は、選択可能なマーカー
と右ボーダーを供する。左の境界領域は最初に、」旦ｄ
ｌｌｌ　−Ｓｎ１片（＋）ＣＧＮ５０２）　（６０２〜
２２１３ｂｐ）として旧３ｍｐＱ中にクローニングされ
、そしてｐＣＧＮ５６５中に」匹１−　Ｅｃｏ　ＲＩと
して再クローニングされ、ｐｃＧＮ５８０を供する。ｐ
ＣＧＮ５６５は、ｐＨｃ８−　Ｃｍに基づいたクローニ
ングベクターであるが、ｐＵｃ１８リンカ−を有する。

ｐｃＧＮ５８０をＢａｍＨＩで線状にして、ｐＶｃＫ１
０２　（フナラフ（Ｋｎａｕｆ）とネスター（Ｎｅｓ　
ｔｅｒ）、Ｐｌａｓｍｉｄ　、１９８２年、８巻、４５
頁）のより小さなｌＩＩフラグメントを置換するのに用
いて、ｐＣＧＮ５８５を生成した。ｐＣＧＮ５８５（７
）小さな方（ｌＤｓａｌＩ７ラグメントをオクス／ＫＡ
Ｎ遺伝子を有するｐＣＧＮ５５２からのＸｈｏ　Ｉフラ
グメントで置換することによって、ｐＣＧＮ５８７が得
られた。

５′−オクスーカナマイシンーオクスー３′（オクスは
プロモーター領域を指示する５′と停止領域を指示する
３′を有するオクトパイン・シンターゼであり、１９８
５年９月１３日出願の米゛国特許出願第７７５，９２３
号明細書を参照されたい）フラグメントを有するｐｃＧ
Ｎ５９４（７）　ＨｉｎｄＩＩＩ　−ＢａｍＨ１領域を
、ｐＵｃ１８からの１ＩｉｎｄｌＩＩ　−ＢａｍＨＩポ
リリンカーで置換した。

ポリリンカーを有する。ｐＴｉＡ６のＯＲＦ　１及び２
を含むｐＮＷ３１ｃ　−８、２９−１（トーマスハウ（
Ｔｈｏｍａｓｈｏｗ）ら、釦旦、１９８０年、１９巻、
７２９頁）　（７）　Ｈｉｎｄ　Ｉ［Ｉ　−ＪＩ　Ｉ　
７−７グメントを、ｐＣＧＮ５６６（７）　Ｈｉｎ　ｄ
　ｎｌ　−ＢａｍＨＩ部位にサブクローニングしてｐＣ
ＧＮ７０３ヲ住成させた。

転写７　（ｐＴｉＡ６　（バーカー（Ｂａｒｋｅｒ）ら
、１９８３年、上記文献、の塩基２３９６〜２９２０に
対応する）の３′領域を含むｐｃＧＮ７０３の５ａｕ３
Ａフラグメントを、ｐＵｃ１８ｋ　ＢａｍＨ１部位にサ
ブクローニングして、ｐｃＧＮ７０９を生成させた。ｐ
ｃＧＮ７０９の」すＲＩ−５ｍａ　Ｉ　ホリリンカー領
域を、カナマイシン耐性遺伝子（ＡＰＩ＋３−　ＩＩ）
を有するｐＣＧＮ５８７の」匹Ｒ１−３ｍａ　Ｉフラグ
メントで置換して、ｐＣＧＮ７２６を生成させた。

ｐＣＧＮ７２６（７）　Ｅ並Ｒ１−５旦■フラグメント
とｐＣＧＮ７３４のＬＩＩ−ユ並Ｒ１フラグメントを、
ｐＵｃ８−ＣｍのＢａｍＨＩ−３旦■部位に挿入して、
ｐＣＧＮ７３Ｂを生成させた。ｐＣＧＮ７２６ｃは、９
００ｂｐのＥｃｏＲｒ−ＥｃｏＲ１フラグメントを欠失
させることによってｐＣＧＮ７３８から誘導される。

ｐｃＧＮ１６７を構成するため、ＣａＭＶ　（７１４４
〜７７３５ｂｐ）（ガードナー（Ｇａｒｄｎｅｒ）　　
ら、１９８１年、上記文献）のＡｌｕ　Ｉフラグメント
を、＾ｌｕｌを用いて消化することによって得、そして
Ｍ１３ｍｐ７　（メッシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）ら、Ｎ
ｕｃｌ、Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、、１９８１年、９巻、３０
９〜３２１頁）のｔｌｉｎ　ｃ　１１部位にクローニン
グして、Ｃ６１４を得た。Ｃ６１４（７）　ＥｃｏＲｒ
消化物は、３５Ｓプロモーターを含むＣ６１４からＥｃ
ｏＲＩフラグメントを生成し、これをｐＵｃ８（ビイラ
（Ｖｉｅｉｒａ）およびメンシング団ｅｓｓｉｎｇ）　
、傾匣、１９８２年、１９巻、２５９頁）の」並ＲＩ部
位にクローニングして、ｐｃＧＮ１４６を生成させた。

プロモーター領域を整えるために、ｊ１１１部位（７６
７０ｂｐ）を、」れＩＩで処理し、続いて」且す１で再
切断し、その後、ＪＬＬＩＩリンカ−を、」ｌす１で処
理されたＤＮＡに結合し、ｐｃＧＮ１４７を生成させた
。

プロモーター領域、選択マーカー（２ＡＴＧを有するＫ
ＡＮ）および３′領域を有するｐｃＧＮ１４８ａを、Ｂ
ｇｌ　ｎ　テｐＣＧＮ５２８を消化し、そしてｐｃＧＮ
１４７がら（７）　Ｂａｍ　ＨＩ　−」しＩＩプロモー
ターフラグメントを挿入することによって調製した。こ
のフラグメントラｐＣＧＮ５２Ｂの」烈■■部位中にク
ローニングし、上Ｉ■部位を、ｐＣＧＮ５２８のカナマ
イシン遺伝子に接近させた。

