DE69029799T2

DE69029799T2 - Modifizierte formen von fortpflanzungshormonen

Info

Publication number: DE69029799T2
Application number: DE69029799T
Authority: DE
Inventors: Irving St. Louis Mo 63141 Boime; Jeffrey L. St. Louis Mo 63123 Keene; Martin M. Houston Tx 7703012 Matzuk
Original assignee: University of Washington; Washington University in St Louis WUSTL
Current assignee: University of Washington; Washington University in St Louis WUSTL
Priority date: 1989-02-21
Filing date: 1990-02-20
Publication date: 1997-05-28
Anticipated expiration: 2010-02-21
Also published as: AU670510B2; EP0461200A4; AU6747494A; WO1990009800A1; DE122010000006I2; JPH04503606A; US5177193A; DK0461200T3; CA2053864C; AU697899B2; AU5332790A; US5405945A; JP3045539B2; DE69029799D1; US5712122A; US6306654B1; ATE148171T1; EP0461200A1; AU6581996A; CA2053864A1

Description

Technischer Hintergrund

Die Erfindung betrifft die Herstellung von menschlichen Fortpflanzungshormonen mit veränderten Glycosylierungsmustern und Aktivitäten und verbesserten modifizierten Formen der β-Untereinheit von LH. Insbesondere betrifft sie die Herstellung von rekombinanten Hormonen unter Bedingungen, unter denen eine effiziente Produktion und Sekretion erfolgt und das Glycosylierungsmusater des Proteins reguliert wird, und die Herstellung von modifizierten Formen von LH mit verbesserten Sekretions- und Dimerisierungseigenschaften.

Hintergrund des Fachgebiets

Die menschliche Fortpflanzungsfunktion wird zum Teil durch eine Familie von heterodimeren menschlichen Glycoprotein-Hormonen reguliert, die eine gemeinsame α-Untereinheit aufweisen, sich jedoch in ihren hormonspezifischen β-Untereinlieiten unterscheiden. Die Familie umfaßt das follikelstimulierende Hormon (FSH), das luteinisierende Hormon (LH), Thyrotropin oder das Schilddrüsen stimulierende Hormon (TSH) und das menschliche Choriongonadotropin (CG). In allen Fällen stellt die α-Untereinheit ein aus 92 Aminosäuren bestehendes Glycoprotein mit zwei maßgeblichen Glycosylierungsstellen an den Asparaginen an Position 52 und 78 dar. Die β-Untereinheiten sind ebenfalls Glycoproteine; zusätzlich zur N-gebundenen Glycosylierung, die von den β-Ketten aller vier Hormone gezeigt wird, enthält menschliches CG vier Mucin-ähnliche, O-gebundene Oligosaccharide, die an einer für dieses Hormon einzigartigen carboxyterminalen Verlängerung gebunden sind. Die Wichtigkeit der O-gebundenen Glycosylierung steht anscheinend nicht in Beziehung mit der Sekretion und dem Aufbau des Hormons (Matzuk M.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 6354- 6358).
Es wurden der menschlichen α-Kette entsprechende genomische Clone und cDNA- Clone hergestellt (Boothby M. et al., J. Biol. Chem. 256 (1981), 5121-5127; Fiddes J.C. et al., J. Mol. App. Genet. 1 (1981), 3-18). Die cDNA- und/oder genomischen Sequenzen der β-Untereinheiten wurden ebenfalls hergestellt. Für CG wird die β-codierende DNA beschrieben von Fiddes J.C. et al., Nature 286 (1980), 684-687, und von Policastro P. et al., J. Biol. Chem. 258 (1983), 11492-11499. Für das luteinisierende Hormon findet man eine solche Beschreibung bei Boorstein W.R. et al., Nature 300 (1982), 419-422; und für TSH bei Hayashizaki Y. et al., FEBS Lett. 188 (1985), 394-400, und bei Whitfield G.K. et al., in "Frontiers in Thyroidology" (1986), Medeiros-Nato G. et al. (Hrsg.), Seiten 173-176, Plenum Press, NY. Diese DNA-Segmente wurden gentechnisch exprimiert und es wurde biologisch aktives Material hergestellt.
Die die FSH-β-Kette codierende genomische Sequenz wurde zur Konstruktion eines rekombinanten Expressionsvektors verwendet, derdie vollständige β-Kette codierende Sequenz enthält, wie in der PCT-Anmeldung WO86/04589, veröffentlicht am 14. August 1986, beschrieben. Zusätzlich wurden von anderen genomische Clone für menschliches FSH-β hergestellt (Watkins P.C. et al., DNA 6 (1987), 205-212; Jameson J.L. et al., Mol. Endocrinol. 2 (1988), 806-815; Jameson J.L. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 64 (1986), 319-327; und Glaser T. et al., Nature 321 (1986), 882-887). Jedoch ist nicht erwiesen, daß menschliches FSH-β konstruiert wurde, um die gentechnische Herstellung des dimeren Hormons zu ermöglichen (das Rinder-β-FSH-Gen wurde ebenfalls hergestellt, wie bei Maurer R.A. et al., DNA 5 (1986), 363-369; und Kim K.E. et al., DNA 7 (1988), 227-333, beschrieben).
Die erfindungsgemäßen Konstrukte erlauben die bedeutsame gentechnische Herstellung dieser Hormonfamilie, insbesondere von FSH und LH, und stellen ferner ein Mittel zur Regulierung des Glycosylierungsmusters und auf diese Weise eine größere Vorhersagbarkeit bei der Formulierung von therapeutisch nützlichen Stoffen bereit.
Obwohl man heute weiß, daß das Glycosylierungsmuster eines bestimmten Proteins große Bedeutung für seine biologische Aktivität haben kann, wurde die Wichtigkeit dieses Musters bei der Charakterisierung von Glycoproteinen lange übersehen. Der Schwerpunkt wurde auf die Aminosäuresequenz gelegt, als wenn diese die einzige Komponente des Glycoproteins wäre. Die Gründe für diese Kurzsichtigkeit sind größtenteils historisch bedingt, jedoch ist diese beinahe ausschließliche Konzentration auf den Peptid-Aspekt erkennbar ein Irrtum. Zum Beispiel ist im Fall von menschlichem CG gut bekannt, daß eine Desialylierung die schnelle Ausscheidung des Hormons über die Leber bewirkt (Morell A.G. et al., J. Biol. Chem. 246 (1971), 1461-1467). Es ist auch bekannt, daß die Entfernung von innerhalb der Sialinsäurereste befindlichen Kohlehydraten oder die vollständige Deglycosylierung menschliches CG in einen Antagonisten umwandelt, der fester an den Rezeptor bindet, jedoch eine verringerte biologische Aktivitat in vitro zeigt (Channing C.P. et al., Endocrinol. 103 (1978), 341-348; Kalyan N.J. et al., J. Biol. Chem. 258 (1983), 67-74; Keutmann H.T. et al., Biochemistry (1983), 3067-3072; und Moyle W.R. et al., J. Biol. Chem. 250 (1975), 9163-9169). Es ist auch bekannt, daß andere Glycoproteine, wie zum Beispiel der Gewebeplasminogenaktivator, durch die Veränderung des Glycosylierungsmusters in ihrem Aktivitätsgrad verändert werden. Deshalb scheint es, daß es zur Regulierung der therapeutischen Funktion der Glycoprotein-Hormone erforderlich sein kann, sowohl die Menge als auch die Art der Glycosylierung zu regulieren.
Matzuk et al., The Journal ofcell Biology 109(4) (Oktober 1989), 1429-1438, beschreiben die Herstellung von rekombinanten LH- und CG-β-Untereinheiten und Chimären davon.
Menschliches FSH und LH wird therapeutisch zur Regulierung verschiedener Aspekte des Stoffwechsels verwendet, die für die Fortpflanzung bei der Frau wichtig sind. Zum Beispiel wird teilweise gereinigtes FSH aus Urin klinisch zur Stimulierung der Follikelreifung bei anovulatorischen Frauen mit einem anovulatorischen Syndrom oder einer fehlenden lutealen Phase verwendet. Luteinisierendes Hormon (LH) und FSH werden in Verbindung miteinander zur Stimulierung der Entwicklung von ovarialen Follikeln fur die in vitro- Fertilisation verwendet. Die Rolle von FSH im Fortpflanzungscyclus ist ausreichend gut bekannt, um diese Art der therapeutischen Anwendung zu erlauben, jedoch traten Schwierigkeiten auf, die zum Teil auf die Heterogenität und Unreinheit des Präparats aus natürlichen Quellen zurückzuführen sind. Diese Heterogenität resultiert aus Variationen in den Glycosylierungsmustern. Entsprechend wird LH therapeutisch zur Erleichterung von Zuständen verwendet, die mit der beeinträchtigten Funktion des weiblichen Fortpflanzungssystem verbunden sind.

