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Die vorliegende Erfindung betrifft im allgemeinen
Zelltherapie und Verfahren zur Behandlung von Zellen, um Tumorigenese
(Tumorbildung) zu unterdrücken.
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Die Entwicklung dieser Erfindung erfolgte mit staatlicher
Unterstützung unter der Subventions-Nr. EY05758 mit dem
National Institute of Health und der University of California.
Der Staat besitzt gewisse Rechte an dieser Erfindung.
Stand der Technik
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Ein Schwerpunkt der Krebsforschung ist bisher die Diagnose
und Behandlung des Zustands gewesen. Aufgrund der Fortschritte
in der Kenntnis biochemischer Prozesse auf zellulärer und
subzellulärer Ebene hat sich in den letzten Jahren die
Aufmerksamkeit auf Verfahren nicht nur zur Diagnose und Behandlung
von Krebs, sondern auch zur Auffindung einer Prädisposition
für Krebs in dem Organismus gerichtet.
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In diesen Arbeiten wurde "Krebsunterdrückung" ursprünglich
als ein Verlust an Tumorigenität definiert, der in
Fusionszellen aus Tumorzellen und normalen Fibroblasten, Lymphozyten
oder Keratinozyten zu beobachten war. Man nahm an, daß der
Effekt von dominanten Suppressionsfaktoren in normalen Zellen
vermittelt wurde. Ergebnisse wiesen darauf hin, daß diese
Faktoren zum Teil genetisch waren, da zwischen der Suppression
der Tumorigenität und der Anwesenheit bestimmter Chromosomen
in fusionierten Zellen ein Zusammenhang bestand.
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Eine weitere Bedeutung krebsunterdrückender Gene ergab
sich in Verbindung mit genetischen Untersuchungen über
bestimmte Neoplasmen im Kindesalter und Tumorsyndrome bei
Erwachsenen. Gene, die zur Bildung dieser Tumore beitragen,
scheinen durch Funktionsverlust und nicht wie bei den
klassischen Onkogenen durch Aktivierung krebserregend zu werden. Das
Retinoblastom, ein im Kindesalter auftretender Augenkrebs, hat
sich als prototypisches Beispiel erwiesen. Verbesserte
zytogenetische Analyse und eine Untersuchung von
Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen (RFLPs) deuten darauf hin, daß ein
Retinoblastom möglicherweise auf einen Verlust eines Genortes
zurückzuführen ist, der sich in der Chromosomenbande 13q14
befindet. Bedeutende Fortschritte sind bei der Verwendung von
RB-cDNA und RB-Protein nicht nur bei der Diagnose und bei
Verfahren zur Behandlung von mit RB in Zusammenhang stehenden
Tumoren, sondern auch bei der Aufklärung der
krebsunterdrückenden Funktionen anderer Gene gemacht worden. Dennoch
besteht ein bedeutender Bedarf an geeigneten Methoden zur
therapeutischen Behandlung von Osteosarkomen, Lungenkarzinomen,
Lymphadenomen, Leukämien, die einer Behandlung durch
RB-Modalitäten nicht zugänglich sind.
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In Anbetracht des Obigen wäre es äußerst wünschenswert,
über ein Verfahren zur spezifischen, von RB-Modalitäten
unabhängigen therapeutischen Behandlung für Osteosarkome,
Lungenkarzinome, Lymphadenome, Leukämien zu verfügen. Überdies wäre
es äußerst wünschenswert, über solche Verfahren zu verfügen,
die in Verbindung mit RB-cDNA und RB-Proteinprodukt zur
Behandlung verschiedener Tumore verwendet werden könnten.
Natürlich wäre es äußerst wünschenswert, über ein solches
therapeutisches Produkt zu verfügen, das in gereinigtem Zustand
hergestellt werden könnte und auf eine zuverlässige Weise
einer defektiven Zelle leicht und wirksam zugeführt werden
könnte.
Offenbarung der Erfindung
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Es ist ein Hauptziel dieser Erfindung, allgemein
zuverlässige und spezifische therapeutische Verfahren und Produkte
bereitzustellen, die zur kontrollierten Krebsunterdrückung
brauchbar sind. Es ist ein weiteres Ziel dieser Erfindung,
Produkte und Verfahren zur kontrollierten Krebsunterdrückung
bereitzustellen, die spezifisch für die Suppression und
Vernichtung von Krebstumoren sind und bei denen biotechnologische
Verfahren und Produkte zur Anwendung kommen.
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Es ist ein noch weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung,
eine pharmazeutische Zusammensetzung zur therapeutischen
Behandlung von Krebs bereitzustellen, wobei die Zusammensetzung
auf der zellulären und intrazellulären Ebene wirkt.
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Es ist ein noch anderes Ziel der vorliegenden Erfindung,
eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von
Zuständen, die durch defektive, mutierte oder fehlende
Krebssuppressorgene verursacht werden, bereitzustellen, wobei der
Wirkstoff der Zusammensetzung ein natürliches oder synthetisch
hergestelltes Produkt ist.
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Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur
Verwendung von p53-cDNA und p53-Genprodukten zur Suppression des
neoplastischen Phänotyps bereit.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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Die oben erwähnten und weitere Ziele und Merkmale dieser
Erfindung sowie die Art und Weise ihrer Erreichung werden
ersichtlich werden und die Erfindung selbst wird am besten
verständlich werden durch Bezugnahme auf die folgende
Beschreibung einer Ausführungsform der Erfindung in Verbindung mit den
beigefügten Zeichnungen, von denen:
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FIG. 1A eine schematische Darstellung dreier humaner p53-
cDNAs ist;
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FIG. 1B eine schematische Darstellung der genomischen
Organisation dreier p53-Retroviren ist;
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FIG. 2A ein Chromatogramm ist, das die Expression von
humanen p53-Proteinen in virusproduzierenden Zellinien
darstellt;
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FIG. 2B ein Chromatogramm ist, das die Bestimmung der
Halbwertszeit von humanem p53 in virusproduzierenden Linien
durch Pulse-Chase-Markierungsexperimente darstellt;
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FIG. 3 die Expression von humanen p53-Proteinen in
virusinfizierten Saos-2-Zellen darstellt;
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FIG. 4 ein Chromatogramm der p53B/T-Komplexbildung in
Saos-2-Zellen ist;
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FIG. 5 die Morphologie in einer Kultur von
Saos-2-Stammzellen darstellt;
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FIG. 6A eine schematische Darstellung der Verdopplungszeit
von Saos-2-Stammzellen und virusinfizierten Klonen ist;
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FIG. 6B eine schematische Darstellung der Sättigungsdichte
von Saos-2-Stamm- und EN-Klonen ist;
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Fig. 7A ein Southern-Blot ist, der das Vorhandensein einer
einmalig integrierten Vp53E-Neo-Sequenz in p53EN-1-Zellen
zeigt; und
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FIG. 7B ein Southern-Blot ist, der einmalig vorkommende,
unabhängig integrierte Vp53B-Hygro-Sequenzen in
p53EN-BH-Klonen zeigt.