この構成に用いたシャトルベクターｐＣＧＮ５２Ｂは、
以下のようにして調製した。カナマイシン遺伝子（ジョ
ーゲンソン（Ｊｏｒｇｅｎｓｏｎ）　　ら、Ｍｏ１．ｇ
ｅｎ、Ｇｅｎｅｔ１９７９年、１７７巻、６５頁）を含
むＴｎ５を有するプラスミドを、ｔｌｉｎｄＩＩＩ−シ
Ｈｒで消化し、そしてカナマイシン遺伝子を有するＨｉ
ｎ　ｄ　ＩＩＩ　−ＢａｍＨＩ７ラグメントをｐＡＣＹ
Ｃ１８４（チャフ　（Ｃｈａｎｇ）とコーエン（Ｃｏｈ
ｅｎ）　、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１９７８年、１
３４巻、１１４１〜１１５６頁）のテトラサイクリン遺
伝子（Ｄ　１ｌｉｎｄ　ＩＩＩ　−ＢａｍＨＩ部位に挿
入することによって、ｐＣＧＮ５２５を調製した。ｐＣ
ＧＮ５２６は、Ｓｍａ■部位中に挿入されたＸｈｏ　Ｉ
リンカ−により改質されたｐＴｉＡ６（トーマスハウ（
Ｔｈｏｍａｓｈｏｈ）　　ら、Ｃｅ１ｌ、１９８０年、
１９巻、７２９〜７３９頁）のＢａｗｌ−ＩＩフラグメ
ントを、ｐＣＧＮ５２５のＢａｍＨＩ部位に挿入するこ
とによって３周製した。ｐｃＧＮ５２８は、ｐＣＧＮ５
２６がらの小さなＸｈｏ　ＩフラグメントをＸｈｏ　Ｉ
で消化することによって欠失させ、再連結することによ
って得た。

ｐｃＧＮ１４９ａは、ｐＭＢ９ＫａｎＸＸ　ＩからのＢ
ａｍＨＩ−カナマイシン遺伝子フラグメントを、ｐｃＧ
Ｎ１４８ａの勿ＨＩ部位にクローニングすることによっ
て製造し、　た。

ｐＭＢ９ＫａｎＸＸ　Ｉは、Ｘｈｏ　１部位を喪失して
いるが、Ｔｉ２Ｏ３からの機能的カナマイシン遺伝子を
有するρ１Ｉｃ４に変異株（ビイラ（Ｖｔｅｉｒａ）お
よびメソシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）　、Ｇｅｎｅ、１９
８２年、１９巻、２５９〜２６８頁）であり、アゲロバ
クチリアで効率的選択を行うことができる。

ｐｃＧＮ１４９ａを、ＩＩＩと３１で消化した。ｐＣＧ
Ｎ１４９ａのこの小さな１ＩＩ−ＩＩフラグメントを、
ＢａｍＨｌ−づｆｌで消化することによって単離された
Ｍｌ　　（下記を参照）からのＢａｍＨＩ−」Ｉフラグ
メントで置換した。これによって、ｐｃＧＮ１６７を生
成し、この構造体は完全な長さのＣａＭＶプロモーター
、ＩＡＴＧ−カナマイシン遺伝子、３′末端および細菌
性Ｔｎ　９０３型カナマイシン遺伝子を含んでいる。Ｍ
ｌはｐＣＧＮ５４６χ（ｐＣＧＮ５８７の構成を参照）
からのＥｃｏＲＩフラグメントであり、そしてこれを１
＾ＴＧ−カナマイシン遺伝子のＰｓｔ１部位が、Ｍ１３
ｍｐ９のポリリンカー領域に接近するような方法で、Ｍ
１３ｍｐ９のＥｃｏＲＩクローニング部位にクローニン
グした。

ＣａＭＶ　−３５５プロモーター、１４ＴＧ−カナマイ
シン遺伝子およびｐＴｉＡ６のＢａｍＨＩ−フラグメン
ト１９を有するｐｃＧＮ１６７（７）　ＨｉｎｄｌＩＩ
　−ＢａｍＨＩ　７ラグメントを、ｐｔｌｃ１９のＢａ
ｍＨＩ　−Ｈｉｎｄ　Ｉ１１部位中にクローニングして
ｐＣＧＮ９７６を生成させた。

転写７からの３５５プロモーターと３′頭域を、ｐＣＧ
Ｎ９７６の０．７　ｋｂ　１ｌｉｎ　ｄ　ｌｌｌ−血Ｒ
１フラグメ７　ト（３５Ｓ７”ｏ−ｔ：　−ター）　ト
１）ＣＧＮ７０９（７）０．５ｋｂ」匹Ｒ１−５…Ｉフ
ラグメント（転写７　：　３　’）を、ｐＣＧＮ５６６
の」旦ｄｌｌｌ　−Ｓ旦■部位に挿入して、　ｐＣＧＮ
７６６ｃを製造した。

ｐＣＧＮ７６６ｃ　（ＣａＭＶ−３５Ｓ　７’ｌ：１モ
ータ）　（７）０．７ｋｂ１１ｉｎｄｌｌｌ　−Ｅｃｏ
ＲＩ　７ラグメントを、ｐｃＧＮ７２６ｃ（１八ＴＧ−
ＭＡＮ　３　’令Ｍ域）の１５ｋｂＨ並Ｒ１−５旦Ｉに
連結シテ、ｐＵｃ１１９ノＨｉｎｄ　ＩＩＩ　−Ｓａｌ
　１部位として、ｐＣＧＮ７７８を生成させた。ｐｃＧ
Ｎ７７８ノ２．２ｋｂｆｉｌ域である、ＣａＭＶ　−３
５ＳプロモーターおよびＩＡＴＧ−ＫＡＮ　−３’　Ｒ
１ｂ２ヲ有ｔ４　Ｈｉｎｄ　ｍ　−Ｓａｌ　Ｉフラクメ
ントヲ用イテ、ｐＣＧＮ７３９（７）　Ｈｉｎ　ｄ　Ｉ
ＩＩ　−５ａｌ　Ｉリンカ−領域を置換して、ｐＣＧＮ
７８３を生成させた。