Offenbarung der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein pharmazeutisch wirksames modifiziertes Protein oder Polypeptid, wobei die Modifikation eine Verlängerung des Carboxyterminus des Proteins oder Polypeptids mit dem carboxyterminalen Peptid (CTP) umfaßt, das von den Aminosäureresten 112-118 bis 145 der β-Untereinheit des menschlichen Choriongonadotropins (hCG) oder einer varianten Form davon dargestellt wird, wobei das modifizierte Protein oder Polypeptid die biologische Aktivität des unmodifizierten Proteins oder Peptids behält. Besonders in Betracht gezogene Proteine und Polypeptide umfassen menschliche heterodimere Glycoprotein-Hormone oder Untereinheiten davon.
Die Erfindung kann folglich ein gentechnisch hergestelltes, heterodimeres, menschliches Hormon aus der Gruppe FSH, LH, TSH und CG durch verbesserte Verfahren und durch ein Verfahren, das die Möglichkeit zur Regulierung des Glycosylierungsmusters sowohl der α- als auch der β-Anteile des Heterodimers bietet, bereitstellen Eine solche Glycosylierungsregulierung kann entweder durch die geeignete Wahl des rekombinanten eukaryotischen Wirts, einschließlich mutierter eukaryotischer Wirte, oder durch die Veränderung der Glycosylierungsstellen durch zum Beispiel stellengerichtete Mutagenese an den geeigneten Aminosäureresten erzielt werden. In jedem Fall beugt die gentechnische Herstellung dieser Hormone dem bei der Isolierung des Hormons aus natürlichen Quellen erhaltenen komplexen Gemisch von Glycosylierungsmustern vor.
Die erfindungsgemäßen Proteine können spezifische Mutanten dieser Familie mit veränderten Glycosylierungsmustern an den zwei Glycosylierungsstellen in der α-Untereinheit oder Varianten der α-Untereinheit mit die Aktivität beeinflussenden Veränderungen am Carboxyterminus umfassen. Folglich sind Expressionssysteme für Muteine der α-Untereinheit, die keine Glycosylierungsstellen am Asparagin an Position 52 oder 78 oder beiden aufweisen oder Modifikationen an den Positionen 88-92 enthalten, und mit diesen Expressionssystemen transfizierte rekombinante Wirtszellen eingeschlossen. Die Modifikationen an den Positionen 88-92 sind insbesondere wichtig, da sie eine Verringerung oder Eliminierung der steroidogenetischen Aktivität der Hormone zur Folge haben, jedoch nicht die Rezeptorbindung beeinflussen. Deshalb können unter Verwendung dieser Modifikationen hergestellte Analoge zu den Hormonen als Antagonisten verwendet werden. Die Zellen konnen mit diesem Untereinheit-Expressionssystem allein oder in Verbindung mit einem Expressionssystem für eine geeignete β-Untereinheit transfiziert werden. Die Erfindung betrifft auch die von diesen Zellen produzierten mutierten Glycoproteine mit veränderter(n) Glycosylierung oder Aktivitätsmustern.
Die erfindungsgemaßen Proteine können modifizierte Formen der LH-β-Kette aufweisen, worin die aus 7 Aminosäuren bestehende hydrophobe Sequenz an den Positionen 115-121 deletiert ist oder durch eine hydrophile Sequenz ersetzt wurde, und mindestens ein Rest, ausgewählt aus der aus Trp&sup8;, Ile¹&sup5; und Met&sup4;² bestehenden Gruppe, durch eine hydrophile Aminosäure ersetzt ist oder Thr&sup5;&sup8; durch Asn ersetzt ist. In bevorzugten Ausführungsformen wird die hydrophile Aminosäure meist wie der ersetzte hydrophobe Rest als Substituent verwendet oder die Aminosaure in der entsprechenden Position in der CG-β-Kette wird substituiert. Ebenfalls bevorzugt werden Ausführungsformen, bei denen die hydrophobe Sequenz an den Positionen 115-121 durch das carboxyterminale Peptid der menschlichen CG-β-Untereinheit oder eine Variante davon ersetzt ist, wie nachstehend beschrieben. Innerhalb der Erfindung sind auch DNA-Sequenzen eingeschlossen, die dieses modifizierte LH-β codieren, sowie rekombinante Stoffe und Verfahren zur Herstellung dieser Untereinheit, entweder allein oder in Gegenwart der α-Untereinheit.
Die Erfindung betrifft gemaß einer Ausführungsform die gentechnische Herstellung von FSH, wobei das so erhaltene Dimer eine verlängerte Form der FSH-β-Kette enthält, d.h. die FSH-β-Sequenz fusioniert mit dem carboxyterminalen Anteil (CTP) der CG-Sequenz oder einer Variante davon. Diese modifizierte Form von FSH wird sehr effizient produziert und sezerniert.
Der carboxyterminale Anteil der CG-β-Untereinheit oder eine Variante dieses carboxyterminalen Peptids hat bedeutende Wirkungen auf den Aufbau von CG, FSH und LH. Diese Verlängerung am Carboxyterminus hat im allgemeinen eine entsprechende Wirkung auf den Aufbau von Hormonen und Arzneimitteln auf Proteinbasis. Deshalb betrifft ein anderer erfindungsgemaßer Gesichtspunkt modifizierte Formen von pharmazeutisch wirksamen Peptiden oder Proteinen, wobei die Modifikation die Ligierung des CTPs oder dessen Variante mit dem Carboxyterminus des Proteins oder Peptids umfaßt. Besonders bevorzugte Proteine oder Peptide sind die Peptid-Hormone.
Gemäß anderen Gesichtspunkten betrifft die Erfindung Arzneimittel, die die vorstehend dargestellten Varianten enthalten, und Verfahren zur Regulierung des Fortpflanzungsstoffwechsels bei Patienten durch das Verabreichen dieser Glycoproteine oder diese enthaltender pharmazeutischer Zusammensetzungen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Figur 1 zeigt eine Restriktionsenzymkarte des menschlichen FSH-β-Gens.
Figur 2 zeigt die Nucleotidsequenz des menschlichen FSH-β-Gens.
Figur 3 zeigt die Konstruktion des menschlichen α-Untereinheit-Minigens und Vektoren für dessen Expression.
Figur 4 zeigt die Konstruktion der verlängerten Form der FSH-β-Untereinheit.
Figur 5 zeigt eine Gegenüberstellung der Aminosäuresequenzen der menschlichen CG- und der menschlichen LH-β-Untereinheiten.
Figur 6 zeigt die Konstruktion von verschiedenen LH-Chimären und -Muteinen.
Figur 7 zeigt aus Zellysaten und Medien immunpräzipiertes FSH oder FSH-β, markiert mit ³&sup5;S-Cystein.
Figur 8 zeigt einen Biotest des rekombinanten menschlichen FSH.
Figur 9 zeigt die chromatographische Fokussierung von rekombinantem und menschlichem Hypophysen-FSH.

Ausführungsformen der Erfindung

Definitionen

Die hier verwendeten Begriffe "menschliche α-Untereinheit" und "menschliche FSH-, LH-, TSH- und CG-β-Untereinheiten" sowie "die heterodimeren Formen" weisen im allgemeinen ihre herkömmlichen Definitionen auf und beziehen sich auf die Proteine mit den auf dem Fachgebiet per se bekannten Aminosäuresequenzen oder allele Varianten davon, speziell konstruierte Muteine davon, die die Aktivität des natürlichen Proteins unabhängig vom gezeigten Glycosylierungsmuster beibehalten, oder mutierte Formen davon mit einer Homologie von mindestens 90% mit den nativen Formen.
"Native" Formen dieser Proteine umfassen diejenigen, die die aus menschlichem Gewebe isolierten Aminosäuresequenzen aufweisen und diese bekannten Sequenzen per se besitzen oder ihre allele Varianten.
"Muteine" Formen dieser Proteine umfassen diejenigen, die zum Beispiel durch stellenspezifische Mutagenese oder durch andere gentechnische Manipulationen absichtlich erzeugte Veränderungen in der Aminosäuresequenz aufweisen oder die synthetisch hergestellt werden. Diese Veränderungen ergeben Aminosäuresequenzen, worin die biologische Aktivität der Untereinheit beibehalten wird und/oder worin die Untereinheit eine Homologie von mindestens 90% mit der nativen Form aufweist.
Ein bevorzugtes Mutein der β-Untereinheit für die Verwendung als Antagonisten der verschiedenen Heterodimere weist Veränderungen in den Aminosäuren der Positionen 88-92 auf.
Ein besonders bevorzugtes Protein der Erfindung ist ein Mutein von FSH-β, zum Beispiel ein "verlängertes" FSH-β, worin die das carboxyterminale Peptid (CTP) von hCG umfassende Aminosäuresequenz mit dem Carboxyterminus von FSH-β fusioniert ist. Der hier verwendete Begriff "CTP" bezieht sich auf die "zusätzliche" Sequenz am C-Terminus des CG-β-Peptids, verglichen mit anderen verwandten Hormonen. Die Länge des wirksamen CTPs kann verglichen mit den anderen β-Untereinheiten in geringem Maße variieren, jedoch umfaßt es etwa die Aminosäuren 112-118 von CG bis zum Rest 145 am C-Terminus. Die genaue Länge des CTPs bei den vorliegenden Konstrukten wird aus dem Inhalt deutlich.
Bei den hier beschriebenen Fusionen kann das native CTP oder eine "Variante" davon verwendet werden. Der Begriff "Variante" bezieht sich auf ein konservatives Analog der Peptidreste von etwa 112-118 bis 145, d.h. auf diese Sequenz, worin etwa 1-5 Aminosäuren der Sequenz ohne wesentliche Veränderung der Eigenschaften verändert werden. Oft resultiert diese Variation einfach aus einer Mutation zur Erzeugung geeigneter Restriktionsstellen.
Obwohl bekannt ist, daß das Glycosylierungsmuster sowohl qualitativ als auch quantitativ einen sehr großen Einfluß auf die Aktivität hat, beziehen sich die Begriffe "FSH-", "TSH-" und "CG-β-Untereinheiten" zur Vereinfachung auf die für die Peptide charakteristische Aminosequenz, der Begriff "α-Untereinheit" ebenfalls. Wenn nur auf die β-Kette verwiesen wird, lauten die Begriffe zum Beispiel FSH-β; wenn auf das Heterodimer verwiesen wird, wird der einfache Begriff "FSH" verwendet. Aus dem Zusammenhang wird deutlich, auf welche Weise das Glycosylierungsmuster zum Beispiel durch den rekombinanten Expressionswirt oder die gentechnische Veränderung an den Glycosylierungsstellen beeinflußt wird. Formen des Glycoproteins mit spezifizierten Glycosylierungsmustern sind entsprechend gekennzeichnet.
Der Begriff eine "transfizierte" rekombinante Wirtszelle, d.h. eine mit den erfindungsgemaßen rekombinanten Expressionssystemen "transfizierte" Zelle, bezieht sich auf eine Wirtszelle, die so verändert wurde, daß sie dieses Expressionssystem enthält, indem es auf eine geeignete Weise, einschließlich Transfektion, Virusinfektion usw., eingeschleust wurde. Der Begriff "transfiziert" bezieht sich auf die dieses Expressionssystem enthaltende Zellen, ob das System in das Chromosom integriert oder extrachromosomal ist. Die "transfizierten" Zellen können entweder im Hinblick auf die Aufnahme des Expressionssystems stabil sein oder nicht. Kurz, der Begriff "transfizierte" rekombinante Zellen mit dem erfindungsgemaßen Expressionssystem bezieht sich auf Zellen, die dieses Expressionssystem als Ergebnis ihrer Manipulation zur dessen Aufnahme einschließen, wenn sie es natürlicherweise nicht umfassen, ungeachtet der Weise, auf die dieser Einbau herbeigeführt wurde.
Der Begriff "Expressionssystem" bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, die eine zu exprimierende codierende Sequenz umfaßt, und diejenigen begleitenden DNA-Kontrollsequenzen, die zur Herbeiführung der Expression der codierenden Sequenz erforderlich sind. Üblicherweise umfassen diese Kontrollsequenzen einen Promotor, Terminationsregulationssequenzen und in einigen Fällen einen Operator oder andere Mechanismen zur Expressionsregulierung. Die Kontrollsequenzen umfassen diejenigen, die so konstruiert werden, daß sie in einer bestimmten rekombinanten Ziel-Wirtszelle funktionsfähig sind, und deshalb muß die Wirtszelle so gewählt werden, daß sie mit den Kontrollsequenzen in dem konstruierten Expressionssystem kompatibel ist.
Die hier verwendeten Begriffe "Zellen", "Zellkulturen" und "Zellinien" werden gleichbedeutend ohne besondere Berücksichtigung von Feinheiten verwendet. Wo der Unterschied zwischen ihnen wichtig ist, wird er aus dem Zusammenhang deutlich. Wo ein beliebiger gemeint sein kann, sind alle eingeschlossen.