Genaue Beschreibung der Figuren
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In FIG. 1A sind drei humane p53-cDNAs schematisch
dargestellt. Die von Lam und Crawford, Mol. Cell. Biol. 6, 1379-
1385 (1986) beschriebene Sequenz, hier als p53L bezeichnet,
wurde durch Sequenzierung von Klonen humaner fötaler Leber-
cDNA und genomischer DNA-Banken gewonnen und wird als Wildtyp
betrachtet. p53B ist ein c-DNA-Klon, der durch die RT-PCR-
Methode, die in einer Klonierung von Wildtyp-p53-cDNA (p53B-
cDNA) resultierte, folgendermaßen aus fötaler Gehirn-RNA
gewonnen wurde: Etwa 15 µg fötaler Gehirn-RNA wurden mit 1,5 g
Oligo(dT)-Primer und 60 Einheiten reverser Transkriptase des
aviären Myeloblastenleukämievirus in cDNA-Puffer (50 mM Tris-
HCl, pH 8,0, 80 mM KCl, 5 mM MgCl&sub2;, jeweils 1 mM dATP, dGTP,
dTTP und dCTP) gemischt. Das Reaktionsgemisch wurde 90 Minuten
bei 42ºC inkubiert. Nach der Reaktion wurde RNA mit 0,5N NaOH
abgebaut, und es wurde einzelsträngige cDNA mit Ethanol
ausgefällt. Mit einem Zehntel der cDNA, 100 ng jedes
Oligonucleotidprimers
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und 5 Einheiten Taq-Polymerase
in PCR-Puffer (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 1,5 mM MgCl&sub2;
und 0,001% Gelatine) wurden 40 Zyklen PCR-Amplifikation in
einem programmierbaren Heizblock (Ericomp, San Diego, CA)
durchgeführt. Jeder Zyklus umfaßte eine 1-minütige
Denaturierung bei 93ºC, 80 Sekunden erneutes Annealen bei 62ºC und eine
3-minütige Primer-Verlängerung bei 72ºC. Die PCR-Produkte
wurden mit Phenol extrahiert und mit Ethanol ausgefällt. Das
Präzipitat wurde in H&sub2;O gelöst und mit Restriktionsenzymen
(Hind III und Sma I) verdaut. Das p53-cDNA-Fragment wurde in
einen Virusvektor subkloniert, um Vp53B-Neo zu bilden.
Subkloniertes p53B wurde unter Verwendung des
Didesoxy-Kettenabbruchverfahrens (F. Sanger, S. Nicklen, A.R. Coulsen, Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 5463 (1077)) sequenziert.
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Die hergeleiteten Aminosäuresequenzen von p53B und p53L
waren trotz zweier stiller Nucleotidsubstitutionen, wie sie
angegeben sind, identisch. p53E ist ein von E. Harlow zur
Verfügung gestellter cDNA-Klon, der an den Positionen 72 und 273
bezüglich p53L oder p53B Aminosäuresubstitutionen aufweist.
Der Arg/Pro&sup7;²-Austausch repräsentiert einen häufigen
Aminosäurepolymorphismus ohne bekannte funktionelle Bedeutung.
Andererseits kommt der Austausch von Arg gegen His an Position
273 ausschließlich in Tumorzellen vor und wird als Mutation
angesehen. Wie viele andere p53-Mutationen liegt Arg²&sup7;³ T
His in einer von zwei Regionen, die für die Bindung an das
SV40-T-Antigen erforderlich sind (schraffierte Kästchen).
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In FIG. 1B ist die genomische Organisation von drei p53-
Retroviren schematisch dargestellt. Vp53E-Neo wurde durch
Inserieren eines p53E enthaltenden 1,5 kb großen Hind III-Sma I-
DNA-Fragments in das Plasmid pLRbRNL konstruiert, wobei RB-
cDNA ersetzt wurde. Um Vp53B-Neo zu bilden, wurde eine mittels
RT-PCR gewonnene p53B-DNA von 1,35 kb Größe direkt in den
pLRbRNL-Vektor inseriert. Das Insert in einem Klon wurde
vollständig sequenziert, wie in Fig. 1A schematisch dargestellt.
Vp53B-Hygro wurde durch Insertion eines Hind
III-DNA-Fragments, das p53B und den RSV-Promotor enthielt, in das Plasmid
477 (ein freundlicherweise von W. Hammerschmidt und B. Sugden
zur Verfügung gestellter MuLV-Hygro-Vektor) konstruiert. Diese
Konstrukte wurden anschließend verwendet, um unter Anwendung
herkömmlicher Techniken die entsprechenden Virus-Stammkulturen
zu produzieren. Angegeben sind einige bedeutende, für die
Konstruktion wichtige Restriktionsorte. H = Hind III, R = Eco RI.
S = Sma I, B = Bam HI, C = Cla I.
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FIG. 2A ist ein Chromatogramm, das murine PA12-Zellen
(Bahn m1), humane WERI-Rb27-Retinoblastomzellen (Bahn m2) und
Vp53EN-, Vp53BN- oder Vp53BH-produzierende PA12-Zellen
darstellt, die mit ³&sup5;S-Methionin metabolisch markiert waren.
Zellysate wurden unter Anwendung herkömmlicher Methoden mit
dem Anti-p53-Antikörper PAb421 immunpräzipitiert. Die
Immunpräzipitate wurden mittels Elektrophorese auf einem 8,5%igen
SDS-Polyacrylamidgel (SDS-PAGE) aufgetrennt und
autoradiographiert. Die Marker-Bahnen m1 und m2 zeigen endogenes murines
p53 (Mp53) und beide polymorphen Formen von humanem p53
(Hp53). Die Pfeile weisen auf humanes p53B-Protein (schwarzer
Pfeil) und p53E-Protein (weißer Pfeil) in Mäusezellen hin.
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FIG. 2B zeigt die Bestimmung der Halbwertszeit von humanem
p53 in virusproduzierenden Linien durch
Pulse-Chase-Markierungsexperimente. p53E (Streifen a) oder p53B (Streifen b & c,
die zwei unabhängige Klone repräsentieren) exprimierende PA12-
Zellen wurden 60 Minuten lang mit 0,25 mCi/ml ³&sup5;S-Methionin
markiert, gefolgt von einem 1000-fachen Überschuß an
unmarkiertem Methionin. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden
Zellen für die oben beschriebene Immunpräzipitation von p53-
Protein mit PAb421 geerntet. Die Halbwertszeit von p53B betrug
20-30 Minuten, während die von p53E 4-5 Stunden war.
Markerbahnen m1 und m2 und schwarze und weiße Pfeile entsprechen
denen in FIG. 2A.
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FIG. 3 ist ein Chromatogramm, das die Expression von
humanen p53-Proteinen in virusinfizierten Saos-2-Zellen
darstellt. Saos-2-Zellen (Bahn 1 und 7) wurden mit Vp53E-Neo,
Vp53B-Neo oder Vp53B-Hygro infiziert, um jeweils p53EN-Klone
(Bahn 2-6), p53BN-Klone (Bahn 8-10) oder p53BH-Klone (Bahn 11
und 12) zu erzeugen. Saos-2-Zellen wurden auch mit Vp53E-Neo
und Vp53B-Hygro doppeltinfiziert, um p53EN-BH-Klone (Bahn 13-
15) zu erzeugen. Eine Zufallsauswahl von Klonen und WERI-Rb27-
Zellen (Bahn M) wurden mit ³&sup5;S-Methionin markiert und wie
bezüglich FIG. 2A beschrieben mit PAb421 immunpräzipitiert. Die
Pfeile kennzeichnen p53B (schwarze Pfeile) und p53E (weiße
Pfeile).