ｐＣＧＮ９４８を、形質転換によってアグロバクテリウ
ム・チュメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
　ｔｕｍｅ−ｆａｃｉｅｎｓ）　ＥＨＡＩＯＩ　（フッ
ド（Ｈｏｏｄ）ら、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１９８
６年、１６８巻、１２９１〜１３０１頁）に導入した。

−晩ＥＩＩＡＩＯＬの２ｍｌ培養液を、ＭＧ／Ｌブイヨ
ン中で３０℃で増殖させ、０．５　ｎｔ／を１０１００
ｍ７（７）／Ｌブイヨン（ガルフィンケル（Ｇａｒｆ　
１ｎｋｅｌ）とネスターＣＮｅ５　ｔｅｒ）、Ｊ、Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ、、１９８０年、１４４巻、７３２〜７
４３頁）に接種して、振盪インキュベーター中で３０℃
で５時間生長させた。ｍ胞を７にで遠心分離することに
よってベレット化し、ＭＧ／ＬブイヨンＩ−に再懸濁さ
せ、氷上に置いた。約１■ノｐＣＧＮ９４ＢＤＮＡを、
１００．Ｊ＋７）ＭＣ；／Ｌブイヨンニ入れ、コレニ、
ＥＩＩＡＩＯＩ？ＡＭ１２００μｌヲ加え、ＤＮＡ−細
胞混合物を有する試験管を直ちにドライアイス／エタノ
ール浴に５仲間入れた。この試験管を、３７℃での水浴
中で５分間速やかに融解させた後、１−の新鮮なＭ　Ｇ
　／ｌ、　１＠養液を加えて、３０℃で２時間振盪し、
た。細胞をペレット化し、そして１００■／１のゲンタ
マイシンを含むＭＧ／Ｌプレー）（１，５％寒天）に塗
布した。プラスミドＤＮＡを、それぞれのゲンタマンシ
ン耐性コロニーから単乱し、１Ｌ２ｉ（Ｅ、ｃｏｌｉ）
中に形質転換させ、そして制限酵素分析を行ったところ
、ゲンタマイシン耐性ＥＨＡＩＯＩが、ｐＣＧＮ９４８
の完全なコピーを含むことが判った。単一コロニーを採
取して、１００■／ｌのゲンタマイシンを含むＭＧ／Ｌ
プレート上に更に２回塗布することによって精製した。

ウェスター（１＋ｌｅｓ　ｔｅｒ）のブラシヵナプス（
Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ）の種子を、９５％エタノ
ールに４分間浸漬した。それらを、殺菌溶液１００ｍＺ
当り“Ｔｗｅｅｎ　２０”溶液界面活性剤５０ｍを有す
る次亜塩素酸ナトリウムの１％溶液中で殺菌した。４５
分間浸漬した後、種子を無菌蒸溜水で４回濯いだ。それ
らを、無菌のプラスチック製の幅７ｃｍ、長さ７ｃｍお
よび高さが１０ｃｍの箱（マゼンタ（Ｍａｇｅｎ　ｔａ
）でＭＳ（ムラシゲ最少有機培養液（Ｍｕｒａｓｈｉｇ
ｅ　ｍｉｎｉｍａｌｏｒｇａ−ｎｉｃｓ　ｍｅｄｉｕｍ
）ギプコ（Ｇｉｂｃｏ））の１０／１０？Ｗ度のもの５
０ｍ１を有し、ピリドキシン（５Ｌｑｒ／ｌ）、ニコチ
ン酸（５０ガ／１）、グリシン（２００μｇ／ｌ）を加
え、０６％寒天で固化させたものに植えた。

光強度を約６５　ｐ　Ｅｍ−”ｓ−’として１６時間−
８時間の明−暗サイクルで２２℃で種子が発芽して、生
長した。５日後に実生を無菌条件にして、胚軸を切除し
て、約４龍の長さに細片に切断した。胚軸切片を支持層
上に平らに置き、支持細胞層がない場合には固化下Ｂ５
　０／ｌ／１またはＢ５０／Ｉ１０培養液上のフィルタ
ーの上部に置いた。

Ｂ５　０／Ｉ１０培地はＢ５塩とビタミン類（ガンボル
フ（Ｇａｎｂｏｒｇ）　％　ミラー（Ｍｉ　１ｌｅｒ）
およびオジマ（Ｏｊｉｍａ）　、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
ａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、、１９６８年、５０＠、１５
１〜１５８頁）、３％スクロース、２．４−ジクロロフ
ェノキシ酢酸（１，０■／１）を含み、ｐＨは５．８に
調整され、培地は０．６％フイトアーガ一（Ｐｈｙｔａ
ｇａｒ）で固化している。Ｂ５　０／１／１は、上記と
同じものにキネチン１．Ｏａｒ／ｌを加えたものである
。支持プレートは、Ｂ５　０／Ｌ１０またはＢ５　０／
１／ｌ培地に２４時間前に、（フィラソチ（Ｆｉｌｌａ
ｔｔｉ）ら、Ｍｏ１．ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、、１９８７
年、２０６巻、１９２〜１９９真に記載の方法で保持さ
れた）固定相タバコ分散液培養液１．０−を加えること
によって調製した。胚軸切片を切断して、アゲロバクチ
リア（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）処理の２４時間前
に支持層プレート上に載せた。