Isolierung des FSH-β codierenden Gens

Ein wichtiger Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Expressionssystems für FSH-β-codierende DNA, welches FSH-β bereitstellt, das leicht dimerisiert, wobei das Hormon hergestellt wird. Das zur Aufnahme in Expressionssysteme, die für zur Prozessierung von Introns befähigte Wirtszellen gedacht sind, geeignete Gen wurde wie folgt präpariert:
Genomische DNA aus JAr-Chorioncarcinomzellen (ein menschlicher Plazenta- Spender) wurde teilweise mit MboI gespalten und in die BamHI-Stelle von λ-MG3 cloniert, ein von Helms C. et al., in DNA 4 (1985), 39-49, beschriebener Vektor; dieser Vektor ist ein Derivat von λ-L47, der von Loenen W.A.M. et al., in Gene 10 (1980), 249-259, beschrieben wird. Die Größe der Insertionen betrug üblicherweise 15-20 kb. Etwa 5 x 10&sup5; Plaques wurden erhalten und gemaß dem Verfahren von Benton W.D. et al., Science 196 (1977), 180-182, unter Verwendung des 41-Mer durchmustert, das die Aminosäuren 94-107 von Exon III von menschlichem FSH-β codiert, wie von Watkins P.C. et al., DNA 6 (1987), 205-212, beschrieben. Dieses 41-Mer weist die folgende Sequenz auf:
TGTACTGTGCGAGGCCTGGGGCCCAGCTACTGCTCCTTTGG.
Zwei positive Clone wurden durch wiederholte Plaquereinigung isoliert und durch eine Restriktionsanalyse wurde gezeigt, daß sie identisch sind; außerdem stimmten sie mit jenen von Glaser T. et al., Nature 321 (1986), 882-887 (a.a.O.) erhaltenen überein. Die Restriktionsfragmente wurden in pUC 18 zur weiteren Restriktionsanalyse und in M13 zur Sequenzierung durch das Didesoxy-Kettenterminationsverfahren von Sanger F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467, subcloniert. Ein in der 16,5 kb großen Insertion dieser Clone enthaltenes 3,7 kb großes HindIII/BamHI-Fragment enthält die hFSH-β-codierende Sequenz.
Die Clone wurden als λI und λR bezeichnet und weisen identische Restriktionskarten auf und sind etwa 16,5 kb lang. Die Restriktionskarte der vollständigen Clone ist in Figur 1 zusammen mit einer Restriktionskarte der 3,7 kb großen menschliches FSH-β-codierenden Sequenz dargestellt.
Die Ergebnisse der Sequenzierung des menschlichen FSH-β-Gens werden in Figur 2 gezeigt. Wie in Figur 2 gezeigt, ist die codierende Sequenz in drei Exons unterteilt. Exon I enthält einen nicht-translatierten 5'-Bereich, über den schon berichtet wurde, daß er zwei Transkripte mit einer Größe von entweder 33 oder 63 bp codiert (Jameson J.L. et al., Mol. Endocrinol. 2 (1988), 806-815). Exon II codiert ein aus 18 Aminosäuren bestehendes Signalpeptid und die Aminosäuren 1-35 des reifen Proteins. Exon III codiert die Aminosäuren 36- 111 und etwa 1,1 kb der nicht-translatierten 3'-Sequenz. Die Exons I und II werden durch ein Intron mit einer Größe von etwa 800 bp und die Exons II und II durch ein Intron mit einer Größe von etwa 1,4 kb voneinander getrennt.
Die erhaltene Nucleotidsequenz entspricht derjenigen, über die von Watkins T.C. et al., DNA 6 (1987), 205-212, und Jameson J.L. et al. (a.a.O.), berichtet wurde, außer daß Tyrosin 58 eher durch TAC als TAT codiert wird und in den nicht-translatierten 3'- und 5'- Bereichen Unterschiede zu Watkins bestehen. Die mutmaßliche Transkriptionsstartstelle 32 bp stromabwärts vom TATA-Element wurde analog zu dem Rindergen festgelegt, über das von Kim K.E. et al., DNA 7 (1988), 227-333, berichtet wurde. Die Sequenz in Figur 2 zeigt ein einziges Polyadenylierungssignal (AATAAA), das sich mit dem Terminationscodon überschneidet, und jüngste Hinweise aus der Untersuchung des Rindergens (a.a.O.) und menschlicher Clone (Jameson J.L. et al. (a.a.O.)) weisen auf die Gegenwart eines etwa 1,1 kb großen nicht-transiatierten 3'-Bereichs hin, der andere Polyadenylierungssignale enthalten kann.
Die in Figur 2 gezeigte Aminosäuresequenz ist mit derjenigen identisch, über die von Watkins (a.a.O.) berichtet wurde, jedoch unterscheidet sie sich von der bereits beschriebenen Sequenz bei der Proteinsequenzierung von gereinigtem menschlichem FSH-β. Die carboxyterminale Sequenz Tyr-Pro-Thr-Ala-Leu-Ser-Tyr, über die von Saxena D.B. et al., J. Biol. Chem. 251 (1976), 993-1005, berichtet wurde, wurde weder in der in Figur 2 gezeigten Sequenz noch in der Sequenz unter Zugrundelegung des Proteins gefunden, über die von Shome B. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 39 (1974), 203-205, berichtet wurde. Eine vor kurzem durchgeführte Bestimmung der Aminosäuresequenz bestätigt die aus der DNA folgernde Sequenz (Stone B. et al., J. Prot. Chem. 7 (1988),325-339).
Eine wichtige Modifikation der die FSH-β-Kette codierenden DNA wird erhalten, wenn das aus 34 Aminosäuren bestehende carboxyterminale Peptid (CTP) der Choriongonadotropin-β-Kette mit dem C-Terminus fusioniert wird. In dieser Form des Hormons ist das C-terminale Glu von FSH-β an Position 111 durch die Aminosäuresequenz verlängert, die durch die Aminosäuren von etwa 112-118 bis 145 der CG-β-Sequenz dargestellt wird.

Vergleichsbeispiel:

Konstruktion von Expressionsvektoren für die native menschliche β-Untereinheit und deren Muteine

Die bei den erfindungsgemaßen Konstruktionen verwendete α-Untereinheit liegt vorteilhafterweise in Form eines Minigens vor. Es wurde festgestellt, daß die Verwendung des Minigens die Produktion der α-Untereinheit sowie deren Dimerisierungsvermögen mit der geeigneten β-Untereinheit erhöht, wobei das gewünschte Heterodimer hergestellt wird. Das Minigen oder die anderen die α-Untereinheit codierenden DNA-Formen können ebenfalls zur Bereitstellung von Muteinen der α-Untereinheit modifiziert werden. Einige von diesen sind insbesondere als Antagonisten nützlich, wie diejenigen mit Deletionen oder Veränderungen an den Aminosäuren an den Positionen 88-92 der nativen Sequenz. Zusätzlich kann das die α-Untereinheit codierende Gen modifiziert werden, um Glycosylierungsmutanten bereitzustellen.
Auf dem Fachgebiet ist bekannt, daß an der Tripeptidstelle Asn-X-Thr/Ser eine N-gebundene Glycosylierung erfolgt, zwei dieser Stellen kommen in der menschlichen α-Untereinheit bei Asn-52 und Asn-78 vor. Eine stellengerichtete Mutagenese wurde an einem menschlichen α-Untereinheit-Fusionsgen durchgeführt, um diese Stellen zu verändern, wobei das Fusionsgen wie folgt konstruiert wurde:
Die α-Untereinheit-cDNA wurde, wie von Matzuk M.M. et al., J. Cell Biol. 106 (1988), 1049-1058, beschrieben und hier unter Bezugnahme eingeschlossen (a.a.O.), als BamHI/XhoI-eingerahmte Nucleotidsequenz gewonnen, die eine XbaI-Stelle in der codierenden Sequenz enthält. Ein durch EcoRI und eine die Exons III und IV enthaltende XhoI-Stelle mit einer XbaI-Stelle in Exon III gebundenes genomisches Fragment wurde aus der menschlichen Chorioncarcinom-Bank gewonnen. Die XbaI/XhoI-Spaltung sowohl des genomischen Fragments als auch der α-Untereinheit-cDNA, gefolgt von der Religierung an der XbaI-Stelle, erzeugt das α-Untereinheit-Minigen als BamHI/XhoI-Fragment, das eine von dem stromabwärts von Exon IV befindlichen genomischen Fragment abgeleitete BglII-Stelle enthält. Das rekonstruierte Gen enthält zwei codierende Bereiche (Exon II und III und Exon IV), ein einziges Intron und die Polyadenylierungssignale 3' zu Exon IV. Das von dem Minigen abgespaltene BamHI/BglII-Fragment wird als die α-Untereinheit-codierende Insertion bei der Konstruktion von Expressionsvektoren verwendet. Die Verwendung des α-Untereinheit- Minigens ergibt eindrucksvolle und überraschende Ergebnisse bei der Beeinflussung der Wirksamkeit der Expressiönssysteme zur Herstellung der dimeren Hormone.
Bei der Konstruktion von Genen, die Muteine der α-Untereinheit codieren, wird das BamHI/XhoI-Fragment selbst in den Vektor M13-UM20 zur stellengerichteten Mutagenese ligiert. Zur Veränderung von Asn-52 bzw. Asn-78 wurden die 22-Mer-Oligomere GGTGACGTCCTTTTGCACCAAC bzw. CTTAGTGGAGCGGGATATG verwendet. Dies führte zu einer Substitution von Aspartatresten für Asparagin. Drei Mutanten wurden konstruiert: α(Asn 1) (Position 52), α(Asn 2) (Position 78) und α(Asn 1+2) (beide Positionen). Entsprechende Veränderungen wurden durch die Substitution des Codons für Alanin durch das für Threonin an den Positionen 54 und 80 unter Verwendung der 26 Mer großen Einheiten: GTGGACTCTGAGGCCACGTTCTTTTG bzw. CAGTGGCACGCCGCATGGTTCTCCAC eingeführt, wobei α(Thr 1), α(Thr 2) und α(Thr 1+2) erhalten wurden.
Die Wildtyp- oder mutierten α-Untereinheiten wurden dann in den Wirtsvektor pM² als 2,4 kb große Minigene als BamHI/BglII-Segmente ligiert, um sie unter die Kontrolle des LTR-Promotors durch Insertion in die BamHI-Stelle stromabwärts des LTRs zu bringen, wie in Figur 3 gezeigt. pM², wie von Matzuk M.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 6354-6358, beschrieben, ist ein Derivat von pSV2Neo und enthält das Ampicillin- Resistenzgen (ampr), das Neomycin-Resistenzgen (neor) und den "long terminal repeat (LTR)"-Promotor des Harvey-Maussarkomvirus mit einer einzigartigen stromabwärts liegenden BamHI-Stelle. pM²/α enthält ein α-Untereinheit-Minigen stromabwärts von einem zweiten LTR. Der so erhaltene gezeigte Vektor pM²/CG-α kann zur Expression der α-Untereinheit per se verwendet werden oder kann als Quelle der menschlichen α-Expressionseinheit zur Konstruktion eines Wirtsvektors verwendet werden, der sich auch der Expression einer zusätzlichen DNA-Sequenz anpassen kann. Ein Beispiel einer nützlichen zusätzlichen DNA- Sequenz umfaßt diejenige, welche die verschiedenen Hormon-β-Ketten codiert.
Der Wirtsvektor pM²/α kann hergestellt werden, indem diese α-Expressionseinheit aus pM²/CG-α als ein EcoRI/EcoRI-Fragment ausgeschnitten und in die EcoRI-Stelle von pM² ligiert wird (Matzuk M.M. et al., Mol. Endocrinol. 2 (1988), 95-100), hier unter Bezugnahme eingeschlossen und auch in Figur 3 gezeigt. Wie hier beschrieben, wird die BamHI- Stelle am 5'-Ende des Gens zuerst deletiert und die XhoI-Stelle am 3'-Ende des Gens wird unter Verwendung von Oligonucleotid-Linkern in eine EcoRI-Stelle umgewandelt. Dieser Vektor kann dann auch eine DNA-Sequenz aufnehmen, die eine β-Untereinheit codiert.
Zusätzlich zu Muteinen der α-Untereinheit, die veränderte Glycosylierungsmuster aufweisen, wird auch eine Gruppe von Muteinen mit verringerter oder ohne Aktivität in bezug auf die Signaltransduktion hergestellt. Experimente unter Anwendung chemischer Derivatisierung bei in vitro-Tests zeigen, daß die Aminosäuren an den Positionen 88-92 (Tyr- Tyr-His-Lys-Ser) für die Signaltransduktionsaktivität des Hormons erforderlich sind.
Demgemäß kann die Deletion oder Veränderung einer oder mehrerer dieser Aminosäuren durch stellengerichtete Mutagenese Analoge ergeben, die weiterhin an den Rezeptor binden, jedoch eine verringerte oder geringfügige Aktivität besitzen. Folglich können alle vier Hormone, die diese α-Untereinheit gemeinsam haben, als Antagonisten für die gewünschten Hormone hergestellt werden.
Sowohl die Wildtyp- als auch die mutierten Vektoren können als Quelle für die menschliche α-Untereinheit verwendet werden und Expressionssysteme für die gentechnische Herstellung der dimeren Hormone bereitstellen. Von besonderer Wichtigkeit sind Mutanten der α-Untereinheit, worin die Glycosylierungsstelle bei Asn-52 verändert ist. Solche mutierten Sequenzen führen, wenn sie in Expressionssysteme ligiert und in geeignete Wirtszellen eingeschleust werden, zur Herstellung von Proteinen, die bei der Kombination mit der geeigneten β-Untereinheit eine antagonistische Aktivität für das gewunschte Hormon aufweisen.
Die vorstehenden Konstruktionen sind natürlich nur für Expressionsvektoren oder -systeme veranschaulichend, die zur Herstellung der α-Untereinheiten oder der entsprechenden heterodimeren Hormone konstruiert werden können. Andere Kontrollsequenzen, einschließlich zum Beispiel verschiedener Promotoren, können in die codierende Sequenz der menschlichen β-Untereinheiten oder des α-Minigens ligiert werden, um die Expression in anderen eukaryotischen Zellen herbeizuführen, die eine geeignete Glycosylierung bereitstellen. Eine Vielzahl von Kontrollsequenzen ist auf dem Fachgebiet bekannt und Verfahren zur Ligierung der die β-Untereinheiten oder das β-Minigen codierenden Sequenz sind natürlich auch verfügbar. Beispielsweise umfassen geeignete Hefe-Promotoren Promotoren für die Synthese von glycolytischen Enzymen, einschließlich derjenigen für die 3-Phosphoglycerat- Kinase, oder Promotoren aus dem Enolase-Gen oder dem Leu2-Gen. Geeignete Säuger-Promotoren umfassen die frühen und späten Promotoren von SV40 oder andere Virus-Promotoren, wie diejenigen, welche von Polyoma, Adenovirus 2, Rinderpapillomavirus oder Vogelsarcomviren abgeleitet sind. Geeignete Virus- und Säuger-Enhancer können ebenfalls verwendet werden. Über die Expression in Insektenzellen unter Verwendung eines Baculovirus- Promotors wurde ebenfalls berichtet. Für Pflanzenzellen geeignete Expressionssysteme können, obwohl weniger üblich, ebenfalls verwendet werden.