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FIG. 4 zeigt p53B/T-Komplexbildung in Saos-2-Zellen. Die
Klone p53BN-1 (Bahn 1 und 2), p53BH-1 (Bahn 3 und 4), p53EN-1-
BH-1 (Bahn 5 und 6) sowie p53EN-1-BH-2 (Bahn 7 und 8) wurden
mittels herkömmlicher Verfahren mit dem Plasmid pRSV40T
transfiziert und wurden 60 Stunden später mit ³&sup5;S-Methionin
metabolisch markiert. Zellysate wurden mit PAb421 (Bahn M, 1, 3, 5
und 7) oder mit PAb419, einem monoklonalen Antikörper gegen
das SV40T-Antigen, (Bahn 2, 4, 6 und 8) immunpräzipitiert.
PAb419 copräzipitierte nur p53B in Zellen, die sowohl p53B als
auch p53E exprimierten.
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FIG. 5 ist eine Photographie, welche die Morphologie in
einer Kultur von Saos-2-Stammzellen und entsprechenden
virusinfizierten Klonen bei 100-facher Vergrößerung darstellt. In
Reihe A sind exponentiell wachsende Zellen gezeigt, während in
Reihe B Zellen bei hoher Populationsdichte gezeigt werden.
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FIG. 6A und 6B sind schematische Darstellungen der
Auswirkungen von p53-Expression in Saos-2-Zellen auf das Wachstum.
In FIG. 6A sind die Verdopplungszeiten von Saos-2-Stammzellen
und von virusinfizierten Klonen in einem exponentiellen
Wachstumsstadium dargestellt. Gleiche Zahlen jedes Zelltyps wurden
in 60-mm-Kulturschalen geimpft; Zellen von zwei Schalen wurden
trypsiniert und 4 Tage lang in täglichen Abständen gezählt.
Verdopplungszeiten wurden aus Geraden hergeleitet, die dem
Logarithmus von Zellenzahlen angelegt worden waren. Fig. 6B
zeigt die Sättigungsdichte von Saos-2-Stamm- und EN-Klonen.
Gleiche Zellenzahlen (1 x 10&sup5;) wurden in 60-mm-Kulturschalen
geimpft; Zellen von zwei Schalen wurden trypsiniert und zu den
angegebenen Zeitpunkten gezählt. Die auf getragenen Punkte sind
die durchschnittlichen Zellenzahlen von
Schalen-Doppelansätzen. Die Sättigungsdichte von p53E exprimierenden Zellen
war 4- bis 5-mal größer als die der Stammzellen.
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FIG. 7 ist ein Southern-Blot von p53EN-BH-Zellen, die eine
Vp53E-Neo-Sequenz und eine Vp53B-Hygro-Sequenz beherbergten.
Aus Saos-2-Stammzellen extrahierte genomische DNA (10 µg) und
die angegebenen Klone wurden mit Eco RI verdaut und in
0,7%igen Agarosegelen aufgetrennt. Es wurde ein Southern-
Transfer durchgeführt, und die Nylonmembranen wurden unter
Anwendung von Standard-Verfahren mit einer ³²P-markierten Neo-
DNA-Sonde (Streifen A) oder Hygro-DNA-Sonde (Streifen B)
hybridisiert. In jedem Klon ist mit jeder Sonde ein einmalig
vorkommendes Verbindungsfragment zu erkennen, was auf einmalig
integrierte Sequenzen jedes Virus hinweist.
Beste Art und Weise, die Erfindung durchzuführen
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Tumorsuppressorgene sind als Gene definiert, bei welchen
Mutationen, die zu einem Funktionsverlust führen, onkogen
sind. Man weiß, daß Wildtyp-Allele solcher Gene eine
Onkogenese verhindern oder unterdrücken können. Das Retinoblastomgen
(RB) ist der Prototyp dieser Klasse. In Retinoblastomzellen
sind ausnahmslos beide Allele dieses Gens mutiert, und RB-
Mutationen finden sich auch in einer Gruppe anderer humaner
Neoplasmen, einschließlich Osteosarkomen,
Weichteilgewebesarkomen und Karzinomen von Brust, Lunge, Blase und Prostata. Die
Einführung einer Wildtyp-Sequenz von RB in Retinoblastomzellen
unterdrückte deren tumorigene Eigenschaften in Nacktmäusen und
lieferte den direkten Beweis für eine Tumorsuppression durch
ein einzelnes Gen. Das Wildtyp-RB-Gen wurde auch in humane
Prostatakarzinomzellen eingeführt, die ein endogenes mutiertes
RB-Protein enthielten (Science 247, 712-715 (1990)). Wiederum
unterdrückte die Expression des exogenen Gens die
Tumorigenität dieser Zellen, was bedeutet, daß das Wildtyp-RB-Protein
gegenüber der mutierten Form phänotypisch dominant war. Diese
Ergebnisse stützen ein allgemeines Modell für die
Eigenschaften von Tumorsuppressorgenen, das aus der "Two-hit"-Hypothese
von Knudson und den Zellhybrid-Untersuchungen von Harris et
al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 68, 820-823 (1971); Nature
223, 363-368 (1969)) entstanden ist. Die Nucleotid-Sequenz des
p53-Gens ist in Tabelle 3 dargestellt.
Tabelle 3
Tabelle 4
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p53 (Tabelle 4) wurde ursprünglich als ein Säugetier-
Zellprotein identifiziert, das an das SV40T-Antigen bindet,
eine Eigenschaft, die auch vom RB-Protein geteilt wird.
Deletionen oder umordnungen des für p53 codierenden murinen oder
humanen Gens wurden bei Friend-Virus-induzierten murinen
Erythroleukämien und bei humanen Osteosarkomen, Lungenkarzinomen,
Lymphadenomen und Leukämien gefunden. Andererseits
exprimierten viele humane Brust-, Lungen- und Dickdarmkarzinome hohe
Pegel an von der gewöhnlichen Form abweichenden p53-Spezies
mit deutlich verlängerten Halbwertszeiten, die auf bestimmte
Punkt-Mutationen in dem p53-Gen zurückzuführen waren (Genes
Devel. 4, 1-8 (1990)). Diese Beobachtungen weisen darauf hin,
daß Mutation von p53 zu humaner Onkogenese beiträgt. p53 wurde
ursprünglich für ein Onkogen gehalten, da bekannt war, daß es
gemeinsam mit einem aktivierten ras-Gen primäre
Rattenembryofibroblasten transformieren konnte. Jedoch ließ die
Beobachtung von p53-Deletionen und Punktmutationen, die über
verschiedene Exons verstreut vorkamen, auch vermuten, daß p53 ein
Tumorsuppressorgen sein könnte, d.h. ein Gen, das durch
Mutation inaktiviert worden war. Tatsächlich stellten Finlay et
al. und Eliyahu et al. (Cell 57, 1083-1093 (1989); Proc. Natl.