アグロバクテリウム・チュメファシェンス（Ａｇｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（ＥＨＡｌ
ｏｌｘ　９４８株）を、ＭＧ／Ｌブイヨン中で３０℃で
アグロバクテリウムの単一コロニーをインキュベートす
ることによって調製した。１６時間後に、バクテリアを
集め、ＭＧ／Ｌブイヨン中に１０’個のバクテリア／−
に希釈したものを調製した。胚軸切片を、アグロバクテ
リウムＱｉ液に入れることによってバクテリアにより接
種し、そして３０〜６０分間放置した後、取り出して、
上記Ｂ５　０／１／ｌまたは０／１１０培地を有するペ
トリ皿に移した。このペトリ皿を、２２℃で、薄明りの
中でインキュベートした。バクテリアと胚軸切片との共
インキュベーションを、２４〜４８時間行った。胚軸切
片を取り出し、５００■／１のカルベニシリン（この時
点で、時には硫酸カナマイシン１０　、２５または５０
■／１加えた）を含むＢ５　０／ｌ／１またはＯ／Ｉ１
０上に、２２℃で連続光（約６５　ｕ　Ｅｍ−”Ｓ−’
）中で７日装置いた。それらを、１％スクロース、３■
／ｌのベンジルアミノ−プリンおよび１■／１のゼアチ
ンを含むＢ５塩培地に移した。これに５００■／Ｉのカ
ルベニシリン、１０　、２５または５０■／ｌ硫酸カナ
マイシンを補充して、０．６％フィトアーガー（Ｐｈｙ
ｔａｇａｒ）　（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））で固化した。

その後、外植片を、２週間毎に新しい培地に移しかえた
。

１月後に、カナマイシンを含む培地上で選択された緑の
カルス（ｃａｌｌｉ）から緑の茎葉が発生した。

これらの茎葉を少なくとも１ｃＩ１１の高さになったら
、カルスから切断して、１％のスクロースを含み、生長
物質を加えず、３００■／ｌカーペニシリンを有するＢ
５培地上に置き、０．６％フイトアーガーで固化した。

茎葉を生長を続け、数枚の葉を取ってネオマイシンホス
ホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＰＴＩＩ）活性を試験し
た。ＮＰＴＩＩ活性のために陽性である茎葉を、１％の
スクロース、２■／ｌのインドール酪酸、２００ｗ／ｌ
のカーペニシリンを有し、０．６％フィトアーガーで固
化したＢ５０／１／１培地を含んだマゼンタ箱に入れた
。２．３週間後に茎葉が発根し、土壌に移した。植物を
、２２℃で、光強度２２０μＥｍ　−２ｓ　−１で、１
６−８時間の明−暗サイクルで生育室で生育し、数週間
後、温室に移した。

サブン２の一゛−ター ｐＣＧＮ９４８とブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ
　ｎａｐｕｓ）の胚軸を含む、アグロバクテリウム・チ
ュメファシエンス（八ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕ
ｍｅｆａｃｉｅｎｓ（ＥＩＩＡＩＯＩの共培養からの再
生ブラシカ・ナプスを、ホウレン草の葉ＡＣＰ遺伝子の
適性組込みおよび胚特異性発現について検討した。デラ
ボルタ（Ｄｅｌｌａｐｏｒｔａ）ら、（Ｐｌａｎｔ　Ｂ
ｉｏｌ、Ｒｅｓ、、１９８３年、１巻、１９〜２１頁）
の方法によって再生した植物の葉から単離されたＤＮＡ
を用いて、サブン分析を行い、ＣｓＣ１中でバンドする
ことによって精製した。ＤＮＡ　（１０ｇ）を制限酵素
ＥｃｏＲＩで消化し、０．７％アガロースゲル上で電気
泳動を行い、ニトロセルロースに移した（マニアチス（
Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、１９８２年、上記文献を参照さ
れたい）。プロットをホウレン草ＡＣＴ配列の１．８　
ｋｂを含むｐＣＧＮ９４５ＤＮＡで、または（ｐｃＧＮ
９３０の」江ｄｌｌＩ／Ｅ赳Ｒ１フラグメントをｐＣＧ
Ｎ５６６へ転位させることによって製造した）　ｐＣＧ
Ｎ９３６ｃから単離した一ＥｃｏＲＩ　／　ＨｉｎｄＩ
ＩＩフラグメントであって、ニックトランスレーション
（製造業者によって記載されていて、ピーアールエル・
ニック・トランスレーション・キット、ベテスダ（Ｂｅ
ｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ）、ガイザースブルク、エム・ディー（ＭＤ））
によって３２　Ｐ　−ｄＣＴＰにより標識されたナピン
５′配列を含むものでプローブした。プロットを、４２
℃で、５０％ホルムアミド、１０ｘデンハート（Ｄｅｎ
ｈａｒｄ　ｔ）、５　ｘＳＳＣ，０，１％Ｓ　　Ｄ　　
Ｓ　、　　５　ｍＭＥＤＴＡ、　　１００μｇ／−の修
生胸腺ＤＮＡおよび１０％硫酸デキストラン（ハイブリ
ッド形成のみ）で予備ハイブリッド形成およびハイブリ
ッド形成を行った。（試薬はマニアチス（Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ）ら、１９８２年、上記文献に記載）。

洗浄は１　ｘＳＳＣ，０，１％ＳＤＳで３０分間、０．
１ｘＳＳＣ，Ｏ，１％ＳＤＳで５５℃で２回行った。

オートラジオダラムは、ＡＣＰ遺伝子（ｐＣＧＮ９４５
）でプローブしたところ、４種の植物からのＤＮＡのＥ
ｃｏＲＩ消化物中でハイブリッド形成された約３．３お
よび３．２ｋｂの２つのバンドを示しており、３．３お
よび３．２ｋｂの」並Ｒ１フラグメントはｐＣＧＮ９４
８のＴ　　ＤＮＡＦ＋Ｊｆ域に存在するので、植物ゲノ
ムにホウレン草の葉ＡＣＰ構造が適性に組込まれている
ことを示した。この遺伝子構造は、ナピン５′配列でプ
ローブしたところ、検出された植物ＤＮＡ−構造ＤＮＡ
ボーダーフラグメントの数によって判定すると、異なる
植物において単一または複数の遺伝子座に存在した。