Konstruktion von Vektoren für die β-Untereinheiten

Im Hinblick auf die codierende DNA für die β-Untereinheiten, wie FSH-β oder LH-β, oder ihre modifizierten Formen kann genomische DNA oder modifizierte genomische DNA direkt in die für eukaryotische Wirtszellen, die zur Prozessierung von Introns befähigt sind, gedachten Expressionssysteme insertiert werden. Die das Protein codierenden Nucleinsäuresequenzen können direkt aus dem genomischen Clon oder dem cDNA-Clon verwendet werden, wie hier beschrieben, oder können unter Anwendung von Festphasen-Oligonucleotid-Standardsyntheseverfahren vollständig oder teilweise synthetisiert werden, wie zum Beispiel von Nambiar K.P. et al., Science 223 (1984), 1299, oder von Jaye E. et al., J. Biol. Chem. 259 (1984), 6311, beschrieben. Diese Verfahren sind nun kommerziell verfügbar. Es ist natürlich offensichtlich, daß nicht nur die spezifischen nativen Nucleotidsequenzen verwendet werden können, sondern auch Nucleotidsequenzen, die Codons enthalten, welche zu diesen degeneriert sind, sowie allele Formen.

Konstruktion von Expressionsvektoren für FSH

Ein nützliches Expressionskonstrukt zur Erzielung einer ausreichenden Expression von FSH resultiert aus der Insertion der β-Untereinheit in einen Wirtsvektor an einer solchen Position, daß sie unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors ist, wobei der Wirtsvektor ein Expressionssystem für das α-Minigen, wie pM²/α, umfaßt. Bei der Insertion als HindIII/BamHI-Fragment ist das FSH fünktionell verbunden mit dem LTR-Promotor seines Expressionssystems. Bei einer veranschaulichenden Konstruktion wurde die HindIII-5'-Stelle des FSH-β-codierenden pUC18-Vektors (pFSH-β) unter Verwendung von Oligonucleotid-Linkern in eine BglII-Stelle umgewandelt und der modifizierte pFSH-β-Vektor wurde mit BglII und BamHI gespalten. Das so erhaltene 3,7 kb große BglII/BamHI-Fragment wurde in die einzigartige BamHI-Stelle stromabwärts des LTR-Promotors ligiert, der kein gewebespezifisches Element aufweist, so daß es mit dem Promotor fünktionell verbunden ist, und die Orientierung wurde durch eine Restriktionsanalyse bestätigt.
Eine wichtige Mutein-codierende Sequenz von FSH-β wird durch das Ligieren der das carboxyterminale Verlängerungspeptid von CG-β (CTP) codierenden Sequenz mit dem 3'-Ende der FSH-β-codierenden Sequenz erhalten. Das C-terminale Glu von FSH-β an Position 111 wird mit der stromabwärts liegenden Sequenz von etwa Aminosäure 112-118 bis zur carboxyterminalen Aminosäure 145 von GC-β oder einer Variante davon ligiert. Bevorzugte Varianten umfassen jene, worin das Ser an Position 118 von GC-β durch Ala ersetzt ist. Diese verlängerte Form wird in einfacher Weise durch Ligierung der mit HindIII gespaltenen, FSH-β-codierenden Insertion mit dem HindIII-Spaltprodukt der GC-β-cDNA hergestellt, wobei diese Religierung zu der SerTAla-Substitution führt. Es wird erwartet, daß das aus der Expression dieser Sequenz resultierende Protein bei der Herstellung als heterodimeres FSH die biologische Aktivität von nativem FSH, jedoch eine längere Halbwertszeit im Kreislauf besitzt. Diese Erwartung wird im Hinblick auf die längere Halbwertszeit von CG verglichen mit LH ausgesprochen, die auf die Gegenwart der verlängerten, O-gebundenen Glycosylierung im CTP-Bereich zurückzuführen ist, wie von Van Hall E., Endocrinol. 88 (1971), 456, beschrieben wurde. Ein Hauptproblem bei FSH in bezug auf die klinischen Anwendung ist die verhältnismaßig kurze Halbwertszeit dieses Proteins im Kreislauf (Wide L., Acta Endocrinol. 112 (1986), 336).
Folglich umfassen "verlängerte" Formen von FSH-β diejenigen, worin die aus etwa 28-34 Aminosäuren bestehende Sequenz, die durch die Reste 112-118 bis 145 von menschlichem CG (oder einer Variante davon) dargestellt wird, mit dem C-Terminus von FSH-β ligiert wird. Wie vorstehend angegeben, bezieht sich der Begriff "Variante" auf ein konservatives Analog der Peptidreste von etwa 112-118 bis 145, d.h. diese Sequenz, worin etwa 1-5 Aminosäuren der Sequenz ohne wesentliche Veränderung der Eigenschaften verändert sind.
Die Konstruktion einer Ausführungsform dieser verlängerten Form von FSH wird in Figur 4 beschrieben. Wie gezeigt, weist die codierende Sequenz für menschliches FSH-β für den im dritten Exon des menschlichen FSH-β-Gens befindlichen C-terminalen Anteil eine Mutation im Stopcodon auf, um eine HindIII-Stelle zu erzeugen. In ähnlicher Weise weist der den Beginn des CTP-Bereichs der menschlichen CG-β-Untereinheit codierende Bereich ebenfalls im dritten Exon des Gens an den Positionen 116 und 117 eine Mutation auf, um eine entsprechende HindIII-Stelle zu erzeugen. Diese Mutation wandelt den Asp-Rest an Position 116 in einen Glutaminsäurerest und den Serinrest an Position 117 in Ala um. Die mutierten genomischen Fragmente werden dann mit HindIII und BamHI gespalten und wie gezeigt miteinander ligiert, wobei ein das verlängerte FSH-β codierende Fragment erhalten wird; falls gewünscht, wird eine weitere Mutagenese durchgeführt, um den Ala-Rest in einen hydrophilen Ser-Rest umzuwandeln. Die FSH-β-Untereinheit enthält folglich den Bereich von CG-β an den Positionen 118-145. Das BamHI/BamHI-Fragment, welches die modifizierte FSH-β-codierende Sequenz enthält, wird dann in die BamHI-Stelle von pM² unter Kontrolle des LTR-Promotors ligiert.
Bei der Cotransformation in Ovarzellen des Chinesischen Hamsters zusammen mit dem Expressionsvektor für die α-Untereinheit pM²/α werden Erträge von sezerniertem FSH von etwa 1 mg/10&sup6; Zellen/24 Stunden Züchten in 1 Liter Medium erhalten.
Weitere Muteine von FSH-β werden durch Deletierung oder Veränderung der N-gebundenen Glycosylierungsstellen hergestellt, die durch die Asn-Tyr-Kombinationen an den Positionen 7/9 und 24/26 der nativen Sequenz dargestellt sind. Es wird erwartet, daß das durch die Expression eines Systems, welches zur Expression der diese Muteine codierenden Gene befähigt ist, hergestellte Protein in bezug auf den FSH-β-Rezeptor eine hinreichende Rezeptorbindung zeigt und bei der Heterodimerisierung mit einer geeigneten α-Untereinheit als Antagonist für die FSH-Aktivität oder bei der Heterodimerisierung mit einer normalen α-Untereinheit als FSH-Ersatz verwendet werden kann.