Acad. Sci U.S.A. 86, 8763-8767 (1989)) fest, daß
Cotransfektion muriner Wildtyp-p53-DNA die Transformationseffizienz
transfizierter Onkogene in Rattenembryofibroblasten
herabsetzen konnte, während mutierte p53-DNA eine solche
Transformation steigerte. Es wurde angenommen, daß der dominante
transformierende Effekt auf eine "dominante negative" Wirkung von
mutiertem p53-Protein zurückzuführen war, das irgendwie die
wachstumshemmende Funktion von Wildtyp-p53-Protein in Zellen
blockierte. Dieses Modell schlug vor, daß die relative Menge
von mutiertem p53 zu Wildtyp-p53 den transformierten Phänotyp
bestimmen konnte, jedoch konnte in diesen
Transfektionsuntersuchungen die Gen-Dosis nicht genau kontrolliert werden.
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Aufgrund solcher technischer Fragen sowie auch wegen der
Möglichkeit artspezifischer Unterschiede in der p53-Funktion
und der unsicheren Bedeutung von transformierten tierischen
Zellen für menschliche Tumorbildung wurde beschlossen, daß die
biologischen Eigenschaften von p53 in dem menschlichen System
erneut beurteilt werden sollten. Man war sich einig, daß eine
ideale Wirtszelle für diese Untersuchungen die experimentelle
Manipulation einmalig im Genom vorkommender Sequenzen von
mutierten oder Wildtyp-p53-Allelen gestatten würde. Jedoch
enthalten die meisten kultivierten humanen Zellen endogene und
möglicherweise mutierte p53-Allele, die einer externen
Kontrolle nicht zugänglich sind. Die humane Osteosarkom-Zellinie
Saos-2 wurde deshalb gewählt, weil sie infolge einer
vollständigen Deletion des p53-Gens kein endogenes p53 aufweist.
Zur Einführung von mutiertem p53 und/oder Wildtyp-p53 unter
der Kontrolle des LTR-Promotors wurden rekombinante Retroviren
benutzt, die von dem "Moloney murine leukemia virus" (Mo-MuLV)
abstammten. Nach Infektion und Selektion isolierte Zellklone
trugen nur ein einziges integriertes Provirus jeden Typs, und
es wurden multiple Klone analysiert, um Positionseffekte
auszuschließen. Eine umfassende Beurteilung biologischer
Eigenschaften dieser Klone schloß Morphologie, Wachstumsraten und
Sättigungsdichte in Kultur, Koloniebildung in Weichagar und
Tumorigenität in Nacktmäusen ein.
Herstellung rekombinanter Retroviren, die mutiertes p53 oder
Wildtyp-p53 enthalten
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Als Bezugsstandard für humanes Wildtyp-p53 wurde die
genomische DNA-Sequenz von Lamb und Crawford (Mol. Cell. Biol.
6, 1379-1385 (1986)) verwendet. Potentielle Wildtyp-p53-DNA
wurde mittels des RT-PCR-Verfahrens aus fötaler Gehirn-RNA
isoliert und in ein Plasmid kloniert. Beim Klonieren von
Wildtyp-p53-cDNA (p53B) wurden etwa 5 µg fötale Gehirn-RNA mit
1,5 µg Oligo(dT)-Primer und 60 Einheiten reverser
Transkriptase des aviären Myeloblastenleukämievirus in cDNA-Puffer (50 mM
Tris-HCl, pH 8,0, 80 mM KCl, 5 mM MgCl&sub2;, jeweils 1 mM dATP,
dGTP, dTTP und dCTP) gemischt. Das Reaktionsgemisch wurde 90
Minuten bei 42ºC inkubiert. Nach der Reaktion wurde RNA mit
0,5N NaOH abgebaut, und es wurde einzelsträngige cDNA mit
Ethanol ausgefällt. Mit einem Zehntel der cDNA, 100 ng jedes
Oligonucleotidprimers
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und 5 Einheiten
Taq-Polymerase in PCR-Puffer (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 1,5 mM
MgCl&sub2; und 0,001% Gelatine) wurden 40 Zyklen PCR-Amplifikation
in einem programmierbaren Heizblock (Ericomp, San Diego, CA)
durchgeführt. Jeder Zyklus umfaßte eine 1-minütige
Denaturierung bei 93ºC, 80 Sekunden erneutes Annealen bei 62ºC und eine
3-minütige Primer-Verlängerung bei 72ºC. Die PCR-Produkte
wurden mit Phenol extrahiert und mit Ethanol ausgefällt. Das
Präzipitat wurde in H&sub2;O gelöst und mit Restriktionsenzymen
(Hind III und Sma I) verdaut. Das p53-cDNA-Fragment wurde in
einen Virusvektor subkloniert, um Vp53B-Neo zu bilden.
Subkloniertes p53B wurde unter Verwendung des
Didesoxy-Kettenabbruchverfahrens (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 5463
(1077)) sequenziert.
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Das Insert in einem Klon (bezeichnet mit p53B) wurde
vollständig sequenziert ( 1300 bp) und offenbarte trotz zweier
stiller Nucleotidaustäusche (FIG. 1A) eine vom Wildtyp
abgeleitete Aminosäuresequenz. Ein anderer p53-cDNA-Klon (p32E),
der aus der Plattenepithelkarzinomzellinie A431 isoliert
worden war, wurde ebenfalls sequenziert, und es hat sich gezeigt,
daß er eine Punktmutation am Codon 273 enthielt, die Arg durch
His ersetzte (FIG. 1A). Dies ist eine funktionell bedeutsame
Mutation, die auch in p53 von zwei anderen Tumorzellinien
festgestellt worden ist. Zudem codierte ein neutraler
Sequenzpolymorphismus in Codon 72 (FIG. 1A) entweder für ein Arg
(p53B) oder ein Pro (p53E). Dieser häufige
Aminosäurepolymorphismus, der ohne bekannte funktionelle Bedeutung ist,
resultierte in einer schnelleren Wanderung von p53B-Protein als
p53E-Protein bei einer SDS-PAGE und wurde daher zur
Unterscheidung dieser Proteine genutzt, wenn diese in derselben
Zelle coexprimiert wurden.
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p53E und p53B wurden dann in einen auf Mo-MuLV basierenden
retroviralen Vektor inseriert, der neo als selektierbares
Markergen enthielt, um jeweils die viralen Genome Vp53E-Neo und
Vp53B-Neo zu bilden (FIG. 1B). Um eine Doppelsubstitution zu
erleichtern, wurde außerdem Vp53B-Hygro durch Inserieren von
p53B in einen ähnlichen Vektor hergestellt, der das Gen
enthielt, von dem bekannt ist, daß es Hygromycinresistenz
verleiht. Unter Verwendung herkömmlicher Verfahren wurden
Stammkulturen von Vp53E-Neo-, Vp53B-Neo- und Vp53B-Hygro-Viren mit
jeweiligen Titern von etwa 1 x 10&sup5;, 2 x 10&sup4; und 1 x 10&sup5;
hergestellt. Die Expression von p53-Proteinen aus den Viren wurde
zunächst in der murinen, von NIH3T3 abstammenden
Verpackungslinie
PA12 bewertet, die zur Virusproduktion verwendet wurde.