ノーザンー゛−− ナピンプロモーターからの組込まれたホウレン草の葉Ａ
ＣＰ遺伝子の発現は、ノーザン分析によって検出された
が、構造ＤＮＡを含むことが示された、形質転換された
植物の一つの葉では検出されなかった。生育している種
子を、形質転換された植物から開花後２１日日月集めた
。種子を切り開いて胚を取り出し、液体窒素中で凍結し
た。総ＲＮＡを、種子の胚およびクローチ（Ｃｒｏｕｃ
ｈ）ら、１９８３年、上記文献記載の方法によって、形
質転換された植物の葉から単離し、（シューメーカー（
Ｓｈｅｗｍａｋｅｒ）　ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、、　１
９８５年、１４０巻、２８１〜２８８頁記載の方法によ
って）ホルムアルデヒドを含む１．５％アガロースゲル
上で電気泳動を行い、ニトロセルロースにプロットした
（トーマス（Ｔｈｏｍａｓ）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ
ｃａｄ、Ｓｃｉ、、　ＵＳＡ％　１９８０年、７７巻、
５２０１〜５２０５頁）。プロットを、上記のように予
備ハイブリッド形成およびハイブリッド形成し、洗浄し
た。プローブは、ニックトランスレーションによって標
識されたホウレン草の葉ＡＣＰ配列のみを含むｐＣＧＮ
９４５から単離されたノ１１／ＢａｍＨＩフラグメント
であった。

約０．８ｋｂのＲＮＡバンドが胚に検出されたが、形質
転換された植物の葉からは検出されなかった。

このことは、ホウレン草の葉のＡＣＰ遺伝子の発現が種
子に特異的であることを示している。

ＡＣＰ残基がエシエリシキア・コーリー（Ｅｓｃｈｅ−
ｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ａ　ＣＰである時には、高
級植物脂肪酸の生合成遺伝子がアシル−ＡＣＰ基質を認
識することが示されているが、異なる源からの異なる形
のＡＣＰは生体内での脂肪酸合成の効率および／または
最終生成物に影響を及ぼす可能性がある。

例えば、ホウレン草（オールロジ（Ｏｈｌｒｏｇｇｅ）
　とクオ（Ｋｕｏ）　、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、１
９８５年、２６０巻、８０３２〜８０３７頁）と大麦（
ホジ（Ｈｏｊ）とスベンゼン（Ｓｖｅｎｄｓｅｎ）、Ｃ
ａｒｌｓｂｅｒｇ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｎ＋ｕｎ、　、１９
８４年、４９巻、４８３〜４９２頁）は共に１種以上の
形のＡＣＰを有する。ＡＣＰのイソ型を使用する普遍性
を支持して、油脂種子作物の価値を高めるために、油脂
種子作物ターニップ・レイプ（ブラシカ・カンペストリ
ス（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ））の種
子に見出されるＡＣＰの遺伝子のｃＤＮＡコピーを単離
して、特徴付けた。

次の説明はブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａ
ｐｕｓ）ではなく、ブラシカ・カンペストリス（Ｂｒａ
ｓｓｉｃａｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）からのナピンプロモ
ーターを用いて、ＡＣＰ遺伝子をキメラ遺伝子に組込む
処理法の説明である。

通常はｒＲ−５００Ｊと呼ばれるターニップ・レイプの
自己適合性変種であるブラシカ・カンペストリスから未
成熟種子を集める。種子全体は、開花後約１４〜２８日
に相当する段階で集める。ｃＤＮＡ／＜ンクのＲＮＡ単
離と調製は、ホウレン草ＡＣＰｃＤＮＡクローンの単離
について上記した通りであった。

ｃＤＮＡバンクをプローブするため、アプライド・バイ
オシステムス・ＤＮＡ・シンセサイザー（Ａｐｐｌｉ−
ｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　ＤＮＡ　５ｙｎｔｈｅｓ
ｉｚｅｒ）３ＢＯＡ型を用いて、製造業者の勧めにした
がってオリゴヌクレオチド（５’　　）　　　−ＡＣＴ
ＴＴＣＴＣＡＡＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＴＴＴＡＧＣＡＧ
Ｃ−（３）を合成した。この合成りＮＡ分子は、アミノ
酸配列（ａｌａ−ａｌａ−１ｙｓ−ｐｒｏ−ｇｌｕ−ｔ
ｈｒ−ｖａｌ−ｇｌｕ−１ｙｓ−ｖａｌ）をコードする
ＤＮＡまたはＲＮＡ配列に対して低緊縮性でハイブリッ
ド形成する。このアミノ酸配列は、ブラシカ・ナプス（
Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ）の種子から単離された
ＡＣＰについて報告されており　（スラバス（Ｓｌａｂ
ａｓ）ら、第７回植物脂質の構造と機能についての国際
シンポジウム、カリフォルニア大学、デービス、カリフ
ォルニア、プレナム出版、ニューヨーク、１９８７年）
、ブラシカ・カンペストリスからのＡＣＰは極めて類似
している。