Konstruktion von Expressionsvektoren für menschliche LH-Muteine

Bei der Herstellung von LH unter Anwendung gentechnischer Verfahren stieß man auf dem Fachgebiet auf Schwierigkeiten, da die LH-β-Kette, zum Beispiel verglichen mit der Choriongonadotropin (CG)-β-Kette, nicht wirksam mit der α-Untereinheit dimerisiert und nicht sezerniert wird, wenn sie als Monomer hergestellt wird. Die erfindungsgemaßen muteinen LH-β-Ketten weisen diese Nachteile nicht auf.
Die Wirkung verschiedener Veränderungen der LH-codierenden Sequenz auf die Sekretion der LH-Kette allein oder auf die Dimerisierung und Sekretion des intakten Hormons kann durch die Expression der die LH-codierenden Sequenz in Zellen, die mit einem geeigneten ein LH-β allein codierendes Expressionssystem enthaltenden Vektor transformiert wurden, oder in Zellen, die die α-Untereinheit gleichzeitig exprimieren, bestimmt werden. Im letzteren Fall kann das α-Untereinheit-Expressionssystem entweder auf einem getrennten Vektor, wie pM²/CG-α, oder auf einem Vektor, der auch die die β-Untereinheit enthält, bereitgestellt werden. Dies kann zum Beispiel durch die Insertion des die β-Untereinheit codierenden Gens in den vorstehend beschriebenen Wirtsvektor pM²/α erfolgen.
Figur 5 zeigt die Unterschiede in der Aminosäuresequenz zwischen den β-Ketten von LH und CG beim Menschen. Eine Leserahmenverschiebung nach dem Codon für Position 114 bei LH verglichen mit CG führt zur Translation einer aus 7 Aminosäuren bestehenden hydrophoben Sequenz, die den C-Terminus von LH bildet, im Gegensatz zur verhältnismäßig hydrophilen aus 31 Aminosäuren bestehenden Sequenz, die das C-terminale Peptid (CTP) von CG, in diesem Fall die Reste 115-145, bereitstellt. In den erfindungsgemäßen Muteinen ist der aus 7 Aminosäuren bestehende hydrophobe C-Terminus von LH deletiert oder durch eine hydrophobe Sequenz ersetzt. Zusätzlich werden eine oder mehrere Substitutionen an den Aminosäuren durchgeführt, die die Sekretion oder Dimerisierung hemmen. Diese LH-Aminosäuren sind aus der aus dem Tryptophanrest an Position 8 (Trp&sup8;), dem Isoleucinrest an Position 15 (Ile¹&sup5;), dem Methioninrest an Position 42 (Met&sup4;²) und dem Asparaginsäurerest an Position 77 (Asp&sup7;&sup7;) bestehenden Gruppe gewählt. Die Kombination dieser Modifikationen ergibt LH-β-Untereinheiten, die ohne Schwierigkeiten sezerniert werden. Zusätzlich fördert die Kombination der Deletion oder des Austausches der aus 7 carboxyterminalen Aminosäuren bestehenden Sequenz in Verbindung mit mindestens einer Substitution für eine Aminosäure, die aus der aus Trp&sup8;, Ile¹&sup5;, Met&sup4;² und dem Threonin an Position 58 (Thr&sup5;&sup8;) bestehenden Gruppe gewählt ist, bei der Coexprimierung der α-Untereinheit die Dimerbildung. Andere Substitutionen können ebenfalls durchgeführt werden, jedoch ist die Kombination der Veränderung oder Deletion des aus 7 Aminosäuren bestehenden Terminus mit der Veränderung einer der vorstehend spezifizierten Aminosäuren zur Erzielung der gewünschten Wirkung erforderlich.
Die Konstruktion von Genen, die diese modifizierten Formen von LH codieren, erlaubt die Konstruktion von Zellinien zur Herstellung des gewunschten Hormonanalogs, um große Mengen des für therapeutische und/oder diagnostische Zwecke nützlichen Analogs bereitzustellen.
Wie im Abschnitt "Hintergrund" angeführt, ist die die LH-β-Kette codierende Sequenz leicht verfügbar. In der nachstehenden Erläuterung wird das den LH-Wildtyp-codierende Ausgangsmaterial als 1270 bp großes HindIII/BamHI-Fragment bereitgestellt, das die codierenden Sequenzen der Exons II und II des LH-β-Gens enthält.
Wie weiterhin nachstehend beschrieben, kann die aus 7 Aminosäuren bestehende Sequenz am C-Terminus von LH entweder direkt durch die Insertion eines Stopcodons nach dem Codon für Aminosäure 114 deletiert oder durch eine hydrophile Sequenz, vorzugsweise das CTP aus menschlichem CG oder eine Variante davon ersetzt werden. Der Austausch der weiteren störenden Aminosäuren an den vorstehend erwähnten Positionen umfaßt jene, die die sekretions- oder dimerisierungshemmenden Wirkungen dieser Aminosäuren aufheben.
Tabelle 1 zeigt veranschaulichend modifizierte Formen der β-Untereinheit, die durch Mutagenese nach der Insertion des LH-β-Gens in den Vektor M13-mp19 und der Hybridisierung mit geeigneten Oligonucleotiden hergestellt wurden. Nach der Mutagenese wurde das modifizierte HindIII/BamHI-Fragment mit der Sequenz von Exon 1 ligiert, um das LH-β-Fragment als 1400 bp großes BglII/BAmHI-Fragment bereitzustellen. Bei Varianten, bei denen das Gen den CTP-Bereich der CG-Sequenz einschloß, enthielt das BglII/BamHI-Fragment jedoch 3600 bp.
Die Konstruktion der die verschiedenen LH-Muteine und LH/CG-Chimäre codierenden Gene ist in Figur 6 beschrieben. Expressionssysteme für sowohl Chimäre von LH als auch CG-β-Untereinheiten und Muteine wurden konstruiert und auf die Fähigkeit zur Produktion von Untereinheiten getestet, die ohne Schwierigkeiten sezerniert werden und/oder Dimere bilden. Wie in Figur 6 zeigt, werden die Chimären durch die Verwendung geeigneter Teile der LH-β- oder CG-β-codierenden Gene konstruiert. Die Chimären sind durch LC oder CL gekennzeichnet, davon abhängig, welche der Untereinheiten den N-Terminus und welche den C-Terminus bildet, und die der Kennzeichnung folgenden Zahl bezeichnet die Zahl der letzten Aminosäure in der β-Untereinheit, die den N-Terminus bildet. So erzeugt die in Figur 6 gezeigte Chimäre LCβ41 eine β-Untereinheit, die die Aminosäuren 1-41 der menschlichen LH-β-Untereinheit als deren N-Terminus und die Aminosäuren 42-145 der menschlichen CG-β-Untereinheit als deren C-Terminus enthält. Da die β-Untereinheit bekannt ist, ist sie von der Kennzeichnung im Text ausgenommen. CL87 bezeichnet ein Konstrukt, das die Aminosäuren 1-87 von CG, gefolgt von den Aminosäuren 88-121 von LH-β, enthält. Konstrukte mit deletierten C-terminalen Sequenzen über Position 114 hinaus werden in Figur 6 als ΔT und in der Tabelle mit (1-114) bezeichnet. So enthält zum Beispiel LC87 (1-114) die Aminosäuren 1-87 der menschlichen LH-β-Untereinheit und die Aminosäuren 88-114 der menschlichen CG-β-Untereinheit. Spezifische Mutationen werden durch die Aminosäure, die für die in der nativen Untereinheit substituiert wurde, und durch die hochgestellte Zahl der Position, an der die Mutation erfolgte, angegeben. So weist LH-Thr&sup4;² auf die menschliche LH-β-Untereinheit hin, bei der das Methionin an Position 42 durch Threonin ersetzt wurde. Kombinationen von Veränderungen in der Sequenz werden entsprechend angegeben; zum Beispiel entspricht LH-Gly&sup4;&sup7;-Ala&sup5;¹ (1-114) einer menschlichen LH-β-Untereinheit, worin die natürlich vorkommenden Aminosäuren an den Positionen 47 bzw. 51 durch Gly bzw. Ala ersetzt sind und der durch die Aminosäuren 115-121 dargestellte Anteil von LH-β deletiert ist.
Expressionsvektoren wurden unter Verwendung von pM für die veranschaulichenden Mutanten in Tabelle 1 durch die Insertion der Gene in die BamHI-Stelle stromabwärts des LTR-Promotors konstruiert. Die Vektoren wurden dann allein oder zusammen mit pM²/CG-α (vorstehend) in Ovarzellen des Chinesischen Hamsters eingeschleust, wie beschrieben von Matzuk M.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 6354-6358, und Matzuk M.M. et al., J. Cell Biol. 106 (1988), 1049-1059, beide vorstehend angeführt. Erfolgreich transformierte Zellen wurden in 0,25 µg/ml G418 selektiert und die Expression wurde durch die Immunpräzipitation stoffwechselmarkierter Zellen nachgewiesen, um Monomer- und Dimer-sezernierende Zellinien zu selektieren.
Stabil transfizierte CHO-Zellinien wurden in "Medium-1" (Ham's F12-Medium, ergänzt mit Penicillin (100 U/ml), Streptomycin (100 µg/ml) und Glutamin (2 mM)) mit 5% (Vol./Vol.) fötalem Kälberserum auf 0,125 mg/ml G418 in einem Brutschrank mit einer befeuchteten, 5% CO&sub2; enthaltenden Atmosphäre aufrechterhalten.
Die Zellen wurden in einer Konzentration von 300 000-350 000 Zellen pro Vertiefung in Platten mit 12 Vertiefungen in 1 ml Medium- 1 ergänzt mit 5% fötalem Kälberserum einen Tag vor der Markierung ausplattiert. Für eine durchgehende Markierung wurden die Zellen zweimal mit Cystein-freiem "Medium-2" (Medium- 1, ergänzt mit 5% dialysiertem Kälberserum) gewaschen und 6 Stunden in 1 ml Cystein-freiem Medium-2 mit mit 20 µCi/ml markiertem Cystein markiert. Für "Pulse-Chase"-Experimente wurden die Zelle zweimal gewaschen und 1,5 Stunden im Cystein-freien Medium-2 vorinkubiert, gefolgt von einer 20minütigen Markierung im Cystein-freien Medium-2, das mit 100 µCi/ml markiertes Cystein enthielt, im Anschluß daran zweimal mit Medium-2 mit 1 mM unmarkiertem Cystein gewaschen und in dem unmarkierten Medium inkubiert.
Das Medium und die Zellysate wurden präpariert, immunpräzipitiert und behandelt, wie von Corless C.L. et al., J. Cell Biol. 104 (1987), 1173-1181, und in der vorstehenderwähnten PNAS-Veröffentlichung von Matzuk beschrieben. Antiseren gegen CG-β, LH-β und die α-Untereinheit wurden durch Standardverfahren präpariert; gegen CG-β erzeugte Antiseren sind mit LH-β vollständig kreuzreaktiv und wurden auch zum Nachweis von LH-β verwendet. Zur Charakterisierung der Immunpräzipitate auf SDS-Gelen wurden 15%ige SDS- Polyacrylamidgele 10 Minuten in 1 M Natriumsalicylat eingeweicht, getrocknet und mit einem vorbelichteten Film autoradiographiert und, falls gewunscht, mit einem LKB-Ultrascan-XL Laser-Densitometer gescannt.
Die Wirkungen der entscheidenden Veränderungen sind in Tabelle 1 aufgeführt. Tabelle 1 Sekretion und Aufbau von LH-β-CG-β-Chimären und -Muteinen
+: Für langsam sezernierte Mutanten wird der Gewinn durch den Vergleich der sezernierten Menge mit der aus dem Lysat in 10 Stunden verschwindenden Menge abgeschätzt.
*: Aus dem Medium gewonnene monoglycosylierte Form, da die α-Untereinheit die genaue Quantifizierung unmöglich macht.
**: Der Gewinn der diglycosylierten Form ist geschätzt.
Wie in der Tabelle gezeigt, hat, verglichen mit dem Verhalten von nativem LH-β, entweder die Deletion der aus 7 Aminosäuren bestehenden C-terminalen Sequenz oder eine entscheidende Veränderung einer einzelnen Aminosäure eine wahrnehmbare Wirkung sowohl auf die Monomersekretion und -gewinnung als auch auf die Dimersekretion und -gewinnung, jedoch liegen die Wirkungen im allgemeinen zwischen der Kombination einer C-terminalen Deletion mit einer geeigneten Aminosäuresubstitution. Unter Verwendung der Monomersekretion als ein Kriterium verringert sich zum Beispiel t1/2 drastisch auf 10 Stunden und der Gewinn erhöht sich signifikant von einem Wert von weniger als 20%, wenn die C-terminale Deletion mit der Substitution der hydrophoben Aminosäure Isoleucin an Position 15, Tryptophan an Position 8, dem Methionin an Position 42 oder dem Asparaginsäurerest an Position 77 kombiniert wird (obwohl diese Wirkung nicht so groß ist). Entsprechende Ergebnisse werden bei der Bewertung der Dimersekretion erhalten, außer daß die Veränderung des Threoninrestes an Position 58 in bezug auf die Dimerisierung sehr wirksam zu sein scheint, wahrend sie auf die Sekretion des Monomers eine geringe Auswirkung hat, und die Veränderung des Asparaginsäurerestes zu Asparagin an Position 77 scheint keine Wirkung zu haben. Die für die durch Kombinationen von LH und CG konstruierten Chimären erhaltenen Daten stimmen mit diesen Ergebnissen überein.
Die erfindungsgemäßen modifizierten Formen von LH-β sind folglich imstande, die Dimerisierung mit der α-Untereinheit und die Sekretion aus der Wirtszelle zu verbessern; diese Modifikationen der β-Untereinheit erlauben die Herstellung von LH in geeigneten Mengen unter Verwendung von rekombinanten Wirtszellen. Die bevorzugten Eigenschaften sind das Ergebnis der Deletion oder Modifikation des hydrophoben C-Terminus der β-Kette an den Positionen 115-121 in Verbindung mit einer Aminosäuremodifikation an einer festgelegten Stelle. Jeder hydrophobe Rest an den Positionen 8, 15 und 42 kann durch einen hydrophilen Rest ersetzt werden; in einer anderen Ausführungsform kann der Threoninrest an Position 58 durch Asparagin ersetzt sein.
Geeignete hydrophile Aminosäurereste umfassen Asparaginsäure, Glutaminsäure, Glycin, Histidin, Lysin, Asparagin, Glutamin, Arginin, Serin und Threonin. Besonders bevorzugt werden die neutralen hydrophilen Aminosäuren Glycin, Asparagin, Glutamin, Serin und Threonin. Besonders bevorzugt wird der Austausch von Tip an Position 8 gegen Arginin und Ile an Position 15 oder Met an Position 42 gegen Threonin, d.h. durch den Rest an der entsprechenden Position in der CG-β-Untereinheit.
Im Hinblick auf die aus 7 Aminosäuren bestehende hydrophobe Sequenz am C-Terminus wird die Modifikation in einfacher Weise durch die Deletion der Sequenz und im allgemeinen durch die Insertion eines Stopcodons an Position 115 in das Gen ausgeführt. Gemäß einer Ausführungsform kann die Sequenz durch eine geeignete hydrophile Sequenz, üblicherweise die aus 31 Aminosäuren bestehende Sequenz, die das carboxyterminale Peptid an den Positionen 115-145 der menschlichen Choriongonadotropin-β-Untereinheit darstellt, oder eine Variante davon ersetzt sein.
Najürlich können zusätzliche Aminosäuremodifikationen eingeschlossen sein, die die Aktivität der LH-Hormons nicht beeinflussen. Besonders bevorzugt wird die Modifikation von Aminosäuren an Positionen, die Aminosäureunterschieden zwischen der LH-Sequenz und der CG-Sequenz entsprechen, wodurch der geeignete Rest von CG den von LH ersetzt, wobei solche zusätzlichen Substitutionen auf 1-2 Reste begrenzt sind.