Die humanen p53-Proteine, mutiert und Wildtyp, wurden in ihren
jeweiligen virusproduzierenden Zellen mit dem erwarteten
Unterschied in der Wanderung bei SDS-PAGE (FIG. 2A)
nachgewiesen. Da in kultivierten Zellen häufiger eine spontane Mutation
von p53 vorkommen kann, wurden zwei zusätzliche biochemische
Eigenschaften dieser p53-Proteine untersucht. Diese waren ihre
zelluläre Halbwertszeit und ihre Fähigkeit, an das T-Antigen
zu binden. Das p53B-Protein besaß eine Halbwertszeit von 20-30
Minuten, verglichen mit 4 bis 5 Stunden beim p53E-Protein
(FIG. 2B), was mit den veröffentlichten Berichten über
Halbwertszeiten von Wildtyp- und mutierten p53-Proteinen in
Einklang steht. Wenn virusproduzierende Zellen mit einem Plasmid
transfiziert wurden, das große Mengen an SV40T-Antigen
exprimierte, und Lysate mit Anti-p53- oder Anti-T-Antikörpern
immunpräzipitiert wurden, wurde das T-Antigen mit dem p53B-
Protein copräzipitiert, jedoch nicht mit dem p53E-Protein, was
darauf hinweist, daß nur das p53B-Protein an T binden konnte.
Zusammengenommen ließen diese Ergebnisse darauf schließen, daß
die p53B enthaltenden Viren Wildtyp-p53 und die p53E
enthaltenden Viren mutiertes p53 exprimierten.
Expression von exogenem p53 in Osteosarkomzellen
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Die Osteosarkomzellinie Saos-2, die aufgrund einer
Deletion des p53-Gens kein endogenes p53 enthält, bietet einen
sauberen Hintergrund für Funktionsuntersuchungen von p53. In
vorausgehenden Experimenten zeigten Saos-2-Zellen, die mit
Stammviren infiziert worden waren, welche nur Neomycin- oder
Hygromycinresistenzgene enthielten, keine Veränderungen in der
Morphologie und Wachstumsrate im Vergleich zu nichtinfizierten
Zellen, was darauf hindeutete, daß eine Selektion durch ein
Arzneimittel keinen nennenswerten Einfluß auf deren
neoplastische Eigenschaften hatte. Saos-2-Zellen, die mit
vergleichbaren Titern an entweder Vp53E-Neo, Vp53B-Neo oder Vp53B-Hygro
in Gegenwart des passenden selektierenden Mittels infiziert
worden waren, ergaben gleiche Zahlen arzneimittelresistenter
Kolonien. Die meisten Kolonien konnten einzeln zu
Massenkulturen vermehrt werden, mit der bemerkenswerten Beobachtung, daß
Vp53B-infizierte Zellen viel langsamer wuchsen als Vp53E-
infizierte Zellen. Vp53E-infizierte Klone exprimierten
einheitlich hohe Pegel an p53E-Protein (FIG. 3A). Von 30
untersuchten Vp53B-infizierten Klonen exprimierten etwa 80%
nachweisbares p53B-Protein (FIG. 3B). Jeweils zwei Vp53E-Neo- und
Vp53B-Hygro-Klone wurden zufällig für eine zweite Infektion
durch das andere Virus ausgewählt, und doppeltinfizierte Klone
wurden wie oben isoliert und vermehrt. Diese Klone
coexprimierten sowohl das p53E- als auch das p53B-Protein (FIG. 3C).
Um wiederum nachzuweisen, daß das p53B-Protein in diesen
Zellen nicht sekundär mutiert war, wurden p53B exprimierende
Klone mit dem 5V40-Antigen-Plasmid transfiziert und Lysate wie
oben beschrieben immunpräzipitiert (FIG. 4). Der Anti-p53-
Antikörper copräzipitierte T in jedem Klon, jedoch
copräzipitierte der Anti-T-Antikörper sogar in Zellen, die sowohl p53B
als auch p53E exprimierten, nur p53B. Die Halbwertszeit von
p53B in Saos-2 wurde ebenfalls gemessen und entsprach
derjenigen von p53B in PA12-Zellen. Diese Daten stützen wiederum die
Ansicht, daß Vp53B-infizierte Saos-2-Klone das Wildtyp-p53
exprimierten.
Mutiertes p53 verlieh Saos-2-Zellen in Kultur einen begrenzten
Wachstumsvorteil.
-
Fünf zufällig ausgewählte Klone, die das p53E-Protein
stabil exprimierten (p53EN-1 bis 5), wurden hinsichtlich
Morphologie (FIG. 5), Wachstumsrate (wie Verdopplungszeit, FIG. 6A),
Sättigungsdichte (FIG. 6B), Weichagarkoloniebildung und
Tumorigenität in Nacktmäusen mit Stammzellen verglichen. In
Tabelle 1 und 2 sind jeweils die Ergebnisse der
Weichagarkoloniebildung und Tumorigenität in Nacktmäusen aufgeführt.
TABELLE 1
Weichagarkoloniebildung von
p53-virusinfizierten Saos-2-Zellen
virusinfizierte Zellen
eingeimpfte Zellenzahl Koloniezahlen
p53-Expression
Stammzellen
keine
mutiert
Wildtyp
mutiert/Wildtyp
TABELLE 2
Tumorigenität von p53-virusinfizierten Saos-2-Zellen
virusinfizierte Zellen
Zahl d. Mäuse mit Tumor
Zahl d. injizierten Mäuse
p53-Expression
Stammzellen
keine
mutiert
Wildtyp
mutiert/Wildtyp
-
Ein Unterschied in der Morphologie war nur unter
Bedingungen dicht gedrängter Zellen zu beobachten, wo Zellen der EN-
Klone weit kleiner und stärker lichtbrechend waren als die
Stammzellen (Fig. 5B). Entsprechend war die Sättigungsdichte
der ersteren 4- 5-fach größer als die von Stammzellen (FIG.
6B). Dieser relative Wachstumsvorteil war trotz gleicher
Verdopplungszeiten, wie sie unter "dünnen" Wachstumsbedingungen
(FIG. 6A) gemessen wurden, zu erkennen. Vier EN-Klone und
Stammzellen zeigten ein ähnliches Koloniebildungsvermögen auf
Weichagar (Tabelle 1) und die gleiche Tumorigenität in
Nacktmäusen (Tabelle 2). Ein Klon, p53EN-1, wies in beiderlei
Hinsicht merklich erhöhte Fähigkeiten auf; insbesondere bildete
er ab einer so geringen Menge injizierter Zellen wie 5 x 10&sup5;
zuverlässig große Tumore. Diese Diskrepanz wurde als innerhalb
des Bereichs klonaler Variabilität liegend angesehen, wie sie
unter Tumorzellen zu erwarten ist. Insgesamt deuteten diese
Ergebnisse darauf hin, daß mutiertes p53 in Abwesenheit von
Wildtyp-p53 so wirkte, daß es Saos-2-Zellen in Kultur einen
begrenzten Wachstumsvorteil (eine höhere Sättigungsdichte)
verlieh. In vielen anderen Aspekten des neoplastischen
Phänotyps entsprach die Anwesenheit von punktmutiertem p53 im
wesentlichen der völligen Abwesenheit von p53.