約２２００個の異なるｃＤＮＡクローンを、コロニーハ
イブリダイゼーション法（タウブ（Ｔａｕｂ）とトンプ
ソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）　、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、　、１９８２年、１２６巻、２２２〜２３０頁）と
ウッド（Ｗｏｏｄ）ら、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳ＾、１９８５年、
８２巻、１５８５〜１５８８頁に記載の条件に対応する
ハイブリダイゼーション条件を用いて分析する。オリゴ
ヌクレオチドプローブに明らかなプローブを示す２種の
ｃＤＮＡクローンのＤＮＡ配列分析は、ブラシカ・ナプ
ス（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ）（スラバス（Ｓｌ
ａｂａｓ）ら、上記）から記載されるＡ　ＣＰタンパク
質とコードされたアミノ酸配列がかなり類似しているこ
とによって明らかなように、ｐｃＧＮＩＢｃｓと呼ばれ
るものはＡＣＰ前駆体タンパク質をコードすることを示
していた。ｐｃＧＮＩＢｃｓ　（ＡＧＢＩとも呼ばれる
）のＤＮＡ配列は、次のように表わされる。

ｌａＴｈｒＳｅｒＬｅｕＡｌａＡＩａＴｈｒＴｈｒＡｒ
ｇ１１ｅＳｅｒＰｈｅＧ１ｎＬｙｓＩｕＩ 硼 Ｄｄｅ［Ａｌｕｌ ｌｌ ａｃＩ ！１ｖ１ ＡＧＣＣＡＡＧＧＣＴＴＴＧＴＴＧＧＧＴＴＴＧＴＴＧ
ＴＴＴＴＣ４８３４８４ＡＴＡＡＴＣＴＴＣＣＴＧＴＣ
ＡＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＣＴＴＴＡＡＴＧＴＧＴＣＡＡ
Ｈｉｎｆｌ　　　　　Ｄｒａｌ ５５３　ＴＴＧＣＣＡＡＡＡＡＡＡ　５６４トランスゲ
−ニック・ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａ
ｐｕｓ）において、ブラシカ−カンペストリス（Ｂｒａ
ｓｓｉｃａ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）の種子ＡＣＰの高
水準の胚特異的な発現を達成するため、キメラ遺伝子を
、ｐＣＧＮ９４６について記載したようにホウレン草Ａ
ＣＰ−コードＤＮＡ配列を用いて胚特異的なキメラ遺伝
子に類似させる。ｐｃＧＮＩＢｃｓＡｃＰコード領域は
、ｐｃＧＮ１ｔ３０３　（下記）に存在するブラシカ・
カンペストリス（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｃａｍｐｅｓＬｒ
ｉｓ）ナピン型プロモーター要素に適合するように調整
する。

確立されたプロトコール（マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ）ら、１９８２年、上記文献）を用いて、ラムダベク
ター・シャロン（Ｃｈａｒｏｎ）　３５において、ブラ
シカ・カンペストリスの」■ＩＩ一部分ゲ部分クツムラ
イブラリ−た。増幅されたライブラリーの力価は、約１
．２ｘｌＯ−’ファージ／　ｎｌであった。、ｉｏｏ、
ｏｏＯの組換えバタテリオファージを、３７℃で２０分
間、ＤＨＩ　Ｂ、コリ　（Ｅ、ｃｏｌｉ）細胞（ハナハ
ン・ディー　（Ｈａｎａｈａｎ、　Ｄ、）、Ｊ、Ｍｏ１
．Ｂｉｏｌ、　、１９８３年、１６６巻、５５７頁）に
吸着させた後、Ｎ　Ｚ　Ｙ　＋　１０　ｍＭ（７）Ｍｇ
ＳＯ４＋０．９％アガロース中に１０５／９ｘ９ＮＺＹ
プレートノ密度で（ＮＺＹＭはマニアチス（Ｍａｎｉａ
ｔｉｓ）ら、１９８２年、上記文献に記載した通りであ
る）加えた。プレートを３７℃で約１３時間インキユヘ
ートし、４°Ｃで２．５時間冷却し、前もって切断され
たフィルターをプレート上に約１分間置き、それらを剥
がすことによってファージをジーン・スクリーン・プラ
スにュー・イングランド・ニューフレアー（Ｎｅｗ　Ｅ
ｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ））に移した。吸着され
たファージＤＮＡを、フィルターを１．５　ＭのＮａＣ
１，０，５ＭのＮａ０ｔｌに１分間浮漉させ、１．５Ｍ
のＮａＣｆ、０、５　Ｍ　トリス−１１Ｃ／！　、ｐｏ
　８．　Ｏで２分間、２　ｘＳＳＣで３分間中和するこ
とによって固定した。フィルターを湿っぽい程度まで風
乾し、サブン分析について記載した方法で４２℃で予備
ハイブリッド形成およびハイブリッド形成を行った。フ
ィルターを、プローブｐＮ１　　（クローチ（Ｃｒｏｕ
ｃｈ）ら工９８３年、上記文献）を用いて上記記載のブ
ラシカ・カンペストリス（Ｂ、ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）
の種子ｃＤＮＡライブラリーから単離されたｃＤＮＡク
ローンＢＥ５の上Ｉ／−ジ１゜■フラグメントを用いて
ナピンを含むクローンをプローブした。３個のプラーク
を二重フィルター上で強力にハイブリッド形成して、（
マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、１９８２年、上記
文献に記載の方法で）プラークを精製した。