Herstellung von Hormonen mit einer durch die Wirtswahl festgelegten Glycosylierung

Die entsprechend den vorhergehenden Absätzen konstruierten Expressionssysteme können in einen bestimmten Wirt eingeschleust werden, so daß das erhaltene Protein ein Glycosylierungsmuster aufweist, das im wesentlichen innerhalb des gewonnenen Proteins übereinstimmt und das für den verwendeten Wirt charakteristisch ist. Diese Glycosylierung kann auch gegebenenfalls durch Veränderungen der in der Aminosäuresequenz enthaltenen Glycosylierungsstellen modifiziert werden. Es müssen natürlich für das konstruierte Expressionssystem geeignete rekombinante Wirte verwendet werden.
Im Hinblick auf das veranschaulichte Expressionssystem unter Verwendung des "long terminal repeat (LTR)" des Harvey-Maussarkomvirus umfassen geeignete Wirtszellen Säugerzellen, insbesondere von Nagetieren abgeleitete Wirtszellen. Eine besonders bevorzugte Wirtszelle ist wegen der Einfachheit und Gleichmäßigkeit des Glycosylierungsmusters eine Ovarzelle des Chinesischen Hamsters. Für die veranschaulichten Expressionssysteme wurden Transfektanten von CHO-Zellen durch die Transfektion von CHO-Zellen gemäß dem Verfahren von Matzuk M.M. et al. (1987), a.a.O., erhalten, außer daß die Zellen in α-MEM mit 10% (Vol./Vol.) Rinderkälberserum, 100 U/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin als Wachstumsmedium aufrechterhalten wurden. Stabile Transfektanten wurden aus diesem mit 250 µg/ml G418 ergänztem Medium selektiert. Dimer-sezernierende Clone wurden durch das Durchmustern von Medien und Lysaten mit α- und β-Antiseren isoliert. Die menschliche α-Untereinheit kann in einem getrennten Vektor oder in dem gleichen Vektor wie die β-Untereinheit exprimiert werden. Zum Beispiel kann pM²/α oder pM/CG-α mit dem Plasmid, das die die β-Untereinheit codierende DNA enthält, cotransfiziert werden, oder pM²/α, in den die die β-Untereinheit codierende DNA insertiert wurde, kann verwendet werden.
Zur Veranschaulichung wurden die vorstehend für menschliches FSR-β beschriebenen, in pM² insertierten Expressionssysteme zur Expression von FSH-β allein oder in pM²/α zur Expression in Verbindung mit der α-Untereinheit in CHO-Zellen eingeschleust und stabile Clone, bei denen nachgewiesen wurde, daß sie die β-Untereinheit oder das Dimer exprimieren, wurden durchgehend mit ³&sup5;S-Cystein während 6 Stunden markiert. Die in die Medien sezernierten Proteine und Proteine aus Zellysaten wurden mit geeigneten Antiseren immunpräzipitiert und auf einer SDS-Page aufgetrennt. Die Ergebnisse sind in Figur 7 im Vergleich zum Verhalten der das Gen für menschliches CG-β exprimierenden Transformanten dargestellt.
Figur 7a, die Gele nach einer sechsstündigen Markierung zeigt, offenbart, daß FSH-β in Abwesenheit der α-Untereinheit im Lysat zurückgehalten wird, während, wie in Figur 7B gezeigt, in Gegenwart der α-Untereinheit das Dimer gebildet und wirksam in das Medium sezerniert wird. Die Ergebnisse der Experimente, bei denen die Zellen mit ³&sup5;S-Cystein während 20 Minuten radioaktiv markiert ("pulse") werden und das radioaktiv markierte Cystein durch unmarkiertes Cystein während bis zu 12 Stunden verdrängt wird ("chase"), sind in den reβstlichen Abschnitten der Figur 7 dargestellt. Figur 7c zeigt die Ergebnisse für die β-Untereinheit von CG, wobei das geringere Molekulargewicht der β-Untereinheit im Medium anscheinend auf die Unterschiede im Glycosylierungsumfang an den zwei Asn-gebundenen Glycosylierungsstellen in CG-β-Untereinheit zurückzuführen ist und für diese β-Untereinheit einzigartig ist. Die Halbwertszeit von CG-β aus Lysaten und der Form von CG-β im Medium ist nach etwa 2 Stunden identisch und es kann praktisch die Gesamtmenge der sezernierten β-Untereinheit gewonnen werden.
Figur 7d zeigt, daß FSH-β allein viel weniger wirksam sezerniert wird und wie CG-β nach etwa 5 Stunden aus den Zellysaten verschwindet; weniger als 20% werden aus dem Medium nach 12 Stunden gewonnen. Ähnlich wie die β-Untereinheiten von LH und TSH wird FSH-β allein uneffizient sezerniert und langsam intrazellulär abgebaut. Jedoch zeigt Figur 7e, daß die Gegenwart der α-Untereinheit die Sekretion der β-Untereinheit für FSH stabilisiert und steigert. Die Halbwertszeit für das Verschwinden aus den Lysaten betrug etwa 90 Minuten und 90% wurden aus dem Medium nach 12 Stunden gewonnen. Dieses Verhalten entspricht dem vorstehend für TSH gezeigten, unterscheidet sich jedoch sowohl von CG als auch von LH.
Die Dimere sezernierenden Transformanten wurden auf ihre biologische Aktivität und durch chromatographische Fokussierung untersucht. Ratten-Granulomzellen wurden mit Aliquots mit ansteigender Konzentration (0,01-1,0 µl/ml) von rekombinantem FSH enthaltendem Medium in einem in vitro-Test auf die Steroidogenese untersucht, wie von Jia X.C. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 62 (1986), 1243-1249, und Jia X.C., Endocrinol. 119 (1986), 1570-1577, beschrieben. Die Ergebnisse dieses Tests sind in Figur 8 aufgeführt. Diese Ergebnisse zeigen, daß die maximale Östrogenproduktion um das Zehnfache höher war als die Basiswerte und die Werte denen durch den Hypophysen-FSH-Standard LER-907 induzierten entsprechen. Weder rekombinantes CG noch gereinigtes FSH-β allein stimuliert die Östrogenproduktion. Die Ergebnisse zeigen, daß das biologisch aktive FSH-Dimer in einer Menge von etwa 1,1 ± 0,4 IU/10&sup6; Zellen/24 Stunden sezerniert wird, was einer spezifischen Aktivität von 6600 IU/mg immunreaktivem FSH entspricht. Folglich sezemieren die Zellen 500 ng FSH/10&sup6; Zellen in 24 Stunden.
Das Medium aus den transfizierten Zellkulturen wurde an einer PBE-94-Säule mit einem pH-Gradienten von 7,0-3,5 chromatographiert und die FSH-Bioaktivitat in jeder Fraktion wurde unter Zugrundelegung des vorstehend beschriebenen in vitro-Tests bestimmt. Als Kontrolle wurde gereinigtes menschliches FSH (NIADD-hFSH-1-3) entsprechend behandelt. Die in Figur 9 gezeigten Ergebnisse offenbaren, daß sowohl rekombinantes als auch isoliertes menschliches FSH einen Aktivitätshauptpeak mit pI-Werten zwischen 5,0-3,6 für rekombinantes FSH und zwischen 5,2 und 3,6 für gereinigtes FSH zeigen. Hypophysen-FSH zeigte einen heterogenen Bereich von bioaktiven alkalischen Formen, der bei dem rekombinanten Protein nicht beobachtet wurde. Die Ergebnisse der chromatographischen Fokussierung weisen auf eine einheitliche, nicht-heterogene, glycosylierte Form des Proteins hin.
Ergänzend hierzu kann eine mutierte CHO-Zellinie mit unzureichender N-Acetylglucosaminyltransferase 1-Aktivität, wie 15B, verwendet werden, um die Glycosylierung sowohl in den α- als auch in den β-Untereinheiten von FSH der heterodimeren Hormone zu verändern. Es wurde gezeigt, daß in CHO-Zellen mit einem Mangel an dem Glycosylierungsenzym N-Acetylglucosamintransferase 1 (NAGT-) produziertes FSH Asn-gebundene (GLcNAc)&sub2; (Mannose)&sub5;-Oligosaccharide zur Folge hat. Die Produktion von FSH in CHO- Zellen ohne CMP-Sialinsäuretransport in den Golgi-Apparat (ST&supmin;) ergibt FSH mit einem Sialinsäure-Mangel.