Wildtyp-p53 unterdrückte die neoplastischen Eigenschaften von
Saos-2-Zellen.
-
Im Vergleich zu Saos-2-Stammzellen waren p53B
exprimierende Klone ausnahmslos vergrößert und abgeflacht und wiesen
längere Verdopplungszeiten in Kultur von etwa 70 Stunden statt
der 30-36 Stunden bei Stammzellen und EN-Zellen auf (FIG. 6A).
Bemerkenswerterweise war das Koloniebildungsvermögen auf
Weichagar unter die Nachweisschwelle einer einzigen Kolonie
gesunken, während Stammzellen und EN-Klone unter den gleichen
Bedingungen Hunderte von Kolonien bildeten (Tabelle 1).
Injektion von jeweils 1 x 10&sup7; Zellen der sieben p53B exprimierenden
Klone in die Flanken von Nacktmäusen führte zu keiner
Tumorbildung nach 8-10 Wochen, obwohl die gleiche Zahl an
Stammzellen oder p53E exprimierenden Zellen in allen
gegenüberliegenden Flanken (Tabelle 2) Tumore bildete. Diese Ergebnisse
ließen sich nicht durch einen besonderen Effekt der viralen
Infektion und Selektion erklären, da ein Klon, Vp53BN-R, der
von Vp53B-Neo-infizierten Zellen abstammte, bei dem jedoch
eine nachweisbare Expression von p53B fehlte, einen Phänotyp
besaß, der von Stammzellen nicht zu unterscheiden war (Tabelle
1 und 2). Die 50%ige Verringerung der Wachstumsrate
kultivierter Saos-2-Zellen durch p53B reichte nicht aus, den völligen
Verlust der Tumorigenität und Weichagarkoloniebildung zu
erklären, was bedeutete, daß Wildtyp-p53 den neoplastischen
Phänotyp dieser Zellen spezifisch unterdrückte. Diese
Ergebnisse ließen darauf schließen, daß der Verlust von Wildtyp-p53
ein wesentliches Ereignis bei der Bildung dieser Tumorlinie
und - weitergefaßt - anderer Osteosarkome mit mutierten
endogenen p53-Genen war.
Wildtyp-p53 war gegenüber mutiertem p53 in einer Zweiallel-
Konfiguration dominant.
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Da sowohl mutierte als auch Wildtyp-p53-Proteine in Saos-
2-Zellen offenbar aktiv waren, war es von Interesse, zu
bestimmen, ob beide Aktivitäten gleichzeitig coexprimiert werden
konnten, ob sie sich gegenseitig aufhoben oder ob eine
Aktivität deutlich über die andere dominant war. Die Konfiguration
von einem Wildtyp-Allel und einem mutierten Allel war von
höchster Relevanz für die natürliche Tumorbildung beim
Menschen, da dies ein notwendiger Zwischenschritt auf dem Weg zum
völligen Verlust von Wildtyp-p53 ist. Die Infektion zweier
verschiedener p53E exprimierender Klone mit Vp53B-Hygro ergab
22 hygromycinresistente Klone, von denen 15 sowohl p53B als
auch p53E coexprimierten. Um die in diesen Klonen vorhandene
Zahl der integrierten Sequenzen jedes Virus zu bestimmen,
wurde die genomische DNA von drei Klonen, die von p53EN-1-Zellen
stammten, die mit Vp53B-Hygro infiziert worden waren, durch
Southern-Blotting (FIG. 7) analysiert. Hybridisierung mit Neo
als Sonde zeigte in allen drei Klonen ein einziges Fragment,
gewöhnlich ein Verbindungsfragment, was ein Hinweis auf das
Vorhandensein einer einmalig integrierten Sequenz von Vp53E-
Neo in p53EN-1-Zellen ist (FIG. 7A). Hybridisierung mit Hygro
zeigte ein einziges, einmaliges Verbindungsfragment in jedem
Klon, was auf das Vorhandensein einmalig vorkommender,
unabhängig integrierter Vp53B-Hygro-Sequenzen in p53EN-BH-Klonen
hinweist (FIG. 7B). Einmalige Integrationen wurden erwartet,
beruhend auf der vorherigen Verwendung eines ähnlichen
rekombinanten Retrovirus mit vergleichbaren Titern. Diese
Ergebnisse bestätigten, daß p53EN-BH-Klone tatsächlich eine
integrierte Sequenz eines jeden Virus enthielten und daß beide exogenen
p53-Gene exprimiert wurden (FIG. 3). Durch Merkmale der
Morphologie, Wachstumsrate, Sättigungsdichte,
Weichagarkoloniebildung und Tumorigenität in Nacktmäusen waren
doppeltsubstituierte Klone von Klonen, die nur p53B exprimierten, nicht zu
unterscheiden (FIG. 5 und 6, Tabelle 1 und 2). Zellen, die
durch Infektion in der anderen Reihenfolge erhalten worden
waren, d.h. mit Vp53E-Neo infizierte p53B exprimierende
Zellen, besaßen denselben Phänotyp. Obwohl das Wildtyp-p53 in
diesen Zellen in etwa 10-fach geringeren Mengen als das
mutierte p53 vorlag (FIG. 3), war eine völlige Dominanz von
Wildtyp-p53-Aktivität zu beobachten. Diese Ergebnisse zeigen,
daß p53 erst nach einem Verlust beider Wildtyp-Allele zur
Tumorbildung beitragen kann. Sie zeigen außerdern, daß die
Wiederherstellung von Wildtyp-p53 in Tumorzellen einen
unterdrückenden Effekt haben kann, sogar in Gegenwart mutierter
p53-Allele.
Funktion von p53 als Tumorsuppressor
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Die Einführung von Wildtyp-p53 in humane
Osteosarkomzellen, denen eine p53-Expression fehlt, unterdrückte deutlich
deren neoplastischen Phänotyp, was zeigt, daß p53 in diesem
System als Tumorsuppressorgen wirken kann. Dagegen erhöhte die
Insertion von mutiertem p53 in diese Zellen einen Aspekt ihres
Wachstums in Kultur (Sättigungsdichte), was darauf hinweist,
daß p53 eine begrenzte Funktion beibehält, wenn auch eine, die
von Wildtyp-p53 aufgehoben wurde. Diese Ergebnisse stimmen in
großen Zügen mit jenen anderer Forscher überein, die sich mit
dem Einfluß von murinem Wildtyp-p53 auf die onkogenvermittelte
Transformation primärer Rattenembryofibroblasten befaßt haben.
In diesen Untersuchungen reduzierte die Cotransfektion von
Plasmid-DNA, die das Wildtyp-p53-Gen enthielt, deutlich die
Transformationseffizienz der verschiedenen aktivierten
Onkogene, entweder einzeln oder in Kombination wie ras + myc oder
ras + E1A. Mutiertes p53 besaß diesen unterdrückenden Effekt
nicht, sondern erhöhte stattdessen auf maßvolle Weise die
Transformationseffizienz. Wildtyp-p53 war auch wirksam bei der
Reduzierung der Transformation durch mutiertes p53 gemeinsam
mit anderen Onkogenen, was auf eine "Dominanz" der Wildtyp-
Suppressionswirkung hinweist. Kolonien, die nach Transfektion
mit Wildtyp-p53-DNA gewonnen wurden, exprimierten entweder gar
kein p53 oder exprimierten ausschließlich mutiertes p53.