下記のものは、ＢＥ５ｃＤＮＡ配列である。

ＢＢ５ｃＤＮＡ　　　長さ＝７３４ ＢＥＳ　ＣＤＮＡ ＡｌｕＩ ＨｐａＩＩ　　　ＡｖａＩｌ ５ｔＮＩ 「 ａｑｌ ζ 八ｌｕＩ 珊 ５ＬＮ１ ■ ｃｃ１ ＧＡＧＴＧＴＧＴＡＴＡＣＣＡＣＧＧＴＧＡＴＡＴＧＡ
ＧＴＧＴＧ　　６２１１１ｉｎｃｌｌ ■ ６２２　ＧＴＴＧＴＴＧＡＴＧＴＡＴＧＴＴＡＡＣＡＣ
ＴＡＣＡＴＡＧＴＣＡＴＧＧＴＧＴＧＴｓａＩ ■ ＧＴＴＣＣＡＴＡＡＡＴＡＡＴＧＴＡＣＴＡＡＴＧＴＡ
ＡＴＡＡＧ　　６９０ｃｃ　１ ６９１　　ＡＡＣＴＡＣＴＣＣＧＴＡＧＡＣＧＧＴＡＡ
ＴＡＡＡＡＧＡＧ八八ＧＴＴＴＴＴＴＴＴｒａ　１ ＴＴＴＡＡ　　へへ４ ラムダＣＧＮＩ−２と呼ばれるクローンの一つを制限マ
ツプして、ナピン遺伝子を重なり合う２．７ｋｂのＸｈ
ｏ　Ｉと２．１ｋｂの５ａｌＩとの制限フラグメントに
局在させた。２個のフラグメントをラムダＣＧＮＩ−２
ＤＮＡからのｐＣＧＮ７８９にサブクローンした（ｐＵ
Ｃに基づいたベクターは、合成リンカー−５′ＧＧＡＡ
ＴＴＣＧＴＣＧＡＧＡＧＡＴＣＴＣＴＧＣＡＧＣＴＣＧ
ＡＧＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴ３′−であってポリリン
カー」並ＲＩ、５ａｉｌ、３ｉｒ、Ｐｓｔｌ、Ｘｈｏｌ
、　　ＢａｍＨＴおよび」旦ｄＩＩＩを表わすものによ
って置換される正常なポリリンカーを有するｐＵｃ１１
９と同じである）。ナピンのようなサブクローンの同一
性を配列によって確かめた。全コード領域配列と外延的
な５′上流および３′下流配列を決定した。

ラムダＣＧＮＩ−２ ＮＣＧ−１８６線状　長さ＝　４３２５゜１　　ＣＴＣ
ＧＡＧＧＣＡＧＴＣＡＣＴＡＡＣＡＴＧＡＡＧＴＴＴＧ
ＡＣＧＡＧＧＡＧＣＣＣＨｉｎｄＩＩＩ ＨｈａＩ　　　Ｘｂａｌ ７０　　ＡＣＴＣＴＡＡＴＴＧＡＧＣＣＧＴＧＣＧＣＴ
ＣＴＡＴＣＴＡＧＡＣＣＡＡＴＴＡＧＡＳａｃ！ ｌｕｌ 八ＴＴＧＡＴＧＧＡＧＣＴＣＴＡＡＡＧＧＴＴＧＣＴＧ
ＧＣＴＧＴ　　１３Ｂｄｅ１ １３９　　ＴＴＴＣＴＴＧＴＴＣＡＴＡＴＧＡＴＴＡＡ
ＣＴＴＣＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＴＡＴＡＡ５Ｏ ｄｅｌ ＡＴＡＴＴＣＴＣＴＧＡＡＡＧＴＧＣＴＴＣＴ’ｒＴＴ
ＧＧＣＡＴＡ　　２０７２０８　　ＴＧＴＡＧＧＴＴＧ
ＧＧＣＡＡＡＡＡＣＧＡＧＧＡＡＧＡＴＴＧＣＴＴＣＴ
ＣＡＡＴＴＴＧＧＡＡＧＡＧＧＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＧ
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が精確に一致することによって決定される場合、ＢＥ５
ｃＤＮＡに対応するｍＲＮＡをコードする遺伝子である
。

発現カセットは、ｐＣＧＮ９４４の構成と同様な方法で
以下のようにして、ラムダＣＧＮＩ−２ナピン遺伝子の
５′末端および３′末端から構成された。

ｐｃＧＮ９４０のナピンコード領域の大半は、旦■によ
る消化によって削除し、そして再連結してｐＣＧＮ１８
００を形成した。ｐｃＧＮ１８００からの単一鎖ＤＮＡ
を用いて、合成オリゴヌクレオチド５　’　−ＧＣＴＴ
ＧＴＴＣＧＣＣＡＴＧＧＡＴＡＣＴＴＧＴＧＴＡＴＧ　
ＴＴＣ−３’を用いる土ノ１？上口の変異誘導反応（ニ
ーデルマン（Ａｄｅｌｍａｎ）ら、ＤＮＡ　１９８３年
、２巻、１８３〜１９３頁・）を行った。

このオリゴヌクレオチドは、プロモーター領域とナピン
遺伝子のＡＴＧ開始コドンとの接合点で、ＥｃｏＲＩお
よびＮｃｏ　Ｉ制限部位を挿入した。適切な変異体が、
変異誘導と配列分析を用いて、ｐＣＧＮ１８０１と呼ば
れるオリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーショ
ンによって同定された。

１．７ｋｂプロモーターフラグメントを、ＥｃｏＲＩに
よる部分消化及びＥｃｏＲＩにより切断されたｐＣＧＮ
７８６　（正常なポリリンカーの代わりに上記の合成リ
ンカ−を有するｐＣＧＮ５６６クロラムフエニコールを
ベースとしたベクター）への連結によってｐｃＧＮ１８
０１からサブクローンし、そしてＤＮＡポリポリーゼエ
クレノウフラグメントによりフィルインし、ｐｃＧ８１
８０２を製造した。ラムダＣＧＮＩ−２ナピン遺伝子か
らの３′配列を、Ｘｈｏ　Ｉ　／　Ｈｉｎ　ｄ　ＩＩＩ
テ消化サレすｐＣＧＮ１８０２ニ付加し、Ｘｈｏ　Ｉと
−Ｈ１ｎｄＩＩＩで消化されたｐｃＧＮ９４１に連結す
ることによってカセットを完成した。その得られた発現
力セラ）　ｐｃＧＮ１８０３は、１．７２５ｋｂのナピ
ンプロモーター配列と１．２６５ｋｂのナピン３′配列
を含み、それらの間に非反復クローニング部位Ｓａｌ　
Ｉ　、」しＩＩ、ＰｓｔｌおよびＸｈｏ　Ｉを有してい
た。