Vergleichsbeispiel:

Einfluß der Glycosylierung auf die Sekretion der menschlichen α-Untereinheit

Die so erhaltenen α-Untereinheit-Expressionssysteme, die konstruiert wurden, wie in den vorhergehenden Absätzen beschrieben, wurden unter Anwendung einer Modifikation des Calciumphosphatverfahrens in CHO-Zellen eingeschleust, wobei die Zellen auf die Insertion der Plasmid-DNA durch das Züchten in einem Kulturmedium mit 0,25 mg/ml G418 durchmustert wurden. Resistente Kolonien wurden 11 Tage nach der Transfektion geerntet und auf die Expression der α-Untereinheit durch die Immunpräzipitation der Medien oder Lysate der Zellen mit einem geeigneten Antiserum durchmustert. Die CHO-Zellen wurden in mit Pen/Strep und Glutamin (2 mM) ergänztem Ham's F12-Medium mit 5% (Vol./Vol.) FCS bei 37ºC in einem Brutschrank mit einer befeuchteten, 5% CO&sub2; enthaltenden Atmosphäre aufrechterhalten; transfizierte Clone wurden unter Zugabe von 0,125 mg/ml G418 aufrechterhalten;
Zur Markierung des Stoffwechsels wurden die Zellen am Tag 0 in Platten mit 12 Vertiefungen in einer Konzentration von 350 000 Zellen/Vertiefüng in 1 ml mit 5% FCS ergänztes Medium eingebracht. Für durchgehende Markierungsexperimente wurden die Zellen zweimal mit Cystein-freiem Medium, ergänzt mit 5% dialysiertem Kälberserum anstelle von FCS, gewaschen und 7-8 Stunden in 1 ml Cystein-freiem Medium mit 5% dialysiertem Kälberserum und 50 uCi/ml ³&sup5;S-Cystein (mehr als 1000 Ci/mMol) markiert. Die Zellysate oder Medien wurden dann immunpräzipitiert und, falls geeignet, mit Endoglycosidasen behandelt, wie von Corless C.L. et al., J. Cell Biol. 104 (1987), 1173-1181, beschrieben. Die Immunpräzipitate wurden auf 15%igen SDS-Polyacrylamidgelen aufgetrennt.
Unter Anwendung dieses Analyseverfahrens wurde deutlich, daß der Grad der Glycosylierung einen Einfluß nicht nur auf die Sekretion der α-Untereinheit, sondern auch auf deren daraus resultierendes Molekulargewicht hatte. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefaßt. Tabelle 2
Wie in Tabelle 2 gezeigt, führt der Verlust der Glycosylierung an der Asn-Glycosylierungsstelle in Position 78 zu einer wesentlichen Abnahme der Sekretionsleistungsfähigkeit. Offensichtlich erfolgt während der Sekretion eine zusätzliche Kohlehydrat-Prozessierung, die sich in der Form mit höherem Molekulargewicht im Medium zeigt. Dies wurde durch die Behandlung der sezernierten Formen mit Endoglycosidase F bestätigt, die komplexe Oligosaccharide zusätzlich zu nicht-komplexen Oligosacchariden mit hohem Mannoseanteil und Oligosacchariden vom Hybrid-Typ spaltet. Mehr als 95% des sezernierten Materials ist empfindlich gegen Endoglycosidase F, jedoch nicht gegen Endoglycosidase E, die nur nicht-komplexe Oligosaccharide mit hohem Mannoseanteil und Oligosaccharide vom Hybrid-Typ spaltet.
Pulse-Chase-Experimente, die durchgeführt wurden, wie bei Matzuk M.M. et al., J. Cell Biol. 106 (1988), 1049-1059, beschrieben und hier unter Bezugnahme eingeschlossen, zeigen, daß die etwas geringeren Mengen von sezerniertem α(Asn 1) oder α(Thr 1) eher auf die donale Variation zurückzuführen sind als auf die Unterschiede bei den Sekretionsmengen oder den Abbauraten. Jedoch wiesen die Mutanten ohne Glycosylierung an der zweiten Glycosylierungsstelle (Position 78) geringere Sekretionsmengen und eine erhöhte Abbaurate auf.
Aus diesen Ergebnissen wird deutlich, daß die Glycosylierung an Position 2 einen sehr großen Einfluß sowohl auf die Sekretionsmenge als auch auf die intrazelluläre Stabilität der α-Untereinheit allein hat.

Vergleichsbeispiel:

Einfluß der α-Untereinheit-Glycosylierung auf die Sekretion von hCG

Der Einfluß des Glycosylierungszustandes der α-Untereinheit auf die Effizienz des Aufbaus des dimeren Hormons hCG wurde ebenfalls von Matzuk M.M. (a.a.O.) untersucht.
Bei den Clonen, in denen hCG-β im Überschuß zur α-Untereinheit gebildet wird, werden alle Wildtyp-α-Untereinheiten in die dimere Form des Hormons zur Sekretion umgewandelt. Andererseits weisen diejenigen Mutanten, denen das Oligosaccharid von Position 52 (Glycosylierungsstelle 1) fehlt, auf Grund der Veränderung des Aufbaus und/oder der Stabilität des dimeren Komplexes eine ungenügende Sekretion von intakten hCG-Dimeren auf Jedoch scheint der Verlust der Glycosylierung an Position 2 eine geringe Wirkung auf den Aufbau des dimeren Hormons zu haben. Die Entfernung beider Glycosylierungsstellen hat eine mittlere Wirkung auf den Aufbau; die Entfernung der Glycosylierung von beiden Stellen scheint eine geringere Wirkung auf die Fähigkeit des Hormons sich zusammen zu lagern zu haben, als die Entfernung der Glycosylierung von Position 1 allein. Zusätzlich stabilisiert die β-Untereinheit von hCG die Mutanten an Position 2 gegen den Abbau der α-Untereinheit.
Aus den vorstehenden Ergebnissen wird deutlich, daß das Glycosylierungsmuster der α-Untereinheit sowohl die Fähigkeit der α-Untereinheit selbst sezerniert zu werden, als auch deren Fähigkeit mit der β-Untereinheit zur Erzeugung eines intakten Hormons zu dimerisieren bestimmt.
Wie in dem die Herstellung von Muteinen der α-Untereinheit beschreibenden Absatz angemerkt wurde, sind bestimmte gekennzeichnete Aminosäuren im carboxyterminalen Anteil der α-Untereinheit für die Signaltransduktionsaktivität erforderlich. Demgemaß ist die inaktivierte α-Untereinheit bei der Konstruktion von Antagonisten durch die Dimerisierung mit der geeigneten β-Untereinheit irgendeines der Hormone FSH, LH, CG und TSH nützlich.
Es ist jedoch klar, daß sich der Einfluß des Glycoproteins der α-Untereinheit auf die Sekretion der β-Untereinheiten der vier Hormone in dieser Gruppe abhängig von der Art der β-Untereinheit unterscheidet. Matzuk M.M. et al., Molec. Endocrinol. 2 (1988), 95-100, hier unter Bezugnahme eingeschlossen, zeigen, daß die Gegenwart des α-Glycoproteins eine andere Wirkung auf die Sekretion von menschlichem Thyrotropin verglichen mit menschlichem CG oder LH hat. Es wurde gezeigt, daß CG-β in Abwesenheit der α-Untereinheit effizienter sezerniert wird, jedoch werden TSH- und LH-β-Untereinheiten langsam intrazellulär abgebaut und in einer Menge von weniger als 10% in das Medium sezerniert. CG-β wird jedoch auch in Gegenwart der α-Untereinheit als intaktes dimeres Hormon effizient sezerniert, während nur 50% von LH-β im Medium als LH-Dimer vorkommen. Andererseits geht die α-Untereinheit mit TSH-β eine effiziente Bindung ein, da mehr als 95% dieser β-Untereinheit als Dimer sezerniert wurden. Dies veranschaulicht, daß der Aufbau des dimeren Hormons von der Art beider Untereinheiten abhängig ist.
Wie in den die Konstruktion der Expressionssysteme für FSH-β betreffenden Absätzen beschriebenen, können Mutein-Formen von FSH-β, die in bezug auf die Halbwertszeit im Kreislauf überlegen sind, durch die Konstruktion eines Muteins hergestellt werden, das die CTP-Aminosäuresequenz am Carboxyterminus des menschlichen CG-β enthält. Zusätzlich können die N-gebundenen Glycosylierungsstellen der FSH-β-Untereinheit ohne Einfluß auf die Rezeptorbindungsaktivität deletiert oder verändert werden.
Mutein-Formen von hCG sind im Schutzumfang der Erfindung ebenfalls eingeschlossen. Verschiedene Muteine von hCG, die deletierte oder veränderte N-gebundene Glycosylierungsstellen enthalten, werden durch die Konstruktion von Expressionssystemen, die jenen für FSH-β und für die β-Untereinheit entsprechen, aus den nützlich modifizierten Formen der geeigneten Gene gentechnisch hergestellt. Die Abwesenheit eines oder aller N-gebundener Oligβosaccharide von hCG hatte nur eine geringe Wirkung auf die Rezeptoraffinität; im Hinblick auf die Produktion von CAMP und die Steroidogenese hatte die Abwesenheit N-gebundener Oligosaccharide von CG-β oder von Asn-78 der α-Untereinheit keine Wirkung. Jedoch war das Oligosaccharid an Asparagin-52 der α-Untereinheit für die cAMP- und Steroidproduktion entscheidend. Zusätzlich demaskierte seine Abwesenheit Unterschiede in den zwei in CG-β vorliegenden N-gebundenen Oligosacchariden und inhibierte in vitro die biologische Aktivität.