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Es schien somit, daß die Expression von exogenem Wildtyp-
p53 mit der Bildung transformierter Kolonien unvereinbar war.
Diese Daten ließen vermuten, daß murines Wildtyp-p53 als ein
Suppressor von transformierten Zellen wirken könnte, obwohl
ein unspezifischer, toxischer Effekt von Wildtyp-p53 nicht
sicher auszuschließen war. Hingegen wurden bei der Entwicklung
der vorliegenden Erfindung transformierte Zellen verwendet,
und es wurden wachsende Klone mit verändertem Phänotyp
erhalten, die stabil exogenes, Wildtyp-p53 exprimierten. Diese
Daten mit humanen Zellen und die vorherigen Untersuchungen mit
Mäusen zeigten gemeinsam, daß die Tumorsuppressionswirkung von
p53 eine spezifische und grundlegende Eigenschaft ist, die
über Artengrenzen hinweg erhalten geblieben ist.
Das Wesen von p53-Mutationen
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Es ist bekannt, daß von vielen kultivierten Zellinien
klonierte murine p53-Gene Punktmutationen aufweisen, die sich in
fünf konservierten Regionen häufen. Diese Mutationsklasse war
verantwortlich für den anfänglichen Eindruck, daß p53 ein
dominantes Onkogen ist, da solche p53-DNA-Fragmente oder
-Konstrukte in einer Reihe von Versuchen die Transformation von
Nagerzellen förderten. Überdies besitzen Proteinprodukte von
mutierten p53-Genen gemeinsame antigene und biochemische
Eigenschaften, die sich vom Wildtyp-p53-Protein unterscheiden,
einschließlich einer langen Halbwertszeit, die in ungewöhnlich
hohen zellulären p53-Protein-Pegeln resultiert. Diese Merkmale
erinnern ziemlich an andere dominante Onkogene wie myc und
ras. Andererseits wurden bei Friend-Virus-induzierten murinen
Erythroleukämien schwere Deletionen oder Umordnungen des p53-
Gens entdeckt, die mit einer Expression eines Genprodukts
unvereinbar waren (Nature 314, 633-636 (1985)). Solche
Mutationen werden als charakteristisch für sogenannte
Tumorsuppressorgene angesehen und dienen zur Inaktivierung ihrer normalen
Funktion. Um zu erklären, wie beide Mutationsarten denselben
onkogenen Phänotyp verleihen konnten, wurde vorgeschlagen, daß
Wildtyp-p53 tatsächlich Tumorbildung supprimierte, und daß die
vielen bekannten Punktmutationen von p53 in Wirklichkeit dazu
dienten, diese Funktion zu inaktivieren. Um die dominante
transformierende Aktivität von mutierten p53-Genen in primären
Zellen zu erklären, war es notwendig, die Hypothese
aufzustellen, daß mutiertes p53-Protein irgendwie endogenes, Wildtyp-
p53-Protein inaktivierte. Diese "dominante negative" Wirkung
könnte durch inhibitorische Wechselwirkungen zwischen
mutierten Proteinen und Wildtyp-Proteinen eintreten (Nature 329,
219-222 (1987)). Eine weiterführende Interpretation dieser
Untersuchungen wurde durch die technischen Nachteile der
Transfektion und durch die ungewisse Rolle von endogenem p53 in
primären Zellen begrenzt.
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Im humanen System haben Vogelstein und Kollegen in
eleganten Untersuchungen gezeigt, daß Deletionen und Punktmutationen
von p53 in kolorektalen Karzinomen, Lungen- oder
Brustkarzinomen koexistieren können. Ein Verlust der Heterozygotie von
polymorphen Markern in der Chromosomenregion 17p ist häufig
bei diesen Tumoren zu beobachten, was dem Verlust einer
Sequenz des p53-Gens (durch Deletion oder mitotische
Nichttrennung) entspricht. Das noch vorhandene p53-Allel ist oft von
somatische Punktmutationen in konservierten Regionen
betroffen. Das Endergebnis ist der Verlust beider Wildtyp-p53-Allele
aus Tumorzellen. Der gleiche Verlust kommt auch in humanen
Osteosarkomen und hepatozellulären Karzinomen durch Deletion
beider p53-Allele vor. Ein völliger Verlust von
Wildtyp-Allelen ähnelt in hohem Maße dem, was beim Retinoblastomgen
festgestellt wurde, und stützt die Vorstellung, daß p53 ein
Tumorsuppressorgen ist. Nigro et al., J.M. Nigro et al., Nature
342, 705-708 (1989) beschrieben jedoch ein kolorektales
Karzinom, das sowohl mutierte (Asp281 T Gly) als auch
Wildtyp-p53-Allele coexprimierte. Die Existenz dieses Tumors wurde
als Begünstigung einer onkogenen Aktivität eines einzelnen
mutierten p53-Allels in Gegenwart von Wildtyp-p53 interpretiert;
der Verlust des zweiten Allels, des Wildtyp-Allels, würde zu
einer Weiterentwicklung des Tumors beitragen.
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In der vorliegenden Erfindung hat sich herausgestellt, daß
der Phänotyp von Saos-2-Zellen mit einmalig vorkommenden
Sequenzen eines Wildtyp- und eines mutierten p53-Allels von
Zellen, die nur Wildtyp-p53 exprimierten, nicht zu unterscheiden
war, was darauf hinweist, daß Wildtyp-p53 in einer Zweiallel-
Konfiguration gegenüber mutiertem p53 dominant ist. Angesichts
dieses Ergebnisses mögen andere Erklärungen für den
widersprüchlichen Dickdarmkarzinomfall in Betracht gezogen werden:
1) Es wurde zufällig ein Zwischenstadium einer p53-Mutation
erfaßt, und p53 hat noch nicht zu den neoplastischen
Eigenschaften dieses Tumors beigetragen; und 2) das "Wildtyp"-p53-
Allel in diesem Tumor trug in Wirklichkeit eine funktionell
wichtige Mutation außerhalb der sequenzierten Region (Exon 5-
9). Andererseits ist es möglich, daß sich gewisse mutierte
p53-Allele abweichend von anderen verhalten oder daß mutierte
p53-Allele in anderen Arten von Tumorzellen anders als in
unserem Saos-2-Modellsystem wirken. Diese Möglichkeiten können
durch Reproduzieren von Experimenten mit anderen mutierten
p53-Genen und anderen p53-negativen Zellen untersucht werden.
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Verwirrung in vorangegangenen Untersuchungen über die
Wechselwirkung zwischen Wildtyp-53 und mutiertern p53 hat eine
wesentliche Frage verschleiert: Ist mutiertes p53 völlig
funktionslos, d.h., entspricht es seiner vollständigen Deletion,
oder behält es eine gewisse begrenzte Funktion bei? Man ist zu
dem Schluß gekommen, daß der letztere Fall wahrscheinlicher
ist. Eine einmalig vorkommende Sequenz von mutiertem p53
erhöhte die Sättigungsdichte von Saos-2-Zellen, und natürlich
konnte diese Wirkung nicht durch Inaktivierung von endogenem
p53 vermittelt werden. Auch führten Wolf et al. (Cell 38, 119-
126 (1984)) ein mutmaßlich mutiertes p53-Gen in
AB-MuLV-transformierte murine Zellen ein, denen eine endogene
p53-Expression fehlte, und stellten fest, daß deren onkogenes Potential
gewachsen war. Daher verleihen mutierte p53-Allele Tumorzellen
ohne Wildtyp-p53 in vivo möglicherweise einen Wachstumsvorteil
oder einen bösartigeren Phänotyp.
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Die Erkenntnisse, daß mutiertes p53 eine biologische
Funktion besitzt und daß seine Funktion gegenüber der von Wildtyp-
p53 rezessiv ist, sind unvereinbar mit der Hypothese einer
dominanten negativen Wirkung, zumindest in Bezug auf die
natürliche humane Tumorigenese. Die dominanten transformierenden
Eigenschaften von mutierten murinen p53-Allelen mögen auf die
hohe Kopienzahl der durch Transfektion eingeführten Gene und
die resultierende massive Überexpression von mutiertem p53
zurückzuführen sein. Unter diesen Umständen mag selbst seine
begrenzte intrinsische Aktivität ausreichen, um zu einem
transformierten Phänotyp beizutragen.
Mechanismen der p53-Funktion
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Die physiologischen oder biochemischen Funktionen von p53
sind nun mit Sicherheit bekannt. In nichttransforrnierten
Zellen steigt die p53-Synthese und -mRNA-Transkription während
des Übergangs von der G&sub0;/G&sub1;- zur S-Phase dramatisch an, was
indirekt auf eine Rolle bei der Regulation des Zellzyklus
hinweist. Jüngste Ergebnisse deuten auch auf eine Aktivität hin,
die möglicherweise mit der Regulierung der DNA-Replikation im
Zusammenhang steht. Untersuchungen über die Suppression des
neoplastischen Phänotyps können allgemeine Parameter für das
Verstehen der normalen Funktion von p53 liefern. Es ist zum
Beispiel klar, daß p53 nicht für den Ablauf des Zellzyklus
erforderlich ist, noch verhindert seine Anwesenheit
notwendigerweise
Zellwachstum und -teilung. Daher mag es an der
Regulation dieser grundlegenden zellulären Prozesse in Antwort auf
externe Wachstums- oder Differenzierungssignale beteiligt
sein. Wildtyp-p53 und mutiertes p53 können sich durch eine
einzige Aminosäure unterscheiden und doch entgegengesetzte
Funktionen in der Zelle ausüben. Unter Bedingungen einer
gleichen Gendosis ist Wildtyp-p53 in der Lage, den Einfluß von
mutiertem p53 trotz eines 10-fachen molaren Überschusses des
letzteren aufzuheben. Diese Beobachtungen lassen sich durch
ein Konkurrieren von Wildtyp-p53 und mutiertem p53 um
gemeinsame zelluläre Ziele erklären, für die das Wildtyp-p53 eine
viel größere Affinität besitzt. In diesem Modell würden
Wildtyp-p53 und mutiertes p53 diesen Zielen gegensätzliche
Wachstumssignale übermitteln, wobei das völlige Fehlen von p53
vielleicht ein Zwischensignal wäre. Alternativ könnte
mutiertes p53 als eigenständiger Weg zur Förderung bestimmter
Merkmale des neoplastischen Phänotyps wirken.
Genetische Mechanismen der p53-Inaktivierung
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Die Dominanz von Wildtyp-p53 über mutiertes p53 in einer
Zweiallel-Konfiguration bedeutet, daß für einen onkogenen
Effekt beide Wildtyp-53-Allele verloren gehen müssen. In dieser
Hinsicht entspricht p53 einem Modell für die
Tumorsuppressorgen-Inaktivierung, das im Falle des Retinoblastomgens als
sicher angenommen werden kann. Der völlige Verlust des RB-Gen-
Produkts ist bisher in allen Retinoblastomen anzutreffen, und
eine Koexistenz von Wildtyp- und mutierten RB-Allelen in
Tumorzellen ist nicht beobachtet worden. Diese Fakten weisen
darauf hin, daß RB erst nach seiner völligen Inaktivierung zur
Onkogenese beiträgt. Andererseits weisen viele Tumorzellen
eine normale RB-Expression auf und sind vermutlich aufgrund von
Mutationen in anderen Genen neoplastisch. Bei solchen
RB&spplus;-Tumorzellen mag die Einführung von exogenem RB eine nur geringe
oder gar keine Wirkung zeigen; die Existenz von RB&spplus;-U20S-
Osteosarkomzellinien mit Wildtyp-p53-Allelen ist zum Beispiel
nicht bekannt. Diese bis jetzt gewonnenen Ergebnisse zeigen,
daß p53 bei vielen verschiedenen Arten humaner Tumore eine
weitreichende Suppressionsaktivität besitzt. Folglich tritt
die Suppressionswirkung von exogenem RB oder p53
möglicherweise
nur in Tumorzellen mit inaktivierten RB- oder p53-Genen
auf. Diese gemeinsamen Eigenschaften von RB und p53
bekräftigen das Tumorsuppressorkonzept, einschließliche des möglichen
klinischen Nutzens ihrer Substitution in geeigneten
Tumorzellen.
Zusammenfassung
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Mutationen des Gens, das für p53, ein 53-kD-Zellprotein,
codiert, sind häufig in humanen Tumorzellen anzutreffen, was
auf eine entscheidende Rolle dieses Gens bei der humanen
Onkogenese hindeutet. Um die schrittweise Mutation oder den
Verlust beider p53-Allele während der humanen Onkogenese
nachzubilden, wurde eine humane Osteosarkomzellinie, Saos-2,
verwendet, welcher endogenes p53 infolge einer vollständigen
Deletion des Gens fehlte. Es wurden dann einmalig vorkommende
Sequenzen von exogenen p53-Genen eingeführt, indem die Zellen
mit rekombinanten Retroviren infiziert wurden, die entweder
Wildtyp- oder punktmutierte Versionen der p53-cDNA-Sequenz
enthielten. Es wurde festgestellt, daß 1) die Expression von
Wildtyp-p53 den neoplastischen Phänotyp von Saos-2-Zellen
unterdrückt; 2) die Expression von mutiertem p53 den Zellen in
Abwesenheit von Wildtyp-p53 einen begrenzten Wachstumsvorteil
verleiht; und 3) Wildtyp-p53 gegenüber mutiertem p53 in einer
Zweiallel-Konfiguration phänotypisch dominant ist. Diese
Ergebnisse zeigen, daß wie bei dem Retinoblastomgen die Mutation
beider Allele des p53-Gens für seine Rolle in der Onkogenese
unbedingt erforderlich ist.
-
Obwohl spezielle Ausführungsformen der vorliegenden
Erfindung offenbart worden sind, versteht sich, daß verschiedene
abweichende Modifikationen möglich sind und innerhalb des
wahren Wesens und Umfangs der beigefügten Ansprüche in Betracht
kommen. Es sind daher keine Beschränkungen auf den genauen
Abriß oder die genaue Offenbarung, wie sie hier vorgelegt
werden, beabsichtigt.