ｐｃＧＮＩＢｃｓからＡＣＰ前駆体コード領域を、ｌ■
とＥｃｏＲＩとを用いて二重消化することによって切断
し、５ａｌＩとＥｃｏＲＩによりあらかじめ消化された
クローニングベクターｐＵｃ１８に連結する。

連結されたＤＮＡの適当な一旦エーユ４　（Ｅ、ｃｏｌ
ｉ）宿主中への形質転換、及びｐＵＣベクターのペニシ
リン耐性青色−白色スクリーニング系（ビイラ（Ｖｉｅ
ｉｒａ）およびメッシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）　、Ｇｅ
ｎｅｓ１９８２年、１９巻、２５９〜２６８頁）を用い
るスクリーニングによって、ＡＣＰ−前駆体コード領域
のための停止コドンの下流に配置されたユニーク」■３
部位を含むプラスミドが生成される。」胆３で消化した
後、」旦■リンカ−による連結は、プラスミドを生成し
、こしコード領域は、ＩＩＩ〜Ｐｓｔｌフラグメントと
して切断され、これはｐＣＧＮ１８０３のＰｓｔｌおよ
びＩ１１部位へクローニングされ、そしてＡＣＰ−前駆
体コード領域がｐｃＧＮ１８０３によってコードされる
胚特異的発現情報のナピンプロモーターおよびターミネ
ータ一部分に対して精確に配列される。次に、その得ら
れたキメラ遺伝子を、二πベクター中に導入して、アグ
ロバクテリウムに転位させて、ｐＣＧＮ９４６のホウレ
ン草ＡＣＰキメラ遺伝子を用いたのと同じ条件を用いて
ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ）の
胚軸セグメントと共培養を行う。

本発明によれば、機能的アシル担体タンパク質、詳細に
は植物アシル担体タンパク質をコードする配列が提供さ
れ、そしてこれはアシル担体タンパク質の存在を検出し
、植物および細閉からゲノムまたはｃＤＮＡのいずれの
ライブラリーをもスクリーニングするプローブとして用
いることができ、アシル担体タンパク質遺伝子の存在を
検出する方法に使用するプローブとして用いることがで
きる。

更に、コード配列は、発現構造の調製に用いることもで
き、このコード配列を調節領域が機能する適当な宿主に
おいて発現するための転写および翻訳開始および終結調
節領域と組み合わせることもできる。特に興味深いこと
は、ＡＣＰコード配列を転写開始領域と共に使用して、
植物において機能させ、詳細には、種子に発現するよう
に調節することである。この方法では、種子油の産生を
増進させ、好適には、脂肪酸の組成を調製することがで
きる。

本明細書において述べた総ての出版物および特許出願明
細書は、本発明が関係する当業者の技術水準を示すため
のものである。総ての刊行物および特許出願明細書は、
それぞれの刊行物および特許出願明細書が具体的且つ個
別的に参考のために説明しているのと同じ程度に参考の
ために引用している。

上記説明を、理解を明確にするために例示および実施例
によって幾分詳細に記載したが、特許請求の範囲内で変
更および修正を行うことができることは明らかであろう
。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、植物のアシル担体タンパク質をコードするｃＤＮＡ
   配列。 ２、上記植物がホウレン草である、特許請求の範囲第１
   項記載のｃＤＮＡ配列。 ３、上記植物がブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）である、
   特許請求の範囲第１項記載のｃＤＮＡ配列。 ４、上記ブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）がカペストリス
   （ｃａｐｅｓｔｒｉｓ）である、特許請求の範囲第３項
   記載のｃＤＮＡ。 ５、上記ブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）がナプス（ｎａ
   ｐｕｓ）である、特許請求の範囲第３項記載のｃＤＮＡ
   。 ６、細胞宿主中で機能的な転写および翻訳開始および終
   結調節領域およびその下に結合された植物のアシル担体
   タンパク質をコードする読み取り枠からなるＤＮＡ構造
   体であり、上記調節領域の少なくとも一つが上記読み取
   り枠の野生型領域以外のものであることを特徴とする、
   ＤＮＡ構造体。 ７、上記読取り枠がホウレン草またはブラシカ（Ｂｒａ
   ｓｓｉｃａ）のアシル担体タンパク質をコードする、特
   許請求の範囲第６項記載のＤＮＡ構造体。 ８、上記調節領域が植物宿主中で機能する、特許請求の
   範囲第６項記載のＤＮＡ構造体。 ９、上記転写開始領域を細胞の分化中に調節する、特許
   請求の範囲第８項記載のＤＮＡ構造体。 １０、上記調節が、発生する胚において、転写を提供す
   る、特許請求の範囲第９項記載のＤＮＡ構造体。 １１、上記転写開始調節領域がナピン調節領域である、
   特許請求の範囲第１０項記載のＤＮＡ構造体。 １２、特許請求の範囲第６項〜第１１項のいずれか１項
   記載のＤＮＡ構造体からなるＴｉ−またはＲｉ−プラス
   ミド。 １３、特許請求の範囲第６項〜第１１項のいずれか１項
   記載のＤＮＡ構造体からなる植物細胞。 １４、上記植物細胞が胚細胞および種子の一部である、
   特許請求の範囲第１３項記載の植物細胞。 １５、上記植物がブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物で
   ある、特許請求の範囲第１４項記載の植物細胞。 １６、植物種子油の生成を増進させる方法であって、 植物を苗から種子へ成長させ、（ここで、上記植物の細
   胞が特許請求の範囲第８項記載の構造体からなりそして
   増加した量の植物油を含むその得られた種子を収穫する
   ことを特徴とする方法。 １７、上記植物がブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物で
   ある、特許請求の範囲第１６項記載の方法。 １８、上記転写開始調節領域がナピン領域である、特許
   請求の範囲第１６項または第１７項のいずれか１項記載
   の方法。