Wirkung der Glycosylierung auf die biologischen Eigenschaften

Es wurde bewiesen, daß die vollständige Deglycosylierung von menschlichem Choriongonadotropin ein Hormon ergibt, das seine Fähigkeit an den Rezeptor zu binden beibehält, jedoch nicht mehr zur Herbeiführung der normalen biologische Antwort der Zelle befähigt ist, die der Rezeptor überträgt. Ähnliche Wirkungen einer vollständigen Deglycosylierung werden bei den weiteren Fortpflanzungshormonen LH und FSH erzielt. Demgemaß stellen die erfindungsgemaßen unglycosylierten Mutanten, ob sie durch rekombinante Produktion in einem Wirt, der nicht imstande ist, eine solche Glycosylierung zu bewirken, oder durch Mutation hergestellt wurden, um die N-gebundenen Glycosylierungsstellen zu entfernen, Antagonisten bereit, die in Situationen nützlich sind, in denen die Fortpflanzungsfunktion reguliert werden muß und ein Antagonist erforderlich ist. Die teilweise Deglycosylierung, wie sie zum Beispiel durch die Bereitstellung einer deglycosylierten Form der α-Untereinheit in Verbindung mit einer β-Untereinheit erhalten werden würde, stellt Moleküle mit mittleren Wirkungen bereit. Die Veränderung der Glycosylierungsstellen in der α-Untereinheit wurde vorstehend beschrieben. Eine entsprechende Veränderung des Glycosylierungsmusters in den β-Untereinheiten kann durch Mutation erzielt werden, um eine oder beide Glycosylierungsstellen an den Positionen 15 und 30 der CG-β-Untereinheit; eine oder beide Glycosylierungsstellen an Position 7 und 24 der FSH-β-Untereinheit; oder die Glycosylierungsstelle an Position 30 der LH-β-Untereinheit zu entfernen.
Diese anderen Formen der Hormone können in einfacher Weise durch die erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt werden, wie durch die Verwendung von Expressionssystemen unter Verwendung des vorstehend beschriebenen α-Minigens oder in Verbindung mit weiteren Modifikationen der FSH-β- und CG-β-Untereinheiten, die auch vorstehend beschrieben wurden.

Wirkung von CTP auf die Clearance

Die Erfindung stellt ferner allgemein ein Verfahren zur Verbesserung der Clearanceeigenschaften von pharmazeutisch wirksamen Proteinen und Hormonen durch die Verlängerung ihrer biologischen Halbwertszeiten in vivo durch eine Modifikation bereit, die die Ligierung des carboxyterminalen Anteils der hCG-β-Untereinheit oder einer Variante davon, wie vorstehend definiert, mit dem Carboxyterminus des pharmazeutisch wirksamen Proteins oder Hormons umfaßt. Solche Modifikationen können in einer Weise durchgeführt werden, die jener für die Konstruktion eines Gens entspricht, das die vorstehende verlängerte FSH-β-Untereinheit codiert, und bei der das modifizierte Gen in ein geeignetes Expressionssystem einbezogen wird, um das Protein herzustellen. Gentechnisch hergestellte pharmazeutisch wirksame Proteine werden nun in industriellem Maßstab hergestellt und demgemäß kann die Expression des modifizierten Gens unter Anwendung allgemein bekannter Verfahren bewirkt werden. Geeignete Kandidaten für die Modifizierung umfassen Hormone, wie Insulin (worin die A-Untereinheit vorzugsweise verlängert werden würde), menschliches Wachstumshormon, Rinderwachstumshormon, Gewebeplasminogenaktivator und Erythropoietin; verschiedene Hormonregulatoren, wie LHRH und dessen Analoge; und allgemein jedes Peptid oder Protein, das wegen seiner biologischen Wirkung verabreicht wird. Im allgemeinen hat diese Modifikation eine längere Halbwertszeit zur Folge, die wegen der Ermöglichung niedrigerer Dosierungen vorteilhaft ist.

Nutzen und Anwendung

Hormone und andere Arzneimittel der vorliegenden Erfindung werden zur Verabreichung unter Anwendung von auf dem Fachgebiet allgemein verstandenen Verfahren formuliert. Übliche Formulierungen und Verabreichungsweisen werden beschrieben in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, letzte Auflage. Diese Formulierungen sind üblicherweise für die systemische Verabreichung vorgesehen, wie durch Injektion, jedoch können auch orale Formulierungen oder topische Formulierungen verwendet werden.
Die Wahl der Formulierung, Verabreichungsweise und Dosierungsmenge ist abhängig von dem einzelnen Hormon oder Protein und kann für das entsprechende Symptom unter Anwendung allgemein bekannter Verfahren optimiert werden.

Claims

1. Pharmazeutisch wirksames modifiziertes Protein oder Polypeptid, wobei die Modifikation eine Verlängerung des Carboxyterminus des Proteins oder Polypeptids mit dem carboxyterminalen Peptid (CTP) umfaßt, das von den Aminosäureresten 112-118 bis 145 der β-Untereinheit des menschlichen Choriongonadotropins (hCG) oder einer varianten Form davon mit der gleichen Funktionalität wie das CTP dargestellt wird, und das modifizierte Protein oder Polypeptid die biologische Aktivität des unmodifizierten Proteins oder Peptids behält.

2. Protein oder Polypeptid nach Anspruch 1, das eine modifizierte Form von Gewebeplasminogenaktivator, Erythropoietin oder eines Hormonregulators ist.

3. Protein oder Polypeptid nach Anspruch 2, wobei der Hormonregulator LHRH oder ein Analog davon ist.

4. Protein oder Polypeptid nach Anspruch 1, das ein Hormon oder eine Untereinheit eines Hormons ist.

5. Protein oder Polypeptid nach Anspruch 4, das die A-Kette von Insulin, menschliches Wachstumshormon, Rinderwachstumshormon oder eine β-Untereinheit eines heterodimeren menschlichen Glycoproteins ist.

6. Protein oder Polypeptid nach Anspruch 5, das die β- Untereinheit eines heterodimeren menschlichen Glycoproteinhormons ist.

7. Protein oder Polypeptid nach Anspruch 6, das die β- Untereinheit des luteinisierenden Hormons (LH) ist.

8. Protein oder Polypeptid naβh Anspruch 7, bei dem die Reste 115 bis 121 der β-Untereinheit deletiert sind und die Verlängerung durch das CTP oder eine Variante davon nach der Position 114 angefügt ist.

9. Protein oder Polypeptid nach Anspruch 6, bei dem die modifizierte β-Untereinheit die β-Untereinheit des follikelstimulierenden Hormons (FSHβ) ist.

10. Protein oder Peptid nach Anspruch 9, wobei die Verlängerung durch das CTP oder eine Variante davon nach der Position 111 der β-Untereinheit angefügt ist.

11. Protein oder Peptid nach Anspruch 6, wobei die modifizierte β-Untereinheit die β-Untereinheit von Schilddrüsen stimulierendem Hormon (TSHβ) ist.

12. Nucleinsäuremolekül, das bei Vorhandensein in einer kompatiblen Wirtszelle zur Expression einer verlängerten Glycoprotein-β-Untereinheit nach einem der Ansprüche 6 bis 11 fähig ist und eine die verlängerte Untereinheit codierende DNA-Sequenz umfaßt, die mit mit dem Wirt kompatiblen Kontrollsequenzen operativ verbunden ist.

13. Wirtszelle, die ein Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 12 enthält.

14. Verfahren zur Herstellung einer verlängerten menschlichen Glycoprotein-β-Untereinheit, das die Züchtung einer Zelle nach Anspruch 13 unter Bedingungen umfaßt, unter denen die codierende Nucleotidsequenz exprimiert wird; und

gegebenenfalls die Gewinnung der verlängerten β-Untereinheit aus der Zellkultur.

15. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 12, das weiter eine die menschliche Gonadoträpin-α-Untereinheit codierende Nucleotidsequenz enthält, operativ verbunden mit Kontrollsequenzen, die zur Herbeiführung ihrer Expression fähig sind.

16. Wirtszelle, die so modifiziert ist, daß sie das Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 15 enthält.

17. Verfahren zur Herstellung einer eine verlängerte β- Untereinheit umfassenden modifizierten Form eines Glycoproteinhormons, das die Züchtung einer Zelle nach Anspruch 16 unter Bedingungen umfaßt, unter denen die die α- und β-Untereinheiten codierenden Nucleotidsequenzen exprimiert werden; und

gegebenenfalls die Gewinnung des Hormons aus der Zellkultur.

18. Zelle nach Anspruch 13, die weiter ein Nucleinsäuremolekül umfaßt, das zur Expression einer die menschliche Gonadotropin-β-Untereinheit codierenden Nucleotidsequenz fähig ist.

19. Verfahren zur Herstellung eines eine verlängerte β- Untereinheit umfassenden modifizierten menschlichen Glycoproteinhormons, das die Züchtung einer Zelle nach Anspruch 18 unter Bedingungen umfaßt, unter denen die die α- und β-Einheiten codierenden Nucleotidsequenzen exprimiert werden; und

gegebenenfalls die Gewinnung des modifizierten Glycoproteinhormons aus der Zellkultur.

20. Modifiziertes menschliches Glycoprotein, das als die β- Untereinheit die verlängerte β-Untereinheit, wie in einem der Ansprüche 6 bis 11 definiert, umfaßt.

21. Arzneimittel, das das modifizierte menschliche Glycoproteinhormon nach Anspruch 20 im Gemisch mit einem geeigneten pharmazeutisch verträglichen Excipienten umfaßt.

22. Rekombinantes Nucleinsäuremolekül, das bei Vorhandensein in einer rekombinanten Wirtszelle zur Expression eines pharmazeutisch wirksamen modifizierten Proteins oder Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 5 fähig ist und eine das modifizierte Protein oder Peptid codierende DNA-Sequenz umfaßt, die operativ mit mit dem Wirt kompatiblen Kontrollsequenzen verbunden ist.

23. Wirtszelle, die so modifiziert ist, daß sie das Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 22 enthält.

24. Verfahren zur Herstellung eines modifiziertes Protein oder Polypeptid enthaltenden Arzneimittels, wobei die Modifikation eine Verlängerung am Carboxyterminus des Proteins oder Polypeptids mit der Aminosäuresequenz des carboxyterminalen Peptids (CTP) umfaßt, das die Positionen 112-118 bis 145 der β-Untereinheit des menschlichen Choriongonadotropins (hCG) oder einer varianten Form davon darstellt;

wobei das Verfahren die Züchtung der Zellen nach Anspruch 23 unter Bedingungen umfaßt, unter denen die das modifizierte Protein oder Polypeptid codierende Nucleotidsequenz exprimiert wird; und

gegebenenfalls die Gewinnung des modifizierten Proteins oder Peptids aus der Kultur.

25. Arzneimittel, das das modifizierte Protein oder Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 im Gemisch mit einem pharmazeutisch verträglichen Excipienten umfaßt.

26. Arzneimittel nach Anspruch 21 oder 25 zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers.